KR20160132694A

KR20160132694A - Cd154에 특이적으로 결합하는 항체

Info

Publication number: KR20160132694A
Application number: KR1020150065562A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 양정윤
Original assignee: 주식회사 프로젠
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2016-11-21
Also published as: WO2016182335A1

Abstract

본 발명은 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 것을 특징으로 하는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 본 발명의 항체는 FcγRI 및 FcγRIII과의 결합은 유지하되, FcγRII와의 결합은 차단됨으로써, 혈전 생성의 부작용 없이 항-CD154 항체로서의 우수한 면역억제효과를 나타내므로 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD154에 특이적으로 결합하는 항체{ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO CD154}

본 발명은 CD154 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Fc 영역 내에 아미노산 변이를 가지는 변이 항체에 관한 것이다.

자가면역반응이란 우리 몸의 면역세포들을 외부 물질로 인식하여 각종 면역반응을 통해 세포조직이 파괴되는 현상이다. 대표적인 자가면역질환으로는 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(루푸스), 건선, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 등이 있으며, 이러한 자가면역질환들은 그 원인이 명확하지 않아 치료가 곤란하다. 또한, 자가면역반응은 장기 이식 시에도 발생할 수 있으며, 이식된 장기는 면역 반응을 유발하여 큰 문제를 일으킬 수 있다.

따라서, 이러한 자가면역질환이나 장기 이식시 나타나는 자가면역반응을 억제하기 위하여 다양한 면역억제제들의 개발이 요구된다.

일반적으로 사용되고 있는 면역억제제로는 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스(tacrolimus), 유전자 합성 억제제인 마이코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 항염증 스테로이드인 프레드니손(prednisone) 등이 있다. 그러나, 이러한 면역억제제는 자가면역질환이나 장기 이식시 장기간 사용되어야 하기에 심각한 부작용을 유발할 수 있다(World L Transplant 2012, 294, 51-58; Transplantation 2012, 709-719; Toxins 2014, 869-891).

이에, 종래 면역억제제를 대체하거나 약물의 지속 기간을 늘리기 위해 다양한 생물 의약품들이 개발되고 있는데, 이 중 하나가 공동자극(costimulation) 억제제이다. 대표적인 공동자극 면역반응으로는 CD28-CD80/CD86, CTLA4-CD80/CD86, CD40-CD40L(CD154) 및 PD1-1-PD-L1 등이 있으며, CTLA-Fc, PD-1 및 항-CD40 또는 항-CD154 항체 등이 생물 의약품으로 연구되고 있다(Transplantation 2013, 95(4), 527-535; Am J Transplant 2012, 12(10), 2575-2587; World J Transplant 2013, 3(4), 68-77).

한편, CD40은 B 세포, 대식세포, 수상세포, 흉선 상피세포와 같은 항원제시세포뿐만 아니라 상피세포 및 섬유아세포 등의 일반세포에서도 발현된다. CD40L이라고도 알려진, CD154는 활성화된 T 세포와 자연 살해(natural killer) 세포에서 주로 발현이 된다. CD40-CD154 신호전달을 통하여 B 세포와 대식세포가 활성화되고 간접적으로 T 세포도 활성화시켜, 면역반응을 촉진시킨다(Iran J Allergy Asthma Immunol 2012, 11(1), 1-13).

따라서, CD154의 작용을 조절하여 면역 반응을 억제하기 위하여, 항-CD154 항체가 개발되었고, 상기 항체는 원숭이를 비롯한 동물실험에서 좋은 효과를 보였다. 그러나 사람을 대상으로 하는 임상실험 결과, 상기 항체는 혈전 생성이라는 매우 심각한 부작용을 나타내어, 현재 CD154에 대한 항체 의약품 개발이 전면적으로 중단된 상태이다(Arthritis & Rheumatism 2002, 46(12), 3251-3258; Arthritis & Rheumatism 2003, 48(3), 719-727; Curr Opin Organ Transplant 2012, 17, 368-375).

항체는 세포의 표면상에 발현된 FcγR(Fc gamma receptor)에 결합함으로써 면역 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. FcγR은 FcγRIa, FcγRIb, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb로 이루어져 있다. 이중 항체와 FcγRI 및 FcγRIII와의 결합이 항체의 효과에 중요한 역할을 하는 반면, 항-CD154 항체와 혈소판의 FcγRII와의 결합은 순차적인 반응을 통해 혈전을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항-CD154 항체의 효과는 유지하면서도 이로 인한 혈전 생성을 방지하기 위해서는, FcγRI 및 FcγRIII와의 결합력은 유지하면서도 FcγRII와의 결합은 차단된 새로운 항-CD154 항체의 개발이 요구된다(Journal of Biological Chemistry, 276, 6591-6604).

World L Transplant 2012, 294, 51-58 Transplantation 2012, 709-719 Toxins 2014, 869-891 Transplantation 2013, 95(4), 527-535 Am J Transplant 2012, 12(10), 2575-2587 World J Transplant 2013, 3(4), 68-77 Iran J Allergy Asthma Immunol 2012, 11(1), 1-13 Arthritis & Rheumatism 2002, 46(12), 3251-3258. Arthritis & Rheumatism 2003, 48(3), 719-727 Curr Opin Organ Transplant 2012, 17, 368-375 Journal of Biological Chemistry, 276, 6591-6604

따라서, 본 발명의 목적은 FcγRI 및 FcγRIII와의 결합력은 유지하면서 FcγRII와의 결합을 차단하여 혈전을 유발하지 않는, CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체로서, 상기 항체가 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 것을 특징으로 하는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항체는 FcγRI 및 FcγRIII과의 결합은 유지하되, FcγRII와의 결합은 차단됨으로써, 혈전 생성의 부작용 없이 항-CD154 항체로서의 우수한 면역억제효과를 나타내므로 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 경쇄용 발현벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 중쇄용 발현벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 경쇄 및 중쇄용 발현벡터의 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 항체(C10m)와 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 모 항체(C10)와 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 6은 대조군으로서 리툭산과 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb와의 농도별 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 7은 1 μM 농도의 리툭산, C10m 및 C10과 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb와의 결합력을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명에 사용된 용어의 정의를 설명한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중-특이적 항체(예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다. 상기 항체는 쥐과(murine), 인간 또는 기타 종으로부터 유래된 것일 수 있으며, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 또한, 항체는 특이적 항원을 인식하고 이와 결합함으로써 면역반응을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "Fc 영역"은 항체의 Fab 영역을 제외한 꼬리(tail) 영역으로서, 항체의 중쇄 불변 영역 중 CH₂ 및 CH₃을 포함하는 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. 상기 Fc 영역은 Fc 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작용하며 면역계를 활성화시킨다. 본 발명에 사용된 아미노산 치환과 관련된 약어, 예를 들면 'D271E'는 본원에 규정된 아미노산 서열에서 kabat 등(kabat et al, SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5^thED. Public Health Service, NIH, MD(1991))에 의한 넘버링 규칙에 따라 271번째 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환된 것을 의미하며, 'S299A'는 본원에 규정된 아미노산 서열에서 kabat 등에 의한 넘버링 규칙에 따라 299번째 위치의 아미노산인 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환된 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체로서, 상기 항체가 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, CD154에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항체는 항-CD154 항체로서, CD154(CD40L)에 특이적으로 결합하여 CD154(CD40L)가 CD40에 결합하는 것을 억제함으로써 면역억제제로서 기능한다. 상기 CD154는 CD4⁺ T 세포의 표면 상에서 발현되는 II형 막관통 단백질로서, CD40 리간드(CD40L: CD40 ligand), CD40 대응 수용체(CD40CR: CD40 counter receptor), gp39, T-BAM, T 세포 활성화 분자, TRAF, TNF 관련 활성화 단백질(TRAP: TNF-Related Activation Protein) 및 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 멤버 5(TNFSF5: Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 5)와 같은 여러 다른 명칭으로 알려져 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역(C_H)을 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역(C_L)을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄를 가질 수 있다.

본 발명의 항체는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항-CD154 항체로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하기 위한 모(parent) 항체의 예로는 C10 항체(GENEXINE사)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 C10 항체는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하며, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 불변 영역(C_H) 및 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역(C_L)을 갖는다. 또한, 상기 C10 항체는 서열번호 15로 표시되는 중쇄를 갖는다. 나아가, 상기 C10 항체는 서열번호 7로 표시되는 경쇄를 갖는다. 상기 C10은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII과 모두 결합하며, 그 중 FcγRII와의 결합을 통해 혈전 형성(thrombosis)이라는 부작용을 나타낸다.

그러나, 본 발명의 항-CD154 항체는 C10 항체와는 달리 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 271번째 위치의 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로, 299번째 위치의 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환됨으로써, FcγRII와의 결합력을 나타내지 않는다. 또한, 서열번호 5로 표시되는 중쇄의 불변 영역 내에 153번째 위치의 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로, 181번째 위치의 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환됨으로써, FcγRII와의 결합력을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 FcγRI 및 FcγRIII과의 결합을 유지하여 항-CD154 항체로서의 우수한 면역억제효과를 나타낼 뿐만 아니라, FcγRII와 결합하지 않음으로써 혈전 생성의 부작용을 낮출 수 있다. 본원에서, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H), 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L), 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역(C_H) 및 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역(C_L)을 갖는 항체는 C10 항체의 변이 항체라는 의미로 'C10m'이라 지칭된다.

본 발명에 따른 항체에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H)은 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)은 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 불변 영역(C_H)은 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며, 서열번호 4로 표시되는 경쇄 불변 영역(C_L)은 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 항체에 있어서, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄는 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며, 서열번호 7로 표시되는 경쇄는 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항-CD154 항체는 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 이때 항체 접합체란 항-CD154 항체에 생물학적 활성을 갖는 물질이 결합된 형태의 항체를 의미한다. 상기 항-CD154 항체는 항체 접합체를 형성함으로써 단백질의 면역원성 및 항원성을 현저히 감소시킬 수 있고, 단백질의 물리적 및 화학적 안정성을 증진시킬 수 있다. 상기 생물학적 활성을 갖는 물질과 항-CD154 항체의 결합은 공유결합 또는 비공유결합에 의해 이루어질 수 있으며, 가역적이거나 조절 가능한 것일 수 있다. 항-CD154 항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예로는 항신생물제, 약물, 독소, 효소, 다른 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편, 합성(예를 들어, PEG) 또는 자연 발생 중합체, DNA, RNA, 압타머, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드화물, 방사성 동위원소, 킬레이트화된 금속 및 NMR 또는 ESR 분광분석법과 같은 기법에 의해 영상화하여 검출할 수 있는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 첨가제는 담체, 부형제 또는 기타 첨가제일 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형을 제조할 때, 상기 항체를 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 항체에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다.

따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 항체의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상, 예를 들어 인간을 포함하는 포유동물에게 투여함으로써 자가면역질환을 치료할 수 있다. 이때, 상기 항체의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 유효성분으로서 상기 항체는 포유동물에 대해 하루 0.001 내지 10 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.005 내지 1 mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 자가면역질환의 예로는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(progressive systemic sclerosis, scleroderma), 전신 홍반성 낭창(lupus), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선(psoriasis), 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변, 궤양성 대장염, 베체트병(Behcet's disease), 크론병, 규소 폐증, 석면 폐증, IgA 신장질환, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 쇼그렌 증후군(Sjogren Syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 그레이브병(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 섬유조직염(fibromyalgia syndrome) 및 측두 동맥염(temporal arteritis)을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 변이 항체(C10m)의 제조

<1-1> 모 항체의 입수 및 서열 분석

변이 항체를 만들기 위한 모 항체로서, C10 항체를 GENEXINE사로부터 입수하였다. 상기 C10 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 코스모진텍에 의뢰하여 확인하였다.

확인 결과, C10 항체는 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경쇄 가변 영역, 서열번호 14의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 상기 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 결과, C10 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

<1-2> 모 항체 서열에 기반한 변이 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자의 합성

상기 모 항체인 C10의 염기서열 분석 결과를 바탕으로, 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내 271번째 위치의 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로, 299번째 위치의 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환된 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 유전자를 설계하였다. 상기 중쇄 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오타이드를 갖고, 경쇄 유전자는 서열번호 13의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 것으로 설계하였다. 이때, 상기 중쇄 유전자의 상류에는 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드를 접합시켰고, 상기 경쇄 유전자의 상류에는 신호 펩타이드를 코딩하는 서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드를 접합시켰다. 상기 설계된 유전자를 유전자 합성 전문기관인 Topgene(Canada)에 의뢰하여 합성하였다.

합성한 서열을 확인한 결과, 서열번호 8의 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 가변 영역을, 서열번호 9의 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 가변 영역을, 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드는 중쇄 불변 영역을, 그리고 서열번호 11의 폴리뉴클레오타이드는 경쇄 불변 영역을 코딩함을 확인할 수 있었다.

<1-3> 변이 항체의 제조

경쇄용 발현벡터를 제조하기 위해, pAD15벡터(GENEXINE사)를 제한효소 NotI 및 XbaI으로 처리한 후, Topgene사에 의해 합성된 경쇄를 코딩하는 유전자와 라이게이션(ligation)하여 경쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.

또한, 중쇄용 발현벡터를 제조하기 위해, pGEM 벡터(INVITROGEN사)를 제한효소 EcoRV 및 XbaI으로 처리한 후, Topgene사에 의해 합성된 중쇄를 코딩하는 유전자와 라이게이션(ligation)하여 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터의 모식도를 도 2에 나타내었다.

그리고 경쇄 및 중쇄를 동시에 발현시키기 위한 벡터를 제조하기 위해, 경쇄용 발현벡터(도 1)를 제한효소 XhoI으로 처리한 후, 제한효소인 SalI으로 처리한 중쇄용 발현벡터(도 2)와 라이게이션하여 경쇄 및 중쇄용 발현벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터의 모식도를 도 3에 나타내었다.

이후, 상기에서 제조한 경쇄 및 중쇄용 발현벡터(도 3)를 전기천공기를 이용하여 CHO DG44 세포주(DHFR-)에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 세포주 중 ELISA 정량 분석을 통해 발현양이 높은 세포를 선별했으며, 단계적으로 메토트렉세이트(methotrexate)의 양을 증가시키면서 "증폭 → 단일클론 선별 → 생산성 측정" 과정을 반복하여 목표로 하는 발현 세포주를 수득하였다.

그리고, 상기 수득된 발현 세포주를 상업적 배지인 Hycell media를 이용하여 3L 배양기에서 배양하였다. 상기 수득한 배양액을 단백질 A 컬럼 및 양이온교환 크로마토그래피(DEAE column)를 통과시키고 연마(polishing) 과정 후 초미세여과 공정을 거쳐 본 발명에 따른 변이 항체(C10m)를 수득하였다.

실시예 2: 변이 항체(C10m)의 서열 확인

상기 실시예 1에서 제조된 C10m의 중쇄 및 경쇄 서열을 확인한 결과, C10m 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 4의 아미노산을 갖는 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

상기 C10m의 아미노산 서열을 C10과 비교한 결과, C10m은 C10의 Fc 영역 내 271번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로, 299번째 아미노산인 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환되었음을 확인하였다.

시험예 1: Fcγ 수용체와의 결합력 확인

상기 실시예 1에서 제조된 C10m과 Fcγ수용체(I, IIa, IIb, IIIa, IIIb)와의 결합력을 C10과 비교하기 위해, GLC 칩(Cat #. 176-5011, Bio-Rad사)의 5개 채널에 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb를 코팅하고, C10m, C10 및 리툭산(양성대조군, Roche사)을 각각 0.011, 0.03, 0.11, 0.3, 1 μM 농도로 분당 30 μl의 속도로 흘려주었다. 실험은 재생버퍼인 25 mM NaOH를 이용하여 제로베이스를 확인한 후, 상기 단계를 반복하여 진행하였다. 그후, 단백질 결합 분석기기(Proteon XPR36, BIO-RAD, USA)를 이용하여 결합곡선을 확인하였다. 상기 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.

하기 도 4 내지 6에서 보는 바와 같이, C10m, C10 및 리툭산과 Fcγ 수용체 I, IIIa 및 IIIb와의 결합에 따른 RU값은 농도에 비례해서 높아지는 것을 알 수 있다. 이는 C10m, C10 및 리툭산과 Fcγ 수용체 I, IIIa 및 IIIb와의 결합이 유지되고 있다는 것을 보여준다. 한편, C10 및 리툭산과 Fcγ 수용체 IIa, IIb와의 결합에 따른 RU값은 농도에 비례하여 높아진 반면, C10m와 Fcγ 수용체 IIa, IIb와의 결합에 따른 RU값은 농도가 높아져도 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 상기 결과는 본 발명의 C10m 항체가 C10 및 리툭산과 달리 Fcγ 수용체 IIa, IIb와의 결합이 차단되었음을 보여준다.

시험예 2: 특정농도에서 Fcγ 수용체와의 결합력 확인

같은 농도의 리툭산, C10m 및 C10과 Fcγ 수용체와의 결합력을 한번에 비교하기 위하여, 1 μM 농도의 각각의 항체와 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa 및 IIIb와의 결합력을 비교하였다. 상기 결과를 하기 도 7에 나타내었다.

하기 도 7에서 보는 바와 같이, C10m은 C10 및 리툭산과 비교하여 Fcγ 수용체 IIa 및 IIb와의 결합력이 없는 것을 확인할 수 있었다.

<110> PROGEN CO., LTD. <120> ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO CD154 <130> FPD/201504-0001/C <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of C10m antibody <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of C10m antibody <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile 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ggccaccctg acagtggaca agtcctccag caccgcctac 240 atgcagctga tcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcac cagaagcgac 300 ggcagaaacg acatggacag ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgtc cagcgccagc 360 accaagggcc ctagcgtgtt tcccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaagactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac 480 agcggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660 tgcgacaaga cccacacctg ccctccctgc cccgcccctg agctgctggg cggccccagc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag gaucccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840 gatggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aaacccagag aggagcagta caacaguacc 900 tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgcct gctcccatcg agaagaccat ctccaaagcc 1020 aagggccagc ccagagaacc ccaggtgtac accctgcctc ccagcagaga cgagctgacc 1080 aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccacaccccc tgtgctggac 1200 agcgatggca gcttctttct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag 1260 ggcaacgtgt tctcctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgtccc tgagccccgg caag 1344 <210> 17 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of heavy chain of C10m antibody <400> 17 atgggctgga gctacatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacccc 57 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of light chain of C10m antibody <400> 18 atggagaccg acaccctgct cctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60 60

Claims

서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 2로 표시되는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체로서, 상기 항체가 서열번호 15로 표시되는 중쇄의 Fc 영역 내에 D271E 및 S299A 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, CD154에 특이적으로 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 항체의 중쇄 불변 영역(C_H)이 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 항체의 경쇄 불변 영역(C_L)이 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 항체가 FcγRI 및 FcγRIII과 결합하고 FcγRII와 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 항체가 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 및 서열번호 7로 표시되는 경쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 자가면역질환이 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(progressive systemic sclerosis, scleroderma), 전신 홍반성 낭창(lupus), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선(psoriasis), 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변, 궤양성 대장염, 베체트병(Behcet's disease), 크론병, 규소 폐증, 석면 폐증, IgA 신장질환, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 쇼그렌 증후군(Sjogren Syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 그레이브병(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 섬유조직염(fibromyalgia syndrome) 및 측두 동맥염(temporal arteritis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.