WO2020230826A1 - イムノクロマト診断キット用吸収パッド及びイムノクロマト診断キット - Google Patents

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WO2020230826A1
WO2020230826A1 PCT/JP2020/019144 JP2020019144W WO2020230826A1 WO 2020230826 A1 WO2020230826 A1 WO 2020230826A1 JP 2020019144 W JP2020019144 W JP 2020019144W WO 2020230826 A1 WO2020230826 A1 WO 2020230826A1
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WO
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pad
diagnostic kit
immunochromatographic
absorption pad
immunochromatographic diagnostic
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PCT/JP2020/019144
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厚志 堀井
武志 松瀬
佐藤　潤一
雄一 原
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旭化成株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit. More specifically, the present invention relates to an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit that has excellent reproducibility of test results and does not cause regurgitation.
  • a sandwich method As the measurement principle of the immunochromatography method, there are a method called a sandwich method and a method called a competitive method. Further, as a measurement format, there are methods called a flow-through type and a lateral flow type.
  • Various substances can be detected as the substances to be tested in the sample, and a typical example is the measurement of detecting the antigen by the sandwich method, and the following operations are sequentially executed.
  • An antibody that specifically binds to an antigen, which is a substance to be tested is immobilized on a predetermined site of a chromatographic medium such as a chromatographic medium membrane, and a test line (hereinafter referred to as “TL”) is placed at an arbitrary position on the chromatographic medium.
  • TL test line
  • a detection reagent in which an antibody that specifically binds to the substance to be inspected is carried on a labeling substance such as an enzyme, a labeling substance, a fluorescent labeling substance, or magnetic particles, and apply the detection reagent to a conjugate pad or the like to dry. Then, a detection reagent-containing portion is formed, and the immunochromatographic diagnostic kit is formed by combining with the chromatograph medium. (3) The sample itself containing the antigen or a solution obtained by diluting it with an arbitrary liquid is dropped at a predetermined position of the immunochromatographic diagnostic kit, for example, on a sample pad, and the antigen and the detection reagent are developed on a chromatograph medium. .. By these operations, the labeling substance is captured by the antibody immobilized on the chromatograph medium at the reaction site via the antigen, and the signal of the labeling substance is detected to make a diagnosis by the immunochromatographic diagnostic kit.
  • a labeling substance such as an enzyme, a labeling substance, a fluorescent labeling
  • the cause of the variation is considered to be the influence of each member that composes the kit, but since the absorption pad is the part that absorbs the liquid, it causes the variation in the color development intensity due to defects such as background coloring. ..
  • the “background” is a phenomenon that occurs when the labeling reagent is clogged in the pores of the chromatographic medium film or non-specifically adsorbed, so that the chromatographic medium film is colored. If the background is poor, the contrast between the chromatograph medium film and the test line (TL) will be poor, making it difficult to see the colored lines of the TL, making it difficult to make a judgment in the medical field. Further, if the background is bad, it becomes difficult to judge a negative TL (that is, no color development). These phenomena can lead to misdiagnosis.
  • background coloring due to backflow of labeling reagents after judgment.
  • the determination time is set for each immunochromatographic diagnostic kit, but in a clinical site where the patient is extremely busy, it is often impossible to make a determination exactly at the determination time.
  • backflow of labeling reagent means that the labeling reagent once absorbed by the absorption pad flows back due to the drying of the chromatograph medium and develops in the opposite direction on the chromatograph medium. This backflow can cause misdiagnosis by coloring the background and even polluting the TL.
  • an object to be solved by the present invention is to provide an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit that has excellent reproducibility of test results and does not cause reflux.
  • the present invention is as follows.
  • the immunochromatographic diagnostic kit using the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present invention has excellent reproducibility of test results and does not cause regurgitation.
  • the absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment is an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit containing carboxymethylated cellulose fibers, and is an average substitution of hydroxyl groups in glucose units constituting the carboxymethylated cellulose fibers.
  • the degree is 0.05 or more and 1.5 or less.
  • the immunochromatographic test method performed using an immunochromatographic diagnostic kit generally includes a flow-through method in which a solution containing an object to be measured is passed in a direction perpendicular to a membrane and a lateral flow method in which a solution containing an object to be measured is passed in a horizontal direction.
  • the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment can be used in any of these methods, and is not limited to these in the sense of the system of the immunochromatographic diagnostic kit that absorbs water.
  • the carboxymethylated cellulose fiber contained in the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment has an average degree of substitution of hydroxyl groups in the glucose unit constituting the cellulose when carboxymethylated is 0.05 or more and 1.5 or less. Is. If the average degree of substitution is too high, a water block will be created in the front part of the absorption pad when the developed liquid is absorbed. As a result, a sufficient amount of the developing liquid is not absorbed, and further, development failure occurs, resulting in inspection variation.
  • the upper limit of the average degree of substitution is preferably 1.3 or less, more preferably 0.9 or less. More preferably, it is 0.6 or less. If the average degree of substitution is 0.05 or more, a sufficient amount of liquid absorption can be secured.
  • the lower limit of the average degree of substitution is preferably 0.1 or more, and more preferably 0.2 or more.
  • the terminal of the carboxymethyl group is a sodium salt, but after that, it is treated with an acid to convert some carboxymethyl groups into a proton type. can do.
  • the method for partially protonating the carboxymethylated cellulose fiber is not particularly limited, but the protonation is carried out by immersing the carboxymethylated cellulose fiber in acetic acid, hydrochloric acid, or nitric acid adjusted to a predetermined concentration using a solvent containing alcohol. It is more preferable that the protonation is carried out by immersing the mixture in acetic acid adjusted to a predetermined concentration using a solvent containing alcohol.
  • the absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit containing the carboxymethylated cellulose fiber of the present embodiment preferably has a catch and release index of 0.5 or less.
  • the "catch and release index” is an index that indicates the balance between the property of the absorbing pad to absorb the applied liquid and the property of the absorbing pad to hold the applied liquid.
  • Catch and release index (100 x C ⁇ D) ⁇ T ⁇ In the formula, C: liquid absorption amount (g / 100 cm 2 ), D: basis weight (g / m 2 ), T: release time (minutes) ⁇ . If the catch-and-release index is too large, the labeling reagent once absorbed by the absorption pad may flow back on the chromatograph medium or test variation may occur.
  • the upper limit of the catch and release index is more preferably 0.3 or less, still more preferably 0.1 or less.
  • the lower limit is preferably 0.0001 or more, and more preferably 0.001 or more.
  • the catch-and-release index is determined by controlling the average substitution degree, average fiber diameter, fiber length, etc. of the carboxymethylated cellulose fiber, and / or the morphology of the absorption pad containing the carboxymethylated cellulose fiber. Can be adjusted.
  • the term "release time” means that an absorption pad having a width of 4 mm and a length of 25 mm is placed on a chromatographic medium having a width of 4 mm and a length of 25 mm without deviation, and 20 ⁇ L of physiological saline is applied. It is a numerical value in minutes that indicates the time required for the saline solution to start migrating from the absorption pad to the chromatographic medium when it is gently and evenly dropped onto the absorption pad. For the measurement of "release time”, if the relationship between the absorption pad size and the amount of physiological saline is the same as the above method, the absorption pad size and physiological saline are different from the above method. The amount of water may be used.
  • the average fiber diameter of the carboxymethylated cellulose fibers is preferably 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less. If the average fiber diameter is too large, a water block will be created in the front part of the absorption pad when the developed liquid is absorbed. As a result, a sufficient amount of the developing liquid is not absorbed, and further, development failure occurs, resulting in inspection variation.
  • the upper limit of the fiber diameter is preferably 80 ⁇ m or less, and more preferably 70 ⁇ m or less. If the average fiber diameter is 1 ⁇ m or more, a sufficient amount of liquid absorption can be secured.
  • the lower limit of the average fiber diameter is preferably 3 ⁇ m or more, and more preferably 5 ⁇ m or more.
  • the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic agent kit containing the carboxymethylated cellulose fibers of the present embodiment can be in the form of a woven fabric, a knitted fabric, or a non-woven fabric.
  • G / m 2 that is, the weight of the non-woven fabric (g) / the area of the non-woven fabric (m 2 )
  • the lower limit of the basis weight is more preferably 20 g / m 2 or more, and further preferably 30 g / m 2 or more.
  • the upper limit of the basis weight is more preferably 350 g / m 2 or less, further preferably 300 g / m 2 or less, still more preferably 250 g / m 2 or less, still more preferably 200 g / m 2 or less, still more preferably 190 g / m. It is 2 or less, more preferably 180 g / m 2 or less.
  • the thickness of the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit containing the carboxymethylated cellulose fiber of the present embodiment is preferably 0.03 mm or more and 10.00 mm or less in the case of a woven fabric or a sheet, for example. If the pad is too thick, for example, when used in an immunochromatographic diagnostic kit, it becomes difficult to store the pad in a housing, and as a result, the diagnostic results vary widely.
  • the upper limit of the thickness of the pad is more preferably 9.00 mm or less, still more preferably 8.00 mm or less. On the other hand, if the sheet is too thin, a sufficient amount of liquid absorption cannot be secured as an absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit.
  • the lower limit of the thickness of the pad is more preferably 0.05 mm or more, still more preferably 0.10 mm or more.
  • the "thickness" of the pad means a value obtained by measuring a load of 1.96 kPa in a thickness test conforming to JIS-L1096.
  • the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment preferably has a liquid absorption amount of 5 g / 100 cm 2 or more and 50 g / 100 cm 2 or less when impregnated with physiological saline. If the amount of liquid absorbed is too large, the structure will collapse when the liquid is absorbed when used in an immunochromatographic diagnostic kit, resulting in poor deployment.
  • the upper limit of the amount of liquid absorbed is preferably 50 g / 100 cm 2 or less, and more preferably 30 g / 100 cm 2 or less. If the amount of liquid absorbed is less than 5 g / 100 cm 2 , the desired effect may not be exhibited and backflow may occur.
  • the lower limit of the amount of liquid absorbed is preferably 5 g / 100 cm 2 or more, and more preferably 10 g / 100 cm 2 or more.
  • the cellulose fiber (before carboxymethylation) that is the raw material of the carboxymethylated cellulose fiber is not particularly limited, and is known as a known cellulose fiber such as cuprammonium rayon, viscose rayon, lyocell, cotton, pulp, and polynosic. , Preferred are cuprammonium rayon, viscose rayon, and more preferably cuprammonium rayon.
  • Some cellulose fiber materials have a low degree of polymerization, and in such materials, if the degree of substitution is high, the fibers are easily decomposed and it is necessary to suppress the degree of substitution to the lowest possible, whereas when cuprammonium rayon is used, It has the advantages of high degree of polymerization and resistance to disintegration even at a relatively high degree of substitution, and a wide range of degree of substitution can be selected.
  • the cellulose fiber may be either a long fiber or a short fiber.
  • the long fibers continuous long fibers are preferable.
  • the long fiber means a fiber having a fiber length of 10 mm or more, and the fiber length is preferably 20 mm or more, more preferably 50 mm or more, and further preferably a continuous long fiber. Since the short fiber cellulose sheet is a short fiber, if the degree of substitution is high, the fibers are easily separated and it is necessary to suppress the degree of substitution as low as possible, whereas when the continuous long fiber sheet is used, the degree of substitution is relatively high. It has the advantage of being hard to collapse and it is possible to select a wide range of substitution degrees.
  • the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit containing the carboxymethylated cellulose fibers of the present embodiment is preferably in the form of cotton, woven fabric, knitted fabric or non-woven fabric, and more preferably carboxymethylated. It is in the form of a woven fabric or non-woven fabric of regenerated cellulose fibers, more preferably a non-woven fabric of carboxymethylated regenerated cellulose fibers. In the non-woven fabric form, the fibers are entangled even in the gelled state when wet, so that high liquid absorption can be obtained while maintaining the strength when wet, which is suitable as an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit. Can be used for.
  • the absorbent pad for immunochromatographic diagnostic kit containing the carboxymethylated cellulose fiber of the present embodiment includes fibers other than those derived from natural or regenerated cellulose fiber, for example, polyester fiber, polypropylene fiber, nylon, as long as the desired action and effect are not impaired.
  • Synthetic fibers such as fibers and bioabsorbable fibers such as polyglycolic acid, polylactic acid, and polyapple acid may be contained.
  • such a material is preferably 50% or less, and more preferably 30% or less.
  • Such fibers may be long fibers or short fibers. As the long fibers, continuous long fibers are preferable.
  • the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment may be a stack of sheets depending on various uses.
  • heat embossing heat embossing
  • heat fusion methods such as ultrasonic fusion
  • mechanical entanglement methods such as needle punching and water jet
  • hot melt adhesives urethane adhesives and other adhesive methods
  • extrusion hot melt adhesives
  • urethane adhesives and other adhesive methods and extrusion.
  • Various known methods such as laminating can be adopted, and the present invention is not particularly limited.
  • the sheet material used for laminating the sheets is not limited in any way, and may be a bioabsorbable polymer such as cellulose, a thermoplastic resin, or polyglycolic acid, polylactic acid, or polyapple acid.
  • the thermoplastic resin can be a polyolefin-based resin, a polyester-based resin, or a polyamide-based resin, and specifically, ethylene, propylene, 1-butene, 1-hexene, 4-methyl-1-.
  • High-pressure low-density polyethylene linear low-density polyethylene (LLDPE), high-density polyethylene, polypropylene (propylene homopolymer), polypropylene random copolymer, which is a single or copolymer of ⁇ -olefins such as penten and 1-octene.
  • LLDPE linear low-density polyethylene
  • HPPE high-density polyethylene
  • polypropylene propylene homopolymer
  • polypropylene random copolymer which is a single or copolymer of ⁇ -olefins such as penten and 1-octene.
  • any one or a mixture of polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polypropylene, and polyethylene is suitable from the viewpoint of stability against heat and moisture and versatility.
  • thermoplastic resins are hydrophobic, and even if the structure is formed as a non-woven fabric, there is almost no one that absorbs water.
  • the variation in water absorption can be reduced by using a non-woven fabric composed of hydrophobic thermoplastic resin fibers and performing a hydrophilic treatment.
  • the method of hydrophilization is not particularly limited, and if it is a physical processing method, for example, hydrophilization by corona treatment or plasma treatment can be mentioned, and a chemical processing method, for example, introduction of a surface functional group, For example, a sulfonic acid group, a carboxylic acid group, or the like can be introduced by an oxidation treatment or the like, or a water-soluble polymer such as polyvinyl alcohol (PVA), a polyester resin, polystyrene sulfonic acid, or polyglutamic acid, and / or a surfactant.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • a treatment agent such as a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, or an amphoteric surfactant is impregnated and coated on a non-woven fabric by a dip nip method or a spray coating method.
  • a nonionic surfactant such as a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, or an amphoteric surfactant
  • examples thereof include known methods such as a method for In consideration of the water absorption required for the absorption pad, an appropriate hydrophilic processing method and conditions, for example, the amount of the treatment agent used and the amount of the functional group introduced can be selected.
  • the method for producing the non-woven fabric is not particularly limited, and examples thereof include spunbonded non-woven fabric, melt-blown non-woven fabric, wet non-woven fabric, dry non-woven fabric, dry pulp non-woven fabric, flash-spun non-woven fabric, and spread non-woven fabric.
  • the non-woven fabric made of ultrafine fibers melt-blown non-woven fabric and flash-spun non-woven fabric are preferable.
  • non-woven fabric used for laminating the sheets those having a basis weight of 20 g / m 2 or more and 200 g / m 2 or less, a thickness of 0.06 mm or more and 1.20 mm or less, and an average fiber diameter of 0.7 ⁇ m or more and 5.0 ⁇ m or less are preferable. Can be used for.
  • An example of a method for producing an absorption pad for an immunochromatographic diagnostic kit containing the carboxymethylated cellulose fiber of the present embodiment is shown below, but the method is not limited to this method.
  • the structure of the natural or regenerated cellulose fiber is stirred at 35 ° C. for 30 minutes while maintaining an alkaline state in an aqueous alcohol-containing sodium hydroxide solution.
  • sodium monochloroacetate containing alcohol is added, and the mixture is stirred at 30 ° C. to 55 ° C. for 1 to 12 hours.
  • the degree of substitution is controlled by the bath ratio of the reaction solution and the structure, the temperature, and the time.
  • reaction conditions can be appropriately changed in consideration of production cost and the like.
  • the obtained structure is adjusted to pH 6.0 to 8.0 with an aqueous acetic acid-containing ethanol solution, and then alcohol is replaced with 70 wt%, 90 wt%, or 100 wt% ethanol. If it contains even a small amount of water, it becomes hard, so by gradually increasing the alcohol concentration, alcohol replacement can be reliably performed and morphological stability can be maintained. Then, the mixture is immersed in an acid-containing ethanol solution adjusted to a predetermined concentration, stirred for 1 hour, alcohol-substituted with 70 wt%, 90 wt%, and 100 wt% ethanol, and dried to obtain a protonated sheet-like structure.
  • the mixture is immersed in an aqueous ethanol solution containing calcium hydroxide adjusted to a predetermined concentration, stirred for 1 hour, alcohol-substituted with 70 wt%, 90 wt%, and 100 wt% ethanol, and dried to obtain a sheet-shaped pad according to the embodiment of the present application. ..
  • the "diagnostic method” performed using the immunochromatographic diagnosis kit using the absorption pad for the immunochromatographic diagnosis kit of the present embodiment refers to various diagnoses performed using the immunochromatographic diagnosis kit in vitro.
  • the diagnostic target is not particularly limited, and can be used for inspections of various diagnostic targets such as human, animal, food, plant, and other environmental tests.
  • a sample sample is collected from the test target, if necessary, pretreated such as extraction and filtration, dropped onto the sample pad, wait for a predetermined time from the start of the test, and the substance to be tested The diagnosis result is judged from the color development that differs depending on the presence or absence.
  • the procedure is not limited to this, and can be used for diagnosis of similar procedures and principles. It is preferable that the sample sample is filtered in advance to remove excess foreign substances and impurities, which can be expected to further speed up the diagnosis and improve the diagnostic accuracy.
  • the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment is for easily detecting the presence or absence of a substance to be tested in various samples.
  • Types of diagnostic kits include lateral flow type and flow-through type. The type is not particularly limited as long as it uses a labeling reagent or an absorption pad, but is preferably a lateral flow type. Further, among the lateral flow types, there are a dipstick type and a cassette type, but these types are not particularly limited.
  • the configuration of the diagnostic kit is not particularly limited, and any configuration generally used in the art may be used.
  • the member is not particularly limited as long as it is used in the art, and for example, (a) sample pad, (b) conjugate pad (including antibody sensitization labeling reagent), and (e) chromatograph shown in FIG.
  • Examples include a graph medium film, (f) an absorbent pad, and (g) a mount. In addition, some of these members may be omitted if necessary.
  • the absorption pad is the part that finally absorbs the sample to be measured in immunochromatography
  • (c) is the test line (TL)
  • (d) is the control line ( CT).
  • examples of the general absorption pad of the prior art include cellulose filter paper, paper, glass fiber, and glass fiber.
  • the sample pad is the part that first receives the sample to be measured in immunochromatography.
  • sample pads include cellulose filter paper, paper, glass fiber, glass fiber, acrylic fiber, nylon fiber, and various woven fabrics.
  • pretreatment may be performed as necessary.
  • a buffer solution, a surfactant, a protein, a reagent for trapping impurities in a sample sample, a preservative, an antibacterial agent, an antioxidant, a hygroscopic agent, and the like may be contained in advance.
  • the conjugate pad is a part where labeled particles such as an antibody-sensitized labeling reagent are dried and immobilized.
  • labeled particles such as an antibody-sensitized labeling reagent are dried and immobilized.
  • general conjugate pads include glass fiber, glass fiber, acrylic fiber, PET fiber alone or composite non-woven fabric, and woven fabric.
  • pretreatment may be performed as necessary.
  • the labeling reagent fixed to the conjugate pad refers to a particulate matter that is insoluble in water, buffer solution, etc. and carries a dye, dye, etc.
  • the material constituting the particles is not particularly limited, and examples of such labeling reagents include metal colloidal particles such as gold colloid, platinum colloid, silver colloid, and selenium colloid, and styrene-based latex such as polystyrene latex and acrylic acid-based latex. Colored latex particles colored with, etc., colored silica particles colored silica composed of a three-dimensional structure composed of silicon atoms and oxygen atoms, colored cellulose particles colored with cellulose, labeling reagents in which colored components such as carbon black are directly granulated. , Magnetic particles, and the like. Further, the labeling reagent may be fluorescent luminescent particles.
  • the labeling reagent needs to support a substance that specifically binds to the substance to be detected, such as an antibody, but the method of supporting the substance is not particularly limited. For example, support by physical adsorption, support by covalent bond, support by a combination thereof, and the like can be mentioned. The type and amount of the substance to be carried are not particularly limited. Antibodies are the most common and preferable types of substances to be carried. Further, as the method of supporting, the support by physical adsorption is preferable from the viewpoint of ease, and the support by covalent bond is preferable from the viewpoint of stability and performance.
  • the target that can be diagnosed by the immunochromatographic diagnostic kit of the present embodiment is not particularly limited, but specific examples include the following: cancer markers, hormones, infectious diseases, autoimmunity, blood proteins, TDM, coagulation. ⁇ Fibrinolysis, amino acids, peptides, proteins, genes, cells, etc. More specifically, CEA, AFP, ferritillin, ⁇ 2 micro, PSA, CA19-9, CA125, BFP, elastase 1, pepsinogen 1.2, fecal occult blood, urinary ⁇ 2 micro, PIVKA-2, urinary BTA, insulin.
  • the chromatographic medium used in the immunochromatographic diagnostic kit is not particularly limited, and various commonly used chromatographic media can be used. Specific examples include a nitrocellulose membrane.
  • a dispersion of a labeling reagent adjusted to a predetermined concentration is prepared, a buffer solution and an antibody are added, and the mixture is stirred for a certain period of time while adjusting the temperature to adsorb the antibody to the labeling reagent.
  • the colored cellulose particles are blocked by further adding a blocking agent and stirring for a certain period of time while adjusting the temperature.
  • a blocking agent various blocking agents can be used depending on the composition of the substance to be tested, the sample, or the solution diluting the sample.
  • centrifugation is performed to separate the supernatant containing excess antibody and blocking agent from the precipitated particles, and the supernatant is removed by decantation.
  • a liquid such as a buffer solution is added to the precipitated particles, and if necessary, dispersion treatment is performed by ultrasonic waves or the like. Washing is performed a required number of times by a series of operations such as sedimentation by centrifugation, removal of supernatant, and addition of liquid to prepare a dispersion containing particles having antibody adsorption / blocking at a predetermined concentration.
  • a buffer solution, a surfactant, a protein, a reagent for trapping impurities in a sample sample, an antiseptic, an antibacterial agent, an antioxidant, a hygroscopic agent, etc. are applied to the regenerated cellulose continuous long fiber non-woven fabric as necessary, and dried. And prepare a sample pad.
  • a chromatographic medium made of a chromatographic medium film in which an antibody is immobilized at a predetermined position, and an absorption pad made of cellulose filter paper for absorbing a sample are prepared.
  • An immunochromatographic diagnostic kit is produced by immobilizing them on a sheet having an adhesive site called a backing sheet and cutting them into a predetermined size.
  • Equation (1) Calculated by ⁇ in the formula, f: 0.1 mol / L potassium hydroxide titer ⁇ .
  • the alkalinity is read as the acidity.
  • (Ii) Average Substitution Degree Weigh 0.5 to 0.7 g of a sample (anhydride) precisely, wrap it in filter paper, and incinerate it in a magnetic crucible. After cooling, transfer this to a 500 mL beaker, add about 250 mL of water and 35 mL of 0.05 mol / L sulfuric acid with a pipette, and boil for 30 minutes.
  • Equation (3) ⁇ In the formula, A: amount of 0.05 mol / L sulfuric acid consumed in 1 g of sample (mL), a: amount of 0.05 mol / L sulfuric acid used (mL), f: 0.05
  • the degree of substitution was calculated from the molar / L sulfuric acid titer, b: 0.1 molar / L potassium hydroxide titration (mL), f1: 0.1 molar / L potassium hydroxide titer ⁇ , and the average thereof.
  • N 3 or more
  • Liquid absorption C (g / 100 cm 2 ) (BA) x 4. .. .. Equation (4) ⁇ In the formula, A: weight in a dry state before immersion (g), B: weight after incubation for 30 minutes (g) ⁇ , the amount of liquid absorbed is calculated.
  • ⁇ Metsuke D (g / m 2 )> A non-woven fabric having an area of 0.5 m 2 or more is dried at 105 ° C. until it reaches a constant weight, and then left in a constant temperature room at 20 ° C. and 65% RH for 16 hours or more to measure the weight, and per unit area of the non-woven fabric. The weight was measured.
  • ⁇ Thickness> A value obtained by measuring a load of 1.96 kPa in a thickness test based on JIS-L1096.
  • ⁇ Release time (minutes)> Prepare a plurality of sets of test pieces in which absorption pads having a width of 4 mm and a length of 25 mm are stacked on a chromatographic medium made of nitrocellulose having a width of 4 mm and a length of 25 mm so as not to shift, and each test piece is prepared with physiological saline. 20 ⁇ L of each was gently and evenly dropped onto the absorption pad of. When time T1 (minutes) had elapsed from the completion of dropping the physiological saline, the absorption pad was removed from the chromatographic medium for one set of test pieces, and the surface condition of the chromatographic medium was visually observed.
  • the release time of the absorption pad was set to T1 (minutes).
  • T1 minutes
  • T2 minutes
  • T1 ⁇ T2 time T1 ⁇ T2
  • the release time was determined by repeating the above operation until a color change due to wetting was observed on the surface of the chromatographic medium. However, if no change in the color of the surface of the chromatographic medium due to liquid wetting is observed in any time from the completion of dropping the saline solution to the elapse of 900 minutes, the release time of the absorption pad is 900. It was a minute.
  • BG coloring ⁇ Background of immunochromatographic diagnostic kit (BG coloring)> An immunochromatographic kit cut to the appropriate width was placed in a plastic housing. Next, a 66 mM PBS containing 1 wt% BSA and a pH of 7.4 was prepared and used as a negative sample. Using the obtained diagnostic kit in a housing, 100 ⁇ L of a negative sample was dropped onto the sample dropping part of the diagnostic kit, and 5 minutes later, using an immunochromatographic reader C10066-10 manufactured by Hamamatsu Photonics, 1 between TL and CL. The color development intensity of the points (unit: mABS) was measured. Here, when the color development intensity is 20 mABS or more, it is determined that BG is colored. Here, the reason why the color is set to 20 mABS or more is that if the color is 20 mABS or more, the coloring can be confirmed visually.
  • mABS color development intensity
  • ⁇ Variation of test line (TL) color development intensity> Regarding the measurement of the TL color development intensity, 100 ⁇ L of the positive sample was dropped onto the sample dropping part of the diagnostic kit in the same manner as described above, and the color development intensity (mABS) of the test line after 5 minutes was measured by an immunochromatographic reader. This measurement was performed a total of 30 times, and the average color development intensity (mABS) was defined as the TL color development intensity.
  • an aqueous ethanol solution containing sodium monochloroacetate 300 g of water, 960 g of ethanol, 122.5 g of sodium monochloroacetate
  • the mixture was stirred at 30 or 50 ° C. for 1 to 12 hours.
  • it was dried to obtain a carboxymethylated sheet-like structure.
  • the sheet-like structure obtained above was adjusted to pH 6.0 to 8.0 with an acetic acid-containing ethanol aqueous solution (acetic acid: 37.5 g, distilled water: 375 g, ethanol: 875 g), and then once with 1375 g of a 70 wt% ethanol aqueous solution.
  • 90 wt% ethanol aqueous solution was washed once with 1250 g, and alcohol was replaced twice with 100 wt% ethanol 1250 g. Then, it is immersed in 1250 g (1 to 100 wt%) of an acetic acid-containing ethanol solution or 1250 g (2 to 5 wt%) of an aqueous ethanol solution, and after stirring for 1 hour, once with 1375 g of a 70 wt% ethanol aqueous solution and once with 1250 g of a 90 wt% ethanol aqueous solution.
  • Example 1 The average substitution degree, catch and release index, basis weight, thickness, and liquid absorption amount of the obtained sheet-like structures (samples 1 to 15) are shown in Table 1 below. These samples 1 to 15 were used as absorption pads.
  • a grass fiber conjugate pad (Ahlstrom, # 8951) was cut into a shape having a height of 10 mm and a length of 300 mm. Then, 1020 ⁇ L of the antibody-sensitized colloidal gold particle dispersion was evenly applied and dried at 50 ° C. for 60 minutes.
  • Sample pad pretreatment Sample pad ((Millipore, C048), PBS buffer containing a large excess of 2.0% by weight BSA (Sigma-Aldrich, A7906) and 2.0% by weight Tween-20®. It was impregnated with (66 mM, pH 7.4), excess liquid was removed, and then dried at 50 ° C. for 60 minutes. Subsequently, it was cut into a shape having a height of 18 mm and a length of 300 mm.
  • BSA Sigma-Aldrich, A7906
  • nitrocellulose membrane coated with capture antibody A nitrocellulose membrane (SHF0900425 manufactured by Millipore) was cut into a shape having a height of 25 mm and a length of 300 mm. Using a liquid coating device (Musashi Engineering Co., Ltd., 300DS), a PBS solution (66 mM, pH 7.4) containing 0.1 wt% anti-hCG- ⁇ mouse antibody (Medix Biochemica Co., Ltd., 6601) was added to 0.1 ⁇ L / mm. It was applied to a portion having a height of 7 mm in proportion.
  • a PBS solution (66 mM, pH 7.4) containing 0.1% by weight of an anti-mouse-rabbit antibody (Z0259 manufactured by Daco) was applied to a portion having a height of 12 mm at a ratio of 0.1 ⁇ L / mm. Subsequently, it was dried at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Examples 1 to 15 [Performance evaluation of immunochromatographic diagnostic kit] Samples 1 to 15 shown in Table 1 below were evaluated using each as an absorption pad. In the performance evaluation of the immunochromatographic diagnostic kit using an absorption pad having a width of 5 mm and a thickness of 0.2 mm or more, the developable amount of the developing solution is about 80 to 120 ⁇ L, so 100 ⁇ L was actually developed and evaluated. .. Further, in the case where the kit width is 2.5 mm or the absorption pad having a thickness of less than 0.2 mm is used, the deployable amount of the developing solution is about 30 to 80 ⁇ L, so 50 ⁇ L is actually developed and evaluated. did. The evaluation results are shown in Table 2 below. None of the diagnostic kits varied and did not cause reflux. In addition, all of the diagnostic kits had few detached fibers, and the safety in the process could be ensured.
  • Example 16 was prepared regenerated cellulose continuous filaments sheet-like structure (cupra sheet-like structure) (width 20 cm, 100 g / m 2 basis weight, thickness 0.9 mm).
  • Example 17 Prepare a regenerated cellulose continuous long fiber sheet-like structure (cupra sheet-like structure) (width 20 cm, 100 g / m 2 grain, thickness 1.0 mm), increase the amount of monochloroacetic acid used, and increase the degree of substitution. The treatment was carried out in the same manner as in Reference Example 1 except for the adjustment so as to obtain a sheet-like structure.
  • Example 18 The treatment was carried out in the same manner as in Reference Example 1 except that a regenerated cellulose continuous long fiber sheet-like structure (cupra sheet-like structure) (width 20 cm, 300 g / m 2 basis weight, thickness 4.0 mm) was prepared. A sheet-like structure was obtained.
  • a regenerated cellulose continuous long fiber sheet-like structure (cupra sheet-like structure) (width 20 cm, 300 g / m 2 basis weight, thickness 4.0 mm) was prepared. A sheet-like structure was obtained.
  • Example 19 A sheet-like structure was obtained by performing the same treatment as in Reference Example 1 except that a rayon short fiber sheet-like structure (width 20 cm, 300 g / m 2 basis weight, thickness 12.0 mm) was prepared.
  • Example 20 A sheet-like structure was obtained by performing the same treatment as in Reference Example 1 except that a rayon short fiber sheet-like structure (width 20 cm, 430 g / m 2 basis weight, thickness 6.7 mm) was prepared.
  • Sample 18 had a large variation in test results due to the catch-and-release index being too high. Since the sample 19 was too thick, the flexibility was impaired, the sample 19 could not be firmly bonded, and the variation became large. Since the basis weight of the sample 20 is too large, the flexibility is impaired, the handleability is remarkably lowered, the basis weight cannot be firmly bonded, and the variation becomes large. Backflow has occurred between the glass fiber absorbent pad and the conventionally used cellulose absorbent pad. In addition, when glass fiber is used, there are many desorbed fibers, and it is difficult to ensure safety in the process.
  • the immunochromatographic diagnostic kit using the absorption pad for the immunochromatographic diagnostic kit of the present invention has little variation in color development intensity and is excellent in reproducibility. Furthermore, since backflow can be prevented, it can be suitably used as an absorption pad for various immunochromatographic diagnostic kits.

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Abstract

検査結果の再現性に優れ、逆流を引き起こさないイムノクロマト診断キット用吸収パッドを提供する。本発明は、カルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドであって、該カルボキシメチル化されたセルロース繊維を構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．０５以上１．５以下であることを特徴とするイムノクロマト診断キット用吸収パッド、及びこれを含むイムノクロマト診断キットに関する。

Description

イムノクロマト診断キット用吸収パッド及びイムノクロマト診断キット
　本発明は、イムノクロマト診断キット用吸収パッドに関する。より詳しくは、本発明は、検査結果の再現性に優れ、逆流を引き起こさないイムノクロマト診断キット用吸収パッドに関する。
　近年、ウィルスや細菌等の病原体感染の有無、妊娠の有無、癌マーカーの有無、食品中の特定原材料や残留農薬などの有害物質の有無などの様々な検査を短時間で行う簡易検査試薬や診断薬、診断キットが開発されている。これらはそれぞれの検査対象物質と、検査対象物質に特異的に反応する物質による特異的反応が利用される。特に、抗原と抗体による抗原抗体反応を用いる免疫学的測定法は、イムノクロマト測定法、比濁免疫測定法、酵素免疫測定法、化学発光測定法、放射免疫測定法、表面プラズモン共鳴を用いる測定法など、多くの測定法が開発されている。そしてこれらの測定法は病院、診療所などでの病気などの検査や、食品会社などでの食物検査などに利用されている。中でもイムノクロマト測定法は、特別な設備、機器、知識を必要とせず操作も簡便で安価であり、迅速な診断が可能であるという特徴から非常に多くの検査が実施されている。近年では、妊娠検査薬やＨＩＶ検査薬などは一般薬局で市販され一般消費者でも測定できるようになり、更には検査対象物質の有無を検査する定性検査だけでなく量を測定する定量検査などもできるようになってきている。
　イムノクロマト測定法の測定原理としては、サンドイッチ法と呼ばれる方法や競合法と呼ばれる方法がある。また、測定形式としては、フロースルー型やラテラルフロー型と呼ばれる方法がある。検体中の検査対象物質としては様々な物質を検出することができるが、典型的な例としてはサンドイッチ法により抗原を検出する測定があり、以下のような操作が順次実行される。
　（１）検査対象物質である抗原に特異的に結合する抗体をクロマトグラフ媒体膜などのクロマトグラフ媒体の所定の部位に固定化し、クロマトグラフ媒体の任意の位置にテストライン（以下「ＴＬ」という。）と呼ばれる反応部位を形成する。
　（２）酵素、標識物質、蛍光標識物質、磁性粒子などの標識物質に、検査対象物質と特異的に結合する抗体を担持させた検出試薬を調製し、コンジュゲートパッドなどに検出試薬を塗布乾燥し、検出試薬含有部を形成させ、前記クロマトグラフ媒体と組み合わせてイムノクロマト診断キットを形成する。
　（３）抗原を含む検体そのもの、又はそれを任意の液体で希釈した溶液を前記イムノクロマト診断キットの所定の位置に、例えば、サンプルパッドに滴下し、抗原と検出試薬をクロマトグラフ媒体上に展開させる。
　これらの操作によって、反応部位においてクロマトグラフ媒体上に固定化された抗体に、抗原を介して標識物質が捕捉され、標識物質の信号を検出することでイムノクロマト診断キットによる診断を行う。
　上記イムノクロマトグラフ法による検査は、臨床現場においては、特に疾患の判定を正確に行うことが従来から強く求められている。例えば、急性冠症候群の診断に有用な検査項目がいくつかある。急性冠症候群の中でも、急性心筋梗塞は，冠動脈が血栓で閉塞され，心筋組織が壊死に陥る疾患であり，発症早期における再灌流の成否が予後に大きく影響する。そのため，正確性の高い診断が重要となる。この場合、診断に必要なマーカーを定量的に検出する必要があり、当然、当該診断で使用されるイムノクロマト診断キットは、イムノクロマト診断キット製品間の発色強度のバラツキが限りなく小さいことが必須である。仮に、発色強度のバラツキが大きいイムノクロマト診断キットを用いた場合、当然、誤診断に繋がり、上記疾患の場合においては、誤診断により、命の危険にさらされる可能性もある。これらより、イムノクロマト診断キット製品間のバラツキを限りなく小さくすることは、イムノクロマト診断キット開発における大きな課題の一つとなっている。
　バラツキの原因としてはキットを構成する各部材の影響が考えられるが、特に吸収パッドに関しては吸液を担う部分であるが故に、バックグラウンドの着色といった不具合による発色強度のバラツキの原因となっている。
　ここで「バックグラウンド」とは、標識試薬が、クロマトグラフ媒体膜の細孔に詰まったり、非特異吸着したりすることで、クロマトグラフ媒体膜が着色してしまい発生する現象である。バックグラウンドが悪いと、クロマトグラフ媒体膜とテストライン（ＴＬ）とのコントラストが悪くなり、ＴＬの発色したラインが見えづらくなってしまい、医療現場で判定しにくくなる。更に、バックグラウンドが悪いと、陰性のＴＬ（すなわち、発色無し）の判断が困難になってしまう。これら現象は、誤診断を引き起こしてしまう可能性がある。
　また、バックグラウンドの着色以外に誤診断を引き起こす問題となる一因として、判定後の標識試薬の逆流によるバックグラウンドの着色というものがある。一般的にイムノクロマト診断キットは、判定時間がそれぞれのイムノクロマト診断キットで定められているが、多忙を極めている臨床現場では、その判定時間丁度に判定できないことが往々にしてある。ここで、「標識試薬の逆流」とは、クロマトグラフ媒体の乾燥により、一旦吸収パッドに吸収された標識試薬が逆流し、クロマトグラフ媒体上を逆方向に展開してしまうことである。この逆流によって、バックグラウンドの着色や、更にはＴＬを汚してしまうことにより、誤診断を引き起こす可能性がある。
　イムノクロマト法の検査キットに用いられる吸収パットとしては、従来、セルロース繊維、ガラス繊維、パルプなどの繊維からなる綿、不織布、ろ紙などが用いられてきた。しかしながら、これらの素材のみで構成される吸収パッドは、その構造や構成素材、製造方法の影響を受け、吸水性が不十分であり、吸収量のバラツキが生じたり、逆流を引き起こしたりすることが問題となっていた。
　これらの問題を解決すべく、以下の特許文献１では、高吸水性ポリマー粒子を用いた吸収パッドを、そして以下の特許文献２では、シリカ粒子などをセルロース繊維などの不織布素材に噴霧した吸収パッドを用いることが検討されている。しかしながら、これらの吸収パッドの場合、繊維密度の均一化や噴霧量の均一化が困難であり、吸水性は改善されても製品間で吸水速度にバラツキが生じ易くなるため、製品間のバラツキの改善には至らないというのが現状である。
　また、従来の吸収パッドに起因するキット製造工程上の問題も報告されている。例えば、グラスファイバー製吸収パッドは、イムノクロマト診断キット生産工程における切断時に脱落繊維が粉塵として舞うことがある。これらグラスファイバーの粉塵は、吸い込んでしまうと気管支の炎症を起こす可能性があるが故に、製造作業員の健康被害の観点から、あまり使用を好まれないことがある。更には、カッティングモジュールの刃が欠けてしまうなどの不具合の報告も多い。これらの理由から、なるべくグラスファイバー製吸収パッドの使用は避けたい。
　このように、バラツキを最大限に抑制しながら、かつ逆流を引き起こさない吸収パッドが強く求められている。
特許第６１３４６１５号公報 特開２０１２－１８９３４６号公報
　かかる従来技術の水準に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、検査結果の再現性に優れ、逆流を引き起こさないイムノクロマト診断キット用吸収パッドを提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、吸収パッドとして、特定のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むことで、再現性が向上し、さらに逆流を抑制することを予想外に見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］カルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドであって、該カルボキシメチル化されたセルロース繊維を構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．０５以上１．５以下であることを特徴とするイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
　［２］前記パッドのキャッチアンドリリース指数が０．５以下である、前記［１］に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
　［３］前記パッドの目付が１０ｇ/ｍ2以上４００ｇ／ｍ2以下であり、かつ、厚みが０．０３ｍｍ以上１０．００ｍｍ以下である、前記［１］又は［２］に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
　［４］前記パッドの、生理食塩水に含浸させた際の吸液量が５ｇ／１００ｃｍ2以上５０ｇ／１００ｃｍ2以下である、前記［１］～［３］のいずれかに記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
　［５］前記パッドが、単層のシート又は積層したシートの形態にある、前記［１］～［４］のいずれかに記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
　［６］前記［１］～［５］のいずれかに記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッドを含むイムノクロマト診断キット。
　本発明のイムノクロマト診断キット用吸収パッドを用いたイムノクロマト診断キットは、検査結果の再現性に優れ、逆流を引き起こさないものとなる。
本発明の一実施形態としてのイムノクロマト診断キットの断面図である。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドは、カルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドであって、該カルボキシメチル化されたセルロース繊維を構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．０５以上１．５以下であることを特徴とする。
　イムノクロマト診断キットを用いて実施するイムノクロマトグラフ法による検査方法には、一般的に、被測定物を含む溶液を膜に対して垂直方向に通過させるフロースルー方式と、水平方向に通過させるラテラルフロー方式の２種類があるが、本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドは、これらのいずれの方式にも使用することができ、また吸水するというイムノクロマト診断キットのシステムという意味では、これらに限定されない。
　本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドに含まれるカルボキシメチル化されたセルロース繊維は、カルボキシメチル化した際のセルロースを構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．０５以上１．５以下である。平均置換度が高すぎると、展開してきた液を吸収した際、吸収パッドの前方部分にウォーターブロックを作ってしまう。それにより、展開液を十分量吸収しなくなり、更には展開不良を起こしてしまうため、検査ばらつきが生じる。平均置換度の上限は、好ましくは１．３以下であり、より好ましくは０．９以下である。さらに好ましくは０．６以下である。平均置換度が０．０５以上あれば、十分な吸液量を確保できる。平均置換度の下限は好ましくは０．１以上であり、より好ましくは０．２以上である。
　また、前記カルボキシメチル化されたセルロース繊維は、カルボキシメチル化した時点では、カルボキシメチル基の末端がナトリウム塩となっているが、その後、酸で処理して一部のカルボキシメチル基をプロトン型にすることができる。カルボキシメチル化されたセルロース繊維を部分的にプロトン化する方法には、特に制限はないが、アルコールを含有する溶媒を用いて所定の濃度に調整した酢酸、塩酸、硝酸に浸漬することによりプロトン化されることが好ましく、アルコールを含有する溶媒を用いて所定の濃度に調整した酢酸に浸漬することによりプロトン化されることがより好ましい。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドは、キャッチアンドリリース指数が０．５以下であることが好ましい。本明細書中、“キャッチアンドリリース指数”とは、付与された液体を吸収パッドが吸収する特性と、付与された液体を吸収パッドが保持する特性とのバランスを指標する指数であり、以下の式：
　　　キャッチアンドリリース指数　＝（１００×Ｃ÷Ｄ）÷　Ｔ
｛式中、Ｃ：吸液量（ｇ／１００ｃｍ2）、Ｄ：目付（ｇ／ｍ2）、Ｔ：リリース時間（分）｝により算出されるものである。キャッチアンドリリース指数が大きすぎると、一旦吸収パッドに吸収された標識試薬がクロマトグラフ媒体上を逆流したり、検査ばらつきが生じたりしてしまう。キャッチアンドリリース指数の上限は、より好ましくは０．３以下であり、さらに好ましくは０．１以下である。下限は、好ましくは０．０００１以上であり、より好ましくは０．００１以上である。キャッチアンドリリース指数は、前記カルボキシメチル化されたセルロース繊維の平均置換度、平均繊維径、繊維長など、および／または前記カルボキシメチル化されたセルロース繊維を含む吸収パッドの形態などをコントロールすることにより調整することができる。
　また本明細書中、“リリース時間”とは、幅４ｍｍ×長さ２５ｍｍのクロマトグラフ媒体上に、幅４ｍｍ×長さ２５ｍｍの吸収パッドをずれの無いよう重ね置き、２０μＬの生理食塩水を該吸収パッド上に静かに満遍なく滴下した際の、吸収パッドからクロマトグラフ媒体に生理食塩水が移行し始めるまでに要した時間を分単位で表した数値をいう。なお、“リリース時間”の測定には、吸収パッド寸法と生理食塩水の液量との関係性が上述の方法と同等となる方法であれば、上述の方法とは異なる吸収パッド寸法および生理食塩水の液量を用いてもよい。
　前記カルボキシメチル化されたセルロース繊維の平均繊維径は、１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。平均繊維径が太すぎると、展開してきた液を吸収した際、吸収パッドの前方部分にウォーターブロックを作ってしまう。それにより、展開液を十分量吸収しなくなり、更には展開不良を起こしてしまうため、検査ばらつきが生じる。繊維径の上限は、好ましくは８０μｍ以下であり、より好ましくは７０μｍ以下である。平均繊維径が１μｍ以上あれば、十分な吸液量を確保できる。平均繊維径の下限は好ましくは３μｍ以上であり、より好ましくは５μｍ以上である。尚、平均繊維径は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＥＯＬ社製）を使用して、Ｎ＝１０で測定した繊維径の平均値を平均繊維径とした。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断薬キット用吸収パッドの形態が織物状、編物状又は不織布状の形態にあることができ、例えば、不織布の形態である場合、その目付（ｇ/ｍ2）（すなわち、不織布重量（ｇ)／不織布面積（ｍ2））は、１０ｇ／ｍ2以上４００ｇ／ｍ2以下であることが好ましい。目付が低すぎると、イムノクロマト診断薬の吸収パッドとして十分な吸液量が得られない。目付の下限は、より好ましくは２０ｇ／ｍ2以上、さらに好ましくは３０ｇ／ｍ2以上である。他方、目付が高すぎると、柔軟性が損なわれ、イムノクロマト診断キット製造時の取扱いが著しく損なわれ、結果として診断結果のばらつきにつながる。目付の上限は、より好ましくは３５０ｇ／ｍ2以下、さらに好ましくは３００ｇ／ｍ2以下，よりさらに好ましくは２５０ｇ／ｍ2以下、よりさらに好ましくは２００ｇ／ｍ2以下、よりさらに好ましくは１９０ｇ／ｍ2以下、よりさらに好ましくは１８０ｇ／ｍ2以下である。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドの厚みは、例えば、織物状又はシート状である場合、０．０３ｍｍ以上１０．００ｍｍ以下であることが好ましい。パッドの厚みが厚すぎると、例えば、イムノクロマト診断キットに使用する際、ハウジングへの収納が困難になり、結果として診断結果のばらつきが大きくなる。パッドの厚みの上限は、より好ましくは９．００ｍｍ以下、さらに好ましくは８．００ｍｍ以下である。他方、シートが薄すぎると、イムノクロマト診断キットの吸収パッドとして十分な吸液量が確保できない。パッドの厚みの下限は、より好ましくは０．０５ｍｍ以上、さらに好ましくは０．１０ｍｍ以上である。本明細書中、パッドの“厚み”とは、ＪＩＳ－Ｌ１０９６に準拠する厚み試験にて、荷重を１．９６ｋＰａとして測定して得られた値をいう。
　本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドは、生理食塩水に含浸させた際の吸液量が５ｇ／１００ｃｍ2以上５０ｇ／１００ｃｍ2以下であることが好ましい。吸液量が大きすぎると、イムノクロマト診断キットに使用する際、吸液すると構造が崩れてしまって展開不良を起こしてしまう。吸液量の上限は、好ましくは５０ｇ／１００ｃｍ2以下、より好ましくは３０ｇ／１００ｃｍ2以下である。吸液量が５ｇ／１００ｃｍ2未満であると、所望の効果が発揮できず、逆流を起こしてしまう恐れがある。吸液量の下限は、好ましくは５ｇ／１００ｃｍ2以上、より好ましくは１０ｇ／１００ｃｍ2以上である。
　前記カルボキシメチル化されたセルロース繊維の原料となる（カルボキシメチル化前の）セルロース繊維としては、特に制限はなく、銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨン、リヨセル、コットン、パルプ、ポリノジックなどの公知のセルロース繊維、好ましくは銅アンモニアレーヨン、ビスコースレーヨン、より好ましくは銅アンモニアレーヨンが挙げられる。セルロース繊維の素材には、重合度の低いものがあり、このような素材では置換度を高くすると繊維が分解しやすく極力低い置換度に抑える必要があるのに対し、銅アンモニアレーヨンを用いると、重合度が高く、比較的高置換度においても崩壊しにくいという利点があり幅広い置換度を選択することが可能である。
　前記セルロース繊維としては長繊維又は短繊維のいずれでもよい。長繊維では連続長繊維が好ましい。本明細書中、長繊維とは、繊維長が１０ｍｍ以上のものをいい、繊維長は、好ましくは２０ｍｍ以上であり、より好ましくは５０ｍｍ以上であり、さらに好ましくは連続長繊維である。短繊維セルロースシートは、短繊維であることから、置換度を高くすると繊維が分離しやすく極力低い置換度に抑える必要があるのに対し、連続長繊維シートを用いると比較的高置換度においても崩壊しにくいという利点があり幅広い置換度を選択することが可能である。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドの形態としては、綿状、織物状、編物状又は不織布状の形態であることが好ましく、より好ましくは、カルボキシメチル化された再生セルロース繊維の織物又不織布、さらに好ましくはカルボキシメチル化再生セルロース繊維の不織布の形態である。不織布状の形態であれば、湿潤時にゲル化した状態でも繊維が交絡しているため、湿潤時の強度を維持した状態で高い吸液性を得ることができ、イムノクロマト診断キット用吸収パッドとして好適に使用することできる。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドには、所望の作用効果を害さない範囲で天然又は再生セルロース繊維由来以外の繊維、例えば、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維等の合成繊維や、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリリンゴ酸等の生体吸収性繊維が含まれていてもよい。所望の効果を害さない範囲としては、このような素材が５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましい。このような繊維は長繊維でも短繊維でもよい。長繊維としては連続長繊維が好ましい。
　本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドは、種々用途に応じて、シートをさらに積層したものであってもよい。不織布を積層する場合、熱エンボス加工、超音波融着等の熱融着法、ニードルパンチ、ウォータージェット等の機械的交絡法、ホットメルト接着剤、ウレタン系接着剤等の接着剤による方法、押出しラミネート等をはじめ、種々公知の方法を採用することができ、特に限定されるものではない。
　シートの積層に用いられるシート素材は、何ら限定されるものではなく、セルロース、熱可塑性樹脂や、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリリンゴ酸等の生体吸収性ポリマーであってもよい。その中で、熱可塑性樹脂としては、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂であることができ、具体的には、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ヘキセン、４－メチル－１－ペンテン、１－オクテン等のα－オレフィンの単独若しくは共重合体である高圧法低密度ポリエチレン、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン（プロピレン単独重合体）、ポリプロピレンランダム共重合体、ポリ１－ブテン、ポリ４－メチル－１－ペンテン、エチレン・プロピレンランダム共重合体、エチレン－１－ブテンランダム共重合体、プロピレン－１－ブテンランダム共重合体等のポリオレフィン、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート等）、ポリアミド（ナイロン－６、ナイロン－６６、ポリメタキシレンアジパミド等）、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、アイオノマー、これらの混合物等を例示することができる。特に、本実施形態に使用する場合、熱や水分に対する安定性や汎用性の点から、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレンのいずれか、または混合物が好適である。
　一般的に熱可塑性樹脂は疎水性のものが多く、不織布として構造形成しても吸水するものは、ほとんどない。本実施形態では、疎水性の熱可塑性樹脂の繊維から構成される不織布を使用し、親水化処理を行うことで、吸水のバラツキを低減させることができることが分かっている。親水化の方法については特に限定せず、物理的な加工方法であれば、例えば、コロナ処理又はプラズマ処理による親水化が挙げられ、また、化学的な加工方法、例えば、表面官能基の導入、例えば、酸化処理等によりスルホン酸基、カルボン酸基等を導入することや、水溶性高分子、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエステル系樹脂、ポリスチレンスルホン酸、若しくはポリグルタミン酸、及び／又は界面活性剤、例えば、ノニオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、若しくは両イオン性界面活性剤等の処理剤を不織布にディップニップ法やスプレーコート法などで含浸、コーティングする方法など公知の方法が挙げられる。吸収パッドに必要な吸水性を考慮して、適切な親水化加工方法及び条件、例えば、処理剤の使用量及び官能基の導入量等を選択することができる。
　シートの積層に不織布を用いる場合、その不織布の製法には特に制限はなく、スパンボンド不織布、メルトブローン不織布、湿式不織布、乾式不織布、乾式パルプ不織布、フラッシュ紡糸不織布、開繊不織布等が挙げられ、特に、極細繊維からなる不織布として、メルトブローン不織布やフラッシュ紡糸不織布が好ましい。
　シートの積層に用いる不織布としては、目付が２０ｇ／ｍ2以上２００ｇ／ｍ2以下、厚みが０．０６ｍｍ以上１．２０ｍｍ以下、そして平均繊維径が０．７μｍ以上５．０μｍ以下のものが好適に使用できる。
　本実施形態のカルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドの製造方法例を以下に示すが、この方法に限定されるものではない。
　天然又は再生セルロース繊維の構造体をアルコール含有水酸化ナトリウム水溶液中でアルカリ状態を維持しながら、３５℃で３０分攪拌する。その後、反応容器中の試薬を排液した後、アルコールを含むモノクロロ酢酸ナトリウムを添加し、３０℃～５５℃で１～１２時間撹拌する。その際の、置換度の制御は、反応液と構造体の浴比、温度、及び時間により制御する。また、その他の反応条件は、生産コスト等も考慮しながら適宜変更することができる。得られた構造体を酢酸含有エタノール水溶液でｐＨ６．０～８．０に調整した後、７０ｗｔ％、９０ｗｔ％、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行なう。少しでも水分を含むと硬くなるので、徐々にアルコール濃度を上げていくことで、アルコール置換を確実に行い、形態安定性を維持することができる。その後所定の濃度に調整した酸含有エタノール溶液に浸漬し、１時間撹拌し、７０ｗｔ％、９０ｗｔ％、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行ない、乾燥させ、プロトン化したシート状構造体を得る。さらに所定の濃度に調整した水酸化カルシウム含有エタノール水溶液に浸漬し、１時間撹拌し、７０ｗｔ％、９０ｗｔ％、１００ｗｔ％エタノールでアルコール置換を行ない、乾燥させ、本願実施形態のシート状のパッドを得る。
　本実施形態のイムノクロマト診断キット用吸収パッドを用いるイムノクロマト診断キットを用いて実施する「診断方法」とは、インビトロにおいて、イムノクロマト診断キットを用いて行われる様々な診断を指す。診断対象は特に限定されるものではなく、人用、動物用、食品用、植物用、その他環境検査など様々な診断対象の検査に用いることができる。一般的な診断の手順では、検査対象から検体試料を採取し、必要であればそれを抽出やろ過などの前処理を行い、サンプルパッドに滴下し、検査開始から所定時間待ち、検査対象物質の有無によって異なる発色より診断結果を判断する。もちろんこの手順に限定されず、同じような手順、原理の診断にも用いることができる。好ましいのは、検体試料を予めろ過しておくことで余分な異物や夾雑物を除去でき、それによりより一層の診断の迅速化や、診断精度の向上が期待できる。
　本実施形態のイムノクロマト診断キットとは、様々な検体中の検査対象物質の有無を簡便に検出するためのものである。診断キットの種類としては、ラテラルフロー式やフロースルー式がある。標識試薬や吸収パッドを用いるものであれば特に限定されないが、好ましくはラテラルフロー式である。また、ラテラルフロー式の中でも、ディップスティックタイプとカセットタイプがあるが、それらのタイプは特に限定されない。診断キットの構成は、特に限定されるものではなく、当該分野で一般的に用いられる構成であればいずれでも構わない。部材としては、当該分野で用いられるものであれば特に限定されず、例えば、図１に示す(a)サンプルパッド、(b)コンジュゲートパッド（抗体感作標識試薬を含む）、(e)クロマトグラフ媒体膜、(f)吸収パッド、及び(g)台紙が挙げられる。また、必要に応じそれら部材を一部省いていても構わない。
　図１に示すように、(f)吸収パッドとは、イムノクロマトにおいて測定対象である検体を最後に吸収する部分であり、(c)は、テストライン（ＴＬ）、（d)は、コントロールライン（ＣＴ）である。尚、前記したように、従来技術の一般的な吸収パッドとしては、セルロース濾紙、紙、ガラス繊維、グラスファイバーなどが挙げられる。
　サンプルパッドは、イムノクロマトにおいて測定対象である検体を最初に受け取る部分である。一般的なサンプルパッドとしては、セルロース濾紙、紙、ガラス繊維、グラスファイバー、アクリル繊維、ナイロン繊維、各種織物などが挙げられる。また、必要に応じて前処理を行っても構わない。例えば、緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを予め含ませるなどの処理を行っても構わない。
　コンジュゲートパッドは、抗体感作標識試薬等の標識粒子を乾燥固定化しておく部分である。一般的なコンジュゲートパッドとしては、ガラス繊維、グラスファイバー、アクリル繊維、ＰＥＴ繊維単体又は複合した不織布、織布などが挙げられる。また、必要に応じて前処理を行っても構わない。
　コンジュゲートパッドに固定される標識試薬とは、水、緩衝液などに不溶性であり、色素や染料等が担持された粒子状物質を指す。粒子を構成する素材は特に限定されないが、このような標識試薬としては、例えば、金コロイド、白金コロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどの金属コロイド粒子、ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックスやアクリル酸系ラテックス等を着色した着色ラテックス粒子、ケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体からなるシリカを着色した着色シリカ粒子、セルロースを着色した着色セルロース粒子、カーボンブラックなどの着色成分をそのまま粒子化した標識試薬、磁性粒子、などが挙げられる。また、前記標識試薬は蛍光発光性粒子でも構わない。
　標識試薬は、抗体などの被検出物に特異的に結合する物質を担持する必要があるが、その担持方法は特に限定されない。例えば、物理的な吸着による担持、共有結合による担持、それらの組み合わせによる担持などが挙げられる。担持する物質の種類や量も特に限定されない。担持する物質の種類としては抗体が最も一般的であり好ましい。また、担持する方法としては、容易さの観点からは物理的な吸着による担持が、安定性や性能などの観点からは共有結合による担持が好ましい。
　本実施形態のイムノクロマト診断キットで診断できる対象は、特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞など。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ－２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ－１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１－ＡＣ、α１－Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ－１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、その他の各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、各種アレルゲン、各種残留農薬、各種有害物が挙げられる。
　イムノクロマト診断キットに用いられるクロマトグラフ媒体は特に限定されるものではなく、一般的に用いられる様々なクロマトグラフ媒体を用いることができる。具体的には、ニトロセルロースメンブレンが挙げられる。
　以下、イムノクロマト診断キットの作製方法の一例について説明する。
　所定の濃度に調整した標識試薬の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、標識試薬に抗体を吸着させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、着色セルロース粒子のブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。抗体吸着・ブロッキング後の標識試薬を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着・ブロッキングを行った粒子を所定の濃度含有した分散液を調製する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をグラスファイバー製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調製する。また再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したクロマトグラフ媒体膜製のクロマトグラフ媒体、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有するシートに固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
　以下、本発明を実施例、比較例により具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
＜平均置換度の測定＞
（ｉ）酸度、アルカリ度
　試料（無水物）約１ｇを３００ｍＬ三角フラスコに精密にはかりとり、水を約２００ｍＬ加えて溶かす。これに０．０５モル/Ｌ硫酸５ｍＬをピペットで加え、１０分間煮沸した後冷却して、フェノールフタレイン指示薬を加え、０．１モル/Ｌ水酸化カリウムで滴定する（ＳｍＬ）。同時に空試験を行い（ＢｍＬ）、下記式（１）： 
　　　アルカリ度＝｛（Ｂ－Ｓ）×ｆ｝／試料無水物重量（ｇ）　．．．　式（１）
｛式中、ｆ：０．１モル／Ｌ水酸化カリウム力価｝によって算出する。
　ここで、（Ｂ－Ｓ）×ｆ値が（－）の時にはアルカリ度を酸度と読み変える。
（ｉｉ）平均置換度
　試料（無水物）０．５～０．７gを精密にはかり、ろ紙に包んで磁製ルツボ中で灰化する。冷却したのち、これを５００ｍＬビーカーに移し、水を約２５０ｍＬ、さらにピペットで０．０５モル/Ｌ硫酸３５ｍＬを加えて３０分間煮沸する。これを冷却し、フェノールフタレイン指示薬を加えて、過剰の酸を０．１モル/Ｌ水酸化カリウムで逆滴定して、下記式（２）と（３）：
　　　Ａ＝（ａ×ｆ－ｂ×ｆ１）／試料無水物重量（ｇ）－アルカリ度（又は＋酸度）　．．．　式（２）
　　　置換度＝（１６２×Ａ）／（１００００－８０×Ａ）　．．．　式（３）
｛式中、Ａ：試料１ｇ中の結合アルカリに消費された０．０５モル／Ｌ硫酸の量（ｍＬ）、ａ：０．０５モル／Ｌ硫酸の使用量（ｍＬ）、ｆ：０．０５モル／Ｌ硫酸の力価、ｂ：０．１モル／Ｌ水酸化カリウムの滴定量（ｍＬ）、ｆ１：０．１モル／Ｌ水酸化カリウムの力価｝により置換度を算出し、その平均値(Ｎ＝３以上)を平均置換度とする。
＜吸液量Ｃ（ｇ／１００ｃｍ2））＞
　シート状構造体の吸液性を、自由な形態変化を許した条件のもとで測定した。具体的にはシート状構造体を５ｃｍ×５ｃｍに切断し、シャーレに配置する。その後、サンプル重量の５０倍量の生理食塩水を３７℃に加温した後、添加し、３７℃の恒温機内で３０分間静置する。その後インキュベート前後の重量から下記式（４）：
　　　吸液量Ｃ（ｇ／１００ｃｍ2）＝（Ｂ－Ａ）×４　．．．　式（４）
｛式中、Ａ：浸漬前の乾燥状態での重量（ｇ）、Ｂ：３０分間インキュベート後の重量（ｇ）｝により、吸液量を算出する。
＜目付Ｄ（ｇ／ｍ2）＞
　０．５ｍ2以上の面積の不織布を、１０５℃で一定重量になるまで乾燥後、２０℃、６５％ＲＨの恒温室に１６時間以上放置してその重量を測定し、不織布の単位面積当たりの重量を測定した。
＜厚み＞
　ＪＩＳ－Ｌ１０９６に準拠する厚み試験にて、荷重を１．９６ｋＰａとして測定して得られる値をいう。
＜リリース時間（分）＞
　幅４ｍｍ×長さ２５ｍｍの、ニトロセルロースからなるクロマトグラフ媒体上に、幅４ｍｍ×長さ２５ｍｍの吸収パッドをずれの無いよう重ね置いた試験片を複数組用意し、生理食塩水を各試験片の吸収パッド上に２０μＬずつ静かに満遍なく滴下した。生理食塩水の滴下完了から時間Ｔ１（分）が経過したとき、１組の試験片に対し、吸収パッドをクロマトグラフ媒体上から取り外してクロマトグラフ媒体の表面状態を目視観察した。このとき、生理食塩水で濡れることにより色が変化した部分がクロマトグラフ媒体表面にあると認められた場合は、当該吸収パッドのリリース時間をＴ１（分）とした。一方、色が変化した部分があると認められなかった場合は、生理食塩水の滴下完了から時間Ｔ２（分）（ただし、Ｔ１＜Ｔ２）が経過したときに、時間Ｔ１（分）経過後に確認した試験片とは異なる１組の試験片に対して、前記と同様の方法でクロマトグラフ媒体表面の色の変化を判断した。以上の操作を、濡れによる色の変化がクロマトグラフ媒体表面に認められるようになるまで繰り返すことで、リリース時間を決定した。ただし、生理食塩水の滴下完了から９００分が経過するまでの間のいずれの時間においても液濡れによるクロマトグラフ媒体表面の色の変化が認められなかった場合は、当該吸収パッドのリリース時間を９００分とした。
＜イムノクロマト診断キットのバックグラウンド（ＢＧ着色）＞
　適切な幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。次に、１重量％ＢＳＡを含む６６ｍＭ、ｐＨ７．４のＰＢＳを調製し、陰性検体とした。得られたハウジング入りの診断キットを用い、１００μＬの陰性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、５分後に、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダーＣ１００６６－１０を用い、ＴＬとＣＬの間の１点の発色強度（単位はｍＡＢＳ）を測定した。ここで発色強度が２０ｍＡＢＳ以上の場合をＢＧが着色していると判断した。ここで２０ｍＡＢＳ以上とした理由は、２０ｍＡＢＳ以上になれば目視で確実に着色を確認できるからである。
＜イムノクロマト診断キットの逆流確認＞
　逆流の確認については、上記バックグラウンドの確認実験と同様の方法で実施した。適切な幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れ、次に、１重量％ＢＳＡを含む６６ｍＭ、ｐＨ７．４のＰＢＳを調製し、陰性検体とした。得られたハウジング入りの診断キットを用い、１００μＬの陰性検体を診断キットのサンプル滴下部に滴下し、２０分後に、ＴＬとＣＬの間の１点の発色強度（単位はｍＡＢＳ）を測定した。ここで発色強度が２０ｍＡＢＳ以上の場合をＢＧが着色していると判断した（判定は×と記録）。着色していない場合は〇と記録した。
＜テストライン（ＴＬ）発色強度のばらつき＞
　ＴＬ発色強度の測定については、上記と同じく陽性検体１００μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、５分後のテストラインの発色強度（ｍＡＢＳ）をイムノクロマトリーダーにより測定した。この測定を計３０回行い、平均の発色強度（ｍＡＢＳ）をＴＬ発色強度とした。
　また、同時にＴＬ発色強度の標準偏差を求め、再現性を表す指標％ＣＶは下記式（５）：
　　　％ＣＶ＝（ＴＬ発色強度の標準偏差／ＴＬ発色強度）×１００　．．．　式（５）
により算出した。
［参考例１（サンプル１～１５）］
　再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（サンプル１～１２）、キュプラ短繊維不織布（サンプル１３）、リヨセル短繊維不織布（サンプル１４）、及びレーヨン短繊維不織布（サンプル１５）（幅２０ｃｍ、各目付、各厚み０．２～７．０ｍｍ）：１００ｇを反応容器に入れ、その後、水酸化ナトリウム含有エタノール水溶液（水：８７５ｇ、エタノール８７５ｇ、ＮａＯＨ：１６２.５ｇ）を加えた後、３５℃で３０分撹拌した。次に、反応容器中の試薬を排液した後、モノクロロ酢酸ナトリウム含有エタノール水溶液（水３００ｇ、エタノール９６０ｇ、モノクロロ酢酸ナトリウム１２２．５ｇ）を添加し、３０又は５０℃で１～１２時間攪拌した。その後、乾燥させ、カルボキシメチル化したシート状構造体を得た。上述で得たシート状構造体を酢酸含有エタノール水溶液（酢酸：３７．５ｇ、蒸留水：３７５ｇ、エタノール：８７５ｇ）でｐＨ６．０～８．０に調整した後、７０ｗｔ％エタノール水溶液１３７５ｇで１回、９０ｗｔ％エタノール水溶液１２５０ｇで１回洗浄し、１００ｗｔ％エタノール１２５０ｇで２回アルコール置換を行なった。その後酢酸含有エタノール溶液１２５０ｇ（１～１００ｗｔ％）又は塩酸含有エタノール水溶液（２～５ｗｔ％）に浸漬し、１時間撹拌した後、７０ｗｔ％エタノール水溶液１３７５ｇで１回、９０ｗｔ％エタノール水溶液１２５０ｇで１回洗浄し、１００ｗｔ％エタノール１２５０ｇで２回アルコール置換を行ない、乾燥させ、更に１０５℃、６ｈ又は１２０℃、３ｈの条件下で熱風乾燥機に入れ、シート状構造体を得た。得られたシート状構造体（サンプル１～１５）の平均置換度、キャッチアンドリリース指数、目付、厚み、及び吸液量を以下の表１に示す。これらサンプル１～１５を、吸収パッドとして使用した。
［抗体感作金コロイド粒子の調製］
　金コロイド粒子懸濁液（田中貴金属社製、平均粒子径４０ｎｍ、粒子濃度０．００６ｗｔ％、平均粒子径４０ｎｍ）２５００μＬに、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を６００μＬ加え、更に抗ｈＣＧ-αマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、モノクローナル抗体）の０．１％水溶液を２００μＬ加えて、ボルテックスで攪拌する。続いて、２５℃で１０分間、温調しながら攪拌した。上記懸濁液に１％のＰＥＧ水溶液を３００μＬ、１０％のＢＳＡ水溶液（ｐＨ９．０、５０ｍＭホウ酸含有）を６００μＬ添加し、ボルテックスで攪拌した。その後、遠心分離操作（１００００ｇ、３０分間）を行い、上澄み液を除去した。その残渣に、１％ＢＳＡ水溶液（０．０５％ＰＥＧ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．２、２０ｍＭトリス含有）を１１０００μＬ添加し、ボルテックスで撹拌した。その後、遠心分離操作（１００００ｇ、３０分間）を行い、上澄み液を除去した。その残渣に、１％ＢＳＡ水溶液（０．０５％ＰＥＧ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．２、２０ｍＭトリス含有）を９００μＬ添加し、超音波処理を３０秒間行った。
［コンジュゲートパッドへの標識試薬の含浸、乾燥］
　グラスファーバー製コンジュゲートパッド（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社製、＃８９５１）を高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。その後、抗体感作金コロイド粒子分散液を１０２０μＬ均等に塗布し、５０℃で６０分乾燥させた。
［サンプルパッドの前処理］
　サンプルパッド（（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０４８）を、大過剰の２．０重量％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と２．０重量％のＴｗｅｅｎ－２０（登録商標）を含有するＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いたのちに５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ１８ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。
［捕捉抗体塗布ニトロセルロース膜の調製］
　ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＨＦ０９００４２５）を高さ２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１重量％抗ｈＣＧ-βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、６６０１）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ７ｍｍの部分に塗布した。続いて０．１重量％の抗マウス-ウサギ抗体（Ｄａｃｏ社製、Ｚ０２５９）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ｐＨ７．４）を０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１２ｍｍの部分に塗布した。続いて３７℃で３０分乾燥させた。
［イムノクロマト診断キットの調製］
　バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、調製した捕捉抗体塗布ニトロセルロース膜、参考例１で製造した吸収パッド（サンプル１～１５）、標識試薬を含有したコンジュゲートパッド、サンプルパッドを張り合わせた。続いて裁断機にて５ｍｍの幅にカットし、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍのイムノクロマト診断キットを得た。
［実施例１～１５］
［イムノクロマト診断キットの性能評価］
　以下の表１に示すサンプル１～１５を、それぞれ吸収パッドとして用いて評価した。イムノクロマト診断キット幅を５ｍｍ、かつ、厚みが０．２ｍｍ以上の吸収パッドを用いたものの性能評価においては、展開液の展開可能量がおよそ８０～１２０μＬとなるため、実際に１００μＬを展開し評価した。また、キット幅を２．５ｍｍにしたもの、又は厚みが０．２ｍｍ未満の吸収パッドを用いたものでは、展開液の展開可能量がおよそ３０～８０μＬとなるため、実際に５０μＬを展開し評価した。評価結果を以下の表２に示す。いずれの診断キットもばらつきが少なく、逆流を引き起こさなかった。また，いずれの診断キットも脱離繊維が少なく、工程上の安全性を確保できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［サンプル１６］
　再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（幅２０ｃｍ、１００ｇ/ｍ2目付、厚み０．９ｍｍ）を用意した。
［サンプル１７］
　再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（幅２０ｃｍ、１００ｇ/ｍ2目付、厚み１．０ｍｍ）を用意し、使用するモノクロロ酢酸の使用量を増やして、置換度が大きくなるように調整した以外は、参考例１と同様の方法で処理を実施し、シート状構造体を得た。
［サンプル１８］
　再生セルロース連続長繊維シート状構造体（キュプラシート状構造体）（幅２０ｃｍ、３００ｇ/ｍ2目付、厚み４．０ｍｍ）を用意した以外は、参考例１と同様の方法で処理を実施し、シート状構造体を得た。
［サンプル１９］
　レーヨン短繊維シート状構造体（幅２０ｃｍ、３００ｇ/ｍ2目付、厚み１２．０ｍｍ）を用意した以外は、参考例１と同様の処理を行い、シート状構造体を得た。
［サンプル２０］
　レーヨン短繊維シート状構造体（幅２０ｃｍ、４３０ｇ/ｍ2目付、厚み６．７ｍｍ）を用意した以外は、参考例１と同様の処理を行い、シート状構造体を得た。
［比較例１～７］
［イムノクロマト診断キットの性能評価］
　以下の表３に示すサンプル１６～２０を、それぞれ、用いて評価した。上記サンプル１６～２０及び、グラスファイバー製吸収パッド（７４ｇ/ｍ2目付、厚み０．５ｍｍ）、セルロース製吸収パッド（１８０ｇ/ｍ2目付、厚み０．５１ｍｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の方法で評価を実施した。評価結果を以下の表４に示す。その結果、カルボキシメチル化していないサンプル１６は逆流を引き起こし、平均置換度が本願範囲を上回っているサンプル１７は、展開中に吸収パッドのゲルが崩壊し、ばらつきが大きくなってしまった。サンプル１８は、キャッチアンドリリース指数が高すぎるせいで、検査結果のばらつきが大きくなった。サンプル１９は、厚みが厚すぎるせいで柔軟性が損なわれ、しっかりと貼り合わせができず、ばらつきが大きくなった。サンプル２０は目付が大きすぎるせいで柔軟性が損なわれ、取扱い性が著しく低下し、しっかりと貼り合わせができず、ばらつきが大きくなった。グラスファイバー製吸収パッドと従来から使用されているセルロース製吸収パッドは、逆流が生じてしまった。また、グラスファイバーを用いると脱離繊維が多く、工程上の安全性確保が困難であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明のイムノクロマト診断キット用吸収パッドを用いたイムノクロマト診断キットは、発色強度のバラツキが少なく再現性に優れるものとなる。更には、逆流も防止できるため、各種イムノクロマト診断キットの吸収パットとして好適に利用可能である。
(a)　サンプルパッド
(b)　コンジュゲートパッド（抗体感作標識試薬を含む）
(c)　テストライン（ＴＬ）
(d)　コントロールライン（ＣＴ）
(e)　クロマトグラフ媒体膜サンプルパッド
(f)　吸収パッド
(g)　台紙

Claims (6)

  1. 　カルボキシメチル化されたセルロース繊維を含むイムノクロマト診断キット用吸収パッドであって、該カルボキシメチル化されたセルロース繊維を構成するグルコース単位中の水酸基の平均置換度が０．０５以上１．５以下であることを特徴とするイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
  2. 　前記パッドのキャッチアンドリリース指数が０．５以下である、請求項１に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
  3. 　前記パッドの目付が１０ｇ/ｍ2以上４００ｇ／ｍ2以下であり、かつ、厚みが０．０３ｍｍ以上１０．００ｍｍ以下である、請求項１又は２に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
  4. 　前記パッドの、生理食塩水に含浸させた際の吸液量が５ｇ／１００ｃｍ2以上５０ｇ／１００ｃｍ2以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
  5. 　前記パッドが、単層のシート又は積層したシートの形態にある、請求項１～４のいずれか１項に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッド。
  6. 　　請求項１～５のいずれか１項に記載のイムノクロマト診断キット用吸収パッドを含むイムノクロマト診断キット。
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