JP2018169373A - 免疫測定方法、免疫測定用キット及びラテラルフロー型クロマトテストストリップ - Google Patents
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Abstract
Description
一方、着色ラテックス粒子は、200nm〜300nmと比較的大きな粒子が使われることが多いため、少ない抗原量でも、大きな粒子がテストラインにキャッチされることによって、感度アップが期待できる。しかし、ラテックス自体の染色度に限界があり、金コロイドほどの濃い発色が得られない。従って、着色ラテックス粒子は大きな粒子でありながら、低い染色度のため、視認性が悪くなり、感度アップが出来ないという問題があった。しかも、着色ラテックス粒子の染色度を上げるために染料を多くすると、粒子の分散性が悪くなるため、染色度の向上も期待できない。
本発明の免疫測定方法は、メンブレン、及び該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップを用い、下記工程(I)〜(III);
工程(I):試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II):前記判定部にて、工程(I)において形成された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III):前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。
本発明の免疫測定用キットは、メンブレン、及び該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップと、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、を含む。
まず、図1を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマトテストストリップ(テストストリップ)について説明する。このテストストリップ200は、後述するように、本発明の一実施の形態の免疫測定方法に好ましく使用できるものである。以下、B型肝炎ウイルス由来のアナライトを測定する場合を例として、説明する。
テストストリップ200に使用されるメンブレン110としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン110は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質(B型肝炎ウイルス由来のアナライト160、各種リガンドなどと反応しない物質)で形成されているものである。メンブレン110の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル(ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物)膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。
テストストリップ200は、B型肝炎ウイルス由来のアナライト160(以下、単に「アナライト160」と記すことがある)を含む試料を添加するための試料添加部120を有していてもよい。試料添加部120は、テストストリップ200に、アナライト160を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部120は、試料が展開する方向において、判定部130よりも上流側のメンブレン110に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン110に設けられて試料添加部120を構成していてもよい。
判定部130には、アナライト160と特異的に結合する捕捉リガンド131が固定されている。捕捉リガンド131は、アナライト160と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト160に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド131は、テストストリップ200に試料を提供した場合においても、判定部130から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド131は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン110に直接的又は間接的に固定されていればよい。
吸液部140は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線(フロントライン)が吸液部140に届いてからの試料の移動速度は、吸液部140の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部140の材質、大きさなどの選定により、アナライト160の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部140は任意の構成であり、省略してもよい。
図示は省略するが、テストストリップ200には、メンブレン110に、標識抗体150を含む反応部が形成されていてもよい。反応部は、試料が流れる方向において、判定部130よりも上流側に設けることができる。なお、図1における試料添加部120を反応部として利用してもよい。テストストリップ200が反応部を有する場合、アナライト160を含む試料を、反応部又は試料添加部120に供すると、反応部において、試料に含まれるアナライト160と標識抗体150とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部又は試料添加部120に供することで、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成させることができるので、いわゆる1ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。
図示は省略するが、テストストリップ200は、メンブレン110に、試料が展開する方向において、判定部130よりも下流側に、標識抗体150と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部130とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ200に供した試料が展開して、反応部及び判定部130に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド131の代わりに、標識抗体150と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部130と同様にして作成され、同様の構成を採ることができる。また、コントロール部については、上記の方法以外に、鍵と鍵穴の関係を示す物質、例えば、アビジンとビオチン、酵素と基質、酵素と補酵素等の物質を用いることも出来る。好ましくはアビジンとビオチンを捕捉リガンド131および標識抗体150の代わりに用いてもよい。
次に、テストストリップ200を用いて行われる本発明の一実施の形態のB型肝炎ウイルスの測定方法について説明する。
工程(I):試料に含まれるアナライト160と、該アナライト160に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識した標識抗体150と、を接触させる工程、
工程(II):判定部130にて、工程(I)において形成された、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体を、捕捉リガンド131に接触させる工程、
工程(III):樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。
工程(I)は、試料に含まれるアナライト160を、標識抗体150に接触させる工程である。アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ200の試料添加部120又は反応部(図示省略)に試料を供し、該反応部においてアナライト160を標識抗体150に接触させてもよいし、テストストリップ200に試料を供する前に、試料中のアナライト160を標識抗体150に接触させてもよい。
工程(II)は、テストストリップ200の判定部130において、工程(I)において形成された、アナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を、捕捉リガンド131に接触させる。複合体170を、捕捉リガンド131に接触させると、捕捉リガンド131は、複合体170のアナライト160に特異的に結合する。その結果、複合体170が判定部130において捕捉される。
工程(III)は、樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(II)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ200において、樹脂−金属複合体100の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。
本実施の形態のB型肝炎ウイルスの測定方法における試料は、アナライト160を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト160を含む生体試料(すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等)が挙げられる。必要に応じて、標識抗体150及び捕捉リガンド131とアナライト160との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト160を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、HBc抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等のリガンドとアナライト160との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。
標識抗体150は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト160に接触させて、アナライトであるアナライト160と標識抗体150とを含む複合体170を形成するために使用される。標識抗体150は、アナライト160に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)〜(III)において、標識抗体150から樹脂−金属複合体100が脱離しない程度に、抗体に樹脂−金属複合体100が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体150は、抗体に樹脂−金属複合体100が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と樹脂−金属複合体100とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。
次に、標識抗体150の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体150の製造は、少なくとも、次の工程A;
工程A)樹脂−金属複合体100を第1のpH条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体150を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程B;
工程B)標識抗体150を第2のpH条件で処理する工程
を含むことができる。
工程Aでは、樹脂−金属複合体100を第1のpH条件で抗体と混合して標識抗体150を得る。工程Aは、固体状の樹脂−金属複合体100を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。第1のpH条件は、樹脂−金属複合体100における金属粒子の金属種や、抗体の種類、工程Bで使用するブロック用緩衝液の種類によって異なる。
工程Bでは、工程Aで得られた標識抗体150を第2のpH条件で処理することによって、標識抗体150への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体150を、第2のpH条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、樹脂−金属複合体100における金属粒子の金属種やブロック緩衝液の種類によって異なる。
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体150に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体150を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばpH8〜9の範囲内に調整した所定濃度の、トリス(Tris)緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のpHの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体150の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体150に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体150を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び/又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)などの人工高分子、オクチルフェノールエトキシレート類、ポリソルベート類等の非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤等を用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類、を用いることができる。このようにして標識抗体150の保存処理を行うことができる。
次に、本実施の形態のB型肝炎ウイルスの測定方法において、標識として使用される樹脂−金属複合体100について詳細に説明する。図2は、本実施の形態で標識として使用する樹脂−金属複合体の断面模式図である。樹脂−金属複合体100は、樹脂粒子10と、金属粒子20と、を備えている。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子20の大部分は、表面吸着金属粒子50となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子50は、樹脂粒子10との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子10から金属粒子20が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖又は側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。好ましくは、ポリ−2−ビニルピリジン、ポリ−3−ビニルピリジン、ポリ−4−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。
免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として用いる場合、より好ましくは、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易な金、白金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。更に好ましくは、保存安定性がよい金、又は免疫測定における検出感度に優れる白金である。
金属粒子20として白金粒子を使用する場合、白金粒子の平均粒子径は、免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは1nm以上50nm以下であり、より好ましくは1nm以上30nm以下であり、さらに好ましくは1nm以上20nm以下であり、最も好ましくは1nm以上15nm以下である。特に、白金粒子の平均粒子径が15nm以下である場合、樹脂−白金複合体をイムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に、特に優れた検出感度が得られる。
また、金属粒子20として金粒子を使用する場合、金粒子の平均粒子径は、免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは1nm以上70nm未満であり、より好ましくは、1nm以上50nm未満である。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、sec−ブタノール、t−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類;テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類;アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類;アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子20の大きさを制御するのに有効となる。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子20の粒径をコントロールすることが出来る。
本発明の一実施の形態に係る免疫測定用キットは、例えばテストストリップ200を用いて、本実施の形態のB型肝炎ウイルスの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト160を検出又は定量するためのキットである。
メンブレン110及び該メンブレン110に、前記アナライト160と特異的に結合する捕捉リガンド131が固定されてなる判定部130を含むテストストリップ200と、 アナライト160に特異的に結合する抗体を樹脂粒子10に複数の金属粒子20が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体100で標識した標識抗体150を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態の免疫測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。
樹脂−金属複合体の吸光度は、光学用白板ガラス製セル(光路長10mm)に0.01wt%に調製した樹脂−金属複合体分散液(分散媒:水)を入れ、瞬間マルチ測光システム(大塚電子社製、MCPD−3700)を用いて、金の場合570nm、白金の場合700nmの吸光度を測定した。金の場合570nmでの吸光度が0.9以上を○(良好)、0.5〜0.9未満を△(可)、0.5未満を×(不可)とした。白金の場合700nmでの吸光度が0.6以上を○(良好)、0.4〜0.6未満を△(可)、0.4未満を×(不可)とした。
磁製るつぼに濃度調整前の分散液1gを入れ、70℃、3時間熱処理を行った。熱処理前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
金属担持量(wt%)=
[500℃加熱処理後の重量(g)/500℃加熱処理前の重量(g)]×100
ディスク遠心式粒度分布計(CPS Instruments社製)を用いて測定した。測定は、樹脂−金属複合体を水に分散させた状態で行った。
金属粒子の平均粒子径の測定は、樹脂−金属複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡(FE−SEM;日立ハイテクノロジーズ社製、SU−9000)により観測した画像から、金属粒子の面積平均径を測定した。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](2.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を滴下し、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径380nmの樹脂粒子A−1を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液B−1を得た。
前記樹脂粒子分散液B−1(50ml)に純水1233mlを加えた後、30mM塩化金酸水溶液(100ml)を加え、室温で24時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を3回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、2.5wt%金イオン吸着樹脂粒子分散液C−1を調製した。
次に、純水1580mlに前記C−1(42.4ml)を加え、3℃で撹拌しながら、528mMのジメチルアミンボラン水溶液(10ml)を滴下した後、室温で2時間撹拌することで、平均粒子径399nmの樹脂−金複合体D−1を得た。前記D−1を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を3回繰り返した後、透析処理により精製することで、1wt%の樹脂−金複合体分散液E−1を得た。E−1中の樹脂−金複合体F−1の吸光度は上記方法に従って測定した結果、0.98であった。また、F−1における金粒子の平均粒子径は25.1nm、金の担持量は53.2wt%であった。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、48.00g)及びジビニルベンゼン(DVB、2.00g)を加え、窒素気流下において60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.500g)を2分かけて滴下し、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径420nmの樹脂粒子A−2を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液B−2を得た。
前記樹脂粒子分散液B−2(50ml)に純水1233mlを加えた後、30mM塩化金酸水溶液(100ml)を加え、室温で24時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を3回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、2.5wt%金イオン吸着樹脂粒子分散液C−2を調製した。
次に、純水1580mlに前記C−2(42.4ml)を加え、3℃で撹拌しながら、528mMのジメチルアミンボラン水溶液(10ml)を滴下した後、室温で2時間撹拌することで、平均粒子径438nmの樹脂−金複合体D−2を得た。前記D−2を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を3回繰り返した後、透析処理により精製することで、1wt%の樹脂−金複合体分散液E−2を得た。E−2中の樹脂−金複合体F−2の吸光度は上記方法に従って測定した結果、0.98であった。また、F−2における金粒子の平均粒子径は25.0nm、金の担持量は54.7wt%であった。F−2の走査型電子顕微鏡(SEM)写真を図3に示した。
Aliquat 336[アルドリッチ社製](3.00g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、49.50g)及びジビニルベンゼン(DVB、0.50g)を加え、窒素気流下において60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.250g)を滴下し、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径370nmの樹脂粒子A−3を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液B−3を得た。
上記樹脂粒子分散液B−3(90ml)に純水245mlを加えた後、400mM塩化白金酸水溶液(90ml)を加え、30℃で3時間撹拌後、室温で24時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を3回繰り返すことで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、5wt%白金イオン吸着樹脂粒子分散液C−3を調製した。
次に、純水3825mlに前記C−3(55ml)を加え、3℃で撹拌しながら、132mMのジメチルアミンボラン水溶液(110ml)を滴下した後、3℃で1時間撹拌した。その後25℃で3時間撹拌することで、平均粒子径382nmの樹脂−白金複合体D−3を得た。前記D−3を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を3回繰り返した後、透析処理により精製することで、不純物を取り除いた。その後、濃度調整を行い1wt%の樹脂−白金複合体分散液E−3を得た。E−3中の樹脂−白金複合体F−3の吸光度は上記方法に従って測定した結果、0.70であった。また、F−3の白金粒子の平均粒子径は5nm、白金の担持量は38.5wt%であった。
<樹脂粒子の合成>
Aliquat 336[アルドリッチ社製](1.50g)及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(PEGMA、10.00g)を300gの純水に溶解した後、2−ビニルピリジン(2−VP、49.50g)及びジビニルベンゼン(DVB、0.50g)を加え、窒素気流下において60℃で30分間撹拌した。撹拌後、18.00gの純水に溶解した2,2−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩(AIBA、0.50g)を滴下し、60℃で3.5時間撹拌することで、平均粒子径430nmの樹脂粒子A−4を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を3回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い10wt%の樹脂粒子分散液B−4を得た。
上記樹脂粒子分散液B−4(90ml)に純水245mlを加えた後、400mM塩化白金酸水溶液(90ml)を加え、30℃で3時間撹拌後、室温で24時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を3回繰り返すことで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、5wt%白金イオン吸着樹脂粒子分散液C−4を調製した。
次に、純水3825mlに前記C−4(55ml)を加え、160rpm、3℃で撹拌しながら、132mMのジメチルアミンボラン水溶液(110ml)を滴下した後、3℃で1時間撹拌した。その後25℃で3時間撹拌することで、平均粒子径454nmの樹脂−白金複合体D−4を得た。前記D−4を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を3回繰り返した後、透析処理により精製することで、不純物を取り除いた。その後、濃度調整を行い1wt%の樹脂−白金複合体分散液E−4を得た。E−4中の樹脂−白金複合体F−4の吸光度は上記方法に従って測定した結果、0.70であった。また、F−4の白金粒子の平均粒子径は5nm、白金の担持量は37.7wt%であった。
<金コロイドの合成>
500ml三つ口丸底フラスコに1mM 塩化金酸水溶液を250ml入れ、加熱還流装置を用い、激しく攪拌しながら沸騰させ、沸騰後38.8mMクエン酸ナトリウム水溶液を25ml添加し、溶液が淡黄色から濃紅色に変化することを確認した。攪拌しながら10分間加熱を続けた後、室温で30分程度攪拌放冷をおこなった。孔径2μmのメンブランフィルターを用いて溶液をろ過し、三角フラスコに移し冷暗所で保存した。作製した粒子の平均粒径は12.3nmであった。また、吸光度は上記方法に従って測定した結果、1.32であった。
実施例、比較例では以下の試薬等を使用した。
抗HBs抗体(7.15mg/mL/PBS):アドテック株式会社製
ブロック用緩衝液:1重量%カゼインNaを調整した。
洗浄用緩衝液:5mMトリス溶液をHClでpH≒8.5に調整した。
保存用緩衝液:洗浄用緩衝液に、スクロースを10重量%濃度になるように添加した。
B型肝炎ウイルス陽性コントロール(PC):B型肝炎ウイルス不活化抗原(アドテック株式会社製)を、検体処理液(アドテック株式会社製)を用いて100倍希釈して調製した。PCの抗原濃度は、5000FFU/mlに相当する。
陰性コントロール:検体処理液(アドテック株式会社製)
PtNCPビーズ(1):作製例3で得た樹脂−白金複合体F−3
(結合工程)
マイクロチューブ[アイビス(登録商標;アズワン社製)2mL]に、樹脂−金属複合体としてPtNCPビーズ(1)の0.05mLを投入し、抗HBs抗体溶液0.95mLを添加した。転倒混和によって十分に混合した後、室温で15分間かけて転倒撹拌を行い、樹脂−白金複合体F−3で標識した抗HBs抗体を含む標識抗体含有液a−1を得た。
次に、標識抗体含有液a−1を氷冷後、10000rpmで1分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に、0.05mLのブロック用緩衝液と0.0025mLの非イオン界面活性剤を添加し、転倒混和によって十分に混合した後、室温で10分間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体含有液b−1を得た。
次に、標識抗体含有液b−1を氷冷後、10000rpmで1分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に洗浄用緩衝液1mLを添加し、10〜30秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を3回繰り返し、洗浄処理とした。
次に、氷冷後、10000rpmで1分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液1mLを添加し、10〜30秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液c−1を得た。
標識抗体含有液c−1を4〜8倍に希釈し、これを30cm×1cmのガラスファイバー(メルクミリポア社製)のパッドに含浸させ、20℃で60分間乾燥させ、標識抗体含有パッドd−1を得た。
d−1及び、抗HBsポリクローナル抗体を固相化させたニトロセルロース膜(メルクミリポア社製)を、バッキングシートに貼り付けて「反応シート」とし、これを5mm幅に裁断し、反応ストリップe−1とした。
評価は、前記反応ストリップe−1を用い、15分後の発色レベルを比較した。発色レベルは金コロイド判定用色見本(アドテック社製)を用いて判定した。性能評価において、抗原はHBsリコンビナント抗原(濃度:1.0mg/mL)の2倍希釈列を用いた。
PtNCPビーズの代わりに金コロイド(平均粒径60μm)を使用したほかは、実施例と同様の方法で、a−2、b−2、c−2、d−2及びe−2を得た。評価結果を表1及び表2に示した。
健常人並びにB型肝炎患者よりサリベット(品番51.1534J、ザルスタット社製)を用いて、付属のスポンジを口の中に含ませ、唾液を染み込ませた。スポンジを遠心管に入れ、1500〜3000×gで2分間遠心を行い、唾液を回収した。
採取した唾液100μLと緩衝液(50mMTris−HCl、0.05%TritonX−100)100μLを混合して混合液を調製し、100μLの混合液を100μLのd−1及びd−2に添加し、それぞれの15分後の発色ラインの有無を観察した。評価結果を表3に示した。なお、表3における+は発色ラインの検出を意味し、−は発色ラインが検出されなかったことを意味する。
Claims (9)
- 試料中に含まれるB型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量する免疫測定方法であって、
メンブレン、及び該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップを用い、下記工程(I)〜(III);
工程(I):試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II):前記判定部にて、工程(I)において形成された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III):前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする免疫測定方法。 - 前記金属粒子が、金粒子又は白金粒子である、請求項1に記載の免疫測定方法。
- 前記樹脂−金属複合体における前記金属粒子は、
前記樹脂粒子外に露出した部位を有する第1の粒子と、
全体が前記樹脂粒子に内包されている第2の粒子と、
を含んでおり、
前記第1の粒子及び前記第2の粒子のうち、少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布しているものである、請求項1又は2に記載の免疫測定方法。 - 前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子である、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫測定方法。
- 前記金属粒子の平均粒子径が1〜100nmの範囲内である、請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫測定方法。
- 前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が30〜1000nmの範囲内である、請求項1から5のいずれか1項に記載の免疫測定方法。
- 前記抗体が、抗HBs抗体である、請求項1から6のいずれか1項に記載の免疫測定方法。
- ラテラルフロー型クロマトテストストリップを用いて、試料中に含まれるB型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するための免疫測定用キットであって、
メンブレン、及び該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップと、
前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
を含む前記アナライトを検出又は定量するための免疫測定用キット。 - 試料中に含まれるB型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマトテストストリップであって、
メンブレンと、
前記メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
前記試料が展開する方向において、前記判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップ。
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