WO2018234453A1 - Hochauflösende scanning-mikroskopie mit der unterscheidung mindestens zweier wellenlängenbereiche - Google Patents

Hochauflösende scanning-mikroskopie mit der unterscheidung mindestens zweier wellenlängenbereiche Download PDF

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WO2018234453A1
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image
sample
illumination
radiation
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PCT/EP2018/066589
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Ingo Kleppe
Ralf Netz
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a method for high-resolution scanning microscopy of a sample, wherein the sample is excited with illumination radiation for emitting fluorescence radiation such that the illumination radiation is focused at a point in or on the sample to a diffraction-limited illumination spot, the point diffraction-limited in a diffraction image is imaged onto a spatially resolving area detector, wherein the
  • Area detector has a spatial resolution that dissolves a structure of the diffraction image, the point is moved relative to the sample in different scan positions with a pitch smaller than half the diameter of the illumination spot, the area detector read and from the data of the area detector and from the data associated scan positions, an image of the sample is generated having a resolution which is increased over a resolution limit of the image, wherein for distinguishing at least two predetermined wavelength ranges by means of a spectrally selective module on the area detector one of the number of wavelength ranges corresponding number of
  • Diffraction structures are generated, which are each point-symmetric to a center of symmetry and lie completely on the surface detector and the diffraction structures are evaluated when generating the image of the sample.
  • the invention further relates to a microscope for high-resolution scanning microscopy with a sample chamber for receiving a sample which can be excited to emit fluorescence radiation, an optic having a focal plane lying in the sample chamber and a
  • a lighting device having an input for supplying illumination radiation and the optics with the sample space
  • Illuminated illumination radiation such that the optics bundles the illumination radiation at a point in the focal plane to a diffraction-limited illumination spot, and an imaging device for diffraction-limited imaging of the point in the focal plane through the optics into a diffraction image on a spatially resolving surface detector, in an image plane conjugate to the focal plane wherein the area detector has a spatial resolution that resolves a structure of the diffraction image, a scanning device for shifting the point to different scan positions with a step size smaller than half the diameter of the illumination spot, and an evaluation device for reading out the area detector for evaluating the Structure of the diffraction image from data of the
  • the microscope for discriminating at least two predetermined ones
  • Wavelength regions comprises a spectrally selective module which generates on the surface detector corresponding to the number of wavelength ranges number of diffraction structures, the surface detector and the spectrally selective element are formed so that the diffraction structures lie completely on the surface detector, and the evaluation device in generating the image of the Sample evaluates the diffraction structures.
  • luminescence microscopy A classical field of application of light microscopy for the investigation of biological preparations is luminescence microscopy.
  • certain dyes so-called phosphors or fluorophores
  • the sample is illuminated with illumination radiation acting as excitation radiation, and the excited luminescence radiation is detected with suitable detectors.
  • illumination radiation acting as excitation radiation
  • suitable detectors the representation of individual, differently colored cell parts in the microscope.
  • several parts of a preparation can be colored simultaneously with different, specifically attaching to different structures of the preparation dyes. This process is called multiple luminescence. It is also possible to measure samples which luminesce per se, ie without the addition of dye.
  • Luminescence is here, as is common practice, as a generic term for phosphorescence and
  • LSM abbreviated laser scanning microscopes
  • confocal detection arrangement one speaks of a confocal LSM
  • multiphoton microscopy only image that plane of the sample is in the focal plane of the lens.
  • An optical section is obtained, and the recording of multiple optical sections at different depths of the sample allows for a
  • Luminescence microscopy and laser scanning microscopy is used, in which a luminescent sample is imaged at different depth levels using an LSM.
  • optical resolution of a light microscope including that of an LSM, is diffraction-limited by the laws of physics.
  • high resolution is used here for
  • the resolution can be increased to a factor of up to 10 over that of a diffraction-limited confocal LSM.
  • a method is described for example in US 586691 1 B1.
  • This PALM-abbreviated method uses a marking substance, which can be activated by means of an optical activation signal. Only in the activated state can the
  • Labeling substance for the emission of certain fluorescence radiation are excited.
  • the activation is made so that at least a certain proportion of the activated
  • Labeling molecules of adjacent activated molecules is so spaced that the label molecules of the moiety are separated or subsequently separable as measured by the optical resolution of the microscopy. After absorption of the luminescence radiation then for these isolated molecules, the center of their resolution-limited conditional
  • Airy-scan microscopy is known.
  • this combines a diffraction-limited illumination of the specimen with an area detector, wherein a scanning device is designed such that the diffraction image of the point illuminated by the illumination spot rests on the area detector. This arrangement is called "de-scanned"
  • Detector array It is usually achieved by arranging a scanner between the sample and the merging point of the illumination device and the imaging device, which deflects the beam path. Such a scanner acts both on the illumination spot and on the image of the spot illuminated with the illumination spot, so that the beam path rests in the imaging direction downstream of the scanner.
  • An alternative to such a scanner is the use of a movable sample stage which shifts the sample. Even then, the diffraction pattern rests on the area detector.
  • the area detector is provided with a spatial resolution which, relative to the image scale, causes oversampling of the diffraction image and thus allows the structure of the diffraction image to be resolved.
  • the EP 2317362 A1 also sees a
  • Embodiment in which a color analysis is possible.
  • a plurality of detectors are provided which lie in corresponding spectral channels, which are formed by a dichroic color divider.
  • This approach has long been known for laser scanning microscopy.
  • it has the disadvantage that for each color channel a corresponding color divider with a corresponding detector is necessary.
  • pinhole In conventional laser scanning microscopy, which uses a non-spatially resolving detector behind a confocal pinhole (so-called pinhole), this requirement is largely unproblematic;
  • an oversampling surface detector according to EP 2317362 A1 a considerable outlay arises, especially as such surface detectors are expensive.
  • the generic WO 2016/020459 A1 further forms the airy scan microscopy in that for at least two predetermined wavelength ranges, the diffraction pattern is provided by means of a spectrally selective element with a corresponding number of diffraction structures, which are each formed as point symmetrical diffraction slices and completely on the same Surface detector laterally juxtaposed.
  • a corresponding evaluation of the diffraction structures it is possible to produce a color image corresponding to the at least two wavelength ranges. This approach requires only one area detector.
  • the diffraction discs lie on top of each other.
  • the invention has for its object to provide a method or a microscope of this kind so that the image quality in the at least two predetermined
  • Wavelength ranges is improved.
  • the sample is excited with illumination radiation to emit fluorescence radiation such that the illumination radiation is focused to a point in or on the sample to form a diffraction-limited illumination spot.
  • the point is diffraction-limited imaged in a diffraction image on a spatially resolving surface detector, wherein the area detector a
  • a microscope for high-resolution scanning microscopy with a sample chamber for receiving a sample which can be excited to emit fluorescence radiation comprises an optic which has an in the
  • Lighting device having an input for supplying illumination radiation and which illuminates the sample space with the illumination radiation via the optics in such a way that the optics illuminate the illumination radiation at a point in the focal plane
  • An imaging device forms the point in the focal plane through the optics into a diffraction image onto a spatially resolving one
  • the area detector which lies in a detector plane conjugate to the focal plane.
  • the area detector has a spatial resolution that resolves a structure of the diffraction image.
  • a scanning device shifts the point to different scanning positions with a pitch smaller than half the diameter of the illumination spot, and a
  • Evaluation device reads the area detector and evaluates in its data Diffraction structure of the diffraction pattern. Of course, it also takes into account the scan positions assigned to these data. It produces an image of the sample that has a resolution that is increased above the resolution limit.
  • the microscope has a spectrally selective module for distinguishing at least two predetermined wavelength ranges, which on the area detector provides the diffraction pattern with a number of diffraction structures corresponding to the number of two predetermined wavelength ranges, wherein the area detector and the spectrally selective module are designed such that the
  • Diffraction structures are completely on the surface detector, and the evaluation evaluates the diffraction structures in generating the image of the sample.
  • the diffraction structures are each point-symmetric to a center of symmetry when viewing a point lying on the optical axis in or on the sample.
  • Diffraction structures are coaxial structures in which an inner diffraction structure is a diffraction disk which annularly surrounds an outer diffraction structure.
  • Another example would be two or more elongated diffraction structures, e.g. B. each have the shape of an eight or dumbbell, but against each other on the area detector by an angle, in the case of two diffraction structures z. B. 90 °, are twisted.
  • the invention achieves a simultaneous increase in resolution and spectral image information with only a single area detector, by splitting the diffraction image on the detector into at least two diffraction structures.
  • the spectrally selective module is used, which is characterized by observing a point lying on the optical axis in or on the sample.
  • Each diffraction structure is associated with a wavelength range (also referred to as a color channel).
  • the method and the microscope thus make it possible to distinguish at least two wavelength ranges.
  • the image of the sample is formed, as usual in the Airy scan, by scanning the sample with the spot of a variety of
  • Symmetry center point-symmetric diffraction structures of the color ranges is surprisingly in the evaluation and generation of the optical image improved spatial resolution in the picture.
  • the resolution is increased compared with the version according to WO 2016/020459 A1, in which diffraction disks are juxtaposed on the detector.
  • the diffraction structures can be designed differently in that the radiation of one wavelength range in the image plane is spatially redistributed, that of the other not. If one keeps the diffraction structures coaxial, maximum resolution is obtained in the image.
  • the diffraction structures are coaxial, in particular in the form of a non-spatially redistributed diffraction structure for a first wavelength range and an annular diffraction structure surrounding this for a second wavelength range.
  • a particularly simple design combines in the module a phase influencing device with a spectrally selective filter, for example, such that the spectrally selective filter, the radiation of one wavelength range passes through a phase mask, the radiation of another wavelength range, however, by no or another phase mask.
  • the wavelength ranges are thereby differently phase-manipulated.
  • Airy disk A central maximum appears, the diffraction disk surrounded by rings of decreasing radiation intensity.
  • Two points can be separated in classical ray optics according to the so-called Rayleigh criterion, if the maxima of their images in the diffraction image are at least about the radius r of the diffraction disk apart.
  • the shape of the spot depends reciprocally on the shape of the aperture, in particular its size is inversely proportional to the size of the aperture.
  • the diffraction disk (so the central diffraction spot) is also called Airy disk according to the English astronomer George Biddell Airy.
  • the aperture given by the round version of the optics, is circular in both illumination and imaging.
  • the size of the diffraction disk also depends on the wavelength Depending on the diffraction-limited illumination used for excitation, it is smaller than in the Stokes-shifted, ie longer-wave fluorescence radiation.
  • the single image has a structure that is referred to here as a diffraction structure. It is oversampled.
  • the generation of point symmetric diffraction structures for the wavelength ranges can be done in various ways, each time the spectrally selective module also makes an influence on the diffraction pattern, for example by a
  • phase influencing means which acts differently for the two different wavelengths, or in that the spectrally selective module guides the wavelength ranges through different phase influencing elements.
  • the spectral selection it is preferred to use the spectral selection near a pupil, in any case not in an intermediate image of the pupil
  • Beam path perform. As far as below the spectrally selective module or the spectral separation is mentioned, so is the different shaping of
  • diffraction structures is meant, so that they are each point-symmetrical and lie with a common center of symmetry on the surface detector.
  • the spectrally selective module or the spectral separation is arranged or made in the imaging beam path and not in a part of the beam path through which the illumination radiation also passes. The imaging radiation then passes through the beam path up to the spectrally selective module, at which the shaping of the different diffraction structures of the individual wavelength ranges occurs.
  • the spectral separation is arranged or made in the imaging beam path and not in a part of the beam path through which the illumination radiation also passes. The imaging radiation then passes through the beam path up to the spectrally selective module, at which the shaping of the different diffraction structures of the individual wavelength ranges occurs.
  • the spectral separation is arranged or made in the imaging beam path and not in a part of the beam path through which the illumination radiation also passes. The imaging radiation then passes through the beam path up to the spectrally selective module, at which the shaping of the different diffraction structures
  • the illumination spot in the sample already arises in the form of several different diffraction structures, which are punctiform symmetrical to a common center of symmetry.
  • the first variant separates color channels of a sample that fluoresces in different colors.
  • the second variant distinguishes components of the sample which can be excited at different wavelength ranges.
  • Beam path which is irradiated only by the image or the illumination, not however, from both. In deviation from this, an arrangement in a common part of the beam path is possible.
  • the core of the invention is to distinguish the wavelength ranges spatially on the position of the diffraction structures on the surface detector and ensure a particularly good resolution by the point symmetry to the common center of symmetry.
  • Equation system so that not only the location information and intensities for the individual points with a high resolution can be specified, but also the indication of the
  • Wavelength ranges d. H. the color.
  • the reconstruction uses a point spread image (PSF) function
  • the image of a desired area of the sample is scanned as in a conventional LSM.
  • the inventive concept can also be carried out simultaneously in parallelized form for a plurality of spots, as is known from WO 2016/020459 A1.
  • Fig. 5 shows a beam path of a spectral distribution
  • FIG. 6 is an illustration of an illumination diffraction image that may occur when illuminating a sample in an embodiment of the microscope of FIG. 1.
  • FIG. 6 is an illustration of an illumination diffraction image that may occur when illuminating a sample in an embodiment of the microscope of FIG. 1.
  • LSM 1 schematically shows a laser scanning microscope 1, which is designed for microscopy of a sample 2.
  • the laser scanning microscope (hereinafter abbreviated as LSM) 1 is controlled by a control unit C and comprises an illumination beam path 3 and an imaging beam path 4.
  • the illumination beam path 3 illuminates a spot in the sample 2, and the imaging beam path 4 images this spot diffraction-limited to a detector.
  • Illumination beam path 3 and imaging beam path 4 share optical elements.
  • the illumination of the sample 2 takes place in the LSM 1 by means of a provided laser beam 5 which is coupled to a mirror 8 via a deflection mirror 6 which is not required to be functionally necessary and a lens 7.
  • the mirror 8 ensures that the laser beam 5 at a reflection angle to a coupling element, for. B. an emission filter 9, falls. to
  • the laser beam 5 is biaxially deflected by a scanner 10 and focused by means of lenses 1 1 and 12 through a lens 13 as a diffraction-limited illumination spot 14 in a focal plane 29 in the sample 2.
  • the illumination spot 14 is punctiform in the illustration of FIG. 1, but it is also a differently shaped illumination spot possible, as will be explained below with reference to FIG. 6.
  • Fluorescence radiation, which was excited at the location (eg point) of the illumination spot 14, is guided from the focal plane 29 via the objective 13, the lenses 11 and 12 back to the scanner 10, after which a stationary light beam is again present in the imaging direction. This falls through the emission filter 9, which thereby additionally has the function of the
  • Fluorescence radiation in the illumination spot 14 reflected back specularly
  • Illumination radiation which can serve as excitation radiation, for example, block. Subsequently, the radiation passes through a later to be explained module 15. A lens 16 finally ensures that the total of the location of the illumination spot 14 in a
  • the image plane 18 is a conjugate plane to the focal plane 29 in which the illumination spot 14 lies in the sample 2.
  • the diffraction image is recorded in the image plane 18 by a surface detector 19. It spatially resolves the diffraction image in the image plane 18, thus causing an oversampling.
  • the area detector 19 includes, purely by way of example, an optical fiber bundle which includes a
  • the extent of the optical fiber bundle input is so large that it covers the extent of the diffraction pattern.
  • Light fiber bundles are placed at their outputs in a different geometric arrangement, as at the Lichtleitmaschinebündeleingang, namely in the form of an elongated plug, in which the output ends of the optical fibers are adjacent.
  • the plug is designed to match the geometric arrangement of a detector line, d. H. each
  • this embodiment of the surface detector 19 is purely exemplary. In principle, an area detector 19 sufficient for the microscope 1 to make an oversampling of the diffraction image in the image plane 18. In particular, it may be
  • the control unit C controls all components of the LSM 1, in particular scanner 10 and
  • the control unit records the diffraction image data for various scan positions, analyzes its diffraction structure and generates a high-resolution overall image of the sample 2. Since the illumination spot 14 in the embodiment of FIG. 1 is a point spot by way of example, the diffraction image would be an airy -Scheibchen. In the microscope 1, however, a spectral selection is used by the module 15 such that the diffraction pattern
  • Fig. 1 is wavelength-dependent modified and thus, in the embodiment of Fig. 1 contains two diffraction structures, which are associated with two wavelength ranges.
  • the resulting in the image plane 18 diffraction pattern 23 thus consists of several
  • the module 15 comprises a spectrally selective element 20 and is arranged in the imaging device 4 or alternatively in the illumination device 3. The effect and arrangement of the spectrally selective module 15 in the imaging device 4 will first be explained below.
  • Diffraction discs have been generally explained in the description.
  • microscopy as described in EP 2317362 A1, its structure is analyzed by oversampling the diffraction pattern, and in connection with the scan positions, which have a step size which is small compared to the minimum dimension of the
  • Illuminating spot 14 a structure can be clarified, which on the
  • Illuminated spot 14 has migrated over the point under consideration, the intensity of the radiation from this first point decreases again. If the imagined second location were not adjacent, the radiation intensity in the diffraction image would fade away, with the increase and decrease of the radiation intensity in the diffraction image correlating exactly with the illumination intensity of the illumination spot 14 (taking into account the step size and fluorescence sensitivity of the first location). But since there is a second location in close proximity, this second location also begins
  • Illumination intensities in the diffraction image that are different than if only a single fluorescent spot were present.
  • Unknown contains, in particular intensity and distance of the locations in the focal plane 29. Due to the large number of scan positions to obtain a system of equations that is overdetermined and it allows radiation intensity and distance, ie also the position, the
  • Reflected wavelength range and transmits radiation of a second wavelength range.
  • the radiation of the reflected wavelength range is imaged via an optical system 16 as well as a deflection mirror serving merely the compactness of the beam path into the image plane 18 and thus onto the area detector 19.
  • Wavelength range arises thus as diffraction structure the already mentioned
  • the radiation of the second wavelength range is transmitted by the spectrally selective filter 20 and reaches a phase-manipulating element, for example a phase mask 17 or an LCOS-SLM.
  • a phase-manipulating element for example a phase mask 17 or an LCOS-SLM.
  • Wavelength range is then reflected and imaged equally over the deflection mirror and the optics as a diffraction-limited image in the image plane 18. Due to the effect of the phase mask 17 or the LCOS-SLM, the diffraction structure is now no
  • Diffraction disc but has the shape of a donut, so is annular in the image plane 18.
  • the diffraction structure of the second wavelength range surrounds that of the first wavelength range. Both are coaxial, so have a common center of symmetry in the center of the image plane 18 and thus on the surface detector 19.
  • Fig. 2 shows this
  • the diffraction image consists of the first diffraction structure 30, which is associated with the first wavelength range and thus color channel. It has the shape of a diffraction disk and is point-symmetrical to a center of symmetry 40, which is shown by way of example in FIG. 2 as a white dot.
  • the first diffraction structure 30 is surrounded by an annular, second diffraction structure 31, which is formed by the radiation which was transmitted at the spectrally selective filter 15 and was influenced by the phase mask 17 or the LCOS-SLM with respect to the phase.
  • the second diffraction structure 31 is point-symmetrical to the center of symmetry 40, so the first diffraction structure 30 surrounds coaxially.
  • the wavelength limits of the color channels are defined by the spectral selective filter 15, which is therefore chosen in one embodiment to match predetermined color channels (wavelength ranges).
  • the combination of the diffraction structures 30, 31 form the diffraction pattern 23, ie the diffraction structures 30, 31 do not move spatially during the microscopy.
  • the originally adjacent diffraction discs of the microscope according to WO 2016/020459 A1 are now replaced by the two coaxial diffraction structures 30, 31.
  • the following behavior occurs in the microscope 1 due to the spectrally selective element 15, assuming that the The first location in the first color channel, to which the first diffraction structure 30 is assigned, and the second location in the second color channel to which the second diffraction structure 31 is associated, fluoresces: As soon as the illumination spot 14 detects the first location, the center, that is, the first location, begins in the diffraction image 23 Diffraction structure 30, to light up. By contrast, the periphery, that is to say the second diffraction structure 31, remains dark, since no radiation arrives in the second color channel, as long as the second spot is not illuminated by the illumination spot 14. The intensity in the first diffraction structure
  • the spatial resolution is not affected by the color resolution.
  • the microscope 1 and the associated microscopy method can distinguish between two wavelength ranges (color channels) in the high-resolution image and obtains a two-color image without additional detectors.
  • the coaxial position of the diffraction structures 30, 31 remains constant in microscopy, in particular the layer does not scale color information. It merely serves to ensure that the diffraction structures 30, 31 do not completely overlap spatially and thus provide distinguishable color information in the image evaluation.
  • the diffraction structures 30, 31 are rotationally symmetrical in the embodiment of the spectrally selective module 15, as used for FIG. 1.
  • the described approach is not based on the use of such structures or just two
  • the diffraction structures are in each case longitudinally marked spots 32, 33 which are shown as elliptical spots purely for the purpose of illustration. They are each point-symmetrical to the center of symmetry 40, but extend along different axes. In the embodiment of Fig. 3, the axes are orthogonal. Fig. 3 further shows that the
  • FIG. 3 additionally shows an option that is suitable for all embodiments, in particular with the use of a surface detector 19 having an optical waveguide.
  • the area detector 19 has pixels 22 exclusively at those points at which radiation intensity of the diffraction pattern 23 also impinges. Since the diffraction pattern 23, as already mentioned, rests in the image plane 18, a corresponding adaptation of the area detector 19 is possible.
  • Fig. 4 shows that more than two color channels are possible.
  • the diffraction structures 34-37 here have the shape of a dumbbell, again symmetrically to the center of symmetry 40.
  • the rotational position of the diffraction structures 34-37 depends on the wavelength, so that in the
  • Embodiment of Fig. 4 four wavelength ranges, ie color channels, are realized.
  • the multiple color channels are possible because, due to the large number of scan positions, the equation system obtained is overdetermined such that, as it were, there is still room for further unknowns in the sense of color channels.
  • the spectrally selective module 15 and the beam path following it are designed such that all wavelength ranges of a
  • Fig. 5 shows an embodiment of such a spectrally selective Module 15, in which two wavelength ranges, ie color channels, are separated and differently phase-manipulated, as is the case for example in the embodiment of FIG.
  • the spectrally selective module 15 has a spectrally selective filter 20a, which separates the incident radiation into two wavelength ranges, which are indicated by different dashed lines.
  • the radiation of the one wavelength range falls through a first phase-manipulating element 17a, the radiation of the other wavelength range through a second, different phase-manipulating element 17b. Subsequently, the radiations so differently manipulated are superimposed again by a combining element 20b and from there reach the optical system 16.
  • the spectrally selective module 15 lies in the imaging device 4 and there in that part of the beam path which acts exclusively for the imaging. In other words, the spectrally selective module 15 is not penetrated by illumination radiation in these embodiments.
  • the color channels, which are generated by the spectrally selective module 15 through the different diffraction structures, are thus color channels of the fluorescent sample.
  • the embodiments of the microscope or microscopy method thus distinguish the fluorescent radiation with respect to its wavelength range (color channel).
  • the spectrally selective module 15 can also be arranged in the illumination device 3. This arrangement is shown in dashed lines in Fig. 1.
  • the spectrally selective module 15 is then in a region of the beam path, which acts exclusively interspersed by illumination radiation. It does not affect the picture, but only the lighting.
  • the spectrally selective module 15 then divides the illumination spot 14 into two illumination diffraction structures 38, 39, as shown in the illustration of FIG. 6. you
  • the spectrally selective module 15 in the illumination beam path thus creates illumination color channels, whereas the arrangement of the spectrally selective element 15 in the imaging beam path
  • the spectrally selective filter 20 and the phase-manipulating element 17 of the module 15 a variety of elements in question, which have a chromatic effect, such as a wedge, a prism, a reflection or a lens doublet.
  • the spectrally selective module 15 can also be placed in a part of the beam path that is run through both in the illumination and in the imaging, or two spectrally selective modules 15 are used. In this way, crosstalk in the simultaneous excitation of two dyes with one wavelength can be suppressed.
  • the spectrally selective module 15 By arranging the spectrally selective module 15 in the illumination device 3, the case may arise that when illuminated with two or more illumination color channels, the shorter illumination wavelength generates a fluorescence signal in the wavelength range of the fluorescence generated by the longer wavelength illumination. The consequence of this would be that one of the structures reappears as a shifted silhouette. By means of a suitable correlation calculation, the shadow proportion can be determined and eliminated.
  • a Fourier transform with respect to the location p provides:
  • equation (8) takes the following form:
  • the object can be obtained by means of an operator who has a

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Abstract

Zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie wird eine Probe (2) mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt, dass die Beleuchtungsstrahlung (5) an einen Punkt in oder auf der Probe (2) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) gebündelt wird. Der Punkt wird beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild (23) auf einen ortsauflösenden Flächendetektor (19) abgebildet, wobei der Flächendetektor (19) eine Ortsauflösung hat, die eine Struktur des Beugungsbildes (23) auflöst. Die Probe (2) wird mittels verschiedener Scanpositionen mit einer Schrittweite abgetastet, die kleiner sind als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks (14). Aus den Daten des Flächendetektors (19) und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen wird ein Bild der Probe (2) erzeugt, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist. Zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen in der Fluoreszenzstrahlung von der Probe (2) wird auf dem Flächendetektor (19) für die mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereiche eine entsprechende Anzahl von Beugungsstrukturen (30-37) erzeugt, die sich unterscheiden, aber ein gemeinsames Symmetriezentrum (40) haben. Beim Erzeugen des Bildes der Probe (2) werden die Beugungsstrukturen (30-37) ausgewertet.

Description

Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier
Wellenlängenbereiche
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird, der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden Flächendetektor abgebildet wird, wobei der
Flächendetektor eine Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, der Punkt relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, der Flächendetektor ausgelesen und aus den Daten des Flächendetektors und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist, wobei zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen mittels eines spektral selektiven Moduls auf dem Flächendetektor eine der Zahl Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von
Beugungsstrukturen erzeugt wird, die jeweils punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum sind und vollständig auf dem Flächendetektor liegen und beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen ausgewertet werden.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die eine im Probenraum liegende Fokalebene und eine
Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der
Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, und einer Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild auf einem ortsauflösenden Flächendetektor, der in einer zur Fokalebene konjugierten Bildebene liegt, wobei der Flächendetektor eine Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, und einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen des Flächendetektors, zum Auswerten der Struktur des Beugungsbildes aus Daten des
Flächendetektors und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist, wobei das Mikroskop zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten
Wellenlängenbereichen ein spektral selektives Modul aufweist, das auf dem Flächendetektor eine der Zahl an Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von Beugungsstrukturen erzeugt, der Flächendetektor und das spektral selektive Element so ausgebildet sind, dass die Beugungsstrukturen vollständig auf dem Flächendetektor liegen, und die Auswerteeinrichtung beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen auswertet.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird mit als Anregungsstrahlung wirkender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren. Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und
Fluoreszenz verstanden, erfasst also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das pars pro toto und nicht einschränkend zu verstehen.
Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene der Probe abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es, ein
dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das dann aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Natürlich wird auch eine Kombination von
Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird. Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskops, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Der Begriff„hochauflösend" wird hier für
Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze verwendet. Die US 5043570 B1 beschreibt einen Versuch, die Auflösung durch "oversampling" zu erhöhen. Dies führt nicht zu einer deutlich verbesserten Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des Mikroskops.
Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 über die eines beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der US 586691 1 B1 beschrieben. Für die
Entvölkerungsprozesse sind verschiedene Ansätze bekannt, beispielsweise wie in der
DE 4416558 C2, US 6633432 B1 oder DE 10325460 A1 beschrieben. Ein weiteres hochauflösendes Mikroskopieverfahren wird in US 5867604 B1 angesprochen, in der ein Objekt mit einer periodischen Struktur abgetastet wird. Ein ähnliches Verfahren zur Auflösungssteigerung schildert auch die EP 1 157297 B1 . Strukturierte Beleuchtung nutzt nichtlineare Prozesse, z. B. eine Sättigung der Fluoreszenz. Der Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild.
Ein Verfahren, das im Weitfeld eine Hochauflösung erreicht, ist aus der WO 2006/127692 A1 und der DE 102006021317 A1 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die
Markierungssubstanz zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Die Aktivierung wird so vorgenommen, dass zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten
Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet ist, dass die Markierungsmoleküle des Anteils gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Nach Aufnahme der Lumineszenzstrahlung wird für diese isolierten Moleküle dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter
Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zulässt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird die Isolierung der Markierungsmoleküle durch Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten und isoliert waren. Weitere hochauflösende Verfahren sind in Hell, "Far-Field Optical Nanoscopy", Science 316, 1153 - 1 158, 2007, beschrieben.
Aus der EP 2317362 A1 ist die sogenannte Airy-Scan-Mikroskopie bekannt. Diese kombiniert in der dort in Fig. 5 dargestellten und beschriebenen Ausführungsform eine beugungsbegrenzte Beleuchtung der Probe mit einem Flächendetektor, wobei eine Scaneinrichtung so ausgebildet ist, dass das Beugungsbild des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes auf dem Flächendetektor ruht. Man bezeichnet diese Anordnung als sogenannte„de-scanned"
Detektoranordnung. Sie wird üblicherweise dadurch erreicht, dass ein Scanner zwischen der Probe und dem Vereinigungspunkt von Beleuchtungseinrichtung und Abbildungseinrichtung angeordnet ist, der den Strahlengang ablenkt. Ein solcher Scanner wirkt sowohl auf den Beleuchtungsfleck als auch auf die Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes, so dass in Abbildungsrichtung nach dem Scanner der Strahlengang ruht. Eine Alternative zu einem solchen Scanner ist die Verwendung eines bewegbaren Probentischs, der die Probe verschiebt. Auch dann ruht das Beugungsbild auf dem Flächendetektor. Im Konzept der EP 2317362 A1 ist der Flächendetektor mit einer Ortsauflösung versehen, die bezogen auf den Abbildungsmaßstab eine Überabtastung des Beugungsbildes bewirkt und es somit erlaubt, die Struktur des Beugungsbildes aufzulösen. Die EP 2317362 A1 sieht auch eine
Ausführungsform vor, bei der eine Farbanalyse möglich ist. Dazu werden mehrere Detektoren vorgesehen, die in entsprechenden Spektralkanälen liegen, welche durch einen dichroitischen Farbteiler gebildet werden. Dieser Ansatz ist für die Laser-Scanning-Mikroskopie schon seit langem bekannt. Er hat jedoch den Nachteil, dass für jeden Farbkanal ein entsprechender Farbteiler mit entsprechendem Detektor nötig ist. Bei der herkömmlichen Laser-Scanning- Mikroskopie, die einen nicht ortsauflösenden Detektor hinter einer konfokalen Lochblende (sogenanntes Pinhole) verwendet, ist diese Anforderung weitgehend unproblematisch; bei der Verwendung eines überabtastenden Flächendetektors gemäß EP 2317362 A1 entsteht jedoch ein erheblicher Aufwand, zumal solche Flächendetektoren teuer sind. Im Überabtastungsprinzip gemäß EP 2317362 A1 müssen diese mehreren Flächendetektoren sub-pixelgenau zueinander justiert werden, da ansonsten ein Farbfehler zwischen den erzeugten Bildern der einzelnen Farbkanäle entstünde. Nur wenn die Flächendetektoren in allen Farbkanälen zur optischen Achse sub-pixelgenau justiert sind, passen die Bilder der einzelnen Farbkanäle übereinander.
Die gattungsbildende WO 2016/020459 A1 bildet die Airy-Scan-Mikroskopie dahingehend weiter, dass für mindestens zwei vorbestimmte Wellenlängenbereiche das Beugungsbild mittels eines spektral selektiven Elementes mit einer entsprechenden Anzahl von Beugungsstrukturen versehen wird, die jeweils als punktsymmetrische Beugungsscheibchen ausgebildet sind und vollständig auf demselben Flächendetektor lateral nebeneinanderliegen. Durch eine entsprechende Auswertung der Beugungsstrukturen ist es möglich, ein farbiges Bild entsprechend den mindestens zwei Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Dieser Ansatz benötigt nur einen Flächendetektor. Die Beugungsscheibchen liegen auf ihm nebeneinander. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. ein Mikroskop dieser Art so weiterzubilden, dass die Bildqualität in den mindestens zwei vorbestimmten
Wellenlängenbereichen verbessert ist.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 9 definiert.
Bei einem Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe wird die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird. Der Punkt wird beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden Flächendetektor abgebildet, wobei der Flächendetektor eine
Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst. Der Punkt wird relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks. Aus den Daten des Flächendetektors und den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen wird ein Bild der Probe erzeugt, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist. Zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen wird mittels eines spektral selektiven Moduls das Beugungsbild mit einer Anzahl von Beugungsstrukturen versehen, die der Zahl an vorbestimmten Wellenlängenbereichen entspricht. Die Beugungsstrukturen liegen auf dem Flächendetektor und werden beim Erzeugen des Bildes der Probe ausgewertet. Ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, umfasst eine Optik, die eine im
Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, und eine
Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem
beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt. Eine Abbildungseinrichtung bildet den Punkt in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden
Flächendetektor ab, der in einer zur Fokalebene konjugierten Detektorebene liegt. Der Flächendetektor hat eine Ortsauflösung, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst. Eine Scaneinrichtung verschiebt den Punkt in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, und eine
Auswerteeinrichtung liest den Flächendetektor aus und wertet in dessen Daten die Beugungsstruktur des Beugungsbildes aus. Dabei berücksichtigt sie natürlich auch die diesen Daten zugeordneten Scanpositionen. Sie erzeugt ein Bild der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist. Das Mikroskop weist zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen ein spektral selektives Modul auf, das auf dem Flächendetektor das Beugungsbild mit einer der Zahl an zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen entsprechenden Anzahl von Beugungsstrukturen versieht, wobei der Flächendetektor und das spektral selektive Modul so ausgebildet sind, dass die
Beugungsstrukturen vollständig auf dem Flächendetektor liegen, und die Auswerteeinrichtung beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen auswertet.
Die Beugungsstrukturen sind bei Betrachtung eines auf der optischen Achse liegenden Punkts in oder auf der Probe jeweils punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum. Die
punktsymmetrischen Beugungsstrukturen überdecken unterschiedliche Bereiche des
Flächendetektors, haben jedoch das gemeinsame Symmetriezentrum , das für den betrachteten Punkt ebenfalls auf der optischen Achse liegt. Durch die Wirkung auf einen auf der optischen Achse liegenden Punkt wird der Begriff„Symmetriezentrum" des optischen Systems bzw. des Verfahrens charakterisiert. Dies schließt nicht aus, dass Punkte neben der optischen Achse abgebildet werden. Es zeigte sich, dass solche Beugungsstrukturen eine Farbauflösung liefern, welche die Ortsauflösung geringstmöglich beeinträchtigt. Ein Beispiel für solche
Beugungsstrukturen sind koaxiale Strukturen, bei denen eine innere Beugungsstruktur ein Beugungsscheibchen ist, die eine äußere Beugungsstruktur ringförmig umgibt. Ein anderes Beispiel wären zwei oder mehrere längliche Beugungsstrukturen, die z. B. jeweils die Form einer Acht oder Hantel haben, gegeneinander aber auf dem Flächendetektor um einen Winkel, im Falle von zwei Beugungsstrukturen z. B. 90°, verdreht sind.
Die Erfindung erreicht eine simultane Auflösungssteigerung und eine spektrale Bildinformation mit nur einem einzigen Flächendetektor, indem das Beugungsbild auf dem Detektor in mindestens zwei Beugungsstrukturen aufgeteilt wird. Dazu wird das spektralselektive Modul verwendet, das durch Betrachtung eines auf der optischen Achse liegenden Punktes in oder auf der Probe charakterisiert ist. Jede Beugungsstruktur ist einem Wellenlängenbereich (auch als Farbkanal bezeichnet) zugeordnet. Das Verfahren und das Mikroskop erlauben es damit, mindestens zwei Wellenlängenbereiche zu unterscheiden. Das Bild der Probe entsteht, wie beim Airy-Scan üblich, durch Abtasten der Probe mit dem Spot aus einer Vielzahl von
Einzelbildern, die jeweils einem anderen Abtastort, also einer anderen Scanposition, zugeordnet sind. Durch die unterschiedlichen, jedoch zu einem gemeinsamen
Symmetriezentrum punktsymmetrischen Beugungsstrukturen der Farbbereiche ergibt sich überraschend bei der Auswertung und Erzeugung des optischen Bildes eine verbesserte räumliche Auflösung im Bild. Die Auflösung ist insbesondere gegenüber der Version gemäß WO 2016/020459 A1 , bei der Beugungsscheibchen auf dem Detektor nebeneinanderliegen, gesteigert. Die Beugungsstrukturen können dadurch unterschiedlich gestaltet werden, dass die Strahlung eines Wellenlängenbereichs in der Bildebene räumlich umverteilt wird, die des anderen nicht. Hält man dabei die Beugungsstrukturen koaxial, wird maximale Auflösung im Bild erhalten. Es ist deshalb in einer Ausführungsform bevorzugt vorgesehen, dass die Beugungsstrukturen koaxial sind, insbesondere in Form einer nicht räumlich umverteilten Beugungsstruktur für einen ersten Wellenlängenbereich und einer diese umgebenden, ringförmigen Beugungsstruktur für einen zweiten Wellenlängenbereich.
In einer anderen Ausführungsform ist es vorgesehen, alle vorbestimmten Wellenlängenbereiche unterschiedlich phasenzumanipulieren.
Eine besonders einfache Bauweise kombiniert im Modul eine Phasenbeeinflussungseinrichtung mit einem spektralselektiven Filter, beispielsweise derart, dass der spektralselektive Filter die Strahlung eines Wellenlängenbereiches durch eine Phasenmaske leitet, die Strahlung eines anderen Wellenlängenbereiches hingegen durch keine oder eine andere Phasenmaske. Die Wellenlängsbereiche werden dadurch unterschiedlich phasenmanipuliert.
Bei der Beugung eines optischen Strahls an einer kreisförmigen Blende entsteht ein
Beugungsscheibchen. Es erscheint ein zentrales Maximum, das Beugungsscheibchen, das umgeben ist von Ringen abnehmender Strahlungsintensität. Selbst ein nach den Gesetzen der geometrischen Optik perfektes Mikroskop, also auch ohne Abbildungsfehler, kann einen Punkt nicht genau auf einen Punkt abbilden, sondern durch die Beugung des Lichts an der Apertur nur auf einen unscharfen Fleck. Dies wird als beugungsbegrenzte Abbildung bezeichnet. Gleiches gilt bei beugungsbegrenzter Beleuchtung eines Punktes. Zwei Punkte lassen sich in klassischer Strahlenoptik nach dem sog. Rayleigh-Kriterium trennen, wenn die Maxima ihrer Abbilder im Beugungsbild mindestens um den Radius r des Beugungsscheibchens auseinander liegen. Die Form des Flecks hängt reziprok von der Form der Apertur ab, insbesondere ist seine Größe umgekehrt proportional zur Größe der Apertur. Die Größe des Beugungsscheibchens ergibt sich aus der ersten Nullstelle der Besselfunktion erster Art, die bei etwa r = 0,6098 liegt. Das Beugungsscheibchen (also der zentrale Beugungsfleck) wird nach dem englischen Astronomen George Biddell Airy auch Airy-Scheibchen genannt. Im Scanning-Mikroskop ist sowohl bei Beleuchtung als auch bei Abbildung die Apertur, gegeben durch die runde Fassung der Optiken, kreisförmig. Da Größe des Beugungsscheibchens zudem von der Wellenlänge abhängt, ist es bei der zu Anregung dienenden beugungsbegrenzten Beleuchtung kleiner als bei der stokesverschobenen, also langwelligeren Fluoreszenzstrahlung.
Der Begriff„beugungsbegrenzt" soll hier nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer
Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20 % verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet. Die Erzeugung punksymmetrischer Beugungsstrukturen für die Wellenlängenbereiche kann auf verschiedene Art und Weisen erfolgen, wobei jedes Mal das spektralselektive Modul auch eine Beeinflussung des Beugungsbildes vornimmt, beispielsweise indem es eine
Phasenbeeinflussungseinrichtung aufweist, die für die beiden unterschiedlichen Wellenlängen verschieden wirkt, oder indem das spektralselektive Modul die Wellenlängenbereiche durch unterschiedliche Phasenbeeinflussungselemente führt. Grundsätzlich ist es bevorzugt, die spektrale Selektion nahe einer Pupille, auf jeden Fall nicht in einem Zwischenbild des
Strahlengangs auszuführen. Soweit nachfolgend vom spektralselektiven Modul bzw. der spektralen Auftrennung die Rede ist, ist damit auch die unterschiedliche Formung der
Beugungsstrukturen gemeint, so dass diese jeweils punktsymmetrisch sind und mit einem gemeinsamen Symmetriezentrum auf dem Flächendetektor liegen. In einer ersten Variante wird das spektralselektive Modul bzw. die spektrale Auftrennung im Abbildungsstrahlengang und nicht in einem Teil des Strahlenganges angeordnet bzw. vorgenommen, durch den auch die Beleuchtungsstrahlung läuft. Die Abbildungsstrahlung durchläuft dann den Strahlengang bis zum spektralselektiven Modul, an dem die Formung der unterschiedlichen Beugungsstrukturen der einzelnen Wellenlängenbereiche erfolgt. In einer zweiten Variante erfolgt die spektrale
Auftrennung in der Beleuchtung bzw. der Beleuchtungseinrichtung so, dass die Abbildung nicht von der spektralen Auftrennung betroffen ist. Auf diese Weise entsteht der Beleuchtungsfleck in der Probe bereits in Form von mehreren unterschiedlichen Beugungsstrukturen, die zu einem gemeinsamen Symmetriezentrum punksymmetrisch sind.
Bei der erstgenannten Variante wirkt die spektrale Auftrennung nur auf die
Fluoreszenzstrahlung von der Probe. Bei der zweitgenannten Variante nur auf die
Fluoreszenzanregung zur Probe. Die erste Variante trennt damit Farbkanäle einer in verschiedenen Farben fluoreszierenden Probe. Die zweite Variante unterscheidet hingegen Bestandteile der Probe, die bei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen anregbar sind.
Beiden Varianten ist es gemein, dass das spektralselektive Modul in einem Teil des
Strahlengangs liegt, der nur von der Abbildung oder der Beleuchtung bestrahlt wird, nicht jedoch von beiden. In Abweichung davon ist auch eine Anordnung in einem gemeinsamen Teil des Strahlenganges möglich.
Der Kern der Erfindung liegt darin, die Wellenlängenbereiche räumlich über die Lage der Beugungsstrukturen auf dem Flächendetektor zu unterscheiden und durch die Punktsymmetrie zum gemeinsamen Symmetriezentrum eine besonders gute Auflösung sicherzustellen. Bei der Erzeugung des Bildes ist eine Entmischung der simultan aufgenommenen
Wellenlängenbereiche bei besonders hoher Auflösung möglich. Auf diese Weise wird eine simultane Aufnahme mehrerer Farbkanäle mit einem einzigen Flächendetektor erreicht.
Da im Rekonstruktionsverfahren gemäß WO 2016/020459 A1 oder EP 2317362 A1 aufgrund der scannenden Verschiebung mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die Größe des
Beleuchtungsflecks, eine Vielzahl an Messungen für jeden einzelnen Punkt in der Probe vorliegt, ergibt sich eine Überbestimmtheit im aufzustellenden und zu lösenden
Gleichungssystem , so dass nicht nur die Ortsangaben und Intensitäten für die einzelnen Punkte mit einer Hochauflösung angegeben werden können, sondern auch die Angabe der
Wellenlängenbereiche, d. h. der Farbe.
Die Rekonstruktion verwendet eine Punktbildverwaschungsfunktion (PSF), die
wellenlängenabhängig ist und das Symmetriezentrum für den eingangs erwähnten Punkt auf der optischen Achse hat.
Die Abbildung eines gewünschten Bereichs der Probe erfolgt wie in einem üblichen LSM scannend. Das erfindungsgemäße Konzept kann auch in parallelisierter Form für mehrere Flecken gleichzeitig durchgeführt werden, wie dies aus der WO 2016/020459 A1 bekannt ist.
Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert ein Steuergerät des Mikroskops diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur hochauflösenden Mikroskopie,
Fig. 2 bis 4 Darstellungen von Beugungsbildern, die beim Betrieb des Mikroskops der Fig. 1 in verschiedenen Ausführungsformen auf dem Flächendetektor auftreten,
Fig. 5 einen Strahlengang einer spektralen Aufteilung, und
Fig. 6 eine Darstellung eines Beleuchtungs-Beugungsbildes, das bei der Beleuchtung einer Probe in einer Ausführungsform des Mikroskops der Fig. 1 auftreten kann.
Fig. 1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1 , das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 beleuchtet einen Spot in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Spot beugungsbegrenzt auf einen Detektor ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich optische Elemente.
Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, dass der Laserstrahl 5 unter einem Reflexionswinkel auf ein Einkoppelelement, z. B. einen Emissionsfilter 9, fällt. Zur
übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse
eingezeichnet.
Nach Reflexion am Emissionsfilter 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 1 1 und 12 durch ein Objektiv 13 als beugungsbegrenzter Beleuchtungsfleck 14 in eine Fokalebene 29 in der Probe 2 fokussiert. Der Beleuchtungsfleck 14 ist dabei in der Darstellung der Fig. 1 punktförmig, es ist jedoch auch ein anders geformter Beleuchtungsfleck möglich, wie nachfolgend anhand der Fig. 6 noch erläutert werden wird. Fluoreszenzstrahlung, die am Ort (z. B. Punkt) des Beleuchtungsflecks 14 angeregt wurde, wird aus der Fokalebene 29 über das Objektiv 13, die Linsen 1 1 und 12 wieder zum Scanner 10 geleitet, nach dem in Abbildungsrichtung wiederum ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch das Emissionsfilter 9, welches dadurch zusätzlich die Funktion hat, von der
Fluoreszenzstrahlung im Beleuchtungsfleck 14 spiegelnd rückreflektierte
Beleuchtungsstrahlung, die beispielsweise als Anregungsstrahlung dienen kann, abzublocken. Anschließend durchläuft die Strahlung ein später zu erläuterndes Modul 15. Eine Linse 16 sorgt abschließend dafür, dass insgesamt der Ort des Beleuchtungsflecks 14 in ein
beugungsbegrenztes, noch näher zu erläuterndes Beugungsbild abgebildet wird, welches in einer Bildebene 18 liegt. Die Bildebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Fokalebene 29, in welcher der Beleuchtungsfleck 14 in der Probe 2 liegt.
Das Beugungsbild wird in der Bildebene 18 von einem Flächendetektor 19 aufgenommen. Es löst das Beugungsbild in der Bildebene 18 räumlich auf, bewirkt also eine Überabtastung. Der Flächendetektor 19 umfasst rein exemplarisch ein Lichtleitfaserbündel, welches ein
Detektorarray speist. Die Ausdehnung des Lichtleitfaserbündeleingangs ist so groß, dass damit die Ausdehnung des Beugungsbildes abgedeckt wird. Die einzelnen Lichtleitfasern im
Leichtleitfaserbündel sind an ihren Ausgängen in eine andere geometrische Anordnung gebracht, als am Lichtleitfaserbündeleingang, nämlich in Form eines längserstreckten Steckers, in dem die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern nebeneinander liegen. Der Stecker ist passend zur geometrischen Anordnung einer Detektorzeile ausgebildet, d. h. jedes
ausgangsseitige Ende einer Lichtleitfaser liegt genau vor einem Pixel der Detektorzeile. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Ausführung des Flächendetektors 19 rein exemplarisch ist. Grundsätzlich genügt für das Mikroskop 1 ein Flächendetektor 19, der in der Bildebene 18 eine Überabtastung des Beugungsbildes vornimmt. Insbesondere kann es sich beim
Flächendetektor 19 auch um eine rechteckige Detektorfläche in der Bildebene 18 handeln, wie es in den nachfolgend beschriebenen Fig. 2 bis 4 der Fall ist. Das Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1 , insbesondere Scanner 10 und
Flächendetektor 19. Das Steuergerät nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten des Beugungsbildes auf, analysiert dessen Beugungsstruktur und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2. Da der Beleuchtungsfleck 14 in der Ausführungsform der Fig. 1 exemplarisch ein Punkt-Spot ist, wäre das Beugungsbild ein Airy-Scheibchen. Im Mikroskop 1 kommt jedoch durch das Modul 15 eine spektrale Selektion derart zum Einsatz, dass das Beugungsbild
wellenlängenabhängig modifiziert wird und somit, in der Ausführungsform der Fig. 1 zwei Beugungsstrukturen enthält, die zwei Wellenlängenbereichen zugeordnet sind. Das dadurch in der Bildebene 18 entstehende Beugungsbild 23 besteht also aus mehreren
Beugungsstrukturen, deren Art und Geometrie nachfolgend noch erläutert werden wird. Das Modul 15 umfasst ein spektralselektives Element 20 und ist in der Abbildungseinrichtung 4 oder alternativ in der Beleuchtungseinrichtung 3 angeordnet. Nachfolgend wird zuerst die Wirkung und Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Abbildungseinrichtung 4 erläutert.
Ohne spektralselektives Modul 15 entstünde, wie bereits erwähnt, bei beugungsbegrenzter Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck 14 beleuchteten Punktes in der Fokalebene 29 in der zugeordneten konjugierten Bildebene 18 ein Beugungsbild, das aufgrund der kreisförmigen Appertur des Objektivs 13 ein Beugungsscheibchen ist. Die Entstehung solcher
Beugungsscheibchen wurde im Allgemeinen bei der Beschreibung bereits erläutert. Bei der Mikroskopie, wie sie in der EP 2317362 A1 beschrieben ist, wird durch Überabtastung des Beugungsbildes dessen Struktur analysiert, und im Zusammenhang mit den Scanpositionen, die eine Schrittweite haben, welche klein gegen die minimale Abmessung des
Beleuchtungsflecks 14 ist, kann eine Strukturaufklärung erfolgen, die über die
Auflösungsgrenze der beugungsbegrenzten Abbildung hinaus geht. Zur Erläuterung seien gedanklich zwei Stellen betrachtet, die in der Fokalebene 29 so eng beieinander liegen, dass sie mit der beugungsbegrenzten Auflösung nicht erfasst werden können. Beim Scannen des Beleuchtungsflecks 14 mit Schrittweiten, die klein gegen den Durchmesser des (in diesem Gedankenexperiment kreisförmigen) Beleuchtungsflecks sind, gelangt zuerst eine der beiden Stellen in den Beleuchtungsfleck. Die Strahlungsintensität im Beugungsbild steigt je mehr diese erste Stelle in den Beleuchtungsfleck 14 gerät. Der Beleuchtungsfleck 14 hat aufgrund seiner beugungsbegrenzten Eigenschaften eine Intensität, die zum Zentrum hin steigt. Somit steigt die Intensität der Strahlung im Beugungsbild in dem Maß, in dem die betrachtete erste Stelle mehr und mehr ins Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Wenn das Zentrum des
Beleuchtungsflecks 14 über die betrachtete Stelle hinweggewandert ist, nimmt die Intensität der Strahlung von dieser ersten Stelle wieder ab. Wäre die gedanklich angenommene zweite Stelle nicht benachbart, würde die Strahlungsintensität im Beugungsbild wieder abklingen, wobei das Ansteigen und das Abnehmen der Strahlungsintensität im Beugungsbild exakt mit dem Verlauf der Beleuchtungsintensität des Beleuchtungsflecks 14 (unter Berücksichtigung der Schrittweite und der Fluoreszenzempfindlichkeit der ersten Stelle) korreliert. Da nun aber eine zweite Stelle in enger Nachbarschaft vorhanden ist, beginnt diese zweite Stelle ebenfalls
Fluoreszenzstrahlung zum Beugungsbild beizusteuern, und zwar umso mehr, je näher ihr das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Ansonsten gilt für die zweite Stelle natürlich genau das gleiche, wie für die erste Stelle. Im Ergebnis erhält man für die Schrittpositionen
Beleuchtungsintensitäten im Beugungsbild, die anders sind, als wenn nur eine einzelne fluoreszierende Stelle vorhanden wäre. Durch die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 und Berücksichtigung der aktuellen Scanposition lässt sich damit mathematisch ermitteln, dass und auch in welchem Abstand zwei Stellen in der Fokalebene 29 fluoreszierten, obwohl diese zwei Stellen mit einer beugungsbegrenzten Auflösung für sich alleine nicht identifizierbar wären. In der dem Fachmann technisch bekannten Umsetzung wird zur Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 für jede Scanposition eine Gleichung aufgestellt, die mehrere
Unbekannte enthält, insbesondere Intensität und Abstand der Stellen in der Fokalebene 29. Durch die Vielzahl an Scanpositionen erhält man ein Gleichungssystem , das überbestimmt ist und es erlaubt, Strahlungsintensität und Abstand, d. h. damit auch die Lage, der
fluoreszierenden Stellen zu ermitteln. Dies wird nachfolgend noch erläutert werden.
Dieses Prinzip einer hochauflösenden Mikroskopie ist mit dem Mikroskop 1 nun dahingehend fortgebildet, dass das spektralselektive Modul 15 das Beugungsbild 23 in der Bildebene 18, welche der Fokalebene 29 konjugiert ist, so beeinflusst, dass es für zwei Wellenlängenbereiche (Farbkanäle) zwei unterschiedliche, punksymmetrische Beugungsstrukturen aufweist, die ein gemeinsames Symmetriezentrum haben. Dies ist in der Ausführungsform gemäß Fig. 1 dadurch erreicht, dass ein spektralselektiver Filter 20 Strahlung eines ersten
Wellenlängenbereichs reflektiert und Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs transmittiert. Die Strahlung des reflektierten Wellenlängenbereichs wird über eine Optik 16 sowie einen lediglich der Kompaktheit des Strahlenganges dienenden Umlenkspiegel in die Bildebene 18 und damit auf den Flächendetektor 19 abgebildet. Für den ersten
Wellenlängenbereich entsteht damit als Beugungsstruktur das bereits erwähnte
Beugungsscheibchen. Die Strahlung des zweiten Wellenlängenbereichs wird hingegen vom spektralselektiven Filter 20 transmittiert und gelangt auf ein phasenmanipulierendes Element, beispielsweise eine Phasenmaske 17 oder ein LCOS-SLM. Die Strahlung des zweiten
Wellenlängenbereichs wird dann reflektiert und gleichermaßen über den Umlenkspiegel und die Optik als beugungsbegrenztes Bild in die Bildebene 18 abgebildet. Aufgrund der Wirkung der Phasenmaske 17 oder des LCOS-SLM ist die Beugungsstruktur hier nun kein
Beugungsscheibchen, sondern hat die Form eines Donut, ist also ringförmig in der Bildebene 18. Damit umgibt die Beugungsstruktur des zweiten Wellenlängenbereichs die des ersten Wellenlängenbereichs. Beide sind koaxial, haben also ein gemeinsames Symmetriezentrum in der Mitte der Bildebene 18 und damit auf dem Flächendetektor 19. Fig. 2 zeigt diese
Ausführungsform exemplarisch für einen quadratischen Flächendetektor 19, der mittels Pixel 22 das Beugungsbild 23 überabtastet. Das Beugungsbild besteht aus der ersten Beugungsstruktur 30, die dem ersten Wellenlängenbereich und damit Farbkanal zugeordnet ist. Sie hat die Form eines Beugungsscheibchens und ist punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum 40, das in der Fig. 2 exemplarisch als weißer Punkt eingezeichnet ist. Die erste Beugungsstruktur 30 wird von einer ringförmigen, zweiten Beugungsstruktur 31 umgeben, die von der Strahlung gebildet wird, welche am spektralselektiven Filter 15 transmittiert und durch die Phasenmaske 17 oder das LCOS-SLM hinsichtlich der Phase beeinflusst wurde. Auch die zweite Beugungsstruktur 31 ist punktsymmetrisch zum Symmetriezentrum 40, umgibt die erste Beugungsstruktur 30 also koaxial. Die Wellenlängengrenzen der Farbkanäle sind durch den spektralselektiven Filter 15 definiert, der deshalb in einer Ausführungsform passend zu vorbestimmten Farbkanälen (Wellenlängenbereichen) gewählt ist. Die Kombination aus den Beugungsstrukturen 30, 31 bilden das Beugungsbild 23, d. h. die Beugungsstrukturen 30, 31 bewegen sich während der Mikroskopie räumlich nicht. Die ursprünglich nebeneinanderliegenden Beugungsscheibchen des Mikroskops gemäß WO 2016/020459 A1 sind nun durch die zwei koaxialen Beugungsstrukturen 30, 31 ersetzt.
Betrachtet man wieder gedanklich zwei in der Fokalebene 29 liegende Stellen, die so eng beabstandet sind, dass sie mit der beugungsbegrenzten Abbildung per se nicht auflösbar wären, stellt sich im Mikroskop 1 aufgrund des spektralselektiven Elementes 15 folgendes Verhalten ein, wenn man annimmt, dass die erste Stelle im ersten Farbkanal, dem die erste Beugungsstruktur 30 zugeordnet ist, und die zweite Stelle im zweiten Farbkanal dem die zweite Beugungsstruktur 31 zugeordnet ist, fluoresziert: Sobald der Beleuchtungsfleck 14 die erste Stelle erfasst, beginnt im Beugungsbild 23 das Zentrum , also die erste Beugungsstruktur 30, aufzuleuchten. Die Peripherie, also die zweite Beugungsstruktur 31 , bleibt hingegen noch dunkel, da keine Strahlung im zweiten Farbkanal ankommt, so lange nicht auch die zweite Stelle vom Beleuchtungsfleck 14 beleuchtet wird. Die Intensität in der ersten Beugungsstruktur
30 steigt so lange an, bis die erste Stelle vom Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 erfasst wird. Dann ist die Intensität im Zentrum , also der Beugungsstruktur 30, des ersten Farbkanals maximal. Analoges gilt für die Beugungsstruktur 31 und den zweiten Farbkanal sowie die zweite Stelle, wenn der Beleuchtungsfleck 14 weitergerückt ist. Im Ergebnis erhält man beim
Überfahren der beiden Stellen mit dem Beleuchtungsfleck 14 ein Hellerwerden und Verblassen der ersten Beugungsstruktur 30 und ein zeitlich etwas später auftretendes Hellerwerden und Verblassen der zweiten Beugungsstruktur 31 . Ein gleichzeitiges Heller- und Dunklerwerden würde sich hingegen zeigen, wenn an einem Ort eine Fluoreszenz in beiden Farbkanälen emittiert würde. Durch die Bildauswertung kann somit sowohl die Ortsinformation als auch die Farbinformation extrahiert werden. Durch die koaxiale Lage der beiden Beugungsstrukturen 30,
31 ist die Ortsauflösung von der Farbauflösung nicht beeinträchtigt.
Die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 in Kombination mit den Scanpositionen erlaubt es, für jede Scanposition eine Gleichung aufzustellen, die nicht nur Lage und
Fluoreszenzintensität der beiden Stellen beinhaltet, sondern auch eine Aussage darüber, ob die erste oder zweite Stelle im ersten oder zweiten Farbkanal leuchtet. Durch die Vielzahl an Scanpositionen ergibt sich ein überbestimmtes Gleichungssystem, das es erlaubt, auch die zusätzliche Zuordnung der leuchtenden Stellen zu den beiden Farbkanälen zu ermitteln. Auf diese Weise kann das Mikroskop 1 und das zugeordnete Mikroskopieverfahren zwischen zwei Wellenlängenbereichen (Farbkanälen) im hochaufgelösten Bild unterscheiden und gewinnt ohne zusätzliche Detektoren ein zweifarbiges Bild. Es sei betont, dass die koaxiale Lage der Beugungsstrukturen 30, 31 bei der Mikroskopie konstant bleibt, insbesondere skaliert die Lage keine Farbinformation. Sie dient lediglich dazu, dass die Beugungsstrukturen 30, 31 räumlich nicht vollständig übereinanderliegen und somit in der Bildauswertung unterscheidbare Farbinformationen liefern.
Die Beugungsstrukturen 30, 31 sind bei der Ausführungsform des spektralselektiven Moduls 15, wie es für die Fig. 1 zur Anwendung kommt, kreisrotationssymmetrisch. Der beschriebene Ansatz ist nicht auf die Verwendung solcher Strukturen oder von nur zwei
Wellenlängenbereichen (Farbkanälen) eingeschränkt. Fig. 3 und 4 zeigen andere
punktsymmetrische Formen für die Beugungsstrukturen.
Gemäß Fig. 3 sind die Beugungsstrukturen jeweils längsverzeichnete Flecke 32, 33, die rein zur Veranschaulichung als elliptische Flecke dargestellt sind. Sie sind jeweils punktsymmetrisch zum Symmetriezentrum 40, erstrecken sich aber entlang unterschiedlicher Achsen. In der Ausführungsform der Fig. 3 sind die Achsen orthogonal. Fig. 3 zeigt weiter, dass die
Beugungsstrukturen der Wellenlängenbereiche nicht zwingend disjunkt, d. h. nicht überlappend ausgeführt sein müssen. Aufgrund der Überbestimmung des Gleichungssystems sind durchaus überlappende Bereiche möglich, wie dies auch aus der WO 2016/020459 A1 , dort für den Fall nebeneinanderliegender Beugungsscheibchen, dem Fachmann bereits bekannt ist. Fig. 3 zeigt zusätzlich eine Option, die für alle Ausführungsformen, insbesondere mit der Verwendung eines Lichtleiter aufweisenden Flächendetektors 19, in Frage kommt. Hier weist der Flächendetektor 19 ausschließlich an denjenigen Stellen Pixel 22 auf, an denen auch Strahlungsintensität des Beugungsbildes 23 auftrifft. Da das Beugungsbild 23, wie bereits erwähnt, in der Bildebene 18 ruht, ist eine entsprechende Anpassung des Flächendetektors 19 möglich.
Fig. 4 zeigt, dass auch mehr als zwei Farbkanäle möglich sind. Die Beugungsstrukturen 34-37 haben hier die Form einer Hantel, wiederum symmetrisch zum Symmetriezentrum 40. Die Drehlage der Beugungsstrukturen 34-37 hängt von der Wellenlänge ab, so dass in der
Ausführungsform der Fig. 4 vier Wellenlängenbereiche, also Farbkanäle, realisiert sind. Die mehreren Farbkanäle sind deshalb möglich, da aufgrund der Vielzahl von Scanpositionen das erhaltene Gleichungssystem derart überbestimmt ist, dass sozusagen noch Platz für weitere Unbekannte im Sinne von Farbkanälen ist.
In den Ausführungsformen der Fig. 3 und 4 ist das spektralselektive Modul 15 und der ihm nachfolgende Strahlengang so ausgestaltet, dass alle Wellenlängenbereiche einer
Phasenmanipulation unterzogen werden und nicht nur, wie in Fig. 1 dargestellt, ein
Wellenlängenbereich. Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform für ein solches spektralselektives Modul 15, bei der zwei Wellenlängenbereiche, also Farbkanäle, getrennt und unterschiedlich phasenmanipuliert werden, wie dies beispielsweise in der Ausführungsform der Fig. 3 der Fall ist. Das spektralselektive Modul 15 weist einen spektralselektiven Filter 20a auf, der die einfallende Strahlung nach zwei Wellenlängenbereichen trennt, die durch unterschiedliche Strichlierung angedeutet sind. Die Strahlung des einen Wellenlängenbereichs fällt durch ein erstes phasenmanipulierendes Element 17a, die Strahlung des anderen Wellenlängenbereichs durch ein zweites, anderes phasenmanipulierendes Element 17b. Anschließend werden die derart unterschiedlich manipulierten Strahlungen von einem Vereinigungselement 20b wieder überlagert und gelangen von dort zur Optik 16.
In der bisherigen Beschreibung wurde davon ausgegangen, dass das spektralselektive Modul 15 in der Abbildungseinrichtung 4 und dort in dem Teil des Strahlengangs liegt, der ausschließlich für die Abbildung wirkt. Mit anderen Worten, das spektralselektive Modul 15 wird in diesen Ausführungsformen nicht von Beleuchtungsstrahlung durchsetzt. Die Farbkanäle, welche vom spektralselektiven Modul 15 durch die unterschiedlichen Beugungsstrukturen erzeugt werden, sind damit Farbkanäle der fluoreszierenden Probe. Die Ausführungsformen des Mikroskops bzw. Mikroskopieverfahrens unterscheiden folglich die fluoreszierende Strahlung hinsichtlich deren Wellenlängenbereich (Farbkanal). Das spektralselektive Modul 15 kann jedoch auch in der Beleuchtungseinrichtung 3 angeordnet werden. Diese Anordnung ist in Fig. 1 gestrichelt gezeichnet. Das spektralselektive Modul 15 liegt dann in einem Bereich des Strahlengangs, der ausschließlich von Beleuchtungsstrahlung durchsetzt wirkt. Es wirkt nicht auf die Abbildung, sondern nur auf die Beleuchtung. Das spektralselektive Modul 15 teilt dann den Beleuchtungsfleck 14 in zwei Beleuchtungs- Beugungsstrukturen 38, 39 auf, wie es in der Darstellung der Fig. 6 gezeigt ist. Sie
unterscheiden sich und haben das gemeinsame Symmetriezentrum 40. Das spektralselektive Modul 15 im Beleuchtungsstrahlengang schafft damit Beleuchtungsfarbkanäle, wohingegen die Anordnung des spektralselektiven Elementes 15 im Abbildungsstrahlengang
Detektionsfarbkanäle erzeugte. Die Probe wird dadurch nicht mehr mit einem z. B.
Beugungsscheibchen beleuchtet, sondern mit mehreren, unterschiedlichen Beleuchtungs- Beugungsstrukturen 38, 39. Im Ergebnis erhält man damit auch auf dem Flächendetektor 19 eine Situation wie in Fig. 3, wobei die Beugungsstrukturen 30, 31 nun nicht mehr
unterschiedlichen Farbkanälen der Fluoreszenzstrahlung, d. h. einer Fluoreszenzantwort, der Probe 2 entsprechen, sondern unterschiedlichen Farbkanälen der Anregung, d. h. einer Fluoreszenzempfindlichkeit, der Probe 2. Ansonsten können alle Varianten, die anhand der Fig. 2 bis 4 für die Ausbildung der Beugungsstrukturen erläutert wurden, gleichermaßen auch für die der Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Beleuchtungseinrichtung 3 verwendet werden. Aufgrund der anderen geometrischen Lage wird jedoch in der Regel die Ausgestaltung des spektralselektiven Moduls 15 bei Anordnung in der Abbildungseinrichtung 4 etwas anders aussehen, als bei der Anordnung in der Beleuchtungseinrichtung 3. Grundsätzlich kommen für den spektralselektiven Filter 20 und das phasenmanipulierende Element 17 des Moduls 15 eine Vielzahl von Elementen in Frage, die einen chromatischen Effekt haben, beispielsweise ein Keil, ein Prisma, eine Einspiegelung oder ein Linsen-Dublett.
In einer Variante zu den oben genannten Alternativen kann das spektralselektive Modul 15 auch in einen Teil des Strahlenganges gelegt werden, der sowohl bei der Beleuchtung als auch bei der Abbildung durchlaufen wird, oder es werden zwei spektralselektive Module 15 verwendet. Auf diese Weise kann ein Übersprechen bei der simultanen Anregung zweier Farbstoffe mit einer Wellenlänge unterdrückt werden. Zusätzlich ergeben sich Möglichkeiten für Kalibrationsmessungen. Da Beleuchtung und die Abbildung bzw. die entsprechenden Einrichtungen eine gemeinsame optische Scaneinrichtung haben, welche den Beleuchtungsfleck über die Probe führt und zugleich den mit dem Beleuchtungsfleck zusammenfallenden Punkt, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf den Detektor wieder descannt, kann man eine Zoomoptik 21 in den Abbildungsstrahlengang setzen. Sie erlaubt es, eine Anpassung des Beugungsbildes 23 an die Größe des Flächendetektors 19 vorzunehmen.
Bei Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Beleuchtungseinrichtung 3 kann der Fall eintreten, dass bei Beleuchtung mit zwei oder mehr Beleuchtungsfarbkanälen die kürzere Beleuchtungswellenlänge ein Fluoreszenzsignal im Wellenlängenbereich der erzeugten Fluoreszenz von der langwelligeren Beleuchtung generiert. Die Folge davon wäre, dass eine der Strukturen als verschobenes Schattenbild noch einmal auftaucht. Mittels einer geeigneten Korrelationsrechnung kann der Schattenbildanteil bestimmt und eliminiert werden.
Zur genaueren Erläuterung der mathematischen Analyse der Aufstellung des oben genannten Gleichungssystems sei zur Einführung zuerst der Fall betrachtet, dass nur eine Farbe auftritt, d. h. das spektralselektive Modul 15 fehlt. Bezeichnet man mit ö(r) das Objekt, mit £(r) die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) der Anregung und mit / (r) die PSF der Detektion, erhält man als Signal ö(r,p) für jeden Bildpunkt folgende Gleichung, wobei r den Abstand vom Ort p des Beleuchtungsflecks bezeichnet:
Figure imgf000020_0002
Eine Fourier-Transformation von bezüglich des Ortes p liefert:
Figure imgf000020_0004
Figure imgf000020_0003
Das Produkt im Realraum wird im Fourier-Raum die folgende Faltung:
Figure imgf000020_0001
Führt man eine Trägerfunktion am Ort r ein:
Figure imgf000020_0005
ergibt sich als Gleichung (2)
Figure imgf000020_0006
Unterschiedliche Orte r am Flächendetektor werden mittels eines Wiener-Filters kombiniert wobei die entsprechenden spektralen Leistungsdichten des Signals
Figure imgf000020_0007
("O") und des Rauschens (n) sind. Dies vorausgeschickt erhält man für mehrere Farbkanäle, also eine wellenlängenabhängige PSF mit verschiedenen Hc (r, ω), die an jedem Pixel des Flächendetektors 19 gemischt werden, die durch die PSF vorgegebenen Gewichte wie folgt:
Figure imgf000021_0004
In dieser Gleichung ist c der Farbkanalindex. Schreibt man die Gleichung (7) als Matrix erhält man:
Figure imgf000021_0005
Berücksichtigt man zusätzliches Rauschen nimmt Gleichung (8) folgende Form an:
Figure imgf000021_0001
Das Objekt kann man mittels eines Operators gewinnen, der eine
Figure imgf000021_0006
Figure imgf000021_0007
Frequenzfilterung und eine Farbkanalentmischung kombiniert:
Figure imgf000021_0002
Wie bei der Ableitung des Wiener-Filters muss nun der quadratische Abstand zwischen dem rekonstruierten und dem wirklichen Objekt für jede Frequenz und jeden Farbkanal minimiert werden:
Figure imgf000021_0003
Unter Verwendung der Gleichung (9) erhält man damit:
Figure imgf000021_0008
Unter Anwendung derselben Grundsätze wie bei der Ableitung des Wiener-Filters, die dem Fachmann beispielsweise aus http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution bekannt sind, erhält man:
Figure imgf000022_0001
Hierin sind die spektralen Leistungsdichten des Signals für jeden Farbkanal und
Figure imgf000022_0004
das Rauschen:
Figure imgf000022_0002
Wenn Emissionsspektren von Fluorophoren überlappen, kann es sein, dass in einem Farbkanal Schatten eines Objekts aus dem anderen Farbkanal auftreten. Solche Schattenbilder werden mit derselben Detektions-PSF verzerrt, wie das Hauptbild im eigentlichen Farbkanal. Dadurch ist ein im Kanal
Figure imgf000022_0010
detektiertes Bild eine Überlagerung der Bilder
Figure imgf000022_0005
entsprechend den den unterschiedlichen Farbkanälen zugeordneten Objekten:
Figure imgf000022_0006
Hier ist eine Entmischungsmatrix. Bei beispielsweise zwei Farben erhält man dann:
Figure imgf000022_0007
Figure imgf000022_0003
Die wahren Bilder zu gewinnen ist einfach, wenn deren Mischungsmatrix
Figure imgf000022_0008
Figure imgf000022_0009
bekannt ist. Ist dies nicht der Fall, kann sie durch Minimierung einer Kreuzkorrelation zwischen den erzeugten Bildern gewonnen werden, d. h. die Matrix ist so zu bestimmen, dass ihre Werte die niedrigste Kreuzkorrelation für die am besten entmischten Objekte sicherstellt. Ein weiteres und auch alternatives Vorgehen zur Analyse der Daten des Flächendetektors 19 basiert auf dem von Sheppard et al., Optik 80, Nr. 2, S. 53, 1982, beschriebenen Ansatz.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), wobei
- die Probe (2) mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe (2) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) gebündelt wird,
der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild (23) auf einen ortsauflösenden Flächendetektor (19) abgebildet wird, wobei der Flächendetektor (19) eine Ortsauflösung aufweist, die eine Beugungsstruktur (30-37) des Beugungsbildes (23) auflöst,
der Punkt relativ zur Probe (2) in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks (14),
der Flächendetektor (19) ausgelesen und aus den Daten des Flächendetektors (19) und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe (2) erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist,
zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen mittels eines spektral selektiven Moduls (15) das Beugungsbild (239) auf dem Flächendetektor (19) eine der Zahl an Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von Beugungsstrukturen (30- 37) erzeugt wird, die jeweils punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum sind und vollständig auf dem Flächendetektor (19) liegen,
beim Erzeugen des Bildes der Probe (2) die Beugungsstrukturen (30-37) ausgewertet werden,
dadurch gekennzeichnet, dass
die punktsymmetrischen Beugungsstrukturen (30-37) unterschiedliche Bereiche in der Bildebene (18) abdecken, aber ein gemeinsames Symmetriezentrum (40) haben.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereiche unterschiedlich phasenmanipuliert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Modul (15) eine Phasenbeeinflussungseinrichtung (17, 17a, 17b) aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nur Strahlung einer Wellenlänge von der Phasenbeeinflussungseinrichtung (17, 17a, 17b) beeinflusst wird und Strahlung einer anderen Wellenlänge nicht, so dass die Beugungsstruktur (30) dieser Strahlung ein Beugungsscheibchen ist.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beugungsstrukturen (30-37) koaxial sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Beugungsstrukturen (32-37) die gleiche Grundstruktur haben, gegeneinander auf dem
Flächendetektor (19) aber um einen Winkel verdreht sind.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Modul (15) nur die Beleuchtung beeinflusst, wobei der Beleuchtungsfleck (14) aus Beleuchtungsbeugungsstrukturen (38, 39) besteht, die sich unterscheiden, aber das gemeinsame Symmetriezentrum (40) haben.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Modul (15) nur die Abbildung beeinflusst, insbesondere dem Flächendetektor (19) vorgeordnet ist.
9. Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit
einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe (2), die zur Abgabe von
Fluoreszenzstrahlung anregbar ist,
einer Optik (1 1 -13), die eine im Probenraum liegende Fokalebene (29) und eine
Auflösungsgrenze hat,
- einer Beleuchtungseinrichtung (3), die einen Eingang (6) zum Zuführen von
Beleuchtungsstrahlung (5) aufweist und die über die Optik (1 1 -13) den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung (5) derart beleuchtet, dass die Optik (1 1 -13) die Beleuchtungsstrahlung (5) an einem Punkt in der Fokalebene (29) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) bündelt,
- einer Abbildungseinrichtung (4) zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene (29) durch die Optik (1 1 -13) in ein Beugungsbild (23) auf einem ortsauflösenden Flächendetektor (19), der in einer zur Fokalebene (29) konjugierten Bildebene (18) liegt, wobei der Flächendetektor (19) eine Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes (23) auflöst,
- einer Scaneinrichtung (10) zur Verschiebung des Punktes in verschiedene
Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des
Beleuchtungsflecks (14), und einer Auswerteeinrichtung (C) zum Auslesen des Flächendetektors (19), zum Auswerten einer Struktur des Beugungsbildes (23) aus Daten des Flächendetektors (19) und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe (2), das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist,
- wobei das Mikroskop (1 ) zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten
Wellenlängenbereichen ein spektral selektives Modul (15) aufweist, das das Beugungsbild (23) auf dem Flächendetektor (19) eine der Zahl an Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von Beugungsstrukturen (30-37) erzeugt,
der Flächendetektor (19) und das spektral selektive Modul (15) so ausgebildet sind, dass die Beugungsstrukturen (30-37) vollständig auf dem Flächendetektor (19) liegen, und
die Auswerteeinrichtung (C) beim Erzeugen des Bildes der Probe (2) die
Beugungsstrukturen (30-37) auswertet,
dadurch gekennzeichnet, dass
die punktsymmetrischen Beugungsstrukturen (30-37) unterschiedliche Bereiche in der Bildebene (18) abdecken, aber ein gemeinsames Symmetriezentrum (40) haben.
10. Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das spektralselektive Modul (15) eine Phasenbeeinflussungseinrichtung (17, 17a, 17b) zur Beeinflussung der
Beugungsstrukturen aufweist, welche die mindestens zwei vorbestimmten
Wellenlängenbereiche unterschiedlich phasenmanipuliert.
11 . Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die
Phasenbeeinflussungseinrichtung mindestens eine Phasenmaske (17, 17a, 17b) und/oder mindestens ein LCOS-SLM aufweist.
12. Mikroskop nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die
Phasenbeeinflussungseinrichtung (17) nur Strahlung eines Wellenlängenbereichs beeinflusst und Strahlung eines anderen Wellenlängenbereichs nicht, so dass deren Beugungsstruktur (30) ein Beugungsscheibchen ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Beugungsstrukturen (30-37) rotationssymmetrisch und koaxial sind.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Beugungsstrukturen (33-37) die gleiche Grundstruktur haben, gegeneinander auf dem
Flächendetektor (19) aber um einen Winkel verdreht sind.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Modul (15) in der Beleuchtungseinrichtung (3), nicht aber in der auch für die Abbildung wirkenden Optik (1 1 -13) angeordnet ist, so dass der Beleuchtungsfleck (14) aus Beleuchtungs-Beugungsstrukturen (38, 39) besteht, die sich unterscheiden, aber das gemeinsame Symmetriezentrum (40) haben.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Modul (15) in der Abbildungseinrichtung (4), nicht aber in der auch für die Beleuchtung wirkenden Optik (1 1 -13) angeordnet ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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DE102019203449A1 (de) * 2019-03-14 2020-09-17 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur Entfaltung von Bilddaten
DE102019107267A1 (de) * 2019-03-21 2020-09-24 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie
DE102020120190A1 (de) 2020-07-30 2022-02-03 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zum detektieren von emissionslicht, detektionsvorrichtung und laser-scanning-mikroskop
WO2022050221A1 (ja) * 2020-09-02 2022-03-10 株式会社ニコン 顕微鏡
CN113625439B (zh) * 2021-08-16 2023-06-06 深圳大学 平场照明的数字扫描结构光超分辨显微成像***及方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5043570A (en) 1989-07-13 1991-08-27 Anritsu Corporation High resolution microscoping system using convolution integration process
DE4416558C2 (de) 1994-02-01 1997-09-04 Hell Stefan Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
US5867604A (en) 1995-08-03 1999-02-02 Ben-Levy; Meir Imaging measurement system
US5866911A (en) 1994-07-15 1999-02-02 Baer; Stephen C. Method and apparatus for improving resolution in scanned optical system
EP1157297B1 (de) 1999-03-02 2002-11-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und vorrichtung zur objektabbildung
US6633432B2 (en) 2000-08-21 2003-10-14 Olympus Optical Co., Ltd. Optical device and a microscope
DE10325460A1 (de) 2003-04-13 2004-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Räumlich hochauflösendes Abbilden
WO2006127692A2 (en) 2005-05-23 2006-11-30 Hess Harald F Optical microscopy with phototransformable optical labels
DE102006021317B3 (de) 2006-05-06 2007-10-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe
EP2317362A1 (de) 2009-10-28 2011-05-04 Carl Zeiss MicroImaging GmbH Mikroskopisches Verfahren und Mikroskop mit gesteigerter Auflösung
WO2016020459A1 (de) 2014-08-06 2016-02-11 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende scanning-mikroskopie mit der unterscheidung mindestens zweier wellenlängenbereiche

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021393A2 (de) 1994-02-01 1995-08-10 Stefan Hell Vorrichtung und verfahren zum optischen messen eines probenpunktes einer probe mit hoher ortsauflösung
US7064824B2 (en) 2003-04-13 2006-06-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. High spatial resoulution imaging and modification of structures
DE102012201286A1 (de) 2012-01-30 2013-08-01 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren für die wellenlängenselektive und örtlich hochauflösende Mikroskopie
DE102012204128B4 (de) 2012-03-15 2023-11-16 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
DE102013019348A1 (de) 2013-08-15 2015-02-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
DE102013019347A1 (de) 2013-08-15 2015-02-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
DE102013015933A1 (de) 2013-09-19 2015-03-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
LU92740B1 (de) * 2015-06-11 2016-12-12 Leica Microsystems Abtastmikroskop
US10317342B2 (en) * 2015-07-05 2019-06-11 The Texas A&M University System Nanometer scale microscopy via graphene plasmons
DE102015116435A1 (de) 2015-09-29 2017-03-30 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Spektralbereiche
CN106770095A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 浙江大学 一种基于非线性光斑调制的超分辨显微成像方法和装置

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5043570A (en) 1989-07-13 1991-08-27 Anritsu Corporation High resolution microscoping system using convolution integration process
DE4416558C2 (de) 1994-02-01 1997-09-04 Hell Stefan Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
US5866911A (en) 1994-07-15 1999-02-02 Baer; Stephen C. Method and apparatus for improving resolution in scanned optical system
US5867604A (en) 1995-08-03 1999-02-02 Ben-Levy; Meir Imaging measurement system
EP1157297B1 (de) 1999-03-02 2002-11-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und vorrichtung zur objektabbildung
US6633432B2 (en) 2000-08-21 2003-10-14 Olympus Optical Co., Ltd. Optical device and a microscope
DE10325460A1 (de) 2003-04-13 2004-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Räumlich hochauflösendes Abbilden
WO2006127692A2 (en) 2005-05-23 2006-11-30 Hess Harald F Optical microscopy with phototransformable optical labels
DE102006021317B3 (de) 2006-05-06 2007-10-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe
EP2317362A1 (de) 2009-10-28 2011-05-04 Carl Zeiss MicroImaging GmbH Mikroskopisches Verfahren und Mikroskop mit gesteigerter Auflösung
WO2016020459A1 (de) 2014-08-06 2016-02-11 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende scanning-mikroskopie mit der unterscheidung mindestens zweier wellenlängenbereiche

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELL: "Far-Field Optical Nanoscopy", SCIENCE, vol. 316, 2007, pages 1153 - 1158, XP008108384, DOI: doi:10.1126/science.1137395
KLAUS WEISSHART: "The Basic Principle of Airyscanning", 31 July 2014 (2014-07-31), XP055508368, Retrieved from the Internet <URL:https://www.embl.de/services/core_facilities/almf/events_ext/2017/EN_wp_LSM-880_Basic-Principle-Airyscan.pdf> [retrieved on 20180920] *
SHANGTING YOU ET AL: "Isotropic superresolution imaging for fluorescence emission difference microscopy", APPLIED OPTICS, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC; US, vol. 53, no. 33, 20 November 2014 (2014-11-20), pages 7838 - 7844, XP001592882, ISSN: 0003-6935, [retrieved on 20141112], DOI: 10.1364/AO.53.007838 *
SHEPPARD ET AL., OPTIK, vol. 80, no. 2, 1982, pages 53
WENSHENG WANG ET AL: "Dual-color super-resolution imaging by fluorescence emission difference microscopy", IMAGING AND APPLIED OPTICS CONGRESS, 28 July 2016 (2016-07-28), XP055507891 *
YOAV SHECHTMAN ET AL: "Multicolour localization microscopy by point-spread-function engineering", NATURE PHOTONICS, vol. 10, no. 9, 8 August 2016 (2016-08-08), UK, pages 590 - 594, XP055507327, ISSN: 1749-4885, DOI: 10.1038/nphoton.2016.137 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111413791A (zh) * 2019-01-07 2020-07-14 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 高分辨率扫描显微术
CN111413791B (zh) * 2019-01-07 2024-03-12 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 高分辨率扫描显微术

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Publication number Publication date
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CN110869833A (zh) 2020-03-06
US11573412B2 (en) 2023-02-07
DE102017113683A1 (de) 2018-12-27

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