CN111413791B - 高分辨率扫描显微术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种样品的高分辨率扫描显微术，其中实行以下步骤：a)通过照明辐射照明样品，b)将点在空间分辨表面检测器上成像为衍射图像，其中衍射结构被分辨，c)在至少两个扫描方向上相对于样品移位点，且在各种扫描位置中从检测器像素中读取像素信号，其中像素信号分别分配到扫描位置，并且相邻的扫描位置彼此重叠而且根据扫描增量来设置，d)生成样品的图像，图像的分辨率提高至超过成像的分辨率极限，其中，在步骤d)中基于所读取的像素信号和所分配的扫描位置且基于点扩散函数来实行解卷积，其中基于像素信号和样品的图像，在解卷积中对于扫描方向中的至少一个扫描方向生成中间位置，该样品的图像包含比扫描位置更多的图像点。
Description
技术领域
本发明涉及样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中样品通过照明辐射在样品中或样品上的一点处被照明，将该点沿着光轴且根据点扩散函数成像在包括检测器像素的空间分辨表面检测器上来成像为衍射图像，其中衍射图像的衍射结构被分辨，将该点相对于样品移位且从检测像素中读取像素信号以对位置进行扫描，其中相邻的扫描位置重叠并且根据扫描增量来设置，并且从所读取的像素信号和所分配的扫描位置中生成样品的图像，该样品的图像的分辨率提高至超过成像的分辨率极限。
本发明还涉及样品的高分辨率扫描显微术的显微镜，包括：照明光束路径，用于照明样品上或样品中的点；成像光束路径，用于沿着光轴将该点在具有检测器像素的空间分辨表面检测器上衍射极限地成像为衍射图像，其中成像光束路径具有点扩散函数且表面检测器将衍射图像的一个衍射结构进行分辨；扫描装置，用于相对于样品移位该点；评估装置，该评估装置以控制的方式连接到表面检测器和扫描装置，并且该评估装置被配置为：致动用于相对于样品移位点的扫描装置，在读出时间从检测器像素中读出像素信号，其中读出时间设定扫描位置且相邻的扫描位置重叠且根据扫描增量进行设置，并且从所读取的像素信号和属于相应读出时间的扫描位置生成样品的图像，该图像的分辨率提高至超过成像光束路径的分辨率极限。
背景技术
光学显微镜的常规应用领域是激光扫描显微术(也简称LSM)，它将共聚焦检测布置用于仅对位于物镜的焦平面中的样品的平面进行成像(参见US 3013467A)。所获得的是光学截面，其厚度取决于共焦光阑的尺寸。在样品的不同深度处记录多个光学截面允许生成样品的三维图像，然后该三维图像由不同的光学截面构成。因此，激光扫描显微术适用于检查较厚制品。
在激光扫描显微术中，在不同的扫描位置中对样品进行扫描。在每个扫描位置处，通过针孔记录共聚焦信号。空间分辨率由扫描位置的密度决定性地确定。获得的图像点的数目恰好等于扫描位置的数目。因此，扫描位置的密度的增加与针孔光阑的减小直接关联，因为当扫描位置较靠近在一起地进行移动时必须减小针孔的尺寸。这限制了分辨率的提高，因为在针孔太小的情况下，检测器处的信噪比变得不合适，使得无法再组合扫描位置处获得的单独的信号以形成有意义的图像。所谓的艾里扫描显微术利用此作为起点。借助于允许更密集地布置扫描位置而不必相应地减小针孔的尺寸，艾里扫描显微术提高了分辨率。替代地，用空间分辨率检测样品光，即在空间分辨检测器上成像样品光，所述样品光来自样品区域，在常规的激光扫描显微术中，该样品区域将对应于很大的针孔，因此不会适合提高分辨率。同时，扫描位置之间的距离减少，使得单独扫描位置目前发生重叠。然而，通过数学解卷积对于每个扫描位置获得图像信息，因此总体上，出现了图像，其像素的数目对应于扫描位置(现在较靠近在一起)的数目。由于相对于常规的激光扫描显微术，扫描位置的密度增加，因此分辨率最终也得到了改进。
例如，在EP 2317362 A1中描述了以这种方式克服常规激光扫描显微镜的分辨率极限。在其中图5中所图示和描述的实施例中，该文件将对样品的衍射受限的照明与表面检测器组合，其中扫描装置被实施为使得用衍射受限的照明斑进行照明的该点的衍射图像停留在表面检测器上。该布置被称为所谓的“解扫描(de-scanned)”检测器布置。典型地通过设置扫描仪来实现，其使光束路径在样品和组合点之间偏转，该组合点位于照明装置和成像装置之间。这样的扫描仪作用在照明光斑上和在被照明光斑照明的点的成像上，结果是在扫描仪之后的成像方向上的束路径是静态的。这样的扫描仪的替代例是使用可移动的样品台来移位样品。在该情况下，衍射图像还停留在表面检测器上。在EP 2317362 A1的构思中，表面检测器配备有空间分辨率，该空间分辨率相对于成像比例，实现对衍射图像的过采样且允许衍射图像的结构被分辨，并且因此有助于更密集地布置扫描位置(相对于常规的激光扫描显微术)。与艾里扫描显微术有关的其他出版物包括US 8705172、DE102010049627A1、US2011/0267688和C.Mueller等人在2010年的《物理综述快报(Phys.Rev.Lett.)》的第104卷、198101发表的出版物；A.York等人于2012年在《自然方法(Nature Methods)》的第9卷发表的《经由多焦点结构化照明显微术在活体、多细胞组织中使分辨率翻倍(Resolution doubling in live,multi-cellular organisms viamultifocal Structured Illumination Microscopy)》；G.De Luca等人在《生物医学光学快讯(Biomedical Optics Express)》的第4卷、第11期的第2644–2656页上发表的《重新扫描共聚焦显微镜：扫描两次以获得更好的分辨率(Re-scan confocal microscopy:scanning twice for better resolution)》；S.Roth的《光学光子重新分配显微术(OPRA)(Optical photon reassignment microscopy(OPRA))》，arXiv：1306.6230；I.Gregor等人于2017年4月24日在SPIE会议10071的100710C上发表的《单分子光谱术和超分辨率成像X(Single Molecule Spectroscopy and Superresolution Imaging X)》(doi：10.1117/12.2255891)；以及A.Jesacher等人在2015年的《Optica》第2卷、第210–213页上发表的《来自二维扫描的三维信息：具有采集后重新聚焦能力的扫描显微镜(Three-dimensionalinformation from two-dimensional scans:a scanning microscope withpostacquisition refocusing capability)》。后面的出版物使用相位掩模以对深度信息进行z编码。
由于在激光扫描显微术和艾里扫描显微术二者中通过扫描顺序地产生图像，因此从检测器的读取信号的时间序列生成图像像素，即最终图像的像素。原则上，扫描位置越靠近在一起，即时间读出之间经过的时间越短，可以分配的扫描像素越小。这通过所谓的奈奎斯特定理与空间分辨率关联。因此，需要至少2倍的过采样以便获得期望的分辨率。然而，在快速读出检测器的情况下，数据速率提高和/或可以操作显微镜的有效记录速度降低。通常，当检测器以高数据速率操作时，即，如果应该以高频率进行读出，则该检测器的噪声性能会恶化。
发明内容
本发明是基于以下目的：在不损失分辨率的情况下提高艾里扫描显微术中的记录速度(例如，降低读出速度)。
本发明在下文中限定。下文还涉及有利的实施例和发展。
本发明提供一种用于样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中实行以下步骤：
a)通过照明辐射在所述样品中或所述样品上的点处照明所述样品，
b)将所述点沿着光轴且根据点扩散函数在包括检测器像素的空间分辨表面检测器上成像为衍射图像，其中所述衍射图像的衍射结构被分辨，
c)在至少两个扫描方向上相对于所述样品移位所述点，且在各种扫描位置中从所述检测器像素中读取像素信号，其中所述像素信号被分别分配到在该处读出所述像素信号的扫描位置，并且相邻的扫描位置彼此重叠而且根据扫描增量来设置，
d)从所读取的像素信号和所分配的扫描位置生成所述样品的图像，所述图像的分辨率提高至超过成像的分辨率极限，
其中，在步骤d)中基于所读取的像素信号和所分配的扫描位置且基于所述点扩散函数来实行解卷积，其中基于所述像素信号和所述样品的图像，在所述解卷积中针对所述扫描方向中的至少一个扫描方向生成中间位置，所述样品的图像包含比扫描位置更多的图像点。
优选地，步骤c)中的所述扫描增量大于所述点扩散函数的半高宽。
优选地，在所述解卷积期间，所述像素信号是对于每个扫描位置傅里叶变换的，且在傅里叶空间中生成所述中间位置。
优选地，实行线性解卷积。
优选地，所述扫描方向包括与所述光轴对齐的z方向，并且将所述点相对于所述样品在所述z方向上间隔开的至少两个扫描平面中移位，并且在步骤d)中，生成所述样品的图像的z堆栈，其中所述堆栈中的z间隔小于所述z方向上的所述扫描增量。
优选地，所述点扩散函数不是为了生成不对称性的目的而进行操纵，并且在所述三维重构中通过来自重叠区域的图像信息来确定关于所述焦平面的绝对位置。
优选地，将所述点在扫描方向中的至少一个扫描方向上连续地移位，并且在所述扫描方向上所读出的时间设定扫描位置。
本发明还提供一种用于样品的高分辨率扫描显微术的显微镜，包括：
-照明光束路径，用于照明所述样品中或所述样品上的点，
-成像光束路径，用于沿着光轴将所述点在具有检测器像素的空间分辨表面检测器上衍射受限地成像为衍射图像，其中所述成像光束路径具有点扩散函数且所述表面检测器对所述衍射图像的一个衍射结构进行分辨，
-扫描装置，用于在至少两个扫描方向上相对于所述样品移位所述点，
-评估装置，所述评估装置以控制的方式连接到所述表面检测器和所述扫描装置，并且所述评估装置被配置为：
--致动用于相对于所述样品移位所述点的扫描装置，
--从所述检测器像素中读取关于扫描位置的像素信号，并且将所述像素信号分配到在该处读取所述像素信号的相应的扫描位置，其中相邻的扫描位置重叠并且根据扫描增量来设置，
--从所读取的像素信号和所分配的扫描位置中生成所述样品的图像，所述图像的分辨率提高至超过所述成像光束路径的分辨率极限，
其中，所述评估装置还被配置为基于属于相应的读出时间的所读取的像素信号和扫描位置且基于所述点扩散函数来实行解卷积，其中所述评估装置被配置为基于所述像素信号，在所述解卷积中针对所述扫描方向中的至少一个扫描方向生成中间位置，以及生成所述样品的图像，所述图像包含比扫描位置更多的图像点。
优选地，所述扫描增量大于所述点扩散函数的半高宽。
优选地，所述评估装置被配置为在所述解卷积期间，对于每个扫描位置对所述像素信号进行傅里叶变换，并且在傅里叶空间生成所述中间位置。
优选地，所述评估装置被配置为实行线性解卷积。
优选地，所指定的方向包括与所述光轴对齐的z方向，并且所述评估装置被配置为致动所述扫描装置使得将所述点相对于所述样品在所述z方向上间隔开的至少两个扫描平面中移位，并且所述评估装置还被配置为生成所述样品的图像的z堆栈，其中所述堆栈中的z间隔小于所述z方向上的所述扫描增量。
优选地，所述点扩散函数不是为了生成不对称性的目的而进行操纵，并且所述评估装置被配置为在所述三维重构中通过来自重叠区域的图像信息来确定关于所述焦平面的绝对位置。
本发明提供了一种根据艾里扫描原理对样品进行高分辨率激光扫描显微术的方法。用照明辐射照明样品。该样品上的照明点以衍射受限的方式在表面检测器上成像为衍射图像。这是沿着光轴且根据点扩散函数(下文还简称为PSF)来实现的，众所周知，该点扩散函数描述了成像分辨率。所述表面检测器包括像素，并且具有分辨衍射图像的衍射结构的空间分辨率。成像点相对于样品在至少两个扫描方向上以相对方式移位。原则上，指定样品上分别成像的样品光斑的单独位置的扫描位置被设定。扫描位置被选择为使得样品的每个点在衍射图像中被多次包含。这优选地对于每个扫描方向在格栅类型的扫描的情况下得到满足，即，然后在x、y和z方向上提供重叠。根据在至少一个特定方向上的扫描增量来设置相邻的扫描位置。然后，将它们的中心间隔开一个扫描增量。自然地，还可能与中心以外的其他参考点有关。像素信号被分配给获得像素信号的扫描位置。
扫描方向可以包括x方向和/或y方向和/或z方向。
因此，根据扫描仪的配置，将扫描位置关联到读出时间。如果扫描仪在一个方向上连续地移位，则读出时间定义扫描位置(即扫描仪的相应位置)，在该扫描位置上读取检测器。然后，在读出时间读取来自检测器像素的像素信号。通常，这通过统一的读出时钟来实现。在基于逐步操作的扫描仪的情况下，仅由扫描仪的致动来设定扫描位置。还存在混合形式，例如，其中扫描仪以连续的方式在一个方向(例如，x方向)上移位，并以与其垂直的逐步的方式(例如，在y方向上)移位。在此，术语“扫描仪”还包括深度扫描，即，扫描仪还可以带来z方向的位移；这还可以以连续或逐步的方式来实现。
通常，基于读取的像素信号和相关联的扫描位置且基于点扩散函数进行三维和/或例如线性解卷积，并且生成样品的图像。在此，在解卷积内，基于像素信号在至少一个扫描方向上生成中间位置。然后，通过这些中间位置生成包含比扫描位置更多的图像点的样品的图像。因此，分辨率提高到超过常规的艾里扫描显微术的分辨率。
重要的是，相邻的扫描位置重叠。关于点扩散函数，出于取向的目的可以使用半高宽。为了实现重叠，扫描增量小于点扩散函数的半高宽的两倍。如果出于取向的目的使用光学分辨率极限，则扫描增量小于光学分辨率极限。
由于根据艾里扫描原理在显微术中实行的解卷积包含傅里叶变换，因此通常优选以下实施例：在解卷积期间将像素信号对于每个扫描位置进行傅里叶变换之后在傅里叶空间中生成中间位置。然后，中间位置在傅里叶空间中由频率(特别是较高的频率)来表示且在实空间中由扫描位置之间的位置来表示。
为了尽可能缓慢地读取表面检测器，在实施例中，将扫描增量在扫描方向上，优选在所有扫描方向(即，在x方向和/或y方向和/或z方向上)保持在一个长度间隔内。向上，长度间隔受点扩散函数的半高宽的两倍所限制。这确保相邻的扫描位置的成像的样品光斑重叠。向下，长度间隔受点扩散函数的半高宽限制；这高于奈奎斯特定理的最低要求。在每种情况下，沿相应的(x，y，z)方向测量点扩散函数的半高宽。因此，在实施例中，长度间隔对于不同方向具有不同的限制。x和y是横向于光轴的方向的示例；z方向沿光轴延伸。在常规的旋转对称PSF的情况下，长度间隔在x方向和y方向上通常是相同的，而通常在z方向上更大。
优选地，扫描位置的间隔大于奈奎斯特和现有技术所规定的间隔。与常规的艾里扫描显微术相比，这减少了图像记录的持续时间，但是由于来自各种检测器像素的信息用于生成中间位置而提高了分辨率。因此，不再需要根据奈奎斯特进行过采样。在成像期间(以及可选地在照明期间，即激发期间)关于点扩散函数的知识，允许扫描增量与表面检测器的像素尺寸(即其分辨率)保持平衡，使得扫描位置的数目可以最小化。例如，在z堆栈(z-stack)的情况下，这可能会使所需扫描平面的数目近似地减半。
检测器像素是表面检测器的像素。图像像素是最终高分辨率图像的像素。在每种情况下，通过在扫描位置处读取检测器会出现扫描像素。本发明相对于扫描像素的数目增加了图像像素的数目；根据奈奎斯特和常规的艾里扫描显微术，这是不可能的。作为在三维解卷积中生成中间位置的结果，扫描像素可以大于点扩散函数的半高宽。令人惊讶地，增加扫描增量或减少扫描像素的数目不会导致分辨率的损失。因此，这导致生成图像所需的时间减少，而不必增加表面检测器的读出速度，或在图像记录持续时间不变的情况下提高分辨率。
有时，生成在z方向上堆栈的图像时可能会出现歧义问题。它由以下事实构成：尽管已知点相对于焦平面的相对位置，但不知道该点位于焦平面上方还是下方。因此，绝对位置是未知的。如果不修改点扩散函数，则点扩散函数实质上是关于光轴对称的(由于不完美的分量，仍可能出现不可避免的残留不对称现象——决定性的是，不存在有目标的PSF操纵)。该对称性通常是关于焦平面的对称性。通常，点扩散函数也相对于光轴对称，特别是旋转对称的。在大多数显微镜中，在束腰坐落在焦平面中的情况下，点扩散函数对应于沙漏形状。由于成像元件的实际实现方式而发生的任何剩余的不对称性不会导致修改，使得从单个图像进行三维重构将产生不具有唯一性的深度分辨的图像。
借助于从在z方向上间隔开的至少两个扫描平面实现的图像堆栈，在发展例中可以消除该歧义，至少两个扫描平面的景深范围在重叠区域中轴向地(即在z方向上)重叠。然后，扫描增量位于长度间隔的z方向上。因此，两个扫描平面的景深范围(在轴向方向上由点扩散函数的半高宽的两倍来给定)使得扫描平面在轴向方向上部分(但不完全)覆盖彼此。可以通过来自重叠区域的图像信息来避免歧义。可以从重叠区域的图像信息中确定绝对位置，并且可以消除重构中的歧义。
因此，在实施例中，成像和照明的光束路径没有操纵点扩散函数且引入有目标的、可确定的不对称度的元件，这对于深度分辨的方法来说是必需的，且用于深度分辨的方法，例如在Jesacher等人的出版物中所解释的。特别地，光束路径不包含像散透镜或相位掩模，其以指定的方式有目标地不对称地且依赖于深度来调制点扩散函数。
实施例中的三维重构在轴向上间隔开的多个离散截平面中生成图像。在一种发展例中，优选的是，生成深度分辨的图像，使得该深度分辨的图像包含多个离散的截平面，该截平面的间隔小于轴向方向上的扫描增量。
使用照明辐射，可以激发荧光辐射的发射，这改进了信噪比且总体上增强了算法，特别是截面厚度可以是非常薄。因此，可选地，将照明辐射聚焦在样品中或样品上的一点处，以形成衍射受限的照明光斑。在衍射受限的照明的情况下，以衍射受限的方式成像的光斑与照明光斑完全重叠。
与该方法类似地提供的显微镜具有评估装置，该评估装置执行方法步骤并且被实施为适合于该方法步骤。类似于该方法，提供对应的显微镜，该显微镜包括：照明光束路径，用于照明具有所述特性的样品；以及成像光束路径，用于将点在具有其像素的表面检测器上衍射受限地成像为衍射图像。在上面和/或下面的文本解释了显微术的方法的各方面的情况下，所述各方面同样涉及评估装置，该评估装置被实施为适合于实行对应的方法步骤。这可以是用对应的软件或对应的程序代码实现的计算机。相反，在显微镜和/或其评估装置和/或其操作的基础上描述的各方面同样涉及显微术的方法。
不言而喻，在不脱离本发明的范围的情况下，上文提及的特征和下文要解释的特征不仅可以用在指定的组合中，还可以用在其他组合中或单独使用。
下面将基于示例性实施例且参考附图来更加详细地解释本发明，该附图同样地公开了本发明所必需的特征。这些示例性实施例仅用于阐明，并且不应解释为限制性的。举例来说，不应将具有多个元件或部件的示例性实施例的描述解释为，所有这些元件或部件出于实现方式的目的都是必需的。而是，其他示例性实施例还可以包含替代元件和部件、较少的元件或部件、或者附加的元件或部件。除非另外指出，否则不同示例性实施例的元件或部件可以彼此组合。针对示例性实施例之一所描述的修改和变化还可以适用于其他示例性实施例。为了避免重复，在不同附图中相同的元件或对应的元件用相同的附图标记来指示表示且不重复说明。附图中：
附图说明
图1示出了高分辨率显微术的显微镜的示意图，
图2示出了检测器像素的示意图，
图3示出了扫描图案的示意图，以及
图4示出了显微术方法的流程图。
具体实施方式
图1示意性示出了具有高分辨率的共聚焦显微镜20，例如其分辨率增加至超过根据所谓的艾里扫描的原理的衍射极限，例如从EP 2317362 A1已知。它具有光源6，用于用照明光斑14照明样品P。将照明光B经由束成形构件7、反射镜8引导到分束器9。分束器9被实施为使得其反射尽可能多的照明光B并且将该照明光B引导至扫描仪10。将照明光B从扫描仪10经由其他束成形光学单元11和12引导至物镜13。物镜13将照明光B聚焦到样品P上以形成照明光斑，该照明光斑位于焦平面中。
照明光斑中(即在点14处)样品所生成的样品光D被物镜13收集并且在关于照明光B的反向路径上被引导至分束器9。分束器9被实施为使得其将尽可能大部分的样品光D透射。因此由分束器9透射的样品光D经由其他滤光器15和其他束成形光学单元16通行到检测器17。检测器17检测样品光D，从其中生成电信号并且将电信号经由导体23、24、25传递到控制和评估装置C，例如计算机。以这种方法，记录该点14的衍射图像18，该衍射图像18如衍射结构18a展示那样是衍射受限的。数学上，这通过点扩散函数(PSF)描述。
为了获得样品P的图像，用扫描仪10将点14在样品P上移动，并且在过程中检测器17被读出。从获得的信号中，例如可以使用监控器来呈现的图像由控制和评估装置C进行编译。
扫描仪10允许横向的二维位移，即在垂直于物镜的光轴的平面上。此外，物镜13可通过驱动器26调整，使得样品P中的焦平面的位置被移位。
图2以俯视图示意性示出了检测器17。为了实现高分辨率，共聚焦显微镜20的检测器17包括多个检测元件或像素31。在示例性方式下，布置包括二十一个像素31，还可以使用不同数目的像素。像素31的大小被选择为使得它们显著地小于在检测器17上生成的衍射图像18。因此，总体上分辨出衍射结构18a。同时，像素31的数目及因此检测器17的整个表面选择为使得对于衍射图像18可以检测相当大一部分的样品光D。为了比较，图2用虚线方式指示了检测器区域30，如可用于具有典型的分辨率的共聚焦显微镜。术语典型的分辨率在此被理解为意味着至多对应于阿贝极限的实现的分辨率。相比之下，具有提高分辨率的共聚焦显微镜20根据艾里原理进行操作，并且因此理论上可以实现将分辨率提高一倍。实践中，分辨率提高地略少，因为在分辨率极限附近的结构仅可能以非常差的对比度进行传输。实际上可以实现高达1.7倍的阿贝极限的分辨率。
具有高分辨率的共聚焦显微镜20的检测器17对于每个扫描的点捕获P个像素信号，其对应于检测器像素31的数目。样品P借助于在样品P上移位的点17进行扫描。这在图3中进行阐明。在连续的读出时间读取检测器像素31。因为扫描仪10将该点14在样品上同时地进行移位，在每个读出时间呈现扫描位置32(图3中为简化起见用圆描绘)。在将扫描仪在x方向上连续地推进，读出时间之间的时间间隔设定了局部扫描增量d以及扫描速度，相邻的扫描位置31根据所述扫描增量进行设置(例如，中心的间隔或其他固定的参考点)。这适用于沿着栅格类型扫描(raster-type scan)的扫描轴线，具体是指最快扫描轴线。这在图3中为x方向。在完全间歇式的操作扫描仪的情况下，读出时钟对于扫描位置的定义是不重要的。对于栅格类型扫描的多达两个其他扫描轴线(y，z)而言，扫描仪致动仅设定扫描增量d。
在至少一个某一方向(例如，z方向)，扫描增量d至少和PSF的半高宽一样大。因此，该下限是方向相关的。这相当于在相应方向上的分辨率的一半，即静态可分辨结构的一半。另一方面，扫描增量d不小于而是大于PSF在相应方向上的半高宽的两倍，使得扫描位置重叠。因此，上限也是方向相关的。
尽管每个样品点至少有一次位于每个扫描像素中，该扫描像素通过将检测器表面投射到在分配给扫描像素的扫描位置处(不会至少两次位于那里)的样品中来限定，如由奈奎斯特理论所需求的那样。
作为像素信号，每个检测器像素31从样品捕获原始图像信号。原始图像信号彼此不同，其中差异由点14相对于由相应检测器像素来检测的样品区域的横向距离来确定。原始图像信号通过将“实际”样品图像与相应检测器像素31的PSF进行卷积来在数学上描述。
评估单元C的功能为从所有像素信号中重构尽可能准确地对应于样品的原型的图像。为此使用解卷积(DCV)和这样的解卷积原始图像信号的随后结合，其中解卷积和结合过程可以用过程技术的方式彼此合并。
图4示意性图示了生成图像的过程，其表示四个基本步骤S1-S4。在步骤S1中，开始样品的扫描过程，在该范围内将点14在样品表面上沿着x方向移位。在一行在x方向上来回移动之后，在y方向上存在位移作为行跳跃。一旦多个行以这种方法完成，就设定第二扫描平面，即存在z方向上的调整。为了简单起见，将这与图3中y方向上的调整组合。图3中，如果表示被认为是样品P的俯视图，则发生y方向上的移位。相比之下，如果图3中的表示被认为是垂直于样品表面的横截面图，则出现z方向上的移位，即沿着辐射入射的光轴。
在步骤S2中，在沿着扫描增量堆叠的某些扫描位置处(例如由连续的扫描仪移位和等距读出时间给定)，在步骤S1中引入的调整期间，连续地对于所有检测器像素31将检测器17的信号读取。举例而言，与扫描位移过程一起，每个读出时间设定扫描位置32中的一个。然后，读出时间选择为使得在x方向上与位移速度一起达到图3中设定的扫描增量d。
扫描位置32重叠；然而，该重叠小于扫描光斑的尺寸的一半或点扩散函数的半高宽的一半。
在步骤S3中，将检测器像素31的像素信号分配给扫描位置32，并且完成扫描过程。
随后，步骤S4中通过计算重构，考虑PSF，从具有相关联的扫描位置的像素信号生成样品P的图像。
如已经提及的，一个实施例中照明光束路径和成像光束路径没有获得操纵元件来使得点扩散函数在有目标的方式下不对称，特别是未提供像散透镜或相位掩模。术语操纵在此旨在于有目标地影响点扩散函数，通过其生成不对称性来防止特别是3D重构中，在位于焦平面下方的层和位于焦平面上方的层的之间的含糊不清。因此，有目标的操纵意味着焦平面下方的层具有与位于焦平面上方的层唯一不同的点扩散函数。这样的操纵典型地需要在光束路径中使用相位掩模和/或像散元件。
在附加地衍射受限的照明中实现最大分辨率。出于解释重构的目的，该情况因此以示例性方式来描绘。此外，在z方向上以示例性方式提高分辨率。
由所有像素31总体检测的信号D(r,p)可以被认为是将激发PSFE(r)和样品光的强度分布O(r)的乘积与成像PSFH(r)进行卷积：
在等式(1)中，p＝(px,py,pz)指示激发的位置，即在样品上，并且r＝(x,y,z)指示检测器像素31的位置。由于表面检测器，z＝0可以设定在D中，因为表面检测器仅在x和y上而不是z上延伸。
因此，等式(1)可以写作：
在常规艾里扫描评估的情况下，在表面检测器的坐标上的x和y中(即在表面检测器的单独像素上)进行求和。这不会实现在该情况下。替代地，基于像素信号生成中间位置。因为根据等式(2)在傅里叶空间中运用解卷积，这些中间位置对应于该情况下的附加较高频率。但是，在该情况下它们被认为是中间位置，因为即使它们在傅里叶空间中按频率呈现，它们也表示相对在实际空间中观看时的扫描位置的中间位置。举例而言，通过狄拉克梳δ(参见https://en.wikipedia.org/wiki/Dirac_comb)在x、y和z中生成中间位置：
因此，Δpz表示在z中附加的中间位置之间的距离。等式(3)的傅里叶变换关于px,py,pz适应：
/>
具有周期Δpz的狄拉克梳的傅里叶变换是具有周期1/Δpz的狄拉克梳。如果将傅里叶变换的等式(1)***等式(4)，则获得以下分解的一般方程组：
如果将FTx′,y′,z′{E(x′,y′,z′)H(x+x′,y+y′,z′)}替换为则获得下式：
为了简化起见，令x和y为检测器像素位置且令i为像素索引：
由于考虑了检测器像素的x、y坐标，等式(7)相对于由所测得的扫描位置的采样提高了z方向上在物空间中的采样。变换完全由PSF的“共聚焦”傅里叶变换来限定。可以例如由傅里叶空间中的线性回归分析获得物空间中的z尺寸。在解卷积中，由于考虑检测器像素的x、y坐标而生成前文提及的附加的位置，使得样品的图像总体上在指定的方向上(在该情况下为z方向)包含比在该指定的扫描方向上扫描位置更多的像素。
该过程不限于在z方向上改进，但是可以总体上适用于全部三个方向x、y和z。在此，然后可以利用三维狄拉克梳，该三维狄拉克梳如下：
类似于等式(3)的计算，然后该等式的傅里叶变换是：
然后如果等式(9)***等式(8)，则获得解卷积的等式的集合，其可以写为下式：
如果只考虑一个方向，则一般方程组简化为等式(7)(在该情况下针对z方向)。自然地，还可以以类似方式对两个方向进行约简。
对于全部实施例共同的是，检测器像素的单独像素信号用于在解卷积中在至少一个指定方向上确定中间位置，并且因此补足扫描位置，以及最终具有其他中间位置的扫描像素。因此，图像中的像素比扫描像素(即，扫描位置)更多。
Claims (13)
1.一种用于样品(P)的高分辨率扫描显微术的方法，其中实行以下步骤：
a)通过照明辐射(B)在所述样品(P)中或所述样品上的点(14)处照明所述样品(P)，
b)将所述点(14)沿着光轴且根据点扩散函数在包括检测器像素(31)的空间分辨表面检测器(17)上成像为衍射图像(18)，其中所述衍射图像(18)的衍射结构(18a)被分辨，
c)在至少两个扫描方向上相对于所述样品(P)移位所述点(14)，且在各种扫描位置(32)中从所述检测器像素中读取像素信号，其中所述像素信号被分别分配到读出所述像素信号处的扫描位置(32)，并且相邻的扫描位置(32)彼此重叠而且根据扫描增量(d)来设置，
d)从所读取的像素信号和所分配的扫描位置(32)生成所述样品(P)的图像，所述图像的分辨率提高至超过成像的分辨率极限，
其中，在步骤d)中基于所读取的像素信号和所分配的扫描位置(32)且基于所述点扩散函数来实行解卷积，其中基于所述像素信号和所述样品(P)的图像，在所述解卷积中针对所述扫描方向中的至少一个扫描方向生成中间位置，所述样品(P)的图像包含比扫描位置(32)更多的图像点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中的所述扫描增量(d)大于所述点扩散函数的半高宽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述解卷积期间，所述像素信号是对于每个扫描位置(32)傅里叶变换的，且在傅里叶空间中生成所述中间位置。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，实行线性解卷积。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述扫描方向包括与所述光轴对齐的z方向，并且将所述点(14)相对于所述样品(P)在所述z方向上间隔开的至少两个扫描平面中移位，并且在步骤d)中，生成所述样品的图像的z堆栈，其中所述堆栈中的z间隔小于所述z方向上的所述扫描增量(d)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述点扩散函数不是为了生成不对称性的目的而进行操纵，并且在三维重构中通过来自重叠区域的图像信息来确定关于焦平面的绝对位置。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述点在扫描方向中的至少一个扫描方向上连续地移位，并且在所述扫描方向上所读出的时间设定扫描位置。
8.一种用于样品(P)的高分辨率扫描显微术的显微镜，包括：
-照明光束路径，用于照明所述样品(P)中或所述样品(P)上的点(14)，
-成像光束路径，用于沿着光轴将所述点(14)在具有检测器像素(31)的空间分辨表面检测器(17)上衍射受限地成像为衍射图像(18)，其中所述成像光束路径具有点扩散函数且所述空间分辨表面检测器(17)对所述衍射图像(18)的一个衍射结构(18a)进行分辨，
-扫描装置(10)，用于在至少两个扫描方向上相对于所述样品(P)移位所述点(14)，
-评估装置(C)，所述评估装置以控制的方式连接到所述空间分辨表面检测器(17)和所述扫描装置(10)，并且所述评估装置被配置为：
--致动用于相对于所述样品(P)移位所述点(14)的扫描装置(10)，
--从所述检测器像素(31)中读取关于扫描位置的像素信号，并且将所述像素信号分配到读取所述像素信号处的相应的扫描位置(32)，其中相邻的扫描位置(32)重叠并且根据扫描增量(d)来设置，
--从所读取的像素信号和所分配的扫描位置(32)中生成所述样品(P)的图像，所述图像的分辨率提高至超过所述成像光束路径的分辨率极限，
其中，所述评估装置(C)还被配置为基于属于相应的读出时间的所读取的像素信号和扫描位置(32)且基于所述点扩散函数来实行解卷积，其中所述评估装置(C)被配置为基于所述像素信号，在所述解卷积中针对所述扫描方向中的至少一个扫描方向生成中间位置，以及生成所述样品(P)的图像，所述图像包含比扫描位置(32)更多的图像点。
9.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述扫描增量(d)大于所述点扩散函数的半高宽。
10.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述评估装置(C)被配置为在所述解卷积期间，对于每个扫描位置(32)对所述像素信号进行傅里叶变换，并且在傅里叶空间生成所述中间位置。
11.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述评估装置(C)被配置为实行线性解卷积。
12.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所指定的方向包括与所述光轴(z)对齐的z方向，并且所述评估装置(C)被配置为致动所述扫描装置使得将所述点相对于所述样品(P)在所述z方向上间隔开的至少两个扫描平面中移位，并且所述评估装置还被配置为生成所述样品的图像的z堆栈，其中所述堆栈中的z间隔小于所述z方向上的所述扫描增量(d)。
13.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述点扩散函数不是为了生成不对称性的目的而进行操纵，并且所述评估装置(C)被配置为在三维重构中通过来自重叠区域的图像信息来确定关于焦平面的绝对位置。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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