CN110869833B - 在至少两个波长范围之间进行辨别的高分辨率扫描显微术 - Google Patents

Abstract

出于高分辨率扫描显微术的目的，样品(2)由照明辐射(5)激发以发射荧光辐射，使得将照明辐射聚焦在样品(2)中或样品(2)上的点处，以形成衍射受限的照明光斑(14)。以衍射受限的方式将点成像在空间分辨二维检测器(19)上的衍射图像(23)中。以小于照明光斑(14)的一半直径的增量，通过不同的扫描位置来扫描样品。从二维检测器(19)的数据以及从向这些数据分配的扫描位置生成样品的图像，该图像的分辨率增加以超过成像的分辨率极限。对应于至少两个预先确定的波长范围的一定数目的衍射结构(30‑37)生成在二维检测器(19)上，所述衍射结构区别于彼此但是具有共同的对称中心(40)。当生成样品(2)的图像时评估衍射结构(30‑37)。

Description

在至少两个波长范围之间进行辨别的高分辨率扫描显微术

技术领域

本发明涉及样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中样品由照明辐射激发样品以发射荧光辐射，使得将照明辐射聚焦在样品中或样品上的一点处以形成衍射受限的照明光斑，将该点以衍射受限的方式成像到空间分辨的表面检测器上的衍射图像中，其中表面检测器具有分辨衍射图像的结构的空间分辨率，将该点相对于样品以小于照明光斑的直径的一半的增量移动到不同扫描位置中，读取表面检测器，以及从表面检测器的数据中并且从分配到所述数据的扫描位置中生成样品的图像，所述图像的分辨率提高以超出成像的分辨率极限，其中，出于通过光谱选择模块在至少两个预先确定的波长范围之间进行区分的目的，多个衍射结构(所述数目对应于波长范围的数目)被生成在表面检测器上，所述衍射结构各自相对于对称中心是点对称的并且完全地位于表面检测器上，并且当生成样品的图像时评价衍射结构。

本发明还涉及一种用于高分辨率扫描显微术的显微镜，该显微镜包括：样品空间，用于接收可激发以发射荧光辐射的样品；光学单元，该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和衍射极限；照明装置，该照明装置具有用于供应照明辐射的入口且采用照明辐射经由光学单元照明样品空间，使得光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的点处以形成衍射受限的照明光斑；成像装置，用于将焦平面中的点经由光学单元衍射受限地成像到空间分辨表面检测器上的衍射图像中，该表面检测器位于与焦平面共轭的像平面中，其中表面检测器具有对衍射图像的结构进行分辨的空间分辨率；扫描装置，用于以小于照明光斑的一半直径的增量来将点移位到不同扫描位置中；以及评估装置，用于读取所述表面检测器，用于从表面检测器的数据和从向所述数据分配的扫描位置评估衍射图像的结构，并且用于生成样品的图像，该图像的分辨率增加以超过分辨率极限；其中显微镜包括光谱选择模块，该光谱选择模块在至少两个预先确定的波长范围之间进行区分，所述选择模块在表面检测器上生成多个衍射结构，所述衍射结构的数目对应于波长范围的数目；表面检测器和光谱选择模块实施为使得衍射结构全部位于表面检测器上；并且评估装置在生成样品的图像时评估衍射结构。

背景技术

用于检查生物制品的光显微术的一个常规应用领域是发冷光显微术。这里，使用特定的染料(所谓的荧光粉或荧光基团)来特定地标记例如细胞部分的样品。利用用作激发辐射的照明辐射来照明样品，并且使用适当的检测器捕获激发的冷光辐射。以这种方法，可以在显微镜中表示单独的不同染色的细胞部分。当然制品的多个部分还可以同时使用不同染料进行染色，该不同染料特定地附着到制品的不同结构。该方法还被称为多冷光。还可以在没有附加染料的情况下测量样品自身发冷光。

通常是这样的情况，在此冷光被认为是磷光和荧光的涵盖性术语，即它涵盖了二者的过程。在文中提及荧光的情况，这旨在于理解为示例性的而不是限制的形式。

为了检查样品，还已知，使用激光扫描显微镜(也缩写为LSM)，其使用共聚焦检测布置(在被称为共聚焦LSM的情况中)或非线性样品相互作用(所谓的多光子显微术)来仅对位于物镜的焦平面中的样品的平面进行成像。获得光学截面，在不同样品深度处对多个光学截面的记录允许样品的三维图像的生成，该三维图像则是由不同光学截面构成。激光扫描显微术因此适用于检查厚制品。当然还使用冷光显微术和激光扫描显微术的组合，其中使用LSM在不同深度平面中成像冷光样品。

原则上，包括LSM的光学分辨率的光显微镜的光学分辨率是受物理定律衍射受限的。术语“高分辨率”在此用于超过衍射极限的分辨率。

US 5043570 B1描述了通过“过采样”改善分辨率的尝试。这没有使得显著改善的分辨率小于显微镜的衍射极限。

使用非线性粒子数减少过程，分辨率可以提高到高达衍射受限的共聚焦LSM的分辨率上的10倍。这种方法例如在US 5866911 B1中描述。对于粒子数减少的过程，已知不同方法，例如在DE 4416558 C2、US 6633432 B1或DE 10325460 A1中描述的已知方法。

在US 5867604 B1中提及另一个高分辨率显微术方法，其中用周期性结构扫描物体。改进分辨率的类似方法还由EP 1157297 B1进行描述。结构化照明使用非线性过程，例如荧光饱和。所述方法需要图像生成的重构算法并且将多个记录用于图像。

从WO 2006/127692 A1和DE 102006021317 A1中已知在宽场中实现高分辨率的方法。该方法(缩写为PALM(光子激活光显微术))使用了可以利用光学激活信号激活的标记物质。只有在激活的状态下标记的物质才可以被激发以发射特定的荧光辐射。激活实现为：使得激活的标记分子的至少一指定部分与邻近激活的分子相距一距离布置，使得该部分的标记的分子被分离开或可以追溯地分离开，以基于显微术的光学分辨率测量。在对冷光辐射进行记录之后，对于所述隔离的分子，它们的辐射分布的中心由于分辨率极限而被确定，基于此，以光学成像通过与实际可能的准确度相比更高的准确度的计算来确定分子的位置。为了成像整个样品，一直重复通过激发辐射、随后激发和荧光辐射成像来对标记分子进行隔离，直到所有标记分子(可能的话)包含在子集中一次且已经被隔离开。

其他高分辨率方法描述在2007年Science第316期、第1153-1158页，由Hell发表的“远场光学纳米显微术(Far-Field Optical Nanoscopy)”中。

EP 2317362 A1已经公开了所谓的艾里扫描显微术。该文档，在其中图5中说明和描述的实施例中，将样品的衍射受限的照明与表面检测器组合，其中扫描装置配置为使得用照明光斑照明的点的衍射图像停留在表面检测器上。该布置被称为所谓的“解扫描(de-scanned)”检测器布置。这典型地通过设置扫描仪来实现，其使束路径在样品和组合点之间偏转，该组合点位于照明装置和成像装置之间。这样的扫描仪对照明光斑和对用照明光斑照明的点的成像起作用，因此在扫描仪后的成像方向上的束路径是静态的。对于这样的扫描仪的替代例是使用可移动的样品台，其使样品移位。在情况下，衍射图像还停留在表面检测器上。在EP 2317362 A1的构思中，表面检测器配备有空间分辨率，该空间分辨率(参考成像比例)实现衍射图像的过采样，且因此允许对衍射图像的结构进行分辨。EP 2317362 A1还提供色彩分析是可能的实施例。为此提供多个检测器，它们位于由二向色色彩分束器形成的对应的光谱通道中。该方法已知为激光扫描显微术。然而，其具有以下缺点，每个色彩通道都需要具有对应的检测器的对应的色彩分束器。在常规的激光扫描显微术(其在共聚焦针孔后面使用非空间分辨的检测器)中，该需求很大程度上不成问题；但是根据EP2317362 A1使用过采样表面检测器与相当大的费用相关联，特别是因为这样的表面检测器是昂贵的。在根据EP 2317362 A1的过采样原理中，多个这样的表面检测器必须关于彼此用亚像素的准确度进行调整，因为否则在单独色彩通道的所生成图像之间会出现色差。仅当在所有色彩通道中相对于光轴以亚像素准确度调整表面检测器时，单独色彩通道的图像才能彼此配合。

通用文件WO 2016/020459 A1开发了艾里扫描显微术，大意是通过光谱选择元件针对至少两个预先确定的波长范围将适当数目的衍射结构提供给衍射图像，所述衍射图像各体现为点对称的艾里斑，并且在同一表面探测器上完全彼此横向相邻地放置。可以通过对衍射结构的适当评估来生成对应于至少两个波长范围的彩色图像。该方法仅需要一个表面检测器。艾里斑彼此相邻地位于其上。

发明内容

本发明基于开发该类型的方法和显微镜的目的，使得在至少两个预先确定的波长范围中改进图像质量。

本发明限定在下文中。

在用于样品的高分辨率扫描显微术的方法中，样品由照明辐射激发以发射荧光辐射，使得将照明辐射聚焦在样品中或样品上的点处，以形成衍射受限的照明光斑。以衍射受限的方式将点成像在空间分辨表面检测器上的衍射图像中，其中表面检测器具有对衍射图像的结构进行分辨的空间分辨率。将该点相对于样品以小于照明光斑的一半直径的增量来移位到不同扫描位置中。从表面检测器的数据和从向该数据分配的扫描位置生成样品的图像，该图像的分辨率增加以超过成像的分辨率极限。出于区分至少两个预先确定的波长范围的目的，使用光谱选择模块在衍射图像上提供多个衍射结构，该衍射结构的数目对应于预先确定的波长范围的数目。衍射结构位于表面检测器上并且当生成样品的图像时被评估。一种用于高分辨率扫描显微术的显微镜，包括：样品空间，用于接收可激发以发射荧光辐射的样品；光学单元，该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和衍射极限；以及照明装置，该照明装置具有用于供应照明辐射的入口且采用照明辐射经由光学单元照明样品空间，使得光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的点处以形成衍射受限的照明光斑。成像装置经由光学单元将焦平面中的点成像到空间分辨表面检测器上的衍射图像中，该表面检测器位于与焦平面共轭的像平面中。表面检测器具有对衍射图像的结构进行分辨的空间分辨率。扫描装置将点以小于照明光斑的一半直径的增量来移位到不同扫描位置中，并且评估装置读取表面检测器，且评估在其数据中的衍射图像的结构。当然，在该情况下还考虑向该数据分配的扫描位置。它生成样品的图像，该图像的分辨率增加以超过分辨率极限。为了在至少两个预先确定的波长范围之间进行区分，显微镜包括：光谱选择模块，该光谱选择模块在表面检测器上提供具有多个衍射结构(所述数目对应于两个预先确定的波长范围的数目)的衍射图像，其中表面检测器和光谱选择模块实施为，使得衍射结构全部位于表面检测器上；以及评估装置，其在生成样品的图像时评估衍射结构。

当观察位于样品中或样品上光轴上的点时，衍射结构相对于对称中心各是点对称的。点对称的衍射结构覆盖了表面检测器的不同区域，但具有共同的对称中心，该共同的对称中心同样位于被观察点的光轴上。光学***或方法的短语“对称中心”以对位于光轴上的点的效果为特征。这不排除点成像在光轴附近。已经发现，这样的衍射结构供应最小程度损害空间分辨率的色彩分辨率。这样的衍射结构的示例是共轴结构，其中内部衍射结构是艾里斑，该艾里斑以环形方式围绕外部衍射结构。另一个示例由两个或更多个细长的衍射结构给出，每个衍射结构具有例如“8”字形或哑铃式的形式，但是在两个衍射结构的情况下相对于彼此在表面检测器上旋转一角度(例如90°)。

借助于将检测器上的衍射图像分成至少两个衍射结构，本发明仅使用单个表面检测器就获得了分辨率的提高以及同时光谱图像信息的增加。为此，使用光谱选择模块，其特征在于观察位于光轴上，样品中或样品上的点。每个衍射结构都与一波长范围(也称为色彩通道)相关联。利用这个，方法和显微镜可以在至少两个波长范围之间进行区分。如在艾里扫描中为常规的，样品的图像来自于大量单独的图像，通过用光斑扫描样品而出现，每个单独的图像都与不同的扫描地点(即不同的扫描位置)相关联。令人惊讶地，当评估和生成光学图像时，相对于共同的对称中心，色彩区域的不同点对称衍射结构在图像中产生改进的空间分辨率。特别是，在根据WO 2016/020459 A1的版本上已经改进了分辨率，其中艾里斑彼此邻近地位于检测器上。

可以借助于一个波长范围内的辐射在像平面中是空间分布的而另一个波长范围中的辐射不是空间分布的，来有区别地设计衍射结构。如果在该过程中衍射结构保持同轴，则获得图像中的最大分辨率。因此，一个实施例优选地规定衍射结构是同轴的，特别是对于第一波长范围而言为空间上非重新分布的衍射结构的形式并且对于第二波长范围而言为围绕所述第一衍射结构的环形形状的形式。

在另一个实施例中，所有预先确定的波长范围设置为经受不同的相位操纵。

特别简单的构造将相位影响装置与光谱选择滤光器组合在模块中，例如使得光谱选择滤光器将一个波长范围中的辐射引导穿过相位掩模，然而另一个波长范围中的辐射没有被引导穿过相位掩模，或者由所述滤光器引导穿过不同的相位掩模。因此，波长范围经受不同相位操纵。

当在圆形光阑处衍射光束时，出现艾里斑。中心极大值处呈现艾里斑，该艾里斑由减少的辐射强度的环围绕。即使根据几何光学定律是理想的显微镜(即，甚至没有成像像差)也不可能将点准确地成像在一点上，而是由于孔处光的衍射成像为离焦的光斑。这称为衍射受限的成像。同样的适用于对点的衍射受限的照明的情况。在经典光束光学中，如果将两个点的图像在衍射图像中的最大值以至少艾里斑的半径r来间隔开，则可以根据所谓的瑞利判据将两个点分开。光斑的形状具有与孔的形状成倒数的关系，特别地该光斑的尺寸与孔的尺寸成反比例。艾里斑的尺寸从第一类贝塞尔函数的第一零点得出，该尺寸大约处于r＝0.6098。以英国天文学家乔治·比德尔·艾里(George Biddell Airy)命名艾里斑(即，中心衍射斑)。在扫描显微镜中，由光学单元的圆形安装件给定的孔在照明中和成像中均是圆形的。因为艾里斑的尺寸还取决于波长，所以在用于激发目的的衍射受限照明的情况中的艾里斑的尺寸比在斯托克斯位移(即，较长波长的荧光辐射)的情况中的更小。

术语“衍射受限”这里旨在不限于根据阿贝理论的衍射极限，而是还涵盖了出于实际缺陷或限制的原因理论最大值损失了20％的情况。甚至在此，单独图像的结构也被称为衍射结构。它是过采样的。

可以以不同方式生成波长范围的点对称衍射结构，其中光谱选择模块还各自影响衍射图像，例如借助于包括对两个不同波长具有不同效应的相位影响装置，或者借助于将波长范围引导通过不同相位影响元件的光谱选择模块。原则上，光谱选择优选地实行在光瞳附近，无论任何情况都不在光束路径的中间像中。就下文参考光谱选择模块或参考光谱分离而言，这还意味着衍射结构的不同成形，使得这些是各自点对称的并且以共同对称中心位于表面检测器上。在第一变型中，在成像光束路径中而非在照明辐射还传播穿过的光束路径的部分中，分别设置并采取光谱选择模块和光谱分离。然后，成像辐射沿着光束路径传播到光谱选择模块，在该处实现单独波长范围的不同衍射结构的成形。在第二变型中，在照明中或照明装置中实现光谱分离，使得光谱分离不影响成像。以这种方法，样品中的照明光斑已经以多个不同衍射结构的形式而出现，该衍射结构关于共同的对称中心是点对称的。

在第一指定的变型中，光谱分离仅作用在来自样品的荧光辐射上。在第二指定的变型中，光谱分离仅作用在用于样品的荧光激发上。因此，第一变型将以不同色彩发荧光的样品的色彩通道分离。相比之下，第二变型区分可用不同波长范围激发的样品的组成部分。对于两个变型共同的是，光谱敏感模块位于光束路径中仅由成像或照明，而不是由成像或照明两者进行辐射的部分中。与此不同，在光束路径的共同部分中的布置也是可能的。

本发明的核心在于通过衍射结构在表面检测器上的位置和取向在空间中的波长范围之间进行区分，以及由于关于共同对称中心的点对称性而确保特别好的分辨率。可以以特别高的分辨率在生成图像时解混同时记录的波长范围。这实现了使用单个表面检测器同时记录多个色彩通道。

因为由于以小于照明光斑的尺寸的增量的扫描位移而在根据WO 2016/020459 A1或EP 2317362 A1的重构方法中对于样品中每个单独点可适用多次测量，这导致了对要构造和求解的方程组的超定，所以可以不仅指定具有高分辨率的单独点的空间规范和强度，而且指定波长范围(即色彩)的规范。

重构使用点扩散函数(PSF)，这是波长相关的且对于开始指定的点具有光轴上的对称中心。

如在典型的LSM中，以扫描的方式产生样品的期望区域的成像。根据本发明的构思还可以对于多个光斑以并行地方式同步地实行，如从WO 2016/020459 A1已知。

在本文描述方法的情况下，显微镜的控制器在操作显微镜期间实现这些方法步骤。

理所当然地，在不会背离本发明的范围的情况下，上述特征以及下面将要解释的那些特征可以不仅用在所指定的组合中而且用在其他组合中或单独使用。

附图说明

下面例如参考所附附图更详细地解释本发明，这还公开本发明的重要特征。附图中：

图1示出了高分辨率显微术的激光扫描显微镜的示意图，

图2至4示出了衍射图像的示意图，该衍射图像在各种实施例中操作图1的显微镜时发生在表面检测器上，

图5示出了光谱分割的光束路径，以及

图6示出了照明衍射图像的示意图，该照明衍射图像可以在在图1的显微镜的实施例中照明样品时出现。

具体实施方式

图1示意性示出了激光扫描显微镜1，其配置为在显微镜下检查样品2。激光扫描显微镜1(下文称为LSM)受控制器C控制并且包括照明光束路径3和成像光束路径4。照明光束路径3照明样品2中的光斑，并且成像光束路径4以衍射受限方式将所述光斑成像在检测器上。照明光束路径3和成像光束路径4共享光学元件。

使用所提供的激光束5在LSM1中照明样品2，将该激光束5经由偏转反射镜6(其在其他情况下在功能上不是必要的)和透镜7耦合到反射镜8。反射镜8确保了激光束5以一反射角入射在输入耦合元件(例如，发射滤光器9)上。为了清楚起见，对于激光束5而言，仅描绘了其主轴。

在激光束5在发射滤光器9处反射之后，该激光束5由扫描仪10A双轴偏转，且使用透镜11和12穿过物镜13以衍射受限照明光斑14的形式将激光束5聚焦在样品2的焦平面29中。在此，在图1的图示中，照明光斑14是点状的，然而还可以是不同形状的照明光斑，如下文要基于图6所描述的。将在照明光斑14的位置(例如点)处所激发的荧光辐射引导离开焦平面29经由物镜13以及透镜11和12而回到扫描仪10，这之后在成像方向上再次呈现静态光束。后者通行穿过发射滤光器9，其因此附加地具有从荧光辐射中阻挡照明辐射的功能，该照明辐射例如可以用作激发辐射并且以镜像的方式反射回到照明光斑14中。随后，辐射通行穿过下文将解释的模块15。最终，透镜16确保了总体上将照明光斑14的位置成像在衍射受限的衍射图像中，该衍射图像位于像平面18中并且将更详细地解释。像平面18是与焦平面29共轭的平面，样品2中照明光斑14位于其中。

衍射图像由表面检测器19记录在像平面18中。它在像平面18中解析衍射图像，即引起过采样。以仅示例性方式，表面检测器19包括光纤束，其馈送检测器阵列。光纤束入口的范围足够大使得由此覆盖衍射图像的范围。光纤束中的单独光纤在它们的输出处设有与在光纤束入口处不同的几何布置，具体地具有延长插头的形式，其中光纤的输出侧端彼此相邻。插头具有与检测器行匹配的实施例，即光纤的每个输出侧端恰好位于检测器行的像素的前面。参考以下事实：表面检测器19的该实施例仅是示例性的。原则上，在像平面18中对衍射图像采取过采样的表面检测器19对于显微镜1是足够用的。特别是，表面检测器19还可以是像平面18中的矩形检测器表面，如下文所描述的图2至4中的情况。

控制器C控制LSM 1的全部部件，特别是扫描仪10和表面检测器19。控制器为不同扫描位置记录衍射图像的数据，分析其衍射结构并且生成样品2的高分辨率总图像。

因为图1的实施例中照明光斑14是示例性方式下的点状斑，所以衍射图像是艾里斑。然而，由于模块15，光谱选择用在显微镜1中，使得衍射图像以波长相关的方式进行修改并且因此在图1的实施例中获得两个衍射结构，所述衍射结构与两个波长范围相关联。因此在像平面18中出现的衍射图像23因此由多个衍射结构构成，将会解释该衍射结构的类型和几何形状。模块15包括光谱选择元件20，且设置在成像装置4中或替代地设置在照明装置3中。下面，首先解释在成像装置4中光谱选择模块15的效果和布置。

在没有光谱选择模块15的情况下，在焦平面29中由照明光斑14照明的点的衍射受限成像的情况下，作为艾里斑的衍射图像由于物镜13的圆形孔径将出现在相关联的共轭像平面18中，如下文要解释的。在描述中，大体上已经解释这样的艾里斑出现的方式。在如EP2317362 A1中描述的显微术中，衍射图像的结构通过对其过采样来进行分析，并且连同扫描位置的增量相对于照明光斑14的最小尺寸较小一起，可以存在超过衍射受限成像的分辨率极限的结构鉴定。出于解释的目的，考虑对两个地点成像，这两个地点在焦平面29中太靠近在一起使得不能由衍射受限的分辨率捕获。当用相对于照明光斑(其在该构思实验中是圆形的)的直径较小的的增量对照明光斑14进行扫描时，两个地点之一首先进入照明光斑。衍射图像中辐射强度随着越来越多第一地点进入照明光斑14而增加。由于其衍射受限的性质，照明光斑14的强度朝着中心增加。因此，随着考虑的第一地点越来越多地移动到照明光斑14的中心的程度，衍射图像中的辐射的强度增加。一旦在考虑的地点上照明光斑14的中心已经迁移开，则来自该第一地点的辐射的强度再次降低。如果不存在邻近成像的第二地点，则在恰好与照明光斑14的照明强度的轮廓相关联的衍射图像中的辐射强度的增加或降低(考虑第一地点的增量和荧光灵敏度)的情况下，衍射图像中的辐射强度会再次衰减。然而，因为第二地点紧密邻近地呈现，该第二地点同样开始将荧光辐射添加至衍射图像，更精确地说，照明光斑14的中心越靠近它。另外，与第一地点完全相同的原理自然而然适用于第二地点。因此，对于与仅出现单荧光地点的情况不同的增量位置，在衍射图像中获得照明强度。通过评估表面检测器19的数据并考虑当前扫描位置，因此可以在数学上确定两个地点在焦平面29发荧光，以及它们之间的间隔，即使这两个地点各自不能用衍射受限的分辨率来识别。在技术上对本领域技术人员已知的实现方式中，出于评估表面检测器19的数据的目的，对于每个扫描位置构造等式，所述等式包含多个未知量，特别是焦平面29中地点的强度和间隔。因为大量扫描位置，获得方程组，该方程组被超定且使得可以确定荧光地点的辐射强度和间隔，即因此还有位置。下面将对此进行解释。

这个高分辨率显微术的原理现在由显微镜1发展，大意是光谱选择模块15在与焦平面29共轭的像平面18中影响衍射图像23，该影响使得所述衍射图像包括针对两个波长范围(色彩通道)的两个不同的点对称的衍射结构，所述衍射结构具有共同的对称中心。在根据图1的实施例中，这借助于光谱选择滤光器20来实现，该光谱选择滤光器20将第一波长范围的辐射反射且将第二波长范围的辐射透射。将反射的波长范围的辐射由光学单元16和偏转反射镜(该偏转反射镜仅用于使光束路径变紧凑)成像到像平面18中并且因此成像到表面检测器19上。因此，上述艾里斑出现作为第一波长范围的衍射结构。相比之下，第二波长范围的辐射由光谱选择滤光器20透射，并且所述辐射到达相位操纵元件，例如相位掩模17或LCOS-SLM。然后将第二波长范围的辐射反射，并且由偏转反射镜和光学单元将其同样地成像到像平面18中作为衍射受限的图像。由于相位掩模17或LCOS-SLM的作用，衍射结构目前在成像平面18中在该情况下不是艾里斑而是具有圆环的形状，即，环状形状。从而，第二波长范围的衍射结构围绕在第一波长范围的衍射结构。两者是共轴的，即它们在像平面18的中心具有共同的对称中心，并且因此在表面检测器19上也具有共同的对称中心。图2以示例性方式针对方形表面检测器19示出了该实施例，该表面检测器通过像素22过采样衍射图像23。衍射图像由第一衍射结构30构成，其分配到第一波长范围并且因此分配到色彩通道。它具有艾里斑的形式，并且是相对于对称中心40点对称的，对称中心在图2中以示例性方式绘制为白点。第一衍射结构30被环形的第二衍射结构31所围绕，该第二衍射结构31由在光谱选择滤光器15处透射的辐射来形成且在相位方面受相位掩模17或LCOS-SLM影响。第二衍射结构31同样是相对于对称中心40点对称的，即以共轴方式围绕第一衍射结构30。色彩通道的波长边界由光谱选择滤光器15来限定，因此在一个实施例中选择为匹配预先确定色彩通道(波长范围)。

衍射图像30、31的组合形成衍射图像23，即在由显微镜检查期间衍射结构30、31不会在空间中移动。根据WO 2016/020459 A1的显微镜的艾里斑(起初彼此相邻)现在替换为两个共轴的衍射结构30、31。

再次设想，考虑两个地点位于焦平面29中，所述地点太靠近在一起使得它们自身无法用衍射受限的成像来分辨，如果假设第一地点在第一色彩通道中发荧光(将第一衍射结构30分配到该第一色彩通道)，并且第二地点在第二色彩通道中发荧光(将第二衍射结构31分配到该第二色彩通道)，则在显微镜1中由于光谱选择元件15而出现以下的行为：一旦照明光斑14捕获了第一地点，中心(即第一衍射结构30)就开始在衍射图像23中发光。相比之下，***(即第二衍射结构31)仍然保持为暗的，因为只要照明光斑14没有照明第二地点，就没有辐射到达第二色彩通道中。第一衍射结构30中的强度增加，直到第一地点由照明光斑14的中心捕获。然后，第一色彩通道的中心处的强度(即衍射结构30的强度)是在最大值。当照明光斑14已经前进时，类似的陈述应用于衍射结构31、和第二色彩通道以及第二地点。因此，当照明光斑14在两个地点上通行时，获得第一衍射结构30的变亮和变暗以及时间上略微延后地获得第二衍射结构31的变亮和变暗A。相比之下，如果在一个位置处的两个色彩通道的两者中要发射荧光，则会出现同时变亮和变暗。因此，位置信息和色彩信息两者可以由图像评估来提取。因为两个衍射结构30、31的共轴位置和取向，空间分辨率不受色彩分辨率破坏。

与扫描位置组合来评估表面检测器19的数据允许为每个扫描位置设立等式，所述等式不仅包含两个地点的位置和取向和荧光强度，而且包含关于第一地点或第二地点是否在第一色彩通道或第二色彩通道中发光的陈述。由于大量的扫描位置，出现超定方程组，这还允许确定发光的地点到两个色彩通道的附加分配。用这种方法，显微镜1和相关联的显微术方法可以在高分辨率图像中在两个波长范围(色彩通道)之间进行区分，并且在没有附加的检测器的情况下获得两个色彩图像。

应该强调的，衍射结构30、31的共轴位置和取向在由显微镜检查期间保持不变，特别是色彩信息不会随着位置和取向缩放。所述共轴位置和取向仅用于阻止衍射结构30、31在空间上完全地一个位于另一个之上，并且因此允许后者在图像评估期间提供可区别的色彩信息。

如在图1中所使用的光谱选择模块15的实施例中，衍射结构30、31是圆旋转对称的。所描述的方法不受限于使用这样的结构或者仅使用两个波长范围(色彩通道)。图3和4示出了衍射结构的其他点对称形状。

根据图3，衍射结构是各纵向变形的光斑32、33，其呈现为椭圆形光斑以仅用于说明的目的。它们是相对于对称中心40各自点对称的，但是沿着不同轴线延伸。在图3的实施例中轴线是正交的。图3还示出了波长范围的衍射结构不一定为不相交的，即具有无重叠的实施例。由于方程组的超定，在该情况下对于彼此相邻的艾里斑，重叠区域必定是可能的，本领域技术人员还已经从WO 2016/020459 A1中意识到这一点。图3附加地示出了所有实施例都有问题的选项，特别是在使用包括光引导件的表面检测器19的情况下。在此，表面检测器19仅在衍射图像23的辐射强度也入射的那些地点处具有像素22。因为如先前提及的衍射图像23停留在像平面18中，表面检测器19的适当调整是可能的。

图4示出了甚至多于两个色彩通道也是可能的。在此，衍射结构34-37的形式为哑铃式，再次关于对称中心40对称。衍射结构34-37的旋转位置取决于波长，所以在图4的实施例中实现四个波长范围(即色彩通道)。因此多个色彩通道是可能的，这是因为由于大量扫描位置，所获得的方程组是超定的，使得(可以说)对于色彩通道的含义内的其他未知量仍存在空间。

在图3和图4的实施例中，光谱选择模块15及其下游的光束路径配置为使得全部波长范围而不是只有一个波长范围(如图1所图示)经受相位操纵。图5示出了这样的实施例：对于这样的光谱选择模块1 5，其中两个波长范围(即色彩通道)被分离且经受不同相位操纵，例如如在图3的实施例中的情况。光谱选择模块15包括光谱选择滤光器20a，其将由根据不同虚线指示的两个波长范围的入射辐射分离开。一个波长范围的辐射通行穿过第一相位操纵元件17a，另一个波长范围的辐射通行穿过不同的第二相位操纵元件17b。随后，以这种方法不同地操纵的辐射再次由统一的元件20b叠加并且从那里到达光学单元16。

在先前的描述中假设光谱选择模块15位于成像装置4中，并且在其中位于光束路径的仅用于成像的部分光束路径中。换言之，在这些实施例中光谱选择模块15不会被照明辐射穿过。因此，通过不同衍射结构由光谱选择模块15生成的色彩通道是发荧光的样品的色彩通道。显微术方法或显微镜的实施例因此在其波长范围(色彩通道)方面区分发荧光的辐射。

然而，光谱选择模块15还可以设置在照明装置3中。图1使用短划线绘制该布置。那么，光谱选择模块15位于仅由照明辐射穿过的光束路径的区域中。光谱选择模块不对成像起作用而是仅对照明起作用。光谱选择模块15然后将照明光斑14分成两个照明衍射结构38、39，如图6的图示中所显示。它们有区别并且具有共同的对称中心40。因此，照明光束路径中的光谱选择模块15创建照明色彩通道，然而光谱选择元件15在成像光束路径中的布置生成检测色彩通道。因此，样品不再例如由艾里斑照明，而是由多个不同照明衍射结构38、39照明。因此，在表面检测器19上还获得如图3中的情景，其中衍射结构30、31现在不再对应于样品2的荧光辐射(即荧光响应)的不同的色彩通道，而是对应于样品2的激发(即荧光灵敏度)的不同色彩通道。另外，全部变型(其基于图2至图4针对衍射结构的实施例进行解释)还可以等同地用于照明装置3中的光谱选择模块15的布置的变型。然而，由于不同几何取向和位置，通常，与在照明装置3中设置时相比，光谱选择模块15的配置在成像装置4中设置时将看起来略微不同。原则上，对于模块15中的光谱选择滤光器20和相位操纵元件17，讨论具有色效应的多种元件，例如楔形件、棱镜、反射构件或透镜双合透镜。

在上述替代例的变型中，光谱选择模块15还可以放置到光在照明期间和成像期间都穿过的一部分光束路径中，或使用两个光谱选择模块15。这可以防止在用一个波长对两种染料同时激发期间的串扰。附加地，出现用于校准测量的各选项。

因为照明和成像装置或对应的装置具有公共的光学扫描装置(其将照明光斑引导在样品上，并且同时关于检测器来解扫描(descan)与照明光斑重合且在该处样品成像的点)，所以可以将变焦光学单元21放置在成像束路径中。其允许衍射图像23与表面检测器19的大小匹配。

当将光谱选择模块15布置在照明装置3中时，可能发生以下情况：在用两个或更多个照明色彩通道进行照明期间，较短照明波长生成的荧光信号落在较长波长照明的生成的荧光的波长范围中。这样的后果将是结构中的一个可能重新出现作为位移的阴影图像。阴影图像分量可以通过适当的相关计算来确定并且消除。

为了更好地解释建立上述方程组的数学分析，首先，仅考虑只有一个色彩发生的情况，即省略光谱选择模块15。如果O(r)表示物、E(r)表示激发的点扩散函数(PSF)、H(r)表示检测的PSF，则对于每个像点，获得以下的等式来作为信号D(r，p)，其中r表示与照明光斑的位置p的距离：

相对于位置p的D(r，p)的傅里叶变换得到：

D(r，ω)＝O(ω)FT_r′{E(r′)H(r′+r)}

  (2)

在实空间中的乘积变成了傅里叶空间中的以下卷积：

如果在位置r处引入支撑函数：

EH(r，ω)＝FT_r′{E(r′)H(r′+r)}

  (4)

等式(2)的结果是

D(r，ω)＝O(ω)EH(r，ω)

  (5)

使用Wiener滤波器将表面检测器处的不同位置r进行组合：

其中<|O(ω)|²>和<|n(ω)|²>是信号(“O”)的和噪声(n)的对应的光谱功率密度。

这暗示，对于多个色彩通道(即具有不同H_c(r，ω)的波长相关的PSF)，其在表面检测器19的每个像素处混合，如下获得由PSF预先确定的权重：

在该等式中，c是色彩通道索引。如果将等式(7)写成矩阵，则：

[D(r，ω)]_r＝[O_c(ω)]_c[EH_c(r，ω)]_c，r

  (8)

如果考虑附加的噪声，等式(8)采取以下形式：

使用运算符[G_c(r，ω)]_r，c可以获得物[O_c(ω)]_c，该运算符将频率过滤与色彩通道解混组合：

如在Wiener滤波器的推导中，对于每个频率和每个色彩通道在重构物体和真实物体之间的二次方距离则必须最小化：

使用等式(9)，因此获得下式：

E|{[O_c(ω)]_cEH_c(r，ω)]_c，r+[N(r，ω)]_r}[G_c(r，ω)]_r，c-[O_c(ω)]_c|²＝min

  (12)

通过应用与Wiener滤波器的推导相同的原理，像是例如本领域技术人员从http：//en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution已知的，获得下式：

  

在此，[I]_c和[σ²]_r是每个色彩通道的信号的光谱功率密度和噪声的光谱功率密度：

[I]_c＝E|[O_c(ω)]_c|²；[σ²]_r＝E|[N(r，ω)]_r|²

  (14)

如果荧光基团的发射光谱重叠，则在每个色彩通道中可能出现来自另一个色彩通道的物体的阴影。在与实际色彩通道中的主图像相同的检测PSF的情况下，这样的阴影图像是扭曲的。因此，通道c中检测的图像O_c(ω)是根据分配到不同色彩通道的物体的图像

的叠加：

在此，[M]_c是解混矩阵。例如在两个色彩的情况下，则结果是：

如果实像的混合矩阵[M]_c是已知的，则容易获得实像

如果情况并非如此，则可以通过以下来获得：将所生成的图像之间的互相关度最小化，即矩阵待确定为使得其值确保最佳解混的物体的互相关度最低。

用于分析表面检测器19的数据的其他程序和替代的程序基于由Sheppard等人在1982年的Optik的第80卷、第2期、第53页描述的方法。

Claims (17)

1.一种用于样品(2)的高分辨率扫描显微术的方法，其中：

-所述样品(2)由照明辐射(5)激发以发射荧光辐射，使得将所述照明辐射聚焦在所述样品(2)中或所述样品(2)上的点处，以形成衍射受限的照明光斑(14)，

-以衍射受限的方式将所述点成像至位于像平面中且位于空间分辨表面检测器(19)上的衍射图像(23)，其中所述空间分辨表面检测器(19)具有对所述衍射图像(23)的衍射结构(30-37)进行分辨的空间分辨率，并且所述像平面与所述衍射受限的照明光斑位于其中的焦平面共轭，

-相对于所述样品(2)，以小于所述照明光斑(14)的一半直径的增量将所述点移位到不同扫描位置中，

-读取所述空间分辨表面检测器(19)，并且从所述空间分辨表面检测器(19)的数据以及从向所述数据分配的扫描位置生成所述样品(2)的图像，所述图像的分辨率增加以超过成像的分辨率极限，

-出于通过在至少两个预先确定的波长范围之间进行区分的目的，利用光谱选择模块(15)在所述空间分辨表面检测器(19)上生成具有多个不同衍射结构(30-37)的衍射图像(23)，所述衍射结构的数目对应于波长范围的数目，所述衍射结构相对于对称中心各自是点对称的且全部位于所述空间分辨表面检测器(19)上，

-当生成所述样品(2)的图像时评估所述衍射结构(30-37)，

其特征在于，

-所述点对称的衍射结构(30-37)具有共同的对称中心(40)且覆盖在该共同的对称中心之外、彼此不重叠的、所述像平面(18)中的有区别的区域。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两个预先确定的波长范围经受不同的相位操纵。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光谱选择模块(15)包括相位影响装置(17，17a，17b)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，只有在一个波长处的辐射受相位影响装置(17，17a，17b)影响，而在另一个波长处的辐射不会受相位影响装置影响，所以该辐射的衍射结构(30)为艾里斑。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍射结构(30-37)是共轴的。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍射结构(34-37)具有相同的基本结构，但是在所述空间分辨表面检测器(19)上相对于彼此旋转一角度。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光谱选择模块(15)仅影响照明，其中所述照明光斑(14)由照明衍射结构(38，39)构成，所述照明衍射结构(38，39)有区别但是具有共同的对称中心(40)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光谱选择模块(15)仅影响所述成像。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述光谱选择模块(15)设置在所述空间分辨表面检测器(19)的上游。

10.一种用于高分辨率扫描显微术的显微镜，包括：

-样品空间，所述样品空间用于接收可激发以发射荧光辐射的样品(2)，

-光学单元(11-13)，所述光学单元(11-13)具有位于所述样品空间中的焦平面(29)和衍射极限，

-照明装置(3)，所述照明装置(3)具有用于接收照明辐射(5)的输入件(6)并且采用所述照明辐射(5)经由所述光学单元(11-13)照明所述样品空间，使得所述光学单元(11-13)将所述照明辐射(5)聚焦到所述焦平面(29)中的点处以形成衍射受限的照明光斑(14)，

-成像装置(4)，所述成像装置(4)用于经由所述光学单元(11-13)将所述焦平面(29)中的点衍射受限地成像至空间分辨表面检测器(19)上的衍射图像(23)，所述空间分辨表面检测器(19)位于与所述焦平面(29)共轭的像平面(18)中，其中所述空间分辨表面检测器(19)具有对所述衍射图像(23)的衍射结构进行分辨的空间分辨率，

-扫描装置(10)，所述扫描装置(10)以小于所述照明光斑(14)的一半直径的增量将所述点移位到不同扫描位置中，以及

-评估装置(C)，所述评估装置(C)读取所述空间分辨表面检测器(19)，并且从所述空间分辨表面检测器(19)的数据以及从向所述数据分配的扫描位置生成所述样品(2)的图像，所述图像的分辨率增加以超过所述分辨率极限，

-其中所述显微镜(1)包括光谱选择模块(15)，所述光谱选择模块(15)在至少两个预先确定的波长范围之间进行区分，所述光谱选择模块在所述空间分辨表面检测器(19)上生成具有多个不同的衍射结构(30-37)的衍射图像(23)，所述衍射结构的数目对应于波长范围的数目，

-所述空间分辨表面检测器(19)和所述光谱选择模块(15)实施为使得所述衍射结构(30-37)是点对称的且全部位于所述空间分辨表面检测器(19)上，以及

-当生成所述样品(2)的图像时，所述评估装置(C)评估所述衍射结构(30-37)，

其特征在于，

-所述点对称的衍射结构(30-37)具有共同的对称中心(40)且覆盖在该共同的对称中心之外、彼此不重叠的、所述像平面(18)中的有区别的区域。

11.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述光谱选择模块(15)包括用于影响所述衍射结构的相位影响装置(17，17a，17b)，所述相位影响装置使所述至少两个预先确定的波长范围经受不同的相位操纵。

12.根据权利要求11所述的显微镜，其特征在于，所述相位影响装置包括至少一个相位掩模和/或至少一个LCOS-SLM。

13.根据权利要求11所述的显微镜，其特征在于，所述相位影响装置仅影响一个波长范围中的辐射而不影响另一个波长范围中的辐射，所以其衍射结构(30)是艾里斑。

14.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述衍射结构(30-37)是旋转对称的并且是共轴的。

15.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述衍射结构(34-37)具有相同的基本结构，但是在所述空间分辨表面检测器(19)上相对于彼此旋转一角度。

16.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述光谱选择模块(15)设置在所述照明装置(3)中但是不在所述光学单元(11-13)中，其同样对于成像有效，因此所述照明光斑(14)由照明衍射结构(38，39)构成，所述照明衍射结构(38，39)有区别但是具有共同的对称中心(40)。

17.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述光谱选择模块(15)设置在所述成像装置(4)中而不是在所述光学单元(11-13)中，其同样对于照明有效。

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