WO2018124009A1 - 低体温改善剤 - Google Patents
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- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Definitions
- the present invention relates to an agent for preventing or improving hypothermia.
- the average human body temperature is approximately 36.5 ° C., which is the temperature at which the body's enzymes are most activated and function.
- hypothermic humans whose normal heat decreases by 0.5 to 1.5 ° C.
- the causes are considered to be lack of minerals / vitamins and proteins, lack of exercise, poor circulation due to excessive stress, disorder of autonomic nerves, and the like.
- the normal level of human fever is highest in infants and gradually decreases with age.
- the body temperature declines during adolescence, the body temperature decreases again as the elderly become older, and the normal temperature tends to be about 0.2 ° C. lower than when young.
- brown adipose tissue responsible for heat production is thought to be a decrease in function of brown adipose tissue responsible for heat production.
- hypothermia leads to a decrease in immunity, a decrease in basal metabolism, a decrease in the enzyme activity in the body, and is susceptible to infections such as cold, and allergic symptoms such as hay fever are likely to occur.
- infections such as cold
- allergic symptoms such as hay fever are likely to occur.
- GIP gastric inhibitory polypeptide or glucose-dependent insulinotropic polypeptide
- GIP is one of the gastrointestinal hormones belonging to the glucagon / secretin family.
- GIP is called incretin together with GLP-1 (glucagon-like peptide 1), and is secreted from K cells present in the small intestine when lipids and carbohydrates are ingested.
- GIP is known to promote insulin secretion from pancreatic ⁇ cells and enhance glucose uptake into adipocytes in the presence of insulin. Therefore, it is considered that the action of GIP is a factor in obesity. In fact, there is a report that obesity is suppressed when the function of GIP is inhibited (Non-patent Document 1).
- Non-patent Document 1 When insulin resistance develops, the absorption of sugar by insulin decreases, resulting in hyperinsulinemia. Hyperinsulinemia is said to be the root cause leading to the development of various lifestyle-related diseases such as obesity, and prevention and improvement of insulin resistance is also from the aspect of reducing the risk of lifestyle-related diseases. is important.
- Non-Patent Document 1 Miyawaki K et al., Nat Med. 8 (7): 738-42, 2002
- the present invention relates to the following 1) to 5).
- An agent for preventing or improving hypothermia comprising a GIP function inhibitor as an active ingredient.
- the present invention relates to providing a hypothermia-improving agent useful for improving hypothermia.
- the present inventors examined the relationship between GIP and body temperature, and found that when GIP was administered, the body temperature significantly decreased and that the hypothermia could be improved by suppressing the GIP function.
- hypothermia preventive or ameliorating agent of the present invention exerts an effect of suppressing a decrease in body temperature against a hypothermic state, for example, hypothermia associated with aging. Therefore, it is useful for preventing or improving a decrease in immunity caused by hypothermia, a decrease in basal metabolism, a poor circulation, a decrease in lymph flow and metabolic power, and a loss of autonomic balance.
- GIP gastric inhibitor polypeptide or glucose-dependent insulinotropic polypeptide
- SEQ ID NO: 1 GIP (1-42) has physiological activity (active GIP), but inactive GIP (3-) is cleaved by N-terminal two amino acids by dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) present in the living body. 42).
- the “GIP function inhibitor” refers to a substance that inhibits or suppresses the function of GIP as a gastrointestinal hormone, that is, functions at the GIP gene or GIP receptor gene level, or at the GIP itself or GIP receptor level.
- anti-GIP antibodies, GIP receptor antagonists, GIP secretion or elevation inhibitors are mentioned.
- the “anti-GIP antibody” may be any antibody that inhibits at least the function of active GIP, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
- International Publication No. 2016/104439, JP The antibody described in JP2013-138638A is preferably an antibody that does not substantially bind to non-active GIP (referred to as “anti-active GIP antibody”).
- the binding constant (Ka) with the active GIP is preferably 10 7 M ⁇ 1 or more, more preferably 10 8 M ⁇ 1 or more, and more preferably 10 9 M ⁇ 1 or more.
- the binding amount of the test antibody to the non-active GIP is 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 1% when the binding amount to the active GIP is 100%. In the following, it is even more preferable that the content is 0.1%.
- the amount of binding with non-active GIP can be determined by measuring the binding between the test antibody and non-active GIP using methods such as Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, and ELISA. .
- the anti-active GIP antibody is, for example, an antibody that recognizes the 8th and subsequent amino acids from the N-terminus of active GIP (SEQ ID NO: 5), and at least one or more amino acids selected from the 8th to 10th (SDY) An antibody that recognizes is preferable.
- SEQ ID NO: 5 an antibody that recognizes the 8th and subsequent amino acids from the N-terminus of active GIP
- SDY an antibody that recognizes
- the anti-active GIP antibody those containing an amino acid sequence represented by the following (1) or a region comprising a conservative sequence modification thereof in the H chain are preferable.
- EMNPSDGRTHFNE Alphabet letters in (1) mean single letter notation of amino acids, and sequences are described in the order from N-terminal to C-terminal.
- F is phenylalanine
- T is threonine
- D is aspartic acid
- E is glutamic acid
- M is methionine
- N is asparagine
- P proline
- S is serine
- G is glycine
- R is arginine
- H histidine.
- “conservative sequence modification” is an amino acid modification other than the complementarity determining region (CDR) involved in antigen determination, and has a significant effect on the reactivity of an antibody consisting of the amino acid sequence before the modification.
- Such conservative sequence modifications include 1 to several, preferably 1 to 3, more preferably 1 amino acid substitutions, additions and deletions.
- Examples of the amino acid sequence subjected to the conservative sequence modification include amino acid sequences having 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 99% or more of the sequence identity with the amino acid sequence before the modification.
- Such modifications can be introduced into the antibodies of the invention by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
- a conservative amino acid substitution includes substitution of an amino acid residue with an amino acid residue (family of amino acid residues) having a similar side chain.
- families of amino acid residues are defined in the art and include basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains ( For example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan), nonpolar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine), ⁇ -branched side chains (eg threonine , Valine, isoleucine), and amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
- basic side chains eg, lysine, arginine, hist
- the identity between amino acid sequences refers to the ratio (%) of the number of positions where the same amino acid residue is present in both sequences when the two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues. Specifically, it is calculated by, for example, the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)), and the genetic information processing software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development) Using a homology analysis (Search homology) program, Unit size to compare (ktup) can be calculated as 2 and analyzed.
- the amino acid sequence represented by (1) above encodes a region consisting of the 13th amino acid residue at positions 50 to 62 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 showing the heavy chain variable region. Therefore, the anti-active GIP antibody more preferably includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a heavy chain variable region or a region comprising a conservative sequence modification thereof. Furthermore, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a conservative sequence modification thereof is included as the heavy chain variable region, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a conservative sequence modification thereof is represented as the L chain variable region. More preferably, it includes a region.
- an anti-active GIP antibody containing a region consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 as the heavy chain variable region and a region consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 as the L chain variable region, the following production example 1 And monoclonal antibodies produced from the hybridoma 9B9H5-B9 strain shown in FIG.
- fragments of the antibody such as F (ab ′) 2 , F (ab ′), single chain Fv (scFv), cysteine residues in VH and VL, A disulfide bond Fv (dsFv) in which an amino acid residue substituted by a group is bonded via a disulfide bond or a polymer thereof, or a dimerized V region (Diabody) in which scFv is dimerized, Also good.
- a peptide containing a part of the anti-active GIP antibody that is, a peptide having a part of the amino acid sequence constituting the antibody and having the above-mentioned reactivity is also included in the fragment of the antibody. It is.
- the immunoglobulin class of the anti-GIP antibody of the present invention is not particularly limited, and may be any immunoglobulin class of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, and IgY, preferably IgG.
- the antibody of the present invention encompasses antibodies of any isotype.
- the anti-GIP antibody (including anti-active GIP antibody) of the present invention may be any of a non-human animal antibody, a human chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody.
- Non-human animal antibodies include, for example, antibodies such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and are preferably mouse antibodies.
- the “human chimeric antibody” refers to an antibody that is derived from a non-human animal and is genetically engineered so that the constant region of an antibody that specifically binds to GIP has the same constant region as a human antibody. Preferably, it is a human / mouse / chimeric antibody.
- a “humanized antibody” corresponds to a human antibody having a primary structure other than the complementarity determining regions (CDRs) of the H and L chains of an antibody that is derived from a non-human animal and specifically binds to GIP.
- the “human antibody” means a human antibody that is an expression product of a completely human-derived antibody gene.
- anti-GIP antibody a commercially available polyclonal antibody (Bioss), as well as a monoclonal antibody prepared by a known means can be used.
- Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced from hybridomas and those produced by designing antibody genes or antibody fragment genes using well-known genetic engineering techniques.
- the above-mentioned anti-active GIP antibody comprises a DNA encoding the H chain variable region (for example, a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1) and a DNA encoding the L chain variable region (for example, SEQ ID NO: 3 DNAs comprising the base sequence represented by the above) are respectively constructed downstream of the promoters of appropriate vectors to construct recombinant vectors, and H chains and L chains are produced from the transformants introduced into the host cells.
- a DNA encoding the H chain variable region for example, a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
- a DNA encoding the L chain variable region for example, SEQ ID NO: 3 DNAs comprising the base sequence represented by the above
- a DNA encoding the H chain variable region for example, a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
- a DNA encoding the L chain variable region for example, SEQ ID NO: 3
- a recombinant vector in which a DNA comprising the nucleotide sequence shown is ligated with a DNA encoding a known linker and inserted downstream of the promoter of an appropriate vector.
- scFv antigen binding capacity
- variable region may be the same as the antibody from which the variable region is derived, or may be derived from a different antibody.
- amino acid mutations for preparing functionally equivalent polypeptides can be introduced using, for example, site-specific mutagenesis.
- Anti-active GIP antibody-producing hybridomas can be basically prepared using known techniques as follows. For example, an active GIP or a peptide having an N-terminal amino acid sequence thereof (a peptide consisting of the 1st to 15th amino acid sequences of SEQ ID NO: 5) may be converted into an appropriate carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (if necessary). KLH) or bovine serum albumin can be used to enhance immunogenicity and to immunize non-human mammals.
- the active GIP used as a sensitizing antigen (immunogen) or the above peptide can be prepared by genetic engineering techniques or chemical synthesis.
- the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with mammalian myeloma cells, which are parent cells used for cell fusion. Specifically, rodent animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
- the sensitizing antigen is injected by intraperitoneal or subcutaneous injection of a mammal.
- the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
- PBS Phosphate-Buffered Saline
- physiological saline physiological saline
- the dose of the antigen is appropriately determined according to the administration route and the animal species, but the usual dose is preferably about 10 ⁇ g to 1 mg per dose.
- immune cells are taken out from the mammal whose antibody level has risen, and cell fusion is performed. Spleen cells are particularly preferred as preferred immune cells for cell fusion.
- myeloma cells of mammals as the other parent cells to be fused with the immune cells, various known cell lines such as P3X63, NS-1, MPC-11, SP2 / 0 and the like are appropriately used.
- the cell fusion of the immune cells and myeloma cells can be performed according to a known method, for example, the method of Keller et al. (Kohler et al., Nature, Vol. 256, p495-497 (1975)). That is, in the presence of a cell fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG having an average molecular weight of 1000 to 6000, concentration of 30 to 60%), Sendai virus (HVJ) and the like, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is optionally added, and RPMI1640 culture solution Fusion cells (hybridomas) are formed by mixing immune cells and myeloma cells in a nutrient culture solution such as a MEM culture solution.
- a cell fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG having an average molecular weight of 1000 to 6000, concentration of 30 to 60%)
- Sendai virus (HVJ) and the like an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is optional
- the hybridoma formed by fusion is cultured for 1 to 7 days in a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium), and separated from unfused cells.
- a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium)
- HAT medium a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin
- the resulting hybridoma is further selected by the antibody it produces (an antibody that binds to active GIP and does not substantially bind to non-active GIP).
- the selected hybridoma is single-cloned according to a known limiting dilution method and established as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
- a known method can be used as a method for detecting the activity of the antibody produced by the hybridoma.
- the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, A method of obtaining ascites is employed.
- Antibody purification can be performed using known purification means such as salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, or affinity chromatography.
- examples of the “GIP receptor antagonist” include methylidene hydrazide compounds described in International Publication No. 2003/097031, specifically 4-hydroxybenzoic acid (2-bromobenzylidene) hydrazide, 3 -Cyano-4-hydroxybenzoic acid [1- (2,3,5,6-tetramethylbenzyl) indol-4-yl] methylidene hydrazide, 3-chloro-4-hydroxybenzoic acid (4-methoxynaphthalene-1 -Yl) methylidenehydrazide, 3-chloro-4-hydroxybenzoic acid [1- (5-chlorothiophen-2-ylmethyl) -1H-indol-5-yl] methylidenehydrazide, and the like.
- examples of the “GIP secretion or elevation inhibitor” include BMPP (3-bromo-5-methyl-2-phenylpyrazolo [1,5-a] pyrimidin-7-ol) (International Publication No. 2001). / 87341), alginic acid (JP 2013-166671), phosphatidylethanolamine (JP 2010-222284), polyglutamic acid (JP 2012-144486), kiraya (JP 2012-171914).
- super long chain fatty acid having 20 or more carbon atoms for example, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid, serotic acid, Montanic acid, melissic acid, lacteric acid, gadoleic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, erucic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, nervonic acid, hexacosenoic acid, octacosenoic acid, etc .; No. 225458), triacylglycerol (Japanese Unexamined Patent Publication No.
- 1% by mass or more of the constituent fatty acid is docosahexaenoic acid and 1% by mass or more is eicosapentaenoic acid, long-chain unsaturated fatty acid ethanolamide
- triacylglycerol Japanese Patent Laid-Open No. 2013-075887
- 10% by mass or more of the constituent fatty acids is ⁇ -linolenic acid
- Acylglycerol having a C14-C18 saturated fatty acid bonded to the 2-position of the glycerol skeleton for example, lauric acid (12: 0), myristic acid (14: 0), palmitic acid (16: 0), linoleic acid (18: 2) Oleic acid (18: 1), stearic acid (18: 0), or arachidonic acid (20: 4)
- Bound 2-acyl mono glycerol JP 2016-047805 publication
- the anti-GIP antibody has an action of suppressing a decrease in body temperature caused by administration of GIP and improving chronic hypothermia in aged mice.
- GIP function inhibitors such as anti-GIP antibodies can be hypothermic prevention or amelioration agents and can be used to produce them.
- a GIP function inhibitor can be used for prevention or improvement of hypothermia.
- the use can be in humans or non-human animals, or specimens derived therefrom, and can be either therapeutic or non-therapeutic.
- non-therapeutic means a concept that does not include medical practice, that is, a concept that does not include a method for operating, treating, or diagnosing a person, more specifically, a doctor or a person who has received instructions from a doctor It is a concept that does not include a method of performing surgery, treatment or diagnosis.
- hypothermia means that the deep body temperature is reduced by 0.5 ° C. or more from the normal temperature
- prevention or improvement of hypothermia means that the deep body temperature is lowered and becomes hypothermia. It means suppressing or improving deep body temperature by improving deep body temperature.
- deep body temperature means the temperature of the deep part of the body (for example, rectum, esophagus, heart, brain, etc.), and is usually rectal temperature. In the case of humans, the deep body temperature can be calculated from the armpit temperature, the oral cavity (sublingual) temperature, the skin temperature, and the like.
- hypothermia causes, but are not limited to, minerals and vitamins, lack of protein, lack of exercise, poor circulation due to excessive stress, disorder of autonomic nerves, aging, etc., but in the present invention, Suitable for preventing or improving hypothermia.
- the hypothermia preventive or ameliorating agent of the present invention can be a drug for humans or animals that exhibits the effect of suppressing the decrease in body temperature or improving the hypothermia, and can also be a material or a preparation used in combination with a pharmaceutical.
- the pharmaceutical can be administered in any dosage form.
- the dosage form include oral administration such as tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc. or parenteral administration such as injections, suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, external preparations, etc.
- the form is parenteral administration.
- Such pharmaceutical preparations of various dosage forms include the GIP function inhibitor of the present invention alone or other pharmaceutically acceptable excipients, binders, extenders, disintegrants, surfactants, lubricants. It can be prepared by appropriately combining a bulking agent, a dispersing agent, a buffering agent, a preservative, a flavoring agent, a fragrance, a coating agent, a carrier, a diluent and the like.
- the content of the GIP function inhibitor in the hypothermic prevention or amelioration agent of the present invention is preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and preferably 1% by mass or less, more preferably 0. 0.1 mass% or less, preferably 0.001 to 1 mass%, more preferably 0.01 to 0.1 mass%.
- the dose of the hypothermia prevention or amelioration agent of the present invention may vary according to the subject's condition, body weight, sex, age or other factors, but as a GIP function inhibitor per adult when administered orally, It is preferably 1 mg or more, more preferably 5 mg or more per day, and preferably 100 mg or less, more preferably 20 mg or less.
- a human having a deep body temperature of 36 ° C. or lower is preferable.
- a hypothermia preventive or ameliorating agent comprising a GIP function inhibitor as an active ingredient.
- Use of a GIP function inhibitor for producing an agent for preventing or improving hypothermia ⁇ 3> A GIP function inhibitor for use in the prevention or improvement of hypothermia.
- a method for preventing or improving hypothermia comprising administering a GIP function inhibitor to a subject.
- the GIP function inhibitor is an anti-GIP antibody, a GIP receptor antagonist, or a GIP secretion or elevation inhibitor.
- the anti-GIP antibody is preferably an anti-active GIP antibody.
- the GIP receptor antagonist is preferably 4-hydroxybenzoic acid (2-bromobenzylidene) hydrazide, 3-cyano-4-hydroxybenzoic acid [1- (2,3,5,6- Tetramethylbenzyl) indol-4-yl] methylidenehydrazide, 3-chloro-4-hydroxybenzoic acid (4-methoxynaphthalen-1-yl) methylidenehydrazide, or 3-chloro-4-hydroxybenzoic acid [1- (5-Chlorothiophen-2-ylmethyl) -1H-indol-5-yl] methylidenehydrazide.
- the GIP secretion or elevating agent is preferably 3-bromo-5-methyl-2-phenylpyrazolo [1,5-a] pyrimidin-7-ol, alginic acid, phosphatidylethanol 1 mass of amine, polyglutamic acid, kiraya, lysophosphatidylinositol, cellulose nanofiber, ⁇ -chitin nanofiber, diacylglycerol, hydroxypropylated starch, monoacylglycerol, ultralong chain fatty acid with 20 or more carbon atoms, constituent fatty acid % Or more is docosahexaenoic acid, and 1% or more by mass is eicosapentaenoic acid triacylglycerol, long-chain unsaturated fatty acid ethanolamide, rice bran extract, catechins, and 10% by mass or more of the constituent fatty acids is ⁇ -linolenic acid.
- the anti-active GIP antibody is preferably an anti-active GIP antibody that binds to active GIP and does not substantially bind to non-active GIP.
- the anti-active GIP antibody is preferably an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a heavy chain variable region or a region comprising a conservative sequence modification thereof.
- the anti-active GIP antibody preferably has a conservative sequence-modified amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- the anti-active GIP antibody preferably includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as the heavy chain variable region or a region comprising a conservative sequence modification thereof, and the sequence as the light chain variable region An antibody comprising a region consisting of the amino acid sequence shown by No.
- the anti-active GIP antibody preferably has a conservative sequence-modified amino acid sequence with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 that is 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- a conservative sequence-modified amino acid sequence with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
- the spleen was extracted from the mouse having increased antibody titer to obtain spleen cells.
- the obtained spleen cells and mouse myeloma cell line P3U1 were fused by the PEG method. Then, it seed
- the hybridoma obtained above is cultured so that a single colony can be obtained by the limiting dilution method, so that the antibody-producing hybridoma is cloned, and the single colony forming well is measured again by ELISA, and the antigen (1 9B9H5-B9 strain was produced that produced an antibody positive for) and negative for antigen (2) (International Publication No. 2016/104439).
- the obtained antibody-producing hybridoma is stored such that the hybridoma is cultured and recovered in the logarithmic growth phase, and then the cell concentration is 1 ⁇ 10 6 cells / mL in a cell frozen solution containing FBS (Fetal Bovine Serum). After the preparation, it was dispensed into a freezing tube so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / tube, and stored at ⁇ 80 ° C. in a bicelle.
- Test Example 1 Reactivity with Active GIP by ELISA Method
- the reactivity between the monoclonal antibody obtained in Production Example 1 and active GIP was confirmed by ELISA method.
- the amino group of the anti-active GIP monoclonal antibody was biotinylated with an NH 2 group biotinylation kit (manufactured by Dojindo).
- a 4-fold dilution series of GIP (1-42) or GIP (3-42) with a maximum concentration of 2000 pg / mL was prepared in 6 stages (8.2 to 2000 pg / mL), and anti-total GIP monoclonal was used as a capture antibody.
- Antibody attached to Millipore's Human GIP (total) ELISA kit
- biotinylated anti-active GIP monoclonal antibody as detection antibody
- sandwich ELISA system using peroxidase-streptavidin conjugate for detection was prepared (FIG. 1). As shown in FIG.
- Example 1 Acute body temperature lowering effect by GIP (1) Animals and rearing method After carrying male misty mice (m / m mice, Oriental Yeast Co., Ltd.) of C57BLKS / J strain at 6 weeks of age (room temperature 23 ° C.) , Humidity 55 ⁇ 10%, light period; 7:00 to 19:00), reared under free feeding and drinking water.
- CE-2 (Clea Japan Co., Ltd.) was used as a bait and acclimated for 2 weeks in the above environment, and then subjected to the test.
- mice (8 weeks old) were treated with physiological saline (control group) or GIP solution (5 nmol / kg body weight) (GIP administration group) in the light period (AM 9:00 to 10:00). It was administered internally. The probe was inserted into the mouse rectum before administration and 0.5, 2, 4.5, and 8 hours after administration, and body temperature (rectal temperature) was measured.
- Body temperature (rectal temperature) measurement A digital rectal thermometer (NS-TC10, manufactured by Neuroscience) was used for rectal temperature measurement. According to the laboratory animal handbook (Yokendo, published in 1983), after holding the mouse without anesthesia, the tip of the probe (RET-3 (19 ⁇ 0.7 mm shaft diameter), manufactured by Physitemp) was placed in the mouse rectum. Inserted 5 to 1 cm and measured for 15 to 30 seconds.
- Example 2 Chronic body temperature lowering action by GIP and body temperature lowering action by anti-GIP antibody
- Animals and rearing method Males of C57BLKS / J strain, leptin receptor abnormal mice (db / db mice, Oriental Yeast Co., Ltd.) )) At 6 weeks of age (room temperature 23 ° C., humidity 55 ⁇ 10%, light period; 7:00 to 19:00) and reared under free feeding and free drinking.
- CE-2 (Clea Japan Co., Ltd.) was used as a bait and acclimated for 2 weeks in the above environment, and then subjected to the test.
- Mouse-derived GIP (manufactured by Ana spec) was dissolved in physiological saline at a concentration of 500 nM to obtain a GIP solution.
- a GIP-conjugated anti-GIP antibody solution was obtained.
- mice (8 weeks old) in physiological saline (control group), GIP solution (5 nmol / kg body weight) (GIP administration group), or GIP-conjugated anti-GIP antibody solution (GIP; 5 nmol / kg body weight, anti-GIP antibody; 1 mg / kg body weight) (GIP + anti-GIP antibody administration group) was administered intraperitoneally every morning (AM 9:00 to 10:00). The administration period was 28 days, and the probe was inserted into the mouse rectum 1-2 hours after administration (3-4 day intervals), and the body temperature (rectal temperature) was measured.
- Body temperature (rectal temperature) measurement A digital rectal thermometer (NS-TC10, manufactured by Neuroscience) was used for rectal temperature measurement. According to the laboratory animal handbook (Yokendo, published in 1983), after holding the mouse without anesthesia, the tip of the probe (RET-3 (19 ⁇ 0.7 mm shaft diameter), manufactured by Physitemp) was placed in the mouse rectum. Inserted 5 to 1 cm and measured for 15 to 30 seconds.
- Example 3 Age-related change in blood GIP level (1) Animals and rearing method After carrying C57BL / 6J male mice (CLEA Japan, Inc.) at 4 weeks of age (room temperature 23 ° C., humidity 55 ⁇ 10%, light Period: 7:00 to 19:00), reared under free feeding and free drinking water. The diet was acclimatized for 1 week with CE-2 (Nippon Claire Co., Ltd.) and then reared for 95 weeks with a normal diet (D12450K, Research Diets, Inc) or a high fat diet (D12451, Research Diets, Inc).
- the blood GIP concentration was determined by measuring the total GIP according to a conventional method using a GIP ELISA kit (manufactured by Millipore) after preparing a plasma fraction by centrifugation of the collected blood.
- Example 4 Age-related changes in deep body temperature (1) Animals and rearing method After carrying C57BL / 6J male mice (CLEA Japan, Inc.) at 4 weeks of age (room temperature 23 ° C., humidity 55 ⁇ 10%, light period; 7:00 to 19:00), reared under free feeding and free drinking. The diet was acclimatized for 1 week with CE-2 (Nippon Claire Co., Ltd.) and then reared for 95 weeks with a normal diet (D12450K, Research Diets, Inc) or a high fat diet (D12451, Research Diets, Inc). Every week from the age of 5 weeks, a probe was inserted into the mouse rectum, and body temperature (rectal temperature) was measured. The administration period was 8 weeks, and the probe was inserted into the mouse rectum over time (at intervals of 2 to 4 weeks), and the body temperature (rectal temperature) was measured.
- Body temperature (rectal temperature) measurement A probe (RET-3 (19 ⁇ 0.7 mm shaft diameter), manufactured by Physitemp) was inserted into the mouse rectum every week from the age of 5 weeks, and body temperature (rectal temperature) was measured. The rectal temperature was measured using a digital rectal thermometer (NS-TC10, manufactured by Neuroscience). According to the laboratory animal handbook (Yokendo, published in 1983), the mouse was held without anesthesia, and the tip of the probe was inserted into the mouse rectum 0.5 to 1 cm and measured for 15 to 30 seconds.
- Example 5 Inhibition of body temperature decrease of anti-GIP antibody on aged mice (1) Animals and rearing method After carrying C57BL / 6J male mice (CLEA Japan, Inc.) at 4 weeks of age (room temperature 23 ° C., humidity 55 ⁇ 10%) , Light period; 7:00 to 19:00), free feeding (D12450K, Research Diets, Inc), and rearing for 111 weeks under free drinking water.
- Body temperature (rectal temperature) measurement A digital rectal thermometer (NS-TC10, manufactured by Neuroscience) was used for rectal temperature measurement. According to the laboratory animal handbook (Yokendo, published in 1983), after holding the mouse without anesthesia, the tip of the probe (RET-3 (19 ⁇ 0.7 mm shaft diameter), manufactured by Physitemp) was placed in the mouse rectum. Inserted 5 to 1 cm and measured for 15 to 30 seconds.
- the diet composition is shown in Table 1 below.
- body weight was measured once a week and food intake was measured twice a week.
- free feeding and free drinking were used.
- a probe was inserted into the mouse rectum and body temperature (rectal temperature) was measured.
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Abstract
低体温に有用な低体温予防又は改善剤の提供。 GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
Description
本発明は、低体温予防又は改善剤に関する。
ヒトの体温の平均は概ね36.5℃であり、これは体内の酵素が最も活性化されて機能する温度である。
しかしながら、近年、平熱が0.5~1.5℃低下する低体温のヒトが増加している。その原因は、ミネラル・ビタミン、タンパク質の不足、運動不足、過度のストレスによる血行不良・自律神経の乱れ等が考えられている。また、ヒトの平熱は乳児で最も高く、年齢が上がるにつれて徐々に低下する。青年期に体温の低下は止まるが、高齢者になると再び体温が低下し、平熱は若い時よりも凡そ0.2℃前後低い傾向がみられる。その一因として、熱産生を担う褐色脂肪組織の機能低下が関わっていると考えられている。
しかしながら、近年、平熱が0.5~1.5℃低下する低体温のヒトが増加している。その原因は、ミネラル・ビタミン、タンパク質の不足、運動不足、過度のストレスによる血行不良・自律神経の乱れ等が考えられている。また、ヒトの平熱は乳児で最も高く、年齢が上がるにつれて徐々に低下する。青年期に体温の低下は止まるが、高齢者になると再び体温が低下し、平熱は若い時よりも凡そ0.2℃前後低い傾向がみられる。その一因として、熱産生を担う褐色脂肪組織の機能低下が関わっていると考えられている。
斯かる低体温は、免疫力の低下、基礎代謝の低下、体内酵素活性の低下を招き、カゼなどの感染症にかかりやすくなり、花粉症などのアレルギー症状が出やすくなる。また、血行不良・リンパの流れや新陳代謝力の低下、自律神経のバランスの崩れを引き起こす。したがって、低体温では、内蔵の機能低下に伴う諸症状、下痢や脱水症状、手足の冷え、肩こり、頭痛、腰痛、腹痛、生理痛、不眠、睡眠の質の低下、疲労感、活動量の低下といった症状がしばしば現れる。
一方、GIP(gastric inhibitory polypeptide又はglucose-dependent insulinotropic polypeptide)は、グルカゴン・セクレチンファミリーに属する消化管ホルモンの1つである。GIPはGLP-1(グルカゴン様ペプチド1)と共にインクレチンと称され、脂質や糖質の摂食時に小腸に存在するK細胞より分泌される。
GIPは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られている。そのため、GIPの作用が肥満の一要因になっているとも考えられ、実際、GIPの機能を阻害すると、肥満が抑制されるとの報告がある(非特許文献1)。
GIPは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られている。そのため、GIPの作用が肥満の一要因になっているとも考えられ、実際、GIPの機能を阻害すると、肥満が抑制されるとの報告がある(非特許文献1)。
さらに、GIPはインスリン抵抗性の一因となることが報告されている(非特許文献1)。インスリン抵抗性を発症すると、インスリンによる糖の吸収作用が低下し、その結果、高インスリン血症を引き起こす。高インスリン血症は、肥満をはじめとする様々な生活習慣病の発症につながる根本的な原因であるとも言われており、インスリン抵抗性の予防・改善は生活習慣病のリスク軽減の面からも重要である。
しかしながら、GIPと低体温が関係するという報告なく、血中GIP濃度を減少させることにより、低体温が改善できることは全く知られていない。
(非特許文献1)Miyawaki Kら、Nat Med.8(7):738-42,2002
本発明は、以下の1)~5)に係るものである。
1)GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
2)低体温予防又は改善剤を製造するための、GIP機能阻害剤の使用。
3)低体温の予防又は改善に使用するためのGIP機能阻害剤。
4)低体温予防又は改善のためのGIP機能阻害剤の使用。
5)GIP機能阻害剤を対象に投与することを含む、低体温の予防又は改善方法。
1)GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
2)低体温予防又は改善剤を製造するための、GIP機能阻害剤の使用。
3)低体温の予防又は改善に使用するためのGIP機能阻害剤。
4)低体温予防又は改善のためのGIP機能阻害剤の使用。
5)GIP機能阻害剤を対象に投与することを含む、低体温の予防又は改善方法。
本発明は、低体温の改善に有用な低体温改善剤を提供することに関する。
本発明者らは、GIPと体温との関係について検討したところ、GIPを投与した場合に体温が有意に低下すること、そしてGIP機能を抑制することによって、低体温が改善できることを見出した。
本発明の低体温予防又は改善剤は、低体温状態、例えば加齢に伴う低体温に対して体温低下抑制効果を発揮する。したがって、低体温に起因して生じる免疫力の低下、基礎代謝の低下、血行不良・リンパの流れや新陳代謝力の低下、自律神経のバランスの崩れ等の予防又は改善に有用である。
本発明において、GIP(gastric inhibitory polypeptide又はglucose-dependent insulinotropic polypeptide)は、配列番号1で示される42個のアミノ酸からなるポリペプチドである。GIP(1-42)は生理活性を有するが(活性型GIP)、生体内に存在するdipeptidyl peptidase-4(DPP-4)によってN末端の2アミノ酸が切断されて不活性型のGIP(3-42)となる。
本発明において、「GIP機能阻害剤」とは、GIPが有する消化管ホルモンとしての機能を阻害又は抑制する物質、すなわちGIP遺伝子又はGIP受容体遺伝子レベルで、あるいはGIP自体又はGIP受容体レベルで機能を阻害する物質を意味し、具体的には抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤、GIP分泌又は上昇抑制剤が挙げられる。
本発明において「抗GIP抗体」とは、少なくとも活性型GIPの機能を阻害する抗体であればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであっても良いが、国際公開第2016/104439号、特開2013-138638号公報に記載の、非活性型GIPとは実質的に結合しない抗体(「抗活性型GIP抗体」と称する)であるのが好ましい。また、活性型GIPとの結合定数(Ka)が107M-1以上であるのが好ましく、より好ましくは108M-1以上であり、より好ましくは109M-1以上である。
抗活性型GIP抗体としては、被験抗体の非活性型GIPに対する結合量が、活性型GIPに対する結合量を100%とした場合、多くとも10%以下、好ましくは5%以下、更に好ましくは1%以下、更により好ましくは0.1%であるものが挙げられる。非活性型GIPとの結合量は、被験抗体と非活性型GIPとの結合を、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びELISA等の方法を用いて測定することにより判断することができる。
抗活性型GIP抗体としては、被験抗体の非活性型GIPに対する結合量が、活性型GIPに対する結合量を100%とした場合、多くとも10%以下、好ましくは5%以下、更に好ましくは1%以下、更により好ましくは0.1%であるものが挙げられる。非活性型GIPとの結合量は、被験抗体と非活性型GIPとの結合を、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びELISA等の方法を用いて測定することにより判断することができる。
抗活性型GIP抗体としては、例えば、活性型GIP(配列番号5)のN末端から8番目以降のアミノ酸を認識する抗体であり、少なくも8~10番目(SDY)から選ばれる1以上のアミノ酸を認識する抗体が好適に挙げられる。
当該抗活性型GIP抗体としては、更に、H鎖に、下記(1)で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものが好適である。
EMNPSDGRTHFNE (1)
(1)中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はN末からC末方向の順に記載している。ここで、Fはフェニルアラニン、Tはスレオニン、Dはアスパラギン酸、Eはグルタミン酸、Mはメチオニン、Nはアスパラギン、Pはプロリン、Sはセリン、Gはグリシン、Rはアルギニン、Hはヒスチジンを示す。
当該抗活性型GIP抗体としては、更に、H鎖に、下記(1)で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものが好適である。
EMNPSDGRTHFNE (1)
(1)中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はN末からC末方向の順に記載している。ここで、Fはフェニルアラニン、Tはスレオニン、Dはアスパラギン酸、Eはグルタミン酸、Mはメチオニン、Nはアスパラギン、Pはプロリン、Sはセリン、Gはグリシン、Rはアルギニン、Hはヒスチジンを示す。
本明細書において、「保存的配列改変」とは、抗原決定に関与する相補性決定領域(CDR)以外のアミノ酸改変であって、改変前のアミノ酸配列からなる抗体の反応性に有意な影響を及ぼさない又は変化させないアミノ酸改変を意味する。そのような保存的配列改変には、1~数個、好ましくは1~3個、より好ましくは1個のアミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。当該保存的配列改変がなされたアミノ酸配列としては、改変前のアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。当該改変は、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基(アミノ酸残基のファミリー)に置換されることが挙げられる。斯かるアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。
尚、アミノ酸配列間の同一性とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合(%)をいう。具体的には、例えばリップマン-パーソン法(Lipman-Pearson法;Science, 227, 1435, (1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(Ver.5.1.1;ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行なうことにより算出できる。
上記(1)で表されるアミノ酸配列は、H鎖可変領域を示す配列番号2で示されるアミノ酸配列の50~62番目の13アミノ酸残基からなる領域をコードするものである。
したがって、上記抗活性型GIP抗体としては、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものであるのがより好ましい。また更に、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものがより好ましい。
H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる領域を含む抗活性型GIP抗体としては、後記製造例1に示すハイブリドーマ9B9H5-B9株から産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
したがって、上記抗活性型GIP抗体としては、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものであるのがより好ましい。また更に、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものがより好ましい。
H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる領域を含む抗活性型GIP抗体としては、後記製造例1に示すハイブリドーマ9B9H5-B9株から産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の抗GIP抗体は、上記反応性を有する限り、当該抗体のフラグメント、例えば、F(ab')2、F(ab')、一本鎖Fv(scFv)、VH及びVL中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合しているジスルフィド結合Fv(dsFv)若しくはこれらの重合体、又はscFvが二量体化した二量体化V領域(Diabody)であっても良い。更に、上記反応性を有する限り、抗活性型GIP抗体の一部を含むペプチド、すなわち抗体を構成するアミノ酸配列の一部を備えるペプチドであって上記反応性を有するものも当該抗体のフラグメントに含まれる。
また、本発明の抗GIP抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgYのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはIgGである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
また本発明の抗GIP抗体(抗活性型GIP抗体を含む)は、非ヒト動物の抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の何れであっても良い。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の抗体を挙げることができ、好ましくはマウスの抗体である。
ここで、「ヒト型キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってGIPと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってGIPと特異的に結合する抗体のH鎖とL鎖の相補性決定領域(CDR)以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体を意味する。
ここで、「ヒト型キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってGIPと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってGIPと特異的に結合する抗体のH鎖とL鎖の相補性決定領域(CDR)以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体を意味する。
抗GIP抗体は、市販のポリクローナル抗体(Bioss社)の他、公知の手段を用いて作製されたモノクローナル抗体を使用することができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマから産生されるもの、及び抗体遺伝子又は抗体フラグメント遺伝子を設計し周知の遺伝子工学的手法を用いて生産されるものが包含される。
例えば、上述した抗活性型GIP抗体は、H鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号1で示される塩基配列からなるDNA)と、L鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号3で示される塩基配列からなるDNA)を、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体からH鎖及びL鎖を製造し、これらを可能性のあるペプチドで連結させる、或いはH鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号1で示される塩基配列からなるDNA)とL鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号3で示される塩基配列からなるDNA)を、公知のリンカーをコードするDNAで繋いで適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞内で発現させる、等により抗原結合能を持った一本鎖の組換え抗体タンパク質(scFv)を生産することが挙げられる。(MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554, 1990、Tim Clackson et al, Nature, 352, 642-628, 1991等参照)。また、更に、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAとを結合させて発現させたものを生産することであってもよい。この場合、定常領域は、可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、あるいは異なる抗体に由来するものであってもよい。
上記の如く機能的に同等なポリペプチドを調製するためのアミノ酸変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発法などを用いて行うことができる。
例えば、上述した抗活性型GIP抗体は、H鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号1で示される塩基配列からなるDNA)と、L鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号3で示される塩基配列からなるDNA)を、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体からH鎖及びL鎖を製造し、これらを可能性のあるペプチドで連結させる、或いはH鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号1で示される塩基配列からなるDNA)とL鎖可変領域をコードするDNA(例えば、配列番号3で示される塩基配列からなるDNA)を、公知のリンカーをコードするDNAで繋いで適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞内で発現させる、等により抗原結合能を持った一本鎖の組換え抗体タンパク質(scFv)を生産することが挙げられる。(MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554, 1990、Tim Clackson et al, Nature, 352, 642-628, 1991等参照)。また、更に、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNAとを結合させて発現させたものを生産することであってもよい。この場合、定常領域は、可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、あるいは異なる抗体に由来するものであってもよい。
上記の如く機能的に同等なポリペプチドを調製するためのアミノ酸変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発法などを用いて行うことができる。
抗活性型GIP抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。
例えば、活性型GIP又はそのN末端のアミノ酸配列を有するペプチド(配列番号5の1~15番目のアミノ酸配列からなるペプチド)を、必要に応じて、適当なキャリアー蛋白質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やウシ血清アルブミンなどと結合することによって、より免疫原性を高め、非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。尚、感作抗原(免疫源)として用いられる活性型GIP又は上記ペプチドは、遺伝子工学的手法又は化学合成により作製することができる。
例えば、活性型GIP又はそのN末端のアミノ酸配列を有するペプチド(配列番号5の1~15番目のアミノ酸配列からなるペプチド)を、必要に応じて、適当なキャリアー蛋白質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やウシ血清アルブミンなどと結合することによって、より免疫原性を高め、非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。尚、感作抗原(免疫源)として用いられる活性型GIP又は上記ペプチドは、遺伝子工学的手法又は化学合成により作製することができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞である哺乳動物のミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は1回当たり10μg~1mg程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばP3X63、NS-1、MPC-11、SP2/0等が適宜使用される。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばP3X63、NS-1、MPC-11、SP2/0等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール(平均分子量1000~6000のPEG、30~60%濃度)、センダイウィルス(HVJ)等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、RPMI1640培養液、MEM培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞(ハイブリドーマ)の形成が行われる。
融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地(HAT培地)等の選択培地で1日~7日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体(活性型GIPに結合し、且つ非活性型GIPとは実質的に結合しない抗体)により更に選択する。
選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばELISA法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばELISA法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法又はアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
本発明において、「GIP受容体拮抗剤」としては、例えば、国際公開第2003/097031号に記載のメチリデンヒドラジド化合物、具体的には、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)インドール-4-イル]メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジド等が挙げられる。
本発明において、「GIP分泌又は上昇抑制剤」としては、例えば、BMPP(3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール)(国際公開第2001/87341号)、アルギン酸(特開2013-166741号公報)、フォスファチジルエタノールアミン(特開2010-222284号公報)、ポリグルタミン酸(特開2012-144486号公報)、キラヤ(特開2012-171914号公報)、リゾフォスファチジルイノシトール(特開2012-171915号公報)、セルロースナノファイバ(特開2009-126837号公報)、β-キチンナノファイバー(特開2010-241713号公報)、ジアシルグリセロール(特開2006-342084号公報)、ヒドロキシプロピル化澱粉(特開2006-342085号公報)、モノアシルグリセロール(特開2007-290989号公報)、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸(例えば、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、ラクセル酸、ガドレイン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ネルボン酸、ヘキサコセン酸、オクタコセン酸等;特開2011-225458号公報)、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール(特開2013-063937号公報)、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド(例えば、オレイルエタノールアミド、リノレイルエタノールアミド、リノレニルエタノールアミド、homo-γ-リノレニルエタノールアミド、アラキドニルエタノールアミド、7,10,13,16-ドコサテトラエニルエタノールアミド;特開2010-180203号公報)、米糠抽出物(特表2012-515139号公報)、カテキン類(特開2010-260856号公報)、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール(特開2013-075887号公報)、グリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロール(例えば、ラウリン酸(12:0)、ミリスチン酸(14:0)、パルミチン酸(16:0)、リノール酸(18:2)、オレイン酸(18:1)、ステアリン酸(18:0)、又はアラキドン酸(20:4)が2位に結合した2-アシルモノグリセロール;特開2016-047805号公報)等が挙げられる。
後記実施例に示すように、抗GIP抗体は、GIPの投与により生じる体温低下を抑制し、老齢マウスにおける慢性的低体温を改善する作用を有する。
したがって、抗GIP抗体のようなGIP機能阻害剤は、低体温予防又は改善剤となり得、またこれを製造するために使用できる。
また、GIP機能阻害剤は、低体温の予防又は改善のために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
したがって、抗GIP抗体のようなGIP機能阻害剤は、低体温予防又は改善剤となり得、またこれを製造するために使用できる。
また、GIP機能阻害剤は、低体温の予防又は改善のために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
本発明において、「低体温」とは、深部体温が平熱より0.5℃以上低下することを意味し、「低体温の予防又は改善」とは、深部体温が低下し低体温となることを抑制すること、又は深部体温を上げて低体温を改善することを意味する。ここで、深部体温とは、体の深部(例えば、直腸、食道、心臓、脳等)の温度を意味し、通常は直腸温である。深部体温は、ヒトの場合、腋下温、口腔(舌下)温、皮膚温等から算出することができる。
低体温の原因は、ミネラル・ビタミン、タンパク質の不足、運動不足、過度のストレスによる血行不良・自律神経の乱れ、加齢等が挙げられ特に限定されないが、本発明においては、加齢に伴って生じる低体温の予防又は改善に適する。
低体温の原因は、ミネラル・ビタミン、タンパク質の不足、運動不足、過度のストレスによる血行不良・自律神経の乱れ、加齢等が挙げられ特に限定されないが、本発明においては、加齢に伴って生じる低体温の予防又は改善に適する。
本発明の低体温予防又は改善剤は、体温低下の抑制や低体温の改善の効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品となり、また医薬品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
本発明の低体温予防又は改善剤を医薬品として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は非経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のGIP機能阻害剤を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のGIP機能阻害剤を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
本発明の低体温予防又は改善剤におけるGIP機能阻害剤の含有量は、好ましくは0.001質量%以上、より好ましくは0.01質量%以上、且つ好ましくは1質量%以下、より好ましくは0.1質量%以下であり、また好ましくは0.001~1質量%、より好ましくは0.01~0.1質量%である。
本発明の低体温予防又は改善剤の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人1人当たり、GIP機能阻害剤として、1日あたり好ましくは1mg以上、より好ましくは5mg以上であり、且つ好ましくは100mg以下、より好ましくは20mg以下である。
また、本発明の低体温予防又は改善剤の投与対象者としては、深部体温が36℃以下のヒトが好ましい。
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
<1>GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
<2>低体温予防又は改善剤を製造するための、GIP機能阻害剤の使用。
<3>低体温の予防又は改善に使用するためのGIP機能阻害剤。
<4>低体温予防又は改善のためのGIP機能阻害剤の(非治療的)使用。
<5>GIP機能阻害剤を対象に投与することを含む、低体温の予防又は改善方法。
<1>GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
<2>低体温予防又は改善剤を製造するための、GIP機能阻害剤の使用。
<3>低体温の予防又は改善に使用するためのGIP機能阻害剤。
<4>低体温予防又は改善のためのGIP機能阻害剤の(非治療的)使用。
<5>GIP機能阻害剤を対象に投与することを含む、低体温の予防又は改善方法。
<6><1>~<5>において、GIP機能阻害剤は、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である。
<7><6>において、抗GIP抗体は好ましくは抗活性型GIP抗体である。
<8><6>において、GIP受容体拮抗剤は好ましくは4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)インドール-4-イル]メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである。
<9><6>において、GIP分泌又は上昇制剤は、好ましくは3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである。
<10><7>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、活性型GIPに結合し、且つ非活性型GIPとは実質的に結合しない抗活性型GIP抗体であって、配列番号5で示されるアミノ酸配列の8~10番目のアミノ酸から選ばれる1以上を少なくとも認識し、且つH鎖に、下記(1)で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
EMNPSDGRTHFNE (1)
<11><10>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
<12><11>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものである。
<13><10>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
<14><13>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、配列番号2で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものであり、配列番号4で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号4で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものである。
<7><6>において、抗GIP抗体は好ましくは抗活性型GIP抗体である。
<8><6>において、GIP受容体拮抗剤は好ましくは4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)インドール-4-イル]メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである。
<9><6>において、GIP分泌又は上昇制剤は、好ましくは3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである。
<10><7>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、活性型GIPに結合し、且つ非活性型GIPとは実質的に結合しない抗活性型GIP抗体であって、配列番号5で示されるアミノ酸配列の8~10番目のアミノ酸から選ばれる1以上を少なくとも認識し、且つH鎖に、下記(1)で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
EMNPSDGRTHFNE (1)
<11><10>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
<12><11>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものである。
<13><10>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、H鎖可変領域として配列番号2で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つL鎖可変領域として配列番号4で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
<14><13>において、抗活性型GIP抗体は、好ましくは、配列番号2で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものであり、配列番号4で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号4で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するものである。
製造例1 抗活性型GIP抗体の作成
(1)免疫用ペプチドの合成
活性型GIPのN末端15アミノ酸(GIP(1-15))にポリエチレングリコールを付加(PEG(polyethylene glycol)化)後、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH;keyhole limpet hemocyanin)を化学的に結合させて、KLH結合PEG化GIP(1-15)を作製し、免疫抗原とした。活性型GIPのN末端15アミノ酸(GIP(1-15))をPEG化したものを測定用抗原(1)、非活性型GIPのN末端13アミノ酸(GIP(3-15))をPEG化したものを測定用抗原(2)とした。
(1)免疫用ペプチドの合成
活性型GIPのN末端15アミノ酸(GIP(1-15))にポリエチレングリコールを付加(PEG(polyethylene glycol)化)後、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH;keyhole limpet hemocyanin)を化学的に結合させて、KLH結合PEG化GIP(1-15)を作製し、免疫抗原とした。活性型GIPのN末端15アミノ酸(GIP(1-15))をPEG化したものを測定用抗原(1)、非活性型GIPのN末端13アミノ酸(GIP(3-15))をPEG化したものを測定用抗原(2)とした。
(2)免疫
BALB/cマウス(オリエンタル酵母工業(株))を用い、背部皮下に免疫した。初回の免疫では、上記で作成した抗原と完全フロイントアジュバンドとを混合したエマルジョンを投与した。初回免疫から2週間毎に抗原と不完全フロイントアジュバンドを混合したエマルジョンを用いて追加免疫を実施した。一度に免疫する抗原量は0.1~0.2mgの範囲で行った。初回免疫実施7週後、マウスより採取した血清を用いて抗体価測定を実施し、抗体価の上昇を確認した。
BALB/cマウス(オリエンタル酵母工業(株))を用い、背部皮下に免疫した。初回の免疫では、上記で作成した抗原と完全フロイントアジュバンドとを混合したエマルジョンを投与した。初回免疫から2週間毎に抗原と不完全フロイントアジュバンドを混合したエマルジョンを用いて追加免疫を実施した。一度に免疫する抗原量は0.1~0.2mgの範囲で行った。初回免疫実施7週後、マウスより採取した血清を用いて抗体価測定を実施し、抗体価の上昇を確認した。
(3)細胞融合
抗体価の上昇したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞株P3U1をPEG法により融合した。その後、96ウェルプレート20枚へ播種(1×105cells/ウェル)した。
抗体価の上昇したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞株P3U1をPEG法により融合した。その後、96ウェルプレート20枚へ播種(1×105cells/ウェル)した。
(4)スクリーニング
測定用抗原(1)及び(2)を固相化したELISA法でハイブリドーマ培養上清と抗原(1)及び(2)との反応を評価し、抗原(1)に陽性かつ抗原(2)に陰性を示したハイブリドーマを抗活性型GIPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
測定用抗原(1)及び(2)を固相化したELISA法でハイブリドーマ培養上清と抗原(1)及び(2)との反応を評価し、抗原(1)に陽性かつ抗原(2)に陰性を示したハイブリドーマを抗活性型GIPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
(5)クローニング
上記で得られたハイブリドーマを限界希釈法によって単一のコロニーが得られるように培養することにより、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行い、シングルコロニー形成ウェルを再びELISA測定し、抗原(1)に陽性かつ抗原(2)に陰性を示す抗体を産生する9B9H5-B9株を樹立した(国際公開第2016/104439号)。
得られた抗体産生ハイブリドーマの保存は、当該ハイブリドーマを培養し、対数増殖期に回収した後、FBS(Fetal Bovine Serum)含有細胞凍結液にて細胞濃度が1×106cells/mLとなるように調製した後、1×106cells/チューブとなるように凍結チューブに分注し、バイセル中にて-80℃で保存した。
上記で得られたハイブリドーマを限界希釈法によって単一のコロニーが得られるように培養することにより、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行い、シングルコロニー形成ウェルを再びELISA測定し、抗原(1)に陽性かつ抗原(2)に陰性を示す抗体を産生する9B9H5-B9株を樹立した(国際公開第2016/104439号)。
得られた抗体産生ハイブリドーマの保存は、当該ハイブリドーマを培養し、対数増殖期に回収した後、FBS(Fetal Bovine Serum)含有細胞凍結液にて細胞濃度が1×106cells/mLとなるように調製した後、1×106cells/チューブとなるように凍結チューブに分注し、バイセル中にて-80℃で保存した。
(6)抗体生産
得られた抗体産生ハイブリドーマの凍結バイアルを起眠し、Hybridoma-SFM(Serum-Free Medium)へ無血清馴化した。拡大培養後、ローラーボトル2本(500mL×2本、1L)で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清を、Protein Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体として精製した。
得られた抗体産生ハイブリドーマの凍結バイアルを起眠し、Hybridoma-SFM(Serum-Free Medium)へ無血清馴化した。拡大培養後、ローラーボトル2本(500mL×2本、1L)で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清を、Protein Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体として精製した。
試験例1 ELISA法による活性型GIPとの反応性
製造例1で得られたモノクローナル抗体と活性型GIPとの反応性をELISA法により確認した。NH2基ビオチン化キット(Dojindo社製)にて抗活性型GIPモノクローナル抗体のアミノ基のビオチン化を行った。Human(total)GIP ELISAキット(Millipore社製)に付属の検出抗体’GIP detection antibody(ビオチン化抗total GIPモノクローナル抗体)の代替として、作製したビオチン化抗活性型GIPモノクローナル抗体1μg/mLを用いてELISAを行った。GIP(1-42)あるいはGIP(3-42)の2000pg/mL溶液を最高濃度とした4倍希釈系列を6段階(8.2~2000pg/mL)まで作製し、捕捉抗体として抗total GIPモノクローナル抗体(Millipore社製 Human GIP(total)ELISAキットに付属)、検出抗体としてビオチン化抗活性型GIPモノクローナル抗体、検出にペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン結合物を用いたサンドイッチELISA系により、GIP濃度をX軸、吸光度450nm-590nmをY軸とした検量線を作製した(図1)。
図1のように、GIP(3-42)では高濃度域においても吸光度が上昇せず、GIP(1-42)にのみ濃度依存的に吸光度が上昇したことから、製造例1で得られたモノクローナル抗体はGIP(3-42)には交差性がなく、GIP(1-42)を特異的に検出できる抗体であることを確認した。
製造例1で得られたモノクローナル抗体と活性型GIPとの反応性をELISA法により確認した。NH2基ビオチン化キット(Dojindo社製)にて抗活性型GIPモノクローナル抗体のアミノ基のビオチン化を行った。Human(total)GIP ELISAキット(Millipore社製)に付属の検出抗体’GIP detection antibody(ビオチン化抗total GIPモノクローナル抗体)の代替として、作製したビオチン化抗活性型GIPモノクローナル抗体1μg/mLを用いてELISAを行った。GIP(1-42)あるいはGIP(3-42)の2000pg/mL溶液を最高濃度とした4倍希釈系列を6段階(8.2~2000pg/mL)まで作製し、捕捉抗体として抗total GIPモノクローナル抗体(Millipore社製 Human GIP(total)ELISAキットに付属)、検出抗体としてビオチン化抗活性型GIPモノクローナル抗体、検出にペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン結合物を用いたサンドイッチELISA系により、GIP濃度をX軸、吸光度450nm-590nmをY軸とした検量線を作製した(図1)。
図1のように、GIP(3-42)では高濃度域においても吸光度が上昇せず、GIP(1-42)にのみ濃度依存的に吸光度が上昇したことから、製造例1で得られたモノクローナル抗体はGIP(3-42)には交差性がなく、GIP(1-42)を特異的に検出できる抗体であることを確認した。
実施例1 GIPによる急性的な体温低下作用
(1)動物および飼育方法
C57BLKS/J系統の雄性mistyマウス(m/mマウス,オリエンタル酵母工業(株))を6週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))を用い、上記環境下で2週間馴化を行った後、試験に供した。
(1)動物および飼育方法
C57BLKS/J系統の雄性mistyマウス(m/mマウス,オリエンタル酵母工業(株))を6週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))を用い、上記環境下で2週間馴化を行った後、試験に供した。
(2)GIP溶液の作製
生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)を500nMの濃度で溶解し、GIP溶液とした。
生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)を500nMの濃度で溶解し、GIP溶液とした。
(3)投与量および投与方法
マウス(8週齢)に生理食塩水(対照群)又はGIP溶液(5nmol/kg体重)(GIP投与群)を明期(AM9:00~10:00)に腹腔内投与した。投与前、および投与0.5,2,4.5,8時間後にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
マウス(8週齢)に生理食塩水(対照群)又はGIP溶液(5nmol/kg体重)(GIP投与群)を明期(AM9:00~10:00)に腹腔内投与した。投与前、および投与0.5,2,4.5,8時間後にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(4)体温(直腸温)測定
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
(5)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(6)結果
対照群と比較して、GIP投与群で急性的な体温低下(2時間後0.83℃低下、4.5時間後0.81℃低下)を示した(図2)。
対照群と比較して、GIP投与群で急性的な体温低下(2時間後0.83℃低下、4.5時間後0.81℃低下)を示した(図2)。
実施例2 GIPによる慢性的な体温低下作用と抗GIP抗体による体温低下抑制作用
(1)動物および飼育方法
C57BLKS/J系統の雄性、レプチン受容体異常マウス(db/dbマウス,オリエンタル酵母工業(株))を6週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))を用い、上記環境下で2週間馴化を行った後、試験に供した。
(1)動物および飼育方法
C57BLKS/J系統の雄性、レプチン受容体異常マウス(db/dbマウス,オリエンタル酵母工業(株))を6週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))を用い、上記環境下で2週間馴化を行った後、試験に供した。
(2)GIP溶液および抗体抗原反応によるGIP結合型抗GIP抗体溶液の作製
生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)を500nMの濃度で溶解し、GIP溶液とした。生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)および製造例1で作製した抗活性型GIP抗体をそれぞれ500nMおよび0.1mg/mLの濃度で溶解し、1~2時間室温でインキュベートした溶液をGIP結合型抗GIP抗体溶液とした。
生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)を500nMの濃度で溶解し、GIP溶液とした。生理食塩水にマウス由来GIP(Ana spec社製)および製造例1で作製した抗活性型GIP抗体をそれぞれ500nMおよび0.1mg/mLの濃度で溶解し、1~2時間室温でインキュベートした溶液をGIP結合型抗GIP抗体溶液とした。
(3)投与量および投与方法
マウス(8週齢)に生理食塩水(対照群)、GIP溶液(5nmol/kg体重)(GIP投与群)、又はGIP結合型抗GIP抗体溶液(GIP;5nmol/kg体重,抗GIP抗体;1mg/kg体重)(GIP+抗GIP抗体投与群)を毎朝(AM9:00~10:00)腹腔内投与した。投与期間は28日間とし、経時的(3~4日間隔)に投与1~2時間後にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
マウス(8週齢)に生理食塩水(対照群)、GIP溶液(5nmol/kg体重)(GIP投与群)、又はGIP結合型抗GIP抗体溶液(GIP;5nmol/kg体重,抗GIP抗体;1mg/kg体重)(GIP+抗GIP抗体投与群)を毎朝(AM9:00~10:00)腹腔内投与した。投与期間は28日間とし、経時的(3~4日間隔)に投与1~2時間後にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(4)体温(直腸温)測定
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
(5)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(6)結果
対照群と比較して、GIP投与群で慢性的な体温低下を示し、GIP+抗GIP抗体投与群で体温低下の抑制が認められた(図3)。
対照群と比較して、GIP投与群で慢性的な体温低下を示し、GIP+抗GIP抗体投与群で体温低下の抑制が認められた(図3)。
実施例3 血中GIP量の加齢性変化
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、通常食(D12450K,Research Diets,Inc)、又は高脂肪食(D12451,Research Diets,Inc)で95週間飼育した。
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、通常食(D12450K,Research Diets,Inc)、又は高脂肪食(D12451,Research Diets,Inc)で95週間飼育した。
(2)採血
各週齢(5,10,15,20,30,40,50,65,80,100週齢)のマウスに対して、イソフルラン麻酔下にて腹部大静脈より全血を採取した。
各週齢(5,10,15,20,30,40,50,65,80,100週齢)のマウスに対して、イソフルラン麻酔下にて腹部大静脈より全血を採取した。
(3)血中GIP量の測定
血中GIPの濃度は、採取した血液を遠心分離により血漿画分を調製後、GIP ELISAキット(Millipore社製)を用いて定法に従い、トータルGIPを測定した。
血中GIPの濃度は、採取した血液を遠心分離により血漿画分を調製後、GIP ELISAキット(Millipore社製)を用いて定法に従い、トータルGIPを測定した。
(4)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(5)結果
加齢に伴って血中GIP濃度の上昇が観察され、特に高脂肪食摂取群では通常食群と比較して、有意な血中GIP量の上昇が認められた(図4)。トータルGIPと活性型GIP量は連動して変化することが知られているため(国際公開2012-121302号)、活性型GIP量も上昇していると考えられる。
加齢に伴って血中GIP濃度の上昇が観察され、特に高脂肪食摂取群では通常食群と比較して、有意な血中GIP量の上昇が認められた(図4)。トータルGIPと活性型GIP量は連動して変化することが知られているため(国際公開2012-121302号)、活性型GIP量も上昇していると考えられる。
実施例4 深部体温の加齢性変化
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、通常食(D12450K,Research Diets,Inc)、又は高脂肪食(D12451,Research Diets,Inc)で95週間飼育した。5週齢より毎週、マウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。投与期間は8週間とし、経時的(2~4週間隔)にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、通常食(D12450K,Research Diets,Inc)、又は高脂肪食(D12451,Research Diets,Inc)で95週間飼育した。5週齢より毎週、マウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。投与期間は8週間とし、経時的(2~4週間隔)にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(2)体温(直腸温)測定
5週齢より毎週、マウス直腸へプローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)を挿入し、体温(直腸温)を計測した。直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブの先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
5週齢より毎週、マウス直腸へプローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)を挿入し、体温(直腸温)を計測した。直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブの先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
(3)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(4)結果
加齢に伴って体温の低下が観察され、特に高脂肪食摂取群では通常食群と比較して、急速な体温低下が認められた(図5)。
加齢に伴って体温の低下が観察され、特に高脂肪食摂取群では通常食群と比較して、急速な体温低下が認められた(図5)。
実施例5 老齢マウスに対する抗GIP抗体の体温低下抑制作用
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌(D12450K,Research Diets,Inc)、自由飲水下で111週間飼育した。
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を4週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌(D12450K,Research Diets,Inc)、自由飲水下で111週間飼育した。
(2)抗GIP抗体溶液の作製
生理食塩水に製造例1で作製した抗活性型GIP抗体を0.05mg/mLの濃度で溶解し、抗GIP抗体溶液とした。
生理食塩水に製造例1で作製した抗活性型GIP抗体を0.05mg/mLの濃度で溶解し、抗GIP抗体溶液とした。
(3)投与量および投与方法
C57BL/6Jマウス(107週齢)に生理食塩水(対照群)又は抗GIP抗体溶液(0.5mg/kg体重)(抗GIP抗体投与群)を1週間に1回(AM9:00~10:00)腹腔内投与した。投与期間は8週間とし、経時的(2~4週間隔)にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
C57BL/6Jマウス(107週齢)に生理食塩水(対照群)又は抗GIP抗体溶液(0.5mg/kg体重)(抗GIP抗体投与群)を1週間に1回(AM9:00~10:00)腹腔内投与した。投与期間は8週間とし、経時的(2~4週間隔)にマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(4)体温(直腸温)測定
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
(5)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には2-way ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(6)結果
対照群および非投与群と比較して、抗GIP抗体投与群では体温が有意に高く、加齢に伴った体温低下の抑制が認められた(図6)。
対照群および非投与群と比較して、抗GIP抗体投与群では体温が有意に高く、加齢に伴った体温低下の抑制が認められた(図6)。
実施例6 高脂肪食継続摂取マウスに対するGIP受容体拮抗剤およびGIP分泌又は上昇抑制剤の体温低下抑制作用
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を7週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、各群体重が同等になるように群分けし、5%の脂質を含む通常食(通常食群)、30%の脂質(トリアシルグリセロール)を含む高脂肪食(高脂肪食群)、0.4%の4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド(4H2BH、Ling et al., J. Med. Chem. 44: 3141-9, 2001に記載の方法によって製造)を含む高脂肪食(4H2BH群)、又は30%のトリアシルグリセロールをジアシルグリセロール(特開2006-342084号公報)に置き換えた高脂肪食(DAG置換群)をそれぞれ26週間(34週齢)給餌した。食餌組成を下記表1に示す。飼育期間中、体重は週1回、摂食量は週2回測定した。なお、飼育期間中は自由摂食、自由摂水とした。34週齢でマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(1)動物および飼育方法
C57BL/6J雄性マウス(日本クレア(株))を7週齢で搬入後(室温23℃,湿度55±10%,明期;7:00~19:00)、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はCE-2(日本クレア(株))で1週間馴化を行った後、各群体重が同等になるように群分けし、5%の脂質を含む通常食(通常食群)、30%の脂質(トリアシルグリセロール)を含む高脂肪食(高脂肪食群)、0.4%の4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド(4H2BH、Ling et al., J. Med. Chem. 44: 3141-9, 2001に記載の方法によって製造)を含む高脂肪食(4H2BH群)、又は30%のトリアシルグリセロールをジアシルグリセロール(特開2006-342084号公報)に置き換えた高脂肪食(DAG置換群)をそれぞれ26週間(34週齢)給餌した。食餌組成を下記表1に示す。飼育期間中、体重は週1回、摂食量は週2回測定した。なお、飼育期間中は自由摂食、自由摂水とした。34週齢でマウス直腸へプローブを挿入し、体温(直腸温)を計測した。
(2)体温(直腸温)測定
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
直腸温測定はデジタル直腸温度計(NS-TC10,Neuroscience社製)を用いた。実験動物ハンドブック(養賢堂、1983年発行)に従い、無麻酔下でマウスを保定後、プローブ(RET-3(19×0.7mmシャフト径),Physitemp社製)の先端をマウス直腸に0.5~1cm挿入し,15~30秒間計測した。
(3)統計解析
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には1-way ANOVA followed by Dunnett’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
解析結果は平均値(Ave.)±標準誤差(SE)で示した。統計解析には1-way ANOVA followed by Dunnett’s post hoc検定を用い、P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。
(4)結果
通常食群と比較して、高脂肪食を継続摂取した群(対照群)では体温の有意な低下が認められたが、GIP受容体拮抗剤(4H2BH)、又はトリアシルグリセロールをジアシルグリセロールに置き換えた高脂肪食(DAG置換群)を摂取した群においては、高脂肪食摂取による体温低下が抑制された(図7)。
通常食群と比較して、高脂肪食を継続摂取した群(対照群)では体温の有意な低下が認められたが、GIP受容体拮抗剤(4H2BH)、又はトリアシルグリセロールをジアシルグリセロールに置き換えた高脂肪食(DAG置換群)を摂取した群においては、高脂肪食摂取による体温低下が抑制された(図7)。
Claims (25)
- GIP機能阻害剤を有効成分とする低体温予防又は改善剤。
- GIP機能阻害剤が、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である請求項1記載の低体温予防又は改善剤。
- 抗GIP抗体が、抗活性型GIP抗体である請求項2記載の低体温予防又は改善剤。
- GIP受容体拮抗剤が、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、又は3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸〔1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)-インドール-4-イル〕メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである請求項2記載の低体温予防又は改善剤。
- GIP分泌又は上昇抑制剤が、3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項2記載の低体温予防又は改善剤。
- 低体温予防又は改善剤を製造するための、GIP機能阻害剤の使用。
- GIP機能阻害剤が、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である請求項6記載の使用。
- 抗GIP抗体が、抗活性型GIP抗体である請求項7記載の使用。
- GIP受容体拮抗剤が、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、又は3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸〔1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)-インドール-4-イル〕メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである請求項7記載の使用。
- GIP分泌又は上昇抑制剤が、3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項7記載の使用。
- 低体温の予防又は改善に使用するためのGIP機能阻害剤。
- GIP機能阻害剤が、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である請求項11記載のGIP機能阻害剤。
- 抗GIP抗体が、抗活性型GIP抗体である請求項12記載のGIP機能阻害剤。
- GIP受容体拮抗剤が、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、又は3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸〔1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)-インドール-4-イル〕メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである請求項12記載のGIP機能阻害剤。
- GIP分泌又は上昇抑制剤が、3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項12記載のGIP機能阻害剤。
- 低体温予防又は改善のためのGIP機能阻害剤の使用。
- GIP機能阻害剤が、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である請求項16記載の使用。
- 抗GIP抗体が、抗活性型GIP抗体である請求項17記載の使用。
- GIP受容体拮抗剤が、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、又は3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸〔1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)-インドール-4-イル〕メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである請求項17記載の使用。
- GIP分泌又は上昇抑制剤が、3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項17記載の使用。
- GIP機能阻害剤を対象に投与することを含む、低体温の予防又は改善方法。
- GIP機能阻害剤が、抗GIP抗体、GIP受容体拮抗剤又はGIP分泌又は上昇抑制剤である請求項21記載の方法。
- 抗GIP抗体が、抗活性型GIP抗体である請求項22記載の方法。
- GIP受容体拮抗剤が、4-ヒドロキシ安息香酸(2-ブロモベンジリデン)ヒドラジド、又は3-シアノ-4-ヒドロキシ安息香酸〔1-(2,3,5,6-テトラメチルベンジル)-インドール-4-イル〕メチリデンヒドラジド、3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(4-メトキシナフタレン-1-イル)メチリデンヒドラジド、又は3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸[1-(5-クロロチオフェン-2-イルメチル)-1H-インドール-5-イル]メチリデンヒドラジドである請求項22記載の方法。
- GIP分泌抑又は上昇制剤が、3-ブロモ-5-メチル-2-フェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-7-オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数20以上の超長鎖脂肪酸、構成脂肪酸の1質量%以上がドコサヘキサエン酸であり、1質量%以上がエイコサペンタエン酸であるトリアシルグリセロール、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、カテキン類、構成脂肪酸の10質量%以上がα-リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の2位にC14~C18飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項22記載の方法。
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