WO2015101293A1 - 激酶抑制剂及其用途 - Google Patents

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吴永谦
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Definitions

  • the invention belongs to the field of medical technology.
  • the present invention relates to a CDK4/6 kinase inhibitor, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, comprising the CDK4/6 kinase inhibitor, which is pharmaceutically acceptable Pharmaceutical preparations, pharmaceutical compositions and kits of the salts, esters thereof, solvates thereof or stereoisomers thereof, and the CDK4/6 kinase inhibitor, pharmaceutically acceptable salts thereof, esters thereof, and solvents thereof Use of the compounds or their stereoisomers.
  • the compounds of the invention are useful for reducing or inhibiting the activity of CDK4/6 kinase in a cell, and/or treating and/or preventing a cancer-associated disease mediated by CDK4/6 kinase.
  • tumor is a kind of cell cycle disease (CCD), and regulating or blocking the cell cycle is one of the ways to treat tumors.
  • CCD cell cycle disease
  • CDKs Cyclin-Dependent-Kinases
  • CDKs-centered cell cycle regulatory networks abnormalities in any link will cause cell cycle abnormalities, and ultimately lead to tumors.
  • the CDK family currently has 21 subtypes that function by binding to its regulatory subunit cyclins (cyclins).
  • cyclins regulatory subunit cyclins
  • the function of various subtypes of CDK in addition to acting on the cell cycle, also includes regulation of transcription, DNA repair, differentiation, and programmed cell death.
  • the CDKs kinase family Based on the key role of CDKs in regulating tumor cell proliferation and death, the CDKs kinase family provides opportunities and new fields for the discovery and development of anti-tumor drugs.
  • the first-generation CDK inhibitors represented by flavopiridol, UCN-01, etc. are "pan-CDK” inhibitors, which block all subtypes of the CDK family in an equivalent manner and show up in clinical trials. Higher toxicity and some inability to achieve effective therapeutic doses have spurred the development of selective CDK inhibitors, which are expected to increase the selectivity of treatment and prevent normal cells from being damaged by some side effects.
  • CDK4/6 plays an irreplaceable role in the CDK subtype involved in the cell cycle.
  • the cell cycle mutations associated with cancer are mainly present in the G1 and G1/S phase transformations.
  • the complex formed by CDK4/6 and CyclinD phosphorylates the tumor suppressor gene Rb product pRb, releasing the bound transcription factor E2F, and initiates The transcription of the gene involved in the S phase causes the cells to pass through the checkpoint and transfer from the G1 phase to the S phase.
  • About 80% of human tumors have cyclinD-CDK4/6-INK4-Rb Abnormality of the pathway. The change of this pathway accelerates the G1 phase process, which accelerates the proliferation of tumor cells and gains a survival advantage.
  • CDK4/6 has become a new anti-tumor target.
  • the advantages of CDK4/6 as an anti-tumor target are: (1) Most proliferating cells rely on CDK2 or CDK4/6 proliferation, but CDK4/6 inhibitors do not exhibit cytotoxicity of "pan-CDK inhibitors", such as Myelosuppression and intestinal reactions. (2) Preclinical experiments show that if the level of cyclin D is increased or P16INK4a is inactivated, the sensitivity of the cells to drugs can be increased. Since the tumor cells have the above phenomenon relative to normal cells, the drug targeting is increased to some extent. Sex.
  • CDK inhibitors So far, no CDK inhibitors have been marketed, and some pharmaceutical companies, including Pfizer, Eli Lilly and Novartis, have reported a series of well-selected CDK4/6 inhibitors, which are in clinical trials.
  • Pfizer palbociclib
  • LY2835219 Phase III
  • LEE-011 Phase III
  • the present invention provides a novel structure of a selective CDK4/6 inhibitor, and finds that the compound of such structure has good pharmacological effects and can effectively pass the blood-brain barrier, providing a CDK inhibitor as a treatment for brain cancer. possibility.
  • One aspect of the invention provides an inhibitor/compound that targets CDK4/6 kinase.
  • an exemplary technical solution of the present invention is as follows:
  • a 1 and A 2 are each independently selected from nitrogen;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or a 3-8 membered cycloalkyl optionally substituted by Q 1 , and Q 1 is selected from C 1-6 alkyl or C 1-6 alkane Oxylate
  • R 2 is selected from C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, cyano, carbamoyl or C 1-6 alkylcarbonylamino;
  • R 3 and R 5 are each independently selected from halogen or hydrogen, and at least one of R 3 and R 5 is halogen;
  • R 4 is selected from a 3-8 membered heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , a 6-14 membered fused heterocyclic group, a 5-8 membered heteroaryl group, a 6-14 membered heteroaryl group, a phenyl group, a naphthyl group. a 6-12 membered bridged heterocyclic group or a 6-12 membered spiroheterocyclic group;
  • Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, cyano, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylsulfonyl, C 1-6 alkylsulfonylamino, di C 1-6 An alkylamino group, or a C 1-6 alkyl group optionally substituted by a substituent, a 3-8 membered cycloalkyl group, a 3-8 membered heterocyclic group or a 6-9 membered bridged heterocyclic group, said substituent being selected from the group consisting of Amino, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylamino, di C 1-6 alkylamino, C 1-6 An alkylsulfonyl group, a 3-8 membered heterocyclic group or a 3-8 membered cycloalkyl group;
  • n is selected from 0, 1, 2, 3, 4 or 5.
  • a 1 and A 2 are each independently selected from nitrogen;
  • R 1 is selected from C 1-4 alkyl or C 1-4 alkoxy
  • R 2 is selected from C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, cyano, carbamoyl or C 1-4 alkylcarbonylamino;
  • R 3 and R 5 are each independently selected from halogen
  • R 4 is selected from a 5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group optionally substituted by Q 2 ;
  • the "5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group” is preferably a "6-membered nitrogen-containing heterocyclic group"
  • Q 2 is selected from amino, hydroxy, halo, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkoxy, di-C 1-4 alkylamino, or optionally substituted C 1-4 alkyl group substituted by, a 3-6 membered cycloalkyl group or a 3-6 membered heterocyclic group selected from the group consisting of amino, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, C 1 a -4 alkylamino group, a di C 1-4 alkylamino group or a 3-6 membered cycloalkyl group;
  • n is selected from 0.
  • a compound according to claim 2 a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, the compound being selected from the group consisting of:
  • a 1 and A 2 are each independently selected from nitrogen;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or a 3-8 membered cycloalkyl optionally substituted by Q 1 wherein Q 1 is selected from C 1-6 alkyl or C 1-6 Alkoxy group;
  • R 2 is selected from C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, cyano, carbamoyl or C 1-6 alkylcarbonylamino;
  • R 3 and R 5 are each independently selected from halogen or hydrogen, and at least one of R 3 and R 5 is halogen;
  • R 4 is selected from a 3-8 membered heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , a 6-14 membered fused heterocyclic group, a 5-8 membered heteroaryl group, a 6-14 membered heteroaryl group, a phenyl group, a naphthyl group. a 6-12 membered bridged heterocyclic group or a 6-12 membered spiroheterocyclyl group, wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, halogen, trifluoromethyl, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkane An oxy group, a 3-8 membered heterocyclic group or a 6-9 membered bridged heterocyclic group.
  • a 1 and A 2 are each selected from nitrogen;
  • R 1 is selected from C 1-4 alkyl or C 1-4 alkoxy
  • R 2 is selected from C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, cyano, carbamoyl or C 1-4 alkylcarbonylamino;
  • R 3 and R 5 are each independently selected from halogen
  • R 4 is selected from a 5-7 membered heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , a 6-11 membered fused heterocyclic group, a 6-11 membered bridged heterocyclic group or a 6-11 membered spiroheterocyclyl group, wherein Q 2 is selected From amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, 5-6 membered heterocyclyl or 7-9 membered bridged heterocyclyl.
  • a 1 and A 2 are each selected from nitrogen;
  • R 1 is an isopropyl group
  • R 2 is selected from the group consisting of methyl, methoxy, cyano, carbamoyl or acetylamino;
  • R 3 and R 5 are each fluorine
  • R 4 is selected from a 5-6 membered heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy a 6-membered heterocyclic group or an 8-membered bridged heterocyclic group.
  • R 2 is a methyl group
  • R 4 is selected from a 5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , and the 5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group is bonded to the methylene group in the formula (I) via a nitrogen atom, wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy or 8-membered nitrogen-containing bridged heterocyclic;
  • the 5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group is preferably a 5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group having 1 to 2 nitrogen atoms.
  • R 4 is selected from the group consisting of optionally substituted by Q 2 Wherein Q 2 is selected from a C 1-4 alkyl group or an 8-membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group.
  • a 1 and A 2 are each selected from nitrogen;
  • R 1 is an isopropyl group
  • R 2 is selected from the group consisting of methyl, methoxy, cyano, carbamoyl or acetylamino;
  • R 3 and R 5 are each fluorine
  • R 4 is selected from 7-9 membered bridged heterocyclyl optionally substituted by Q 2 , wherein Q 2 is selected from amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, 6-membered heterocyclyl or 8-membered bridge heterocyclic group.
  • R 2 is a methyl group
  • R 4 is selected from a 7-9 membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group optionally substituted by Q 2 , which is bonded to the methylene group in the formula (I) through a nitrogen atom, Wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic;
  • the 7-9 membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group is preferably a 7-9 membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group having 1 to 2 nitrogen atoms.
  • R 4 is selected from the group consisting of optionally substituted by Q 2 Wherein Q 2 is selected from a C 1-4 alkyl group or a 6-membered nitrogen-containing heterocyclic group.
  • a 1 and A 2 are each independently selected from nitrogen;
  • R 1 is an isopropyl group
  • R 2 is selected from the group consisting of methyl, methoxy, cyano, carbamoyl or acetylamino;
  • R 3 and R 5 are each fluorine
  • R 4 is selected from 6-10 membered fused heterocyclyl optionally substituted by Q 2 , wherein Q 2 is selected from amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, 6-membered heterocyclyl or 8-membered bridge heterocyclic group.
  • R 2 is a methyl group
  • R 4 is selected from a 6-10 membered nitrogen-containing fused heterocyclic group containing 1, 2 or 3 identical or different heteroatoms optionally substituted by Q 2 , preferably selected from a nitrogen atom and an oxygen atom, and containing At least one nitrogen atom, the 6-10 membered fused heterocyclic group is bonded to the methylene group of the formula (I) via a nitrogen atom, wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano or C 1 -4 alkyl.
  • R 4 is selected from the group consisting of optionally substituted by Q 2 Wherein Q 2 is selected from amino or C 1-4 alkyl.
  • a 1 and A 2 are each independently selected from nitrogen;
  • R 1 is an isopropyl group
  • R 2 is selected from the group consisting of methyl, methoxy, cyano, carbamoyl or acetylamino;
  • R 3 and R 5 are each fluorine
  • R 4 is selected from 7-11 membered spiroheterocyclyl optionally substituted by Q 2 , wherein Q 2 is selected from amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano, C 1-4 alkyl, 6-membered heterocyclic or 8-membered bridge heterocyclic group.
  • R 2 is selected from a methyl group
  • R 4 is selected from a 7-11 membered nitrogen-containing spiroheterocyclyl optionally substituted by Q 2 , which is bonded to the methylene group of formula (I) via a nitrogen atom, Wherein Q 2 is selected from the group consisting of amino, hydroxy, trifluoromethyl, cyano or C 1-4 alkyl;
  • the 7-11 membered nitrogen-containing spiroheterocyclyl group is preferably a 7-11 membered nitrogen-containing spiroheterocyclyl group having 1 to 2 nitrogen atoms.
  • R 4 is selected from the group consisting of optionally substituted by Q 2 Wherein Q 2 is selected from C 1-4 alkyl.
  • the compound according to item 1 a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, which is selected from the compounds shown in Table A.
  • the invention also relates to various uses of the disclosed compounds. Accordingly, the present invention also relates to the following exemplary technical solutions:
  • a pharmaceutical composition comprising the compound according to any one of aspects 1 to 18, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, and optionally a One or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • composition of embodiment 19 further comprising one or more additional anti-neoplastic agents and/or immunosuppressive agents.
  • the additional anti-tumor agent and/or immunosuppressive agent is selected from one or more of the following: methotrexate, capecitabine, gemcitabine, Deoxyfluorouridine, pemetrexed disodium, pazopanib, imatinib, erlotinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, Herceptin, bevacizum Anti-rituximab, trastuzumab, paclitaxel, vinorelbine, docetaxel, doxorubicin, hydroxycamptothecin, mitomycin, epirubicin, pirarubicin, Bleomycin, letrozole, tamoxifen, fulvestrant, triclinin, flutamide, leuprolide, anastrozole, ifosfamide, busulfan, cyclophosphamide, card Mustastine, nitustine, semustine, nitrogen mustard,
  • the cancer-related disease is selected from the group consisting of a brain tumor, a lung cancer, a squamous cell carcinoma, a bladder cancer, a stomach cancer, an ovarian cancer, a peritoneal cancer, a pancreatic cancer, a breast cancer, a head and a neck cancer, and a child.
  • Cervical cancer endometrial cancer, rectal cancer, liver cancer, kidney cancer, esophageal adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, prostate cancer, female genital tract cancer, carcinoma in situ, lymphoma, neurofibromatosis, thyroid cancer, bone cancer , skin cancer, brain cancer, colon cancer, testicular cancer, gastrointestinal stromal tumor, prostate tumor, mast cell tumor, multiple myeloma, melanoma, glioma or sarcoma.
  • claim 22 or 23 wherein the subject is a mammal, such as a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent , primates; wherein, a particularly preferred subject is a human.
  • a mammal such as a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent , primates; wherein, a particularly preferred subject is a human.
  • the medicament further comprises one or more additional anti-neoplastic agents and/or immunosuppressive agents; preferably, the additional anti-tumor agent and/or Or the immunosuppressive agent is selected from one or more of the following: methotrexate, capecitabine, gemcitabine, deoxyfluorouridine, pemetrexed disodium, pazopanib, imatinib , erlotinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, herceptin, bevacizumab, rituximab, trastuzumab, paclitaxel, vinorelbine, dosi Hesai, doxorubicin, hydroxycamptothecin, mitomycin, epirubicin, pirarubicin, bo Levomycin, letrozole, tamoxifen, fulvestrant, triclinin, flutamide, leuprolide, anastrozole,
  • a method of treating and/or preventing a cancer-associated disease mediated by a CDK4/6 kinase comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of a compound of any one of the methods 1 to 18, which is pharmaceutically acceptable A salt, an ester thereof, a solvate thereof, or a stereoisomer thereof, or a pharmaceutical composition according to any one of the schemes 19-21, is administered to a subject in need thereof.
  • the cancer-related disease is selected from the group consisting of a brain tumor, a lung cancer, a squamous cell carcinoma, a bladder cancer, a stomach cancer, an ovarian cancer, a peritoneal cancer, a pancreatic cancer, a breast cancer, a head and a neck cancer, and a child.
  • Cervical cancer endometrial cancer, rectal cancer, liver cancer, kidney cancer, esophageal adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, prostate cancer, female genital tract cancer, carcinoma in situ, lymphoma, neurofibromatosis, thyroid cancer, bone cancer , skin cancer, brain cancer, colon cancer, testicular cancer, gastrointestinal stromal tumor, prostate tumor, mast cell tumor, multiple myeloma, melanoma, glioma or sarcoma.
  • the subject is a mammal, such as a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent , primates; wherein, a particularly preferred subject is a human.
  • the compound according to claim 30, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, wherein the cancer-related disease is selected from the group consisting of brain tumor, lung cancer, squamous cell carcinoma , bladder cancer, stomach cancer, ovarian cancer, Peritoneal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, endometrial cancer, rectal cancer, liver cancer, kidney cancer, esophageal adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, prostate cancer, female genital cancer, carcinoma in situ , lymphoma, neurofibromatosis, thyroid cancer, bone cancer, skin cancer, brain cancer, colon cancer, testicular cancer, gastrointestinal stromal tumor, prostate tumor, mast cell tumor, multiple myeloma, melanoma, colloid Tumor or sarcoma.
  • the cancer-related disease is selected from the group consisting of brain tumor, lung cancer, squamous cell
  • the formulation is for administration in vivo or in vitro; for example, the formulation is administered to a subject (eg, a mammal; eg, a bovine, an equine, an estro, a porcine, canine, feline, rodent, primate; for example, a human, to reduce or inhibit CDK4 and/or CDK6 kinase activity in a cell in a subject; or The formulation is administered to an in vitro cell (eg, a cell line or a cell from a subject, such as a cancer cell) to reduce or inhibit CDK4 and/or CDK6 kinase activity in cells in vitro.
  • a subject eg, a mammal; eg, a bovine, an equine, an estro, a porcine
  • canine feline, rodent, primate
  • a human for example, a human
  • the formulation is administered to an in vitro cell (eg, a cell line or a cell from
  • the cell is selected from the group consisting of a brain tumor cell, a lung cancer cell, a squamous cell carcinoma cell, a bladder cancer cell, a gastric cancer cell, an ovarian cancer cell, a peritoneal cancer cell, and a pancreatic cancer cell.
  • a method of reducing or inhibiting CDK4 and/or CDK6 kinase activity in a cell which comprises administering to said cell an effective amount of a compound according to any one of aspects 1 to 18, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof , their solvates or their stereoisomers.
  • the cell is a subject (eg, a mammal; eg, a bovine, equine, ovine, porcine, canine family) a cell in the body of an animal, a feline, a rodent, a primate; for example, a human; or the method is used in vitro, for example, the cell is a cell in vitro (eg, a cell line or a subject) Cells such as cancer cells).
  • a subject eg, a mammal; eg, a bovine, equine, ovine, porcine, canine family
  • a cell in the body of an animal eg, a feline, a rodent, a primate; for example, a human
  • the method is used in vitro, for example, the cell is a cell in vitro (eg, a cell line or a subject) Cells such as cancer cells).
  • the cell is selected from the group consisting of a brain tumor cell, a lung cancer cell, a squamous cell carcinoma cell, a bladder cancer cell, a gastric cancer cell, an ovarian cancer cell, a peritoneal cancer cell, and a pancreatic cancer cell.
  • the compound of claim 40 a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, for administration in vivo or in vitro; for example, the preparation is administered to a subject (for example, a mammal; for example, a bovine, an equine, a sheep, a porcine, a canine, a feline, a rodent, a primate; for example, a human, to reduce or inhibit a test.
  • a mammal for example, a bovine, an equine, a sheep, a porcine, a canine, a feline, a rodent, a primate; for example, a human, to reduce or inhibit a test.
  • CDK4 and/or CDK6 kinase activity in cells in vivo alternatively, the formulation is administered to cells in vitro (eg, cell lines or cells from a subject, such as cancer cells) to reduce or inhibit CDK4 and/or cells in vitro Or CDK6 kinase activity.
  • cells in vitro eg, cell lines or cells from a subject, such as cancer cells
  • the compound of claim 40 or 41 a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, wherein the cell is selected from the group consisting of a brain tumor cell, a lung cancer cell, and a squamous epithelium.
  • Cell cancer cells bladder cancer cells, gastric cancer cells, ovarian cancer cells, peritoneal cancer cells, pancreatic cancer cells, breast cancer cells, head and neck cancer cells, cervical cancer cells, endometrial cancer cells, rectal cancer cells, liver cancer cells, kidney Cancer cells, esophageal adenocarcinoma cells, esophageal squamous cell carcinoma cells, prostate cancer cells, female genital tract cancer cells, carcinoma cells in situ, lymphoma cells, neurofibromatosis cells, thyroid cancer cells, bone cancer cells, skin cancer cells , brain cancer cells, colon cancer cells, testicular cancer cells, gastrointestinal stromal tumors Cells, prostate tumor cells, mast cell tumor cells, multiple myeloma cells, melanoma cells, glioma cells or sarcoma cells.
  • kits for reducing or inhibiting CDK4 and/or CDK6 kinase activity in a cell comprising the compound of any one of claims 1 to 18, a pharmaceutically acceptable salt thereof, The esters, solvates thereof or stereoisomers thereof, and optionally also include instructions for use.
  • the "Me” is a methyl group.
  • the wavy line in the substituent The meaning is that the group of the substituent at the position of the wavy line is linked to the group of the main chain (for example, a benzene ring) by a chemical bond.
  • halogen atom as used in the present invention includes, for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • C 1-6 alkyl group described in the present invention may be linear or branched, and includes, for example, "C 1-4 alkyl group", “C 1-3 alkyl group” and the like, and specific examples thereof include, but are not limited to, : methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, 2-methylpropyl, 1-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, n-pentyl, 3-methyl Butyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1 -methylpentyl, 3,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3- Dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl
  • C 1-6 alkoxy group, C 1-6 alkylcarbonylamino group, C 1-6 alkylsulfonyl group, C 1-6 alkylsulfonylamino group, C 1-6 alkylamino group, "Di-C 1-6 alkylamino" means C 1-6 alkyl-O-, C 1-6 alkyl-C(O)NH-, C 1-6 alkyl-SO 2 -, C 1- a group formed by 6 alkyl-SO 2 NH-, C 1-6 alkyl-NH-, (C 1-6 alkyl) 2 -N-, wherein "C 1-6 alkyl" is as defined above Said.
  • DiC 1-4 alkylamino means C 1-4 alkyl-O-, C 1-4 alkyl-C(O)NH-, C 1-4 alkyl-SO 2 -, C 1- a group formed by a 4- alkyl-SO 2 NH-, C 1-4 alkyl-NH-, (C 1-4 alkyl) 2 -N-form wherein "C 1-4 alkyl” is as defined above Said.
  • the "3-8 membered cycloalkyl group" as used in the present invention means that the alkane moiety of 3 to 8 carbon atoms is removed by a hydrogen atom-derived cyclic alkyl group, and includes, for example, "3-6 membered cycloalkyl group", 4-6 membered cycloalkyl” and the like. Examples thereof include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutane, cyclopentyl, cyclohexane, cycloheptyl, cyclooctyl, and the like.
  • the “3-8 membered heterocyclic group” as used in the present invention includes, for example, “3-7 membered heterocyclic group", "3-6 membered heterocyclic group”, “4-7 membered heterocyclic group”, “4- 6-membered heterocyclic group”, "5-7 membered heterocyclic group”, “5-6 membered heterocyclic group”, “5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group”, “6-membered heterocyclic group”, “6-membered member” Nitrogen-containing heterocyclic group" and the like.
  • Specific examples include, but are not limited to, aziridine, 2H-azepine, diaziryl, 3H-diazapropenyl, azetidinyl, 1,4-dioxo Heterocyclohexane, 1,3-dioxanyl, 1,3-dioxolyl, 1,4-dioxadienyl, tetrahydrofuranyl, dihydropyrrolyl , pyrrolidinyl, imidazolidinyl, 4,5-dihydroimidazolyl, pyrazolidinyl, 4,5-dihydropyrazolyl, 2,5-dihydrothienyl, tetrahydrothiophenyl, 4,5 -dihydrothiazolyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, hexahydropyrimidinyl, hexahydropyridazinyl, 4,5-dihydr
  • the term "linked to a methylene group in the formula (I) by a nitrogen atom” as used in the present invention means a nitrogen-containing group (for example, a nitrogen-containing heterocyclic group such as a "5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group” or "6-membered nitrogen-containing heterocyclic group”; nitrogen-containing fused heterocyclic group such as “6-10 membered nitrogen-containing fused heterocyclic group”; nitrogen-containing bridged heterocyclic group such as "7-9 membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group” Or “8-membered nitrogen-containing bridged heterocyclic group”; a nitrogen-containing spiroheterocyclyl group such as "7-11 membered nitrogen-containing spiroheterocyclyl" is bonded to a methylene group through a nitrogen atom.
  • a nitrogen-containing heterocyclic group such as a "5-6 membered nitrogen-containing heterocyclic group” or "6-membered nitrogen-containing heterocyclic group
  • the fused ring of the present invention refers to a fused ring structure formed by two or more cyclic structures sharing two adjacent atoms (ie, sharing one bond).
  • the bridge ring of the present invention refers to a bridge ring structure formed by two or more ring structures sharing two non-adjacent carbon atoms with each other.
  • the spiro ring according to the present invention refers to a spiro ring structure in which two or more ring structures are connected to each other by a carbon atom.
  • the "6-14 membered fused heterocyclic group" as used in the present invention means that two or more cyclic structures share two adjacent atoms (ie, share a bond) to form at least one hetero atom.
  • a fused ring structure of 6 to 14 ring atoms including, for example, "6-11 membered fused heterocyclic group", “6-10 membered fused heterocyclic group”, “7-10 membered fused heterocyclic group”, “9- A 10-membered fused heterocyclic group, a "6-10 membered nitrogen-containing fused heterocyclic group", and the like.
  • the "5-8 membered heteroaryl group” as used in the present invention includes, for example, "5-7 membered heteroaryl group", "5-6 membered heteroaryl group” and the like. Specific examples include, but are not limited to, furyl, thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, 1, 2,3-Triazolyl, 1,2,4-triazolyl, 1,2,3-oxadiazolyl, 1,2,4-oxadiazolyl, 1,2,5-oxadiazolyl 1,3,4-oxadiazolyl, pyridyl, 2-pyridone, 4-pyridone, pyrimidinyl, 1,4-dioxadienyl, 2H-1,2-oxazinyl 4H-1,2-oxazinyl, 6H-1,2-
  • 6-14 membered fused heteroaryl group as used in the present invention means that two or more cyclic structures share two adjacent atoms (ie, share one bond) to form at least one hetero atom.
  • 6-14 ring atomic, aromatic fused ring structures including, for example, "6-10 membered heteroaryl", “7-10 membered heteroaryl”, “9-10 membered heteroaryl” "Wait.
  • Specific examples include, but are not limited to, benzofuranyl, benzoisofuranyl, benzothienyl, fluorenyl, isoindole, benzoxazolyl, benzimidazolyl, oxazolyl, benzotriazole , quinolyl, 2-quinolinone, 4-quinolinone, 1-isoquinolinone, isoquinolyl, acridinyl, phenanthryl, benzoxazinyl, pyridazinyl, quinazoline A phenyl group, a quinoxalinyl group, a phenol sulfinyl group, an acridinyl group, a fluorenyl group, a naphthyridinyl group, a phenazine, a phenothiazine, and the like.
  • the "6-12-membered bridged heterocyclic group" as used in the present invention means a bridged ring structure of 6 to 12 ring atoms having at least one hetero atom formed by sharing two non-adjacent atoms in any two rings.
  • the hetero atom is selected from the group consisting of N, S, O, CO, SO, and/or SO 2 and the like.
  • the "6-12 member spiroheterocyclyl group" as used in the present invention means a spiro ring structure of 6 to 12 ring atoms having at least two rings sharing one atom and having at least one hetero atom, said hetero atom. It is selected from N, S, O, CO, SO, and/or SO 2 and the like.
  • the invention also provides a preparation method of the compound of the formula (I'), which comprises, but is not limited to, the following route (wherein the abbreviations represent the following definitions: DCM: dichloromethane; DIPEA: N, N-diisopropyl Ethylethylamine; DMF: N,N-dimethylformamide; DMSO: dimethyl sulfoxide; EA: ethyl acetate; HATU: 2-(7-azobenzotriazole)-N,N, N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate; MeOH: methanol; NBS: N-bromosuccinimide; PE: petroleum ether; THF: tetrahydrofuran; Xant-phos: 4,5 - bisdiphenylphosphino-9,9-dimethyloxaxan; x-phos: 2-dicyclohexylphosphor-2',4',6'-triiso
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , n, A 1 , A 2 are as described above,
  • X represents halogen, is selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine, and iodine; and the halogenating agent is selected from the group consisting of: I 2 , Br 2 .
  • the raw material 1 and the organic base are dissolved in an organic solvent, and the raw material 2 is slowly added dropwise under a low temperature condition. After the stirring reaction is completed, the reaction mixture is extracted, the organic layer is dried, and concentrated to obtain an intermediate 1, wherein the organic solvent is preferably DCM or 1, 4-Dioxane, the organic base is preferably triethylamine.
  • the organic solvent is preferably DCM or 1, 4-Dioxane
  • the organic base is preferably triethylamine.
  • the intermediate 1, the raw material 3 and the organic base are dissolved in an organic solvent, and phosphorus oxychloride is added dropwise. After the reaction is completed, the alkali is added, the pH of the reaction mixture is adjusted to neutral, extracted, and the organic phase is separated and dried.
  • Intermediate 2 wherein the organic solvent is preferably dichloromethane or 1,2-dichloroethane, and the organic base is preferably triethylamine.
  • the intermediate 2 is dissolved in an organic solvent, potassium tert-butoxide is added, and the mixture is heated to 100 ° C for 2 hours. After the reaction is completed, water is quenched, the reaction mixture is extracted, the organic phase is dried, and the residue is purified by column chromatography.
  • Intermediate 3 wherein the organic solvent is preferably DCM.
  • the intermediate 3 and the pinacol borate are dissolved in an organic solvent, and palladium acetate, tricyclohexylphosphoric acid and potassium acetate are added, and the reaction is heated under nitrogen. After the reaction is completed, water and an organic solvent are added for extraction, and the organic layer is dried, concentrated, and subjected to column chromatography to obtain Intermediate 4, wherein the organic solvent is preferably DMF or 1,4-dioxane.
  • the organic solvent is preferably DMF or 1,4-dioxane.
  • the starting material 4 and the intermediate 4 are dissolved in an organic solvent, an inorganic base and tetrakis(triphenylphosphine)palladium are added, and the reaction is completed by heating under nitrogen atmosphere, water is added, the reaction mixture is extracted, the organic phase is dried, and concentrated, and the column layer is applied.
  • the intermediate 5 is isolated, wherein the organic solvent is preferably 1,4 dioxane or DMF.
  • the raw material 5 is dissolved in an organic solvent, and benzoyl peroxide and NBS are added to heat to the end of the reaction, and the filtrate is concentrated. The residue is subjected to column chromatography to give the intermediate 6 wherein the organic solvent is preferably carbon tetrachloride.
  • the intermediate 6 and the starting material 6 are dissolved in an organic solvent, and an inorganic base is added to the reaction at room temperature until the reaction is completed.
  • the mixture is filtered, and the filtrate is concentrated. The residue is purified by column chromatography.
  • the raw material 6 is a primary or secondary amine.
  • the "pharmaceutically acceptable salt" of the compound of the formula (I') or the formula (I) of the present invention means an acidic functional group (for example, -COOH, -OH, which is present in the compound of the formula (I') or the formula (I).
  • a salt formed with a suitable inorganic or organic cation including a salt formed with an alkali metal or an alkaline earth metal, an ammonium salt, and a salt formed with a nitrogen-containing organic base; and formula (I') Or a salt formed by a basic functional group (for example, -NH 2 or the like) present in the compound of the formula (I) with a suitable inorganic or organic anion (acid), and an inorganic acid, and an organic carboxylic acid.
  • the "ester” of the compound of the formula (I') or the formula (I) of the present invention means an ester which is formed by esterification reaction with an alcohol when a compound of the formula (I') or the compound of the formula (I) is present;
  • a compound of the formula (I') or the formula (I) has a hydroxyl group, it is esterified by an esterification reaction with an organic acid, an inorganic acid, an organic acid salt or the like.
  • the ester can be hydrolyzed to form the corresponding acid or alcohol in the presence of an acid or a base.
  • the "solvate” of the compound of the formula (I') or the formula (I) of the present invention means a substance which is formed by association with a solvent molecule.
  • the solvent may be an organic solvent (e.g., methanol, ethanol, propanol, acetonitrile, etc.), water, or the like.
  • a compound of formula (I') or formula (I) of the present invention can form an ethanolate with ethanol and form a hydrate with water.
  • the “stereoisomers” of the compounds of the invention are classified into conformational and conformational isomers, while the configurational isomerism is further divided into cis-trans isomerization and optical isomerism.
  • Conformational isomerism refers to a stereoisomerism in which organic molecules of a certain configuration cause different arrangement of atoms or groups of molecules in space due to the rotation or distortion of carbon and carbon single bonds. Common alkanes and rings are common. The structure of an alkane compound, such as the chair conformation and the ship conformation that appear in the cyclohexane structure.
  • Stepoisomer means that when the compound of the invention contains one or more asymmetric centers, it can be used as a racemate and a racemic mixture, a single enantiomer, a mixture of diastereomers and a single Diastereomers.
  • the compounds of the invention have asymmetric centers, each of which will independently produce two optical isomers, the scope of the invention including all possible optical isomers and mixtures of diastereomers and pure or partially Pure compound. If the compound of the present invention contains an olefinic double bond, the present invention includes a cis isomer and a trans isomer unless otherwise specified.
  • the compounds of the present invention may exist in tautomeric forms which have different hydrogen attachment points by displacement of one or more double bonds.
  • a ketone and its enol form are keto-enol tautomers.
  • Each tautomer and mixtures thereof are included in the compounds of the invention.
  • All enantiomers, diastereomers, racemic isomers, cis and trans isomers, tautomers, geometric isomers, and diasters of the compounds of formula (I') or formula (I) Isomers and mixtures thereof are included within the scope of the invention.
  • the invention further claims to include a compound of formula (I') or formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof, and optionally one or more A pharmaceutical composition of a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Drug group The compound can be formulated into any of the pharmaceutically acceptable dosage forms.
  • the pharmaceutical composition may also be administered to a patient or subject in need of such treatment by any suitable mode of administration, such as oral, parenteral, rectal or pulmonary administration.
  • the pharmaceutical composition can be prepared into a conventional solid preparation such as a tablet, a capsule, a pill, a granule, etc.; or an oral liquid preparation such as an oral solution or an oral suspension. , syrup, and the like.
  • the pharmaceutical composition can be prepared as an injection, including an injection, a sterile powder for injection, and a concentrated solution for injection.
  • the injection can be produced by a conventional method in the prior art, and when the injection is formulated, an additional agent may be added, or a suitable additive may be added depending on the nature of the drug.
  • the pharmaceutical composition can be formulated as a suppository or the like.
  • the pharmaceutical composition can be formulated as an inhalant or a spray.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise one or more than the compound of the formula (I') or the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof.
  • additional anti-tumor agents and / or immunosuppressive agents may further comprise one or more than the compound of the formula (I') or the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof.
  • the antitumor agent and/or immunosuppressive agent including but not limited to methotrexate, capecitabine, gemcitabine, deoxyfluorouridine, pemetrexed disodium, pazopanib, imatin Nie, erlotinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, Herceptin, bevacizumab, rituximab, trastuzumab, paclitaxel, vinorelbine, multiple Citadine, doxorubicin, hydroxycamptothecin, mitomycin, epirubicin, pirarubicin, bleomycin, letrozole, tamoxifen, fulvestrant, tricepsin Lin, flutamide, leuprolide, anastrozole, ifosfamide, busulfan, cyclophosphamide, carmustine, nimustine, semustine, nitrogen mustard, melphalan, tumor Ning, carbo
  • the present invention also provides a compound represented by the formula (I') or the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof or a pharmaceutical composition of the present invention
  • a cancer-associated disease mediated by CDK4/6 kinase in a subject.
  • the cancer-related disease is selected from the group consisting of brain tumor, lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder cancer, gastric cancer, ovarian cancer, peritoneal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer.
  • endometrial cancer rectal cancer, liver cancer, kidney cancer, esophageal adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, prostate cancer, female genital tract cancer, carcinoma in situ, lymphoma, neurofibromatosis, thyroid cancer, bone cancer, skin Cancer, brain cancer, colon cancer, testicular cancer, gastrointestinal stromal tumor, prostate tumor, mast cell tumor, multiple myeloma, melanoma, glioma or sarcoma.
  • the subject or patient may be any animal, preferably a mammal, such as a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, spirit. Long-lived animals. Among them, a particularly preferred subject is a human.
  • the invention also provides a method of treating and/or preventing a cancer-associated disease mediated by CDK4/6 kinase, which comprises treating A therapeutically and/or prophylactically effective amount of a compound of the invention, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof or a pharmaceutical composition of the invention, administered to a subject in need thereof .
  • an effective amount refers to an amount sufficient to achieve, or at least partially achieve, a desired effect.
  • an effective amount to prevent a disease eg, a cancer-associated disease mediated by CDK4/6 kinase
  • an effective amount to prevent, arrest, or delay the onset of a disease eg, a cancer-associated disease mediated by CDK4/6 kinase
  • treating an effective amount of a disease is meant an amount sufficient to cure or at least partially arrest the disease and its complications in a patient already suffering from the disease. Determination of such an effective amount is well within the capabilities of those skilled in the art.
  • the amount effective for therapeutic use will depend on the severity of the condition to be treated, the overall condition of the patient's own immune system, the general condition of the patient such as age, weight and sex, the mode of administration of the drug, and other treatments for simultaneous administration. and many more.
  • a compound or pharmaceutical composition of the invention can be administered to a subject in need thereof in any suitable manner, in any suitable dosage form.
  • a compound or pharmaceutical composition of the invention can be administered to a subject in need thereof by oral, parenteral, rectal or pulmonary administration.
  • the compound or pharmaceutical composition of the present invention may be a tablet, a capsule, a pill, a granule, a solution, a suspension, a syrup, an injection (including an injection, a sterile powder for injection and a concentrated solution for injection), and a suppository. , inhalation or spray.
  • the method of the invention can be used in a variety of subjects, preferably mammals, such as bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, primate Animals.
  • mammals such as bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, primate Animals.
  • a particularly preferred subject is a human.
  • the methods of the invention can be used to treat and/or prevent a variety of cancer-associated diseases mediated by CDK4/6 kinase, including but not limited to brain tumors, lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder Cancer, gastric cancer, ovarian cancer, peritoneal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, endometrial cancer, rectal cancer, liver cancer, kidney cancer, esophageal adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, prostate cancer, female Genital tract cancer, carcinoma in situ, lymphoma, neurofibromatosis, thyroid cancer, bone cancer, skin cancer, brain cancer, colon cancer, testicular cancer, gastrointestinal stromal tumor, prostate tumor, mast cell tumor, multiple bone marrow Tumor, melanoma, glioma or sarcoma.
  • CDK4/6 kinase including but not limited to brain tumors, lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder Cancer, gas
  • the method of the present invention may further comprise, The subject administers one or more additional anti-tumor agents and/or immunosuppressive agents.
  • the compounds of the invention may be used in combination with one or more additional anti-neoplastic agents and/or immunosuppressive agents.
  • the additional anti-tumor agent and/or immunosuppressive agent is selected from one or more of the group consisting of methotrexate, capecitabine, gemcitabine, deoxyfluorouridine , pemetrexed disodium, pazopanib, imatinib, erlotinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, herceptin, bevacizumab, rituximab Monoclonal antibody, trastuzumab, Paclitaxel, vinorelbine, docetaxel, doxorubicin, hydroxycamptothecin, mitomycin, epirubicin, pirarubicin, bleomycin, letrozole, tamoxifen, Fulvestrant, triclinin, flutamide, leuprolide, anastrozole, ifosfamide, busulfan, cyclophosphamide, carmustine, nimustine, semustine
  • the compounds of the invention and the additional anti-neoplastic agents and/or immunosuppressive agents can be administered in any order.
  • the additional anti-neoplastic agent and/or immunosuppressive agent can be administered to the subject prior to, concurrently with, or subsequent to administration of the compound of the invention.
  • the present invention also provides the use of a compound of the formula (I') or the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof for the preparation of a preparation, Formulations are used to reduce or inhibit CDK4 and/or CDK6 kinase activity in cells.
  • the formulation is for administration in vivo or in vitro.
  • the formulation can be administered to a subject (eg, a mammal; eg, a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, primate) For example, human) to reduce or inhibit CDK4 and/or CDK6 kinase activity in cells in a subject; alternatively, the formulation can be administered to cells in vitro (eg, cell lines or cells from a subject such as cancer) Cells) to reduce or inhibit CDK4 and/or CDK6 kinase activity in cells in vitro.
  • a subject eg, a mammal; eg, a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, primate
  • a subject eg, a mammal; eg, a bovine, equine, ovine, porcine, canine, feline, rodent, primate
  • the formulation can be administered to cells in vitro (eg, cell lines or cells
  • the cell is selected from the group consisting of a brain tumor cell, a lung cancer cell, a squamous cell carcinoma cell, a bladder cancer cell, a gastric cancer cell, an ovarian cancer cell, a peritoneal cancer cell, a pancreatic cancer cell, a breast cancer cell, Head and neck cancer cells, cervical cancer cells, endometrial cancer cells, rectal cancer cells, liver cancer cells, renal cancer cells, esophageal adenocarcinoma cells, esophageal squamous cell carcinoma cells, prostate cancer cells, female reproductive tract cancer cells, in situ Cancer cells, lymphoma cells, neurofibromatosis cells, thyroid cancer cells, bone cancer cells, skin cancer cells, brain cancer cells, colon cancer cells, testicular cancer cells, gastrointestinal stromal tumor cells, prostate tumor cells, mast cells Tumor cells, multiple myeloma cells, melanoma cells, glioma cells or sarcoma cells.
  • the invention also provides a method of reducing or inhibiting CDK4 and/or CDK6 kinase activity in a cell comprising administering to said cell an effective amount of a compound of the invention, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof Or their stereoisomers.
  • the method is for use in vivo, for example, the cell is a subject (eg, a mammal; eg, a bovine, an equine, a sheep, a porcine, a canine, a cat) a cell, a rodent, a primate; for example, a human; or the method is for use in vitro, for example, the cell is a cell in vitro (eg, a cell line or a cell from a subject, such as a cancer) cell).
  • a subject eg, a mammal; eg, a bovine, an equine, a sheep, a porcine, a canine, a cat
  • a cell eg.g, a rodent, a primate
  • the cell is a cell in vitro (eg, a cell line or a cell from a subject, such as a cancer) cell).
  • the cell is selected from the group consisting of a brain tumor cell, a lung cancer cell, a squamous cell carcinoma cell, a bladder cancer cell, a gastric cancer cell, an ovarian cancer cell, a peritoneal cancer cell, a pancreatic cancer cell, a breast cancer cell, Head and neck cancer cells, cervical cancer cells, endometrial cancer cells, rectum Cancer cells, liver cancer cells, renal cancer cells, esophageal adenocarcinoma cells, esophageal squamous cell carcinoma cells, prostate cancer cells, female genital cancer cells, carcinoma cells in situ, lymphoma cells, neurofibromatosis cells, thyroid cancer cells, Bone cancer cells, skin cancer cells, brain cancer cells, colon cancer cells, testicular cancer cells, gastrointestinal stromal tumor cells, prostate tumor cells, mast cell tumor cells, multiple myeloma cells, melanoma cells, glioma Cell or sarcoma cells.
  • the present invention also provides a kit for reducing or inhibiting CDK4 and/or CDK6 kinase activity in a cell, the kit comprising the compound of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, and a solvent thereof Compounds or their stereoisomers, and optionally also instructions for use.
  • the compound of the formula (I') or the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, an ester thereof, a solvate thereof or a stereoisomer thereof thereof has excellent CDK4/6 kinase inhibitory activity;
  • Test substance Compounds 1, 13, and 14, of the present invention, chemical names, structural formulas, and preparation methods are shown in the preparation examples of the respective compounds.
  • a DMSO stock solution of 10 mM test substance was taken and diluted with DMSO to prepare a solution having a concentration of 50 ⁇ M as a mother liquid.
  • the above mother liquor was diluted four times in DMSO to prepare a solution of 12.5 ⁇ M, 3.125 ⁇ M, 0.78 ⁇ M, 0.195 ⁇ M, 0.0488 ⁇ M, 12.2 nM, 3 nM, 0.76 nM, 0.19 nM, and then buffered with 1 ⁇ kinase for each concentration.
  • the solution was diluted 10 times to prepare a 5-fold compound solution.
  • the reaction was terminated by adding 25 ⁇ L of stop solution to each of the corresponding wells.
  • the Caliper instrument reads the data and calculates the inhibition rate by the following formula, and then performs curve fitting using GraphPad 5.0 software to obtain an IC 50 value.
  • Inhibition rate (maximum - sample value) / (maximum - minimum value) ⁇ 100
  • the maximum value a positive control without a test substance; the minimum value: a negative control without an enzyme.
  • Test substance The chemical name and preparation method of the compound of the present invention can be found in the preparation examples of the respective compounds.
  • the washing solution having a mother liquor concentration of 20 times was diluted with ultrapure water to a double washing solution.
  • the BrdU detection antibody having a mother liquid concentration of 100 times was diluted with a detection antibody dilution to a 1-fold detection antibody solution.
  • the anti-mouse IgG having a mother liquor concentration of 100-fold was diluted with an HRP-labeled antibody dilution to a 1-fold HRP-labeled secondary antibody solution.
  • the BrdU solution having a mother liquor concentration of 1000-fold was diluted into a 10-fold BrdU solution using a cell-specific medium.
  • Formulation test compound mother liquor 10 mM mother liquor was formulated with 100% DMSO.
  • test compound gradient dilution solution was prepared: 10 mM test compound stock was diluted 4 times in DMSO with a concentration of 2.5 mM, 625 ⁇ M, 156 ⁇ M, 39 ⁇ M, 9.8 ⁇ M, 2.5 ⁇ M. 2 ⁇ L of DMSO-diluted compound was added to 198 ⁇ L of 10% FBS-containing medium to prepare a 10-fold test substance with a maximum concentration of 100 ⁇ M and a DMSO concentration of 1% for a total of 7 concentration gradients.
  • MDA-MB-435S medium L-15+10%FBS+0.01mg/mL insulin
  • MCF-7 medium DMEM + 10% FBS + 0.01 mg / mL insulin
  • Pancreatic digestion was carried out to 80% of cells (logarithmic growth phase), and the cells were collected by centrifugation.
  • MDA-MB-435S and U87MG cells were resuspended in FBS-free medium, counted and adjusted to inoculate 96-well plates, MDA-MB-435S cells were seeded at 3000/well/81 ⁇ L, and U87MG cells were seeded at 4000/well/81 ⁇ L;
  • the MCF-7 cells were resuspended in medium containing 1% FBS, counted and adjusted to inoculate 96-well plates, inoculated with 4000 cells/well/82 ⁇ L, and cultured in a 37 °C cell culture incubator;
  • MDA-MB-435S and U87MG cells were added with FBS (9 ⁇ L) per well, and MCF-7 cells were supplemented with 8 ⁇ L of FBS per well to make the final concentration of FBS 10%;
  • test substance (10 ⁇ L) at different concentrations to each well to make the final concentration of the test substance 10 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 625 nM, 156 nM, 39 nM, 9.8 nM, 2.5 nM, 3 replicate wells/group, culture at 37 °C. 72 hours;
  • Normal cell control normal cells without any treatment
  • OD blank control blank control value
  • OD normal cell control normal cell control value
  • Test article Part of the compound of the present invention, self-made, and its chemical name and preparation method are shown in the preparation examples of each compound.
  • the reference drug LY2835219 self-made (prepared by the preparation method of the patent CN102264725A), has the structural formula as described in the background art.
  • Test animals female nude mice (BALB/c), control drug: 3 / time point of administration, body weight 22-25 g / only; compound 1: 3 / time point of administration, body weight 22-25 g / only Compound 6-1: 6 / route of administration / test article, weight 18-26 g / only.
  • MC methylcellulose
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • pH 5.0 buffer Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (1.56 g) was weighed, purified water was added to prepare a 50 mL solution, and the pH was adjusted to 5.0 with a sodium hydroxide solution.
  • HPC hydroxypropylcellulose
  • test solution is administered according to the following method:
  • Control drug/compound 1, IV administration group 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30 h before administration, 10 mg/kg for PO administration: before administration, 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30 h after administration.
  • Compound 1, PO was administered in the 100 mg/kg group: 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48 h after administration.
  • the control drug/Compound 1 was collected from the intraocular eye by 300 ⁇ L of whole blood at each time point, and the plasma was separated by centrifugation at 8000 rpm for 6 min in a high-speed centrifuge, and the plasma was frozen in a refrigerator at -80 °C.
  • Compound 6-1 collected 60 ⁇ L of whole blood through intraocular fistula at each time point, and the blood was collected and placed in an anticoagulation tube containing K 2 EDTA anticoagulant, and the blood sample was centrifuged at 8000 rpm for 6 minutes to obtain a plasma sample.
  • the plasma samples of the reference drug and Compound 1 were analyzed by protein precipitation: 50 ⁇ L of plasma was taken, 200 ⁇ L of internal standard (500 ng/mL acetonitrile solution containing warfarin), vortexed at 1500 rpm for 3 min, and then centrifuged at 13,000 rpm. 5 min, 100 ⁇ L of the supernatant was taken, 400 ⁇ L of water was added, vortexed, and analyzed by LC-MS/MS.
  • the plasma samples of Compound 6-1 were analyzed by protein precipitation. The appropriate amount of plasma was added, a certain volume of internal standard solution was added, vortexed, the supernatant was taken, diluted with a certain volume of water, and vortexed, LC-MS/ MS injection analysis.
  • AUC last represents the area under the curve of the drug 0 ⁇ t
  • V ss represents the steady-state apparent distribution volume
  • T max represents the peak plasma concentration
  • Test article Compound 1 of the present invention, self-made, and its chemical name and preparation method are shown in the preparation examples of the respective compounds.
  • Control drug LY2835219, self-made (prepared by the preparation method of CN102264725A), and its structural formula is as described in the background art.
  • Test animals male SD rats, 3 / dose / test, weighing 200-240 g / only.
  • Preparation method of solvent pH 4.0buffer take citric acid (21g), add water to dissolve, quantify to 1000mL to obtain a liquid, save for use; take disodium hydrogen phosphate (71.63g), add water to dissolve, quantify to 1000mL, get ethyl acetate, Save spare.
  • the above liquid A 614.5 mL was mixed with the liquid B (385.5 mL), and shaken to obtain.
  • the solution LY2835219 with a concentration of 13.5 mg/mL was prepared by using the solvent pH 4.0 buffer as a solvent.
  • the above solutions 4-6 were respectively administered as drug solutions of 15 mg/kg, 45 mg/kg and 135 mg/kg of the compound 1PO.
  • test solution is administered according to the following method:
  • Collection time point PO 15 mg/kg group: 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48 h after administration.
  • PO 45 mg/kg group 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48, 56, 72 h after administration.
  • PO 135 mg/kg group 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48, 56, 72, 96, 102 h after administration.
  • Collection time point PO 15 mg/kg group: 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48 h after administration.
  • PO 45 mg/kg group 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48 h after administration.
  • PO 135 mg/kg group 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 30, 48, 56, 72, 96 h after administration.
  • the plasma samples of the reference drug and Compound 1 were analyzed by protein precipitation: 30 ⁇ L of plasma was added, and 200 ⁇ L of internal standard (containing PD0332991, the structural formula was Prepared according to the preparation method of patent CN101001857A, 50 ng/mL acetonitrile solution), vortex at 1500 rpm for 10 min, then centrifuge at 4000 rpm for 20 min, take 100 ⁇ L of the supernatant, add 100 ⁇ L of water, vortex and mix, then perform LC. - MS/MS analysis.
  • T max represents the peak plasma concentration
  • AUC last represents the area under the curve of the drug 0 ⁇ t
  • Test article Compound 1 of the present invention, self-made, and its chemical name and preparation method are shown in the preparation examples of the respective compounds.
  • Control drug LY2835219, self-made (prepared by the preparation method of CN102264725A), and its structural formula is as described in the background art.
  • Test animals female nude mice (BALB/c), 8/dose group/test sample, weighing 19-27 g/only.
  • Preparation method of blank solvent containing 0.5% MC and 0.1% SDS Weigh MC (2g), add ultrapure water (350mL) to dissolve, add SDS (0.4g), dilute to 400mL, mix well, 0.22 ⁇ m The filter was sterilized by filtration and stored at 4 ° C to obtain a blank solvent solution.
  • control drug homogenization solution 1 with the concentration of 10mg/mL; take the control drug homogenization solution 1 (0.5mL), add the solvent (1.5 mL), vortex and mix to obtain a control drug homogenizing solution 2 with a concentration of 2.5 mg/mL.
  • COLO205 cancer cells were cultured in RPMI-1640 medium containing inactivated 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin and 2 mM glutamine in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
  • the initial concentration of the cell culture was 5 ⁇ 10 5 /mL, and the cells were subcultured every 3 to 4 days after the cells were over. Tumor cells in the logarithmic growth phase are used for in vivo tumor inoculation.
  • COLO205 tumor cells resuspended in PBS 1 ⁇ 10 7 / 0.1 mL were inoculated subcutaneously in the right flank of the experimental animals, and the animals were sacrificed when the tumor grew to 800 mm 3 to 1000 mm 3 , and the tumor was excised under sterile conditions.
  • Tumor cells were passaged twice in mice in this manner, and the obtained primary cultured cells were inoculated subcutaneously into the right flank of the experimental animals, and each animal was inoculated with 5 ⁇ 10 6 / 0.1 mL.
  • the tumors were administered in groups when the tumors were as long as about 100 mm 3 . Oral administration, the administration volume is 0.1 mL/10 g of the animal body weight.
  • test solution is administered according to the following method:
  • Blood collection The method of blood collection is blood collection in the eye.
  • the blood collection/tumor time point design of the control drug and Compound 1 after the last administration (Day 22) was the same, and 8 nude mice in each dose group were divided into A and B groups:
  • Group A (No. 1-4): 15 min, 1 h, 2 h, each mouse was sacrificed after 2 h of blood sampling;
  • Group B (No. 5-8): 4h, 8h, 24h, each mouse was sacrificed after 24 hours of blood sampling;
  • the plasma samples of the reference drug and Compound 1 were analyzed by protein precipitation: 50 ⁇ L of plasma was added, 150 ⁇ L of internal standard (containing dexamethasone 50 ng/mL in acetonitrile solution), vortexed at 1500 rpm for 3 min, and then centrifuged at 4000 rpm. After 20 min, 100 ⁇ L of the supernatant was taken, 100 ⁇ L of water was added, vortexed, and then subjected to LC-MS/MS analysis.
  • internal standard containing dexamethasone 50 ng/mL in acetonitrile solution
  • AUC last represents the area under the curve of the drug 0 ⁇ t
  • T max represents the peak plasma concentration
  • Test article Compound 1 of the present invention, self-made, and its chemical name and preparation method are shown in the preparation examples of the respective compounds.
  • Control drug LY2835219, self-made (prepared by the preparation method of CN102264725A), and its structural formula is as described in the background art.
  • Test animals male SD rats, 3 / test / time point, weighing 250-300 g / only.
  • the reference drug (108.22 mg) was weighed, and the solvent (36.07 mL) was added and ground to homogenize the suspension to obtain a homogeneous solution 1.
  • This solution was used as a control drug LY2835219 rat PO administration solution.
  • test solution is administered separately according to the following methods:
  • control drug and Compound 1 PO was subjected to cardiac puncture at 2, 4, 24, and 48 h after administration, and about 8 mL of whole blood was collected, and a centrifuge tube containing K 2 EDTA as an anticoagulant was placed, and cerebrospinal fluid was collected at the same time. Brain tissue, 3 at each time point. Whole blood samples were collected and centrifuged at 3000 rpm in a high-speed centrifuge. The plasma was separated by centrifugation at 4 ° C for 10 min, and the plasma was frozen in a -80 ° C refrigerator. After the sample was collected, the concentrations of the control drug and Compound 1 in plasma, brain tissue, cerebrospinal fluid, and the like were measured.
  • the plasma samples of the control drug and Compound 1 administration group were analyzed by protein precipitation method: the sample to be tested (-80 ° C) was taken out from the refrigerator, vortexed at room temperature for 3 min, and 30 ⁇ L of plasma was taken.
  • the internal standard including PD0332991, 25 ng/mL acetonitrile solution 200 ⁇ L, vortex at 1500 rpm for 10 min, then centrifuge at 4000 rpm for 20 min, take the supernatant (100 ⁇ L), add water (100 ⁇ L), vortex and mix, then perform LC-MS /MS analysis.
  • the brain tissue samples and cerebrospinal fluid samples of the control drug and Compound 1 administration group were analyzed by protein precipitation method: the sample to be tested was taken out from the refrigerator (-80 ° C), naturally fused at room temperature, vortexed for 3 min, and the brain tissue after homogenization was taken.
  • AUC last represents the area under the curve of the drug 0 ⁇ t
  • T max represents the peak plasma concentration
  • the compound of the present invention evaluates the permeability of the blood-brain barrier in rats compared with the control drug. It can effectively enter the brain tissue from plasma, and the exposure of the drug in the cerebrospinal fluid is significantly higher than the control drug LY2835219.
  • Test article The compound of the present invention, self-made, and its chemical name and preparation method are shown in the preparation examples of each compound.
  • Control drug LY2835219, self-made (prepared by the preparation method of CN102264725A), and its structural formula is as described in the background art.
  • Test animals female nude mice (BALB/c), 10/dose group/test sample, weighing 18-22 g/only.
  • Preparation of solvent containing 0.5% MC take appropriate amount of MC, add a certain volume of ultrapure water, dissolve, and mix well, that is, solvent 1 with MC content of 0.5%;
  • Preparation of solvent containing 0.5% MC and 0.1% SDS Weigh the appropriate amount of MC and SDS, add a certain volume of ultrapure water, dissolve and mix well, then obtain solvent 2 with MC content of 0.5% and SDS content of 0.1%. ;
  • control drug homogenization solution 1 Take the reference drug (508.87mg) and SDS (39.37mg), dilute with solvent 1 (39.37mL), grind evenly to obtain the control drug homogenization solution 1 with a concentration of 10.1mg/mL; take the control drug homogenization solution 1 ( 13.125 mL), solvent 2 (13.125 mL) was added, and the mixture was uniformly ground to obtain a control drug homogenizing solution 2 having a concentration of 5.0 mg/mL.
  • Compound 1 (931.77 mg) and SDS (45.9 mg) were taken, diluted with solvent 1 (45.9 mL), and uniformly ground to obtain Compound 1 homogeneous solution 1 at a concentration of 20.0 mg/mL; Compound 1 (20.0 mg/mL) was taken.
  • a homogeneous solution (19.69 mL), adding solvent 2 (19.69 mL), and grinding uniformly to obtain a homogeneous solution of Compound 1 at a concentration of 10.0 mg/mL; a homogeneous solution of Compound 1 (10.0 mg/mL) was obtained ( 13.125 mL), solvent 2 (13.125 mL) was added, and the mixture was uniformly ground to obtain a compound 1 homogeneous solution 3 having a concentration of 5.0 mg/mL.
  • U87MG cells derived from ATCC were cultured in MEM medium containing 10% fetal calf serum, and the cells were digested according to a conventional method using trypsin containing EDTA, subcultured twice a week, and placed at 37 ° C, 5% CO 2 culture. Continue to train in the box.
  • the logarithmic growth phase tumor cells were collected, and the concentration of U87MG cells was adjusted to 5 ⁇ 10 7 /mL in a ratio of 1:1 with PBS and Matrigel.
  • 0.1 mL of the cell suspension was inoculated into the right side of each mouse near the back subcutaneously with a 1 mL syringe. .
  • the tumor volume was observed and measured.
  • the average tumor volume of U87MG reached about 200 mm 3 8 days after inoculation, and then the tumor cell-bearing mice were grouped and administered by oral administration.
  • the dose was 0.1 mL of the animal body weight. /10g.
  • test solution is administered according to the following method:
  • Blood collection The method of blood collection is blood collection in the eye.
  • the blood collection/tumor time point design of the control drug and Compound 1 after the last administration (Day 22) was the same.
  • One of the 10 nude mice in each dose group was reserved, and the other 9 were divided into three groups: A, B, and C:
  • Group A (No. 1-3): before the drug, 1h, 2h, each mouse was sacrificed after 2 hours of blood sampling;
  • Group B (No. 4-6): 15 min, 4 h, 6 h, each mouse was sacrificed after 6 hours of blood sampling;
  • Group C (No. 7-9): 30 min, 10 h, 24 h, each mouse was sacrificed after 24 hours of blood sampling;
  • the plasma samples of the reference drug and Compound 1 were analyzed by protein precipitation: 30 ⁇ L of plasma was taken into a square 96 deep well plate, and 200 ⁇ L of internal standard (PD0332991) in acetonitrile (25 ng/mL) was added, and vortexed at 1500 rpm for 3 min. Then, centrifuge at 4000 rpm for 20 min, take 100 ⁇ L of the supernatant, add 100 ⁇ L of water, vortex and mix, and analyze by LC-MS/MS.
  • internal standard PD0332991
  • acetonitrile 25 ng/mL
  • AUC last represents the area under the curve of the drug 0 ⁇ t
  • T mzx represents peak plasma concentration
  • 2,5-Difluoro-4-iodopyridine (4.82 g, 20 mmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide (40 mL), and aqueous ammonia (40 mL) was added under stirring, and the mixture was stirred at 90 ° C for 12 h. Ethyl acetate (150 mL) was added, and the title compound was evaporated. Rate 50%).
  • 6-Bromo-4-fluoro-1-isopropyl-2-methyl-1H-benzo[d]imidazole (9.0 g, 33.2 mmol), boronic acid pinacol ester (12.65 g, 49.8 mmol), Palladium acetate (840 mg, 3.75 mmol), tricyclohexylphosphine (1.63 g, 5.8 mmol) and potassium acetate (9.78 g, 99.8 mmol) were added to dimethyl sulfoxide (60 mL) and heated to 80 ° C under nitrogen. 6h. Water (200 mL) and ethyl acetate (200 mL) were added, and the aqueous layer was evaporated, evaporated, evaporated, evaporated, evaporated, The title compound (6.0 g, yield 56.8%).
  • tert-Butyl 4-(2-(bis(4-methoxybenzyl)amino)pyrimidin-5-yl)piperazine-1-carboxylate (6.2 g, 11.9 mmol) was dissolved in dichloromethane (30 mL) And a mixed solution of trifluoroacetic acid (30 mL), stirred at room temperature for 30 minutes, and the solvent was removed by rotary evaporation. Dichloromethane was evaporated and the solvent was evaporated again to give a crude material (m. The product was not purified and was used for the next step.
  • Example 6-1 N-(5-fluoro-4-(4-fluoro-1-isopropyl-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-6-yl)pyridin-2-yl) Preparation of 5-(-(cis)-5-methylhexahydropyrrolo[3,4-c]pyrrole-2(1H)-yl)methyl)pyrimidin-2-amine (Compound 6-1)
  • Example 6-2 5-(((cis)-5-ethylhexahydropyrrolo[3,4-c]pyrrole-2(1H)-yl)methyl)-N-(5-fluoro- Preparation of 4-(4-fluoro-1-isopropyl-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-6-yl)pyridin-2-ylpyrimidin-2-amine (Compound 6-2)
  • tert-Butyl (cis)-5-ethylhexahydropyrrolo[3,4-c]pyrrole-2(1H)-formate (317 mg, 1.32 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 mL) and The mixed solution of fluoroacetic acid (3 mL) was stirred at room temperature for 30 minutes, and the solvent was evaporated to dryness. The product was taken to the next step without purification.
  • Example 7 N-(5-fluoro-4-(4-fluoro-1-isopropyl-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-6-yl)pyridin-2-yl)-5 Preparation of (((cis)-hexahydropyrrolo[3,4-b][1,4]oxazin-6(2H)-yl)methyl)pyrimidin-2-amine (Compound 7)
  • Example 8 (Exo)-3-((2-((5-fluoro-4-(4-fluoro-1-isopropyl-2-methyl-1H-benzo[d]imidazole-6-) Preparation of pyridin-2-yl)amino)pyrimidin-5-yl)methyl)-3-azabicyclo[3.1.0]hexane-6-amine (Compound 8)
  • tert-Butyl (exo)-6-((benzyloxycarbonyl)amino)-3-azabicyclo[3.1.0]hexane-3-carboxylate (578 mg, 1.74 mmol) was dissolved in dichloromethane. In 10 mL), trifluoroacetic acid (5 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hr.
  • N,N-bis(4-methoxybenzyl)-5-(4-methylpiperazinyl-1yl)pyrimidine-2-amine 800 mg, 1.8 mmol
  • trifluoroacetic acid 10 mL
  • methyl chloride 10 mL

Abstract

本发明涉及CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，含有所述CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体的药物制剂、药物组合物和试剂盒，以及所述CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体的用途。例如，本发明的化合物可用于降低或抑制细胞中的CDK4/6激酶的活性，和/或治疗和/或预防由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病。

Description

激酶抑制剂及其用途 技术领域
本发明属于医药技术领域。特别地，本发明涉及CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，含有所述CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体的药物制剂、药物组合物和试剂盒，以及所述CDK4/6激酶抑制剂、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体的用途。例如，本发明的化合物可用于降低或抑制细胞中的CDK4/6激酶的活性，和/或治疗和/或预防由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病。
背景技术
肿瘤的发生与多种癌基因和抑癌基因的失衡有关。几乎所有癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都会汇聚到细胞周期上来。因此，可以说肿瘤是一类细胞周期性疾病(Cell Cycle Disease，CCD)，调节或阻断细胞周期是***的途径之一。目前，已发现的与细胞周期调控有关的分子很多，其中细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-Dependent-Kinases，CDKs)是细胞周期调控网络的核心分子。CDKs为催化亚单位，是一类丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶，作为细胞内重要的信号传导分子，参与细胞周期的不同时期。研究表明，以CDKs为中心的细胞周期调控网络，任何环节的异常都将引起细胞周期异常，最终导致肿瘤的发生。CDK家族目前有21个亚型，通过与其调节性亚单元cyclins(细胞周期蛋白)结合发挥作用。CDK各种亚型的功能，除了作用于细胞周期之外，还包括对转录、DNA修复、分化和细胞程序性死亡的调节。基于CDKs在调控肿瘤细胞的增殖和死亡中所起的关键作用，CDKs激酶家族为抗肿瘤药物的发现与研制提供了机会和新的领域。
在研发药物中，以flavopiridol、UCN-01等为代表的第一代CDK抑制剂为“pan-CDK”抑制剂，它们以等效的方式阻断CDK家族所有亚型，在临床试验中表现出了比较高的毒性，有的不能达到有效的治疗剂量，因此激发人们开始研发选择性CDK抑制剂，期望能提高治疗的选择性以及防止正常细胞受到一些副作用的损害。
在参与细胞周期的CDK亚型中，CDK4/6发挥着不可替代的作用。与癌症有关的细胞周期突变主要存在于G1期和G1/S期转化过程中，CDK4/6与CyclinD形成的复合物，通过抑癌基因Rb产物pRb磷酸化，释放结合的转录因子E2F，启动与S期有关的基因转录，促使细胞通过检验点，并从G1期向S期转移。大约80％的人类肿瘤中有cyclinD-CDK4/6-INK4-Rb 通路的异常。这条通路的改变，加速了G1期进程，使得肿瘤细胞增殖加快而获得生存优势。因此，对该通路的干预成为一种治疗策略，CDK4/6成为一种新的抗肿瘤靶点。CDK4/6作为抗肿瘤靶点的优势在于：(1)大多数增殖的细胞依赖CDK2或者CDK4/6增殖，但CDK4/6的抑制剂不表现出“pan-CDK抑制剂”的细胞毒性，如骨髓抑制和肠道反应。(2)临床前实验表明，如果细胞cyclin D水平升高或者P16INK4a失活，能够增加细胞对药物的敏感性，由于肿瘤细胞相对于正常细胞存在上述现象，所以一定程度上增加了药物的靶向性。
目前为止还没有CDK抑制剂药物上市，包括辉瑞，礼来和诺华等在内的一些医药公司陆续报道一系列选择性较好的CDK4/6抑制剂，正在临床试验阶段。其中，特别值得关注的是Pfizer开发的PD0332991(palbociclib)和Eli Lilly的LY2835219(Phase III)和Novartis的LEE-011(Phase III)。
Figure PCTCN2014095615-appb-000001
2013年4月，辉瑞的PD0332991获得FDA重大突破药物认定，2014年8月，已向FDA提交新药申请(NDA)，寻求批准PD0332991(palbociclib)联合曲唑(letrozole)用于既往未接受过***治疗以控制晚期病情的绝经后女性***受体阳性(ER+)、人表皮生长因子受体2阴性(HER2-)局部晚期或转移性乳腺癌的治疗。这对CDK4/6抑制剂的开发起着非常正面的作用。
为了达到更好的肿瘤治疗效果的目的，更好的满足市场需求，我们希望能够开发出新一代的高效低毒的CDK4/6抑制剂。本发明将提供一种新型结构的选择性CDK4/6抑制剂，并发现此类结构的化合物具有很好的药效，且能有效通过血脑屏障，为CDK抑制剂作为脑癌的治疗提供了可能性。
发明内容
本发明的一个方面提供了靶向CDK4/6激酶的抑制剂/化合物。特别地，本发明的示例性技术方案如下：
1.下述式(I′)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，
Figure PCTCN2014095615-appb-000002
其中，
A1和A2分别独立地选自氮；
R1选自C1-6烷基、C1-6烷氧基或任选被Q1取代的3-8元环烷基，Q1选自C1-6烷基或C1-6烷氧基；
R2选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-6烷基羰基氨基；
R3和R5分别独立地选自卤素或氢，且R3和R5至少一个为卤素；
R4选自任选被Q2取代的3-8元杂环基、6-14元稠杂环基、5-8元杂芳基、6-14元稠杂芳基、苯基、萘基、6-12元桥杂环基或6-12元螺杂环基；
Q2选自氨基，羟基，卤素，三氟甲基，氰基，C1-6烷氧基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基磺酰氨基，二C1-6烷基氨基，或任选被取代基取代的C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元杂环基或6-9元桥杂环基，所述取代基选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、C1-6烷基磺酰基、3-8元杂环基或3-8元环烷基；
n选自0、1、2、3、4或5。
2、如方案1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
A1和A2分别独立地选自氮；
R1选自C1-4烷基或C1-4烷氧基；
R2选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-4烷基羰基氨基；
R3和R5分别独立地选自卤素；
R4选自任选被Q2取代的5-6元含氮杂环基；
所述的“5-6元含氮杂环基”优选为“6元含氮杂环基”；
Q2选自氨基，羟基，卤素，三氟甲基，氰基，C1-4烷氧基，二C1-4烷基氨基，或任选被取代基取代的C1-4烷基、3-6元环烷基或3-6元杂环基，所述取代基选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基或3-6元环烷基；
n选自0。
3、如方案2所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，所述化合物选自：
Figure PCTCN2014095615-appb-000003
4、方案1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中所述化合物具有下述式(I)的结构，
Figure PCTCN2014095615-appb-000004
其中，
A1和A2分别独立地选自氮；
R1选自C1-6烷基、C1-6烷氧基或任选被Q1取代的3-8元环烷基，其中Q1选自C1-6烷基或C1-6烷氧基；
R2选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-6烷基羰基氨基；
R3和R5分别独立地选自卤素或氢，且R3和R5至少一个为卤素；
R4选自任选被Q2取代的3-8元杂环基、6-14元稠杂环基、5-8元杂芳基、6-14元稠杂芳基、苯基、萘基、6-12元桥杂环基或6-12元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、3-8元杂环基或6-9元桥杂环基。
5、如方案4所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
A1和A2分别选自氮；
R1选自C1-4烷基或C1-4烷氧基；
R2选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-4烷基羰基氨基；
R3和R5分别独立地选自卤素；
R4选自任选被Q2取代的5-7元杂环基、6-11元稠杂环基、6-11元桥杂环基或6-11元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-6元杂环基或7-9元桥杂环基。
6、如方案5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中
A1和A2分别选自氮；
R1是异丙基；
R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
R3和R5分别是氟；
R4选自任选被Q2取代的5-6元杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、6元杂环基或8元桥杂环基。
7、如方案6所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R2是甲基；
R4选自任选被Q2取代的5-6元含氮杂环基，所述5-6元含氮杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或8元含氮桥杂环基；
所述的5-6元含氮杂环基优选为含1-2个氮原子的5-6元含氮杂环基。
8、如方案7所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构 体，其中，
R4选自任选被Q2取代的
Figure PCTCN2014095615-appb-000005
其中Q2选自C1-4烷基或8元含氮桥杂环基。
9、如方案5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
A1和A2分别选自氮；
R1是异丙基；
R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
R3和R5分别是氟；
R4选自任选被Q2取代的7-9元桥杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
10、如方案9所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R2是甲基；
R4选自任选被Q2取代的7-9元含氮桥杂环基，所述7-9元含氮桥杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基或6元含氮杂环基；
所述7-9元含氮桥杂环基优选为含1-2个氮原子的7-9元含氮桥杂环基。
11、如方案10所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R4选自任选被Q2取代的
Figure PCTCN2014095615-appb-000006
其中Q2选自C1-4烷基或6元含氮杂环基。
12、如方案5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
A1和A2分别独立地选自氮；
R1是异丙基；
R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
R3和R5各自是氟；
R4选自任选被Q2取代的6-10元稠杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
13、如方案12所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R2是甲基；
R4选自任选被Q2取代的含有1、2或3个相同或不同杂原子的6-10元含氮稠杂环基，所述杂原子优选选自氮原子和氧原子，并且含有至少一个氮原子，所述6-10元稠杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基或C1-4烷基。
14、如方案13所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R4选自任选被Q2取代的
Figure PCTCN2014095615-appb-000007
Figure PCTCN2014095615-appb-000008
其中Q2选自氨基或C1-4烷基。
15、如方案5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
A1和A2分别独立地选自氮；
R1是异丙基；
R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
R3和R5各自是氟；
R4选自任选被Q2取代的7-11元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
16、如方案15所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R2选自甲基；
R4选自任选被Q2取代的7-11元含氮螺杂环基，所述7-11元含氮螺杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基或C1-4烷基；
所述7-11元含氮螺杂环基优选为含1-2个氮原子的7-11元含氮螺杂环基。
17、如方案16所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
R4选自任选被Q2取代的
Figure PCTCN2014095615-appb-000009
其中Q2选自C1-4烷基。
18、如方案1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，所述化合物选自表A中所示的化合物。
表A：本发明的部分化合物
Figure PCTCN2014095615-appb-000011
Figure PCTCN2014095615-appb-000012
Figure PCTCN2014095615-appb-000013
Figure PCTCN2014095615-appb-000014
本发明还涉及了所公开的化合物的各种用途。因此，本发明还涉及下述示例性技术方案：
19、一种药物组合物，其包含方案1-18中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，以及任选的一种或多种药用载体。
20、如方案19所述的药物组合物，其还包含一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂。
21、如方案20所述的药物组合物，其中所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。
22、方案1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防受试者中由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病。
23、如方案22所述的用途，其中所述癌症相关疾病选自脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
24、如方案22或23所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
25、如方案22-24任一项所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂；优选地，所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博 来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。
26、治疗和/或预防由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病的方法，其包括将治疗和/或预防有效量的方案1-18中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体或者方案19-21中任一项所述的药物组合物施用给有此需要的受试者。
27、如方案26所述的方法，其中所述癌症相关疾病选自脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
28、如方案26或27所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
29、如方案25-28任一项所述的方法，其中所述方法还包括，给所述受试者施用一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂；优选地，所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。
30、方案1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，用于治疗和/或预防受试者中由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病。
31、如方案30所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中所述癌症相关疾病选自脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、 腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
32、如方案30或31所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
33、如方案30-32任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其与一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂联合使用；优选地，所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。
34、方案1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体用于制备制剂的用途，所述制剂用于降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。
35、如方案34所述的用途，其中所述制剂用于体内或者体外施用；例如，所述制剂被施用至受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性；或者，所述制剂被施用至体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如癌症细胞)，以降低或抑制体外细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。
36、如方案34或35所述的用途，其中所述细胞选自脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子***细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、***癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾 丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、***肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。
37、降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性的方法，其包括给所述细胞施用有效量的方案1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体。
38、如方案37所述的方法，其中所述方法用于体内，例如所述细胞是受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内的细胞；或者，所述方法用于体外，例如所述细胞是体外的细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如癌症细胞)。
39、如方案37或38所述的方法，其中所述细胞选自脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子***细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、***癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、***肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。
40、方案1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，用于降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。
41、方案40所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，用于体内或者体外施用；例如，所述制剂被施用至受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性；或者，所述制剂被施用至体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如癌症细胞)，以降低或抑制体外细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。
42、如方案40或41所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中所述细胞选自脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子***细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、***癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤 细胞、***肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。
43、一种用于降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性的试剂盒，所述的试剂盒包括方案1至18中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，且任选地还包括使用说明。
发明详述
在本申请的说明书和权利要求书中，化合物都是依据化学结构式而命名的，如果表示同一化合物时化合物的命名与化学结构式不符，以化学结构式或化学反应式为准。
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，下面提供了部分相关术语的定义和解释。另外，当本申请所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不一致时，以本申请所提供的术语的定义和解释为准。
在本发明中，所述的“Me”为甲基。
在本发明中，取代基中的波浪线
Figure PCTCN2014095615-appb-000015
的含义是在波浪线的位置上取代基的基团与主链(例如，苯环)的基团通过化学键相连接。
本发明所述的“卤素原子”包括例如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
本发明所述的“C1-6烷基”可以为直链或支链状，包括例如“C1-4烷基”、“C1-3烷基”等，其具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-甲基丙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1，2-二甲基丙基等。
本发明所述的“C1-6烷氧基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基磺酰氨基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基”是指以C1-6烷基-O-、C1-6烷基-C(O)NH-、C1-6烷基-SO2-、C1-6烷基-SO2NH-、C1-6烷基-NH-、(C1-6烷基)2-N-方式形成的基团，其中“C1-6烷基”的定义如前文所述。
本发明所述的“C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷基磺酰氨基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基”是指以C1-4烷基-O-、C1-4烷基-C(O)NH-、C1-4烷基-SO2-、C1-4烷基-SO2NH-、C1-4烷基-NH-、(C1-4烷基)2-N-方式形成的基团，其中“C1-4烷基”的定义如前文所述。
本发明所述的“3-8元环烷基”，是指3-8个碳原子的烷烃部分去除一个氢原子衍生的环状烷基，包括例如“3-6元环烷基”、“4-6元环烷基”等。其实例包括但不限于：环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基、环辛烷基等。
本发明所述的“3-8元杂环基”，包括例如“3-7元杂环基”、“3-6元杂环基”、“4-7元杂环基”、“4-6元杂环基”、“5-7元杂环基”、“5-6元杂环基”、“5-6元含氮杂环基”、“6元杂环基”、“6元含氮杂环基”等。具体实例包括但不仅限于：氮杂环丙烷基、2H-氮杂环丙烷基、二氮杂环丙烷基、3H-二氮杂环丙烯基、氮杂环丁烷基、1，4-二氧杂环己烷基、1，3-二氧杂环己烷基、1，3-二氧杂环戊烷基、1，4-二氧杂环己二烯基、四氢呋喃基、二氢吡咯基、吡咯烷基、咪唑烷基、4，5-二氢咪唑基、吡唑烷基、4，5-二氢吡唑基、2，5-二氢噻吩基、四氢噻吩基、4，5-二氢噻唑基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基、4，5-二氢噁唑基、4，5-二氢异噁唑基、2，3-二氢异噁唑基、2H-1，2-噁嗪基、6H-1，3-噁嗪基、4H-1，3-噻嗪基、6H-1，3-噻嗪基、2H-吡喃基、2H-吡喃-2-酮基、3，4-二氢-2H-吡喃基等，优选为“5-6元含氮杂环基”。
本发明所述的“通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接”是指含氮基团(例如，含氮杂环基，如“5-6元含氮杂环基”或“6元含氮杂环基”；含氮稠杂环基，如“6-10元含氮稠杂环基”；含氮桥杂环基，如“7-9元含氮桥杂环基”或“8元含氮桥杂环基”；含氮螺杂环基，如“7-11元含氮螺杂环基”)通过氮原子与亚甲基连接。
根据IUPAC化合物命名的规则，本发明所述的稠环是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子(即共用一个键)连接起来形成的稠环结构。本发明所述的桥环是指由两个或两个以上环状结构彼此共用两个非相邻碳原子连接起来形成的桥环结构。本发明所述的螺环是指由两个或两个以上环状结构彼此共用一个碳原子连接起来形成的螺环结构。
本发明所述的“6-14元稠杂环基”，是指两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子(即共用一个键)连接起来形成的至少含有一个杂原子的6-14个环原子的稠环结构，包括例如“6-11元稠杂环基”、“6-10元稠杂环基”、“7-10元稠杂环基”、“9-10元稠杂环基”、“6-10元含氮稠杂环基”等。具体实例包括但不仅限于：3-氮杂双环[3.1.0]己烷、3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷、3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷、3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷、八氢吡咯并[3，4-c]吡咯、八氢吡咯并[3，4-b]吡咯、八氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪、八氢-1H-吡咯并[3，4-c]吡啶、八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶、八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪、十氢-2，6-萘、四氢咪唑并[4，5-c]吡啶基、3，4-二氢喹唑啉基、1，2-二氢喹喔啉基、苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯基、1，3-二氢异苯并呋喃基、2H-色原烯基、2H-色原烯-2-酮基、4H-色烯基、4H-色烯-4-酮基、色满基、4H-1，3-苯并噁 嗪基、4，6-二氢-1H-呋喃并[3，4-d]咪唑基、3a，4，6，6a-四氢-1H-呋喃并[3，4-d]咪唑基、4，6-二氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑基、4，6-二氢-1H-吡咯并[3，4-d]咪唑基、4，5，6，7-四氢-1H-苯并[d]咪唑基等。
本发明所述的“5-8元杂芳基”，包括例如“5-7元杂芳基”、“5-6元杂芳基”等。具体实例包括但不仅限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-***基、1，2，4-***基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮、4-吡啶酮、嘧啶基、1，4-二氧杂环己二烯基、2H-1，2-噁嗪基、4H-1，2-噁嗪基、6H-1，2-噁嗪基、4H-1，3-噁嗪基、6H-1，3-噁嗪基、4H-1，4-噁嗪基、哒嗪基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1，2，4，5-四嗪基、氮杂环庚三烯基、1，3-二氮杂环庚三烯基、氮杂环辛四烯基等，优选为“5～6元杂芳基”。
本发明所述的“6-14元稠杂芳基”，是指两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子(即共用一个键)连接起来形成的至少含有一个杂原子的6-14个环原子的、具有芳香性的稠环结构，包括例如“6-10元稠杂芳基”、“7-10元稠杂芳基”、“9-10元稠杂芳基”等。具体实例包括但不限于：苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并***基、喹啉基、2-喹啉酮、4-喹啉酮、1-异喹啉酮、异喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并哒嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、酚嗪基、喋啶基、嘌呤基、萘啶基、吩嗪、吩噻嗪等。
本发明所述的“6-12元桥杂环基”，是指任意两个环共用两个不相邻的原子形成的至少含有一个杂原子的6-12个环原子的桥环结构，所述的杂原子选自N、S、O、CO、SO和/或SO2等。其中包括例如“6-11元桥杂环基”、“6-9元桥杂环基”、“7-10元桥杂环基”、“7-9元桥杂环基”、“7-9元含氮桥杂环基”、“7-8元桥杂环基”、“8元桥杂环基”、“8元含氮桥杂环基”等。其实例包括但不限于：
Figure PCTCN2014095615-appb-000016
Figure PCTCN2014095615-appb-000017
Figure PCTCN2014095615-appb-000018
等。
本发明所述的“6-12元螺杂环基”，是指至少有两个环共享一个原子形成的至少含有一个杂原子的6-12个环原子的螺环结构，所述的杂原子选自N、S、O、CO、SO和/或SO2等。其中包括例如“6-11元螺杂环基”、“7-11元螺杂环基”、“7-11元含氮螺杂环基”、“7-10元螺杂 环基”、“7-9元螺杂环基”、“7-8元螺杂环基”等。其实例包括但不仅限于：
Figure PCTCN2014095615-appb-000019
Figure PCTCN2014095615-appb-000020
Figure PCTCN2014095615-appb-000021
等。
本发明还提供了式(I′)化合物的制备方法，其包括但不限于下述工艺路线(其中，各缩写所代表的定义如下：DCM：二氯甲烷；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；EA：乙酸乙酯；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；MeOH：甲醇；NBS：N-溴代丁二酰亚胺；PE：石油醚；THF：四氢呋哺；Xant-phos：4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽；x-phos：2-二环己基磷-2’，4’，6’-三异丙基联苯)：
Figure PCTCN2014095615-appb-000022
其中，R1、R2、R3、R4、R5、n、A1、A2如前文所述，X代表卤素，选自氟、氯、溴、碘；卤化试剂选自：I2、Br2。
具体的示例性步骤如下：
1、中间体1的制备
将原料1和有机碱溶于有机溶剂中，低温条件下缓慢滴加原料2，搅拌反应结束后，将反应混合物萃取，有机层干燥，浓缩后得中间体1，其中有机溶剂优选DCM或1，4-二氧六环，有机碱优选为三乙胺。
2、中间体2的制备
将中间体1、原料3和有机碱溶于有机溶剂中，滴加三氯氧磷，反应结束后，加入碱，将反应混合物调pH值为中性，萃取，分出有机相干燥，浓缩得中间体2，其中有机溶剂优选二氯甲烷或1，2-二氯乙烷，有机碱优选三乙胺。
3、中间体3的制备
将中间体2溶于有机溶剂中，加入叔丁醇钾，升温至100℃反应2小时，反应结束后，加水淬灭，将反应混合物萃取，有机相干燥，浓缩后残余物经柱层析得到中间体3，其中有机溶剂优选DCM。
4、中间体4的制备
将中间体3和频哪醇硼酸酯溶于有机溶剂中，加入醋酸钯，三环己基磷和醋酸钾，氮气保护下，加热反应。反应结束后，加入水和有机溶剂萃取，有机层干燥，浓缩，经柱层析分离得中间体4，其中有机溶剂优选DMF或1，4-二氧六环。
5、中间体5的制备
将原料4和中间体4溶于有机溶剂中，加入无机碱和四(三苯基膦)钯，氮气保护下加热至反应结束，加水，将反应混合物萃取，有机相干燥，浓缩，经柱层析分离得中间体5，其中有机溶剂优选1，4二氧六环或者DMF。
6、中间体6的制备
将原料5溶于有机溶剂中，加入过氧化苯甲酰和NBS加热至反应结束，过滤，滤液浓缩，残余物经柱层析分离得中间体6，其中有机溶剂优选四氯化碳。
7、中间体7的制备
将中间体6和原料6溶于有机溶剂中，加入无机碱室温反应，至反应结束，过滤，滤液浓缩，残余物经柱层析分离得中间体7，其中有机溶剂优选乙腈。
8、式(I′)化合物的制备
将中间体5和中间体7溶于有机溶剂中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯、2-二环己基磷-2’，4’，6’-三异丙基联苯、碳酸铯、氮气保护下加热反应。反应结束后，加入水，将反应混 合物萃取，有机相干燥，残余物经柱层析分离得式(I′)化合物，其中有机溶剂优选1，4二氧六环或者DMF。
其中，原料6为伯胺或者仲胺等。
本发明式(I′)或式(I)所示化合物的“药学上可接受的盐”是指式(I′)或式(I)化合物中存在的酸性官能团(例如-COOH、-OH、-SO3H等)与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，包括与碱金属或碱土金属形成的盐、铵盐，以及与含氮有机碱形成的盐；以及式(I′)或式(I)化合物中存在的碱性官能团(例如-NH2等)与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，包括与无机酸、与有机羧酸。
本发明式(I′)或式(I)所示化合物的“酯”是指，当式(I′)或式(I)化合物存在羧基时，其与醇发生酯化反应而形成的酯；当式(I′)或式(I)化合物存在羟基时，其与有机酸、无机酸、有机酸盐等发生酯化反应而形成的酯。酯在酸或者碱存在的条件下，可以发生水解反应生成相应的酸或醇。
本发明式(I′)或式(I)所示化合物的“溶剂化物”是指其与溶剂分子缔合形成的物质。所述溶剂可以是有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等)、水等。例如本发明式(I′)或式(I)化合物可以与乙醇形成乙醇化物，与水形成水合物。
本发明化合物的“立体异构”分为构象和构型异构，而构型异构还分为顺反异构和旋光异构。构象异构是指具有一定构型的有机物分子由于碳、碳单键的旋转或扭曲而使得分子各原子或原子团在空间产生不同的排列方式的一种立体异构现象，常见的有烷烃和环烷烃类化合物的结构，如环己烷结构中出现的椅式构象和船式构象。“立体异构体”，指当本发明化合物含有一个或多个不对称中心，因而可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单一非对映异构体。本发明化合物有不对称中心，这类不对称中心各自会独立地产生两个光学异构体，本发明的范围包括所有可能的光学异构体和非对映异构体混合物和纯的或部分纯的化合物。本发明所述的化合物若含有烯烃双键，除非特别说明，本发明包括顺式异构体和反式异构体。本发明所述的化合物可以以互变异构体形式存在，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点。例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。各互变异构体及其混合物都包括在本发明的化合物中。所有式(I′)或式(I)化合物的对映异构体、非对映异构体、消旋异构体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物，均包括在本发明范围中。
本发明进一步要求保护包括式(I′)或式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体以及任选的一种或多种药用载体的药物组合物。所述药物组 合物可以制成药学上可接受的任一剂型。所述药物组合物还可以以任何合适的给药方式，例如口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。用于口服给药时，所述药物组合物可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，所述药物组合物可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，所述药物组合物可制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物组合物可制成吸入剂或喷雾剂等。
除了式(I′)或式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体外，本发明的药物组合物还可包括一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂。所述的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂，包括但不限于甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素或氨鲁米特。
本发明还提供了本发明式(I′)或式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体或者本发明的药物组合物在制备用于治疗和/或预防受试者中由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病的药物中的用途。在一个优选的实施方案中，所述癌症相关的疾病选自脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
在本发明中，受试者或者患者可以是任何动物，优选地哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。其中，特别优选的受试者为人。
本发明还提供了治疗和/或预防由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病的方法，其包括将治 疗和/或预防有效量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体或者本发明的药物组合物施用给有此需要的受试者。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止己患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如上文所详细论述的，本发明的化合物或药物组合物可以以任何合适的施用方式、任何合适的剂型施用给有此需要的受试者。例如，本发明的化合物或药物组合物可以以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要受试者。本发明的化合物或药物组合物可以为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、栓剂、吸入剂或喷雾剂。
此外，本发明方法可以用于各种受试者，优选地哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。其中，特别优选的受试者为人。
此外，如上文所详细论述的，本发明方法可以用于治疗和/或预防各种由CDK4/6激酶介导的癌症相关疾病，包括但不限于脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
此外，除了式(I′)或式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体外，本发明方法还可以包括，给所述受试者施用一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂。换言之，在本发明的方法中，可以将本发明化合物与一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂联合使用。
在一个优选的实施方案中，所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、 紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。在一个优选的实施方案中，本发明化合物与所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂可以以任何顺序施用。例如，所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂可以在施用本发明化合物之前、同时或者之后给所述受试者施用。
本发明还提供了式(I′)或式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体用于制备制剂的用途，所述制剂用于降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。在一个优选的实施方案中，所述制剂用于体内或者体外施用。例如，所述制剂可被施用至受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内，以降低或抑制受试者体内细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性；或者，所述制剂可被施用至体外细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如癌症细胞)，以降低或抑制体外细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性。在一个优选的实施方案中，所述细胞选自脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子***细胞、子宫内膜癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、***癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、***肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。
本发明还提供了降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性的方法，其包括给所述细胞施用有效量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体。在一个优选的实施方案中，所述方法用于体内，例如所述细胞是受试者(例如哺乳动物；例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人)体内的细胞；或者，所述方法用于体外，例如所述细胞是体外的细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞例如癌症细胞)。在一个优选的实施方案中，所述细胞选自脑瘤细胞、肺癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、腹膜癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、子***细胞、子宫内膜癌细胞、直肠 癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、食管腺癌细胞、食管鳞状细胞癌细胞、***癌细胞、雌性生殖道癌细胞、原位癌细胞、淋巴瘤细胞、神经纤维瘤细胞、甲状腺癌细胞、骨癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、结肠癌细胞、睾丸癌细胞、胃肠道间质瘤细胞、***肿瘤细胞、肥大细胞肿瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞或肉瘤细胞。
本发明还提供了一种用于降低或抑制细胞中的CDK4和/或CDK6激酶活性的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，且任选地还包括使用说明。
发明的有益技术效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)本发明式(I′)或式(I)化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体具有优异的CDK4/6激酶抑制活性；
(2)本发明式(I′)或式(I)化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体显示出良好的生物稳定性，作用更持久，生物利用度高。
(3)本发明式(I′)或式(I)化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体显示出良好的血脑屏障通过性，为CDK抑制剂作为脑癌的治疗提供了可能性。
(4)本发明式(I′)或式(I)化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体显示出较低的毒性，耐药性好，安全性高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本发明的基本思想和范围。
实验方案
以下提供本发明的部分化合物的示例性实验方案，以显示本发明化合物的有利活性和有益技术效果。但是应当理解，下述实验方案仅仅是对本发明内容的示例，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员在本说明书的教导下，能够对本发明的技术方案进行适当的修改或改变，而不背离本发明的精神和范围。
实验例1：本发明化合物的体外酶学活性实验
测试物：本发明的化合物1、13、14，其化学名称、结构式和制备方法见各个化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，其结构式见背景技术部分，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)。
下述实验中的缩写所代表的含义如下：
Figure PCTCN2014095615-appb-000023
实验方法：采用Caliper Mobility Shift方法进行CDK4/6激酶的抑制活性测定
1.1倍激酶缓冲液的配制：
1)1倍CDK4激酶缓冲液的配制
分别取800μL母液浓度为1000mM的pH7.5的HEPES、40μL母液浓度为10％的Triton X-100，加入到39160μL的超纯水中，混匀。
2)1倍CDK6激酶缓冲液的配制
分别取50mL母液浓度为1000mM的pH7.5的HEPES、50μL母液浓度为30％的Brij-35，加入到949.95mL的超纯水中，混匀。
2.终止液的配制
分别取25mL母液浓度为4％的包被液Coating Reagent#3(Caliper仪器所使用的12-sipper chip中自带)、50mL母液浓度为1000mM pH7.5的HEPES、50mL母液浓度为0.5M的EDTA、0.25mL母液浓度为30％的Brij-35，加入到374.75mL的超纯水中，混匀。
3.2.5倍激酶溶液的配制
1)2.5倍CDK4/D3激酶溶液的配制
分别取7μL CDK4/D3酶溶液、9μL母液浓度为1M的DTT，加入到1784μL 1倍CDK4激酶缓冲液中，混匀。
2)2.5倍CDK6/D3激酶溶液的配制
分别取18μL CDK6/D3酶溶液、14μL母液浓度为1M的DTT，加入到2768μL 1倍CDK6激酶缓冲液中，混匀。
4.2.5倍多肽溶液的配制
1)2.5倍CDK4/D3多肽溶液的配制
分别取10μL母液浓度为100mM的ATP溶液、45μL母液浓度为1M的MgCl2，45μL FAM标记的多肽8，加入到1700μL 1倍CDK4激酶缓冲液，混匀。
2)2.5倍CDK6/D3多肽溶液的配制
分别取23μL母液浓度为100mM的ATP溶液、75μL母液浓度为1M的MgCl2，75μLFAM标记的多肽8，加入到2827μL 1倍CDK6激酶缓冲液，混匀。
5.5倍测试物溶液配制：
取10mM测试物的DMSO储备液，用DMSO稀释制成浓度为50μM的溶液，作为母液。用DMSO将上述母液四倍逐级稀释制成12.5μM，3.125μM，0.78μM，0.195μM，0.0488μM，12.2nM，3nM，0.76nM，0.19nM的溶液，然后每个浓度分别用1倍激酶缓冲液稀释10倍，制成5倍化合物溶液。
6.CDK4/6酶学反应：
1)384孔板中相对应的孔中分别加入5μL配制好的5倍测试物溶液、10μL配制好的2.5倍激酶溶液，室温孵育10分钟。
2)相对应的孔中再分别加入10μL配制好的2.5倍多肽溶液，启动酶反应，28℃孵育5小时。
7.酶学检测：
每个相对应的孔中分别加入25μL终止液，终止反应。
8.Caliper仪器读取数据，并通过下式计算抑制率，然后采用GraphPad5.0软件进行曲线拟合，得出IC50值。
抑制率＝(最大值-样本值)/(最大值-最小值)×100，
其中，最大值：不加测试物的阳性对照；最小值：不加酶的阴性对照。
实验结果示于表1中：
表1：本发明化合物的体外酶学抑制活性
Figure PCTCN2014095615-appb-000024
Figure PCTCN2014095615-appb-000025
实验结论：由表1可知，本发明化合物对CDK4和CDK6激酶的抑制活性与对照药相当，显示出足够的抑制活性。
实验例2：本发明化合物的体外细胞学抑制活性
测试物：本发明的化合物，其化学名称和制备方法见各个化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，其结构式见背景技术部分，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)。
下述实验中的缩写所代表的含义如下：
Figure PCTCN2014095615-appb-000026
实验方法：采用BrdU方法(BrdU细胞增殖试验试剂盒，Cell Signaling Technology公司)进行细胞增殖检测
1.试剂和化合物配制
1倍洗液配制：
将母液浓度为20倍的洗液用超纯水稀释成1倍洗液。
1倍检测抗体溶液配制：
将母液浓度为100倍的BrdU检测抗体用检测抗体稀释液稀释成1倍检测抗体溶液。
1倍HRP标记的二抗溶液配制：
将母液浓度为100倍的抗小鼠IgG，HRP标记抗体用HRP标记抗体稀释液稀释成1倍HRP标记的二抗溶液。
10倍BrdU溶液：
将母液浓度为1000倍的BrdU溶液用细胞对应的培养基稀释成10倍BrdU溶液。
配制测试化合物：
配制测试化合物母液：用100％DMSO配制成10mM的母液。
配制测试化合物梯度稀释溶液：取10mM的测试化合物母液用DMSO 4倍连续梯度稀释，浓度分别为2.5mM，625μM，156μM，39μM，9.8μM，2.5μM。分别取2μL的DMSO稀释的化合物加到198μL含10％FBS的培养液中配制成10倍测试物，测试物最高浓度为100μM，DMSO浓度为1％，共7个浓度梯度。
培养基配制：
MDA-MB-435S培养基：L-15+10％FBS+0.01mg/mL胰岛素
MCF-7培养基：DMEM+10％FBS+0.01mg/mL胰岛素
U87MG培养基：MEM+10％FBS
2.试验步骤
(1)胰酶消化生长至80％的细胞(对数生长期)，离心收集细胞。用不含FBS的培养基重悬MDA-MB-435S和U87MG细胞，计数并调整接种96孔板，MDA-MB-435S细胞接种3000个/孔/81μL，U87MG细胞接种4000个/孔/81μL；用含1％FBS的培养基重悬MCF-7细胞，计数并调整接种96孔板，接种4000个/孔/82μL，置于37℃细胞培养箱中培养；
(2)培养24小时后MDA-MB-435S和U87MG细胞每孔添加FBS(9μL)，MCF-7细胞每孔添加8μL FBS，使FBS终浓度为10％；
(3)每孔加入不同浓度的10倍测试物(10μL)，使测试物终浓度分别为10μM，2.5μM，625nM，156nM，39nM，9.8nM，2.5nM，3复孔/组，37℃培养72小时；
溶剂对照：0.1％DMSO
空白对照：只加培养基，没有细胞
正常细胞对照：没有任何处理的正常细胞
(4)每孔加入10倍BrdU溶液(10μL)，细胞培养箱中孵育4小时后弃去培养基；
(5)每孔加入固定/变性液(10μL)，室温孵育30分钟，弃去溶液；
(6)每孔加入1倍检测抗体溶液(100μL)，室温孵育1小时，弃去溶液，用1倍洗液200μL/孔洗3次；
(7)每孔加入1倍HRP标记的二抗溶液(100μL)，室温孵育30分钟，弃去溶液，用1倍洗液200μL/孔洗3次；
(8)每孔加入TMB底物溶液(100μL)，室温孵育30分钟；
(9)每孔加入终止液(100μL)，酶标仪450nm检测OD值。
3.数据处理
1)细胞存活率(％)＝(OD测试物-OD空白对照)/(OD正常细胞对照-OD空白对照)×100％，
OD空白对照：空白对照值，OD正常细胞对照：正常细胞对照值；
2)数据使用GraphPad Prism 5软件作图，得到曲线及IC50值。
实验结果示于表2中。
表2：本发明化合物的体外细胞学活性
Figure PCTCN2014095615-appb-000027
实验结论：由表2数据可知，本发明化合物对于体外细胞具有很高的抑制活性，且明显优于LY2835219。
实验例3：本发明化合物的裸鼠体内药代动力学实验
供试品：本发明部分化合物，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
对照药LY2835219，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)，其结构式如背景技术所述。
受试动物：雌性裸鼠(BALB/c)，对照药：3只/给药途径时间点，体重22-25g/只；化合物1：3只/给药途径时间点，体重22-25g/只；化合物6-1：6只/给药途径/供试品，体重18-26g/只。
供试品溶液制备：
空白溶媒1的配制
称取MC(甲基纤维素)(500mg)和SDS(十二烷基硫酸钠)(100mg)，混匀，加入水(100mL)，研磨，涡旋混匀，得0.5％MC+0.1％SDS的溶液。
空白溶媒2的配制
pH 5.0 buffer的配制：称取二水合磷酸二氢钠(1.56g)，加入纯化水配成50mL溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至5.0。
空白溶媒3的配制
0.1％吐温80+2％HPC：称取HPC(羟丙基纤维素)(20g)，缓慢加入搅拌着的纯化水(1000mL)中，再加入吐温80(1mL)，搅拌至澄清。
对照药：
①称取对照药(12.18mg)，加入生理盐水(9.529mL)，超声溶解，涡旋混匀，配制成浓度 为1mg/mL的无色透明溶液1，此溶液作为对照药裸鼠IV给药药液1；
②称取对照药(13.12mg)，加入空白溶媒1(10.265mL)，研磨，混悬均匀，配制成浓度为1mg/mL的均质溶液2，此溶液作为对照药裸鼠PO给药药液2。
化合物1：
①称取化合物1(5.79mg)，加入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)(0.556mL)，超声溶解，再加入生理盐水(4.999mL)，涡旋混匀，得澄清溶液，此溶液作为化合物1裸鼠IV给药药液1；
②称取化合物1(12.20mg)，加入空白溶媒1(11.706mL)，研磨，混悬均匀，配制成浓度为1mg/mL的均质溶液，此溶液作为化合物1裸鼠PO给药药液2。
③称取化合物1(84.63mg)，加入空白溶媒1(8.120mL)，研磨，混悬均匀，配制成浓度为10mg/mL的均质溶液，此溶液作为化合物1裸鼠PO给药药液3。
化合物6-1：
①取化合物6-1(2.01mg)加入空白溶媒2(3.928mL)，超声溶解，涡旋混匀，配制成浓度为0.5mg/mL的均质溶液，此溶液作为化合物6-1裸鼠IV给药药液1；
②称取化合物6-1(5.11mg)加入空白溶媒3(4.951mL)置于组织研磨器中，1000转/分钟的转速研磨均匀，将研磨液转移入离心管中，涡旋混匀，配制成浓度为1mg/mL的均质溶液，此溶液作为化合物6-1裸鼠PO 10mg/kg给药药液2。
③称取化合物6-1(51.10mg)加入空白溶媒3(1.496mL)置于组织研磨器中，1000转/分钟的转速研磨均匀，将研磨液转移入离心管中，再加入上述溶媒(1mL)清洗组织研磨器，将清洗液转移入离心管中，涡旋混匀，配制成浓度为20mg/mL的均质溶液，此溶液作为化合物6-1裸鼠PO 200mg/kg给药药液3。
实验方法
给药：
将供试品药液按照下表方法给药：
Figure PCTCN2014095615-appb-000028
Figure PCTCN2014095615-appb-000029
采血：
采集时间点：
对照药/化合物1，IV给药组：给药前、给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、30h；PO给药10mg/kg组：给药前、给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30h。
化合物1，PO给药100mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48h。
化合物6-1的IV给药2.5mg/kg组、PO给药10mg/kg组：给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h；化合物6-1的PO给药100mg/kg组：0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48h。
对照药/化合物1每个时间点通过眼内眦采集300μL全血，高速离心机中8000转/分钟离心6min分离血浆，血浆于-80℃冰箱冻存。化合物6-1每个时间点通过眼内龇采集60μL全血，血液采集后放置到含有K2EDTA抗凝剂的抗凝管中，血液样品在8000转/分钟离心6分钟得到血浆样品。
血浆样品分析
对照药与化合物1的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法：取血浆50μL，加入内标(含华法林500ng/mL的乙腈溶液)200μL，1500转/分钟涡旋3min，然后13000转/分钟离心5min，取上清液100μL，再加入400μL水，涡旋混匀，LC-MS/MS分析。
化合物6-1的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法，取适量血浆，加入一定体积内标溶液，涡旋离心，取上清液，加入一定体积的水稀释，涡旋混匀，LC-MS/MS进样分析。
表3-1：裸鼠PK评价结果(IV)
Figure PCTCN2014095615-appb-000030
表3-2：裸鼠PK评价结果(PO)
Figure PCTCN2014095615-appb-000031
AUClast代表药时曲线下面积0→t
CL代表清除率
Vss表示稳态表观分布容积
Tmax代表血药浓度达峰时间
Cmax代表血药浓度达峰浓度
F％代表绝对生物利用度
由表3-1和表3-2的实验结果可知，与同等剂量的对照药相比，本发明化合物的药代动力学性质良好，尤其是暴露量和生物利用度均高于对照药，且高剂量组生物利用度接近100％。
实验例4：本发明化合物的大鼠体内线性药代动力学实验
供试品：本发明化合物1，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)，其结构式如背景技术所述。
受试动物：雄性SD大鼠，3只/给药剂量/供试品，体重200-240g/只。
供试品溶液制备：
溶媒pH 4.0buffer的配制方法：取枸橼酸(21g)，加水溶解，定量至1000mL得甲液，保存备用；取磷酸氢二钠(71.63g)，加水溶解，定量至1000mL，得乙液，保存备用。取上述甲液(614.5mL)与乙液(385.5mL)混合，摇匀，即得。
对于对照药：
①用溶媒pH 4.0buffer作为溶剂配制对照药LY2835219浓度为1.5mg/mL的溶液1；
②用溶媒pH 4.0buffer作为溶剂配制对照药LY2835219浓度为4.5mg/mL的溶液2；
③用溶媒pH 4.0buffer作为溶剂配制对照药LY2835219浓度为13.5mg/mL的溶液3。
上述溶液1-3分别作为对照药LY2835219PO 15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg的给药药 液；
对于化合物1：
①用溶媒pH 4.0buffer作为溶剂配制化合物1的浓度为13.5mg/mL的溶液4；
②取上述均质溶液4(4mL)，用溶媒pH 4.0buffer作为稀释配制化合物1的浓度为4.5mg/mL的溶液5；
③取上述均质溶液4(1.4mL)，用溶媒pH 4.0buffer作为稀释配制化合物1的浓度为1.5mg/mL的溶液6。
上述溶液4-6分别作为化合物1PO 15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg的给药药液。
实验方法
给药：
将供试品药液按照下表方法进行给药：
Figure PCTCN2014095615-appb-000032
采血：
对于对照药：
采集时间点：PO 15mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48h。PO 45mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48、56、72h。PO 135mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48、56、72、96、102h。
对于化合物1：
采集时间点：PO 15mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48h。PO 45mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48h。PO 135mg/kg组：给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、24、30、48、56、72、96h。
每个时间点通过尾静脉采取100μL左右全血，加入到K2EDTA抗凝管里，高速离心机中 8000转/分钟离心6min分离血浆，血浆于-80℃冰箱冻存。
血浆样品分析
对照药和化合物1的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法：取30μL血浆，加入200μL内标(含PD0332991，结构式为
Figure PCTCN2014095615-appb-000033
参考专利CN101001857A制备方法制备，50ng/mL的乙腈溶液)，1500转/分钟涡旋10min，然后4000转/分钟离心20min，取上清液100μL，再加入100μL水，涡旋混匀，然后进行LC-MS/MS分析。
表4-1：对照药大鼠PK评价结果(PO)
Figure PCTCN2014095615-appb-000034
表4-2：化合物1大鼠PK评价结果(PO)
Figure PCTCN2014095615-appb-000035
Tmax代表血药浓度达峰时间
Cmax代表血药浓度达峰浓度
AUClast代表药时曲线下面积0→t
由表4-1和表4-2的实验结果可知，与对照药相比，同等剂量下，本发明化合物Cmax、AUClast均高于对照药，并且随着剂量增加，AUClast成线性增加，本发明化合物1的线性药代动力学性质良好。
实验例5本发明化合物对人源结肠癌细胞Colo-205在BALB/c裸小鼠皮下肿瘤模型上的药效学和药物安全性评价
供试品：本发明化合物1，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)，其结构式如背景技术所述。
下述实验中的缩写所代表的含义如下：
Figure PCTCN2014095615-appb-000036
受试动物：雌性裸鼠(BALB/c)，8只/剂量组/供试品，体重19-27g/只。
供试品溶液制备：
含0.5％MC和0.1％SDS的空白溶媒的配制方法：称取MC(2g)，加入超纯水(350mL)溶解，再加入SDS(0.4g)，定容至400mL，充分混匀，0.22μm滤器过滤除菌，4℃分装保存，得空白溶媒溶液。
称取对照药(32mg)，加入溶媒(2.5mL)，涡旋混匀，得浓度为10mg/mL的对照药均质溶液1；取对照药均质溶液1(0.5mL)，加入溶媒(1.5mL)，涡旋混匀，得浓度为2.5mg/mL的对照药均质溶液2。
称取化合物1(6.3mg)，加入溶媒(2.4mL)，涡旋混匀，得浓度为2.5mg/mL的化合物1的均质溶液1；取化合物1(12.6mg)，加入溶媒(2.4mL)，涡旋混匀，得浓度为5mg/mL的化合物1的均质溶液2；取化合物1(25.2mg)，加入溶媒(2.4mL)，涡旋混匀，得浓度为10mg/mL的化合物1的均质溶液3。以上所有对照药和化合物1的均质溶液每日给药前配制，并避光保存。
实验方法
细胞培养：
用含有灭活的10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养COLO205癌细胞。细胞培养起始浓度为5×105个/mL，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代。将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤接种。
细胞接种和分组：
PBS重悬的COLO205肿瘤细胞1×107个/0.1mL接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，在 肿瘤生长到800mm3至1000mm3时处死动物，在无菌条件下，剥离肿瘤，剔除坏死的组织，选择生长良好的肿瘤组织，分离肿瘤细胞进行原代培养并扩增，然后再接种到动物皮下。如此将肿瘤细胞在小鼠体内进行两次传代，将获得的原代培养细胞接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，每只动物接种5×106个/0.1mL。肿瘤长至100mm3左右时分组给药。口服给药，给药体积按动物体重为0.1mL/10g。
给药：
将供试品药液按照下表方法进行给药：
Figure PCTCN2014095615-appb-000037
采血：采血方式为眼内眦采血。对照药和化合物1末次给药后(第22天)采血/肿瘤时间点设计相同，每个剂量组的8只裸鼠分成A、B两组：
A组(编号1-4)：15min、1h、2h，每只小鼠采完2h血样后，处死；
B组(编号5-8)：4h、8h、24h，每只小鼠采完24h血样后，处死；
每个时间点采取100μL左右全血加入到K2EDTA抗凝管里，高速离心机中4500转/分钟、4℃下离心5min分离血浆，血浆于-80℃冰箱冻存。
血浆样品分析
对照药和化合物1的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法：取50μL血浆，加入内标150μL(含***50ng/mL的乙腈溶液)，1500转/分钟涡旋3min，然后4000转/分钟离心20min，取上清液100μL，再加入100μL水，涡旋混匀，然后进行LC-MS/MS分析。
表5-1：对照药裸鼠PK评价结果
Figure PCTCN2014095615-appb-000038
表5-2：化合物1裸鼠PK评价结果
Figure PCTCN2014095615-appb-000039
AUClast代表药时曲线下面积0→t
Tmax代表血药浓度达峰时间
Cmax代表血药浓度达峰浓度
由表5-1和表5-2的实验结果可知，与对照药相比，本发明化合物1的药代动力学性质良好；同等剂量时，化合物1的暴露量AUClast以及Cmax均明显高于对照药。
实验例6：本发明化合物的大鼠血脑屏障通透性评价体内实验
供试品：本发明化合物1，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)，其结构式如背景技术所述。
受试动物：雄性SD大鼠，3只/供试品/时间点，体重250-300g/只。
供试品溶液制备：
溶媒的配制：0.5％MC(甲基纤维素)+0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，称取MC(500mg)和SDS(100mg)，混匀，加入水(100mL)，研磨，涡旋混匀。
称取对照药(108.22mg)，加入溶媒(36.07mL)，研磨，使混悬均匀，即得均质溶液1。此溶液作为对照药LY2835219大鼠PO给药药液。
称取化合物1(111.52mg)，加入溶媒(35.39mL)，研磨，使混悬均匀，即得均质溶液2。此溶液作为化合物1大鼠PO给药药液。
实验方法
给药：
将供试品药液按照下表方法分别进行给药：
Figure PCTCN2014095615-appb-000040
采样方案：
对于对照药和化合物1，PO分别给药后分别在2、4、24、48h进行心脏穿刺采血，采集全血约8mL，置含有K2EDTA为抗凝剂的离心管中，同时采集脑脊液及脑组织，每个时间点3只。全血样品采出后高速离心机中3000转/分钟，4℃下离心10min分离血浆，血浆于-80℃冰箱冻存。样品采集完毕后，分别测定血浆、脑组织、脑脊液中的对照药和化合物1的浓度。
血浆样品分析
对照药和化合物1给药组的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法：从冰箱中取出待测样品(-80℃)，室温自然融化后涡旋3min，取血浆30μL，加入内标(含PD0332991，25ng/mL的乙腈溶液)200μL，1500转/分钟涡旋10min，然后4000转/分钟离心20min，取上清液(100μL)，再加入水(100μL)，涡旋混匀，然后进行LC-MS/MS分析。
脑组织和脑脊液样品分析
对照药和化合物1给药组的脑组织样品和脑脊液样品分析均采用蛋白沉淀法：从冰箱中取出待测样品(-80℃)，室温自然融化后涡旋3min，取匀浆后的脑组织样品(20μL)，加入200μL内标(含右美沙芬40ng/mL和去甲右美沙芬50ng/mL的甲醇∶水＝1∶1的溶液)，1500转/分钟涡旋3min，然后4000g、4℃下离心5min，取上清液(100μL)，再加入0.1％甲酸-水(50μL)，涡旋混匀，然后进行LC-MS/MS分析。脑脊液的处理方式同匀浆后的脑组织样品的处理方式。
表6：本发明化合物1的大鼠血脑屏障通透性评价实验结果
Figure PCTCN2014095615-appb-000041
AUClast代表药时曲线下面积0→t
Tmax代表血药浓度达峰时间
Cmax代表血药浓度达峰浓度
由表6的实验结果可知，与对照药相比，本发明化合物在大鼠血脑屏障通透性评价实验 中可以有效地由血浆进入脑组织中，并且在脑脊液中药物的暴露量明显高于对照药LY2835219。
实验例7：本发明化合物在人脑胶质瘤细胞U-87MG在BALB/c裸小鼠皮下肿瘤模型中的药效学和药物安全性评价
供试品：本发明化合物，自制，其化学名称和制备方法见各化合物的制备实施例。
对照药：LY2835219，自制(参考专利CN102264725A制备方法制备)，其结构式如背景技术所述。
下述实验中的缩写所代表的含义如下：
Figure PCTCN2014095615-appb-000042
受试动物：雌性裸鼠(BALB/c)，10只/剂量组/供试品，体重18-22g/只。
供试品溶液制备：
含0.5％MC的溶媒配制：取MC适量，加入一定体积的超纯水，溶解，充分混匀，即得MC含量为0.5％的溶媒1；
含0.5％MC和0.1％SDS的溶媒配制：分别称取MC、SDS适量，加入一定体积的超纯水，溶解，充分混匀，即得MC含量为0.5％、SDS含量为0.1％的溶媒2；
取对照药(508.87mg)和SDS(39.37mg)，用溶媒1(39.37mL)进行稀释，研磨均匀，得浓度为10.1mg/mL的对照药均质溶液1；取对照药均质溶液1(13.125mL)，加入溶媒2(13.125mL)，研磨均匀，得浓度为5.0mg/mL的对照药均质溶液2。
取化合物1(931.77mg)和SDS(45.9mg)，用溶媒1(45.9mL)进行稀释，研磨均匀，得浓度为20.0mg/mL的化合物1均质溶液1；取化合物1(20.0mg/mL)的均质溶液(19.69mL)，加入溶媒2(19.69mL)，研磨均匀，得浓度为10.0mg/mL的化合物1均质溶液2；取化合物1(10.0mg/mL)的均质溶液(13.125mL)，加入溶媒2(13.125mL)，研磨均匀，得浓度为5.0mg/mL的化合物1均质溶液3。
实验方法
细胞培养：
将来源于ATCC的U87MG细胞培养于含10％胎牛血清的MEM培养基中，细胞按照常规方法使用含有EDTA的胰蛋白酶进行消化，每周传代两次，放置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
细胞接种和分组：
收集对数生长期肿瘤细胞，用PBS和基质胶按照1∶1比例调整U87MG细胞浓度为5×107/mL，用1mL注射器将0.1mL细胞悬液接种于每只小鼠右侧靠近背部皮下。观察和测量肿瘤体积，U87MG平均肿瘤体积在接种后8天达到约200mm3，然后对肿瘤细胞荷瘤鼠进行分组和给药，给药方式为口服给药，给药体积按动物体重为0.1mL/10g。
给药：
将供试品药液按照下表方法进行给药：
Figure PCTCN2014095615-appb-000043
采血：采血方式为眼内眦采血。对照药和化合物1末次给药后(第22天)采血/肿瘤时间点设计相同，每个剂量组的10只裸鼠中，1只备用，其他9只分成A、B、C三组：
A组(编号1-3)：药前、1h、2h，每只小鼠采完2h血样后，处死；
B组(编号4-6)：15min、4h、6h，每只小鼠采完6h血样后，处死；
C组(编号7-9)：30min、10h、24h，每只小鼠采完24h血样后，处死；
每个时间点采取约300μL全血，加入到含有K2EDTA的抗凝管中，高速离心机中8000转/分钟离心6min分离血浆，血浆于-80℃冰箱冻存。
血浆样品分析
对照药和化合物1的血浆样品分析均采用蛋白沉淀法：取30μL血浆至方型96深孔板中，加入200μL内标(PD0332991)的乙腈溶液(25ng/mL)，1500转/分钟涡旋3min，然后4000转/分钟离心20min，取上清液100μL，再加入100μL水，涡旋混匀，LC-MS/MS分析。
表7-1：对照药裸鼠PK评价结果
Figure PCTCN2014095615-appb-000044
Figure PCTCN2014095615-appb-000045
表7-2：化合物1裸鼠PK评价结果
Figure PCTCN2014095615-appb-000046
AUClast代表药时曲线下面积0→t
Tmzx代表血药浓度达峰时间
Cmax代表血药浓度达峰浓度
由表7-1和表7-2的实验结果可知，与对照药相比，本发明化合物的药代动力学性质良好；在同等剂量时，化合物1的暴露量以及Cmax均高于阳对药。
制备方案
以下提供本发明的部分化合物的示例性制备方案。但是应当理解，下述制备方案仅仅是对本发明内容的示例，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员在本说明书的教导下，能够对本发明的技术方案进行适当的修改或改变，而不背离本发明的精神和范围。
制备例1：5-(溴甲基)-2-氯嘧啶的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000047
将2-氯-5-甲基嘧啶(12.86g，0.1mol)溶于四氯化碳(300mL)中，搅拌条件下加入N-溴代丁二酰亚胺(25.72g，0.14mol)和过氧化苯甲酰(1.29g，5mmol)，油浴加热至回流，反应8h后降至室温，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得标题化合物(8.7g，产率42％)。
制备例2：2，5-二氟-4-碘吡啶的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000048
量取二异丙胺(17mL，122mmol)加入到四氢呋喃(220mL)中，降温至-20℃，氮气保护 下缓慢加入正丁基锂(49mL，122.5mmol)，加料完毕后，-20℃搅拌0.5h，降温至-78℃，缓慢滴加2，5-二氟吡啶(13.3g，115mmol)的四氢呋喃溶液(30mL)后在该温度下搅拌4h。称取碘(32g，126mmol)溶于四氢呋喃(100mL)，-78℃下缓慢滴加到上述反应液中，滴加完毕后搅拌1h。加入水(10mL)和四氢呋喃(30mL)后升至室温，加入饱和硫代亚硫酸钠，分层得有机相，水相用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1)得标题化合物(13.5g，产率48％)。
制备例3：5-氟-4-碘吡啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000049
将2，5-二氟-4-碘吡啶(4.82g，20mmol)溶于二甲基亚砜(40mL)中，搅拌条件下加入氨水(40mL)，90℃封管条件下搅拌12h。加入乙酸乙酯(150mL)，分层得有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)得标题化合物(2.38g，产率50％)。
制备例4：N-异丙基乙酰胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000050
将异丙胺(5.0g，84.7mmol)和三乙胺(12.8g，126.7mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，降温至0℃，缓慢滴加乙酸酐(17.3g，169.4mmol)，滴加完毕后升至室温反应12小时。减压蒸馏除溶剂，剩余物加入乙酸乙酯(100mL)和碳酸钾(20g)，搅拌6小时后，抽滤，减压蒸馏除溶剂，得油状标题化合物(7.65g，产率89.5％)。
制备例5：(Z)-N′-(4-溴-2，6-二氟苯基)-N-异丙基乙脒的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000051
将4-溴-2，6-二氟苯胺(7.87g，37.9mmol))、N-异丙基乙酰胺(7.65g，75.7mmol)和三乙胺(5.7g，56.9mmol)溶于甲苯(150mL)中，缓慢滴加三氯氧磷(5.8g，37.9mmol)，滴加完毕后，加热回流反应3小时。然后，将反应混合物冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，加入二氯甲烷(200mL)，用饱和碳酸氢钠溶液(2×100mL)洗涤两次，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸馏，得固体标题化合物(7.3g，产率66.2％)。
制备例6：6-溴-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000052
将(Z)-N′-(4-溴-2，6-二氟苯基)-N-异丙基乙脒(7.0g，24.1mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(50mL)中，加入叔丁醇钾(3.2g，28.9mmol)，升温至100℃反应2小时，冷却至室温，加入二氯甲烷(100mL)和饱和食盐水(50mL)，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物，经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，得固体标题化合物(4.0g，产率61.3％)。
制备例7：4-氟-1-异丙基-2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-苯并[d]咪唑的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000053
将6-溴-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(9.0g，33.2mmol)、联硼酸频哪醇酯(12.65g，49.8mmol)，醋酸钯(840mg，3.75mmol)，三环己基磷(1.63g，5.8mmol)和醋酸钾(9.78g，99.8mmol)加入到二甲基亚砜(60mL)中，氮气保护下升温至80℃反应6h。加水(200mL)和乙酸乙酯(200mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)得标题化合物(6.0g，产率56.8％)。
制备例8：5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000054
将4-氟-1-异丙基-2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-苯并[d]咪唑(3.18g，10mmol)、5-氟-4-碘吡啶-2-胺(2.38g，10mmol)、碳酸钾(2.76g，20mmol)和四(三苯基膦)钯(1.15g，1mmol)加入到35mL微波管中，加入1，4-二氧六环(15mL)和水(3mL)，微波120℃反应1h。加水和乙酸乙酯，分液，得有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得标题化合物(2.1g，产率69.5％)。
制备例9：4-氟-6-(5-氟-2-碘吡啶-4-基)-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000055
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(1.0g，3.31mmol)溶于二 碘甲烷(30mL)中，加入碘化亚铜(0.63g，3.32mmol)、亚硝酸叔丁酯(0.341g，3.31mmol)和碘(0.84g，3.31mmol)，加热至85℃，反应15分钟，冷却后直接经硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝200∶1～1∶1)，得标题化合物(700mg，产率51.1％)。
制备例10：5-溴-2-氨基嘧啶的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000056
将2-氨基嘧啶(20.0g，0.21mol)溶于乙腈(500mL)中，加入N-溴代丁二酰亚胺(37.0g，0.21mol)，20℃搅拌4小时，抽滤，滤饼干燥，得到产物(33.0g，产率90.2％)。
制备例11：5-溴-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000057
将5-溴-2-氨基嘧啶(8.9g，51.15mmol)溶于四氢呋喃(150mL)中，冰浴下缓慢加入氢化钠(4.4g，110.0mmol，60％)，升至室温搅拌30分钟，加入4-甲氧基苄氯(20.0g，127.71mmol)，加热至75℃反应8h。加入冰水，淬灭反应，加入乙酸乙酯(200mL)萃取，水相用乙酸乙酯(50mL)洗涤，合并有机相，干燥，浓缩，经硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)，得标题化合物(10.0g，产率47.2％)。
制备例12：叔丁基4-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000058
将5-溴-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺(10.0g，24.1mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(8.97g，48.2mmol)、叔丁醇钠(4.63g，48.2mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(200mg)和1，1′-联萘-2，2′-双二苯瞵(400mg)加入到甲苯(200mL)中。氮气保护，80℃油浴中加热8小时，旋蒸除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得标题化合物(6.2g，产率49.6％)。
制备例13：5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000059
将叔丁基4-(2-(双(4-甲氧基苄基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(6.2g，11.9mmol)溶于二氯甲烷(30mL)和三氟乙酸(30mL)的混合溶液中，室温搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，加入少 量二氯甲烷，再次旋蒸除去溶剂，得粗产物(2.1g)。产物无需提纯，用于进行下一步。
制备例14：叔丁基4-(2-氨基嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000060
将5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(2.1g，11.7mmol)溶于二氯甲烷(25mL)中，加入三乙胺(1.77g，17.5mmol)，滴加二碳酸二叔丁酯(3.05g，14.0mmol)，加毕室温搅拌1小时，旋蒸除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得产物(1.52g，两步合计产率45.8％)。
制备例15：叔丁基4-(2-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000061
将4-(2-氨基嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(475mg，1.70mmol)、4-氟-6-(5-氟-2-碘吡啶-4-基)-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(350mg，0.85mmol)溶于1，4-二氧六环(20mL)，加入碳酸铯(826mg，2.54mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(78mg，0.085mmol)和2-二环己基膦-2’，4’，6’-三异丙基联苯(81mg，0.17mmol)。氮气保护，加热至110℃，反应16h，过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得标题化合物(250mg，产率52.1％)。
制备例16：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000062
将叔丁基4-(2-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(250mg，0.44mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)的混合溶液中，20℃搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，加入二氯甲烷(10mL)，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得标题化合物(180mg，产率88.1％)。
实施例1：5-((4-乙基哌嗪-1-)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物1)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000063
(1)2-氯-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000064
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(4.14g，20mmol)溶于四氢呋喃(70mL)，搅拌条件下加入三乙胺(6.06g，60mmol)和1-乙基哌嗪(4.56g，40mmol)，室温搅拌4小时。TLC检测原料消失，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)得标题化合物(3.4g，产率70.8％)。
(2)5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000065
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(700mg，2.32mmol)，2-氯-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)嘧啶(557mg，2.32mmol)，4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(221mg，0.38mmol)，碳酸铯(2.26g，6.96mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(212mg，0.23mmol)加入到100mL茄型瓶中，加入1，4-二氧六环(50mL)，氮气保护下110℃反应4小时，抽滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)得标题化合物(500mg，产率42.6％)。
分子式：C27H32F2N8分子量：506.3LC-MS(m/z)：507.4(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.56(d，J＝6.4Hz，1H)，8.49(s，2H)，8.26(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.27(d，J＝11.6Hz，1H)，3.50(s，2H)，2.69(s，3H)，2.38-2.64(m，10H)，1.70(d，J＝7.2Hz，6H)，1.11(t，J＝7.2Hz，3H).
实施例2：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((7-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物2)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000066
(1)叔丁基2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000067
将5-溴甲基-2-氯嘧啶(235mg，1.14mmol)溶解于四氢呋喃(5mL)中，加入叔丁基2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸酯盐酸盐(300mg，1.14mmol)和三乙胺(345mg，3.42mmol)，室温搅拌过夜，减压蒸掉多余的溶剂，加水(5mL)稀释，乙酸乙酯(3×10mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得到标题化合物(240mg，产率60％)。
(2)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000068
将叔丁基2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸酯(240mg，0.68mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，室温搅拌2小时，减压蒸掉多余的溶剂，得到标题化合物(156mg，产率91％)。
(3)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-7-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000069
将2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷(156mg，0.62mmol)溶解于乙腈(5mL)中，加入37％甲醛水溶液(251mg，3.1mmol)和氰基硼氢化钠(78mg，1.24mmol)，室温搅拌2小时，减压蒸掉多余的溶剂，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得到标题化合物(100mg，产率61％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((7-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000070
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(113mg，0.37mmol)和2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-7-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷(100mg，0.37mmol)溶解于1，4-二氧六环(5mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(34mg，0.037mmol)，2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(35mg，0.074mmol)和碳酸铯(300mg，0.93mmol)，氮气保护下回流搅拌过夜，过滤，减压蒸掉多余的溶剂，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化得到标题化合
物(17mg，产率8.6％)。
分子式：C29H34F2N8分子量：532.6 LC-MS(m/z)：533(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.53(d，J＝6.0Hz，1H)，8.50(s，2H)，8.27(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.27(d，J＝11.2Hz，1H)，3.68(s，2H)，3.21-3.22(m，4H)，2.80-3.00(m，4H)，2.69(s，3H)，2.63(s，3H)，1.90-2.00(m，4H)，1.70(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例3：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((2-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物3)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000071
(1)7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-甲酸叔丁酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000072
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(220mg，1.06mmol)溶解于四氢呋喃(5mL)中，加入叔丁基2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-甲酸酯(200mg，0.88mmol)和三乙胺(268mg，2.65mmol)，室温搅拌过夜，减压蒸除溶剂，加水(5mL)稀释，乙酸乙酯(3×10mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化得到标题化合物(190mg，产率60.5％)。
(2)7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000073
将叔丁基7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-甲酸酯(190mg，0.54mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，得到标题化合物(110mg，产率81％)。
(3)7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000074
将7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷(110mg，0.44mmol)溶解于乙腈(5mL)中，加入37％甲醛水溶液(178mg，2.2mmol)和氰基硼氢化钠(55mg，0.88mmol)，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得到标题化合物(80mg，产率68％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((2-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000075
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(90mg，0.3mmol)和7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2-甲基-2，7-二氮杂螺[3.5]壬烷(80mg，0.3mmol)溶解于1，4-二氧六环(5mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(27mg，0.03mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(29mg，0.06mmol)和碳酸铯(244mg，0.75mmol)，氮气保护下回流搅拌过夜，过滤，减压蒸除溶剂，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化得到标题化合物(8mg，产率5％)。
分子式：C29H34F2N8分子量：532.6 LC-MS(m/z)：533(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.67(s，2H)，8.56(d，J＝6.0Hz，1H)，8.31(d，J＝2.4Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.00-4.11(m，6H)，3.00-3.19(m，4H)，2.96(s，3H)，2.69(s，3H)，2.11-2.21(m，4H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例4：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((6-甲基-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物4)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000076
(1)叔丁基6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000077
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(326mg，1.57mmol)溶于乙腈(10mL)中，加入碳酸钾(433mg，3.14mmol)和叔丁基2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(310mg，1.57mmol)，室温反应16小时。抽滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(330mg，产率65％)。
(2)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000078
将叔丁基6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(330mg，1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌1小时，浓缩，得油状标题化合物(210mg，产率93％)。
(3)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000079
将2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷(210mg，0.94mmol)溶于乙腈(5mL)中，加入甲醛溶液(0.5mL)和氰基硼氢化钠(65mg，1.04mmol)，室温搅拌2小时，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(150mg，产率67％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((6-甲基-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000080
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(190mg，0.63mmol)和2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷(150mg，0.63mmol)溶于1，4-二氧六环(10mL)中，加入2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(60mg，0.13mmol)、碳酸铯(614mg，1.89mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(60mg，0.06mmol)，氮气保护下，升温至110℃反应16小时，抽滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)纯化，得固体标题化合物(23mg，产率7％)。
分子式：C27H30F2N8分子量：504.3 LC-MS(m/z)：505.3(M+H)+
1H-NMR(400MHz，CD3OD-d4)δ：8.54(d，J＝6.0Hz，1H)，8.46(s，2H)，8.26(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.27(d，J＝11.2Hz，1H)，4.84-4.85(m，1H)，3.54(s，6H)，3.39(s，4H)，2.69(s，3H)，2.41(s，3H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例5：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((9-甲基-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物5)的制备
(1)叔丁基9-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000082
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(326mg，1.57mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，搅拌条件下加入三乙胺(158mg，1.57mmol)和叔丁基3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(200mg，0.79mmol)，室温搅拌4h。抽滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(210mg，产率70％)。
(2)3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000083
将叔丁基9-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(210mg，0.55mmol)加入到二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌1h，浓缩，得标题化合物(145mg，产率94％)。
(3)3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-9-甲基-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000084
将3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷(145mg，0.52mmol)溶于乙腈(5mL)中，搅拌条件下加入37％甲醛溶液(0.5mL)和氰基硼氢化钠(65mg，1.04mmol)，加料完毕后室温搅拌2h，浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(65mg，产率42.7％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((9-甲基-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000085
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(77mg，0.26mmol)、3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-9-甲基-3，9-二氮杂螺[5.5]十一烷(65mg，0.22mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(20mg，0.04mmol)、碳酸铯(205mg，0.63mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(20mg，0.02mmol)加入到1，4-二氧六环(10mL)中，氮气保护下110℃反应16h，抽滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(10mg，产率8％)。
分子式：C31H38F2N8分子量：560.7 LC-MS(m/z)：561.4(M+H)+
1H-NMR(400MHz，CD3OD-d4)δ：8.54(d，J＝6.0Hz，1H)，8.49(s，2H)，8.26(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.28(d，J＝11.6Hz，1H)，3.53(s，2H)，2.98-3.07(m，4H)，2.71-2.68(m，6H)，2.50-2.52(m，4H)，1.66-1.71(m，9H)，1.61-1.65(m，5H).
实施例6：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)嘧啶2-胺(化合物6)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000086
(1)5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000087
将六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(318mg，1.5mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(310mg，1.5mmol)溶于乙腈(50mL)中，加入碳酸钾(621mg，4.5mmol)，室温反应8小时。过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(430mg，产率85％)。
(2)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000088
将5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(430mg，1.27mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌3小时。减压蒸除溶剂，得黄色油状标题化合物(302mg粗品)，不经纯化直接用于下步反应。
(3)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-甲基八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000089
将2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-c]吡咯(302mg粗品)溶解于甲醇(50mL)中，室温下加入甲醛水溶液(37％，1g，12.3mmol)，反应2小时，加入氰基硼氢化钠(0.8g，12.7mmol)，室温下搅拌12小时。反应完毕，浓缩反应液，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得到标题化合物(260mg，2步产率81％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)嘧啶2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000090
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(302mg，1.0mmol)和2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-甲基八氢吡咯基[3，4-c]吡咯(252mg，1.0mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(92mg，0.1mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(95mg，0.2mmol)和碳酸铯(975mg，3.0mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(100mL)和乙酸乙酯(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(150mL×2)，合并有机相，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得到标题化合物(223mg，产率43％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.6 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.03(s，1H)，8.45(s，2H)，8.43(d，J＝6.4Hz，1H)，8.36(s，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.80-4.83(m，1H)，3.34-3.49(m，6H)，2.66(brs.，4H)，2.61(s，3H)，2.35(brs.，5H)，1.57(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例6-1：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺)式-5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物6-1)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000091
(1)叔丁基5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-(顺式)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000092
将叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯(300mg，1.41mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(292.5mg，1.41mmol)溶解于乙腈(50mL)中，加入碳酸钾(585mg，4.23mmol)，室温反应4小时。过滤，滤液蒸干，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)得标题化合物(402mg，产率82％)。
(2)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-(顺式)-八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000093
将叔丁基5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-(顺式)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯(400mg，1.18mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌3小时，减压蒸除溶剂得标题化合物(300mg粗品)，不经纯化直接用于下步反应。
(3)2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-甲基-(顺式)-八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000094
将2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-(顺式)-八氢吡咯并[3，4-c]吡咯(300mg)粗品溶于甲醇(50mL)中，室温下加入甲醛水溶液(37％，0.96g，11.8mmol)，反应2小时，加入氰基硼氢化钠(0.74g，11.8mmol)，室温下搅拌12小时，反应完毕，蒸干溶剂，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得到标题化合物(175mg，2步产率58％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000095
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(302mg，1.0mmol)和2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-甲基-(顺式)-八氢吡咯并[3，4-c]吡咯(252mg，1.0mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(92mg，0.1mmol)，2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(95mg，0.2mmol)和碳酸铯(975mg，3.0mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(100mL)和乙酸乙酯(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(150mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)，得到标题化合物(207mg，产率40％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.60 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.64(d，J＝6.0Hz，1H)，8.48-8.47(m，3H)，8.29(d，J＝2.4Hz，1H)，7.64(t，J＝1.2Hz，1H)，7.25(d，J＝9.6Hz，1H)，4.70-4.74(m，1H)，3.57(s，2H)，3.40(brs，2H)，3.07(s，2H)，2.64-2.69(m，10H)，2.40-2.48(m，2H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例6-2：5-(((顺式)-5-乙基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物6-2)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000096
(1)叔丁基(顺式)-5-乙基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000097
将叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯(424mg，2.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，滴加乙醛水溶液(40％)(2.2mL，20mmol)，室温搅拌2小时，缓慢加入氰基硼氢化钠(1.26g，20mmol)，加完后继续室温搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离，得到产物(317mg，产率66.0％)。
(2)(顺式)-2-乙基八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000098
将叔丁基(顺式)-5-乙基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-甲酸酯(317mg，1.32mmol)溶于二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶液中，室温搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，加入少量二氯甲烷，旋蒸除去溶剂，得粗产物(181mg)。产物无需提纯，进行下一步。
(3)(顺式)-2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-乙基八氢吡咯并[3，4-c]吡咯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000099
将(顺式)-2-乙基八氢吡咯并[3，4-c]吡咯(181mg，1.29mmol)、5-溴甲基-2-氯嘧啶(267mg，1.29mmol)和碳酸钾(178mg，1.29mmol)加入到乙腈(15mL)中，60℃油浴中加热1小时。旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离，得产物(300mg，产率87.0％)。
(4)5-(((顺式)-5-乙基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000100
将(顺式)-2-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-5-乙基八氢吡咯并[3，4-c]吡咯(300mg，1.12mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(338mg，1.12mmol)、碳酸铯(730 mg，2.24mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(30mg)和2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(60mg)加入到1，4-二氧六环(20mL)中。氮气保护，110℃油浴中加热8小时，旋蒸除去溶剂，反相柱层析(水∶甲醇＝10∶1-1∶1)分离，得标题化合物(176mg，产率29.5％)。
分子式：C29H34F2N8  分子量：532.6  LC-MS(m/z)：533.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.64(d，J＝5.6Hz，2H)，8.44(s，2H)，8.29(d，J＝2.0Hz，1H)，8.24(s，1H)，8.06(s，1H)，7.63(s，1H)，7.24-7.26(m，1H)，4.70-4.73(m，1H)，3.55(s，2H)，2.90-3.05(m，2H)，2.80-2.87(m，2H)，2.69(s，3H)，2.45-2.60(m，6H)，2.25-2.35(m，2H)，1.68(d，J＝8.4Hz，6H)，1.15-1.18(m，3H).
实施例7：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺)式-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-6(2H)-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物7)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000101
(1)4-苄基-6-叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4，6-二甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000102
将叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-6(2H)-甲酸酯(342mg，1.5mmol)和N，N-二异丙基乙胺(581mg，4.5mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中，冰浴下滴加氯甲酸苄酯(358mg，2.1mmol)，滴加完毕后室温下反应4小时。加入水(30mL)，分液，水相用二氯甲烷萃取(50mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)纯化，得标题化合物(473mg，产率87％)。
(2)苄基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000103
将4-苄基-6-叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4，6-二甲酸酯(473mg，1.3mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌3小时，减压蒸除溶剂，得标题化合物(400mg粗品)，直接用于下步反应。
(3)苄基(顺式)-6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000104
将苄基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(400mg粗品)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(269mg，1.3mmol)溶解于乙腈(50mL)中，加入碳酸钾(538mg，3.9mmol)，室温反应8小时。过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(409mg，产率81％)。
(4)苄基(顺式)-6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000105
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(302mg，1.0mmol)和苄基6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(389mg，1.0mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(92mg，0.1mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(95mg，0.2mmol)和碳酸铯(975mg，3.0mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(100mL)和乙酸乙酯(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(150mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得到标题化合物(288mg，产率44％)。
(5)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-6(2H)-基)甲基)嘧啶-2-胺
Figure PCTCN2014095615-appb-000106
将苄基6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)(顺式)六氢吡咯并[3，4-b][1，4]噁嗪-4(4aH)-甲酸酯(280mg，0.43mmol)和钯碳(30mg)悬浮于甲醇(40mL)和氨水(6mL)中。体系抽真空，置换氢气，室温下反应16小时，硅藻土过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝1∶20，加0.2％三乙胺)纯化，得到白色固体标题化合物(178mg，产率80％)。
分子式：C27H30F2N8O  分子量：520.6  LC-MS(m/z)：521.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.02(s，1H)，8.44-8.42(m，3H)，8.35(s，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.79-4.83(m，1H)，3.79(s，1H)，3.16-3.60(m，6H)，3.15(m，1H)，2.91-2.95(m，1H)，2.80-2.85(m，1H)，2.73-2.69(m，1H)，2.54-2.65(m，5H)，1.57(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例8：(外型)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-胺的制备(化合物8)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000107
(1)叔丁基(外型)-6-((苄氧羰基)氨基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000108
将叔丁基(外型)-6-氨基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯(396mg，2.0mmol)和N，N-二异丙基乙胺(774mg，6.0mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中，冰浴下滴加氯甲酸苄酯(409mg，2.4mmol)，滴加完毕后室温下反应4小时，浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，得标题化合物(578mg，产率87％)。
(2)苄基((外型)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000109
将叔丁基(外型)-6-((苄氧羰基)氨基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯(578mg，1.74mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌3小时，减压蒸除溶剂，得标题化合物(450mg粗品)，不经纯化直接用于下步反应。
(3)苄基((外型)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000110
将苄基((外型)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯(450mg粗品)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(415mg，2.0mmol)溶于乙腈(50mL)中，加入碳酸钾(828mg，6.0mmol)，室温反应4小时，过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(487mg，两步产率78％)。
(4)苄基(外型)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000111
苄基((外型)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯(480mg，1.34mmol)和将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(405mg，1.34mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(119mg，0.13mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(124mg，0.26mmol)和碳酸铯(1.3g，4.02mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(100mL)和乙酸乙酯(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(150mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(527mg，产率63％)。
(5)(外型)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000112
苄基(外型)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-6-基)氨基甲酸酯的(500mg，0.80mmol)和钯碳(50mg)悬浮于甲醇(40mL)中，滴加氨水(6mL)。体系抽真空，置换氢气，室温下反应16小时，过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得到标题化合物(192mg，产率49％)。
分子式：C26H28F2N8  分子量：490.6  LC-MS(m/z)：491.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.04(s，1H)，8.43(d，J＝6.0Hz，1H)，8.39(s，2H)，8.35(d，J＝2.0Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.78-4.85(m，1H)，3.46(s，2H)，2.87(d，J＝8.8Hz，2H)，2.62(s，3H)，2.55(s，1H)，2.33(d，J＝8.4Hz，2H)，1.57-1.60(m，8H).
实施例9：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((反式)-八氢-6H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-6-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物9)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000113
(1)1-苄基6-叔丁基(反式)-六氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1，6(5H)-二羧酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000114
将(反式)-八氢-6H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-6-羧酸叔丁酯(242mg，1.0mmol)和三乙胺(120mg，1.2mmol)加入到二氯甲烷(5mL)中，冰浴下缓慢滴加氯甲酸苄酯(188mg，1.1mmol)，滴加完毕后升至室温搅拌三十分钟，旋干溶剂得到粗产物(300mg粗品)，产物无需提纯，进行下一步。
(2)(反式)-八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸苄酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000115
将1-苄基6-叔丁基(反式)-六氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1，6(5H)-二羧酸酯(溶于二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶液中，室温搅拌三十分钟，旋干溶剂，加入少量二氯甲烷，再次旋干溶剂得粗产物(260mg)。产物无需提纯，进行下一步。
(3)(反式)-6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸苄酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000116
将(反式)-八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸苄酯(260mg，0.94mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(393mg，1.9mmol)和碳酸钾(786mg，5.7mmol)加入到乙腈(15mL)中，60℃油浴中加热一小时。旋干溶液，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得产物300mg，三步合计产率75％。
(4)(反式)-6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸苄酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000117
将(反式)-6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸苄酯(300mg，0.75mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(449mg，1.5mmol)，碳酸钾(317mg，2.3mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(30mg)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(60mg，0.13mmol)加入到20mL的1，4-二氧六环中。氮气保护，110℃油浴中加热8小时，旋干溶剂，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得标题化合物(113mg，产率23％)。
(5)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((反式)-八氢-6H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-6-基)甲基)嘧啶-2-胺
Figure PCTCN2014095615-appb-000118
将苄基(反式)-6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡啶并[3，4-b][1，4]噁嗪-1-羧酸酯(113mg，0.17mmol)，溶于甲醇(5mL)和氨水(0.50mL)中，加入钯碳催化剂(30mg)，通氢气还原2小时，抽滤，旋干溶液，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得到产物(30mg，产率33％)。
分子式：C28H32F2N8O  分子量：534.6  LC-MS(m/z)：535.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)6：8.63-8.66(m，2H)，8.44(s，2H)，8.29(d，J＝2.0Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.26(d，J＝8.0Hz，1H)，4.70-4.73(m，1H)，3.84(dd，J1＝2.8Hz，J2＝11.2Hz，1H)，3.62-3.63(m，1H)，3.47-3.48(m，2H)，3.20-3.21(m，1H)，2.86-3.02(m，4H)，2.68(s，3H)，2.35-2.40(m，1H)，2.11-2.12(m，1H)，1.94-2.01(m，1H)，1.68(d，J＝10.8Hz，6H)，1.66-1.63(m，1H)，1.55-1.45(m，1H).
实施例10：5-((4-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哌啶-1-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物10)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000119
(1)1-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-醇的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000120
将4-羟基哌啶(202mg，2mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(414mg，2.0mmol)溶解于乙腈(50mL)中，加入碳酸钾(828mg，6.0mmol)，室温反应4小时，过滤，滤液蒸干，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)得标题化合物(378mg，产率83％)。
(2)1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-醇的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000121
1-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-醇(342mg，1.5mmol)和将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(453mg，1.5mmol)溶于1，4-二氧六环(50mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(137mg，0.15mmol)，2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(143mg，0.3mmol)和碳酸铯(1.47g，4.5mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(100mL)和乙酸乙酯(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(150mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得标题化合物(489mg，产率66％)。
(3)1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-酮的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000122
将1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-醇(450mg，0.91mmol)溶于二甲基亚砜(6mL)和三乙胺(4mL)中，搅拌下加入三氧化硫吡啶(723mg，4.55mmol)，加毕室温搅拌反应2小时。加入水(10mL)，水相用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，有机相合并，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得标题化合物(363mg，产率81％)。
(4)5-((4-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哌啶-1-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000123
将1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌啶-4-酮(300mg，0.61mmol)和8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷盐酸盐(91.3mg，0.61 mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入三氯化铟(270mg，1.22mmol)，室温搅拌12小时，加入氰基硼氢化钠(77mg，1.22mmol)，继续室温搅拌反应2小时。加入水(20mL)，乙酸乙酯(20mL×5)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得标题化合物(133mg，产率37％)。
分子式：C32H38F2N8O  分子量：588.7  LC-MS(m/z)：589.4(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)6：10.01(s，1H)，8.43-8.42(m，3H)，8.35(d，J＝2.0Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.79-4.83(m，1H)，4.10-4.17(m，2H)，3.44-3.49(m，2H)，2.81-2.87(m，2H)，2.65(s，3H)，2.22-2.24(m，2H)，1.99-2.06(m，3H)，1.74-1.76(m，2H)，1.67-1.73(m，5H)，1.56-1.58(m，6H)，1.36-1.38(m，2H).
实施例11：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((8-吗啉基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备(化合物11)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000124
(1)8-吗啉基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000125
将8-氧代-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(226mg，1.0mmol)和吗啉(870mg，10mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入催化量的醋酸(20mg)，室温搅拌30分钟。加入氰基硼氢化钠(95mg，1.5mmol)，室温搅拌2小时，加入乙酸乙酯(100mL)，水洗，有机相干燥，旋干得到粗产物(300mg)，无需提纯直接用于下步。
(2)4-(3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)吗啉的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000126
将8-吗啉基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(300mg，1.0mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)的混合溶液中，室温搅拌30分钟，旋干溶剂，加入碳酸钾(276mg，2.0mmol)和5-溴甲基-2-氯嘧啶(310mg，1.5mmol)，乙腈(10mL)，60℃油浴中加热一小时。旋干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离得产物(236mg，两步合计产率73％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((8-吗啉基-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000127
将4-(3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吗啉(236mg，0.73mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(332mg，1.1mmol)、碳酸钾(202mg，1.5mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(24mg)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(48mg)加入到1，4-二氧六环(10mL)中。氮气保护，110℃油浴中加热8小时，旋干溶剂，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得产物(41mg，产率10％)。
分子式：C32H38F2N8O 分子量：588.7 LC-MS(m/z)：589.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.66(d，J＝6.0Hz，1H)，8.36-8.52(m，3H)，8.28(s，1H)，7.64(s，1H)，7.27(d，J＝8.0Hz，1H)，4.70-4.74(m，1H)，3.71(s，4H)，2.69(s，5H)，2.34-2.42(m，6H)，2.10-2.15(m，3H)，1.68-1.79(m，8H)，1.05-1.30(m，4H).
实施例12：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((3-吗啉-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物12)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000128
(1)8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000129
将5-溴甲基-2-氯嘧啶(621mg，3.0mmol)、3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷盐酸盐(324mg，2.0mmol)和碳酸钾(552mg，4.0mmol)加入到20mL乙腈中，加热回流一小时。旋干溶剂，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)分离得产物(387mg，产率77％)。
(2)8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5基)甲基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000130
将8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(387mg，1.54mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(930mg，3.08mmol)、碳酸钾(638mg，4.62mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(39mg)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(78mg)加入到 1，4-二氧六环(20mL)中。氮气保护，110℃油浴中加热8小时，旋干溶剂，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得标题化合物(133mg，产率17％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-((3-吗啉-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000131
将8-((2-((5-氟-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(133mg，0.257mmol)溶于四氢呋喃(1mL)和甲醇(1mL)的混合溶剂中，加入吗啉(223mg，2.57mmol)、醋酸(20mg)，室温搅拌3小时，加入氰基硼氢化钠(25mg，0.386mmol)，室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯(20mL)，分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥，旋干，制备色谱(洗脱剂为水∶乙腈＝10∶1-1∶1)分离得产物(40mg，产率33％)。
分子式：C32H38F2N8O 分子量：588.7 LC-MS(m/z)：589.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：9.48(brs.，1H)，8.67(d，J＝6.0Hz，1H)，8.62(s，2H)，8.38(d，J＝2.4Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.25(d，J＝13.2Hz，1H)，4.67-4.74(m，1H)，3.72(s，4H)，3.60(s，2H)，3.36(s，2H)，2.66(s，3H)，2.55(brs，5H)，2.05-2.07(m，2H)，1.84-1.82(m，2H)，1.67-1.68(m，10H).
实施例13：5-((3-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物13)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000132
(1)8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000133
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(412mg，2mmol)溶于四氢呋喃(30mL)中，搅拌条件下加入三乙胺(606mg，6mmol)和3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯(509mg，2.4mmol)，室温搅拌4h。TLC检测原料消失，抽滤，滤液浓缩，粗品经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得标题化合物(600mg，产率88.8％)。
(2)8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000134
将8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯(600mg，1.78mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，搅拌条件下加入三氟乙酸(5mL)，室温搅拌4h。TLC检测原料消失，浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)得标题化合物(400mg，产率94.6％)。
(3)8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000135
将8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(400mg，1.68mmol)溶于乙腈(20mL)，搅拌条件下加入溴乙烷(363mg，3.36mmol)和碳酸钾(695.5mg，5.04mmol)，40℃搅拌过夜。TLC检测原料消失，抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得标题化合物(380mg，产率85.2％)。
(4)5-((3-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000136
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(200mg，0.66mmol)，8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(175.6mg，0.66mmol)，2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(63mg，0.13mmol)，碳酸铯(643.5mg，1.98mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(60mg，0.066mmol)加入到100mL茄型瓶中，加入1，4-二氧六环(20mL)，氮气保护下110℃反应4h，抽滤，滤液经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)得标题化合物(100mg，产率28.5％)。
分子式：C29H34F2N8 分子量：532.3 LC-MS(m/z)：533.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.54-8.58(m，3H)，8.27(d，J＝2.0Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.26(d，J＝11.6Hz，1H)，4.84-4.88(m，1H)，3.37-3.60(m，3H)，3.00-3.21(m，4H)，2.69(s，3H)，2.25-2.35(m，2H)，1.85-2.05(m，2H)，1.67-1.71(m，6H)，1.22-1.35(m，2H)，1.16-1.20(m，4H).
实施例14：5-((8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物14)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000137
(1)8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000138
将3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯(212mg，1mmol)溶于乙腈(20mL)中，搅拌条件下加入溴乙烷(129.6mg，1.2mmol)和碳酸钾(414mg，3mmol)，40℃搅拌过夜。TLC检测原料消失，抽滤，滤液减压蒸馏得标题化合物(200mg，产率83.3％)。
(2)8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000139
将8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸叔丁酯(200mg，0.83mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，搅拌条件下加入三氟乙酸(3mL)，室温搅拌1h。TLC检测原料消失，减压蒸馏得标题化合物(100mg，产率85.8％)。
(3)3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000140
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(146mg，0.71mmol)溶于四氢呋喃(30mL)中，搅拌条件下加入碳酸钾(294mg，2.13mmol)和8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(100mg，0.71mmol)，室温搅拌4h。TLC检测原料消失，抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)得标题化合物(150mg，产率79.4％)。
(4)5-((8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000141
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(170mg，0.564mmol)，3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-8-乙基-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷(150mg，0.564mmol)，2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(54mg，0.11mmol)，碳酸铯(550mg，1.69mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(52mg，0.057mmol)加入到100mL茄型瓶中，加入1，4-二氧六环(20mL)，氮气保护下 110℃反应4h，抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)得标题化合物(120mg，产率40％)。
分子式：C29H34F2N8 分子量：532.3 LC-MS(m/z)：533.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.53(d，J＝6.0Hz，1H)，8.50(s，2H)，8.27(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.26(d，J＝11.2Hz，1H)，4.60(s，1H)，3.95-4.02(m，2H)，3.59(s，2H)，3.00-3.12(m，2H)，2.92(d，J＝12.8Hz，2H)，2.69(s，3H)，2.59(d，J＝12.8Hz，2H)，2.11-2.16(m，4H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H)，1.31-1.35(m，3H).
实施例15：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基甲基)嘧啶-2-胺(化合物15)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000142
(1)叔丁基4-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000143
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(500mg，2.42mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，加入叔丁基哌嗪-1-甲酸酯(372mg，2mmol)和三乙胺(404mg，4mmol)，室温搅拌过夜。反应完毕，减压浓缩，加水(15mL)稀释，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化，得到标题化合物(520mg，产率83％)。
(2)叔丁基4-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000144
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(302mg，1mmol)和叔丁基4-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(312mg，1mmol)溶解于1，4-二氧六环(15mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(92mg，0.1mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(95mg，0.2mmol)和碳酸铯(815mg，2.5mmol)，氮气保护下回流搅拌过夜，过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得到标题化合物(350mg，产率60％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基甲基) 嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000145
将叔丁基4-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)哌嗪-1-甲酸酯(200mg，0.346mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温搅拌2小时，减压浓缩，加入二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液，分液，有机相干燥，过滤，真空浓缩，粗品经硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝p-1∶20，加0.5％三乙胺)纯化，得到白色固体状标题化合物(110mg，产率67％)。
分子式：C25H28F2N8 分子量：478.5 LC-MS(m/z)：479.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.03(s，1H)，8.42-8.47(m，3H)，8.35(d，J＝2.0Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.78-4.85(m，1H)，3.34(s，2H)，2.62-2.66(m，7H)，2.20-2.31(m，5H)，1.58(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例16：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(化合物16)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000146
(1)叔丁基4-(嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000147
将5-溴嘧啶(3.16g，20mmol)、叔丁基哌嗪-1-甲酸酯(3.72g，20mmol)、1，1′-联萘-2，2′-双二苯膦(2.49g，4mmol)、碳酸铯(13.0g，40mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(1.83g，2mmol)加入到100mL茄型瓶中，加入甲苯(80mL)，氮气保护下90℃反应12小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(3.1g，产率58.7％)。
(2)叔丁基4-(2-溴嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000148
称取叔丁基4-(嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(2.64g，10mmol)加入到乙腈(125mL)中，搅拌条件下加入N-溴代丁二酰亚胺(1.78g，10mmol)，25℃搅拌16小时。反应液浓缩，加入乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)，分液得有机相，浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1) 纯化，得标题化合物(40mg，产率1.17％)。
(3)叔丁基4-(2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000149
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(36mg，0.12mmol)、叔丁基4-(2-溴嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(40mg，0.12mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(11.4mg，0.024mmol)、碳酸铯(97.7mg，0.3mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(11mg，0.012mmol)加入到25mL茄型瓶中，加入1，4-二氧六环(10mL)，氮气保护下110℃反应2小时，抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(15mg，产率22.2％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000150
将叔丁基4-(2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(15mg，0.027mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，搅拌条件下加入三氟乙酸(2mL)，25℃搅拌0.5小时。浓缩反应液，残渣加入乙酸乙酯(10mL)稀释，通氨气至碱性，浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(7mg，产率56.0％)。
分子式：C24H26F2N8 分子量：464.5 LC-MS(m/z)：465.4(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.77(d，J＝6.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.31(d，J＝2.8Hz，1H)，8.27(s，1H)，7.81(s，1H)，7.30(d，J＝11.2Hz，1H)，4.86-4.93(m，1H)，3.16-3.18(m，4H)，3.04-3.06(m，4H)，2.69(s，3H)，1.70(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例17：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(化合物17)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000151
(1)N，N-双(4-甲氧基苄基)-5-(4-甲基哌嗪基-1-基)嘧啶-2胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000152
将5-溴-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺(2.0g，4.83mmol)溶解于甲苯(20mL)中，加入N-甲基哌嗪(483mg，4.83mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(221mg，0.24mmol)、1，1′-联萘-2，2′-双二苯膦(301mg，0.48mmol)和叔丁醇钠(930mg，9.7mmol)，体系置换氮气，80℃搅拌反应18小时，冷却至室温，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(859mg，41％)。
(2)5-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000153
将N，N-双(4-甲氧基苄基)-5-(4-甲基哌嗪基-1基)嘧啶-2胺(800mg，1.8mmol)溶于三氟乙酸(10mL)和二氯甲烷(10mL)的混合溶液中，加热至40℃，反应18小时。减压浓缩反应液，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(285mg，82％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000154
将5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)嘧啶-2-胺(193mg，1.0mmol)、4-氟-6-(5-氟-2-碘吡啶-4-基)-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(413mg，1.0mmol)、2-二环己基磷-2’，4’，6’-三异丙基联苯(47.7mg，0.10mmol)、碳酸铯(815mg，2.5mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(45.8mg，0.05mmol)溶于1，4-二氧六环(20mL)，体系置换氮气，升温至120℃反应8小时，过滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(52.6mg，产率11％)。
分子式：C25H28F2N8 分子量：478.6 LC-MS(m/z)：479.0(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：9.66(s，1H)，8.36(d，J＝6Hz，1H)，8.29-8.31(m，3H)，7.73(s，1H)，7.20(d，J＝11.6Hz，1H)，4.79-4.83(m，1H)，3.07-3.10(m，4H)，2.61(s，3H)，2.43-2.46(m，4H)，2.20(s，3H)，1.57(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例18：5-(4-乙基哌嗪-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)
吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物18)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000155
(1)5-(4-乙基哌嗪-1-基)-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000156
将5-溴-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺(800mg，1.94mmol)溶解于甲苯(20mL)中，加入N-乙基哌嗪(330mg，2.89mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(89mg，0.097mmol)、1，1′-联萘-2，2′-双二苯膦(121mg，0.194mmol)和叔丁醇钠(372mg，3.88mmol)，氮气保护下80℃搅拌18小时，冷却至室温，过滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝0-1∶30)纯化，得到标题化合物(440mg，产率51％)。
(2)5-(4-乙基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000157
将5-(4-乙基哌嗪-1-基)-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺(440mg，0.98mmol)溶于三氟乙酸(5mL)中，加热至40℃，反应18小时。减压蒸除去溶剂，得标题化合物(180mg，产率89％)，直接投入下一步反应。
(3)5-(4-乙基哌嗪-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000158
将4-氟-6-(5-氟-2-碘吡啶-4-基)-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(359mg，0.87mmol)和5-(4-乙基哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(180mg，0.87mmol)溶于甲苯(10mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(80mg，0.087mmol)、4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(50mg，0.087mmol)和叔丁醇钠(209mg，2.18mmol)，氮气保护下加热至100℃反应16小时。冷却至室温，加入甲醇(5mL)，通过硅藻土过滤，滤液真空浓缩，粗品经硅胶柱层析(甲醇∶二氯甲烷＝0-1∶10，加0.5％氨水)纯化，得到白色固体标题化合物(18mg，产率4.2％)。
分子式：C26H30F2N8  分子量：492.6  LC-MS(m/z)：493(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.46(d，J＝5.2Hz，1H)，8.34(s，2H)，8.22(s，1H)，7.78(s，1H)，7.25(d，J＝11.2Hz，1H)，4.55-4.62(m，1H)，3.20-3.28(m，4H)，2.80-2.91(m，4H)，2.72-2.75(m，2H)，2.68(s，3H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H)，1.22(t，J＝7.2Hz，3H).
实施例19：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(化合物20)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000159
(1)6-(2-溴-5-氟吡啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000160
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(906mg，3.0mmol)溶于乙腈(30mL)中，缓慢滴加亚硝酸叔丁酯(340mg，3.3mmol)，滴加完毕后室温搅拌30分钟，加入溴化铜(1.00g，4.5mmol)，室温搅拌2小时，抽滤，旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化，得到产物(498mg，产率45.4％)。
(2)叔丁基4-(2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000161
将叔丁基4-(2-氨基嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯(380mg，1.36mmol)、6-(2-溴-5-氟吡啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(498mg，1.36mmol)、碳酸铯(447mg，1.36mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(38mg)和2-二环己基磷-2’，4’，6’-三异丙基联苯(76mg)加入到1，4-二氧六环(20mL)中。氮气保护，110℃油浴中加热8小时，旋蒸除去溶剂，柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1-1∶1)分离，得产物(256mg，产率33.3％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000162
将N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(170mg，0.366mmol)溶于甲醇(5mL)中，滴加氧杂环丁酮(39.5mg，0.549mmol)，室温搅拌2小时，缓慢加入氰基硼氢化钠(34.6mg，0.549mmol)，室温继续搅拌30分钟，旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离，得到产物(82mg，产率42.1％)。
分子式：C27H30F2N8O  分子量：520.6  LC-MS(m/z)：521.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.47(m，J＝6.4Hz，1H)，8.30(s，2H)，8.20(d，J＝2.4Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.26(d，J＝8.0Hz，1H)，4.72(t，J＝6.4Hz，2H)，4.59-4.64(m，3H)，3.50-3.55(m，1H)，3.19(t，J＝4.8Hz，4H)，2.68(s，3H)，2.52(t，J＝4.8Hz，4H)，1.68(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例20：5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物21)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000163
(1)5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000164
氮气保护下，向反应瓶中加入5-溴-N，N-双(4-甲氧基苄基)-嘧啶-2-胺(2.0g，4.84mmol)、N，N-二甲基哌啶-4-胺(620mg，4.84mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(221mg，0.24mmol)、1，1′-联萘-2，2′-双二苯膦(301mg，0.48mmol)和叔丁醇钠(930mg，9.7mmol)至甲苯(50mL)中，加热至80℃，反应16小时。反应完毕，冷却至室温，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)纯化，得标题化合物(758mg，34％)。
(2)5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000165
向5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-N，N-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2-胺(758mg，1.64mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入三氟乙酸(10mL)，加热至40℃反应16小时。反应完毕，冷却至室温，浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得标题化合物(282mg，78％)。
(3)5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000166
将5-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)嘧啶-2-胺(282mg，1.28mmol)、4-氟-6-(5-氟-2-碘吡啶-4-基)-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(528mg，1.28mmol)、2-二环己基磷-2’，4’，6’-三异丙基联苯(61mg，0.13mmol)、碳酸铯(1.2g，3.7mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(58mg，0.06mmol)加入到1，4-二氧六环(20mL)中，氮气环境下120℃反应2小时，抽滤，滤液浓缩，经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(40mg，产率6％)。
分子式：C27H32F2N8   分子量：506.6   LC-MS(m/z)：507.1(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.46(d，J＝6.0Hz，1H)，8.34(s，2H)，8.21(d，J＝2.4Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.25(d，J＝11.6Hz，1H)，4.57(s，1H)，3.71-3.76(m，2H)，2.96-3.11(m，1H)，2.77-2.83(m，2H)，2.72(s，6H)，2.68(s，3H)，2.11-2.14(m，2H)，1.78-1.82(m，2H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例21：5-(4-(环丙甲基)哌嗪-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物22)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000167
(1)5-(4-(环丙甲基)哌嗪-1-基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000168
将N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(哌嗪-1-基)嘧啶-2-胺(90mg，0.194mmol)溶于甲醇(5mL)中，加入环丙甲醛(68mg，0.97mmol)，20℃搅拌30分钟，加入氰基硼氢化钠(122mg，1.94mmol)，加完后20℃搅拌16h，加入水(10mL)和乙酸乙酯(20mL)，分液，有机相浓缩，经硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得标题化合物 (19mg，产率18.9％)。
分子式：C28H32F2N8   分子量：518.6   LC-MS(m/z)：519.2(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.41(s，1H)，8.09-8.20(m，3H)，7.74(s，1H)，7.17-7.19(m，1H)，4.89-4.91(m，1H)，2.95-3.15(m，4H)，2.68(s，3H)，2.52-2.68(m，4H)，2.26-2.29(m，2H)，1.67(d，J＝6.8Hz，6H)，1.29-1.31(m，1H)，0.55-0.57(m，2H)，0.21-0.29(m，2H).
实施例22：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-5(1m)-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物23)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000169
(1)叔丁基(顺式)-5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000170
称取叔丁基(顺式)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-甲酸酯(250mg，1.18mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(490mg，2.37mmol)加入到四氢呋喃(10mL)中，加入三乙胺(238mg，2.36mmol)，室温下搅拌16小时。直接浓缩，粗品硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化，得标题化合物(300mg，产率75.2％)。
(2)叔丁基(顺式)-5-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000171
称取叔丁基(顺式)-5-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-甲酸酯(300mg，0.89mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(269mg，0.89mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(87mg，0.18mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(82mg，0.09mmol)和碳酸铯(587mg，1.8mmol)加入到1，4-二氧六环(5mL)中，氮气保护下升温至110℃反应16小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(370mg，产率68.7％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-六氢吡咯 并[3，4-b]吡咯-5(1H)-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000172
称取叔丁基(顺式)-5-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-甲酸酯(370mg，0.61mmol)溶于二氯甲烷(8mL)中，冰浴下加入三氟乙酸(1mL)，加完升至室温搅拌2小时。反应液旋干后再用二氯甲烷(10mL)溶解，用碳酸氢钠中和，浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)纯化，得标题化合物(250mg，产率81.2％)。
分子式：C27H30F2N8  分子量：504.6  LC-MS(m/z)：505.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)6：8.51-8.54(m，3H)，8.28(d，J＝2.4Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.27(d，J＝11.2Hz，1H)，4.85-4.95(m，1H)，4.12-4.18(m，1H)，3.58(s，2H)，3.35-3.42(m，1H)，3.16-3.27(m，1H)，3.08-3.15(m，1H)，2.96-3.05(m，1H)，2.77-2.83(m，1H)，2.69(s，3H)，2.40-2.55(m，2H)，2.15-2.28(m，1H)，1.85-1.95(m，1H)，1.69(d，J＝7.2Hz，6H).
实施例23：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物24)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000173
(1)叔丁基(顺式)-6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000174
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(183.4mg，0.884mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，搅拌条件下加入三乙胺(134.3mg，1.33mmol)和叔丁基(顺式)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-甲酸酯(100mg，0.442mmol)，室温搅拌4小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝100∶1)纯化，得标题化合物(102mg，产率65.4％)。
(2)叔丁基(顺式)-6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡咯[3，4-b]吡啶-1-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000175
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(85.6mg，0.283mmol)、叔丁基(顺式)-6-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-甲酸酯(100mg，0.283mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(27mg，0.0566mmol)、碳酸铯(276.6mg，0.849mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(25.9mg，0.0283mmol)加入到1，4-二氧六环(10mL)中，氮气保护下110℃反应6小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(80mg，产率45.6％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000176
将叔丁基(顺式)-6-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-1H-吡咯[3，4-b]吡啶-1-甲酸酯(80mg，0.129mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，室温搅拌2小时。反应完成，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得白色固体状标题化合物(30mg，产率44.8％)。
分子式：C28H32F2N8  分子量：518.6  LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：9.31(s，1H)，8.66(d，J＝6.0Hz，1H)，8.55(s，2H)，8.37(d，J＝2.0Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.24-7.26(m，1H)，4.65-4.75(m，1H)，3.71(s，2H)，3.22-3.25(m，1H)，2.84-2.94(m，3H)，2.68-2.72(m，6H)，2.39-2.48(m，1H)，1.58-1.73(m，11H).
实施例24：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物25)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000177
(1)叔丁基(顺式)-1-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000178
将5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(183.4mg，0.884mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，搅拌条件下加入三乙胺(134.3mg，1.33mmol)和叔丁基(顺式)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-甲酸酯(100mg，0.442mmol)，室温搅拌4小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝100∶1)纯化，得标题化合物(125mg，产率80.1％)。
(2)叔丁基(顺式)-1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000179
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(85.6mg，0.283mmol)、叔丁基(顺式)-1-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-甲酸酯(100mg，0.283mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(27mg，0.0566mmol)、碳酸铯(276.6mg，0.849mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(25.9mg，0.0283mmol)加入到1，4-二氧六环(10mL)中，氮气保护下110℃反应6小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(95mg，产率54.2％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000180
将叔丁基(顺式)-1-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-甲酸酯(95mg，0.154mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，室温搅拌2小时。反应完成，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得白色固体状标题化合物(40mg，产率50.3％)。
分子式：C28H32F2N8  分子量：518.6  LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：10.30(s，1H)，8.69(d，J＝6.0Hz，1H)，8.62(s，2H)，8.49(d，J＝2.4Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.25(d，J＝10.8Hz，1H)，4.68-4.75(m，1H)，3.81-3.92(m，2H)，3.27-3.41(m，3H)，3.09(d，J＝13.6Hz，1H)，2.92(s，1H)，2.84(d，J＝10.8Hz，1H)，2.68(s，3H)，2.48-2.55(m，1H)，1.95-2.01(m，1H)，1.48-1.72(m，10H).
实施例25：5-(((1S，6R)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物26)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000181
(1)叔丁基(1S，6R)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000182
称取叔丁基(1S，6R)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(240mg，1.13mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(352mg，1.70mmol)加入到四氢呋喃(20mL)中，加入三乙胺(228mg，2.26mmol)，室温下搅拌16小时。直接浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得标题化合物(310mg，产率81.0％)。
(2)叔丁基(1S，6R)-8-((2-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000183
称取叔丁基(1S，6R)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(310mg，0.91mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(275mg，0.91mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(86mg，0.18mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(82mg，0.09mmol)和碳酸铯(743mg，2.28mmol)加入到1，4-二氧六环(40mL)中，氮气保护下升温至110℃反应16小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(340mg，产率61.8％)。
(3)5-(((1S，6R)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000184
称取叔丁基(1S，6R)-8-((2-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(340mg，0.56mmol)，加入到二氯甲烷(8mL)中，冰浴下加入三氟乙酸(6mL)，加完升至室温搅拌2小时。反应液浓缩，再用二氯甲烷(10mL)溶解，用碳酸氢钠中和后浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(260mg，产率92.1％)。
分子式：C27H30F2N8分子量：504.6 LC-MS(m/z)：505.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.54(d，J＝6.4Hz，1H)，8.52(s，2H)，8.27(d，J＝2.4Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.24(d，J＝11.2Hz，1H)，4.87-4.92(m，1H)，3.76(d，J＝13.2Hz，1H)，3.38-3.47(m，3H)，3.35(s，3H)，3.18(d，J＝14.0Hz，1H)，2.91-3.07(m，3H)，2.84-2.88(m，1H)，2.48-2.52(m，1H)，2.17-2.21(m，1H)，2.01-2.07(m，1H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例26：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1S，6R)-3-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物27)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000185
N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1S，6R)-3-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000186
称取5-(((1S，6R)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(100mg，0.20mmol)，加入到甲醇(4mL)中，冰浴下加入37％甲醛水溶液(0.5mL)和氰基硼氢化钠(100mg，1.6mmol)，加完升至室温搅拌1小时。反应液经制备薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得标题化合物(70mg，产率68.1％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.6 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.55(d，J＝6.4Hz，1H)，8.52(s，2H)，8.25(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.27(d，J＝11.6Hz，1H)，4.85-4.89(m，1H)，3.68(d，J＝12.8Hz，1H)，3.39(d， J＝13.2Hz，1H)，3.23-3.28(m，1H)，2.91-2.93(m，2H)，2.78(d，J＝12.4Hz，2H)，2.69(s，3H)，2.27(s，3H)，2.17-2.25(m，1H)，1.96-2.02(m，3H)，1.88-1.95(m，1H)，1.69(d，J＝7.2Hz，6H).
实施例27：5-(((1R，6S)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物28)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000187
(1)叔丁基(1R，65)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000188
称取叔丁基(1R，6S)-3，8-二氮杂二环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(200mg，0.94mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(390mg，1.88mmol)加入到四氢呋喃(10mL)中，加入三乙胺(285mg，2.82mmol)，室温下搅拌16小时，直接浓缩，粗品硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化，得标题化合物(195mg，产率61.7％)。
(2)叔丁基(1R，6S)-8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000189
称取叔丁基(1R，6S)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(100mg，0.30mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(90mg，0.30mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(30mg，0.06mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(28mg，0.03mmol)和碳酸铯(295mg，0.91mmol)加入到1，4-二氧六环(5mL)中，氮气保护下升温至110℃反应16小时。抽滤，滤液浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(104mg，产率56.7％)。
(3)5-(((1R，6S)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000190
称取叔丁基(1R，6S)-8-((2-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(104mg，0.17mmol)，加入到二氯甲烷(8mL)中，冰浴下加入三氟乙酸(1mL)，加完升至室温搅拌2小时。反应液旋干，再用二氯甲烷(10mL)溶解，用碳酸氢钠中和后浓缩，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)纯化，得标题化合物(44mg，产率52.9％)。
分子式：C27H30F2N8分子量：504.6 LC-MS(m/z)：505.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.64(d，J＝6.0Hz，1H)，8.44(s，2H)，8.23(d，J＝2.4Hz，1H)，7.96(s，1H)，7.63(s，1H)，7.26-7.29(m，1H)，4.68-4.83(m，1H)，3.60-3.63(m，1H)，3.31-3.40(m，1H)，2.95-3.09(m，3H)，2.83-2.93(m，1H)，2.75-2.80(m，1H)，2.69(s，3H)，2.60-2.65(m，1H)，2.20-2.40(m，2H)，1.85-2.05(m，2H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例28：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1R，6S)-3-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物29)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000191
(1)叔丁基(1R，6S)-8-(2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000192
将叔丁基(1R，6S)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(100mg，0.47mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(97.5mg，0.47mmol)溶解于无水四氢呋喃(10mL)中，滴加三乙胺(71.2mg，0.71mmol)，室温反应4小时。然后将反应混合物浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化，得标题化合物(97.3mg，产率61％)。
(2)叔丁基(1R，6S)-8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000193
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(84.6mg，0.28mmol)和叔丁基(1R，6S)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(95mg，0.28mmol)溶于1，4-二氧六环(15mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(25.6mg，0.028mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(26.7mg，0.056mmol)和碳酸铯(273.7mg，0.84mmol)，氮气保护下加热至110℃反应8小时。冷却至室温，浓缩，加入水(30mL)和乙酸乙酯(50mL)，分液，水相用乙酸乙酯萃取(50mL×2)，有机相合并，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得到标题化合物(88.2mg，产率52％)。
(3)5-(((1R，6S)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000194
将叔丁基(1R，6S)-8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-羧酸酯(88mg，0.146mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，室温搅拌3小时。减压蒸除溶剂，剩余物用饱和碳酸氢钠溶液调至pH＝8，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1)的混合溶液(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，浓缩，得标题化合物(100mg粗品)，不经纯化直接用于下步反应。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1R，6S)-3-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000195
将5-(((1R，6S)-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺粗品(100mg粗品)溶于甲醇(5mL)中，室温下加入甲醛水溶液(37％，118mg，1.46mmol)，反应2小时，加入氰基硼氢化钠(91.7g，1.46mmol)，室温下搅拌1小时。反应完毕，向反应液中加入石油醚(50mL)，经硅胶柱层析(二 氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化，得到标题化合物(20mg，两步产率26.4％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.6 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)δ：8.55(d，J＝6.0Hz，1H)，8.52(s，2H)，8.27(d，J＝2.4Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.25(d，J＝11.2Hz，1H)，4.86-4.92(m，1H)，3.68(d，J＝13.2Hz，1H)，3.37(d，J＝13.2Hz，1H)，3.27-3.31(m，1H)，2.89-2.95(m，2H)，2.85(d，J＝11.6Hz，2H)，2.68(s，3H)，2.33(s，3H)，2.23-2.25(m，1H)，2.01-2.07(m，5H)，1.69(d，J＝6.8Hz，6H).
实施例29：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物30)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000196
(1)叔丁基(顺式)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000197
将三乙胺(336mg，3.33mmol)加入到叔丁基(顺式)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(250mg，1.11mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(660mg，3.19mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中，20℃搅拌5小时。反应完毕后，减压浓缩，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)分离，得产物(200mg，产率51.2％)。
(2)叔丁基(顺式)-8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000198
将叔丁基(顺式)-8-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(200mg，0.57mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(206mg，0.68mmol)、碳酸铯(370mg，1.14mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(26mg，0.029mmol)和2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(27mg，0.057mmol)加入到的1，4-二氧六环(5mL)中，氮气保护，110℃油浴中加热8小时。反应完毕，减压浓缩，经柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离， 得产物(50mg，产率14.2％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-8-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000199
将叔丁基(顺式)-8-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(50mg，0.08mmol)加入到二氯甲烷(5mL)中，然后再将三氟乙酸(3mL)滴加到反应体系中，20℃搅拌5小时。反应完毕后，将反应液减压浓缩，将残渣溶于二氯甲烷，并滴入三乙胺(2mL)，再次减压蒸干浓缩，残渣柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)分离，得产物(12mg，产率28.6％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.6 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.52(brs，3H)，8.27(brs，1H)，7.79(brs，1H)，7.27(brs，1H)，4.60-4.68(m，1H)，3.73-3.81(m，1H)，3.43-3.46(m，1H)，3.06-3.14(m，3H)，2.90-3.03(m，2H)，2.68-2.73(m，4H)，2.19(m，1H)，1.82-1.85(m，1H)，1.69(s，6H)，0.80-0.90(m，2H).
实施例30：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-7-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物31)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000200
(1)叔丁基(顺式)-7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000201
将叔丁基(顺式)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(0.12g，0.53mmol)和三乙胺(0.11g，1.09mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(0.13g，0.63mmol)，25℃搅拌反应18小时。将反应液浓缩，再用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)纯化，得黄色固体状标题化合物(0.15g，产率80.2％)。
(2)叔丁基(顺式)-7-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000202
将5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(0.1g，0.33mmol)和叔丁基(顺式)-7-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(0.11g，0.31mmol)溶解于1，4-二氧六环(10mL)中，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0.03g，0.03mmol)、2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(0.02g，0.04mmol)和碳酸铯(0.2g，0.61mmol)，氮气保护下加热至100℃搅拌反应6小时。将反应液浓缩，用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝50∶1)纯化，得黄色固体状标题化合物(0.12g，产率62.2％)。
(3)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((顺式)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-7-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000203
将叔丁基(顺式)-7-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-1-甲基-3，7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸酯(0.12g，0.19mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(3mL)，室温搅拌反应3小时。将反应液浓缩，加入乙酸乙酯(30mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(10mL×2)，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得粗品用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，得黄色固体状标题化合物(58mg，产率47.2％)。
分子式：C28H32F2N8分子量：518.62 LC-MS(m/z)：519.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.07(s，1H)，9.08(brs，1H)，8.46(s，2H)，8.42(d，J＝6.0Hz，1H)，8.35(d，J＝1.6Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.77-4.85(m，1H)，3.62(d，J＝12.8Hz，1H)，3.14(d，J＝5.2Hz，1H)，2.93-3.08(m，6H)，2.62(s，3H)，2.54(d，J＝6.4Hz，1H)，1.72-1.79(m，1H)，1.57(d，J＝7.2Hz，6H)，1.47-1.56(m，1H)，1.15-1.29(m，4H).
实施例31：(((1S，5S)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)嘧啶-2-胺(化合物32)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000204
(1)叔丁基(1R，5S)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000205
将叔丁基(1R，5S)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(350.0mg，1.77mmol)溶于四氢呋喃溶液(15mL)中，加入三乙胺(715.0mg，7.08mmol)和5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(734.0mg，3.54mmol)，继续搅拌2小时。反应完成，将反应液浓缩，加入乙酸乙酯(50mL)和水(30mL)，分液，水相用乙酸乙酯(30mL)萃取，合并有机相，浓缩，剩余物经硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得标题化合物(500mg，产率87.0％)。
(2)叔丁基(1R，5S)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000206
将叔丁基(1R，5S)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(500.0mg，1.54mmol)和5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(465.5mg，1.54mmol)溶解在1，4-二氧六环(15mL)中，加入碳酸铯(1.0g，3.08mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(141.0mg，0.154mmol)和2-二环己基膦-2'，4’，6’-三异丙基联苯(147.0mg，0.308mmol)。氮气保护，加热至110℃，反应16h，过滤，滤液浓缩，剩余物经硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得标题化合物(400mg，产率44.0％)。
(3)(((1S，5S)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000207
将叔丁基(1R，5S)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)氨基)嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(300mg，0.508mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(2mL)的混合溶液中，20℃搅拌30分钟。浓缩，加入二氯甲烷(10mL)，再次浓缩，剩余物经硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得标题化合物(160mg，产率64.2％)。
分子式：C26H28F2N8   分子量：490.6   LC-MS(m/z)：491.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.04(s，1H)，8.58(s，2H)，8.44(d，J＝6.0Hz，1H)，8.36(d，J＝2.4Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.22(d，J＝11.2Hz，1H)，4.81-4.86(m，1H)，4.62-4.67(m，1H)，3.87-3.92(m，1H)，3.74(d，J＝14.0Hz，1H)，3.63(d，J＝13.6Hz，1H)，3.49-3.55(m，2H)，3.18-3.21(m，1H)，3.05-3.11(m，1H)，2.96(d，J＝8.0Hz，1H)，2.62(s，3H)，2.11-2.19(m，2H)，1.57(d，J＝7.2Hz，6H).
实施例32：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)-5-(((1R，5S)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物33)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000208
(1)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)-5-(((1R，5S)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000209
将5-(((1S，5S)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2基)嘧啶-2-胺(100mg，0.204mmol)溶于甲醇(5mL)中，加入甲醛水溶液(0.5mL)，搅拌0.5小时，将氰基硼氢化钠(64.0mg，1.01mmol)加入到溶液中，继续搅拌0.5小时。将样品直接用硅胶柱层析分离(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)，得标题化合物(20mg，产率19.4％)。
分子式：C27H30F2N8   分子量：504.6   LC-MS(m/z)：505.2(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.60(s，2H)，8.55(d，J＝6.0Hz，1H)，8.26(d，J＝2.4Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.26(d，J＝11.2Hz，1H)，4.90-4.93(m，1H)，4.62-4.71(m，1H)，3.91-3.98(m，1H)，3.82(d，J＝13.6Hz，1H)，3.63(d，J＝13.6Hz，1H)，3.23-3.25(m，1H)，3.04-3.06(m，1H)，2.88(brs，3H)，2.69(s，3H)，2.35-2.38(m，1H)，2.18-2.26(m，2H)，2.02-2.04(m，1H)，1.69(d，J＝7.2Hz，6H).
实施例33：5-(((1R，5R)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(化合物34)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000210
(1)叔丁基(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶基-5-基)甲基)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000211
将三乙胺(0.77g，7.57mmol)加入到叔丁基(1S，5R)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(500mg，2.52mmol)和5-溴甲基-2-氯嘧啶(784mg，3.78mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中，室温搅拌5小时。反应完毕后，减压浓缩，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)分离得产物(750mg，产率91.6％)。
(2)叔丁基(1S，5R)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5基)甲基)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000212
将叔丁基(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶基-5-基)甲基)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(200mg，0.62mmol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(223mg，0.78mmol)、碳酸铯(401mg，1.23mmol)、Pd2(dba)3(11mg，0.012mmol)、X-Phos(11mg，0.024mmol)加入到1，4-二氧六环(5mL)中。氮气保护，110℃反应8小时。反应完毕后，减压浓缩，柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离得产物(210mg，产率57.7％)。
(3)5-(((1R，5R)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)-N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000213
将叔丁基(1S，5R)-3-((2-((5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-5基)甲基)-3，6-二氮杂二环[3.2.0]庚烷-6-甲酸酯(210mg，0.36mmol)加入到二氯甲 烷(10mL)中，然后再将三氟乙酸(3mL)滴加到反应体系中，室温搅拌5小时。反应完毕后，将反应液减压浓缩，将残渣溶于二氯甲烷，并滴入三乙胺(2mL)。再次减压蒸干浓缩，柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)分离得产物(120mg，产率68.8％)。
分子式：C26H28F2N8   分子量：490.6   LC-MS(m/z)：491.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.60(s，2H)，8.55(d，J＝6.0Hz，1H)，8.27(d，J＝2.0Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.27(d，J＝11.2Hz，1H)，4.56-4.61(m，1H)，3.91(t，J＝9.6Hz，1H)，3.75(q，J＝12.4Hz，2H)，3.52-3.62(m，1H)，3.12-3.26(m，2H)，3.01(d，J＝10.0Hz，1H)，2.68(s，3H)，2.22-2.35(m，1H)，2.15-2.22(m，1H)，1.89(s，1H)，1.69(d，J＝10.0Hz，6H).
实施例34：N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1S，5R)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物35)的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000214
(1)叔丁基(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-羧酸酯的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000215
将叔丁基(1S，5R)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-羧酸酯(256mg，1.29mmol)、5-(溴甲基)-2-氯嘧啶(267mg，1.29mmol)和碳酸钾(178mg，1.29mmol)加入到乙腈(15mL)中，60℃加热1小时。浓缩反应液，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化分离得产物(300mg，产率71.6％)。
(2)(1R，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000216
将叔丁基(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-6-羧酸酯(300mg，0.92mmol)溶于二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶液中，室温搅拌30分钟。浓缩反应液，加入少量二氯甲烷，再次浓缩，得粗产物(201mg)。产物无需提纯，进行下一步。
(3)(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000217
将(1R，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷(201mg，0.89mmol)溶于甲醇(10mL)中，滴加甲醛水溶液(40％，0.67mL，8.9mmol)，室温搅拌2小时，缓慢加入氰基硼氢化钠(561mg，8.9mmol)，加完后继续室温搅拌30分钟。浓缩反应液，硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)分离得到产物(124mg，两步合计产率56.2％)。
(4)N-(5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-基)-5-(((1S，5R)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷-3-基)甲基)嘧啶-2-胺的制备
Figure PCTCN2014095615-appb-000218
将(1S，5R)-3-((2-氯嘧啶-5-基)甲基)-6-甲基-3，6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷(124mg，0.52m mol)、5-氟-4-(4-氟-1-异丙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)吡啶-2-胺(157mg，0.52mmol)、碳酸铯(338mg，1.04m mol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(30mg)和2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯(60mg)加入到的1，4-二氧六环(10mL)中，氮气保护，110℃加热8小时。浓缩反应液，反相制备色谱(水∶甲醇＝10∶1-1∶1)分离，得标题化合物(26mg，产率10.0％)。
分子式：C27H30F2N8   分子量：504.6   LC-MS(m/z)：505.3(M+H+)
1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.59(s，2H)，8.56(d，J＝6.0Hz，2H)，8.28(d，J＝2.4Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.23(d，J＝11.6Hz，1H)，4.25-4.27(m，1H)，3.71-3.74(m，3H)，3.64-3.69(m，1H)，3.23-3.30(m，2H)，3.06-3.15(m，1H)，2.93-2.98(m，1H)，2.68(s，3H)，2.56(s，3H)，2.13-2.19(m，2H)，1.68(d，J＝8.4Hz，6H).

Claims (23)

  1. 通式(I′)所示的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，
    Figure PCTCN2014095615-appb-100001
    其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自C1-6烷基、C1-6烷氧基或任选被Q1取代的3-8元环烷基，Q1选自C1-6烷基或C1-6烷氧基；
    R2选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-6烷基羰基氨基；
    R3和R5分别独立地选自卤素或氢，且R3和R5至少一个为卤素；
    R4选自任选被Q2取代的3-8元杂环基、6-14元稠杂环基、5-8元杂芳基、6-14元稠杂芳基、苯基、萘基、6-12元桥杂环基或6-12元螺杂环基；
    Q2选自氨基，羟基，卤素，三氟甲基，氰基，C1-6烷氧基，C1-6烷基磺酰基，C1-6烷基磺酰氨基，二C1-6烷基氨基，或任选被取代基取代的C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元杂环基或6-9元桥杂环基，所述取代基选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、二C1-6烷基氨基、C1-6烷基磺酰基、3-8元杂环基或3-8元环烷基；
    n选自0、1、2、3、4或5。
  2. 权利要求1的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自C1-4烷基或C1-4烷氧基；
    R2选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-4烷基羰基氨基；
    R3和R5分别独立地选自卤素；
    R4选自任选被Q2取代的5-6元含氮杂环基；
    所述的“5-6元含氮杂环基”优选为“6元含氮杂环基”；
    Q2选自氨基，羟基，卤素，三氟甲基，氰基，C1-4烷氧基，二C1-4烷基氨基，或任选被 取代基取代的C1-4烷基、3-6元环烷基或3-6元杂环基，所述取代基选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷基氨基、二C1-4烷基氨基或3-6元环烷基；
    n选自0。
  3. 如权利要求2所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，所述化合物选自：
    Figure PCTCN2014095615-appb-100002
  4. 权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中所述化合物具有下述式(I)的结构，
    Figure PCTCN2014095615-appb-100003
    其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自C1-6烷基、C1-6烷氧基或任选被Q1取代的3-8元环烷基，其中Q1选自C1-6烷基或C1-6烷氧基；
    R2选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-6烷基羰基氨基；
    R3和R5分别独立地选自卤素或氢，且R3和R5至少一个为卤素；
    R4选自任选被Q2取代的3-8元杂环基、6-14元稠杂环基、5-8元杂芳基、6-14元稠杂芳基、苯基、萘基、6-12元桥杂环基或6-12元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、卤素、三氟甲基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、3-8元杂环基或6-9元桥杂环基。
  5. 如权利要求4所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自C1-4烷基或C1-4烷氧基；
    R2选自C1-4烷基、C1-4烷氧基、氰基、氨基甲酰基或C1-4烷基羰基氨基；
    R3和R5分别独立地选自卤素；
    R4选自任选被Q2取代的5-7元杂环基、6-11元稠杂环基、6-11元桥杂环基或6-11元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、5-6元杂环基或7-9元桥杂环基。
  6. 如权利要求5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自异丙基；
    R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
    R3和R5各自是氟；
    R4选自任选被Q2取代的5-6元杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、6元杂环基或8元桥杂环基。
  7. 如权利要求6所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R2选自甲基；
    R4选自任选被Q2取代的5-6元含氮杂环基，所述5-6元含氮杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或8元 含氮桥杂环基；
    所述的5-6元含氮杂环基优选为含1-2个氮原子的5-6元含氮杂环基。
  8. 如权利要求7所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R4选自任选被Q2取代的
    Figure PCTCN2014095615-appb-100004
    其中Q2选自C1-4烷基或8元含氮桥杂环基。
  9. 如权利要求5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自异丙基；
    R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
    R3和R5各自是氟；
    R4选自任选被Q2取代的7-9元桥杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
  10. 如权利要求9所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R2选自甲基；
    R4选自任选被Q2取代的7-9元含氮桥杂环基，所述7-9元含氮桥杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基或6元含氮杂环基；
    所述7-9元含氮桥杂环基优选为含1-2个氮原子的7-9元含氮桥杂环基。
  11. 如权利要求10所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R4选自任选被Q2取代的
    Figure PCTCN2014095615-appb-100005
    其中Q2选自C1-4烷基或6元含氮杂环基。
  12. 如权利要求5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自异丙基；
    R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
    R3和R5各自是氟；
    R4选自任选被Q2取代的6-10元稠杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
  13. 如权利要求12所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R2选自甲基；
    R4选自任选被Q2取代的含有1、2或3个相同或不同杂原子的6-10元稠杂环基，所述杂原子优选选自氮原子和氧原子，并且含有至少一个氮原子，所述6-10元稠杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基或C1-4烷基。
  14. 如权利要求13所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R4选自任选被Q2取代的
    Figure PCTCN2014095615-appb-100006
    Figure PCTCN2014095615-appb-100007
    其中Q2选自氨基或C1-4烷基。
  15. 如权利要求5所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    A1和A2分别独立地选自氮；
    R1选自异丙基；
    R2选自甲基、甲氧基、氰基、氨基甲酰基或乙酰氨基；
    R3和R5各自是氟；
    R4选自任选被Q2取代的7-11元螺杂环基，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基、C1-4烷基、6元杂环基或8元桥杂环基。
  16. 如权利要求15所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R2选自甲基；
    R4选自任选被Q2取代的7-11元含氮螺杂环基，所述7-11元含氮螺杂环基通过氮原子与通式(I)中的亚甲基连接，其中Q2选自氨基、羟基、三氟甲基、氰基或C1-4烷基；
    所述7-11元含氮螺杂环基优选为含1-2个氮原子的7-11元含氮螺杂环基。
  17. 如权利要求16所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，其中，
    R4选自任选被Q2取代的
    Figure PCTCN2014095615-appb-100008
    Figure PCTCN2014095615-appb-100009
    其中Q2选自C1-4烷基。
  18. 如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，所述化合物选自下述化合物：
    Figure PCTCN2014095615-appb-100010
    Figure PCTCN2014095615-appb-100011
    Figure PCTCN2014095615-appb-100012
    Figure PCTCN2014095615-appb-100013
  19. 一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体，以及任选的一种或多种药用载体。
  20. 如权利要求19所述的药物组合物，其还包含一种或多种额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂。
  21. 如权利要求20所述的药物组合物，其中所述额外的抗肿瘤剂和/或免疫抑制剂选自下述中的一种或多种：甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素和氨鲁米特。
  22. 权利要求1-18任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其酯、其溶剂化物或它们的立体异构体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防受试者中由CDK4/6激酶 介导的癌症相关疾病。
  23. 如权利要求22所述的用途，其中所述癌症相关疾病选自脑瘤、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子***、子宫内膜癌、直肠癌、肝癌、肾癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、***癌、雌性生殖道癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、***肿瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。
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