WO2013111823A1 - スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法 - Google Patents

スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法 Download PDF

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extract
glp
sphingoid
secretion
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高原義之
辻本豪三
孝 平田
菅原達也
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株式会社Ｊ－オイルミルズ
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    • C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an extract containing a sphingoid base, and more particularly to a method for producing an intestinal hormone secretion-promoting component, and a functional food and a medicament containing the intestinal hormone secretion-promoting component.
  • incretins hormones having the ability to promote the release of insulin from pancreatic ⁇ cells.
  • incretins hormones having the ability to promote the release of insulin from pancreatic ⁇ cells.
  • GLP-1 glucagon-like peptide 1
  • GIP gastric inhibitory peptide
  • Sugars, amino acids, peptides, lipids and fatty acids are known as food-derived components that promote incretin secretion from the intestinal tract. Both are used by the human body as nutrients.
  • pharmaceuticals that control intestinal hormone secretion to promote insulin release and to treat diabetes have been developed.
  • An approach of administering a GLP-1 derivative that is difficult to be degraded in the body and a degrading enzyme inhibitor (DPP4 inhibitor) that suppresses GLP-1 degradation in the body are drawing attention as next-generation diabetes drugs.
  • DPP4 inhibitor degrading enzyme inhibitor
  • a signal enters the cell by binding of a fatty acid derived from food to the receptor protein (GPR120) present on the incretin-secreting cell of the intestine, and the incretin secretion is Be guided.
  • Fatty acids having a strong action are long-chain unsaturated fatty acids.
  • ⁇ -linolenic acid ( ⁇ LA) and DHA are known to have the strongest incretin secretion action.
  • Sphingolipid is a general term for substances having the structure shown in FIG. 1, and is widely present in animals and plants.
  • a long-chain base component (sphingoid bases) and a ceramide in which a fatty acid is bonded with an acid amide have a common structure, and a sugar or phosphoric acid and a base are further bonded thereto. It is classified into a sphingophospholipid in which a glycosphingolipid with a glycoside bond and a phosphate and a base are combined.
  • Sphingolipids have been suggested to have skin beautifying effects and colorectal cancer prevention effects, and their food functions are attracting attention.
  • Many of the animal long-chain base components (sphingoid bases) are sphingosine (2-amino-4-octadecene-1,3-diol), a long-chain amino alcohol with 18 carbons.
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • sphingolipids and their constituents have various physiological activities, the present inventors considered the possibility that they have an incretin secretion-promoting action, and further promoted the incretin secretion action of various sphingolipids and their constituents. It was investigated. There has been no report that sphingolipid, its component ceramide, and its component sphingoid base have an incretin secretion promoting action.
  • sphingolipids are not easily decomposed in the intestinal tract, and sphingolipids or constituents thereof (for example, ceramide and sphingoid base) are hardly absorbed in the intestinal tract. Since cells involved in GLP-1 secretion are present in the lower intestine or in the upper part of the large intestine, the ingested sphingolipid or its constituent components are advantageous in that they reach the GLP-1 secreting cell that is the site of action. On the other hand, ⁇ -linolenic acid is mostly absorbed in the small intestine, and the amount that reaches the GLP-1 secreting cells is a part of the intake.
  • sphingolipids or their constituent components can be expected to exert the same GLP-1 secretion promoting effect as ⁇ -linolenic acid in a smaller amount than ⁇ -linolenic acid.
  • a sphingolipid or a component thereof can be expected to have a higher GLP-1 secretion promoting effect than ⁇ -linolenic acid per calorie or per molecule (number of moles).
  • sphingolipids are not easily degraded in the intestinal tract, it is better to administer the sphingoid base, which is the main body that acts on fatty acid receptors and promotes secretion of GLP-1, rather than administering sphingolipids or ceramides.
  • sphingoid bases are difficult to absorb in the intestinal tract, administration of sphingoid bases is less likely to be an excess of nutrients and induce obesity than administration of common lipids (eg, ⁇ -linolenic acid) It can be easily estimated that this is advantageous.
  • common lipids eg, ⁇ -linolenic acid
  • GLP-1 is known to stimulate the satiety center and suppress appetite.
  • the clinical results of GLP-1 derivatives clearly showed an obesity-suppressing effect. Therefore, if food is ingested, GLP-1 is released from the intestinal tract and the blood concentration of GLP-1 rises, so it can be said that ingesting food naturally also leads to prevention of diabetes.
  • An object of the present invention is to provide a method for extracting from a food a component having a high ability to promote intestinal hormone secretion per calorie or per molecule (number of moles) or a component having an ability to promote intestinal hormone secretion and difficult to be absorbed from the intestinal tract. Therefore, it is intended to provide functional foods and medicines that can be used for the prevention or treatment of obesity or diabetes.
  • the present inventors have components that are present in food and have high intestinal hormone secretion promoting ability such as GLP-1 release activity per calorie or per molecule (number of moles), or have intestinal hormone secretion promoting ability and are absorbed from the intestinal tract. We thought that it would be possible to prevent or treat obesity or diabetes by taking out difficult ingredients and taking them. Based on this idea, a component having high intestinal hormone secretion promoting activity per calorie or molecule (number of moles), or a component having intestinal hormone secretion promoting activity and difficult to be absorbed from the intestinal tract was searched for in food ingredients.
  • sphingoid bases which are components of sphingolipids widely present in animals and plants, have a high GLP-1 secretion promoting activity. Sphingoid bases are known to be difficult to absorb from the intestinal tract.
  • the present invention includes the following steps (1) to (3): (1) a step of extracting a lipid containing sphingolipid from a natural product, (2) a step of obtaining a glycosphingolipid by fractionating by chromatography from the extract obtained in step (1), and (3) an acid hydrolysis of the glycosphingolipid, and then a fatty acid methyl ester from the decomposition product. And a step of extracting and removing free fatty acids, A method for producing an extract containing a sphingoid base is provided.
  • the natural product is preferably sea cucumber or corn.
  • the present invention also provides a functional food composition or a pharmaceutical composition containing an extract containing a sphingoid base.
  • the extract is preferably a compound having a sphingoid base structure.
  • the compound having a sphingoid base structure is preferably a sphingolipid.
  • the compound having a sphingoid base structure is preferably ceramide.
  • composition of the present invention is suitable for preventing or treating diabetes, obesity, or metabolic syndrome, or assisting the prevention or treatment.
  • the sphingoid base has a function of promoting GLP-1 secretion, for example.
  • the sphingoid base is 4-sphingenin (d18: 14t) represented by 4,8-sphingadienin represented by (d18: 24t, 8t (c)), 4-hydroxy-8-sphingenin represented by (t18: 18t (c)), 9-methyl-4,8-sphingadienine (9-Me-d18: 24t, 8t) represented by 4,8,10-sphingatrienin (d18: 34t, 8t, 10t) represented by: 9-methyl-4,8,10-sphingatrienin (d19: 34t, 8t, 10t) It is preferably at least one selected from the group consisting of
  • a component having a high ability to promote secretion of intestinal hormone per calorie or a component having an ability to promote secretion of intestinal hormone from food and hardly absorbed from the intestinal tract is fractionated.
  • the extract can be provided as a functional food or medicine that can be used for the prevention or treatment of obesity and diabetes.
  • the present inventors have established a method for extracting a component that promotes intestinal hormone secretion from the fat of the food component, and have attempted to provide functional foods and pharmaceuticals containing the separated component. By improving the purity of the target component, it is possible to avoid the risk of side effects that the impurities may have. Alternatively, by clarifying the structure and properties of the active body, it is possible to stably supply the target component.
  • the raw material to be used is not particularly limited as long as it is a natural product containing sphingolipid.
  • the natural product include animal origin such as sea cucumber, fish brain and cow brain, and plant origin such as corn, wheat and rice bran, preferably sea cucumber and / or corn.
  • a solvent eg methanol
  • alkali eg potassium hydroxide
  • a final alkali concentration 0.2 to 0.5 N (eg 30 to 40 ° C., 0 Heat for 5-2 hours).
  • chloroform and water are added so that the chloroform layer and the aqueous layer are separated. For example, twice the amount of chloroform and 40% of its water are added and stirred, and the separated chloroform layer is recovered.
  • the chloroform layer is washed with water. For example, half the amount of chloroform and half the amount of water are added and stirred, and then the chloroform layer is recovered.
  • the chloroform layer contains an alkali-stable lipid fraction (crude sphingolipid fraction).
  • the sphingolipid fraction is purified using various chromatographies. For example, silica gel column chromatography or high performance liquid chromatography equipped with a silica gel column is used.
  • silica gel column chromatography for example, silica gel suspended in chloroform is packed in a glass column, and the sphingolipid fraction dissolved in chloroform is applied to the column.
  • the eluate is eluted by gradually increasing the methanol ratio in a mixed ratio of chloroform: methanol.
  • Each eluate is used in an amount equivalent to 1.5 times the column volume.
  • glycosphingolipid glucosylceramide
  • Hydrous methanolic 1N hydrochloric acid is added to the glycosphingolipid (glycosylceramide) fraction for acid hydrolysis. Acid hydrolysis at 75-85 ° C. for 10-20 hours. The decomposition product is washed 3 or 4 times with hexane to extract and remove fatty acid methyl esters and free fatty acids.
  • 4N KOH is added to the remaining methanol layer to adjust the pH to 9.7 or more, and after adding an approximately equal amount of water, the sphingoid base is extracted three times with an equal amount of diethyl ether. The collected diethyl ether is washed with an equal amount of water and then dried to nitrogen to obtain a sphingoid base.
  • a part of the obtained aldehyde derivative solution is subjected to GC-MS.
  • GC-MS analysis for example, GC-17A, QP5050A instrument (both Shimadzu, Kyoto, Japan) is used.
  • the column is DB-1 (0.25 mm ID ⁇ 30 m, 0.25 ⁇ m; Agilent Technologies, California, USA).
  • the column temperature is 80 ° C. to 160 ° C. (temperature increase 2 ° C./min), 160 ° C. to 200 ° C. (temperature increase 1 ° C./min), and the interface and injector temperatures are 250 ° C.
  • Examples of uses of functional foods containing GLP-1 secretion promoting substances or pharmaceuticals containing GLP-1 secretion promoting substances as active ingredients include the following.
  • target diseases or symptoms associated with an increase in the concentration of GLP-1 include (1) a therapeutic agent for diabetes by promoting insulin secretion from pancreatic ⁇ cells (2) hyperglycemia and insulin resistance by promoting differentiation and proliferation of pancreatic ⁇ cells Diabetes preventive that prevents the transition from sex and obesity to diabetes. Or improvement of engraftment rate of transplanted cells at the time of ⁇ -cell transplantation; (3) Treatment with excessive gastric acid by inhibiting gastric acid secretion; (4) Treatment for diarrhea by inhibiting intestinal motility And (6) obesity prevention treatment by suppressing appetite, and the like.
  • the target disease or symptom is not limited to the above, and all treatment and symptom improvement by increasing the concentration of GLP-1 are targeted.
  • composition of the present invention in addition to an extract containing a sphingoid base as an active ingredient, a pharmacologically or pharmaceutically acceptable carrier or auxiliary agent may be added within a range that does not inhibit the effect of the present invention. it can.
  • additives examples include excipients such as corn starch, crystalline cellulose, lactose; disintegrants such as starch, sodium alginate, gelatin, calcium carbonate, calcium citrate; methyl cellulose or salts thereof, ethyl cellulose, gum arabic, Binders such as gelatin; Lubricants such as talc, magnesium stearate, polyethylene glycol, hydrogenated vegetable oil; xanthine derivatives, pH adjusters, cooling agents, suspending agents, thickeners, solubilizers, antioxidants , Coating agents, plasticizers, surfactants, water, alcohols, water-soluble polymers, sweeteners such as fructose, glucose, sorbitol, flavoring agents, acidulants such as citric acid, flavorings, colorants, vitamins, minerals And lipids.
  • excipients such as corn starch, crystalline cellulose, lactose
  • disintegrants such as starch, sodium alginate, gelatin, calcium carbonate, calcium citrate; methyl
  • composition of the present invention is not particularly limited, and for example, solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets, chewable tablets, drops, drinks, liquids, suspensions, emulsions. , Syrups and dry syrups.
  • the usage of the composition of the present invention is not particularly limited.
  • the pharmaceutical may be oral or parenteral (intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, transdermal administration, etc.).
  • the intake time of the composition of the present invention may be before or after a meal, and is preferably taken before or simultaneously with a meal.
  • the intake amount of the composition of the present invention as a functional food can vary depending on the age, weight, and past disease (for example, obesity) of the subject to ingest.
  • the dose of the composition of the present invention as a pharmaceutical agent can vary depending on the age, weight, and past disease (for example, obesity) of the patient to be administered.
  • the present invention also provides a food containing the above composition.
  • a food containing the above composition By adding the composition of the present invention to foods, secretion of intestinal hormones, particularly GLP-1, can be promoted.
  • food are not particularly limited, for example, side dishes such as salad, deep-fried tofu, tofu, konjac; soup; bread, cooked rice and noodles; cookies, muffins, cakes, chips, snacks, chocolate, jelly, pudding, chewing gum, Candy and other confectionery; dairy products such as yogurt and milk; fish paste products such as ham, sausage and kamaboko; beverages such as coffee, juice and sports drinks; and general processed foods such as seasonings such as dressings, soy sauce and sauces Can be mentioned.
  • side dishes such as salad, deep-fried tofu, tofu, konjac
  • soup bread, cooked rice and noodles
  • dairy products such as yogurt and milk
  • fish paste products such as ham,
  • Example 1 Preparation of sphingoid base from corn or sea cucumber 1) Total lipid extraction Total lipid was extracted from 100 g of dried corn powder or sea cucumber powder by the Folch method using chloroform-methanol (2: 1) mixture. . To the obtained total lipid, 100 mL of methanol and 10 mL of 4N KOH were added and incubated at 37 ° C. for 1 hour to decompose glycerolipid. To this, 200 mL of chloroform and 80 mL of water were added, and only the lower chloroform layer was collected with a separatory funnel.
  • glycosphingolipid Purification of glycosphingolipid by silicic acid column chromatography Each fraction was collected and subjected to TLC together with samples (sphingomyelin, lactosylceramide, glucosylceramide, ceramide, cholesterol), and the glycosphingolipid (glucosylceramide) was The fractions contained (fractions 11 to 14) were combined and concentrated to dryness with an evaporator and nitrogen gas to obtain a glycosphingolipid fraction. The recovery rate of the glycosphingolipid fraction with respect to the dry powder was about 0.05% for corn and about 0.5% for sea cucumber.
  • Example 2 Estimation of structure of sphingoid base prepared from corn or sea cucumber The sphingoid base prepared in Example 1 was analyzed by GC-MS. Specifically, 100 ⁇ L of the sphingoid base solution obtained by acid hydrolysis was transferred to a glass tube and nitrogen-dried, and 1 mL of methanol and a 0.2 M periodic acid aqueous solution (428.0 mg of sodium periodate in water). 200 ⁇ L) was added and allowed to react in the dark for 1 hour. Thereafter, extraction was performed 3 times with 1 mL of hexane, and the collected hexane layer was washed with 3 mL of water and then concentrated with nitrogen gas. 1 ⁇ L of the obtained aldehyde derivative solution was subjected to GC-MS.
  • GC-17A and QP5050A instrument both Shimadzu, Kyoto, Japan
  • the column used was CP-Sil 88 (0.25 mm ID ⁇ 50 m, 0.2 mm; Chrompak, Middelburg, The Netherlands).
  • the column temperature was 80 ° C. to 160 ° C. (temperature increase 2 ° C./min), 160 ° C. to 200 ° C. (temperature increase 1 ° C./min), and the interface and injector temperatures were 250 ° C.
  • the measurement results of the corn-derived sphingoid base are shown in FIG.
  • the measurement results of the sea cucumber-derived sphingoid base are shown in FIG.
  • Example 3 Measurement of GLP-1 secretion-promoting activity against STC-1 STC-1 of the sample below (see cell line of hormone-secreting cells of the intestinal tract: Am. J. Pathol. 136: 1349-1363 (1990)) GLP-1 secretion promoting activity was measured.
  • STC-1 cells were seeded at a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / mL in 12 mL plates. After culturing for 48 hours, each sample ( ⁇ mol, DMSO solution) dissolved in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM (SIGMA, D6429)) (500 ⁇ L) was added. After stimulation for 1 hour, the amount of GLP-1 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Samples used were DMSO (control), ⁇ -linolenic acid 20 ⁇ M, sphingosine 10 ⁇ M and 40 ⁇ M, sea cucumber-derived sphingoid bases 10 and 40 ⁇ M, corn-derived sphingoid bases 10 and 40 ⁇ M.
  • the concentration is the final concentration.
  • Rat GLP-1 ELISA Kit wako (Wako Pure Chemical Industries, 29-59201) was used.
  • FIG. 4 shows the GLP-1 release characteristics of each sample.
  • Example 4 Measurement of GLP-1 secretion promoting activity against STC-1 STC-1 of the following sample (see cell lines secreting hormone-secreting cells of the intestinal tract: Am. J. Pathol. 136: 1349-1363 (1990)) GLP-1 secretion promoting activity was measured.
  • STC-1 cells were seeded at a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / mL in 12 mL plates. After culturing for 48 hours, each sample ( ⁇ mol, DMSO solution) dissolved in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM (SIGMA, D6429)) (500 ⁇ L) was added. After stimulation for 1 hour, the amount of GLP-1 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Samples used were DMSO (control), ⁇ -linolenic acid 10 ⁇ M, 40 ⁇ M and 100 ⁇ M, sphingosine 4 ⁇ M, 10 ⁇ M and 40 ⁇ M, sea cucumber-derived sphingoid bases 4 ⁇ M, 10 ⁇ M and 40 ⁇ M, and corn-derived sphingoid base 4 ⁇ M, 10 ⁇ M and 40 ⁇ M. It is. The concentration is the final concentration.
  • Rat GLP-1 ELISA Kit wako (Wako Pure Chemical Industries, 29-59201) was used. The results are shown in FIG.
  • sphingosine is comparable to ⁇ -linolenic acid in terms of GLP-1 secretion promoting activity against STC-1, whereas sea cucumber-derived sphingoid base and corn-derived sphingoid base are ⁇ It can be seen that linolenic acid has an activity of promoting intestinal hormone secretion per molecule (number of moles).
  • Example 5 Mouse administration test ICR mice, males 8 weeks old, were fasted for 18 hours and then orally administered with 1.5 mg / g body weight of glucose. Immediately thereafter, the following sample 27 mg / g body weight was suspended in 0.5% CMC and orally administered. For control, only 0.5% CMC solution was administered. The N number was 3 or 4. The sample used is ⁇ -linolenic acid, sphingosine, corn-derived sphingoid base, or sea cucumber-derived sphingoid base.
  • sphingosine did not show a significant difference from the control in terms of plasma GLP-1 concentration.
  • corn-derived sphingoid base and sea cucumber-derived sphingoid base significantly promoted GLP-1 secretion from the intestinal tract by oral administration. It was found that the sphingoid base has a GLP-1 secretion-promoting effect that is almost the same as or stronger than ⁇ -linolenic acid.
  • the extract containing the sphingoid base of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical or functional food for the purpose of promoting intestinal hormone secretion.

Abstract

【課題】スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法、及び得られた抽出物を含有する機能性食品又は医薬品組成物を提供する。 【解決手段】本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法は、（１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、（２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び（３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程を含む。得られる抽出物は、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進機能が高く、且つ腸管から吸収されにくいので、肥満、糖尿病あるいは腸疾患の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬の有効成分として有用である。

Description

スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法
　本発明は、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法に関し、より詳細には腸管ホルモン分泌促進成分の製造方法、並びに腸管ホルモン分泌促進成分を含む機能性食品及び医薬に関する。
　食物を摂取すると腸管から種々のホルモンが分泌され、種々の生理機能を発揮することが知られている。腸管ホルモンのうちで、膵蔵のβ細胞からインスリンを放出促進する能力を持つホルモンがインクレチンと称されている。インクレチンの具体例として、グルカゴン様ペプチド（以下、ＧＬＰ－１（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　１）と呼ぶ）及びＧＩＰ（ｇａｓｔｒｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ）が知られている。インクレチンはインスリン分泌を介して、血糖の組織取り込みを調節する重要なホルモンである。インクレチン分泌の障害は糖尿病発症の原因となる。
　腸管よりインクレチン分泌を促進する食物由来の成分として、糖類、アミノ酸、ペプチド、脂質や脂肪酸類が知られている。いずれも栄養素として人体に利用される。また、腸管ホルモン分泌をコントロールしてインスリン放出を促進し、糖尿病を治療しようとする医薬品が開発されている。体内で分解されにくいＧＬＰ－１誘導体を投与するアプローチと、体内でのＧＬＰ－１分解を抑える分解酵素阻害剤（ＤＰＰ４インヒビター）が次世代糖尿病薬として注目されている。
　腸管からのインクレチン分泌の分子メカニズムに関して、腸管のインクレチン分泌細胞上に存在する受容体蛋白質（ＧＰＲ１２０）に対して、食物由来の脂肪酸が結合することによりシグナルが細胞に入り、インクレチン分泌が誘導される。この作用を強く持つ脂肪酸は長鎖不飽和脂肪酸である。天然物の中では、αリノレン酸（αＬＡ）やＤＨＡが最も強いインクレチン分泌作用を持つことが知られている。
　スフィンゴ脂質は、図１に示す構造を持つ物質の総称であり、動物や植物に広く存在する。長鎖塩基成分（スフィンゴイド塩基類）と脂肪酸が酸アミド結合したセラミドを共通構造とし、それにさらに糖又はリン酸及び塩基が結合する。糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質とリン酸及び塩基とが結合したスフィンゴリン脂質に分類される。スフィンゴ脂質には、美肌効果や大腸がん予防効果などの可能性が示唆されており、その食品機能が注目されている。動物の長鎖塩基成分（スフィンゴイド塩基）の多くは、１８個の炭素を持つ長鎖アミノアルコールである、スフィンゴシン（２－アミノ－４－オクタデセン－１，３－ジオール）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　スフィンゴシン以外のスフィンゴイド塩基として種々の構造体が、動物や植物由来スフィンゴ脂質より発見されている。スフィンゴ脂質、その成分であるセラミド、さらにその成分であるスフィンゴイド塩基自体にも、種々の生物活性が報告されている。特に、スフィンゴシンがリン酸化されたスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）は、細胞膜上に存在するＳ１Ｐ受容体のリガンドとして、細胞運動制御、アクチン骨格形成、細胞増殖、接着結合形成のような様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。
　スフィンゴ脂質及びその構成成分が種々の生理活性を持つことから、本発明者等は、これらがインクチン分泌促進作用を持つ可能性を考え、さらに種々のスフィンゴ脂質及びその構成成分のインクレチン分泌促進作用を検討した。なお、スフィンゴ脂質、その成分であるセラミド、さらにその成分であるスフィンゴイド塩基がインクレチン分泌促進作用を有するという報告はこれまで無い。
　スフィンゴイド構造を持つ化合物、例えばスフィンゴ脂質及びセラミドは、消化管内で一部分解されることがわかっている。よって、スフィンゴ脂質あるいはセラミドを経口投与した場合に、その分解物（例えば、スフィンゴイド塩基）がＧＬＰ－１分泌促進効果を示すことが考えられる。
　しかし、スフィンゴ脂質は腸管で分解されにくく、さらに、スフィンゴ脂質あるいはその構成成分（例えばセラミドやスフィンゴイド塩基）は腸管で吸収されにくい。ＧＬＰ－１分泌に関与する細胞は小腸下部あるいは大腸上部に存在することから、摂取したスフィンゴ脂質あるいはその構成成分はその作用部位であるＧＬＰ－１分泌細胞まで到達する点で有利である。一方、αリノレン酸は、小腸でほとんどが吸収され、ＧＬＰ－１分泌細胞に到達する量は摂取量の一部である。故に、スフィンゴ脂質あるいはその構成成分は、αリノレン酸より少ない量でαリノレン酸と同等のＧＬＰ－１分泌促進効果を発揮することが期待できる。スフィンゴ脂質あるいはその構成成分は、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たり、αリノレン酸より高いＧＬＰ－１分泌促進効果が期待できる。特に、スフィンゴ脂質は、腸管で分解されにくいために、スフィンゴ脂質やセラミドを投与するよりも、脂肪酸受容体に作用してＧＬＰ－１を分泌促進する本体であるスフィンゴイド塩基を直接投与する方がＧＬＰ－１分泌促進に有利であることは容易に推測できる。スフィンゴイド塩基が腸管で吸収されにくいことからも、一般的脂質（例えばαリノレン酸）を投与するよりも、スフィンゴイド塩基を投与することが、過剰な栄養素となり肥満を誘発する可能性が低いという点で有利であることが容易に推測できる。
Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ．２０１０，３３（１０）：２２７７－２２８４ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１０，１５１（５）：１９８４－１９８９ Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（１）：９０－９４ Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．２００９，５０　Ｓｕｐｐｌ：Ｓ９１－９６ Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．２００９，１７９１（７）：６９２－６９６ Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ．２００７　Ｏｃｔ；８７（４）：１４０９－１４３９ Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１９６９　Ｊｕｌ　２９；１８７（１）：１１３－１２１ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．２０１０．５１：１７６１-１７６９
　上記次世代糖尿病薬などの臨床結果から、ＧＬＰ－１の血中濃度を上昇させることが糖尿病治療に有効であることが明確になってきている。一方、ＧＬＰ－１は満腹中枢を刺激して、食欲を抑制することが知られている。ＧＬＰ－１誘導体の臨床結果により、肥満抑制効果が明確に示された。したがって、食物を摂取すれば、腸管からＧＬＰ－１が放出され、ＧＬＰ－１の血中濃度が上昇するので、自然に食物を摂取することは、糖尿病を予防することにもつながるといえる。
　しかし、食物は栄養ともなるので、食物を摂取過剰することで、肥満、ひいては糖尿病を招く。カロリーの取り過ぎで肥満状態に陥ると、生活習慣病として糖尿病が誘発されることは周知である。したがって、ＧＬＰ－１の血中濃度を上昇させるために、食物を過剰に摂取することは、糖尿病の予防又は治療方法として適切でない。
　本発明の目的は、食物中からカロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進能の高い成分あるいは、腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を取り出す方法を提供することにより、肥満あるいは糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬を提供することにある。
　本発明者等は、食物中に存在し、ＧＬＰ－１放出活性などの腸管ホルモン分泌促進能がカロリー当たりあるいは分子（モル数）当たり高い成分、あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を取り出し、これを摂取することにより、肥満あるいは糖尿病の予防あるいは治療が可能ではないかと考えた。かかる発想の下に、カロリー当たりあるいは分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進活性の高い成分、あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を、食品成分中に探した。鋭意努力の結果、動植物に広く存在するスフィンゴ脂質の成分である、スフィンゴイド塩基類が高いＧＬＰ－１分泌促進活性を持つことを発見した。スフィンゴイド塩基類は腸管から吸収されにくいことがわかっている。
　本発明は、下記（１）～（３）の工程：
（１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、
（２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び
（３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程、
を含む、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法を提供する。
　前記天然物は、ナマコ又はトウモロコシであることが好ましい。
　本発明は、また、スフィンゴイド塩基を含む抽出物を含有する機能性食品組成物又は医薬品組成物を提供する。
　前記抽出物は、スフィンゴイド塩基構造を有する化合物であることが好ましい。
　前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物は、スフィンゴ脂質であることが好ましい。
　前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物は、セラミドであることが好ましい。
　本発明の組成物は、糖尿病、肥満、又はメタボリックシンドロームの予防又は治療あるいは予防又は治療を補助するために好適である。
　前記スフィンゴイド塩基は、例えばＧＬＰ－１分泌を促進する機能を有する。
　前記スフィンゴイド塩基は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で示される４－スフィンゲニン（ｄ１８：１４ｔ）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で示される４，８－スフィンガジエニン（ｄ１８：２４ｔ，８ｔ（ｃ））、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で示される４－ヒドロキシ－８－スフィンゲニン（ｔ１８：１８ｔ（ｃ））、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で示される９－メチル－４，８－スフィンガジエニン（９－Ｍｅ－ｄ１８：２４ｔ，８ｔ）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で示される４，８，１０－スフィンガトリエニン（ｄ１８：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）、及び、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 で示される９－メチル－４，８，１０－スフィンガトリエニン（ｄ１９：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）
からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
　本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法によれば、食物中からカロリー当たりの腸管ホルモン分泌促進能が高い成分あるいは腸管ホルモン分泌促進能を持ち且つ腸管から吸収されにくい成分を分画して取り出すことができる。抽出物は、肥満、糖尿病の予防あるいは治療に供しうる機能食品や医薬品として提供することができる。
　本発明者等は、食品成分の脂肪から腸管ホルモン分泌促進する成分を抽出する方法を確立し、分離された成分を含む機能性食品や医薬品の提供を試みた。目的の成分の純度を向上させることにより、夾雑物が持つ可能性のある副作用の危険を回避できる。あるいは活性本体の構造や性質を明らかにすることにより、目的の成分の安定的供給を可能にする。
スフィンゴ脂質の構造を示す図である。 トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基アルデヒド誘導体のＧＣクロマトグラムである。 ナマコ由来スフィンゴイド塩基のＧＣクロマトグラムである。 ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基によるＳＴＣ－１細胞からのＧＬＰ－１分泌促進活性を示すグラフである。 スフィンゴシン、ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基によるＳＴＣ－１細胞からのＧＬＰ－１分泌促進活性を示すグラフである。 スフィンゴシン、ナマコあるいはトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基の経口投与によるマウス門脈のＧＬＰ－１分泌促進効果を示すグラフである。
　本発明のスフィンゴ塩基を含む抽出物の製造方法を、以下に説明する。使用する原料は、スフィンゴ脂質を含有する天然物であれば特に限定されない。該天然物の例には、ナマコ、魚の脳、牛の脳等の動物由来、並びにトウモロコシ、小麦、米糠等の植物由来が挙げられ、好ましくはナマコ及び／又はトウモロコシである。前記天然物に、脂質を溶解する溶媒（例えばクロロホルムとメタノールとの混合液をクロロホルム：メタノール＝２：１の混合比）で添加し、スフィンゴ脂質を含む総脂質を抽出する。抽出した総脂質中のグリセロ脂質を分解する。
　溶媒（例えばメタノール）中に総脂質を溶解して、アルカリ（例えば水酸化カリウム）を加えて、アルカリの最終濃度０．２～０．５Ｎの弱アルカリ性として、加熱（例えば３０～４０℃、０．５～２時間）加熱する。
　アルカリ加水分解後、クロロホルムと水を加えて、クロロホルム層と水層が分離するようにする。例えば、２倍量のクロロホルムとその４割量の水を加えて、撹拌し、分離したクロロホルム層を回収する。
　次に、クロロホルム層を水洗する。例えば、クロロホルム量の半量のメタノールと半量の水を加えて撹拌後、クロロホルム層を回収する。クロロホルム層にアルカリ安定性の脂質画分（粗スフィンゴ脂質画分）が含まれる。
　租スフィンゴ脂質画分を、各種クロマログラフィーを用いて精製する。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーやシリカゲルカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーを用いる。
　シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、例えばガラスカラムにクロロホルムに懸濁したシリカゲルを充てんし、クロロホルムに溶解した租スフィンゴ脂質画分をカラムに供する。溶出液は、例えば、クロロホルム：メタノールの混合比を段階的にメタノールの比率を上げて溶出する。例えば、クロロホルム：メタノール＝９５：５、クロロホルム：メタノール＝９０：１０、クロロホルム：メタノール＝８０：２０、クロロホルム：メタノール＝７０：３０というように、段階的にメタノール比率の高い溶出液で溶出する。各溶出液は、カラム容量と等量から１．５倍量を用いる。
　溶出液ごとに３～５画分に分別して溶出液を採取する。クロロホルムとメタノールの混合比は、段階的に変えても連続的に変えてもかまわない。
　画分の一部を、標品（スフィンゴミエリン、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、セラミド、コレステロール）と共に、薄層クロマトグラフィーに展開して画分の成分を調べる。スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）が含まれるフラクションを集めて、エバポレーターと窒素ガスで濃縮乾固したものを、スフィンゴ糖脂質画分とする。
　スフィンゴ糖脂質（グリコシルセラミド）画分に含水メタノール性１Ｎ塩酸を加えて酸加水分解する。７５～８５℃で１０～２０時間、酸加水分解する。分解物をヘキサンで３、４回洗浄し、脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する。
　残ったメタノール層に４Ｎ　ＫＯＨを加えてｐＨを９．７以上に調整し、およそ等量の水を加えた後、等量のジエチルエーテルで３回スフィンゴイド塩基を抽出する。採取したジエチルエーテルを等量の水で洗った後、窒素乾固して、スフィンゴイド塩基とする。
　調製したスフィンゴイド塩基にメタノールと１／５量の０．２Ｍ過沃素酸水溶液を加え、暗所で１時間反応させる。その後、およそ等量のヘキサンで３回抽出し、集めたヘキサン層を等量の水で洗浄した後に、窒素ガスで濃縮する。
　得られたアルデヒド誘導体溶液の一部をＧＣ－ＭＳに供する。ＧＣ－ＭＳ分析には例えば、ＧＣ－１７Ａ，ＱＰ５０５０Ａ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（いずれも、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いる。カラムは、ＤＢ－１（０．２５ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３０ｍ，０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いる。カラム温度は、８０℃～１６０℃（昇温２℃／ｍｉｎ）、１６０℃～２００℃（昇温１℃／ｍｉｎ）、インターフェースとインジュクターの温度は２５０℃とする。
　トウモロコシから調製したスフィンゴイド塩基の成分をＧＣ－ＭＳで構造解析した結果を、図２及び表１に示す。それらの主成分は、次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　化合物２及び化合物３の８位には、シス型とトランス型の両方が存在するところ、本調製サンプルには、シス型が多く含まれる。
　ナマコから調製したスフィンゴイド塩基の成分をＧＣ－ＭＳで構造解析した結果を図３及び表２に示す。それらの主成分は次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　化合物４、化合物５及び化合物６以外にも、炭素鎖が１７や１６のものなどの多種類のスフィンゴイド塩基が存在する。
　ＧＬＰ－１分泌促進物質を含む機能性食品、あるいはＧＬＰ－１分泌促進物質を有効成分として含む医薬の用途としては、以下の用途がある。
　ＧＬＰ－１の濃度増加にともなう対象疾患又は症状として、例えば、（１）膵臓β細胞からインスリン分泌を促進することによる糖尿病治療薬（２）膵臓β細胞の分化増殖促進による、高血糖、インスリン抵抗性、肥満などから糖尿病に移行することを予防する糖尿病予防薬。又はβ細胞移植時の移植細胞の生着率向上；（３）胃酸分泌抑制による胃酸過多治療；（４）腸管運動抑制による下痢治療（５）神経の可塑性や生存を維持し、神経障害による疾患の治療；及び（６）食欲抑制による肥満予防治療、などが対象となる。ただし、対象疾患又は症状は、上記に限定されるものでなく、ＧＬＰ－１の濃度亢進による治療及び症状改善のすべてが対象となる。
　本発明の組成物は、有効成分としてのスフィンゴイド塩基を含む抽出物以外に、薬理学上あるいは食品学上許容される担体や助剤を、本発明の効果を阻害しない範囲で添加することができる。そのような添加剤の例には、コーンスターチ、結晶セルロース、ラクトース等の賦形剤；澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；メチルセルロース又はその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン等の結合剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等の滑沢剤；キサンチン誘導体、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、果糖、ブドウ糖、ソルビトール等の甘味料、矯味剤、クエン酸等の酸味料、香料、着色剤、ビタミン類、ミネラル類、脂質等が挙げられる。
　本発明の組成物の形状は、特に限定されず、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤が挙げられる。
　本発明の組成物の用法は、特に制限がない。医薬では、経口と非経口（静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与等）のいずれでもよい。本発明の組成物の摂取時期は、食前及び食後のいずれでもよく、好ましくは食事前もしくは食事と同時に摂取する。
　本発明の組成物の機能性食品としての摂取量は、摂取する対象の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。
　本発明の組成物の医薬品としての用量は、投与される患者の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。
　本発明は、また、上記組成物を含む食品を提供する。食品には、食品の中に本発明の組成物を添加しておくことで、腸管ホルモン、特にＧＬＰ－１の分泌を促進することができる。食品の例は、特に限定されず、例えば、サラダ、唐揚げ、豆腐、こんにゃく等の惣菜；スープ；パン、米飯及びヌードル；クッキー、マフィン、ケーキ、チップス、スナック、チョコレート、ゼリー、プリン、チューインガム、キャンディ等の菓子類；ヨーグルト、牛乳等の乳製品；ハム、ソーセージ、かまぼこ等の魚肉練り製品；コーヒー、ジュース、スポーツ飲料等の飲料；並びにドレッシング、醤油、ソース等の調味料等の一般加工食品が挙げられる。
〔実施例１〕トウモロコシ又はナマコからのスフィンゴイド塩基の調製
１）総脂質抽出
　クロロホルム－メタノール（２：１）混液を用いたＦｏｌｃｈ法にて、乾燥トウモロコシ粉末又はナマコ粉末１００ｇから総脂質を抽出した。得られた総脂質にメタノール１００ｍLと４Ｎ　ＫＯＨ　１０ｍLを加え、３７℃で１時間インキュベーションしてグリセロ脂質を分解した。これにクロロホルム２００ｍLと水８０ｍLを加えて、分液漏斗で下層のクロロホルム層のみを集めた。集められたクロロホルム層にさらにメタノール１００ｍLと水９０ｍLを加えて水洗し、再び分液漏斗で下層を集めた。このクロロホルム層からアルカリ安定性の脂質画分（粗スフィンゴ脂質画分）を回収した。
２）ケイ酸カラムクロマトグラフィーによるスフィンゴ糖脂質の精製
　シリカゲル６０（０．０６３－０．２００ｍｍ　カラムクロマトグラフィー用、ＭＥＲＣＫ）４６ｇを、適量のクロロホルムに懸濁し、ガラス製カラム（直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）に充填した。弱アルカリ分解処理した上記の試料を、少量のクロロホルムに溶解してカラムに供した。溶出溶媒としてクロロホルム５０ｍL、クロロホルム－メタノール（９５：５）１００　ｍL、同（９０：１０）１００ｍL、同（８０：２０）１００ｍL、同（７０：３０）１００ｍL、及びメタノール１００ｍLをこの順番に用い、溶出した各フラクションを集めた。
クロロホルム５０ｍL・・・フラクション１
クロロホルム－メタノール（９５：５）１００ｍL・・・フラクション２，３
クロロホルム－メタノール（９０：１０）１００ｍL・・・フラクション４，５，６，７
クロロホルム－メタノール（８０：２０）１００ｍL・・・フラクション８，９，１０，１１
クロロホルム－メタノール（７０：３０）１００ｍL・・・フラクション１２，１３
メタノール１００ｍL・・・フラクション１４，１５
３）スフィンゴ糖脂質の薄層クロマトグラフィー
　シリカゲル薄層プレート（２５ＨＰＴＬＣ　Ｐｌａｔｅｓ　１０ｘ１０　Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、ＭＥＲＣＫ）に標品とサンプルをスポットし、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝６４：１６：２）で展開した。次いで、硫酸銅発色試薬｛２ｍLのＨ２ＳＯ４、２０ｍLの３３％酢酸水溶液（６．６ｍL酢酸＋１３．４ｍL水）、２０ｍLのＨ３ＰＯ４、３６０ｍLの０．５％　ＣｕＳＯ４水溶液（１．８ｇＣｕＳＯ４＋３６０ｍL水）を混合して調製｝に前記プレートを浸し、ドライヤーで乾燥させた後、ホットプレートで加熱して発色させた。
４）ケイ酸カラムクロマトグラフィーによるスフィンゴ糖脂質の精製
　各フラクションを回収して、標品（スフィンゴミエリン、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、セラミド、コレステロール）と共にＴＬＣに供し、スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）が含まれるフラクション（フラクション１１～１４）を合わせ、エバポレーターと窒素ガスで濃縮乾固したものを、スフィンゴ糖脂質画分とした。スフィンゴ糖脂質画分は、乾燥粉末に対しての回収率がトウモロコシで約０．０５％、ナマコで約０．５％であった。
５）グルコシルセラミドの酸加水分解（スフィンゴイド塩基の調製）
　トウモロコシ又はナマコ由来グルコシルセラミド４ｍｇに、１ｍLの含水メタノール性１Ｎ塩酸（濃塩酸４．３ｍLに水４．７ｍLを加え、メタノールで５０ｍLに希釈）を加え、ネジ口チューブ中で、８０℃で１６時間ブロックヒーターにて反応させた。室温に冷却した後、１ｍLのヘキサンで３回洗浄し、脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去した。残ったメタノール層に４Ｎ　ＫＯＨを２００μＬ加えｐＨを９．７以上に調整し、１ｍLの水を加えた後、１ｍLのジエチルエーテルで３回スフィンゴイド塩基を抽出した。採取した３ｍLのジエチルエーテルは等量の水で洗った後、窒素乾固したものの重量を測定し、１ｍｇ／ｍLの濃度になるようにクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）に溶解し、－３０℃で保存した。
〔実施例２〕トウモロコシあるいはナマコから調製したスフィンゴイド塩基の構造の推定
　実施例１により調製したスフィンゴイド塩基をＧＣ－ＭＳにより分析した。具体的には、酸加水分解によって得られたスフィンゴイド塩基溶液１００μＬを、ガラスチューブに移して窒素乾固し、メタノール１ｍLと０．２Ｍ過沃素酸水溶液（過沃素酸ナトリウム４２８．０ｍｇを水に溶かして１０ｍLにメスアップしたもの）２００μＬを加え、暗所で１時間反応させた。その後、１ｍLヘキサンで３回抽出し、集めたヘキサン層を３ｍLの水で洗浄した後、窒素ガスで濃縮した。得られたアルデヒド誘導体溶液１μＬをＧＣ－ＭＳに供した。
　ＧＣ－ＭＳ分析には、ＧＣ－１７Ａ、ＱＰ５０５０Ａ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（いずれもＳｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。カラムはＣＰ－Ｓｉｌ　８８（０．２５ｍｍ　ＩＤ×５０ｍ、０．２ｍｍ；Ｃｈｒｏｍｐａｋ、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。カラム温度は８０℃～１６０℃（昇温２℃／ｍｉｎ）、１６０℃～２００℃（昇温１℃／ｍｉｎ）、インターフェースとインジェクターの温度は２５０℃とした。トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基の測定結果を、図２及び表１に示した。ナマコ由来スフィンゴイド塩基の測定結果を、図３及び表２に示した。
〔実施例３〕ＳＴＣ－１に対するＧＬＰ－１分泌促進活性の測定
　下記のサンプルのＳＴＣ－１（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１３４９－１３６３（１９９０）参照）からのＧＬＰ－１分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ－１細胞を４×１０５細胞／ｍLの濃度で１ｍLずつ１２ウェルプレートに蒔いた。４８時間培養後、各サンプル（μｍｏｌ、ＤＭＳＯ溶液）を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２９））（５００μL）に溶解したものを添加した。１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ－１量をＥＬＩＳＡで測定した。
　使用したサンプルは、ＤＭＳＯ（コントロール）、αリノレン酸２０μＭ、スフィンゴシン１０μＭ、及び４０μＭ、ナマコ由来スフィンゴイド塩基１０及び４０μＭ、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基１０及び４０μＭであった。濃度は、最終濃度である。ＥＬＩＳＡは、Ｒａｔ　ＧＬＰ－１　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９－５９２０１）を用いた。図４に、各サンプルのＧＬＰ－１放出特性を示す。
〔実施例４〕ＳＴＣ－１に対するＧＬＰ－１分泌促進活性の測定
　下記サンプルのＳＴＣ－１（腸管のホルモン分泌細胞の株化細胞：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１３４９－１３６３（１９９０）参照）からのＧＬＰ－１分泌促進活性を測定した。ＳＴＣ－１細胞を４×１０５細胞／ｍLの濃度で１ｍLずつ１２ウェルプレートに蒔いた。４８時間培養後、各サンプル（μｍｏｌ、ＤＭＳＯ溶液）をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２９））（５００μL）に溶解したものを添加した。１時間刺激後、培養上清のＧＬＰ－１量をＥＬＩＳＡで測定した。
　使用したサンプルは、ＤＭＳＯ（コントロール）、αリノレン酸１０μＭ、４０μＭ及び１００μＭ、スフィンゴシン４μＭ、１０μＭ及び４０μＭ、ナマコ由来スフィンゴイド塩基４基４０μＭ、１０μＭ及び４０μＭ、並びにトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基４μＭ、１０μＭ及び４０μＭである。濃度は最終濃度である。ＥＬＩＳＡは、Ｒａｔ　ＧＬＰ－１　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９－５９２０１）を用いた。結果を図５に示す。
　実施例３及び実施例４の結果から、ＳＴＣ－１に対するＧＬＰ－１分泌促進活性に関して、スフィンゴシンがαリノレン酸と同程度であるのに対し、ナマコ由来スフィンゴイド塩基及びトウモロコシ由来スフィンゴイド塩基がαリノレン酸より分子（モル数）当たりの腸管ホルモン分泌促進能の高い活性を持つことがわかる。
〔実施例５〕マウス投与試験
　ＩＣＲマウス、オス８週齢を１８時間絶食後、グルコースを１．５ｍｇ／ｇ体重、経口投与した。直後に、以下のサンプル２７ｍｇ／ｇ体重を０．５％ＣＭＣに懸濁し、経口投与した。コントロールには、０．５％ＣＭＣ溶液のみを投与した。Ｎ数は３又は４とした。使用したサンプルは、αリノレン酸、スフィンゴシン、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基、又はナマコ由来スフィンゴイド塩基である。
　サンプルの投与１時間後、門脈より採血し、血漿を得て、－８０℃で凍結保存した。保存血漿サンプルを融解後、ＧＬＰ－１量をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡとしては、Ｒａｔ　ＧＬＰ－１　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ　ｗａｋｏ（和光純薬工業、２９－５９２０１）を用いた。結果を図６に示す。有意差検定は、Ｓｃｈｅｆｆｅの多重検定を用いた。図中、＊印は、コントロールと比べて有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
　スフィンゴシンの経口投与では、血漿ＧＬＰ－１濃度に関してコントロールと有意な差が得られなかった。一方、トウモロコシ由来スフィンゴイド塩基及びナマコ由来スフィンゴイド塩基は、経口投与で腸管からのＧＬＰ－１分泌を有意に促進した。スフィンゴイド塩基のＧＬＰ－１分泌促進効果は、αリノレン酸とほぼ同程度かあるいはより強いことが判明した。
　本発明のスフィンゴイド塩基を含む抽出物は、腸管ホルモン分泌促進を目的とする医薬や機能性食品の有効成分として利用することができる。

Claims (9)

  1. 　下記（１）～（３）の工程：
    （１）天然物からスフィンゴ脂質を含有する脂質を抽出する工程、
    （２）工程（１）により得られた抽出物からクロマトグラフィーにより分画してスフィンゴ糖脂質を得る工程、及び
    （３）前記スフィンゴ糖脂質を酸加水分解した後、その分解物から脂肪酸メチルエステル及び遊離脂肪酸を抽出除去する工程、
    を含む、スフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法。
  2. 　前記天然物が、ナマコ又はトウモロコシである、請求項１に記載のスフィンゴイド塩基を含む抽出物の製造方法。
  3. 　スフィンゴイド塩基を含む抽出物を含有する機能性食品組成物又は医薬品組成物。
  4. 　前記抽出物がスフィンゴイド塩基構造を有する化合物である、請求項３に記載の組成物。
  5. 　前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物がスフィンゴ脂質である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　前記スフィンゴイド塩基構造を有する化合物がセラミドである、請求項４に記載の組成物。
  7. 　糖尿病、肥満、又はメタボリックシンドロームの予防又は治療あるいは予防又は治療を補助するための請求項３に記載の組成物。
  8. 　前記スフィンゴイド塩基がＧＬＰ－１分泌を促進する機能を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
  9. 　前記スフィンゴイド塩基が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で示される４－スフィンゲニン（ｄ１８：１４ｔ）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で示される４，８－スフィンガジエニン（ｄ１８：２４ｔ，８ｔ（ｃ））、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で示される４－ヒドロキシ－８－スフィンゲニン（ｔ１８：１８ｔ（ｃ））、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で示される９－メチル－４，８－スフィンガジエニン（９－Ｍｅ－ｄ１８：２４ｔ，８ｔ）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で示される４，８，１０－スフィンガトリエニン（ｄ１８：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）、及び、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で示される９－メチル－４，８，１０－スフィンガトリエニン（ｄ１９：３４ｔ，８ｔ，１０ｔ）
    からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３に記載の組成物。
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