KR100953177B1

KR100953177B1 - 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 레스베라트롤 유도체 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100953177B1
Application number: KR1020090132891A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 박영철; 조동하; 김민호
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2010-04-15

Abstract

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 레스베라트롤(resveratrol) 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물이 항염증 효과를 가지며 상기 효과가 레스베라트롤보다 우수하다는 것을 확인하였다.

레스베라트롤, 레스베라트롤 유도체, 염증, 항염증, 면역

Description

항염증 및 면역억제 효과를 갖는 레스베라트롤 유도체 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물 {Resveratrol derivative having anti-inflammatory and immono-suppressive effects and the pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 레스베라트롤(resveratrol) 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게는 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)에서 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하여 염증반응을 억제하는 레스베라트롤 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역 관련 염증 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

염증반응은 조직(세포)이 손상되거나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 노출되었을 때 국소 혈관과 체액에 존재하는 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴, 홍반, 부종 발열 통증 등이 나타나는 것을 말한다. 일반적으로 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생 명체 기능회복작용을 유도한다. 그러나 항원이 계속 제거되지 않거나 특정한 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 지속되면 과민성질환이나 만성 염증이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등의 치료과정에서도 장해요인이 된다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric oxide, NO, 매우 불안정하며 반응성이 강한 물질로서 생체 내에서 다양한 작용을 함)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 반해 헴옥시게나아제-1(HO-1)은 항산화제인 빌리베르딘(biliverdin)과 빌리루빈(bilirubin)을 생산해 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다.

따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX-2(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 표적이 되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS로는 여러 종류가 존재한다. cNOS (constitutive NOS: 이미 세포내에서 존재하는 단백질로 어떤 자극에 의하여 활성을 갖게 되는 것)인 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있다. 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 반면 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와도 관련 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp 387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35, pp 27-28, 1996).

LPS(lipopolysaccharide, 미생물이 생성하는 독소 종류)를 실험동물에 투여하면 많은 양의 질산염(nitrate, NO^3-)이 생성되는데 이는 대식세포에서 발생된 산화질소(NO)에서 유래하는 것으로 증명되었다. 또한, 이러한 산화질소는 대식세포와 관련된 항미생물 작용과 항암 작용의 중요한 매개물이라는 사실이 밝혀졌다. 항생제 치료시, 세균이 죽으면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)를 일으키기도 한다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med., 21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc., 409, 1982). 따라서 LPS의 작용을 줄이는 약물처리 또한 효과적인 염증억제 효과를 가져올 수 있다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 하며 효과적인 면역체계에서 중요한 역할을 수행한다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자-α[TNF-α], 인터류킨-1[IL-1], 인터루킨-2[IL-2]), 세포사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자, 산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE₂(프로스 타글란딘 E₂)를 방출하고, 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절 한다(Bresnihan, 1999; Burmester et al, 1997; Gracie et al, 1999). 또한 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존하여 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병(Gracie et al, 1999; Michaelsson et al, 1995; Stuhlmuller et al, 2000)과 관련된 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐 하는 것은 대식세포 기능조절 및 LPS의 조절 등에 달려있다.

그러나 현재까지 알려진 항염증 약물은 염증 감소 및 통증을 완화시켜 주기는 하나 위장장애 등의 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하여 새로운 치료제를 개발하거나 기존 치료제를 개선하는 것이 필수적이다.

레스베라트롤(trans-3,4',5-trihydroxystilbene)은 포도와 다른 식품에 존재하는 폴리페놀 화합물로서 강한 항산화제[Fauconneau, B. et al., Life Sci 1997 61: 2103-10], 항염증 활성[Kawada, N. et al., Hepatology 1998 27: 1265-74, Rotondo, S. et al., Br J Pharmacol 1998 123: 1691-9, Jang, M. et al., Science 1997 275: 218-20]을 가지고 있으며, 화학적 암 예방 효과를 나타내고[Jang, M. et al., Science 1997 275: 218-20], 저밀도 지질단백질의 산화를 조절한다고 보고되어 있다[Frankel, E.N. et al., Lancet 1993. 341: 1103-4]. 레스베라트롤은 항염증에 관여하는 여러 가지 유전자의 발현을 조절할 수 있는데[Manna, S.K. et al., J Immunol 2000 164: 6509-19, Tsai, S.H. et al., Br J Pharmacol 1999 126(3): 673-80] TNF-α와 IL-1 등의 사이토카인이나 LPS(lipopolysaccharide)의 활성을 방해한다는 것이 밝혀져 있다[Jang, M. et al., Science 1997 275(5297) : 218-20, Slater, I. J. Odum, and J. Hum Exp Toxicol 1999 18(10): 625-6].

상기에 언급된 것들을 참고로 하여 레스베라트롤 및 레스베라트롤 유도체 화합물을 이용하여 항염증 및 면역조절 활성 연구하던 중, 본 발명인은 레스베라트롤 유도체 화합물이 대식세포에서 면역반응을 조절하며 염증반응과 관련하여 NO 생성 및 iNOS, COX-2, PGE₂, TNF-α 등의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다. 이로 인해 상기 레스베라트롤 유도체 화합물이 항염증 활성을 나타내며 염증 질환을 치료하는데 효과적임을 밝혔다.

본 발명의 목적은 NO 생성 및 iNOS, TNF-α, COX-2, PGE₂ 등의 활성이 억제되어 항염증 활성을 갖는 레스베라트롤 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 염증 작용과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 레스베라트롤 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 레스베라트롤 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 항염증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 수산기(OH)는 임의적으로 페닐환의 오르토(ortho), 메 타(meta) 또는 파라(para)에 위치하고 m과 n은 독립적으로 0, 1 또는 2 이다.

본 발명의 대표적인 레스베라트롤 유도체 화합물은 아래와 같다.

화합물 1 : 2,5-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 2 : 3,4-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 3 : 3-Hydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 4 : N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 5 : 3,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 6 : 3,5-Dihydroxy-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 7 : 3,5-Dihydroxy-N-phenyl-benzamide

화합물 8 : 3,5-Dihydroxy-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1의 레스베라트롤 유도체를 포함하는 항염증 및 면역억제의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.

레스베라트롤 유도체 화합물의 항염증 효과 확인은,

NO 생성 억제 확인 단계; iNOS 억제 확인 단계; TNF-α 억제 확인 단계; COX-2 억제 확인 단계; PGE₂ 억제 확인 단계; 세포독성 확인 단계; 및 동물에서의 염증 억제 확인 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내 지 50 % 중량으로 포함한다. 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 화합물은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증 관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강 기능 식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 염증 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

본 발명인은 레스베라트롤 및 레스베라트롤 유도체 화합물을 이용하여 항염증 활성과 면역조절 활성을 연구하던 중, 레스베라트롤 유도체 화합물이 대식세포에서 면역반응을 조절하여 항염증 활성을 나타내며 염증 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 화합물들은 염증반응을 일으키는 매개체로 알려져 있는 NO의 생성을 줄이며, 염증반응과 관련되어 있는 각각의 활성물질을 억제하는 것으로 확인되었다. 상기 화합물들은 세포 독성이 낮은 안전한 물질로 염증을 치료하거나 예방 또는 개선하기 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 사용예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예는 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1. 레스베라트롤 유도체 화합물의 합성>

본 발명에서는 화학식 1의 대표적인 레스베라트롤 유도체 화합물 8개를 이용하여 활성을 확인하였다. 상기 대표적인 레스베라트롤 유도체 화합물들의 구조 및 이름은 표 1에 나타내었고 화합물들의 합성 방법 및 분석은 하기와 같다. 화합물의 분석은 ¹H-NMR을 사용하였다.

화합물번호	명 칭
화합물 1	2,5-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 2	3,4-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 3	3-Hydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 4	N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 5	3,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 6	3,5-Dihydroxy-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide
화합물 7	3,5-Dihydroxy-N-phenyl-benzamide
화합물 8	3,5-Dihydroxy-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide

1-1. 화합물 4 [N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

벤조익산 (6.1g, 0.05mol)과 트리에틸아민 (6.1g, 0.06mol)을 테트라하이드로퓨란 (200ml)에 가하고 0^oC로 냉각한다. 반응물에 메탄술포닐 클로라이드 (5.7g 0.05 mol)를 적가하고 20 분간 교반 후 4-아미노페놀 (5.5g, 0.05mol)을 가한다. 반응물을 0^oC를 유지하며 4 시간 동안 교반 후 감압 증발시킨다. 잔류물에 소량의 에탄올을 가하여 용해 시킨 후 0.5N 염산 수용액을 가하고 격렬히 교반하여 흰색 침전을 생성시킨다. 생성된 침전을 감압 여과하여 N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (9.4g, 82%)을 수득 하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 10.02(s, 1H), 9.24(s, 1H), 7.93(d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.45 7.54 (m, 5H), 6.75(d, 2H, J = 8.7Hz).

1-2. 화합물 3 [3-Hydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

테트라하이드로퓨란 (300ml)에 3-히드록시 벤조익산 (13.8g, 0.10mol)과 트리에틸 아민 (12.1g, 0.12mol)를 가한 후 10분간 교반한다. 반응물에 초산무수물 (12.2, 0.12mol)을 적가한 후 3 시간 동안 환류시킨다. 반응물을 실온으로 냉각하고 감압증발 시킨 후 디클로로메탄과 물을 가하고 유기층을 물과 1N 염산 수용액으로 수 차례 세척 후 감압 증발시킨다. 잔유물(oil)에 헥산을 가하여 침전을 생성하고 감압 여과하여 3-아세톡시벤조산(16.2g, 90%)을 수득하였다. 3-아세톡시 벤조익산 (9.0g, 0.05mol)과 트리에틸아민 (6.1g, 0.05mol)을 테트라하이드로퓨란 (200ml)에 가하고 0^oC로 냉각한다. 반응물에 메탄술포닐 클로라이드 (5.7, 0.05mol)를 적가하고 20 분간 교반 후 4-아미노페놀 (5.5g, 0.05mol)을 가한다. 반응물을 0^oC를 유지하며 4 시간 동안 교반 후 감압 증발시킨다. 잔류물에 소량의 에탄올을 가하여 용해 시킨 후 0.5N 염산 수용액을 가하고 격렬히 교반하여 흰색 침전을 생성시킨다. 생성된 침전을 감압 여과하여 3-아세톡시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (11.2g, 83%)을 수득 하였다. 상기 3-아세톡시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (8.1g, 0.03mol)를 0.5M 수산화칼륨 (300ml) 수용액에 가한 후 40분간 환류시킨다. 용액을 실온으로 냉각 시킨 후 1N 염산 수용액을 가하여 pH를 4~3으로 산성화 시킨다. 생성된 흰색 침전을 감압 여과하고 물로 수 차례 세척하여 순수한 3-히드록시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (6.0g, 88%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 9.89(s, 1H), 9.62(s, 1H), 9.23(s, 1H), 7.50(d, 2H, J = 8.7 Hz),7.30(m, 3H), 6.92(d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.70(d, 2H, J = 8.7 Hz).

1-3. 화합물 8 [3,5-Dihydroxy-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

3-히드록시 벤조산 대신에 3,5-디히드록시 벤조산을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 3,5-디히드록시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (5.5g, 75%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 9.82(s, 1H), 9.56(s, 2H),9.22(s, 1H), 7.51(d, 2H, 8.7 Hz), 6.73(m, 3H), 6.37(s, 1H).

1-4. 화합물 2 [3,4-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

3-히드록시 벤조산 대신에 3,4-디히드록시 벤조산을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 3,5-디히드록시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (5.1g, 70%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 9.68(s, 1H), 9.42(bs, 3H), 7.49(d, 1H, J = 8.Hz), 7.35(s, 1H), 7.34(d, 1H, J = 8.4Hz), 6.80(d, 1H, J = 8.4Hz), 6.71(d, 2H, J = 8.7Hz).

1-5. 화합물 1 [2,5-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

3-히드록시 벤조산 대신에 2,4-디히드록시 벤조산을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 3,5-디히드록시-N-(4-히드록시페닐)벤즈아미드 (4.8g, 65%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 12.47(s, 1H), 10.09(s, 1H), 9.89(s, 1H), 9.26(s, 1H), 7.82(d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.35(d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.70(d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.20(d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.22(s, 1H).

1-6. 화합물 7 [3,5-Dihydroxy-N-phenyl-benzamide]의 제조

4-아미노페놀 대신 아닐린을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2과 동일한 방법을 사용하여 목적 화합물 (5.2g, 76%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 10.02(s, 1H), 9.55(s, 2H), 7.76(d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.31(m, 3H), 7.04(m, 1H), 6.76(s, 2H), 6.40(s, 1H).

1-7. 화합물 6 [3,5-Dihydroxy-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

4-아미노페놀 대신 3-아미노페놀을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2과 동일한 방법을 사용하여 목적 화합물 (5.9g, 80%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆) : 9.93(s, 1H), 9.53(bs, 2H) , 9.40(bs, 1H), 7.33(s, 1H), 7.09(m, 2H), 6.73(s, 2H), 6.48(d, 1H, J=7.6Hz), 6.39(s, 1H).

1-8. 화합물 5 [3,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxy-phenyl)-benzamide]의 제조

4-아미노페놀 대신 2-아미노페놀을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1-2과 동일한 방법을 사용하여 목적 화합물 (5.9g, 71%)을 수득하였다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d ₆):δ 9.82(bs, 3H), 9.08(s, 1H), 7.75(d, 1H, J = 7.8 Hz), 6.80 7.10(m, 3H), 6.76(s, 2H), 6.40(s, 1H).

<실시예 2. 레스베라트롤 유도체 화합물들의 NO 생성 억제 효과>

먼저 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물들이 NO의 생성을 억제하는 지를 확인하였다. 이를 위해 생쥐대식세포인 RAW 264.7[RPMI1640에 100 U/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 10% 우혈청의 배지 이용]에 레스베라트롤과 각 레스베라트롤 유도체 화합물을 농도별로 30분간. 전처리한 후 LPS(2㎍/㎖)를 24시간 동안 처리하였다. NO 농도의 측정은 그리에스 어세이(Griess assay, Int J Biochem Cell Biol, 41(4), pp 811-821, 2009)를 참조하였다. 각각의 화합물은 도 1에 나타난 바와 같이 레스베라트롤에 비해 NO 생성을 확연하게 줄이는 효과가 있었다.

<실시예 3. 레스베라트롤 유도체 화합물들의 iNOS 생성 억제 효과>

레스베라트롤 유도체 화합물들의 iNOS 생성 억제 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 발현되는 iNOS의 mRNA 발현 정도를 비교하였다. 세포 배양 및 화합물의 처리는 실시예 2의 조건으로 수행하되 LPS는 6시간만 처리하였다(화합물 처리 농도차이는 있음). 이를 위해 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 및 quantitative real-time PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 먼저 세포를 트리졸 시약(Trizol, Invitrogen, USA)을 이용하여 모든 RNA를 분리하였고 이를 주형으로 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase)와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였고 이를 주형으로 다시 RT-PCR 및 real-time PCR을 실시하였다. 상기 RT-PCR의 결과는 도 2에, real-time PCR의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 2 및 도 3의 결과를 확인해보면, 상기 레스베라트롤 유도체 화합물이 iNOS의 생성을 줄이는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 4. 레스베라트롤 유도체 화합물들의 TNF-α 생성 억제 효과>

레스베라트롤 유도체 화합물들의 TNF-α 생성 억제 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 발현되는 TNF-α의 mRNA 발현 정도를 비교하였으며 이를 위해 실시예 3과 동일한 방법(화합물 처리 농도차이는 있음)으로 세포배양, LPS와 화합물 처리, cDNA 합성, RT-PCR 및 real-time PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR의 결과는 도 4에, real-time PCR의 결과는 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5의 결과를 확인해보면, 상기 레스베라트롤 유도체 화합물이 TNF-α의 생성을 줄이는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 5. 레스베라트롤 유도체 화합물들의 COX-2 생성 억제 효과>

레스베라트롤 유도체 화합물들의 COX-2 생성 억제 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 발현되는 COX-2의 mRNA 발현 정도를 비교하였으며 이를 위해 실시예 3과 동일한 방법(화합물 처리 농도차이는 있음)으로 세포배양, LPS와 화합물 처리, cDNA 합성, RT-PCR 및 real-time PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR의 결과는 도 6에, real-time PCR의 결과는 도 7에 나타내었다. 도 6 및 도 7의 결과를 확인해보면, 상기 레스베라트롤 유도체 화합물이 COX-2의 생성을 확연하게 줄이는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 6. 레스베라트롤 유도체 화합물들의 PGE ₂ 생성 억제 효과>

레스베라트롤 유도체 화합물들의 PGE₂ 생성 억제 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 발현되는 PGE₂의 mRNA 발현 정도를 비교하였으며 이를 위해 ELISA(Endogen, Cambridge, MA)를 수행하였고, 실시예 3과 동일한 방법으로 세포배양, LPS와 화합물 처리를 하였다. 상기 PGE₂ 생성 억제 효과는 도 8에 나타내었고, 도 8의 결과를 확인하면 상기 레스베라트롤 유도체 화합물이 PGE₂의 생성을 확연하게 줄이는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 7. 세포독성 효과>

레스베라트롤 유도체 화합물이 안전한 항염증 제제로 사용될 수 있는지 확인하기 위해 세포독성을 확인하였다. 이를 위해 RAW264.7에 레스베라트롤과 레스베라트롤 유도체 화합물을 24시간 동안 농도별로 처리하여 J Biol Chem 279(39), pp 41189-41196, 2004 에 기재된 MTT 어세이를 이용하여 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 대로 레스베라트롤 및 레스베라트롤 유도체 화합물은 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실시예 8. 귀부종 억제 효과 - 동물실험>

레스베라트롤 유도체 화합물이 염증억제 효과가 있다는 것을 추가적으로 확인하기 위해 ICR 생쥐에 귀 부종을 유도하여 이를 억제하는지 확인하였다. 이를 위해 웅성 ICR 생쥐(각 군당 7마리)에 0.5% CMC (carboxymethylcellulose, 약물 분산용 현탁액), 레스베라트롤 유도체 화합물 1(10mg/kg), 인도메타신(indomethacin, 10mg/kg, 아스피린과 비슷한 역할을 함)을 4번 경구투여로 전처리하였다. 마지막 투여 이후 아라키돈산(AA, Arachidonic acid, 2% w/v, 25㎕/ear)을 이용하여 귀부종(ear edema)을 유도하였다[Biochem Pharmacol, 37(11), pp 2161-2165, 1988). 아라키돈산(AA) 처리 4시간 이후 부종의 두께를 측정하였고 도 10에 이를 나타내었다. 도 10에 나타난 결과로 레스베라트롤 유도체 화합물인 화합물 1이 뛰어난 귀부종 억제 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 9. 약제의 제조예>

9-1. 산제의 제조

본 발명의 화합물 1 ....................................... 300㎎

유당 .................................................... 100㎎

탈크 .................................................... 10㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

9-2. 정제의 제조

본 발명의 화합물 1 ........................................ 300㎎

옥수수전분 ................................................ 100㎎

유당 ..................................................... 100㎎

스테아린산 마그네슘 ...................................... 2㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

9-3. 캅셀제의 제조

본 발명의 화합물 1 .......................................... 300㎎

옥수수전분 ................................................. 100㎎

유당 ....................................................... 100㎎

스테아린산마그네슘 ......................................... 2㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

9-4. 주사제의 제조

본 발명의 화합물 1 ........................................... 300㎎

주사용 멸균 증류수............................................ 적량

pH 조절제 .................................................... 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

9-5. 액제의 제조

본 발명의 화합물 1 ............................................ 0.5g

이성화당 ...................................................... 10g

만니톨 ....................................................... 5g

정제수 ........................................................ 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬행을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

<실시예 10. 건강식품의 제조예>

10-1. 건강 식품의 제조

본 발명의 화합물 1 ........................................... 1000㎎

비타민 혼합물................................................. 적량

비타민 A 아세테이트 ......................................... 70㎍

비타민 E .................................................... 1.0㎎

비타민 B1 ................................................... 0.13㎎

비타민 B2 .................................................... 0.15㎎

비타민 B6 ................................................... 0.5㎎

비타민 B12 .................................................. 0.2㎍

비타민 C .................................................... 10㎎

비오틴 ....................................................... 10㎍

니코틴산아미드 ................................................ 1.7㎎

엽산........................................................... 50㎍

판토텐산 칼슘 ................................................. 0.5㎎

무기질 혼합물 ................................................. 적량

황산제1철...................................................... 1.75㎎

산화아연....................................................... 0.82㎎

탄산마그네슘 .................................................. 25.3㎎

제1인산칼륨.................................................... 15㎎

제2인산칼슘.................................................... 55㎎

구연산칼륨..................................................... 90㎎

탄산칼슘 ...................................................... 100㎎

염화마그네슘 .................................................. 24.8㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만 수요 계층이나, 수요 국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 생쥐대식세포 RAW264.7에 레스베라트롤과 레스베라트롤 유도체인 화합물 1 및 화합물 2를 처리한 후 LPS를 24시간 반응하여 NO 생성이 억제되는 결과를 측정한 그래프(Griess assay)이다.

도 2 및 도 3은 생쥐대식세포 RAW264.7에 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물 1을 처리한 후 LPS를 24시간 반응하여 iNOS 생성이 억제되는 결과를 측정한 그림(RT-PCR) 및 그래프(real time PCR)이다.

도 4 및 도 5는 생쥐대식세포 RAW264.7에 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물 1을 처리한 후 LPS를 24시간 반응하여 TNF-α 생성이 억제되는 결과를 측정한 그림(RT-PCR) 및 그래프(real time PCR)이다.

도 6 및 도 7는 생쥐대식세포 RAW264.7에 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물 1을 처리한 후 LPS를 24시간 반응하여 COX-2 생성이 억제되는 결과를 측정한 그림(RT-PCR) 및 그래프(real time PCR)이다.

도 8은 생쥐대식세포 RAW264.7에 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물 1을 처리한 후 LPS를 24시간 반응하여 PGE₂ 생성이 억제되는 결과를 측정한 그래프(ELISA)이다.

도 9는 화합물의 독성여부를 확인하기 위해 생쥐 대식세포 RAW264.7에 레스베라트롤과 레스베라트롤 유도체 화합물 1 및 화합물 2를 24시간 동안 농도별로 처리한 결과를 나타내는 그래프(MTT assay)이다.

도 10은 ICR 생쥐에서 본 발명의 레스베라트롤 유도체 화합물 1의 귀부종 억제효과를 나타내는 그래프(귀 두께 비교율)이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 수산기(OH)는 임의로 페닐환의 오르토(ortho), 메타(meta) 또는 파라(para)에 치환되고 m과 n은 동시에 0이 아닌 것으로써, m과 n은 독립적으로 0, 1 또는 2 이다.
제 1 항에 있어서,

상기 화학식 1은 2,5-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide 또는 3,4-Dihydroxy-N-(4-hydroxy-phenyl)-benzamide 인 것을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 조성물은 NO의 생성을 억제하는 것임을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 조성물은 iNOS의 활성을 억제시키는 것임을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 조성물은 TNF-α의 활성을 억제시키는 것임을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 조성물은 COX-2의 활성을 억제시키는 것임을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 조성물은 PGE₂의 활성을 억제시키는 것임을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항의 화학식 1로 표시되는 레스베라트롤 유도체 화합물 중 적어도 한 가지 이상과 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.