WO2013038907A1 - 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤 - Google Patents

細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for inhibiting cell growth, a nucleic acid molecule having an RNA interference effect on a NEK10 variant gene, an expression vector for expressing the nucleic acid molecule in a cell, and a composition for inhibiting NEK10 variant gene expression, comprising the nucleic acid molecule.
  • the present invention relates to an anticancer agent comprising the nucleic acid molecule as an active ingredient, and a method for screening an anticancer agent.
  • Cancer is the number one cause of death in Japan in recent years, with more than 30,000 deaths each year due to cancer. Despite advances in cancer detection and treatment, cancer mortality remains high. In recent years, molecular target anticancer drugs such as Gleevec (registered trademark) and Herceptin (registered trademark) have attracted attention as cancer chemotherapy. It is desired.
  • Gleevec registered trademark
  • Herceptin registered trademark
  • NIMA kinase was discovered from Aspergillus nidulans, and Fin1 which is a homolog of NIMA kinase was discovered from fission yeast.
  • NIMA kinase belongs to the serine / threonine kinase family and has been shown to be important in the M phase of the cell cycle. That is, it was revealed that NIMA kinase is a molecule having a central role in controlling M phase entry, chromosome aggregation, spindle formation, and cytokinesis (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • NIMA related kinases The homologue of human NIMA kinase is NIMA related kinases (NEK), which exists from NEK 1 to 11, and forms the NEK family.
  • NEK NIMA related kinases
  • the NEK family has been shown to be an important molecule in the cell cycle and signal transduction pathways.
  • NEK2, NEK6, NEK7, and NEK9 of the NEK family have been reported to be involved in the control of M phase entry, chromosome aggregation, spindle formation, and cytokinesis, similar to NIMA kinase and Fin1.
  • NEK2 NIMA related kinases
  • Non-Patent Document 3 There is a report that NEK10 is important for G2 / M checkpoint control in response to UV irradiation (see, for example, Non-Patent Document 3). It has also been reported that SNPs present in the NEK10 gene are involved in breast cancer morbidity (see, for example, Non-Patent Documents 4 and 5). However, it was unclear whether NEK10 was involved in the growth of cells, particularly cancer cells. In addition, a molecule presumed to be a human NEK10 variant (accession number: AK098832.1, hereinafter, human NEK10 variant) is registered in the NCBI database. Since it has a kinase domain like other NEK family molecules, human NEK10 variants may also be involved in cell cycle control, but it is unclear what functions they have in vivo.
  • An object of the present invention is to provide a method for inhibiting cell growth, a nucleic acid molecule useful as an anticancer agent, and a method for screening a new anticancer agent.
  • NEK10 variants are important for cell proliferation and cell cycle control because molecules having homology with human NEK10 variants also exist in mice, and NEK10 variants are conserved across species.
  • the NEK10 variant whose function in vivo was unknown, was intensively studied.
  • the present inventor has found that cell growth suppression occurs when the expression of NEK10 variant is suppressed in a cell, and that a nucleic acid having an RNA interference effect on NEK10 variant mRNA (NEK10 siRNA) is applied to a cell, particularly a cancer cell. It has been found that it has a cell growth inhibitory action, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following configuration.
  • a method for inhibiting cell growth comprising an expression reduction step of reducing expression of a NEK10 variant gene or an activity reduction step of reducing the activity of a NEK10 variant protein in a cell.
  • the expression reduction step is selected from the group consisting of a nucleic acid molecule that suppresses expression of a NEK10 variant gene by RNA interference, a precursor of the nucleic acid molecule, and an expression vector that can express the nucleic acid molecule or the precursor.
  • the nucleic acid molecule is an siRNA having an RNA interference action that targets a base sequence in mRNA of a NEK10 variant gene represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the nucleic acid molecule is (A) a siRNA comprising a combination of a sense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, (B) a siRNA comprising a combination of a sense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, (C) a combination of a sense RNA containing 15 to 24 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense RNA containing a base sequence complementary to the sense RNA, and NEK10 SiRNA having an RNA interference effect on a variant gene, (D) a combination of a sense RNA containing 15 to 24 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense RNA containing a base sequence complementary to the sense RNA, and NEK10 SiRNA having an RNA interference effect on a variant gene,
  • the precursor is (P) 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a base sequence in which one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added or deleted And 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a base sequence in which one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added or deleted Or (q) 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added or missing The missing base sequence and 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added or deleted And a shR comprising A; And the method for inhibiting cell growth according to (2) above, wherein siRNA having an RNA interference action against a NEK10 variant gene is produced from the shRNA of (p) and the shRNA of (q) in a cell.
  • B a siRNA comprising a combination of a sense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • C a combination of a sense RNA containing 15 to 24 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense RNA containing a base sequence complementary to the sense RNA, and NEK10 SiRNA having an RNA interference effect on a variant gene
  • D a combination of a sense RNA containing 15 to 24 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense RNA containing a base sequence complementary to
  • shRNA A nucleic acid molecule which is a precursor for producing siRNA having an RNA interference action against a NEK10 variant gene in a cell.
  • An expression vector comprising the nucleic acid molecule according to (8) or (9) and capable of expressing the nucleic acid molecule.
  • NEK10 variant gene expression comprising one or more selected from the group consisting of the nucleic acid molecule according to (8), the nucleic acid molecule according to (9), and the expression vector according to (10) Composition for suppression.
  • An anticancer agent comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the nucleic acid molecule according to (8), the nucleic acid molecule according to (9), and the expression vector according to (10) .
  • a screening method for an anticancer agent using as an index the inhibitory effect on the expression of the NEK10 variant gene or the inhibitory effect on the activity of the NEK10 variant protein (14) a step of culturing NEK10 variant-expressing cells in the presence and absence of a candidate substance for the NEK10 variant gene expression inhibitory effect or the inhibitory effect on NEK10 variant protein activity; and the NEK10 variant in the cell; measuring the mRNA expression level or NEK10 variant protein activity level, and comparing the expression level or activity level in the presence and absence of the candidate substance; The screening method of the anticancer agent as described in said (13) containing.
  • the method for inhibiting cell growth of the present invention cell growth can be suppressed by acting on a novel pathway of reducing NEK10 variant activity.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a substance having an RNA interference action on NEK10 variant mRNA, and is suitably used for the cell growth inhibition method of the present invention. That is, the cell growth inhibition method and nucleic acid molecule of the present invention are extremely useful in the treatment of cancer, and can exhibit an antitumor effect even for cancer patients that have not been effective by conventional growth inhibition methods. I can expect.
  • a novel candidate compound for an anticancer agent can be obtained by the method for screening an anticancer agent of the present invention.
  • Example 1 when the NEK10 variant mRNA expression at the time of control siRNA processing is set to 100, it is the figure which showed the relative NEK10 variant mRNA expression level of each siRNA processing group. In Example 1, it is the figure which showed the cell growth rate of each siRNA processing group when the cell growth at the time of control siRNA processing is set to 100.
  • FIG. 1 when the NEK10 variant mRNA expression at the time of control siRNA processing is set to 100, it is the figure which showed the relative NEK10 variant mRNA expression level of each siRNA processing group. In Example 1, it is the figure which showed the cell growth rate of each siRNA processing group when the cell growth at the time of control siRNA processing is set to 100.
  • the method for inhibiting cell growth of the present invention includes an expression reduction step for reducing expression of a NEK10 variant gene and / or an activity reduction step for reducing the activity of a NEK10 variant protein (protein encoded by the NEK10 variant gene) in the cell. It is characterized by that.
  • a NEK10 variant protein protein encoded by the NEK10 variant gene
  • cell proliferation of the cell can be suppressed. This is considered to be a phenomenon that occurs because NEK10 variant protein is involved in cell proliferation in cells.
  • the method for reducing the expression of NEK10 variant gene or the activity of NEK10 variant protein is not particularly limited, and any of known methods used for reducing the expression of a specific gene or protein activity in a cell can be used. It may be used.
  • a substance that binds to the NEK10 variant protein such as an antibody against the NEK10 variant protein, is introduced into the cell, and the substance is bound to the NEK10 variant protein in the cell.
  • examples thereof include a method for suppressing the interaction of NEK10 variant protein with other biomolecules.
  • the method of introducing a substance that binds to the NEK10 variant protein into the cell is not particularly limited, and the substance may be directly introduced into the cell by injection or the like, and the substance is brought into contact with the cell surface to end. It may be incorporated into cells by cytosis or the like.
  • the NEK10 variant protein has a kinase activity like the NEK10 protein. Therefore, the activity of NEK10 variant protein can also be suppressed by expressing a dominant negative form in which the kinase active site of NEK10 variant protein is deleted or substituted in the cell.
  • RNA interference method a method of knocking down the NEK10 variant gene by RNA interference method.
  • a nucleic acid molecule that induces RNA interference such as antisense nucleic acid, ribozyme nucleic acid, or double-stranded RNA (dsRNA), that targets NEK10 variant gene mRNA (NEK10 variant mRNA) is introduced into the cell. Then, the NEK10 variant mRNA in the cells is degraded.
  • RNA interference refers to a siRNA that is a dsRNA formed from a sense siRNA consisting of a sequence homologous to a part of the mRNA sequence of a target gene (small interfering RNA) and an antisense siRNA consisting of a complementary sequence thereto.
  • siRNA dissociates into sense siRNA and antisense siRNA in the cell, the target gene mRNA and antisense siRNA form a double strand, and then the formed dsRNA is degraded by Dicer. Is a phenomenon in which the expression of a target gene is suppressed.
  • the RNA interference method introduces a relatively long dsRNA or hairpin shRNA (smallphairpin RNA), which is a precursor of siRNA into the cell, or siRNA or a precursor thereof. It is also possible to suppress the expression of the target gene in the same manner as siRNA by introducing a vector that expresses. Furthermore, a method for suppressing the expression of a target gene in vivo by siRNA is also known (P. Anton et al., Nature, 2002, vol. 418, p38-39; L. David et al., Nat. Genet., 2002, vol.32, p107-108).
  • RNAi nucleic acid molecule having RNA interference effect on NEK10 variant gene it is preferable to reduce the expression of the NEK10 variant gene by introducing into the cell a nucleic acid molecule having an RNA interference action against the NEK10 variant gene (hereinafter sometimes referred to as “RNAi nucleic acid molecule”).
  • the RNAi nucleic acid molecule is not particularly limited as long as it is a nucleic acid molecule having an RNA interference effect on NEK10 variant mRNA, but siRNA is preferable.
  • the siRNA used as the RNAi nucleic acid molecule in the present invention may be an siRNA for any region as long as it has an RNA interference effect on NEK10 variant mRNA.
  • An siRNA having an RNA interference action on a partial base sequence of NEK10 variant mRNA can be appropriately designed and prepared by those skilled in the art based on the base sequence information of NEK10 variant mRNA.
  • the nucleotide sequence of cDNA of human NEK10 variant mRNA is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the siRNA used in the present invention preferably has a nucleotide sequence that is completely complementary to the target nucleotide sequence in the NEK10 variant mRNA, but as long as it has an RNA interference action, it has a mismatch of one or several nucleotides. There may be.
  • the base pair length of siRNA used in the present invention is not particularly limited as long as it exhibits an RNA interference action against NEK10 variant mRNA.
  • siRNA in which the sense RNA and the antisense RNA have 15 to 30 base pairs, preferably 21 to 23 base pairs.
  • siRNA used in the present invention has an RNA interference action
  • one or several bases may be modified.
  • the modification include methylation, inosine, dU, fluorescent group modification, phosphorylation, and the like.
  • the modified base may be in sense RNA, in antisense RNA, or may be present in both.
  • the end structure of siRNA used in the present invention may be either a blunt end or a protruding end as long as the expression of the NEK10 variant gene can be regulated by the RNA interference effect.
  • the protruding end structure can include not only a structure in which the 3 'end side protrudes but also a structure in which the 5' end side protrudes as long as the RNA interference effect is exhibited.
  • the number of protruding bases is 2 to 3 bases in many siRNAs that have already been reported to show RNA interference effects against other genes, but siRNA used in the present invention induces RNA interference effects.
  • the number of protruding bases may be 1 to 8 bases, preferably 2 to 4 bases. This protruding base does not have to be complementary (antisense) or identical (sense) sequence to NEK10 variant mRNA.
  • siRNA having an RNA interference action against NEK10 variant mRNA examples include, for example, the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in NEK10 variant mRNA or a continuous base sequence thereof, for example, 15 to 24 contiguous sequences.
  • SiRNA having an RNA interference effect targeting a base sequence to be detected preferably 18 to 20 consecutive base sequences.
  • the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in NEK10 variant mRNA or a partial base sequence thereof for example, 15-24 continuous base sequences, preferably 18-20 continuous base sequences.
  • SiRNA having an RNA interference action targeting the target is also included.
  • siRNA targeting the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in NEK10 variant mRNA or a partial base sequence thereof is specifically represented by SEQ ID NO: 2 (5′-GAAAUCCUGUCAGAUGAAUACUUCA-3 ′)
  • Examples include siRNA having a RNA interference action against a NEK10 variant gene, comprising a combination of a sense RNA containing ⁇ 24 consecutive base sequences and an antisense RNA containing a base sequence complementary to the sense RNA.
  • a sense RNA comprising a base sequence in which one or several bases are substituted, added or deleted in 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the sense RNA SiRNA having a RNA interference action against the NEK10 variant gene, which is a combination of antisense RNAs containing a complementary nucleotide sequence to NEK10.
  • the sense RNA SiRNA having a RNA interference action against the NEK10 variant gene, which is a combination of antisense RNAs containing a complementary nucleotide sequence to NEK10.
  • one or several bases may be modified, and siRNA which has RNA interference effect with respect to a NEK10 variant gene may be sufficient.
  • siRNA targeting the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in NEK10 variant mRNA or a partial base sequence thereof is specifically represented by SEQ ID NO: 4 (5′-UCUGCCUUGUUGUUCACCACCUAUU-3 ′)
  • Examples include siRNA having a RNA interference action against a NEK10 variant gene, comprising a combination of a sense RNA containing ⁇ 24 consecutive base sequences and an antisense RNA containing a base sequence complementary to the sense RNA.
  • a sense RNA comprising a base sequence in which one or several bases are substituted, added or deleted in 15 or more consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the sense RNA SiRNA having a RNA interference action against the NEK10 variant gene, which is a combination of antisense RNAs containing a complementary nucleotide sequence to NEK10.
  • one or several bases may be modified, and siRNA which has RNA interference effect with respect to a NEK10 variant gene may be sufficient.
  • RNAi nucleic acid molecule such as siRNA
  • a precursor of the RNAi nucleic acid molecule is introduced into the cell, and the precursor is subjected to a reaction such as degradation in the cell.
  • RNAi nucleic acid molecules may be produced from the body.
  • the precursor of the RNAi nucleic acid molecule is not particularly limited as long as it is a precursor that finally produces an RNAi nucleic acid molecule such as siRNA in a cell.
  • siRNA precursors include relatively long dsRNA, and single-stranded RNA in which sense RNA and antisense RNA constituting siRNA are linked via a spacer.
  • the length of the spacer is not particularly limited, but may be 3 to 23 bases, for example.
  • RNA (shRNA) in which a spacer connecting the sense RNA and the antisense RNA forms a loop and the RNA sequences before and after that anneal to form a double strand is also preferred.
  • the length of the loop and stem in the shRNA is not particularly limited, but for example, the stem may be 5 to 29 bases. Further, the base may have an overhang of several bases at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end.
  • Examples of the precursor used in the method for inhibiting cell growth of the present invention include shRNA having RNA interference action targeting the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 in mRNA of NEK10 variant gene.
  • shRNA having RNA interference action targeting the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 in mRNA of NEK10 variant gene.
  • siRNA targeting the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in NEK10 variant mRNA or a partial base sequence thereof, or SEQ ID NO: 4 in NEK10 variant mRNA ShRNA capable of producing either the full length of the base sequence represented by or a siRNA targeting the partial base sequence thereof is preferred.
  • Examples of the nucleic acid molecule that is a precursor for producing siRNA targeting the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a partial base sequence thereof include 15 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 15 or more in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the above continuous base sequence, or a base sequence in which one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added or deleted Or a base sequence in which one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added, or deleted, from the shRNA to NEK10 in the cell. Examples include those that produce siRNA having an RNA interference action against a variant gene.
  • Examples of the nucleic acid molecule that is a precursor for producing siRNA targeting the full length of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a partial base sequence thereof include 15 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • a base sequence in which one or several bases in the base sequence are modified, substituted, added, or deleted, from the shRNA to NEK10 in the cell include those that produce siRNA having an RNA interference action against a variant gene.
  • RNAi nucleic acid molecules such as siRNA or nucleic acid molecules that are precursors thereof include, for example, a chemical in vitro synthesis system, an in vitro transcription method using phage RNA polymerase, a long dsRNA that is transcribed and associated using a cloned cDNA as a template. Can be appropriately prepared by a method of cleaving with RNase III or Dicer.
  • the synthesized nucleic acid molecule may be modified, or the RNAi nucleic acid molecule may be synthesized using the modified base.
  • an expression vector capable of expressing an RNAi nucleic acid molecule or a nucleic acid molecule that is a precursor thereof is introduced into the cell, and the RNAi nucleic acid molecule or the like is produced from the expression vector in the cell.
  • a vector capable of expressing siRNA include, for example, an expression vector linked to different promoters so that the sense RNA and the antisense RNA of siRNA are separately expressed, selective splicing, etc.
  • Examples include expression vectors in which sense RNA is transcribed separately.
  • the vector capable of expressing shRNA include an expression vector in which a single-stranded RNA constituting shRNA is linked downstream of a promoter.
  • RNA polymerase III promoter or the like can be used as the promoter. Specifically, for example, U6 promoter and H1 promoter can be used.
  • a retrovirus vector As a known vector, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a viral vector such as a minus-strand RNA virus vector, a non-viral vector such as a plasmid, or the like can be used.
  • RNAi nucleic acid molecule such as siRNA, a precursor thereof, or an expression vector thereof into a cell
  • any of known methods used for introducing a nucleic acid molecule into a cell can be used. It may be used.
  • an RNAi nucleic acid molecule or the like may be directly introduced into the cell by injection or the like, and may be incorporated into the cell by endocytosis or the like using a known gene introduction reagent as necessary.
  • only one type of RNAi nucleic acid molecule or the like to be introduced into a cell may be used, or two or more types may be introduced in combination.
  • the cell to be inhibited from growth expresses a cell in which the NEK10 variant gene is expressed, that is, mRNA that is a transcription product of the NEK10 variant gene and a protein that is a translation product thereof.
  • Cell (hereinafter referred to as NEK10 variant-expressing cell). It is not particularly limited as long as it is a NEK10 variant-expressing cell, and it may be a normal cell or a cancer cell.
  • the tissue etc. from which it originates are not particularly limited. For example, in the case of cancer cells, the cancer type is not particularly limited.
  • the cell derived from a human may be sufficient and the cell derived from animals other than a human may be sufficient.
  • the cell that is the target of inhibiting the growth may be a cultured cell, a cell collected from a living individual, or a cell in the living individual.
  • RNA interference occurs in the cell and the expression of the NEK10 variant gene decreases, and as a result, cell proliferation of the cell is suppressed.
  • these nucleic acid molecules can be used as an active ingredient of a cell growth inhibitor, and thus are useful substances as drugs for diseases in which cell overgrowth such as tumors is a problem.
  • these nucleic acid molecules are used as they are or mixed with a pharmacologically acceptable compounding agent as appropriate, as a composition for suppressing NEK10 variant gene expression (the composition of the present invention) or an anticancer agent (the anticancer agent of the present invention).
  • a composition for suppressing NEK10 variant gene expression the composition of the present invention
  • an anticancer agent the anticancer agent of the present invention.
  • the composition and anticancer agent of the present invention may contain only one type of nucleic acid molecule such as siRNA, or may contain a plurality of types in combination.
  • the anticancer agent of the present invention comprising a nucleic acid molecule having an RNA interference effect on NEK10 variant mRNA as an active ingredient is considered to be extremely useful in the treatment of cancers that express the NEK10 variant gene.
  • the NEK10 variant gene is expressed not only in breast cancer but also in at least liver cancer, kidney cancer, prostate cancer, and uterine cancer. For this reason, the anticancer agent of the present invention is expected to exhibit a cell proliferating action and exhibit a high antitumor effect in many cancer cells.
  • composition and anticancer agent of the present invention exhibit anticancer effects such as cancer cell proliferation inhibitory action and cancer cell death-inducing action, sensitivity enhancing action against anticancer agents, etc., against cancer cells expressing the NEK10 variant gene. Moreover, these effects by the composition or anticancer agent of the present invention may be transient or may be exhibited constantly. Moreover, after the introduction of the composition or anticancer agent of the present invention, after a certain period of time has passed, the effect may finally be manifested.
  • the compounding agents that may be added to the composition and anticancer agent of the present invention include carriers, excipients, disintegrants, binders, lubricants, fluidizing agents, coating agents, suspending agents, emulsifiers, and stabilization. And pharmaceutically acceptable additives such as agents, preservatives, flavoring agents, flavoring agents, diluents, and solubilizing agents.
  • the composition and anticancer agent of the present invention can be used orally or parenterally (systemic administration, topical administration, etc.) in the form of powders, granules, tablets, caplets, capsules, injections, suppositories, ointments, etc. ) Safely administered.
  • the content of the active ingredient (RNAi nucleic acid molecule or nucleic acid molecule that is a precursor thereof) in the composition and anticancer agent of the present invention varies depending on the preparation, but is usually preferably 0.1 to 100% by weight.
  • the dosage varies depending on the administration route, the age of the patient, and the actual symptoms to be prevented or treated, but when administered orally to an adult, for example, 0.01 mg to 2000 mg, preferably 0.1 mg per day as an active ingredient It can be ⁇ 1000 mg and can be administered once or divided into several times a day.
  • ⁇ Screening method of anticancer agent> As described above, by suppressing the function of the NEK10 variant protein in the cancer cell, for example, by reducing the expression of the NEK10 variant gene, the cell proliferation of the cancer cell is suppressed and an antitumor effect is exhibited. For this reason, the substance which has the effect
  • Candidate substances for anticancer agents include nucleic acids, peptides, proteins, organic compounds (including low molecular compounds and high molecular compounds), inorganic compounds, and the like.
  • the screening method of the present invention can be carried out on a sample containing these candidate substances (hereinafter referred to as test substances).
  • Samples containing a test substance include cell extracts, gene library expression products, microbial culture supernatants, bacterial cell components, and the like.
  • NEK10 variant-expressing cells are cultured in the presence or absence of the test substance, The expression level of NEK10 variant mRNA or NEK10 variant protein is compared.
  • the cells used for screening may be NEK10 variant-expressing cells.
  • human-derived NEK10 variant-expressing cells When screening for anticancer agents effective for humans, it is preferable to use human-derived NEK10 variant-expressing cells. However, as long as the cells are derived from a species having a base sequence having homology with human NEK10 variant mRNA, animals other than humans are used.
  • the NEK10 variant-expressing cell may be used.
  • a mouse-derived NEK10 variant-expressing cell may be used because a nucleotide sequence (NCBI accession number: NM_0011195119.1) having homology with human NEK10 variant mRNA is present in the mouse transcript.
  • the category of cells used for screening includes tissues that are aggregates of cells.
  • a transformed cell prepared by introducing an expression vector having cDNA of a human NEK10 variant gene and capable of producing a NEK10 variant protein can also be used as a NEK10 variant expression cell.
  • the contact between the test substance and the NEK10 variant-expressing cells is performed, for example, by culturing the test substance in a culture solution of NEK10 variant-expressing cells.
  • the contact condition between the test substance and the NEK10 variant-expressing cell is not particularly limited, but the culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that allow the NEK10 variant mRNA or protein to be expressed without killing the cell are selected. It is preferable.
  • Selection of candidate substances can be performed, for example, by bringing a test substance into contact with a NEK10 variant-expressing cell under the above conditions and searching for a substance that reduces the expression level of NEK10 variant mRNA or protein. Specifically, when NEK10 variant-expressing cells are cultured in the presence of a test substance, the test substance whose NEK10 variant mRNA or protein expression level is smaller than the NEK10 variant mRNA or protein expression level in the absence of the test substance under the same conditions Sort out.
  • the expression level of NEK10 variant mRNA is determined by Northern blot method using an oligonucleotide probe having a sequence complementary to the base sequence of NEK10 variant mRNA, a measurement method using DNA array, a partial base sequence in NEK10 variant mRNA as a primer
  • the RT-PCR method and real-time PCR method can be used.
  • the expression level of NEK10 variant protein can be measured by, for example, a known method using an antibody against NEK10 variant protein.
  • Examples of the measurement method using an antibody include Western blotting, immunoprecipitation, ELISA, and the like.
  • the NEK10 variant has kinase activity. Therefore, screening of anticancer agents can be performed using the inhibitory effect on the kinase activity of NEK10 variant protein as an index among test substances. Specifically, for example, purified NEK10 variant protein or a cell extract expressing NEK10 variant protein is used to compare the kinase activity of NEK10 variant protein in the presence or absence of the test substance.
  • a recombinant protein produced by a gene recombination technique can be used as the NEK10 variant protein used for measuring the kinase activity.
  • the recombinant protein can be produced by a conventional method using cDNA of NEK10 variant gene and a known expression system.
  • the expression system include an expression system using E. coli, yeast, insect cells, mammalian cells and the like as host cells, and a cell-free expression system.
  • a host cell extract after forced expression of NEK10 variant protein may be used as it is for kinase activity measurement, or a recombinant protein purified from the extract may be used.
  • an extract of cells originally expressing NEK10 variant protein and a NEK10 variant protein purified from the extract can also be used for kinase activity measurement.
  • kinase substrates As a substrate used for kinase activity measurement, various proteins generally used as kinase substrates can be used. Specific examples include MBP (myelin basic protein) and histones.
  • the protein used as a substrate may be a recombinant protein, may be artificially synthesized by peptide synthesis or the like, or may be an endogenous protein in a cell. When a recombinant protein or a protein originally present in a cell is used, either a cell extract or a protein purified from the extract may be used for kinase activity measurement.
  • test substance and NEK10 variant-expressing cells are brought into contact in a measurement environment for kinase activity measurement.
  • Conditions such as temperature, pH, and salt concentration for kinase activity measurement are not particularly limited as long as phosphorylation of a protein serving as a substrate by NEK10 variant protein occurs.
  • Selection of candidate substances can be performed, for example, by comparing the phosphorylation amount of the substrate protein by the NEK10 variant protein with the phosphorylation amount of the substrate protein in the absence of the test substance in the presence of the test substance under the above conditions. it can. Specifically, a test substance in which the phosphorylation amount of the substrate protein in the presence of the test substance is smaller than the phosphorylation amount of the substrate protein in the absence of the test substance under the same conditions is selected.
  • the substance selected by the method for screening an anticancer agent of the present invention has an action of suppressing the expression of NEK10 variant gene in cells and reducing the production of NEK10 variant protein or reducing the kinase activity of NEK10 variant protein. It is considered useful for cancer treatment. It is also possible to obtain derivatives having excellent effects and safety by producing various derivatives of the test substance selected by the screening method and conducting further screening on these derivatives.
  • a primer for amplifying cDNA synthesized from NEK10 variant mRNA and a primer for amplifying cDNA synthesized from GAPDH mRNA were used, and BRILIANT SYBR (registered trademark) Real-time PCR was performed using GREEN master mix (Stratagene) according to the instructions for use.
  • Amplification of GAPDH was performed as a reaction system control. That is, after heat denaturation at 95 ° C. for 10 minutes, a PCR reaction was performed in which one cycle was 95 ° C. for 30 seconds, then 55 ° C. for 60 seconds, followed by 40 cycles of a cycle reaction consisting of 72 ° C. for 60 seconds.
  • MX3000 (STRATAGENE) was used as the real-time PCR machine.
  • a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6: 5′-GCACACAAAGGTATTTTATGG-3 ′, and the base sequence of SEQ ID NO: 7: 5′-CTACTCAAACTTGCCTTTCCA-3 ′
  • a reverse primer consisting of
  • primers for amplifying cDNA synthesized from GAPDH mRNA a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8: 5′-TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-3 ′, and SEQ ID NO: 9: 5 ′ -ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-3 ′
  • a reverse primer consisting of a base sequence was used.
  • the determination of the Ct value was performed using software MX Pro (STRATAGENE).
  • the Ct value is the number of cycles (Cycle Threshold: Ct value) at
  • ⁇ Ct (NEK10 gene variant) value C value of NEK10 variant mRNA ⁇ Ct value of GAPDH mRNA
  • Table 1 shows the relative expression level of NEK10 variant mRNA in various cancer cell lines when the expression level of NEK10 variant mRNA in HeLaS3 cells is 100, obtained using the above formula (2).
  • NEK10 variant mRNA expression was observed in breast cancer cells, liver cancer, kidney cancer, prostate cancer and uterine cancer cells. Therefore, it is speculated that the NEK10 variant plays an important role not only in breast cancer cells but also in cancer cells other than breast cancer.
  • Example 1 This example was performed in order to confirm that siRNA having an RNA interference action on NEK10 variant mRNA suppresses the expression of NEK10 variant mRNA and suppresses the growth of cancer cells.
  • NEK10 siRNA # 1 comprising a combination of a sense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense RNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a base represented by SEQ ID NO: 4
  • NEK10 variant after introduction into siRNA and siRNA treatment comprising siRNA comprising a combination of sense RNA comprising sequence and antisense RNA comprising nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (hereinafter referred to as NEK10 siRNA # 2)
  • mRNA was measured by real-time PCR using SYBR (registered trademark) GREEN, and the knockdown effect on NEK10 variant mRNA was examined.
  • control siRNA NEK10 siRNA # 1, or NEK10 siRNA # 2 was introduced into the cells and treated with siRNA.
  • the subsequent NEK10 variant mRNA was measured by real-time PCR using SYBR (registered trademark) GREEN, and the knockdown effect of NEK10 variant mRNA by each siRNA was examined.
  • Control siRNA was purchased from Invitrogen, and NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 were synthesized by Invitrogen.
  • siRNA was introduced using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Specifically, 1 ⁇ L of siRNA (20 nM) dissolved in 50 ⁇ L of OptiMEM (Invitrogen) was mixed with 1 ⁇ L of Lipofectamine RNAiMAX dissolved in 50 ⁇ L of OptiMEM and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and further mixed at room temperature for 20 minutes. Left to stand. After allowing to stand, the above mixed solution was added to the cells and cultured at 37 ° C. for 3 hours. Then, the medium was changed, and the cells were further cultured for 72 hours.
  • OptiMEM Invitrogen
  • the reagents, primers and equipment used are the same as in Reference Example 1.
  • NEK10 variant mRNA amount 2 ( ⁇ Ct (control) value ⁇ Ct (sample) value) ⁇ 100
  • the vertical axis represents the relative NEK10 variant mRNA expression level of each siRNA treatment group when the NEK10 variant mRNA expression at the time of control siRNA treatment is 100.
  • the horizontal axis shows each siRNA treatment group.
  • control siRNA or NEK10 siRNA-treated NEK10 mRNA paired control (%) is 107 ⁇ 6.2 in the control siRNA treatment group, 11 ⁇ 0.5 in the NEK10 siRNA # 1 treatment group, The NEK10 siRNA # 2 treatment group was 86 ⁇ 7.4.
  • the NEK10 siRNA # 1 treatment group was significantly (***, p ⁇ 0.001) NEK10 variant mRNA compared to the control siRNA treatment group. was suppressed.
  • the NEK10 siRNA # 2 treatment group also significantly (**, p ⁇ 0.01) suppressed the expression of NEK10 variant mRNA as compared to the control siRNA treatment group. That is, it has been clarified that NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 both suppress NEK10 variant mRNA expression in breast cancer cells.
  • NEK10 siRNA cancer cell growth inhibitory effect It was confirmed that NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 have a growth inhibitory effect on cancer cells. That is, whether or not cell growth was suppressed by introducing NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 into cells and knocking down the NEK10 variant gene was examined by the methylene blue method.
  • Each siRNA was introduced into MDA-MB-231 cells in the same manner as described above (confirmation of NEK10 variant mRNA expression inhibitory action), and cultured for 72 hours after introduction. After the culture, the medium was removed, 1000 ⁇ L of methanol was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 minutes to fix the cells. After removing methanol, 1000 ⁇ L of staining solution (0.05% methylene blue solution) was added and staining was performed for 30 minutes. After washing 3 times with 4 mL of distilled water, 2 mL of 3% HCl solution was added, and the absorbance at 660 nm of methylene blue was measured using a microplate reader (BioRad).
  • the vertical axis represents the cell growth rate of each siRNA treatment group when the cell growth at the time of control siRNA treatment is 100.
  • the horizontal axis shows each siRNA treatment group.
  • the cell growth rate (%) of breast cancer cells MDA-MB-231 by each siRNA treatment was 88 ⁇ 18 in the control siRNA treatment group, 34 ⁇ 14 in the NEK10 siRNA # 1 treatment group, and 58 ⁇ 17 in the NEK10 siRNA # 2 treatment group. Met.
  • the NEK10 siRNA # 1 treatment group was significantly (*, p ⁇ 0.05) MDA-MB-231 compared with the control siRNA treatment group. Inhibited cell growth.
  • the NEK10 siRNA # 2 treatment group could not confirm statistical significance, the growth of MDA-MB-231 cells was suppressed as compared with the control siRNA treatment group. That is, it has been clarified that NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 have a growth inhibitory effect on breast cancer cells, although they have some effects.
  • NEK10 siRNA # 1 which has a higher inhibitory effect on the expression of NEK10 variant mRNA, had a higher cell growth inhibitory effect than NEK10 siRNA # 2.
  • siRNA that can be 86 or less in (%).
  • NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 target different sequences of NEK10 variant mRNA, when each siRNA is used alone by using NEK10 siRNA # 1 and NEK10 siRNA # 2 together It is expected that a higher cell growth inhibitory effect (antitumor effect) can be obtained.
  • the cell growth suppression method and nucleic acid molecule of the present invention can suppress the growth of various cells expressing NEK10 variant genes, particularly cancer cells, and are therefore used in the fields of cancer treatment and production of anticancer agents. Is possible.

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Abstract

本発明は、細胞の増殖抑制方法、抗癌剤として有用な核酸分子、及び新たな抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。本発明においては、細胞にＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子を導入することにより、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果が得られる。本発明は、この抑制効果を指標とした抗癌剤のスクリーニング方法も提供する。

Description

細胞の増殖抑制方法、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
　本発明は、細胞の増殖抑制方法、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子、細胞内に当該核酸分子を発現させるための発現ベクター、当該核酸分子を含む、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物、当該核酸分子を有効成分とする抗癌剤、及び抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
　癌は、近年の日本における第１位の死因であり、毎年３０、００００以上が癌により亡くなっている。癌の検出及び治療は進歩しているにもかかわらず、癌の死亡率は依然として高いままである。癌の化学療法として、近年、グリベック（登録商標）やハーセプチン（登録商標）等の分子標的抗癌剤が注目を集めているが、効果を示す患者が限定されるため、新たな分子標的抗癌剤の開発が望まれている。
　１９７０年代初頭に、ＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓから、また、ＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅのホモログであるＦｉｎ１が***酵母から発見された。ＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅはセリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、細胞周期のＭ期に重要であることが示された。すなわち、ＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅは、Ｍ期への進入、染色体の凝集、紡錘体の形成及び細胞質***の制御において中心的役割を有する分子であることが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。
　ヒトのＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅのホモログは、ＮＩＭＡ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅｓ（ＮＥＫ）でありＮＥＫ１から１１まで存在し、ＮＥＫファミリーを形成する。これまでに、ＮＥＫファミリーは細胞周期及びシグナル伝達経路に重要な分子であることがわかっている。例えば、ＮＥＫファミリーのうちのＮＥＫ２、ＮＥＫ６、ＮＥＫ７、及びＮＥＫ９は、ＮＩＭＡ　ｋｉｎａｓｅ及びＦｉｎ１と同様に、Ｍ期への進入、染色体の凝集、紡錘体の形成及び細胞質***の制御に関与すると報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
　ＮＥＫ１０については、ＵＶ照射に対する応答におけるＧ２／Ｍ期チェックポイント制御に重要であるとの報告がある（例えば、非特許文献３参照）。また、ＮＥＫ１０遺伝子に存在するＳＮＰが乳癌の罹患率に関与することが報告されている（例えば、非特許文献４及び５参照）。但し、ＮＥＫ１０が細胞、特に癌細胞の増殖に関与しているかについては、不明であった。また、ＮＣＢＩのデータベースには、ヒトＮＥＫ１０バリアントと推測される分子（アクセッション番号：ＡＫ０９８８３２．１、以下、ヒトＮＥＫ１０バリアント）が登録されている。他のＮＥＫファミリー分子と同様にキナーゼドメインを有することから、ヒトＮＥＫ１０バリアントも細胞周期制御に関わっている可能性があるものの、生体内でどのような機能を持つかは不明であった。
Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，ｖｏｌ．１３，ｐ．２２１～２２８． Ｌ．Ｏ’Ｒｅｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ２００７，ｖｏｌ．２，ｐ．２５～３６． Ｌ．Ｓ．Ｍｏｎｉｚ　ｅｔ　ａｌ．，　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．３１，ｐ．３０～４２． Ｓ．Ａｈｍｅｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, ２００９， ｖｏｌ．４１， ｐ．５８５～５９０. Ａ．Ｃ．Ａｎｔｏｎｉｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，ｖｏｌ．７０，ｐ．９７４２～９７５４.
　本発明は、細胞の増殖抑制方法、抗癌剤として有用な核酸分子、及び新たな抗癌剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、ヒトＮＥＫ１０バリアントと相同性を有する分子がマウスにも存在し、ＮＥＫ１０バリアントが種を超えて保存されていることから、ＮＥＫ１０バリアントは細胞増殖や細胞周期制御に重要であると考え、生体内での機能が不明であったＮＥＫ１０バリアントについて鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、細胞においてＮＥＫ１０バリアントの発現が抑制されると細胞増殖抑制が起こること、及びＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸（ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ）が細胞、特に癌細胞に対する細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の構成をとる。
（１）　細胞において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる発現低下工程、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる活性低下工程を含む、細胞の増殖抑制方法。
（２）　前記発現低下工程が、ＲＮＡ干渉によりＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制する核酸分子、前記核酸分子の前駆体、及び、前記核酸分子又は前記前駆体を発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種を細胞に導入する工程である、前記（１）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（３）　前記核酸分子が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであり、
　前記前駆体が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｈＲＮＡである、前記（２）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（４）　前記核酸分子が、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、並びに、
（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
からなる群より選択される、前記（２）又は（３）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（５）　前記前駆体が、細胞内において、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は
（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
の何れかを産生する核酸分子である、
前記（２）～（４）の何れか一つに記載の細胞の増殖抑制方法。
（６）　前記前駆体が、
（ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
（ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；
であり、かつ
細胞内において、前記（ｐ）のｓｈＲＮＡ及び前記（ｑ）のｓｈＲＮＡから、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生される、前記（２）に記載の細胞の増殖抑制方法。
（７）　前記細胞が癌細胞である、前記（１）～（６）のいずれか一つに記載の細胞の増殖抑制方法。
（８）　（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
（ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は、
（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
である、核酸分子。
（９）　（ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
（ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ、
であり、細胞内において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である、核酸分子。
（１０）　前記（８）又は（９）に記載の核酸分子を含み、当該核酸分子を発現させ得る、発現ベクター。
（１１）　前記（８）に記載の核酸分子、前記（９）に記載の核酸分子、及び前記（１０）に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を含む、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物。
（１２）　前記（８）に記載の核酸分子、前記（９）に記載の核酸分子、及び前記（１０）に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、抗癌剤。
（１３）　ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果を指標とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
（１４）　ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現抑制効果、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果についての候補物質の存在下及び非存在下で、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞をそれぞれ培養する工程；及び
　当該細胞内のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性量を測定し、当該候補物質存在下及び非存在下での発現量又は活性量を比較する工程；
を含む、前記（１３）に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
　本発明の細胞の増殖抑制方法により、ＮＥＫ１０バリアント活性の低下という新規な経路に作用することによって、細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の核酸分子は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する物質であり、本発明の細胞の増殖抑制方法に好適に用いられる。すなわち、本発明の細胞の増殖抑制方法及び核酸分子は、癌の治療において極めて有用であり、従来の増殖抑制方法によっては効果が得られなかった癌患者に対しても抗腫瘍効果を示すことが期待できる。
　また、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法により、新たな抗癌剤の候補化合物を取得することができる。
実施例１において、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理時のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を示した図である。 実施例１において、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理時の細胞増殖を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の細胞増殖率を示した図である。
＜細胞の増殖抑制方法＞
　本発明の細胞の増殖抑制方法は、細胞において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる発現低下工程、及び/又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質（ＮＥＫ１０バリアント遺伝子がコードするタンパク質）の活性を低下させる活性低下工程を含むことを特徴とする。細胞内におけるＮＥＫ１０バリアントタンパク質の機能を抑制することにより、細胞の細胞増殖を抑制することができる。これは、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質が、細胞における細胞増殖に関与しているために生じる現象と考えられる。ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる方法は、特に限定されるものではなく、細胞内における特定の遺伝子の発現又はタンパク質の活性を低下させる際に用いられる公知の手法のいずれを用いてもよい。
　ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる方法としては、例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に対する抗体等の、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に結合する物質を細胞内に導入し、当該物質を細胞内のＮＥＫ１０バリアントタンパク質と結合させることによってＮＥＫ１０バリアントタンパク質が他の生体分子と相互作用することを抑制する方法が挙げられる。ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に結合する物質を細胞内へ導入する方法は特に限定されるものではなく、当該物質をインジェクション等により直接細胞内へ導入してもよく、当該物質を細胞表面上に接触させてエンドサイトーシス等により細胞内へ取り込ませてもよい。その他、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質はＮＥＫ１０タンパク質と同様にキナーゼ活性を持つことが、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の構造から推測される。したがって、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性は、細胞内に、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性部位を欠失又は置換したドミナントネガティブ体を発現させることによって抑制することも可能である。
　一方、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる方法としては、ＲＮＡ干渉法によりＮＥＫ１０バリアント遺伝子をノックダウンする方法を挙げることができる。具体的には、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ（ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ）を標的とする、アンチセンス核酸、リボザイム核酸、又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等のＲＮＡ干渉を誘導する核酸分子を、細胞内へ導入し、当該細胞内のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを分解させる。
　一般的にＲＮＡ干渉とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部と相同な配列からなるセンスｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスｓｉＲＮＡから形成されたｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡを細胞に投与することにより、細胞内でｓｉＲＮＡが、センスｓｉＲＮＡ及びアンチセンスｓｉＲＮＡに乖離し、標的遺伝子ｍＲＮＡとアンチセンスｓｉＲＮＡが二本鎖を形成し、その後、この形成されたｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒにより分解されることにより、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。ＲＮＡ干渉法は、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するほか、細胞内へｓｉＲＮＡの前駆体となる比較的長鎖のｄｓＲＮＡ又はヘアピン型のｓｈＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ)を導入することや、ｓｉＲＮＡ又はその前駆体を発現するベクターを導入することによっても、ｓｉＲＮＡと同様に目的遺伝子の発現を抑制することも可能である。さらに、ｓｉＲＮＡにより、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて標的遺伝子の発現を抑制する方法も知られている（Ｐ．Ａｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，ｖｏｌ．４１８，ｐ３８－３９；Ｌ．Ｄａｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００２，ｖｏｌ．３２，ｐ１０７－１０８）。
［ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子］
　本発明においては、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子（以下、「ＲＮＡｉ核酸分子」ということがある）を細胞へ導入することによって、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させることが好ましい。ＲＮＡｉ核酸分子としては、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子であれば特に限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
　本発明においてＲＮＡｉ核酸分子として用いられるｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を有する限り、そのどの領域に対してのｓｉＲＮＡであってもよい。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの部分塩基配列に対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、当業者であれば、適宜設計して調製することが出来る。例えば、ヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の標的とする塩基配列と、完全に相補的な塩基配列を有していることが好ましいが、ＲＮＡ干渉作用を有する限り、１又は数塩基のミスマッチがあってもよい。
　本発明において用いられるｓｉＲＮＡの塩基対長は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉作用を示すものであれば特に限定されるものではない。例えば、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡが１５～３０個の塩基対、好ましくは２１～２３個の塩基対からなるｓｉＲＮＡが挙げられる。
　また、本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉作用を有する限り、１又は数個の塩基が修飾されていてもよい。当該修飾としては、メチル化、イノシン化、ｄＵ化、蛍光基修飾、又はリン酸化等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ中、修飾塩基は、センスＲＮＡ中にあってもよく、アンチセンスＲＮＡ中にあってもよく、両方に存在していてもよい。
　本発明において用いられるｓｉＲＮＡの末端構造は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現をＲＮＡ干渉効果により調節することが可能であれば、平滑末端と突出末端のいずれであってもよい。突出末端構造は、３’末端側が突出している構造だけではなく、上記ＲＮＡ干渉効果を示す限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、既に他の遺伝子に対しＲＮＡ干渉効果を示すことが報告されているｓｉＲＮＡの多くでは２～３塩基であるが、本発明において用いられるｓｉＲＮＡでは、ＲＮＡ干渉効果を誘導することができる塩基数であればよく、例えば、突出する塩基数は、１～８塩基、好ましくは２～４塩基であってもよい。この突出している塩基については、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相補的（アンチセンス）又は同一（センス）配列である必要はない。
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡとしては、例えば、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその一部の連続する塩基配列、例えば１５～２４個の連続する塩基配列、好ましくは１８～２０個の連続する塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその一部の連続する塩基配列、例えば１５～２４個の連続する塩基配列、好ましくは１８～２０個の連続する塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡも挙げられる。
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号２（５’－ＧＡＡＡＵＣＣＵＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＡＡＣＵＵＣＡ－３’）で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３（５’－ＵＧＡＡＧＵＵＡＵＣＡＵＣＵＧＡＣＡＧＧＡＵＵＵＣ－３’）で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡや、配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。その他、これらのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号４（５’－ＵＣＵＧＣＣＵＵＧＵＵＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＵＡＵＵ－３’）で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５（５’－ＡＡＵＡＧＵＧＧＵＧＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡ－３’）で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡや、配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが挙げられる。また、配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。その他、これらのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであってもよい。
［ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体］
　本発明の細胞の増殖抑制方法においては、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子を直接細胞へ導入してもよく、ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体を細胞へ導入し、当該細胞内において分解等の反応により当該前駆体からＲＮＡｉ核酸分子を産生させてもよい。ＲＮＡｉ核酸分子の前駆体としては、細胞内において最終的にｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子を産生する前駆体であればよく、特に限定されない。ｓｉＲＮＡの前駆体としては、例えば、比較的長鎖のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡがスペーサーを介して連結されている一本鎖ＲＮＡが挙げられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、例えば３～２３塩基としてよい。また、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを連結するスペーサーがループを形成して、その前後のＲＮＡ配列同士がアニールして２本鎖を形成するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も好ましい。ｓｈＲＮＡ中のループ及びステムの長さは特に限定されないが、例えばステムは５～２９塩基としてよい。また、５’末端及び／又は３’末端に数塩基のオーバーハングを有していてもよく、有していなくてもよい。これらの前駆体が、細胞内でＤｉｃｅｒ等により消化される結果、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子が産生される。
　本発明の細胞の増殖抑制方法において用いられる前駆体としては、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の配列番号２又は４で表される塩基配列を標的とする、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｈＲＮＡが挙げられる。本発明において用いられる前駆体としては、細胞内において、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ、又はＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ、の何れかを産生し得るｓｈＲＮＡが好ましい。
　配列番号２で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である核酸分子としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ等であって、細胞内において当該ｓｈＲＮＡからＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生されるものが挙げられる。配列番号４で表される塩基配列の全長若しくはその部分塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である核酸分子としては、例えば、配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ等であって、細胞内において当該ｓｈＲＮＡからＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生されるものが挙げられる。
　ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子は、例えば、化学的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成系、ファージＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写法、クローン化したｃＤＮＡを鋳型として転写し会合させた長いｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅ III又はＤｉｃｅｒによって切断する方法等により、適宜調製することができる。また、修飾塩基を含むＲＮＡｉ核酸分子を用いる場合には、合成された核酸分子に対して修飾を施してもよく、修飾塩基を用いてＲＮＡｉ核酸分子を合成させてもよい。
［発現ベクター］
　本発明の細胞の増殖抑制方法においては、ＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子を発現し得る発現ベクターを細胞に導入し、当該細胞内において、当該発現ベクターからＲＮＡｉ核酸分子等を産生させてもよい。ｓｉＲＮＡを発現し得るベクターとしては、例えば、ｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが別々に発現するように、それぞれ別々のプロモーターと連結した発現ベクター、選択的スプライシング等により１つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが別個に転写されるようにした発現ベクター等が挙げられる。ｓｈＲＮＡを発現し得るベクターとしては、例えば、プロモーターの下流に、ｓｈＲＮＡを構成する一本鎖のＲＮＡを連結した発現ベクター等が挙げられる。
　これらの発現ベクターは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製することができる（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，ｖｏｌ．２９６，ｐ．５５０～５５３；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００１，ｖｏｌ．１９，ｐ．５００～５０５；Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ　ａｎｄ　Ｋ．Ｔａｉｒａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２，ｖｏｌ．１９，ｐ．４９７～５００；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１４４３～１４４８；Ｃ．Ｐ．Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２，ｖｏｌ．１９，ｐ．５０５～５０８；Ｇ．Ｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．５５１５～５５２０；Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１４９４３～１４９４５；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，２００２，ｖｏｌ．１６，ｐ．９４８～９５８）。より具体的には、目的のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって構築することが可能である。プロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等を用いることができる。具体的には、例えばＵ６プロモーターやＨ１プロモーター等が利用できる。公知のベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター等のウイルスベクターや、プラスミド等の非ウイルスベクター等が利用できる。
［細胞への導入］
　ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸分子、その前駆体、又はこれらの発現ベクターを細胞へ導入する方法は、特に限定されるものではなく、核酸分子を細胞内へ導入する際に用いられる公知の手法のいずれを用いてもよい。例えば、ＲＮＡｉ核酸分子等をインジェクション等により直接細胞内へ導入してもよく、必要に応じて公知の遺伝子導入試薬等を使用してエンドサイトーシス等により細胞内へ取り込ませてもよい。また、細胞へ導入するＲＮＡｉ核酸分子等は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を組み合わせて導入してもよい。
　本発明の細胞の増殖抑制方法において、増殖を抑制させる対象となる細胞は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子が発現している細胞、すなわち、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡやその翻訳産物であるタンパク質を発現し得る細胞（以下、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞）である。ＮＥＫ１０バリアント発現細胞であれば特に限定されず、正常細胞であってもよく、癌細胞であってもよい。また、由来する組織等は特に限定されない。例えば、癌細胞の場合には、癌種も特に限定されない。また、ヒト由来の細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。増殖を抑制させる対象となる細胞は、培養細胞や、生物個体から採取された細胞であってもよく、生物個体中の細胞であってもよい。
＜ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物、抗癌剤＞
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡの前駆体（中でも、ｓｈＲＮＡ）、前記ｓｉＲＮＡの発現ベクター、又は前記前駆体の発現ベクター等の核酸分子を細胞内へ導入すると、当該細胞内でＲＮＡ干渉がおこり、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現が低下する結果、当該細胞の細胞増殖が抑制される。つまり、これらの核酸分子は細胞増殖抑制剤の有効成分とし得るものであり、よって腫瘍等の細胞の過増殖等が問題となる疾患に対する医薬品として有用な物質である。そこで、これらの核酸分子は、そのまま、あるいは適宜薬理学的に許容される配合剤と混合して、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物（本発明の組成物）又は抗癌剤（本発明の抗癌剤）として使用することができる。なお、本発明の組成物及び抗癌剤は、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子を１種類のみ含有していてもよく、複数種類を組み合わせて含有していてもよい。
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有する核酸分子を有効成分とする本発明の抗癌剤は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子を発現する癌に対する治療において極めて有用であると考えられる。そして、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子は、乳癌のみならず、少なくとも肝癌、腎癌、前立腺癌、及び子宮癌で発現している。このため、本発明の抗癌剤は、多くの癌細胞において、細胞増殖作用を示し、高い抗腫瘍効果を発揮することが期待される。
　本発明の組成物及び抗癌剤は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子を発現する癌細胞に対して、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞死誘導作用等の抗癌作用や、抗癌剤等に対する感受性増強作用等を示す。また、本発明の組成物又は抗癌剤によるこれらの作用効果は、一過性であってもよく、恒常的に発揮されるものであってもよい。また、本発明の組成物又は抗癌剤の導入後、ある一定期間が経過した後に、最終的に効果が発現されるものであっても良い。
　本発明の組成物及び抗癌剤に添加してもよい配合剤としては、担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、コーティング剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、矯味剤、着香剤、希釈剤、溶解補助剤等の製薬上許容し得る添加剤が挙げられる。又、本発明の組成物及び抗癌剤は、粉剤、顆粒剤、錠剤、カブレット剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤等の製剤形態で、経口又は非経口的（全身投与、局所投与等）に安全に投与される。本発明の組成物及び抗癌剤中の有効成分（ＲＮＡｉ核酸分子又はその前駆体である核酸分子）の含有量は、製剤により種々異なるが、通常０．１～１００重量％であることが好ましい。投与量は、投与経路、患者の年齢、及び、予防又は治療すべき実際の症状等により異なるが、例えば成人に経口投与する場合、有効成分として１日０．０１ｍｇ～２０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～１０００ｍｇとすることができ、１日１回又は数回に分けて投与できる。
＜抗癌剤のスクリーニング方法＞
　上述のように、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる等により、癌細胞内におけるＮＥＫ１０バリアントタンパク質の機能を抑制させることによって、癌細胞の細胞増殖が抑制され、抗腫瘍効果を示す。このため、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を抑制する作用を有する物質は、癌治療薬の有効成分として有用である可能性が高い。したがって、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果を指標とすることにより、新規抗癌剤のスクリーニングが可能である。
　抗癌剤の候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物や高分子化合物を含む）、無機化合物等を挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質（以下、被験物質）を含む試料を対象として実施することができる。被験物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清及び菌体成分等が含まれる。
　被験物質の中から、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果を指標として探索する場合には、具体的には、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養し、両条件下でのＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の発現量を比較する。
　スクリーニングに使用する細胞としては、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞であればよい。ヒトに有効な抗癌剤をスクリーニングする場合、ヒト由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞を用いることが好ましいが、ヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相同性を示す塩基配列が存在する種由来の細胞であれば、ヒト以外の動物由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞であってもよい。例えば、マウスの転写産物中にもヒトＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡと相同性を示す塩基配列（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００１１９５１１９．１）が存在することから、マウス由来のＮＥＫ１０バリアント発現細胞を用いてもよい。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。その他、定法に従って、ヒトＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＮＥＫ１０バリアントタンパク質を産生可能な状態に調製された形質転換細胞を、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞として使用することもできる。
　上述のスクリーニング方法において、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞との接触は、例えば、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞の培養液に被験物質を添加した状態で培養することにより行う。また、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞との接触条件は、特に限定されないが、当該細胞が死滅せず、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又は蛋白質が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成等）を選択することが好ましい。
　候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞とを接触させ、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＮＥＫ１０バリアント発現細胞を培養した場合に、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質発現量が、同条件の被験物質非存在下のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ又はタンパク質発現量よりも小さい被験物質を選別する。
　ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ等を利用したノーザンブロット法やＤＮＡアレイを利用した測定方法、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ中の部分塩基配列をプライマーとしたＲＴ－ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等により測定することができる。
　ＮＥＫ１０バリアントタンパク質の発現量は、例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質に対する抗体を利用した公知の方法により測定することができる。抗体を利用した測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等が挙げられる。
　ＮＥＫ１０バリアントはキナーゼ活性を持つことが構造から推定される。したがって、被験物質の中から、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性に対する抑制効果を指標として、抗癌剤のスクリーニングを行うこともできる。具体的には、例えば、精製したＮＥＫ１０バリアントタンパク質又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質を発現する細胞の抽出液を用い、被験物質の存在下又は非存在下での、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性を比較する。
　キナーゼ活性測定に用いられるＮＥＫ１０バリアントタンパク質としては、遺伝子組換え技術により産生された組換えタンパク質を用いることができる。組換えタンパク質は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｃＤＮＡと公知の発現系を用いて常法により製造することができる。発現系としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等を宿主細胞とする発現系、無細胞発現系等が挙げられる。例えば、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質を強制発現後の宿主細胞の抽出液をそのままキナーゼ活性測定に用いてもよく、当該抽出液から精製した組換えタンパク質を用いてもよい。また、元々ＮＥＫ１０バリアントタンパク質を発現している細胞の抽出液や、当該抽出液から精製されたＮＥＫ１０バリアントタンパク質も、キナーゼ活性測定に用いることができる。
　キナーゼ活性測定に用いられる基質としては、キナーゼの基質として一般的に用いられる各種タンパク質を用いることができる。具体的には、ＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒストン等が挙げられる。基質とするタンパク質は、組換えタンパク質であってもよく、ペプチド合成等により人工的に合成されたものであってもよく、細胞内の内在性のタンパク質であってもよい。組換えタンパク質や元々細胞内に存在しているタンパク質を用いる場合、細胞の抽出液と当該抽出液から精製したタンパク質のいずれをキナーゼ活性測定に用いてもよい。
　上述のスクリーニング方法において、被験物質とＮＥＫ１０バリアント発現細胞は、キナーゼ活性測定の測定環境下で接触させる。キナーゼ活性測定の温度、ｐＨ、塩濃度等の条件は、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質による基質となるタンパク質のリン酸化が起こる条件であればよく、特に限定されない。
　候補物質の選別は、例えば上記条件の被験物質存在下で、ＮＥＫ１０バリアントタンパク質による基質タンパク質のリン酸化量と、被験物質非存在下での基質タンパク質のリン酸化量とを比較することにより行うことができる。具体的には、被験物質存在下での基質タンパク質のリン酸化量が、同条件の被験物質非存在下での基質タンパク質のリン酸化量よりも小さい被験物質を選別する。
　本発明の抗癌剤のスクリーニング方法により選抜された物質は、細胞においてＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制しＮＥＫ１０バリアントタンパク質の産生を低下させるか、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質のキナーゼ活性を低下させる作用を有するものであり、癌治療に有用であると考えられる。また、当該スクリーニング方法によって選別された被検物質の各種誘導体を製造し、これらに対してさらなるスクリーニングを行うことによって、効果や安全性に優れた誘導体を得ることも可能である。
　以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例等で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
［参考例１］
　本参考例は、各種癌細胞株において、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を確認するために行った。すなわち、表１に記載の各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントのｍＲＮＡの相対発現量を、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定した。
　各癌細胞株よりＲＮＡｅａｓｙ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。４００ｎｇの精製したＲＮＡを用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用説明に従い使用し、ｃＤＮＡを調製した。すなわち、ＲＮＡを６５℃で５分間変性処理を行った後４℃で急冷し、その後５５℃で３０分間及び７５℃で１５分間反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
　得られたｃＤＮＡのうち１μＬを鋳型とし、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマー、及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを用い、ＢＲＩＬＩＡＮＴ　ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い使用説明に従い使用し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨの増幅は、反応系のコントロールとして行った。すなわち、９５℃、１０分間の熱変性の後、１サイクルが９５℃、３０秒間、次いで５５℃、６０秒間、その後７２℃、６０秒間からなるサイクル反応を４０サイクル行うＰＣＲ反応を行った。リアルタイムＰＣＲ機は、ＭＸ３０００（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、配列番号６：５’－ＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＴＧＧ－３’の塩基配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号７：５’－ＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡ－３’の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとして、配列番号８：５’－ＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴ－３’の塩基配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号９：５’ －ＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣ－３’の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。Ｃｔ値の判定は、ソフトウエアＭＸ　Ｐｒｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。Ｃｔ値とは、ＰＣＲ反応により標的遺伝子の増幅が指数関数的におこる立ち上がりのサイクル数（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ値）のことである。
　下記の式（１）を用いて、得られたＣｔ値から、各種癌細胞株のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値（キャリブレータと比較した場合の相対的なＣｔ値）を求めた。
式（１）：　
ΔＣｔ（ＮＥＫ１０遺伝子バリアント）値＝ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値－ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡのＣｔ値
　式（１）から得られた各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値を用いて、ＨｅＬａＳ３細胞におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を１００とした場合の、各種癌細胞株の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を、式（２）により求めた。
式（２）：　
各種癌細胞株のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの相対発現値＝（各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値／ＨｅＬａＳ３細胞におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのΔＣｔ値）×１００
　前記式（２）を用いて得られた、ＨｅＬａＳ３細胞のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を１００とした場合の、各種癌細胞株におけるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの相対的な発現量を表１に示す。ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現は、乳癌細胞、肝癌、腎癌、前立腺癌及び子宮癌細胞で認められた。したがって、ＮＥＫ１０バリアントは乳癌細胞のみならず、乳癌以外の癌細胞でも重要な働きを担っていることが推測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例１］
　本実施例は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を抑制し、かつ癌細胞の増殖を抑制することを確認するために行った。
＜ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制作用の確認＞
　配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ（以下、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１）及び配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ（以下、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２）について、細胞内に導入してｓｉＲＮＡ処理を行った後のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定し、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡに対するノックダウン効果を検討した。
　実施例１でＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを発現していることが確認された乳癌細胞株　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用い、コントロールｓｉＲＮＡ、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１、又はＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２を細胞内に導入し、ｓｉＲＮＡ処理後のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮによるリアルタイムＰＣＲにより測定し、各ｓｉＲＮＡによるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのノックダウン効果を検討した。コントロールｓｉＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が合成したものを使用した。
　１万個／ｗｅｌｌのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、２４時間後にｓｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い製造者の使用説明に従い使用し導入した。すなわち、１μＬのｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）を５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に溶解した溶液を、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸを５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭに溶解し室温で５分間静置した溶液と混合し、さらに室温で２０分間静置した。静置後、上記混合液を細胞に添加し、３７℃で３時間培養した後、培地を交換し、さらに７２時間培養した。その後、培地を除去し、ＲＮＡｅａｓｙ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、各ｗｅｌｌ中の細胞からＲＮＡを精製した。
　精製されたＲＮＡのうち５００ｎｇ用い、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、参考例１と同様にしてｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡのうち１μＬを鋳型とし、参考例１と同様にしてＣｔ値の測定を行った。使用した試薬、プライマー及び機器も参考例１と同様である。
　実験はトリプリケイトで行い、Ｃｔ値のトリプリケイトの平均値を下記の式（３）に代入し、各ｓｉＲＮＡ処理群のΔＣｔ値を求めた。また、実験は３回繰り返した。
式（３）－１：
ΔＣｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ）値＝コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値－コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのＣｔ値
式（３）－２：
ΔＣｔ（ｓａｍｐｌｅ）値＝ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理群のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡのＣｔ値－ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理群のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのＣｔ値
　前記式（３）で得られた各ｓｉＲＮＡ処理群のΔＣｔ値を用いて、下記式（４）により、各実験における各ｓｉＲＮＡ処理によるＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を、１回目のコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群を１００とした場合の相対値として求めた。但し、式（４）中、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ量は、対コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群に対する％である。
式（４）：
ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ量＝２（ΔＣｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ）値－ΔＣｔ（ｓａｍｐｌｅ）値）×１００
　算出結果を図１に示す。図１中、縦軸はコントロールｓｉＲＮＡ処理時のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の相対的なＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量を示す。横軸は各ｓｉＲＮＡ処理群を示す。
　乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における、コントロール　ｓｉＲＮＡ又はＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理によるＮＥＫ１０　ｍＲＮＡの対コントロール（％）は、コントロールｓｉＲＮＡ処理群が１０７±６．２、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１処理群が１１±０．５、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２処理群が８６±７．４であった。Ｄｕｎｎｅｔ検定によりコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群とＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理群とを検定した結果、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１処理群は、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊＊＊、ｐ＜０．００１）にＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡを抑制した。同様に、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２処理群も、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊＊、ｐ＜０．０１）にＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現を抑制した。すなわち、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２はいずれも、乳癌細胞において、ＮＥＫ１０バリアントのｍＲＮＡ発現を抑制することが明らかとなった。 
＜ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡの癌細胞の増殖抑制効果＞
　ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２が癌細胞に対する増殖抑制効果を有することを確認した。すなわち、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２を細胞内に導入し、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子をノックダウンすることにより細胞増殖が抑制されるか、メチレンブルー法により検討した。
　上記（ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制作用の確認）と同様にして、各ｓｉＲＮＡをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞へ導入し、導入後、７２時間培養した。培養後、培地を除去し、１０００μＬのメタノールを添加して室温で２分間放置し、細胞を固定した。メタノールを除去後、１０００μＬの染色液（０．０５％メチレンブルー溶液）を添加し、３０分間染色した。４ｍＬの蒸留水で３回洗浄した後、３％ＨＣｌ溶液を２ｍＬ添加し、メチレンブルーの６６０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。
　実験はトリプリケイトで実施し、同様の実験を３回繰り返した。１回目の実験のコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群のトリプリケイトの平均値をコントロールとし、各実験のｓｉＲＮＡ処理群のトリプリケイトの平均値を用いて、下記式（５）により細胞増殖率（％）を算出した。
式（５）：
細胞増殖率（％）＝（各実験のコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群又はＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理群の６６０ｎｍの吸光度／１回目の実験のコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群の６６０ｎｍの吸光度）×１００
　算出結果を図２に示す。図２中、縦軸はコントロールｓｉＲＮＡ処理時の細胞増殖を１００とした場合の、各ｓｉＲＮＡ処理群の細胞増殖率を示す。横軸は各ｓｉＲＮＡ処理群を示す。
　各ｓｉＲＮＡ処理による乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞増殖率（％）は、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群が８８±１８、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１処理群が３４±１４、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２処理群が５８±１７であった。Ｄｕｎｎｅｔ検定によりコントロール　ｓｉＲＮＡ処理群とＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ処理群とを検定した結果、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１処理群は、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群と比較して有意（＊、ｐ＜０．０５）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖を抑制した。
　また、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２処理群は、統計学的な有意性は確認できなかったものの、コントロール　ｓｉＲＮＡ処理群よりも、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖が抑制されていた。すなわち、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１及びＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２は、効果の多少はあるがいずれも、乳癌細胞に対する増殖抑制効果を有することが明らかとなった。
　また、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制効果がより高いＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１のほうが、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２よりも細胞増殖抑制効果が高かった。これより、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現抑制効果が高いｓｉＲＮＡを用いることにより、より高い細胞増殖抑制効果が得られること、十分な細胞増殖抑制効果を得るためには、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの発現量を対コントロール（％）で８６以下とし得るｓｉＲＮＡを用いることが好ましいことが示唆された。また、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１とＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２は、ＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡの異なる配列を標的としていることから、ＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃１とＮＥＫ１０　ｓｉＲＮＡ＃２を併用することにより、それぞれのｓｉＲＮＡを単独で使用した場合よりも高い細胞増殖抑制効果（抗腫瘍効果）が得られることが期待される。
　本発明の細胞の増殖抑制方法及び核酸分子は、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子が発現している様々な細胞、特に癌細胞の増殖を抑制することができるため、癌の治療及び抗癌剤の製造等の分野で利用が可能である。

Claims (14)

  1. 　細胞において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を低下させる発現低下工程、及び／又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性を低下させる活性低下工程を含む、細胞の増殖抑制方法。
  2. 　前記発現低下工程が、ＲＮＡ干渉によりＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現を抑制する核酸分子、前記核酸分子の前駆体、及び、前記核酸分子又は前記前駆体を発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種を細胞に導入する工程である、請求項１に記載の細胞の増殖抑制方法。
  3. 　前記核酸分子が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡであり、
    　前記前駆体が、配列番号２又は４で表される、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子のｍＲＮＡ中の塩基配列を標的とするＲＮＡ干渉作用を有するｓｈＲＮＡである、請求項２に記載の細胞の増殖抑制方法。
  4. 　前記核酸分子が、
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、並びに、
    （ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    からなる群より選択される、請求項２に記載の細胞の増殖抑制方法。
  5. 　前記前駆体が、細胞内において、
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は
    （ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    の何れかを産生する核酸分子である、請求項２に記載の細胞の増殖抑制方法。
  6. 　前記前駆体が、
    （ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
    （ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；であり、かつ
    細胞内において、前記（ｐ）のｓｈＲＮＡ及び前記（ｑ）のｓｈＲＮＡから、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡが産生される、請求項２に記載の細胞の増殖抑制方法。
  7. 　前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の細胞の増殖抑制方法。
  8. 　（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号３で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンスＲＮＡ、及び配列番号５で表される塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなるｓｉＲＮＡ、
    （ｃ）配列番号２で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列中の１５～２４個の連続する塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｅ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    （ｆ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列において１個若しくは数個の塩基が置換、付加又は欠失している塩基配列を含むセンスＲＮＡ、及び前記センスＲＮＡと相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡの組み合わせからなり、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、又は、
    （ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのｓｉＲＮＡにおいて、１個若しくは数個の塩基が修飾されており、かつＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、
    である、核酸分子。
  9. 　（ｐ）配列番号２で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、
    配列番号３で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ；あるいは
    （ｑ）配列番号４で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、配列番号５で表される塩基配列中の１５個以上の連続する塩基配列、又は当該塩基配列中の１個若しくは数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失している塩基配列と、を含むｓｈＲＮＡ、
    であり、細胞内において、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡを産生するための前駆体である、核酸分子。
  10. 　請求項８又は９に記載の核酸分子を含み、当該核酸分子を発現させ得る、発現ベクター。
  11. 　請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載の核酸分子、及び請求項１０に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を含む、ＮＥＫ１０バリアント遺伝子発現抑制用組成物。
  12. 　請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載の核酸分子、及び請求項１０に記載の発現ベクターからなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、抗癌剤。
  13. 　ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現に対する抑制効果又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果を指標とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
  14. 　ＮＥＫ１０バリアント遺伝子の発現抑制効果、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性に対する抑制効果についての候補物質の存在下及び非存在下で、ＮＥＫ１０バリアント発現細胞をそれぞれ培養する工程；及び
    　当該細胞内のＮＥＫ１０バリアントｍＲＮＡ発現量、又はＮＥＫ１０バリアントタンパク質の活性量を測定し、当該候補物質存在下及び非存在下での発現量又は活性量を比較する工程；
    を含む、請求項１３に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
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