MX2014002600A - Metodo para inhibir crecimiento celular, molecula de acido nucleico que tiene efecto de inteferencia de arn sobre gen variante nek10 y agente anticancer. - Google Patents

Metodo para inhibir crecimiento celular, molecula de acido nucleico que tiene efecto de inteferencia de arn sobre gen variante nek10 y agente anticancer.

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Abstract

La presente invención proporciona un método para inhibir crecimiento celular, una molécula de ácido nucleico útil como agente anti cáncer o anti cancerígeno y un método para selección de nuevos agentes anti cáncer. En la presente invención, efectos inhibitorios sobre la expresión del gen variante NEK10 o efectos inhibitorios sobre la actividad de proteína variante NEK10 se obtienen en células por transferencia de células con una molécula de ácido nucleico que tiene un efecto de interferencia de RNA en gene variante NEK10. La presente invención también proporciona un método para selección de agentes anti cáncer mediante el uso de este efecto inhibitorio como un indicador.

Description

MÉTODO PARA INHIBIR CRECIMIENTO CELULAR, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE TIENE EFECTO DE INTERFERENCIA DE ARN SOBRE GEN VARIANTE NEK10 Y AGENTE ANTICÁNCER CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para inhibir crecimiento celular, una molécula de ácido nucleico que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, una composición para inhibir la expresión de gen variante NEK10 que comprende un vector de expresión para expresar esa molécula de ácido nucleico en células y esa molécula de ácido nucleico, un agente anti-cáncer que tiene esa molécula de ácido nucleico tiene un ingrediente activo del mismo y un método para cribar agentes anti-cáncer.
TÉCNICA PREVIA El cáncer es la causa principal de muerte en el Japón moderno, con más de 300,000 personas que mueren anualmente por cáncer. A pesar de avances realizados en la detección y tratamiento de cáncer, las tasas de mortalidad asociadas con cáncer, permanecen elevadas. Aunque agentes anti-cáncer dirigidos a nivel molecular tales como Glivec™ y Herceptin™ recientemente han atraído la atención para utilizar en quimioterapia de cáncer, ya que los pacientes en quienes han demostrado eficacia son limitados, hay un deseo por el desarrollo de un agente anti-cáncer dirigido a nivel molecular novedoso.
Empezando en la primer parte de la década de 1970, NIMA quinasa se descubrió en Aspergillus nidulans, y un homólogo de NIMA quinasa en la forma de Finí se descubrió en levadura de fisión. NIMA quinasa pertenece a la familia serina/treonina quinasa, y se ha indicado que juega un papel importante durante la fase M del ciclo celular. Es decir, NIMA quinasa se determinó claramente que es una molécula que juega un papel central para entrar en la fase M, control de condensación de cromosoma, formación de huso y división citoplásmica (ver, por ejemplo Documento que No es de Patente 1 ).
Homólogos de la NIMA quinasa humana consisten de quinasas relacionadas a NIMA (NEK) en la forma de NEK1 a NEK11 , y estas quinasas constituyen la familia NEK. Hasta ahora, la familia NEK se conocía que consistía de moléculas importantes en el ciclo celular y las rutas de señalización. Por ejemplo, los miembros de la familia NEK de NEK2, NEK6, NEK7 y NEK9 se ha reportado que entran en la fase M, control de condensación de cromosomas, formación de husillo y división citoplásmica en la misma forma que NIMA quinasa y Finí (ver, por ejemplo, Documento que No es de Patente 2).
NEK10 se ha reportado que juega un papel importante para controlar el punto de control fase G2/M en respuesta a radiación UV (ver, por ejemplo, el Documento que No es de Patente 3). Un SNP presente en el gen NEK10 se ha reportado involucrado en la incidencia de cáncer de mama (ver, por ejemplo, Documentos que No son de Patente 4 y 5). Sin embargo, no es claro si NEK10 está involucrado en crecimiento celular y particularmente en crecimiento de células de cáncer. Además, una molécula que se supone que es una variante NEK10 humana está registrada en la base de datos NCBI (número de acceso: AK098832.1 , referida como variante NEK10 humana). Aunque hay la posibilidad de que la variante NEK10 humana también está involucrada en el control del ciclo celular ya que tiene un segmento quinasa similar al de otras moléculas de la familia NEK, se desconocen que tipos de funciones posee en el cuerpo.
Documentos de la Técnica Previa Documentos de Patente Documento que No es de Patente 1 : M.J. O'Connell, et al. , Trends in Cell Biology, 2003, Vol. 13, pp. 221-228 Documento que No es de Patente 2: L. O'Regan, et al., Cell División, 2007, Vol. 2, pp. 25-36 Documento que No es de Patente 3: L.S. Moniz, et al. , Molecular and Cellular Biology, 2011 , Vol. 31 , pp. 30-42 Documento que No es de Patente 4: S. Ahmed, et al., Nature Genetics, 2009, Vol. 41 , pp. 585-590 Documento que No es de Patente 5: A.C. Antoniou, et al., Cáncer Research, 2010, Vol. 70, pp. 9742-9754 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema a Resolver por la Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para inhibir crecimiento celular, una molécula de ácido nucleico útil como un agente anti-cáncer y un método para cribar agentes anti-cáncer novedosos.
MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA El inventor de la presente invención consideró que, ya que una molécula que tiene homología con la variante NEK10 humana está presente en ratones y la variante NEK10 se conserva a través de las especies, la variante NEK10 puede ser importante en crecimiento celular y control del ciclo celular y por lo tanto realizó extensa investigación en la variante NEK10 ya que su función biológica se desconoce. Como resultado, el inventor de la presente invención encontró que el crecimiento celular se inhibe cuando se inhibe la expresión de la variante NEK10 en células, y que un ácido nucleico que tiene un efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10 (NEK10 siRNA) tiene una acción inhibitoria de crecimiento celular en células y particularmente en células de cáncer, de esta manera llevando a completar la presente invención.
Es decir, la presente invención adopta las constituciones indicadas a continuación. (1 ) Un método para inhibir crecimiento celular, que comprende: una etapa para disminuir expresión, para disminuir expresión de gen variante NEK10, o una etapa para disminuir actividad, para disminuir actividad de proteína variante NEK10 en células. (2) El método para inhibir crecimiento celular descrito en (1 ) anteriormente, en donde la etapa para disminuir expresión es una etapa para transfectar células con cuando menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de gen variante NEK10 por interferencia de RNA, un precursor de la molécula de ácido nucleico y un vector de expresión capaz de expresar la molécula de ácido nucleico o el precursor. (3) El método para inhibir crecimiento celular descrito en (2) anteriormente, en donde la molécula de ácido nucleico es siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia base en mRNA del gen variante NEK10 representado por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y el precursor es shRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia base en mRNA del gen variante NE 10 representado por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. (4) El método para inhibir el crecimiento celular descrito en (2) o (3) anteriores, en donde la molécula de ácido nucleico se elige del grupo que consiste de: (a) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que contiene la secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (d) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en la que una o una pluralidad de las bases es una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 se sustituye, agrega o elimina y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en la que una o una pluralidad de las bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, se sustituye, agrega o elimina y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, y (g) siRNA en donde una de una pluralidad de bases en siRNA descritas en cualquiera de (a) a (f) se modifica y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10. (5) El método para inhibir el crecimiento celular descrito en cualquiera de (2) a (4) anteriores, en donde el precursor produce en células, cualquiera de: (a) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (d) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en la que una o una pluralidad de las bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 se sustituye, agrega o elimina, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste de la combinación de RNAsentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de las bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 está sustituida, agregada o eliminada, y un RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, o (g) siRNA en donde una o una pluralidad de bases en siRNA descritas en cualquiera de (a) a (f) se modifica y tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10. (6) El método para inhibir crecimiento celular descrito en (2) anteriormente, en donde el precursor es: (p) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia de bases se modifica, sustituye, agrega o elimina, o (q) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esta secuencia de bases se modifica, sustituye, agrega o elimina; y siRNA, que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, se produce en células de shRNA de (p) o shRNA de (q). (7) El método para inhibir crecimiento celular descrito en cualquiera de (1 ) a (6) anteriores, en donde las células son células de cáncer. (8) Una molécula de ácido nucleico que es: (a) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (d) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en la que una o una pluralidad de las bases en la secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 está sustituida, agregada o eliminada, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de las bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 está sustituida, agregada o eliminada, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, o (g) siRNA en donde una o una pluralidad de bases en siRNA descritas en cualquiera de (a) a (f) se modifica y tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10. (9) Una molécula de ácido nucleico que es: (p) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, (q) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y. es un precursor para producir siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10 en células. (10) Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico descrito en (8) o (9) anterior que es capaz de expresar ese ácido nucleico. (11 ) Una composición para inhibir la expresión de gen variante NEK10, que comprende uno o más tipos selectos del grupo que consiste de: la molécula de ácido nucleico descrita en (8) anterior, la molécula de ácido nucleico descrita en (9) anterior, y el vector de expresión descrito en (10). (12) Un agente anti-cáncer que contiene como ingrediente activo del mismo uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste de: la molécula de ácido nucleico descrita en (8) anterior, la molécula de ácido nucleico descrita en (9) anterior, y el vector de expresión descrito en (10) anterior. (13) Un método para cribar agentes anti-cáncer utilizando un efecto inhibitorio en expresión de gen variante NEK10 o un agente inhibitorio en actividad de proteína variante NEK10 como un indicador. (14) El método para cribar agentes anti-cáncer descritos en (13) anterior, que comprende: una etapa para cultivar células que expresan variante NEK10 respectivamente en la presencia y ausencia de una sustancia candidato para un efecto inhibitorio en expresión de gen variante NEK10 o un efecto inhibitorio en actividad de proteína variante NEK10, y una etapa para medir el nivel de expresión de mR A variante NEK10 en células o la cantidad de actividad de proteína variante NEK10 y comparar los niveles de expresión o cantidades de actividad en la presencia y ausencia de la sustancia candidato.
EFECTOS DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención, puede inhibirse crecimiento celular al actuar en una ruta novedosa que disminuye la actividad de gen variante NEK10. Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención es una sustancia que tiene efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10 y de preferencia se utiliza en el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención. Es decir, el método para inhibir crecimiento celular y la molécula de ácido nucleico de la presente invención son extremadamente útiles en el tratamiento de cáncer, y puede esperarse que demuestran efectos antitumor, incluso en pacientes de cáncer para los cuales efectos fueron incapaces de obtenerse con métodos de inhibición de crecimiento convencionales.
Además, de acuerdo con el método para cribar agentes anti-cáncer de la presente invención, pueden adquirirse compuestos candidatos novedosos de agentes anti-cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que indica niveles de expresión de mRNA variante NEK10 relativos de cada grupo de tratamiento con siRNA con base en un valor de 100 para el nivel de expresión de mRNA variante NEK10 durante tratamiento con siRNA de control en el Ejemplo 1.
La Figura 2 es una gráfica que indica velocidades de crecimiento celular de cada grupo de tratamiento siRNA con base en un valor de 100 para crecimiento celular durante tratamiento con siRNA de control en el Ejemplo 1.
MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN <Método para Inhibir Crecimiento Celular> El método para inhibir crecimiento celular de la presente invención se caracteriza porque comprende una etapa para disminuir expresión, para disminuir expresión de gen variante NEK10 y/o una etapa para disminuir actividad, para disminuir la actividad de proteína variante NEK10 (proteína codificada por gen variante NEK10), en células. En el crecimiento celular puede inhibirse al inhibir la función de proteína variante NEK10 en células. Esto se considera que es un fenómeno que ocurre debido a que la proteína variante NEK10 está involucrada en crecimiento celular en células. No hay limitaciones particulares en el método empleado para disminuir la expresión de proteína variante NEK10 o disminuir la actividad de proteína variante NEK10 y cualquier técnica conocida empleada para disminuir la expresión de un gen específico o la actividad de una proteína en células puede ser utilizada.
Un ejemplo de un método empleado para disminuir la actividad de proteína variante NEK10 consiste de transfectar células con una sustancia que liga a proteína variante NEK10 tal como un anticuerpo a proteína variante NEK10, e inhibir la interacción de proteína variante NEK10 con otras biomoléculas al provocar que esta sustancia ligue con proteína variante NEK10 intracelular. No hay limitaciones particulares en el método empleado para transfectar células con una sustancia que liga a proteína variante NEK10 y la sustancia puede utilizarse para transfectar las células directamente por inyección y semejantes, o la sustancia puede permitir que contacte la superficie celular y transfectar las células por endocitosis y semejantes. Además, proteína variante NEK10 se pronostica que tiene actividad quinasa en la misma forma que proteína NEK10 con base en estructura de proteína variante NEK10. De esta manera, la actividad de proteína variante NEK10 puede ser inhibida al expresar dentro de células una forma negativa dominante en donde el sitio activo quinasa de proteína variante NEK10 se ha eliminado o sustituido.
Por otra parte, un ejemplo de un método para disminuir expresión de gen variante NEK10 consiste de interferencia de gen variante NEK10 por interferencia de RNA. Más específicamente, células se transfectan con una molécula de ácido nucleico que induce interferencia de RNAdirigida a mRNA de gen variante NEK10 (mRNA vanante NEK10) y provoca degradación de mRNA variante NEK10 dentro de las células, tal como un ácido nucleico anti-sentido, ácido nucleico ribosima o RNA de doble hebra (dsRNA).
En general, la interferencia de RNA se refiere a un fenómeno por el cual la expresión de un gen objetivo se inhibe al administrar en RNA de interferencia de células pequeñas (siRNA) que consiste de dsRNA formado de siRNA sentido que consiste de una secuencia parcialmente homologa de la secuencia mRNA del gen objetivo y siRNA anti-sentido que consiste de una secuencia complementaria, de esta manera provocando que el siRNA en las células se separe en siRNA sentido y siRNA anti-sentido y permitir que el mRNA gen objetivo y el siRNA anti sentido formen una doble hebra, después de lo cual el dsRNA formado se degrada por Dicen Además de transfectar células con siRNA, la interferencia de RNA también puede emplearse para inhibir expresión de un gen objetivo en la misma forma que siRNA al transfectar células con un dsRNA de hebra larga comparativa o shRNA de horquilla (RNA de horquilla corta) que sirve como precursor siRNA, o al transfectar con un vector que expresa siRNA o un precursor del mismo. Aún más, también se conocen métodos para inhibir expresión de un gen objetivo por siRNA in vivo (P. Antón, er al., Nature, 2002, Vol. 418, pp. 38-39; L. David, et al., Nat. Genet., 2002, Vol. 32, pp. 107-108).
[Molécula de Ácido Nucleico que Tiene Efecto de Interferencia de RNA en Gen Variante NEK10] En la presente invención, expresión de gen variante NEK10, de preferencia se disminuye al transfectar células con una molécula de ácido nucleico que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10 (también referido como la "molécula de ácido nucleico RNAi"). No hay limitaciones particulares en la molécula de ácido nucleico de interferencia siempre que tiene un efecto de interferencia RNAi en mRNA variante NEK10, y de preferencia es siRNA.
El siRNA empleado en la presente invención para la molécula de ácido nucleico RNAi puede ser siRNA para cualquier región de mRNA variante NEK10 siempre que tenga un efecto de interferencia de RNA en esa región. siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA en una secuencia base de partículas de mRNA variante NEK10, pueden prepararse por una persona con destreza ordinaria en la técnica por diseño conveniente con base en la información de secuencia de base de mRNA variante NEK10. Por ejemplo, la secuencia base de cDNA de mRNA variante NEK10 se muestra en SEQ ID NO: 1. Aunque siRNA empleado en la presente invención de preferencia tiene una secuencia base que es totalmente complementaria con la secuencia base objetivo en mRN A variante NEK10, puede contener una o una pluralidad de mal apareamientos siempre que tenga un efecto de interferencia RNA.
No hay limitaciones particulares en la longitud de par base en el siRNA empleado en la presente invención, siempre que demuestre un efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10. Un ejemplo del mismo es siRNA en donde RNA sentido y RNA anti-sentido consisten de 15 a 30 pares base y de preferencia 21 a 23 pares base.
Además, siRNA empleado en la presente invención puede tener una o una pluralidad de bases modificadas siempre que tenga un efecto de interferencia de RNA. Ejemplos de estas modificaciones incluyen metilación, inosinilación, formación de dU, modificación de grupo fluorescente y fosforilación. La base modificada puede estar presente en siRNA en RNA sentido, RNA anti-sentido o ambos.
La estructura de extremo de siRNA empleada en la presente invención puede ser la de un extremo romo o un extremo saliente siempre que permita que la expresión de un gen variante NEK10 sea regulada por un efecto de interferencia RNA. Una estructura de extremo saliente puede incluir no sólo una estructura en la que el extremo 3' sobresale, pero también una estructura en la que el extremo 5' que demuestra el efecto de interferencia de RNA anteriormente mencionado sobresale. Además, aunque el número de bases salientes es 2 a 3 en numerosos siRNA previamente reportados que demuestran un efecto de interferencia de RNA en otros genes, el número de bases en siRNA empleado en la presente invención sólo se requiere que sea capaz de inducir un efecto de interferencia de RNA, y por ejemplo, el número de bases salientes puede ser 1 a 8 y de preferencia 2 a 4. Estas bases salientes no se requiere que constituyan una secuencia complementaria (anti-sentido) o idéntica (sentido) a mRNA variante NEK10.
Ejemplos de siRNA que tienen un efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10 incluyen siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia base contigua de toda la longitud o longitud parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 en mRNA variante NEK10, tal como una secuencia base contigua de 15 a 24 bases y de preferencia una secuencia base contigua de 18 a 20 bases. Otro ejemplo es siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia de base contigua de toda la longitud o longitud parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO.: 4 en mRNA variante NEK10, tal como una secuencia de base contigua de 15 a 24 bases y de preferencia una secuencia base contigua de 18 a 20 bases.
Ejemplos específicos de siRNA que hacen blanco en toda la longitud o su longitud parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 en mRNA variante NEK10 incluyen: siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 (5'-GAAAUCCUGUCAGAUGAUAACUUCA-3') y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 (S'-UGAAGUUAUCAUCUGACAGGAUUUC-S"), y siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido anteriormente mencionado; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10.
Además, el siRNA también puede ser siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia de base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 está sustituida, agregada o eliminada y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido anteriormente mencionado y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10. Además, el siRNA también puede ser siRNA en donde una o una pluralidad. de las bases en estos siRNA se modifican mientras que también tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10.
Ejemplos específicos de siRNA que hacen blanco en toda la longitud o su longitud parcial, de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 en mRNA variante NEK10 incluyen: siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 (5'-UCUGCCUUGUUUGUUCACCACUAUU-3') y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 (5'-AAUAGUGGUGAACAAACAAGGCAGA-3'), y siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido anteriormente mencionado; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10. Además, siRNA también puede ser siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia de bases contigua de 15 o más bases en la secuencia de base representada por SEQ ID NO: 4 está sustituida, agregada o eliminada y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido anteriormente mencionado; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10. Además, el siRNA también puede ser siRNA en donde una o una pluralidad de las bases en estas siRNA se modifican mientras que también tienen un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10.
[Precursor de Molécula de Ácido Nucleico RNAi] En el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención, las células pueden ser transfectadas directamente con una molécula de ácido nucleico RNAi tal como siRNA, o células pueden ser transfectadas con un precursor de la molécula de ácido nucleico RNAi y la molécula de ácido nucleico RNAi puede producirse a partir de precursor por una reacción tal como degradación dentro de las células. No hay limitaciones particulares en el precursor de la molécula de ácido nucleico RNAi siempre que es un precursor que finalmente produce una molécula de ácido nucleico RNAi tal como siRNA en células. Ejemplos de precursores de siRNA incluyen dsRNA de hebra comparativamente larga y RNA de una sola hebra en donde RNA sentido y RNA anti-sentido que constituyen siRNA se acoplan mediante un espaciador. Aunque no hay limitaciones particulares en la longitud del espaciador, por ejemplo puede ser 3 a 23 bases de longitud. Además, el espaciador que acopla el RNA sentido y el RNA anti-sentido de preferencia forma un bucle, y secuencias RNA antes y después -del bucle de preferencia son alineadas para formar una doble hebra (shRNA). Aunque no hay limitaciones particulares en la longitud del bucle y tronco en shRNA, la longitud del tronco puede ser por ejemplo de 5 a 29 bases. Además, una saliente que consiste de varias bases puede o no estar presente en el extremo 5' y/o extremo 3'. Una molécula de ácido nucleico RNAi tal como siRNA se produce por estos precursores como resultado de digestión con Dicer y semejantes dentro de células.
Un ejemplo de un precursor empleado en el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención es shRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 en mRNAdel gen variante NEK10. El precursor empleado en la presente invención de preferencia es shRNA capaz de producir en células ya sea siRNA que hacen blanco en toda la longitud o longitud parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 en mRNA variante NEK10, o siRNA que hace blanco en toda la longitud o longitud parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 en mRNA variante NEK10.
Ejemplos de moléculas de ácido nucleico que son precursores para producir siRNA que hacen blanco en la secuencia completa o secuencia parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 incluyendo shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifican, sustituyen, agregan o eliminan; y una secuencia base contigua de 15 o más bases representadas por SEQ ID NO: 3, o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia se modifica, sustituye, agrega o elimina; y siendo capaz de producir siRNA que tienen un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10 de ese shRNA en células. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico que son precursoras para producir siRNA que hacen blanco a toda la secuencia o secuencia parcial de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 incluyen shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifican, sustituyen, agregan o eliminan; y una secuencia base contigua de 15 o más bases representadas por SEQ ID NO: 5, o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esta secuencia se modifican, sustituyen, agregan o eliminan, y siendo capaz de producir siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10 de ese shRNA en células.
Una molécula de ácido nucleico RNAi tal como siRNA o una molécula de ácido nucleico que es su precursor, puede ser preparada de manera conveniente por ejemplo por un sistema de síntesis química in vitro, método de transcripción vitro utilizando fago RNA polimerasa o método en el que dsRNA largo que se ha conjugado por transcripción utilizando cDNA clonado como una plantilla se disocia por RNase III o Dicer. Además, en el caso de utilizar una molécula de ácido nucleico RNAi que contiene una base modificada, la modificación puede llevarse a cabo en una molécula de ácido nucleico sintetizada o una molécula de ácido nucleico RNAi puede ser sintetizada utilizando la base modificada.
[Vector de Expresión] En el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención, una molécula de ácido nucleico RNAi y semejantes puede producirse a partir de un vector de expresión capaz de expresar una molécula de ácido nucleico RNAi o su precursor en células al transfectar las células con el vector de expresión. Ejemplos de vectores capaces de expresar siRNA incluyen vectores de expresión en donde promotores separados respectivamente se acoplan para expresar por separado RNA sentido y RNA anti-sentido de siRNA, y vectores de expresión diseñados de manera tal que RNA sentido y RNA anti-sentido se transcriben por separado de un solo promotor por empalme selectivo y semejantes. Ejemplos de vectores capaces de expresar shRNA incluyen vectores de expresión en donde un RNA de una sola hebra que constituye shRNA se acopla corriente abajo de un promotor.
Estos vectores de expresión pueden fabricarse fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica utilizando técnicas de ingeniería genética ordinarias (T.R. Brummelkamp, et al., Science, 2002, Vol. 296, pp. 550-553; N.S. Lee, er a/., Nat. Biotech., 2001 , Vol. 19, pp. 500-505; M. Miyagishi and K. Taira, Nat. Biotech., 2002, Vol. 19, pp. 497-500; P.J. Paddison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
USA, 2002, Vol. 99, pp. 1443-1448; CP. Paul, et al., Nat. Biotech., 2002, Vol. 19, p. 505-508; G. Sui, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, pp. 5515-5520; G. .
Barton and R. Medzhitov, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, pp. 14943-14945; P.J. Paddison, et al., Genes Dev., 2002, Vol. 16, pp. 948-958). Más específicamente, DNA que codifica una secuencia de RNA objetivo puede construirse al insertar convenientemente diversos vectores de expresión conocidos.
Promotor de RNA polimerasa III y semejantes pueden emplearse como promotor.
Más específicamente, un promotor tal como un promotor U6 o promotor H1 pueden emplearse. Ejemplos de vectores conocidos que pueden utilizarse incluyen vectores virales tales como vector de retrovirus, vector de adenovirus, vectores virales adeno-asociados o vectores virales de menos- hebra RNA y vectores no virales tales como plásmidos.
[Transfección Celular] No hay limitaciones particulares al método empleado para transfectar células con moléculas de ácido nucleico RNAi tales como siRNA, sus precursores o su vector de expresión, y cualquier técnica conocida empleada cuando se transfectan células con moléculas de ácido nucleico puede ser empleada. Por ejemplo, células pueden ser transfectadas con una molécula de ácido nucleico RNAi y semejantes por inyección o puede permitirse que se incorpore en células por endocitosis y semejantes utilizando un reactivo de transfección de genes conocido como sea necesario. Además, células pueden ser transfectadas con un tipo de molécula de ácido nucleico RNAi y semejantes o transfectadas con dos o más tipos en combinación.
En el método para inhibir crecimiento celular de la presente invención, aquellas células dirigidas para inhibición de crecimiento son células en donde el gen variante NEK10 se expresa o en otras palabras, células capaces de expresar el producto de transcripción del gen variante NEK10 en la forma mRNA o su producto de traducción en la forma de una proteína (referido como células que expresan variante NEK10). No hay limitaciones particulares en las células que expresan variante NEK10, y pueden ser células normales o células de cáncer. Además, no hay limitaciones particulares en el órgano del cual se derivan. Por ejemplo, no hay limitaciones particulares en el tipo de cáncer en el caso de células de cáncer. Además, las células pueden ser de origen humano o pueden derivarse de un animal diferente a humano. Las células dirigidas para inhibición de crecimiento pueden ser células cultivadas, células recolectadas de un individuo vivo o células presentes en un individuo vivo. <Composiclón y Agente Anti Cáncer para Inhibir Expresión de Gen Variante NEK10 > Cuando las células se transfectan con una molécula de ácido nucleico tal como siRNA que tiene efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10, un precursor de ese siRNA (y particularmente, shRNA), un vector de expresión del siRNA anteriormente mencionado o un vector de expresión del precursor anteriormente mencionado, como resultado de interferencia de RNA que ocurre en las células y que la expresión de gen variante NEK10 disminuye, el crecimiento de las células se inhibe. En otras palabras, estas moléculas de ácido nucleico se obtienen en una forma de ingredientes activos y un inhibidor de crecimiento celular y por lo tanto son sustancias que son útiles como agentes farmacéuticos contra enfermedades provocadas por hiperproliferación de células tales como células de tumor. Por lo tanto, estas moléculas de ácido nucleico pueden ser empleadas, ya sea en forma directa o después de mezclado conveniente con un agente de formulación farmacológicamente aceptable, como una composición (composición de la presente invención) o agente anti-cáncer (agente anti-cáncer de la presente invención) para inhibir la expresión de gen variante NEK10. Además, la composición y el agente de cáncer de la presente invención pueden contener sólo un tipo de molécula de ácido nucleico tal como siRNA o una pluralidad de tipos pueden estar contenidos en combinación.
El agente anti-cáncer de la presente invención que tiene como su ingrediente activo una molécula de ácido nucleico que tiene un efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10 se considera que es útil en el tratamiento de cáncer que expresa el gen variante NEK10. El gen variante NEK10 se expresa no sólo en cáncer de mama, sino también al menos en cáncer de hígado, cáncer de riñon, cáncer de próstata y cáncer uterino. Consecuentemente, el agente anti-cáncer de la presente invención se espera que demuestre un alto nivel de efectos antitumor en numerosos tipos de células de cáncer al afectar su crecimiento celular.
La composición y agente anti-cáncer de la presente invención demuestran efectos anti-cáncer tales como efecto inhibitorio de crecimiento de células de cáncer, efecto inductor de muerte de células de cáncer o efecto de mejora de sensibilidad con respecto a agentes anti-cáncer y semejantes. Además, estos efectos de la composición y agente anti-cáncer de la presente invención pueden demostrarse transitoriamente o en forma permanente. Además, los efectos pueden demostrarse finalmente después que una cantidad fija de tiempo ha transcurrido después de transfección con la composición o agente anti-cáncer de la presente invención.
Ejemplos de agentes de formulación que pueden agregarse a la composición y agente anti-cáncer de la presente invención, incluyen aditivos farmacológicamente aceptables tales como portadores, excipientes, agentes desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, fluidificantes, agentes de revestimiento, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, estabilizantes, conservadores, correctivos, agentes saborizantes, diluyentes o asistentes de solubilidad. Además, la composición y agente anti-cáncer de la presente invención se administran en forma segura de manera oral o parenteral (incluyendo administración sistémica y administración local) en una forma de preparación tal como polvo, gránulos, tableta, comprimido oblongo, cápsula, inyección, supositorio o ungüento. Aún que variante de acuerdo con la preparación, el contenido de ingrediente activo (molécula de ácido nucleico RNAi o molécula de ácido nucleico en la forma de su precursor) en la composición y agente anti-cáncer de la presente invención normalmente de preferencia es 0.1 % en peso a 100% en peso. Aunque variantes de acuerdo con factores tales como la ruta de administración, edad del paciente o síntomas actuales a evitar o tratar, la dosis por ejemplo es 0.01 mg a 2000 mg por día y de preferencia 0.1 mg a 1000 mg por día, como la cantidad de ingrediente activo en el caso de administrar oralmente a un adulto, y la dosis puede ser administrada una vez al día o dividida entre varias administraciones. <Método para Cribar Agentes Anti-Cáncer> Como se describió previamente, el crecimiento de células de cáncer se inhibe y se demuestran efectos antitumor como resultado de inhibir la función de proteína variante NEK10 en células de cáncer al disminuir la expresión de gen variante NEK10. Consecuentemente, sustancias que tienen un efecto que inhibe la expresión de gen variante NEK10 o sustancias que tienen un efecto que inhibe la actividad de proteína variante NEK10, tienen altas posibilidades de ser útiles como ingredientes activos de fármacos terapéuticos para el cáncer. De esta manera, agentes anti-cáncer novedosos pueden ser cribados al utilizar el efecto inhibitorio en la expresión de gen variante NEK10 o el efecto inhibitorio en actividad de proteína variante NEK10 como un indicador.
Ejemplos de sustancias candidato de agentes anti-cáncer incluyen ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, compuestos orgánicos (incluyendo compuestos de bajo peso molecular y compuestos de alto peso molecular) y compuestos inorgánicos. El método de criba de la presente invención puede llevarse a cabo en muestras que contienen estas sustancias candidato (que se referirán como sustancias de prueba). Muestras que contienen sustancias de prueba incluyen extractos celulares, productos de expresión de bibliotecas génicas, sobrenadantes de cultivo microbiano, componentes fúngales y semejantes.
En forma más específica, en el caso de búsqueda entre sustancias de prueba al utilizar el efecto inhibitorio en la expresión de gen variante NEK10 como un indicador, células que expresan el gen variante NEK10 se cultivan en la presencia o ausencia de una sustancia de prueba seguido por comparar niveles de expresión de mRNA variante NEK10 o proteína variante de NEK10 bajo ambas condiciones.
Las células empleadas en criba sólo se requiere que sean células que expresan variante NEK10. Aunque células que expresan variante NEK10 derivadas de humanos de preferencia se emplean en el caso de criba de agentes anti-cáncer efectivos en humanos, células que expresan variante NEK10 derivadas de un animal diferente a un humano también pueden emplearse, siempre que las células se deriven de una especie en donde una secuencia base que indica homología con mRNA variante NEK10 está presente. Por ejemplo, ya que una secuencia base que indica homología con un mRNA variante NEK10 humano (NCBI número de acceso: NM_001195119.1 ) está presente en productos de transcripción de ratón, células que expresan variante NEK10 derivadas de ratón también pueden ser empleadas. Además, el intervalo de células empleadas en criba incluye tejido que es una colección de células. Además, células transformadas que se preparan en un estado que permiten la producción de proteína variante NEK10 al transfectar con un vector de expresión que tiene cDNA de gen variante NEK10 humano de acuerdo con métodos establecidos, también puede emplearse como células que expresan variante NEK10.
En el método de criba anteriormente mencionado, contacto entre una sustancia de prueba y células que expresan variante NEK10 puede llevarse a cabo por ejemplo al cultivar las células que expresan variante NEK10 en un estado en donde la sustancia de prueba se agrega a una solución de cultivo de las células que expresan variante NEK10. Además, aunque no hay limitaciones particulares, condiciones de cultivo (tales como temperatura, pH y composición de medio) que permiten que las células expresen mRNA variante NEK10 o proteína sin destruir las células de preferencia se eligen de las condiciones bajo las cuales una sustancia de prueba hace contacto a células que expresan variante NEK10.
Sustancias candidato pueden cribarse por contacto de una sustancia de prueba con células que expresan variante NEK10 bajo las condiciones anteriormente mencionadas, por ejemplo y búsqueda por aquellas sustancias que provoca una disminución en el nivel de expresión de proteína o mRNA variante NEK10. En forma más específica, en el caso de tener células que expresan variante NEK10 cultivadas en la presencia de una sustancia de prueba, una sustancia de prueba se selecciona para la cual el nivel de expresión de proteína o mRNA variante de NEK10 es menos que el nivel de expresión de proteína mRNA variante de NEK10 en la ausencia de la sustancia de prueba bajo las mismas condiciones.
El nivel de expresión de proteína mRNA variante de NEK10 puede medirse por un método de medición utilizando transferencia northern o matriz de DNA que utiliza una sonda oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia base de mRNA variante NEK10, o por RT-PCR o PCR en tiempo real utilizando secuencias base parciales presentes en mRNA variante NEK10 como cebadores.
El nivel de expresión de proteína variante NEK10 puede medirse por ejemplo, por un método conocido que utiliza anticuerpo a proteína variante NEK10.
Ejemplos de métodos de medición que utilizan anticuerpo incluyen transferencia Western, inmunoprecipitación y ELISA.
Variante NEK10 se pronostica que tiene actividad de quinasa en base a su estructura. De esta manera, agentes anti-cáncer pueden cribarse al utilizar un indicador de un efecto inhibitorio en la actividad quinasa de la proteína variante NEK10. Más específicamente, la actividad quinasa de proteína variante NEK10 se compara en la presencia y ausencia de una sustancia de prueba utilizando proteína variante NEK10 purificada o un extracto de células que expresan proteína variante NEK10.
Una proteína recombinante producida por tecnología de recombinación de genes puede utilizarse como proteína variante NEK10 durante medición de actividad quinasa. Proteína recombinante puede producirse de acuerdo con métodos ordinarios empleando cDNA de gen variante NEK10 y un sistema de expresión conocido. Ejemplos de sistemas de expresión incluye sistema de expresión que utilizan E. coli, levadura, células de insecto o células de mamífero como células huésped así como sistemas de expresión libres de células. Por ejemplo, un extracto de células huésped que siguen expresión forzada de proteína variante NEK10 puede ser empleado directamente en medición de actividad quinasa, o proteína recombinante purificada del extracto celular puede ser empleada. Además, un extracto de células que expresan inherentemente proteína variante NEK10 o proteína variante NEK10 purificada de ese extracto, también puede utilizarse para medir actividad de quinasa.
Diversos tipos de proteínas comúnmente empleados como sustratos quinasa pueden emplearse para el sustrato utilizado durante medición de actividad quinasa. Ejemplos específicos de los mismos incluyen proteína básica mielina (MBP = Myelin Basic Protein) e histona. La proteína empleada como sustrato puede ser una proteína recombinante, puede ser sintetizada artificialmente por síntesis de péptidos y semejantes, o puede ser una proteína intrínseca presente en las células. En el caso de utilizar una proteína recombinante o una proteíná intrínsecamente presente en células, un extracto celular o proteína purificada de ese extracto puede emplearse para medir actividad de quinasa.
En el método de criba anteriormente mencionado, una sustancia de prueba y células que expresan variante NEK10 se ponen en contacto en el ambiente empleado para medición de actividad quinasa. Condiciones tales como temperatura, pH o concentración de sal durante medición de actividad quinasa consisten de aquellas condiciones bajo las cuales la proteína que sirve como sustrato se fosforila por proteína variante NEK10 y no hay limitaciones particulares en la misma.
Selección de una sustancia de prueba puede llevarse a cabo al comparar la cantidad de proteína sustrato fosforilada por proteína variante NEK10 en la presencia de la sustancia de prueba bajo las condiciones anteriormente mencionadas y la cantidad del sustrato fosforilado por proteína variante NEK10 en la ausencia de la sustancia de prueba. Más específicamente, una sustancia de prueba se elige para la cual la cantidad fosforilada de proteína sustrato en la presencia de una sustancia de prueba es menos que la cantidad fosforilada de proteína sustrato en la ausencia de la sustancia de prueba bajo las mismas condiciones.
Una sustancia se elige de acuerdo con el método para criba de agentes anti-cáncer de la presente invención tiene el efecto que ya sea disminuye la producción de proteína variante NEK10 o disminuye la actividad de quinasa de proteína variante NEK10 al inhibir expresión de un gen variante NEK10 en células, y se considera útil en el tratamiento de cáncer. Además, derivados que tienen superior eficacia y seguridad también pueden ser obtenidos al producir diversos derivados de sustancias de prueba seleccionadas de acuerdo con este método de criba al llevar a cabo adicional criba los mismos.
Ejemplos Aunque lo siguiente proporciona una explicación más detallada de la presente invención a través de sus ejemplos, estos ejemplos sólo se pretenden ejemplares y la presente invención no se limita a ellos. Además, reactivos comercialmente disponibles mencionados en los ejemplos empleados de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes a menos que se indique específicamente de otra forma.
[Ejemplo de Referencia 1] El presente ejemplo de referencia se llevó a cabo a fin de confirmar la expresión de mRNA variante NEK10 en diversas líneas de células de cáncer. Es decir, los niveles de expresión relativa de mRNA variante NEK10 en las diversas líneas celulares de cáncer citadas en la Tabla 1 se miden por PCR en tiempo real utilizando SYBR™ Green.
Total RNA se purificó de cada línea celular de cáncer utilizando el RNAeasy Kit (Qiagen). cDNA se preparó utilizando 400 ng de RNA purificado al utilizar reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones. Es decir, RNA se sometió a tratamiento de desnaturalización por 5 minutos a 65°C seguido por rápido enfriamiento a 4°C y subsecuente permitir que reaccione por 30 minutos a 55°C y después por 15 minutos a 75°C para sintetizar cDNA.
Utilizando 1 µ?_ del cDNA resultante como plantilla, PCR en tiempo real se lleva a cabo utilizando un cebador para amplificación de cDNA sintetizado a partir de mRNA variante NEK10, un cebador para amplificar cDNA sintetizado a partir de GAPDH, y Brilliant SYBR™ Green Master Mix (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones. Amplificación de GAPDH se llevó a cabo como un control para el sistema de reacción. Es decir, después de desnaturalización térmica por 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de PCR se llevan a cabo con un ciclo que consiste de 30 segundos a 95°C, 60 segundos a 55°C y 60 segundos a 72°C. El sistema MX3000 (Stratagene) se emplea para PCR en tiempo real. Los cebadores empleados para amplificar cDNA sintetizado a partir de mRNA variante NEK10 que consiste de un cebador directo compuesto por la secuencia base de SEQ ID NO: 6 (5'-G C AC ACAAAG GTATTTTATG G -3' ) y un cebador inverso compuesto por la secuencia base de SEQ ID NO: 7 (5'-CTACTCAAACTTGCCTTCTCA-3'). Además, los cebadores empleados para amplificar cDNA sintetizado a partir de GAPDH mRNA consisten de un cebador directo compuesto por la secuencia base de SEQ ID NO: 8 (5'-TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-3') y un cebador inverso compuesto por la secuencia base de SEQ ID NO: 9 (5 -ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-3'). MX Pro software (Stratagene) se utiliza para determinar valores Ct. Valor Ct se refiere al número umbral de ciclos en los cuales amplificación de un gen objetivo por una reacción PCR ocurre exponencialmente (umbral de ciclo).
Los valores ACt (valor Ct relativo en el caso de comparar con un calibrador) de mRNA variante NEK10 de diversas líneas celulares de cáncer, se determinan a partir de valores Ct resultantes utilizando la Ecuación (1 ) indicada a continuación.
Ecuación (1 ): Valor ACt (variante de gen NEK10) = valor Ct de mRNA variante NEK10 - valor Ct de GAPDH mRNA Los niveles de expresión relativa de mRNA variante NEK10 en cada línea celular de cáncer se determinan de acuerdo con la Ecuación (2) con base en el valor de 100 para el nivel de expresión de mRNA variante NEK10 en células HeLaS3 al utilizar los valores ACt de mRNA variante NEK10 en cada una de las líneas celulares de cáncer que se obtienen de la Ecuación (1 ).
Ecuación (2): Nivel de expresión relativa de mRNA variante NEK10 en cada línea celular de cáncer = (valor ACt de mRNA variante NEK10 en cada línea celular de cáncer/valor ACt de mRNA variante NEK10 en células HeLaS3) ? 100 Los niveles de expresión relativa de mRNA variante NEK10 en cada línea celular de cáncer con base en un valor de 100 para el nivel de expresión de mRNA variante NEK10 en células Hel_aS3 obtenido utilizando la Ecuación (2) anteriormente mencionada, se muestran en la Tabla 1. La expresión de mRNA variante NEK10 se observa en células de cáncer de mamá, cáncer de hígado, cáncer de riñon, cáncer de próstata y cáncer uterino. De esta manera, la variante NEK10 se pronostica que juega un papel importante no sólo en células de cáncer de mama sino en otras células de cáncer por igual.
[Tabla 1] [Ejemplo 1] El presente ejemplo se llevó a cabo a fin de confirmar que siRNA tiene un efecto de interferencia de RNA en mRNA variante NEK10 inhibe la expresión de mRNA variante NEK10 e inhibe crecimiento de células de cáncer. <Confirmación de Efecto Inhibitorio de Expresión en mRNA variante NEK10> Después de llevar a cabo tratamiento siRNA al transfectar células con siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 (que se referirá como NEK10 siRNA #1 ) y siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 (referida como NEK10 siRNA #2), mRNA variante NEK10 se mide por PCR en tiempo real utilizando SYBR™ Green para estudiar los efectos de interferencia génica en mRNA variante NEK10.
Línea celular de cáncer de mama DA-MB-231 , que se confirmó que expresa mRNA variante NEK10 en el Ejemplo 1 , se transfecta con siRNA de control, NEK10 siRNA #1 o NEK10 siRNA #2, y mRNA variante NEK10 después del tratamiento con siRNA se mide por PCR en tiempo real utilizando SYBR™ Green para estudiar los efectos de interferencia génica en mRNA variante NEK10 de cada siRNA. siRNA de control se adquiere de Invitrogen, y siRNA sintetizado por Invitrogen se utiliza para NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2.
Células MDA-MB-231 se diseminaron en placas de 12 pozos a 10,000 células por pozo y transfectaron con siRNA 24 horas posteriormente utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es decir, una solución obtenida al disolver 1 µ?_ de siRNA (20 nM) en 50 µ?_ de OptiMEM (Invitrogen) se mezcla con una solución obtenida al disolver 1 µ?_ de Lipofectamina RNAiMAX en 50 µ? de OptiMEM y dejar reposar sin perturbar por 5 minutos a temperatura ambiente, seguido por además permitir que repose sin perturbar por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de reposar, la mezcla anteriormente mencionada se agrega a las células, y después de cultivar por 3 horas a 37°C, el medio se reemplaza seguido por cultivado adicional por 72 horas. Subsecuentemente, el medio se retira y RNA se purifica de células en cada pozo utilizando el RNAeasy Kit (Qiagen).
Empleando 500 ng del RNA purificado, cDNA se prepara en la misma forma que el Ejemplo de Referencia 1 utilizando el reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen). Valores Ct se miden en la misma forma que el Ejemplo de Referencia 1 utilizando 1 µ?_ del cDNA resultante como plantilla. Los reactivos, cebadores y equipo empleados son los mismos que aquellos utilizados en el Ejemplo de Referencia 1.
El experimento se realiza en triplicado, el valor promedio de los valores Ct triplicados se sustituye en la siguiente Ecuación (3) para determinar los valores ACt de cada grupo de tratamiento siRNA. Además, el experimento se repitió tres veces.
Ecuación (3)-1 : Valor ACt (control) = valor Ct de mRNA variante NEK10 de grupo de tratamiento siRNA - valor Ct de GAPDH mRNA de grupo de tratamiento siRNA de control Ecuación (3)-2: Valor ACt (muestra) = valor Ct de mRNA variante NEK10 de grupo de tratamiento de siRNA NEK10- valor Ct de GAPDH mRNA del grupo de tratamiento de siRNA NEK10.
El nivel de expresión de mRNA variante NEK10 atribuible a cada tratamiento siRNA en cada experimento se determina de acuerdo con la siguiente Ecuación (4) como el valor relativo con base en un valor de 100 para el primer grupo de tratamiento siRNA de control utilizando los valores ACt de cada grupo de tratamiento siRNA que se obtienen con la Ecuación anteriormente mencionada (3). Sin embargo, en la Ecuación (4), la cantidad de mRNA variante NEK10 es un porcentaje (%) respecto al grupo de tratamiento siRNA de control.
Ecuación (4): Cantidad de mRNA variante NEK10 = 2(valor ACt (control) " valor ?a (muestra)) ? 100 Los resultados de cálculo se muestran en la Figura 1. En la Figura 1 , los niveles de expresión relativa de mRNA variante NEK10 de cada grupo de tratamiento siRNA con base en un valor de 100 para el nivel de expresión de mRNA variante NEK10 durante tratamiento de siRNA de control se trazan en eje vertical. Cada grupo de tratamiento siRNA se traza en el eje horizontal.
Los porcentajes de mRNA NEK10 atribuible a siRNA de control o tratamiento de NEK10 siRNA contra el control de (%) en línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 fueron 107+6.2 para el grupo de tratamiento de siRNA de control, 11 ±0.5 para el grupo de tratamiento NEK10 siRNA #1 , y 86±7.4 para el grupo de tratamiento NEK10 siRNA #2. Como resultado de prueba el grupo de tratamiento siRNA de control y los grupos de tratamiento NEK10 siRNA utilizando la prueba de Dunnett, el grupo NEK10 siRNA #1 inhibe significativamente mRNA variante NEK10 en comparación con el grupo de tratamiento siRNA de control (***, p<0.001 ). De manera similar, el grupo de tratamiento NEK10 siRNA #2 también inhibe significativamente la expresión de mRNA variante NEK10 en comparación con el grupo de tratamiento de siRNA de control (**, p<0.01 ). Es decir, ambos NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2 claramente han demostrado que inhiben la expresión de mRNA variante NEK10 en células de cáncer de mama. <Efecto Inhibitorio de Crecimiento de NEK10 siRNA en Células de Cáncer> NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2 se confirmó que tienen efectos inhibitorios de crecimiento en células de cáncer. Es decir, un estudio se realizó por ensayo de azul de metileno para determinar si el crecimiento celular se inhibe por interferencia génica del gen variante NEK10 al transfectar las células con NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2.
Células MDA-MB-231 se transfectaron con cada siRNA en la misma forma como se describió previamente (Confirmación de Efecto Inhibitorio de Expresión en mRNA Variante NEK10) seguido por cultivo por 72 horas después de transfección. Después de cultivar, el medio se retiró seguido por la adición de 1000 µ?_ de metanol y se deja reposar por 2 minutos a temperatura ambiente para fijar las células. Después de retirar el metanol, 1000 µ?_ de solución colorante (solución de azul metileno al 0.05%) se agregan seguido por tenido por 30 minutos. Después de lavar tres veces con 4 mL de agua destilada, 2 ml_ de una solución HCI al 3% se agregan seguido por medición de la absorbancia de azul de metileno a 660 nm utilizando un lector de microplacas (BioRad).
El experimento se realizó en triplicado y el mismo experimento se repitió tres veces. El valor triplicado promedio del grupo de tratamiento de siRNA de control del primer experimento se empleó como un control. Las velocidades de crecimiento celular (%) se calcularon de acuerdo con la siguiente Ecuación (5) utilizando los valores triplicados promedio del grupo de tratamiento siRNA de cada experimento.
Ecuación (5): Velocidad de crecimiento celular (%) = (absorbancia a 660 nm del grupo de tratamiento siRNA de control o grupo de tratamiento de NEK10 siRNA de cada experimento/absorbancia a 660 nm del grupo de tratamiento siRNA de control del primer experimento) ? 100 Los resultados de cálculo se muestran en la Figura 2. Las velocidades de crecimiento celular de cada grupo de tratamiento siRNA basadas en un valor de 100 para crecimiento celular durante el tratamiento de siRNA de control se trazan en el eje vertical. Cada grupo de tratamiento siRNA se traza en el eje horizontal.
Las velocidades de crecimiento celular (%) de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 atribuibles a cada tratamiento siRNA fueron 88±18 para el grupo de tratamiento siRNA de control, 34±14 para el grupo de tratamiento NEK10 siRNA #1 , y 58+17 para el grupo de tratamiento NEK10 siRNA #2. Como resultado de prueba, el grupo de tratamiento siRNA de control y los grupos de tratamiento NEK10 siRNA utilizando la prueba de Dunnett, el grupo NEK10 siRNA #1 significativamente inhibe el crecimiento de células MDA-MB-231 en comparación con el grupo de tratamiento siRNA de control (*, p<0.05).
Además, aunque significancia estadística fue incapaz de confirmarse para el grupo NEK10 siRNA #2, inhibe el crecimiento de células MDA-MB-231 a un grado mayor que el grupo de tratamiento siRNA de control. Es decir, aunque hay diferencias en el grado de sus efectos, tanto NEK10 siRNA #1 como NEK10 siRNA #2 claramente se determinó que tiene efectos inhibidores de crecimiento en células de cáncer de mama.
Además, NEK10 siRNA #1 , que demuestra mayores efectos inhibitorios de expresión en mRNA variante NEK10, también demostró mayores efectos inhibitorios de crecimiento celular que NEK10 siRNA #2. Como resultado, se sugirió que se obtienen mayores efectos inhibidores de crecimiento celular para utilizar siRNA que tiene mayores efectos inhibitorios de expresión en mRNA variante NEK10, y que para obtener efectos inhibitorios de crecimiento celular adecuados, es preferible utilizar siRNA capaz de obtener un nivel de expresión de mRNA variante NEK10 de 86 o menor contra el control (%). Además, ya que NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2 hacen blanco en diferentes secuencias de mRNA variante NEK10, uso concomitante de NEK10 siRNA #1 y NEK10 siRNA #2 se espera que permita obtener mayores efectos inhibitorios de crecimiento celular (efectos antitumor) que en el caso de utilizar cualquiera siRNA sólo.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL Ya que el método para inhibir crecimiento celular y moléculas de ácido nucleico de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de diversas células, y particularmente células de cáncer, que expresan el gen variante NEK10, pueden utilizarse en campos tales como el tratamiento de cáncer y la producción de agentes anti-cáncer.
. LISTADO DE SECUENCIAS <110> Nippon Kayaku Co., Ltd. <120> Método para inhibir proliferación celular, una molécula de ácido nucleico actividad de interferencia de RNA en gen NEK10 y agente anti-cáncer <130> J70124A1 <160> 9 <210> 1 <211 > 1215 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagctga tagaaggagc cccgcttgga gagcatttca gttctttgaa ggaaaaacat 60 caccatttta ctgaagaaag actatggaaa atatttatac agctgtgctt agctcttcga 120 tacttacaca aggagaagag gattgtccat agagatctga caccaaacaa cattatgttg 180 ggggataagg acaaagtaac cgttactgac tttggcctgg caaagcaaaa acaagaaaac 240 agtaaactca cctctgtggt tggaacaatc ctgtattctt gccccgaggt actgaagagt 300 gagccgtatg gggagaaggc tgatgtctgg gcagtaggct gcatccttta tcagatggcg 360 actttgagtc cccccttcta cagcactaac atgctgtcct tggctacaaa aatagtggag 420 gcggtatatg aaccagtccc agaaggtatc tactctgaaa aagtaacaga caccatcagc 480 aggtgcctca ctcctgatgc ggaagctcgt ccagatattg tagaagtcag ttcgatgata 540 tcagatgtca tgatgaaata tttagacaac ttatctacat cccagttgtc cttggaaaag 600 aagctagaac gggaacgaag acgcacacaa aggtatttta tggaagccaa ccggaacacc 660 gtcacatgtc accatgagct ggctgttcta tctcacgaga cctttgagaa ggcaagtttg 720 agtagcagca gcagtggagc agccagcctg aaaagtgaac tttcagaaag cgcagacctg 780 ccccctgaag gcttccaggc ctcctatggt aaagacgaag acagggcctg tgacgaaatc 840 ctgtcagatg ataacttcaa cctggaaaat gctgagaaag atacatattc agaggtagat 900 gatgaattgg acatttcgga taactccagc agctccagtt caagccccct gaaagaatct 960 acattcaaca ttttaaagag aagttttagt gcttcaggag gagaaagaca atcccaaaca 1020 agggacttca ctggaggaac aggatcaaga ccaagaccag ctttgctgcc tcttgacctg 1080 cttctgaaag tgccacccca catgctcagg gcccacatta aggaaataga ggctgagtta 11 0 gtgacagggt ggcagtccca tagccttcct gctgtgattc ttcgaaatct caaagatcat 1200 ggtagtactt actag 1215 <210> 2 <211 > 25 <212> RNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: RNA sentido de siRNA para gen variante NEK10 <400> 2 gaaauccugu cagaugauaa cuuca 25 <210> 3 <211 > 25 <212> RNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: RNA antisentido de siRNA para gen variante NEK10 <400> 3 ugaaguuauc aucugacagg <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: RNA sentido de siRNA para gen variante NEK10 <400> 4 ucugccuugu uuguucacca cuauu 25 <210> 5 <211 > 25 <212> RNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: RNA antisentido de siRNA para gen variante NEK10 <400> 5 aauaguggug aacaaacaag gcaga 25 <210> 6 <211 > 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador directo para NEK10 variante mRNA <400> 6 gcacacaaag gtattttatg g 21 <210> 7 <211 > 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inverso para NEK10 variante mRNA <400> 7 ctactcaaac ttgccttctc a 21 <210> 8 <211 > 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador directo para GAPDH mRNA <400> 8 tctgctcctc ctgttcgaca gt 22 <210> 9 <211 > 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificia I <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inverso para GAPDH mRNA <400> 9 accaaatccg ttgactccga c 21

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para inhibir crecimiento celular, caracterizado porque comprende: disminuir la expresión de gen variante NEK10 y/o disminuir la actividad de proteína variante NEK10 en células.
2. El método para inhibir crecimiento celular de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque disminuir la expresión es transfectar células con al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de: una molécula de ácido nucleico que inhibe expresión de gen variante NEK10 por interferencia de RNA, un precursor de la molécula de ácido nucleico y un vector de expresión capaz de expresar molécula de ácido nucleico o el precursor.
3. El método para inhibir crecimiento celular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia base en mRNA de gen variante NEK10 representado por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y el precursor es shRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA que hace blanco en una secuencia base en mRNA de gen variante NEK10 representado por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
4. El método para inhibir crecimiento celular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico se elige del grupo que consiste de: (a) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, (d) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti -sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de las bases en la secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 se sustituye, agrega o elimina y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste de una combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia de bases contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 se sustituye, agrega o elimina y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10, y (g) siRNA en donde una o una pluralidad de bases en siRNA descrito en cualquiera de (a) a (f) se modifica, y tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10.
5. El método para inhibir crecimiento celular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el precursor produce en células cualquiera de: (a) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que consiste de una secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (d) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia de base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 es sustituida, agregada o eliminada y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 está sustituida, agregada o eliminada, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, o (g) siRNAen donde una o una pluralidad de bases en siRNA descrito en cualquiera de (a) a (f) se modifican y tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10.
6. El método para inhibir crecimiento celular de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el precursor es: (p) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye o elimina y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, o (q) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina; y, siRNA, que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, se produce en células de shRNA de (p) y shRNA de (q).
7. El método para inhibir crecimiento celular de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque las células son células de cáncer.
8. Una molécula de ácido nucleico que es: (a) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3, (b) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 y RNA anti-sentido que consiste de la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5, (c) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria al RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en gen vanante NEK10, (d) siRNA que consiste en la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base contigua de 15 a 24 bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (e) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 está sustituida, agregada o eliminada y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, (f) siRNA que consiste de la combinación de RNA sentido que contiene una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en la secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 está sustituida, agregada o eliminada, y RNA anti-sentido que contiene una secuencia base complementaria a RNA sentido; y que tienen un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10, o (g) siRNA en donde una o una pluralidad de bases en siRNA descrito en cualquiera de (a) a (f) se modifica y tiene un efecto de interferencia de RNA en gen variante NEK10.
9. Una molécula de ácido nucleico que es: (p) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 2 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esa secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 3 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases de secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina, o (q) shRNA que contiene una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 4 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esta secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina y una secuencia base contigua de 15 o más bases en la secuencia base representada por SEQ ID NO: 5 o una secuencia base en donde una o una pluralidad de bases en esta secuencia base se modifica, sustituye, agrega o elimina; y, es un precursor para producir siRNA que tiene un efecto de interferencia de RNA en el gen variante NEK10 en células.
10. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, que es capaz de expresar ese ácido nucleico.
11. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, que es capaz de expresar ese ácido nucleico.
12. Una composición para inhibir expresión de gen variante NEK10, que comprende uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste de: una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 10 y el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 11.
13. Un agente anti-cáncer que contiene como ingrediente activo del mismo, uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste de: la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 y el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11.
14. Un método para cribar agentes anti-cáncer utilizando un efecto inhibitorio en la expresión de gen variante NEK10 y/o un efecto inhibitorio en la actividad de proteína variante NEK10 como un indicador, que comprende: cultivar células que expresan variante NEK10 respectivamente en la presencia y ausencia de una sustancia candidato para un efecto inhibitorio en la expresión de gen variante NEK10 o un efecto inhibitorio en la actividad de proteína vanante NEK10, y medir el nivel de expresión de mRNA variante NEK10 en células o la cantidad de actividad de proteína variante NEK10, y comparar los niveles de expresión o cantidades de actividad en la presencia y ausencia de la sustancia candidato.
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