KR20140059229A - 세포 증식 억제 방법, nek10 변이체 유전자에 대한 rna 간섭 작용을 갖는 핵산 분자, 및 항암제 - Google Patents

세포 증식 억제 방법, nek10 변이체 유전자에 대한 rna 간섭 작용을 갖는 핵산 분자, 및 항암제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 증식 억제 방법, 항암제로 유용한 핵산 분자, 및 신규 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, NEK10 변이체 유전자 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성 억제 효과는 세포에서 핵산 분자 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 세포를 도입함에 의하여 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 이 억제 효과를 지표로 하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

세포 증식 억제 방법, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자, 및 항암제{METHOD FOR INHIBITING CELL GROWTH, NUCLEIC ACID MOLECULE HAVING RNA INTERFERENCE EFFECT ON NEK10 VARIANT GENE, AND ANTICANCER AGENT}
본 발명은 세포 증식 억제 방법, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자, 세포에서 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현 벡터 및 상기 핵산 분자를 포함하는 NEK10 변이체 유전자 발현 억제용 조성물, 상기 핵산 분자를 유효 성분으로 갖는 항암제, 및 항암제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 최근 일본에서 1위의 사망 원인이며, 매년 300,000명 이상이 암에 의해 사망한다. 암의 검출 및 치료는 발전하고 있음 에도 불구하고, 암 사망률은 여전히 높은 상태이다. 암 화학요법으로, 글리벡™과 허셉틴™과 같은 분자-표적 항암제가 주목받고 있으나, 효과를 나타내는 환자가 제한적이므로, 새로운 분자-표적 항암제의 개발이 필요하다.
1970년대 초, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)에서 NIMA 키나아제가 발견되고, 분열 효모에서 Fin1 형태의 NIMA 키나아제의 호몰로그가 발견되었다. NIMA 키나아제는 세린/트레오닌 키나아제 군에 속하고, 세포 주기의 M 기에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 즉, NIMA 키나아제는 M 기의 진입, 염색체 응축, 스핀들 형성 및 세포질 분열에 있어서 중추적인 역할을 하는 분자임이 명확히 밝혀졌다(예를 들어, 비특허 문헌 1 참조).
인간 NIMA 키나아제의 호몰로그는 NEK1 내지 NEK11 형태의 NIMA-관련 키나아제 (NEK)로 이루어지고, 이들 키나아제는 NEK 군(family)을 형성한다. 지금까지, NEK 군은 세포 주기 및 신호 전달 경로에서 중요한 분자들로 이루어진다고 알려져 있다. 예를 들어, NIMA 키나아제 및 Fin1과 동일하게, NEK 군의 구성원인 NEK2, NEK6, NEK7 및 NEK9은 M 기의 진입, 염색체 응축, 스핀들 형성 및 세포질 분열의 제어에 관여한다고 보고되어 있다(예를 들어, 비특허 문헌 2 참조).
NEK10은 UV 조사에 반응하는 G2/M 기 체크포인트 제어에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다(예를 들어, 비특허 문헌 3 참조). NEK10 유전자에 존재하는 SNP는 유방암의 발병률에 관여하는 것으로 보고되어 있다 (예를 들어, 비특허 문헌 4 및 5 참조). 그러나, NEK10이 세포 증식, 및 특히 암 세포 증식에 관여하는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 또한, 인간 NEK10 변이체로 추측되는 분자가 NCBI 데이터베이스에 등록되어 있다(인간 NEK10 변이체로 불리는 것으로, 등록 번호: AK098832.1). NEK 군의 다른 분자와 유사한 키나아제 세그먼트를 가지고 있기 때문에, 인간 NEK10 변이체 또한 세포 주기의 제어에 관여할 가능성이 있지만, 생체 내에서 어떤 기능을 갖는지는 불분명하다.
비특허 문헌 1: M.J. O'Connell, et al., Trends in Cell Biology, 2003, Vol. 13, pp. 221-228 비특허 문헌 2: L. O'Regan, et al., Cell Division, 2007, Vol. 2, pp. 25-36 비특허 문헌 3: L.S. Moniz, et al., Molecular and Cellular Biology, 2011, Vol. 31, pp. 30-42 비특허 문헌 4: S. Ahmed, et al., Nature genetics, 2009, Vol. 41, pp. 585-590 비특허 문헌 5: A.C. Antoniou, et al., cancer Research, 2010, Vol. 70, pp. 9742-9754
본 발명의 목적은 세포 증식 억제 방법, 항암제로 유용한 핵산 분자, 및 신규 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 인간 NEK10 변이체와 상동성을 갖는 분자가 마우스에도 존재하고 NEK10 변이체는 종을 넘어 보존되기 때문에, NEK10 변이체가 세포 증식 및 세포 주기 제어에 중요한 역할을 할 수도 있다고 생각했고, NEK10 변이체의 생물학적 기능이 알려지지 않았기 때문에 NEK10 변이체에 대하여 광범위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포에서 NEK10 변이체의 발현이 억제되면 세포 증식이 억제되고, NEK10 변이체 mRNA에 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산(NEK10 siRNA)이 세포, 특히 암 세포에서 세포 증식 억제 작용이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 하기의 구성을 취한다.
(1) NEK10 변이체 유전자의 발현을 저하시키기 위한 발현 저하 단계, 또는
NEK10 변이체 단백질의 활성을 저하시키기 위한 활성 저하 단계를 포함하는 세포 증식 억제 방법.
(2) 상기 발현 저하 단계는 RNA 간섭에 의하여 NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자의 전구체, 및 상기 핵산 분자 또는 상기 전구체를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 선택되는 적어도 1 종을 세포에 도입하는 단계인 상기 (1)에서 기술된 세포 증식 억제 방법.
(3) 상기 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 NEK10 변이체 유전자의 mRNA의 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이고,
전구체는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 NEK10 변이체 유전자의 mRNA의 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 shRNA인 상기 (2)에서 기술된 세포 증식 억제 방법.
(4) 상기 핵산 분자는
(a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 및
(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA으로부터 선택되는 것인 상기 (2) 또는 (3)에서 기술된 세포 증식 억제 방법.
(5) 상기 전구체는, 세포에서,
(a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 또는
(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생산하는 것인 상기 (2) ~ (4) 중 어느 하나에서 기술된 세포 증식 억제 방법.
(6) 상기 전구체는
(p) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA; 또는
(q) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA이고,
상기 (p)의 shRNA 및 (q)의 shRNA으로부터 세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA가 생성되는 상기 (2)에 기술된 세포 증식 억제 방법.
(7) 상기 세포는 암 세포인 상기 (1) ~ (6) 중 어느 하나에서 기술된 세포 증식 억제 방법.
(8)(a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
(c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
(f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 또는
(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA인 핵산 분자.
(9) (p) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA; 또는
(q) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA이고,
세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생성하기 위한 전구체인 핵산 분자.
(10) 상기 (8) 또는 (9)에 기술된 핵산을 함유하는 상기 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
(11) 상기 (8)에 기술된 핵산 분자, 상기 (9)에 기술된 핵산 분자, 및 상기 (10)에 기술된 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 포함하는 NEK10 변이체 유전자의 발현 억제용 조성물.
(12) (8)에 기술된 핵산 분자, 상기 (9)에 기술된 핵산 분자, 및 상기 (10)에 기술된 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 유효 성분으로 함유하는 항암제.
(13) NEK10 변이체 유전자 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성 억제 효과를 지표로 이용하는 항암제 스크리닝 방법.
(14) 상기 (13)에 기술된 항암제 스크리닝 방법에서, NEK10 변이체 유전자의 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성 억제효과에 대한 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서, NEK10 변이체 발현 세포를 각각 배양하는 단계, 및
상기 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서, 세포에서의 NEK10 변이체 mRNA의 발현량 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성량을 측정하고 상기 발현량 또는 활성량을 비교하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
본 발명의 세포 증식 억제 방법에 따르면, NEK10 변이체 유전자의 활성 저하라는 새로운 경로에 작용하여 세포 증식을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 NEK10 변이체 mRNA에 대하여 RNA 간섭 작용을 갖는 물질이고, 본 발명의 세포 증식 억제 방법에 적합하게 사용된다. 즉, 본 발명의 세포 증식 억제 방법 및 핵산 분자는 암 치료에 매우 유용하고, 기존의 증식 억제 방법으로 효과를 얻을 수 없었던 환자에 대해서도 항암 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 따르면, 신규 항암제 후보 화합물을 얻을 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 대조군 siRNA 처리시 NEK10 변이체의 mRNA 발현을 100으로 했을 때 각 siRNA 처리군의 상대적인 NEK10 변이체 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 대조군 siRNA 처리시 세포 증식을 100으로 했을 때 각 siRNA 처리군의 세포 증식 속도를 나타낸 그래프이다.
<세포 증식 억제 방법>
본 발명의 세포 증식 억제 방법은 세포에서 NEK10 변이체 유전자의 발현을 저하시키기 위한 발현 저하 단계 및/또는 NEK10 변이체 단백질(NEK10 변이체 유전자에 의해 코딩되는 단백질)의 발현 저하를 위한 발현 저하 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 세포에서 NEK10 변이체 단백질의 기능을 억제함으로써 세포 증식을 억제할 수 있다. 이는 세포에서 NEK10 변이체 단백질이 세포 증식에 관여하기 때문에 일어나는 현상이라고 생각된다. NEK10 변이체 유전자의 발현 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성을 저하시키는 방법은 특별히 제한되지 않고, 세포에서 특정 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 저하시키는 공지의 방법 중 하나를 사용할 수 있다.
NEK10 변이체 단백질의 활성을 저하시키는 방법으로, 예를 들어, NEK10 변이체 단백질에 대한 항체 등의 NEK10 변이체 단백질에 결합하는 물질을 세포 내로 도입하고, 상기 물질을 세포 내 NEK10 변이체 단백질과 결함시킴으로써 NEK10 변이체 단백질과 다른 생체분자의 상호작용을 억제하는 방법이 있다. NEK10 변이체 단백질에 결합하는 물질로 세포 내로 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 상기 물질을 주입 등에 의해 직접적으로 세포 내로 도입시킬 수도 있고, 또는 상기 물질이 세포 표면에 접촉시켜 엔도사이토시스 등에 의해 세포 내로 도입시킬 수 있다. 또한, NEK10 변이체 단백질의 구조에 기초하여, NEK10 변이체 단백질은 NEK10 단백질과 마찬가지로 키나아제 활성을 가질 것이라고 추측된다. 따라서, 세포 내에서 NEK10 변이체 단백질의 키나아제 활성 부위가 결실 또는 치환된 우성 음성체 (dominant negative form)를 발현시킴으로써 NEK10 변이체 단백질의 활성을 억제할 수 있다.
한편, NEK10 변이체 유전자의 발현을 저하시키는 방법의 예로 RNA 간섭에 의하여 NEK10 변이체 유전자를 넉다운시키는 것을 들 수 있다. 더욱 구체적으로, NEK10 변이체 유전자의 mRNA(NEK10 변이체 mRNA)를 표적으로 하는, 안티센스 핵산, 리보자임 핵산 또는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 등의 핵산 분자를 세포 내로 도입하고 상기 세포 내의 NEK10 변이체 mRNA의 분해를 일으킨다.
일반적으로, RNA 간섭은 표적 유전자의 mRNA 서열의 일부와 상동인 서열로 이루어진 센스 siRNA 및 이에 상보적인 서열로 이루어진 안티센스 siRNA로부터 형성된 dsRNA로 이루어진 siRNA(small interfering RNA)를 세포에 투여하여, 세포 내에서 siRNA가 센스 siRNA 및 안티센스 siRNA로 분리되고 표적 유전자 mRNA와 안티센스 siRNA가 이중 가닥을 형성한 다음, 형성된 dsRNA가 다이서에 의해 분해되어 표적 유전자의 발현이 억제되는 현상이다. RNA 간섭법은, siRNA를 세포 내로 도입하는 것 외에, siRNA의 전구체가 되는 비교적 긴 사슬의 dsRNA 또는 헤어핀 shRNA (short hairpin RNA)를 세포 내에 도입하거나, siRNA 또는 그의 전구체를 발현하는 벡터를 도입하여 siRNA와 마찬가지로 표적 유전자의 발현을 억제하는 것도 가능하다. 또한, 인 비보(in vivo)에서, siRNA에 의하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법도 알려져 있다(P. Anton et al., Nature, 2002, Vol. 418, pp. 38-39; L. David et al., Nat. Genet., 2002, Vol. 32, pp. 107-108).
[NEK10 변이체 유전자에 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자]
본 발명은, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자(이하, "RNAi 핵산 분자"라고도 함)를 세포에 도입하여 NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하다. RNAi 핵산 분자는 NEK10 변이체 mRNA에 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자이면 특별히 한정되는 것은 아니나, siRNA인 것이 바람직하다.
본 발명에서 RNAi 핵산 분자로 사용되는 siRNA는 NEK10 변이체 mRNA에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 한, 그 어느 영역에서의 siRNA라도 좋다. NEK10 변이체 mRNA의 부분 염기 서열에 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA는 NEK10 변이체 mRNA의 염기 서열 정보에 따라 당업자라면 적절하게 설계하고 제조할 수 있다. 예를 들어, 인간 NEK10 변이체 mRNA의 cDNA의 염기 서열은 서열번호 1로 나타난다. 본 발명에서 사용되는 siRNA는 NEK10 변이체 mRNA 중의 표적 염기 서열과 완전히 상보적인 염기 서열을 갖는 것이 바람직하나, RNA 간섭 작용을 갖는 한 1 또는 수 개의 불일치한 염기가 있을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 siRNA의 염기쌍 길이는 NEK10 변이체 mRNA에 대한 RNA 간섭 작용을 나타내는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 15 ~ 30개의 염기쌍, 바람직하게는 21 ~ 23개의 염기쌍으로 이루어진 siRNA를 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 siRNA는 RNA 간섭 작용을 갖는 한 1 또는 수 개의 염기가 수식되어도 좋다. 이들 수식의 예는 메틸화, 이노신화(inosinylation), dU화, 형광기 수식 및 인산화를 포함한다. siRNA 중의 수식된 염기는 센스 RNA 중에 있어도 좋고, 안티센스 RNA 중에 있어도 좋으며, 또는 모두에 존재하고 있어도 좋다.
본 발명에서 사용되는 siRNA의 말단 구조는 NEK10 변이체 유전자의 발현이 RNA 간섭 효과에 의해 조절될 수 있는 한, 평활 말단(blunt end) 또는 돌출 말단(overhanging end) 중 하나일 수 있다. 돌출 말단 구조는 3'-말단이 돌출되어 있는 구조뿐만 아니라, 상기 RNA 간섭 효과를 나타내는 한, 5'-말단이 돌출되어 있는 구조를 포함할 수 있다. 또한, 돌출 염기의 수는 이미 다른 유전자에 대한 RNA 간섭 효과를 나타낸 것으로 보고된 siRNA의 다수에서는 2 ~ 3 염기이지만, 본 발명에서 사용되는 siRNA는, RNA 간섭 효과를 유도할 수 있는 염기수인 경우, 예를 들어, 돌출 염기 수는 1 ~ 8 염기, 바람직하게는 2 ~ 4 염기여도 좋다. 이 돌출 염기는 서열 NEK10 변이체 mRNA에 상보적인 (안티센스) 또는 일치하는 (센스) 서열일 필요는 없다.
NEK10 변이체 mRNA에 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA는, 예를 들어, NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 2로 표시되는 염기 서열의 전체 또는 일부 길이의 연속된 염기 서열, 예를 들어, 15 ~ 24개의 연속된 염기 서열, 바람직하게는 18 ~ 20개의 연속된 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA일 수 있다. 또한, NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 4로 표시되는 염기 서열의 전체 또는 일부 길이의 연속된 염기 서열, 예를 들어, 15 ~ 24개의 연속된 염기 서열, 바람직하게는 18 ~ 20개의 연속된 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA일 수 있다.
NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 2로 표시되는 염기 서열의 전체 또는 일부 길이의 염기 서열을 표적으로 하는 siRNA는 구체적으로 서열번호 2 (5'-GAAAUCCUGUCAGAUGAUAACUUCA-3')로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 3 (5'-UGAAGUUAUCAUCUGACAGGAUUUC-3')으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA, 및 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 ~ 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA 및 상기 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 상기 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이어도 좋다. 그밖에, 이러한 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되어 있고 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이어도 좋다.
NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 4로 표시되는 염기 서열의 전체 또는 일부 길이의 염기 서열을 표적으로 하는 siRNA는 구체적으로, 서열번호 4 (5'-UCUGCCUUGUUUGUUCACCACUAUU-3')로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 5 (5'-AAUAGUGGUGAACAAACAAGGCAGA-3')로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA, 및 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 ~ 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA 및 상기 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 상기 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이어도 좋다. 그밖에, 이러한 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되어 있고 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이어도 좋다.
[RNAi 핵산 분자의 전구체]
본 발명의 세포 증식 억제 방법에 있어서, siRNA 등의 RNAi 핵산 분자를 직접 세포에 도입하여도 좋고, RNAi 핵산 분자의 전구체를 세포에 도입하고 당해 세포 내에서 분해 등의 반응에 의하여 당해 전구체로부터 RNAi 핵산 분자를 생성하도록 하여도 좋다. RNAi 핵산 분자의 전구체로는 세포 내에서 궁극적으로 siRNA 등의 RNAi 핵산 분자를 생성하는 전구체이기만 하면 되고, 특별히 한정되지 않는다. siRNA 전구체로는, 예를 들어, 비교적 긴 사슬의 dsRNA, siRNA를 구성하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 스페이서를 통해 연결되어 있는 단일 가닥 siRNA가 포함된다. 스페이서의 길이는 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 3 ~ 23 염기가 좋다. 또한, 센스 RNA 및 안티센스 RNA를 연결하는 스페이서가 루프를 형성하여 그 전후의 RNA 서열을 어닐링하고 2 가닥을 형성하는 RNA (shRNA)도 바람직하다. shRNA의 루프 및 줄기의 길이는 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 5 ~ 29 염기도 좋다. 또한, 5' 말단 및/또는 3' 말단에 몇 염기의 돌출이 있어도 좋고, 있지 않아도 좋다. 이들 전구체가 세포 내에서 다이서 등에 의하여 소화되는 결과, siRNA 등의 RNAi 핵산 분자가 생성된다.
본 발명의 세포 증식 억제 방법에서 이용되는 전구체로는 NEK10 변이체 유전자의 mRNA 중의 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 shRNA를 들 수 있다. 본 발명에서 이용되는 전구체는, 세포 내에서, NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 2로 표시되는 염기 서열의 전체 길이, 또는 일부 길이를 표적으로 하는 siRNA 또는 NEK10 변이체 mRNA 중의 서열번호 4로 표시되는 염기 서열의 전체 길이 또는 일부 길이를 표적으로 하는 siRNA를 생성할 수 있는 shRNA가 바람직하다.
서열번호 2로 표시되는 염기 서열의 전체 서열 또는 부분 서열을 표적으로 하는 siRNA를 생성하는 전구체인 핵산 분자로는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열, 또는 당해 염기 서열 중의 1개 또는 수 개의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열; 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열, 또는 당해 염기 서열 중의 1개 또는 수 개의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하고; 세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생성할 수 있는 shRNA를 들 수 있다. 서열번호 4로 표시되는 염기 서열의 전체 서열 또는 부분 서열을 표적으로 하는 siRNA를 생성하는 전구체인 핵산 분자로는, 예를 들어, 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열, 또는 당해 염기 서열 중의 1개 또는 수 개의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열; 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열, 또는 당해 염기 서열 중의 1개 또는 수 개의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하고; 세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생성할 수 있는 shRNA를 들 수 있다.
siRNA 등의 RNAi 핵산 분자 또는 그의 전구체인 핵산 분자는, 예를 들어, 화학적 인 비트로(in vitro) 합성계, 파지 RNA 중합효소를 이용한 인 비트로 전사법, 또는 복제한 cDNA를 주형으로 하여 전사 회합된 긴 dsRNA를 RNase III 또는 다이서에 의하여 절단하는 방법 등에 따라 적절히 합성할 수 있다. 또한, 수식된 염기를 함유하는 RNAi 핵산 분자를 이용하는 경우에는, 합성된 핵산 분자에 대하여 수식을 수행해도 좋고, 수식된 염기를 이용하여 RNAi 핵산 분자를 합성할 수도 있다.
[발현 벡터]
본 발명의 세포 증식 억제 방법에 있어서, RNAi 핵산 분자 또는 그의 전구체를 발현할 수 있는 발현 벡터를 세포에 도입하여 당해 세포 안에서 당해 발현 벡터에서 RNAi 핵산 분자 등을 생성할 수 있다. siRNA를 발현할 수 있는 벡터는, 예를 들어, siRNA의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 각각 발현되도록 별개의 프로모터와 연결된 발현 벡터, 및 선택적 스플라이싱 등에 의하여 1 개의 프로모터로부터 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 각각 전사되도록 하는 발현 벡터 등을 들 수 있다. shRNA를 발현할 수 있는 벡터로, 예를 들어, 프로모터 하류(downstream)에 shRNA를 구성하는 단일 가닥 RNA를 연결한 발현 벡터 등을 들 수 있다.
이러한 발현 벡터는, 당업자에게 있어서 일반적인 유전 공학 기술을 통해 쉽게 제작할 수 있다 (T.R. Brummelkamp, et al., Science, 2002, Vol. 296, pp. 550-553; N.S. Lee, et al., Nat. Biotech., 2001, Vol. 20, pp. 500-505; M. Miyagishi 및 K. Taira, Nat. Biotech., 2002, Vol. 20, pp. 497-500; P.J. Paddison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, pp. 1443-1448; C.P. Paul, et al., Nat. Biotech., 2002, Vol. 20, p. 505-508; G. Sui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, pp. 5515-5520; G.M. Barton 및 R. Medzhitov, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, pp. 14943-14945; P.J. Paddison, et al., Genes Dev., 2002, Vol. 16, pp. 948-958). 보다 구체적으로는, 목적한 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 공지의 다양한 발현 벡터에 적절히 삽입하여 구축하는 것이 가능하다. 프로모터로는 RNA 중합효소 III 프로모터 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 U6 프로모터 또는 H1 프로모터 등이 유효하다. 공지의 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 또는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터(minus-strand RNA viral vectors) 등의 바이러스 벡터, 및 플라스미드 등의 비-바이러스 벡터 등이 이용 가능하다.
[세포에의 도입]
siRNA 등의 RNAi 핵산 분자, 그의 전구체, 또는 그의 발현 벡터를 세포에 도입하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 핵산 분자를 세포 내로 도입하는데 이용되는 공지의 방법 중 하나를 사용해도 좋다. 예를 들어, RNAi 핵산 분자 등을 주입 등에 의하여 직접 세포 내로 도입하여도 좋고, 필요에 따라 공지의 유전자 도입 시약 등을 사용하여 엔도사이토시스 등에 의하여 세포 내에 봉입(incorporate)할 수 있다. 또한, 세포에 도입하는 RNAi 핵산 분자 등은 1 종류만 사용해도 좋고, 2 종류 이상을 조합하여 도입할 수도 있다.
본 발명의 세포 증식 억제 방법에 있어서, 증식을 억제하는 대상 세포는 NEK10 변이체 유전자가 발현하는 세포, 즉 NEK10 변이체 유전자의 전사 산물인 mRNA 및 그 번역 산물인 단백질을 발현할 수 있는 세포(이하 NEK10 변이체 발현 세포)이다. NEK10 변이체 발현 세포라면 특별히 한정되지 않으며, 정상 세포라도 좋고 또는 암 세포여도 좋다. 또한, 세포의 유래 조직 등은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 암 세포의 경우에는 암의 종류도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 인간 유래 세포여도 좋고, 인간 이외의 동물 유래의 세포여도 좋다. 증식을 억제하는 대상 세포는 배양 세포와 생물 개체로부터 수집한 세포여도 좋고, 생물 개체 중의 세포여도 좋다.
<NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 항암제>
NEK10 변이체 mRNA에 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 상기 siRNA의 전구체 (그 중에서도, shRNA), 상기 siRNA의 발현 벡터 또는 상기 전구체의 발현 벡터 등의 핵산 분자를 세포 내에 도입하면, 그 세포 내에서 RNA 간섭이 일어나 NEK10 변이체 유전자의 발현이 저하되는 결과, 해당 세포의 세포 증식이 억제된다. 다시 말해, 이러한 핵산 분자는 세포 증식 억제제의 유효 성분으로 얻는 것이고 따라서 종양 등의 세포의 과증식 등이 문제되는 질환에 대한 의약품으로 유용한 물질이다. 따라서, 이러한 핵산 분자는 그대로 또는 적절한 약제학적으로 허용 가능한 배합제와 혼합하여, NEK10 변이체 유전자 발현 억제용 조성물 (본 발명의 조성물) 또는 항암제 (본 발명의 항암제)로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 항암제는 siRNA 등의 핵산 분자를 1 종류만 함유하고 있어도 좋고, 여러 종류를 동시에 함유하고 있어도 좋다.
NEK10 변이체 mRNA에 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산 분자를 유효 성분으로 하는 본 발명의 항암제는 NEK10 변이체 유전자를 발현하는 암의 치료에 매우 유용한 것으로 생각된다. NEK10 변이체 유전자는 유방암뿐만 아니라, 간암, 신장암, 전립선암 및 자궁암에서 발현된다. 따라서, 본 발명의 항암제는 세포 증식 작용을 보이는 많은 암 세포에서 높은 항종양 효과를 발휘할 것으로 예상된다.
본 발명의 조성물 및 항암제는 NEK10 변이체 유전자를 발현하는 암세포에 대하여, 암세포 증식 억제 작용, 암세포 사멸 유도 작용 등의 항암 작용 또는 항암제 등에 대한 감수성 증강 작용을 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물 및 항암제에 의한 이러한 작용 효과는 일시적이어도 좋고, 항시적으로 발휘되는 것이어도 좋다. 또한, 본 발명의 조성물 또는 항암제의 도입 후 일정 기간이 경과한 후 궁극적으로 효과가 발현되는 것이어도 좋다.
본 발명의 조성물 및 항암제에 첨가할 수 있는 배합제의 예로는 담체, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 유동화제, 코팅제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 보존제, 교미제, 착향제, 희석제 또는 용해 보조제 등의 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 항암제는 산제, 과립제, 정제, 캐플릿(caplet), 캡슐제, 주사제, 좌제, 연고제 등의 제제 형태로 경구 또는 비경구(전신 투여, 국소 투여 등)로 안전하게 투여된다. 본 발명의 조성물 및 항암제의 유효 성분 (RNAi 핵산 분자 또는 그의 전구체인 핵산 분자)의 함량은 제제에 따라 다르지만, 보통 0.1~100 중량%인 것이 바람직하다. 투여량은 투여 경로, 환자의 연령 및 예방 또는 치료해야 하는 실제 증상 등에 따라 다르지만, 예를 들어, 성인에 경구 투여하는 경우 유효 성분으로서 1 일 0.01mg ~ 2000mg, 바람직하게는 0.1mg ~ 1000mg 일 수 있으며, 1 일 1 회 또는 수 회로 나누어 투여 할 수 있다.
<항암제의 스크리닝 방법>
상술한 바와 같이, NEK10 변이체 유전자의 발현 저하에 의해 암 세포 내에서의 NEK10 변이체 단백질의 기능을 억제함으로써 암 세포의 증식이 억제되어 항종양 효과를 나타낸다. 따라서, NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하는 작용을 갖는 물질 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성을 억제하는 작용을 갖는 물질은 암 치료제의 유효 성분으로 유용할 가능성이 높다. 따라서, NEK10 변이체 유전자의 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성에 대한 억제 효과를 지표로 하여 신규 항암제의 스크리닝이 가능하다.
항암제의 후보 물질의 예로는 핵산, 펩타이드, 단백질, 유기 화합물 (저분자 화합물 및 고분자 화합물을 포함) 및 무기 화합물 등을 들 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법은 이 후보 물질 (이하, 시험 물질)을 함유하는 시료를 대상으로 수행할 수 있다. 시험 물질을 함유하는 시료에는 세포 추출물, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 미생물 배양 상청액, 균체 성분 등이 포함된다.
시험 물질 중에서 NEK10 변이체 유전자의 발현에 대한 억제 효과를 지표로 검색하는 경우에는, 구체적으로는, NEK10 변이체 유전자 발현 세포를 시험 물질의 존재 또는 부존재 하에서 배양하고, 두 조건하에서의 NEK10 변이체 mRNA 또는 NEK10 변이체 단백질의 발현량을 비교한다.
스크리닝에 사용하는 세포는 NEK10 변이체 발현 세포이면 된다. 인간에 효과적인 항암제를 스크리닝하는 경우, 인간 유래 NEK10 변이체 발현 세포를 이용하는 것이 바람직하지만, 인간 NEK10 변이체 mRNA와 상동성을 나타내는 염기 서열이 존재하는 종 유래의 세포라면, 인간 이외의 동물 유래의 NEK10 변이체 발현 세포이어도 된다. 예를 들어, 마우스의 전사 산물 중에도 인간 NEK10 변이체 mRNA와 상동성을 나타내는 염기서열(NCBI 어세션 번호: NM_001195119.1)이 존재하기 때문에, 마우스 유래 NEK10 변이체 발현 세포를 이용해도 된다. 또한, 스크리닝에 이용되는 세포의 범주에는 세포의 집합체인 조직을 포함한다. 기타, 인간 NEK10 변이체 유전자의 cDNA를 갖는 발현 벡터를 도입하여 NEK10 변이체 단백질을 생산할 수 있는 상태로 제조된 형질전환 세포를 NEK10 변이체 발현 세포로 사용할 수도 있다.
상기 스크리닝 방법에서, 시험 물질 및 NEK10 변이체 발현 세포의 접촉은, 예를 들어, NEK10 변이체 발현 세포의 배양액에 시험 물질을 첨가한 상태에서 배양함에 의하여 수행할 수 있다. 또한, 시험 물질과 NEK10 변이체 발현 세포의 접촉 조건은 특별히 한정되지는 않으나, 해당 세포가 사멸하지 않고 NEK10 변이체 mRNA 또는 단백질을 발현할 수 있는 배양 조건(온도, pH, 배지 조성 등)을 선택하는 것이 바람직하다.
후보 물질의 선별은, 예를 들어 상기 조건에서 시험 물질과 NEK10 변이체 발현 세포를 접촉시켜 NEK10 변이체 mRNA 또는 단백질의 발현량을 저하시키는 물질을 탐색하여 수행할 수 있다. 구체적으로는, 시험 물질의 존재 하에서 NEK10 변이체 발현 세포를 배양한 경우의 NEK10 변이체 mRNA 또는 단백질의 발현량이 같은 조건의 시험 물질 부존재 하에서의 NEK10 변이체 mRNA 또는 단백질의 발현량보다 적은 시험 물질을 선별한다.
NEK10 변이체 mRNA 또는 단백질의 발현량은 NEK10 변이체 mRNA의 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드 프로브 등을 이용한 노던 블롯법 또는 DNA 어레이를 이용한 측정 방법, 또는 NEK10 변이체 mRNA 중의 부분 염기 서열을 프라이머로 하는 RT-PCR법 또는 실시간 PCR(real-time PCR)법 등에 의해 측정할 수 있다.
NEK10 변이체 단백질의 발현량은, 예를 들어, NEK10 변이체 단백질에 대한 항체를 이용하는 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 항체를 이용하는 측정 방법으로는, 예를 들어, 웨스턴 블롯법, 면역침강법 및 ELISA 등을 들 수 있다.
NEK10 변이체는 그의 구조에 기인하여 키나아제 활성을 가질 것으로 추정된다. 따라서, NEK10 변이체 단백질의 키나아제 활성에 대한 억제 효과를 지표로 하여 항암제를 스크리닝할 수도 있다. 구체적으로, 예를 들어, 정제한 NEK10 변이체 단백질 또는 NEK10 변이체 단백질을 발현하는 세포 추출액을 이용하여, 시험 물질의 존재 또는 부존재 하에서, NEK10 변이체 단백질의 키나아제 활성을 비교한다.
키나아제 활성 측정에 사용되는 NEK10 변이체 단백질로 유전자 재조합 기술에 의해 생산된 재조합 단백질을 사용할 수 있다. 재조합 단백질은 NEK10 변이체 유전자의 cDNA 및 공지의 발현 시스템을 이용하여 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 발현 시스템으로는 대장균, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포 등을 숙주 세포로 하는 발현 시스템, 무세포 발현 시스템 등을 들 수 있다. 예를 들어, NEK10 변이체 단백질의 강제 발현 후의, 숙주 세포의 추출액을 그대로 키나아제 활성 측정에 사용하여도 좋고, 그 추출액에서 정제한 재조합 단백질을 이용해도 좋다. 또한, 본질적으로 NEK10 변이체 단백질을 발현하는 세포의 추출액과 당해 추출액에서 정제된 NEK10 변이체 단백질 또한 키나아제 활성 측정에 사용할 수 있다.
키나아제 활성 측정에 사용되는 기질로는 키나아제 기질로서 일반적으로 사용되는 각종 단백질을 사용할 수 있다. 구체적으로는, MBP (myelin basic protein) 히스톤 등을 들 수 있다. 기질 단백질은 재조합 단백질 이어도 좋고, 펩티드 합성 등에 의해 인공적으로 합성된 것이라도 좋고, 세포 내의 내재성 단백질 이어도 좋다. 재조합 단백질이나 본질적으로 세포 내에 존재하는 단백질을 사용하는 경우, 세포 추출액과 해당 추출액에서 정제한 단백질 중 어느 하나를 키나아제 활성 측정에 사용할 수 있다.
상기 스크리닝 방법에서, 시험 물질 및 NEK10 변이체 발현 세포를 키나아제 활성 측정 환경 하에서 접촉시킨다. 키나아제 활성 측정의 온도, pH, 염 농도 등의 조건은 NEK10 변이제 단백질에 의하여 기질이 되는 단백질의 인산화가 일어나는 조건이면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
후보 물질의 선별은, 예를 들어 상기 조건의 시험 물질의 존재 하에서 NEK10 변이체 단백질에 의하여 기질 단백질이 인산화된 양과 시험 물질의 부존재 하에서 기질 단백질이 인산화된 양을 비교함으로써 할 있다. 구체적으로, 시험 물질의 존재 하에서 기질 단백질이 인산화된 양이 동일한 조건의 시험 물질의 부존재 하에서 기질 단백질이 인산화된 양보다 적은 시험 물질을 선별한다.
본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 의해 선별된 물질은 세포에서 NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하여 NEK10 변이체 단백질의 생산을 저하하거나 또는 NEK10 변이체 단백질 키나아제 활성을 저하하는 작용을 가지며 암 치료에 유용할 것으로 생각된다. 또한 해당 검사 방법에 의해 선별된 시험 물질의 다양한 유도체를 제조하고 이들을 추가로 스크리닝하여 효과와 안전성이 뛰어난 유도체를 얻는 것도 가능하다.
실시예
이하에서, 본 발명을 실시예 등에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 일 예이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 등에서 언급된 시판 시약은 별다른 언급이 없으면 공급자의 사용 지침에 따라 사용하였다.
[참고예 1]
본 참고예는 다양한 암 세포주에서 NEK10 변이체 mRNA의 발현을 확인하기 위하여 수행하였다. 즉, 표 1에 기재된 각종 암 세포주에서 NEK10 변이체 mRNA의 상대적인 발현량을 SYBR (등록 상표) GREEN에 의한 실시간 PCR(Real Time PCR)로 측정하였다.
각 암 세포주로부터 RNAeasy Kit (QIAGEN 사)를 이용하여 총 RNA를 정제하였다. 400ng의 정제된 RNA를 이용하여 역전사 효소 SuperscriptIII(Invitrogen 사)를 사용 설명에 따라 사용하고 cDNA를 제조하였다. 즉, RNA를 65 ℃에서 5 분 동안 변성 처리한 후 4 ℃에서 급냉한 후 55 ℃에서 30 분 동안 및 75 ℃에서 15 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
얻어진 cDNA 중 1μL를 주형으로 하여, NEK10 변이체 mRNA에서 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 GAPDH의 mRNA에서 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 BRILIANT SYBR (등록 상표) GREEN master mix (STRATAGENE 사)을 사용 지시에 따라 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. GAPDH의 증폭은 반응 시스템의 대조군으로 수행하였다. 즉, 95 ℃, 10 분 동안 열 변성한 후, 1 사이클이 95 ℃, 30 초 동안, 이어서 55 ℃, 60 초 동안, 그런 다음 72 ℃, 60 초 동안 이루어지는 사이클 반응을 40 사이클 반복하는 PCR 반응을 수행하였다. 실시간 PCR 기기는 MX3000 (STRATAGENE 사)을 사용하였다. NEK10 변이체 mRNA에서 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 6 : 5'-GCACACAAAGGTATTTTATGG-3'의 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열번호 7 : 5'-CTACTCAAACTTGCCTTCTCA-3'의 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 사용하였다. 또한, GAPDH의 mRNA에서 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 8 : 5'-TCTGCTCCTCCTGTTCGACAGT-3'의 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열번호 9 : 5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGAC-3'염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 사용하였다. Ct 값의 판정에 소프트웨어 MX Pro (STRATAGENE 사)을 사용하였다. Ct 값은 PCR 반응에 의해 표적 유전자의 증폭이 지수함수적으로 일어나는 사이클의 문턱수(threshold number)이다(Cycle Threshold : Ct 값).
하기 식 (1)을 이용하여 얻은 Ct 값에서 각종 암 세포주의 NEK10 변이체 mRNA의 ΔCt 값 (캘리브레이터와 비교했을 때의 상대적인 Ct 값)을 구하였다.
식 (1):
ΔCt (NEK10 유전자 변이체) 값 = NEK10 변이체 mRNA의 Ct 값 - GAPDH mRNA의 Ct 값
식 (1)에서 얻은 각종 암 세포주에서의 NEK10 변이체 mRNA의 ΔCt 값을 사용하여 HeLaS3 세포의 NEK10 변이체 mRNA의 발현량을 100으로 했을 경우의 각종 암 세포주의 상대적인 NEK10 변이체 mRNA 발현량을 식 (2)에 따라 구하였다.
식 (2):
각종 암 세포주의 NEK10 변이체 mRNA의 상대적 발현량 = (각종 암 세포주에서 NEK10 변이체 mRNA의 ΔCt 값 / HeLaS3 세포의 NEK10 변이체 mRNA의 ΔCt 값) × 100
상기 식 (2)를 이용하여 얻은 HeLaS3 세포에서의 NEK10 변이체 mRNA 발현량을 100으로 했을 경우의 각종 암 세포주에서의 NEK10 변이체 mRNA의 상대적 발현량을 표 1에 나타내었다. NEK10 변이체 mRNA의 발현이 유방암 세포, 간암, 신장암, 전립선암 및 자궁 경부암 세포에서 관찰되었다. 따라서 NEK10 변이체는 유방암 세포뿐만 아니라, 유방암 이외의 암세포에서도 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 추측된다.
세포주 암 NEK10 변이체 mRNA (HeLaS3의 %)
MDA-MB-157 유방암 965
MDA-MB-231 유방암 156
MDA-MB-468 유방암 227
ZR-75-30 유방암 121
HepG2 간암 217
HLE 간암 435
A498 신장암 166
Caki-1 신장암 112
PC3 전립선암 108
HeLaS3 자궁암 100
[실시예 1]
본 실시예는 NEK10 변이체 mRNA에 대하여 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA가 NEK10 변이체 mRNA의 발현을 억제하고, 암세포의 증식을 억제하는지 확인하기 위하여 수행하였다.
<NEK10 변이체 mRNA 발현 억제 작용 확인>
서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA (이하, NEK10 siRNA #1) 및 siRNA 이루어진 the combination 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA (이하, NEK10 siRNA #2)를 세포 내로 도입하여 siRNA 처리를 수행한 후, NEK10 변이체 mRNA를 SYBR (등록 상표) GREEN 의한 실시간 PCR로 측정하고 NEK10 변이체 mRNA에 대한 넉다운 효과를 검토하였다.
실시예 1에서 NEK10 변이체 mRNA를 발현하고 있는 것으로 확인된 유방암 세포주 MDA-MB-231을 이용하여, 대조군 siRNA, NEK10 siRNA # 1 또는 NEK10 siRNA # 2를 세포 내에 도입하여 siRNA를 처리한 후, NEK10 변이체 mRNA를 SYBR (등록 상표) GREEN 의한 실시간 PCR로 측정하고, 각 siRNA에 따른 NEK10 변이체 mRNA 넉다운 효과를 검토하였다. 대조군 siRNA는 인비트로겐(Invitrogen) 사로부터 구입하고 NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2는 인비트로겐(Invitrogen) 사가 합성한 것을 사용하였다.
1 만개 / 웰의 MDA-MB-231 세포를 12 웰 플레이트에 씨딩하고, 24 시간 후에, siRNA를 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사)를 이용하여 제조자의 사용 지침에 따라 도입하였다. 즉, 1μL의 siRNA (20nM)을 50μL의 OptiMEM (Invitrogen 사)에 용해시킨 용액을 1μL의 Lipofectamine RNAiMAX을 50μL의 OptiMEM에 용해하고 실온에서 5 분간 정치한 용액과 혼합하고 실온에서 20 분간 정치하였다. 정치 한 후, 상기 혼합액을 세포에 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 배양 한 후, 배지를 교환하고, 추가로 72 시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 RNAeasy Kit (QIAGEN 사)를 이용하여 각 웰의 세포에서 RNA를 정제하였다.
정제된 RNA 중 500ng 이용하여, 역전사 효소 SuperscriptIII (Invitrogen 사)를 사용하여 참고예 1과 동일한 방법으로 cDNA를 제조하였다. 얻어진 cDNA 중 1μL를 주형으로 하여, 참고예 1과 동일한 방법으로 Ct 값을 측정하였다. 사용한 시약, 프라이머 및 기기도 참고예 1과 동일하다.
실험은 트리플리케이트로 수행하고, 트리플리케이트된 Ct 값의 평균값을 하기 식 (3)에 대입하여 각 siRNA 처리군의 ΔCt 값을 구하였다. 또한 실험은 3 회 반복하였다.
식 (3)-1:
ΔCt (대조군) 값 = 대조군 siRNA 처리군의 NEK10 변이체 mRNA의 Ct 값 - 대조군 siRNA 처리군의 GAPDH의 mRNA의 Ct 값
식 (3)-2:
ΔCt (샘플) 값 = NEK10 siRNA 처리군의 NEK10 변이체 mRNA의 Ct 값 - NEK10 siRNA 처리군의 GAPDH의 mRNA의 Ct 값
상기 식 (3)에서 얻어진 각 siRNA 처리군의 ΔCt 값을 이용하여, 하기 식 (4)에 의하여, 각 실험에서 각 siRNA 처리에 의한 NEK10 변형 mRNA의 발현량을 1 번째 대조군 siRNA 처리군을 100으로 했을 경우의 상대 값으로 구하였다. 다만, 식 (4) 중에서, NEK10 변이체 mRNA 양은 대조군 siRNA 처리군에 대한 상대적인 %이다.
식 (4):
NEK10 변이체 mRNA 양 = 2 (Δ Ct (대조군) 값-Δ Ct (샘플) 값) × 100
계산 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 세로축은 대조군 siRNA 처리시 NEK10 변이체 mRNA 발현을 100으로 했을 때의 각 siRNA 처리군의 상대적인 NEK10 변이체 mRNA 발현량을 나타낸다. 가로축은 각 siRNA 처리군을 나타낸다.
유방암 세포 MDA-MB-231의 대조군 siRNA 또는 NEK10 siRNA 처리에 의한 NEK10 mRNA의 퍼센트 대 대조군 (%)은 대조군 siRNA 처리군이 107 ± 6.2, NEK10 siRNA # 1 처리군이 11 ± 0.5, NEK10 siRNA # 2 처리군이 86 ± 7.4 이었다. Dunnet 검정에 의해 대조군 siRNA 처리군과 NEK10 siRNA 처리군을 검정한 결과, NEK10 siRNA # 1 처리군은 대조군 siRNA 처리군에 비해 유의적으로(***, p <0.001) NEK10 변이체 mRNA 을 억제하였다.
유사하게, NEK10 siRNA #2 처리군 또한 대조군 siRNA 처리군에 비해 유의적으로(** p <0.01) NEK10 변형 mRNA의 발현을 억제하였다. 즉, NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2는 모두 유방암 세포에서 NEK10 변이체의 mRNA 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
<NEK10 siRNA의 암 세포 증식 억제 효과>
NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2가 암세포에 대한 증식 억제 효과가 있는 것을 확인하였다. 즉, NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2를 세포 내에 도입하여 NEK10 변이체 유전자를 넉다운시킴으로써 세포 증식이 억제되는지 메틸렌 블루법으로 알아보았다.
상기 (NEK10 변이제 mRNA의 발현 억제 작용 확인)과 동일한 방법으로, 각 siRNA를 MDA-MB-231 세포에 도입하고, 도입 후, 72 시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고, 1000μL의 메탄올을 첨가하여 실온에서 2 분간 방치하여 세포를 고정하였다. 메탄올을 제거 후, 1000μL의 염색액 (0.05 % 메틸렌 블루 용액)을 첨가하여, 30 분간 염색하였다. 4mL의 증류수로 3 회 세척한 후, 3 % HCl 용액을 2mL 첨가하여, 메틸렌 블루의 660nm의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 (BioRad 사)를 이용하여 측정하였다.
실험은 트리플리케이트로 실시하고 같은 실험을 3 회 반복하였다. 첫 번째 실험의 대조군 siRNA 처리군의 트리플리케이트의 평균을 대조군으로 하고, 각 실험의 siRNA 처리군의 트리플리케이트의 평균을 이용하여 하기식 (5)에 의해 세포 증식률 (%)을 산출하였다.
식 (5):
세포 증식률 (%) = (각 실험의 대조군 siRNA 처리군 또는 NEK10 siRNA 처리군의 660nm에서의 흡광도 / 1 차 실험의 대조군 siRNA 처리군의 660nm의 흡광도) X 100
계산 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2 중, 세로축은 대조군 siRNA 처리시 세포 증식을 100으로 했을 때 각 siRNA 처리군의 세포 증식률을 보여준다. 가로축은 각 siRNA 처리군을 나타낸다.
각 siRNA 처리에 의한 유방암 세포 MDA-MB-231 세포 증식률 (%)은 대조군 siRNA 처리군이 88±18, NEK10 siRNA # 1 처리군이 34±14, NEK10 siRNA # 2 처리군이 58±17 이었다. Dunnet 검정에 의해 대조군 siRNA 처리군과 NEK10 siRNA 처리군을 검정한 결과, NEK10 siRNA # 1 처리군은 대조군 siRNA 처리군에 비해 유의하게 (*, p <0.05) MDA-MB-231 세포의 증식을 억제하였다.
또한, NEK10 siRNA # 2 처리군은 통계학적 유의성은 확인할 수 없었지만, 대조군 siRNA 처리군보다, MDA-MB-231 세포의 증식을 억제하였다. 즉, NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2는 효과에 있어서 약간의 차이는 있지만, 모두 유방암 세포에 대한 증식 억제 효과가 있음이 밝혀졌다.
또한, NEK10 변이체 mRNA의 발현 억제 효과가 높은 NEK10 siRNA # 1가 NEK10 siRNA # 2보다 세포 증식 억제 효과가 높았다. 이로부터, NEK10 변이체 mRNA의 발현 억제 효과가 높은 siRNA를 이용하여, 더 높은 세포 증식 억제 효과를 얻을 수 있는, 충분한 세포 증식 억제 효과를 얻기 위하여는, NEK10 변이체 mRNA의 발현량을 대조군 대비 (%) 86 이하로 할 수 있는 siRNA를 이용하는 것이 바람직함을 제시한다. 또한, NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2는 NEK10 변이체 mRNA의 다른 서열을 표적으로 하기 때문에 NEK10 siRNA # 1 및 NEK10 siRNA # 2를 병용함으로써 각각의 siRNA를 단독으로 사용하는 경우보다 높은 세포 증식 억제 효과 (항종양 효과)를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
산업상 이용가능성
본 발명의 세포 증식 억제 방법 및 핵산 분자는 NEK10 변이체 유전자가 발현되는 다양한 세포, 특히 암세포의 증식을 억제 할 수 있기 때문에, 암의 치료 및 항암제의 제조 등의 분야에 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Nippon Kayaku Co., Ltd. <120> Method for inhibiting cell proliferation, nucleic acid molecule with RNA interference activity to NEK10 gene, and anticancer agent <130> J70124A1 <160> 9 <210> 1 <211> 1215 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagctga tagaaggagc cccgcttgga gagcatttca gttctttgaa ggaaaaacat 60 caccatttta ctgaagaaag actatggaaa atatttatac agctgtgctt agctcttcga 120 tacttacaca aggagaagag gattgtccat agagatctga caccaaacaa cattatgttg 180 ggggataagg acaaagtaac cgttactgac tttggcctgg caaagcaaaa acaagaaaac 240 agtaaactca cctctgtggt tggaacaatc ctgtattctt gccccgaggt actgaagagt 300 gagccgtatg gggagaaggc tgatgtctgg gcagtaggct gcatccttta tcagatggcg 360 actttgagtc cccccttcta cagcactaac atgctgtcct tggctacaaa aatagtggag 420 gcggtatatg aaccagtccc agaaggtatc tactctgaaa aagtaacaga caccatcagc 480 aggtgcctca ctcctgatgc ggaagctcgt ccagatattg tagaagtcag ttcgatgata 540 tcagatgtca tgatgaaata tttagacaac ttatctacat cccagttgtc cttggaaaag 600 aagctagaac gggaacgaag acgcacacaa aggtatttta tggaagccaa ccggaacacc 660 gtcacatgtc accatgagct ggctgttcta tctcacgaga cctttgagaa ggcaagtttg 720 agtagcagca gcagtggagc agccagcctg aaaagtgaac tttcagaaag cgcagacctg 780 ccccctgaag gcttccaggc ctcctatggt aaagacgaag acagggcctg tgacgaaatc 840 ctgtcagatg ataacttcaa cctggaaaat gctgagaaag atacatattc agaggtagat 900 gatgaattgg acatttcgga taactccagc agctccagtt caagccccct gaaagaatct 960 acattcaaca ttttaaagag aagttttagt gcttcaggag gagaaagaca atcccaaaca 1020 agggacttca ctggaggaac aggatcaaga ccaagaccag ctttgctgcc tcttgacctg 1080 cttctgaaag tgccacccca catgctcagg gcccacatta aggaaataga ggctgagtta 1140 gtgacagggt ggcagtccca tagccttcct gctgtgattc ttcgaaatct caaagatcat 1200 ggtagtactt actag 1215 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense RNA of siRNA for NEK10 variant gene <400> 2 gaaauccugu cagaugauaa cuuca 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense RNA of siRNA for NEK10 variant gene <400> 3 ugaaguuauc aucugacagg auuuc 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense RNA of siRNA for NEK10 variant gene <400> 4 ucugccuugu uuguucacca cuauu 25 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense RNA of siRNA for NEK10 variant gene <400> 5 aauaguggug aacaaacaag gcaga 25 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Forward primer for NEK10 variant mRNA <400> 6 gcacacaaag gtattttatg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer for NEK10 variant mRNA <400> 7 ctactcaaac ttgccttctc a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Forward primer for GAPDH mRNA <400> 8 tctgctcctc ctgttcgaca gt 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Reverse primer for GAPDH mRNA <400> 9 accaaatccg ttgactccga c 21

Claims (14)

  1. 세포에서 NEK10 변이체 유전자의 발현을 저하시키기 위한 발현 저하 단계, 및/또는
    NEK10 변이체 단백질의 활성을 저하시키기 위한 활성 저하 단계를 포함하는 세포 증식 억제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 저하 단계는
    RNA 간섭에 의하여 NEK10 변이체 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자의 전구체, 및 상기 핵산 분자 또는 상기 전구체를 발현할 수 있는 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종을 세포에 도입하는 단계인 세포 증식 억제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 NEK10 변이체 유전자의 mRNA의 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA이고,
    전구체는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 NEK10 변이체 유전자의 mRNA의 염기 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭 작용을 갖는 shRNA인 세포 증식 억제 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    (a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 및
    (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA으로부터 선택되는 것인 세포 증식 억제 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 전구체는 세포에서
    (a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 또는
    (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생산하는 것인 세포 증식 억제 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 전구체는
    (p) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA; 또는
    (q) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA이고,
    상기 (p)의 shRNA 및 (q)의 shRNA으로부터 세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA가 생성되는 것인 세포 증식 억제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인 세포 증식 억제 방법.
  8. (a) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (b) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 센스 RNA, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 안티센스 RNA의 조합으로 이루어진 siRNA,
    (c) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (d) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15 내지 24개의 연속된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (e) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA,
    (f) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기서열에서 하나 또는 다수의 염기가 치환, 부가 또는 결실된 염기 서열을 함유하는 센스 RNA, 및 센스 RNA에 상보적인 염기 서열을 함유하는 안티센스 RNA의 조합으로 이루어지고; NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, 또는
    (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 기술된 siRNA에서 하나 또는 다수의 염기가 수식되고, NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA인 핵산 분자.
  9. (p) 서열번호 2로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA; 또는
    (q) 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열 중의 15개 이상의 연속된 염기 서열 또는 상기 염기 서열에서 하나 또는 다수의 염기가 수식, 치환, 부가 또는 결실된 염기서열을 함유하는 shRNA이고,
    세포에서 NEK10 변이체 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA를 생성하기 위한 전구체인 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 따른 핵산을 함유하는 상기 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  11. 제8항에 따른 핵산 분자, 제9항에 따른 핵산 분자, 및 제10항에 따른 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 NEK10 변이체 유전자의 발현 억제용 조성물.
  12. 제8항에 따른 핵산 분자, 제9항에 따른 핵산 분자, 및 제10항에 따른 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효 성분으로 함유하는 항암제.
  13. NEK10 변이체 유전자 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성 억제 효과를 지표로 이용하는 항암제 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서, NEK10 변이체 유전자의 발현 억제 효과 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성 억제 효과에 대한 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서, NEK10 변이체 발현 세포를 각각 배양하는 단계, 및
    상기 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서, 세포에서의 NEK10 변이체 mRNA의 발현량 또는 NEK10 변이체 단백질의 활성량을 측정하고 상기 발현량 또는 활성량을 비교하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
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