WO2012155780A1 - 分枝型peg修饰的glp-1类似物及其可药用盐 - Google Patents

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branched peg
lys
pharmaceutically acceptable
glp
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王瑞军
赵军军
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江苏豪森药业股份有限公司
江苏豪森医药集团连云港宏创医药有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to a branched PEG-modified GLP-1 analogue, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the analog, and a medicament for treating and/or preventing type II diabetes Aspect of the application. Background technique
  • the most commonly used drugs include insulin, sulfonylureas, biguanides, and glitazones. These drugs emphasize that the body's blood sugar tends to be normal and cannot correct the complications caused by diabetes, especially the kidneys, cardiovascular system, vision and nervous system. These complications are directly related to the increase in mortality caused by diabetes.
  • the main side effects of the first generation of drugs for the treatment of diabetes include hypoglycemia, weight gain, and edema. The mechanism of action of these drugs may vary, but there is no mechanism to protect the ⁇ -cells that secrete insulin, making it impossible to maintain normal blood glucose metabolism and endocrine regulation in the body.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • the glucagon-like peptide-1 was discovered in 1984 as an enteroendocrine hormone. If a hormone is administered to a type 2 diabetic, the blood glucose level can be adjusted to normal levels (Nathan, DM, et al. Diabetes Care 1992; 15:270-6; Zander, M, et al. Lancet 2002; 359:824- 30).
  • glucagon-like peptides and their receptor agonists are mainly responsible for the secretion of insulin by activating the glucagon analog-1 receptor on the surface of pancreatic ⁇ -cells. Because this effect is determined by the level of blood glucose in the body itself, it does not occur like traditional medicine, even in the presence of glucagon-like peptide-1 and its receptor agonist. Severe hypoglycemia causes life-threatening hypoglycemic shock. Specifically, when the blood glucose concentration in the body is higher than 6 mmol/L, the glucagon-like peptide-1 can have a remarkable effect of promoting insulin secretion, and when the blood glucose in the body tends to a normal level, it does not continue to function.
  • such agonists also have the effect of stimulating rodent (rat:) islet ⁇ -cell growth and increasing beta-cell tissue.
  • This ability to repair islet ⁇ -cells provides promise for the cure of type 2 diabetes, at least delaying the progression from type II to type I.
  • glucagon-like peptide-1 and its receptor agonist simultaneously inhibit the secretion of glucagon and thereby reduce the possibility of hepatic blood glucose output. More significantly, such agonists are effective in inhibiting gastrointestinal motility and gastric emptying, resulting in reduced food intake and reduced body weight. This can help control the weight of people with type 2 diabetes.
  • CN1976948A discloses a long-acting polyethylene glycol (PEG)-modified insulin secretagogue peptide compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof, which have the function of activating glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor Insulin secretion, lowering blood sugar, so it can effectively treat or prevent type 2 diabetes.
  • PEG polyethylene glycol
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • This patent application gives a sequence of a series of GLP-1 receptor agonists, which are also indicated by the modification of the sequence by polyethylene glycol.
  • PEG for modification has various structures, such as two-branched type, four-branched type, etc.
  • branched type PEG has various kinds of linkers, such as a glycerin linker, a lysine linker and the like.
  • linkers such as a glycerin linker, a lysine linker and the like.
  • the branched PEG is selected from the group consisting of two-branched or four-branched; the molecular weight of the branched PEG is 20-60 KD; and the linker of the branched PEG is selected from glycerol or lysine.
  • each test substance agonizes the GLP-1 receptor EC 5 .
  • mM molecular weight of PEG increases (from 20KD for PEX-167 to 40KD for PEX-168) and the number of PEG branches increases (from the straight chain of PEX-165 to the two branches of PEX-167, To the four branches of PEX-166:), the in vitro activity of the modified polypeptide was significantly reduced.
  • changes in in vivo activity with changes in PEG molecular weight and PEG branching status are not necessarily consistent with changes in in vitro activity, maintenance of in vitro activity is a necessary condition for excellent in vivo activity.
  • the long-acting effect of the linear PEG modification is weaker than the modification of the branched PEG.
  • the effect, while the two-branch PEG modification, the larger the molecular weight, the longer the activity in vivo, that is, the long-term effect produced by the modification of the large molecular weight and branched PEG is obvious.
  • the two-branched PEG has a prominent advantage in modifying the peptide chain of the present invention. Therefore, the branched PEG of the present invention is preferably of a two-branched type; the molecular weight of the branched PEG is preferably 40 KD or 60 KD.
  • the linker of the branched PEG of the present invention is preferably lysine (Lys) o
  • the PEG is a branched type mPEG2-Lys-MAL (40kD) o More preferably, the structure of the branched PEG-modified GLP-1 analogue of formula (II) His-D-Ala - Glu-Gly - Thr-Phe-Thr- Ser-Asp-Leu-Ser- Lys-Gin-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg- Leu - Phe - lie - Glu - Trp - Leu - Lys - Gin - Gly - Gly - Pro - Ser - Ser - Gly - Ala - Pro
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the branched PEG-modified GLP-1 analogue and a pharmaceutically acceptable salt thereof, which comprises a method of synthesis, purification and drying, which is preferably a solid phase or a liquid phase.
  • the purification method is preferably a reverse phase high performance liquid phase, ion exchange or gel filtration purification method, and the drying is preferably freeze drying.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the branched PEG-modified GLP-1 analog and a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment and/or prevention of type 2 diabetes.
  • the present invention optimizes the design and extensive screening of PEG for modification, and obtains a longer-lasting and more active GLP-1 analog, and the compound provided by the invention has simple preparation process and low cost. It is more suitable for industrial production.
  • Figure 1 HPLC chromatogram and analysis conditions of SEQ ID N0.95.
  • FIG. 1 Maldi-TOF map of PEX-168.
  • SEQ ID N0.95 The sequence of SEQ ID N0.95 is shown in formula (I): HdAEGTFTSDL SKQNleEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPC-NH 2
  • Resin Rink Amide-AM resin (; Gil Biochemical).
  • reagents ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarbodiimide (DIC), hydroxybenzotriazole ( ⁇ ), dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), trifluoroacetic acid (TFA), Tis, piperidine (PIP), acrylonitrile (ACN).
  • Rink Amide-AM resin (0.7mmol/g) 20g as solid phase carrier, Fmoc-AA-OH (5 times excess, 70mmol) as raw material, DIC (5 times excess, 70mmol), HOBT (5-fold excess, 70 mmol) is a condensing agent, according to the sequence of SEQ ID N0.95
  • the C-terminal is sequentially synthesized to the N-terminus, the amino acid condensation time is about 2-4 hours per step, the Fmoc protecting group removal reagent is 20% piperidine/DMF, and the condensation and de-Fmoc endpoint detection is performed by the ketone test method (Kaiser Test). .
  • the molecular weight of the obtained compound was determined by ESI-MS (yield: 4211.7).
  • This example is a synthesis of a linear, branched maleimide-based reactive polyethylene glycol, wherein the main raw materials are mPEG-OH (5kD), mPEG-OH (10kD), mPEG-OH (20kD), mPEG. -OH (30kD) are purchased from Sunbio, Korea, and other reagents such as ethylenediamine and N-hydroxysuccinimide (HOSi, Lys, toluene, and dichloromethane) are common reagents.
  • the molecular weight of the product measured by MALDI-TOF-MS was 20522.5 (theoretical value: 20000 ⁇ 2000).
  • the precipitated solid was precipitated, collected by filtration, and dried in vacuo to give a white solid (17.6 g, which was crude product of intermediate 4, and the crude product was purified by strong basic anion exchanger QAE-Sephadex A-50, removing 5 kD, 10 kD, 15 kD components, and combining 20 kD. component, extracted with DCM, the organic layers were combined, dried over anhydrous Na 2 S0 4, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure, the precipitated solid was settling in dry ether, filtered and dried in vacuo to give a white solid 12g, that is, pure intermediate 4 .
  • the synthesis of SC-mPEG (10kD) is referred to the synthesis step of SC-mPEG (20kD) in 2.1.
  • the molecular weight of the product measured by MALDI-TOF-MS was 20815.2 (theoretical value: 20000 ⁇ 2000).
  • the synthesis of SC-mPEG (20 kD) is referred to the synthesis step of SC-mPEG (20 kD) in 2.1.
  • the molecular weight of the product measured by MALDI-TOF-MS was 41135.8 (theoretical value: 40000 ⁇ 4000)
  • the molecular weight of the product measured by MALDI-TOF-MS was 62604.8 (theoretical: 60000 ⁇ 6000).
  • Example 3 Synthesis of PEGylated GLP-1 Analog SEQ ID N0.95 Reactive polyethylene glycol mPEG-MAL (20kD), mPEG4-Lys-MAL (20kD), mPEG2-Lys-MAL (20kD), mPEG2-Lys-MAL (40kD), mPEG2-Lys prepared in Example 2, respectively -MAL (60kD) and mPEG2-glycerol-MAL (40kD) (No. 2D3Y0T01) purchased from NEKTAR, USA, reacted with GLP-1 analogue SEQ ID N0.95 to form a thioether bond by Michael addition reaction.
  • the polypeptide is covalently bound to polyethylene glycol to give the PEGylated GLP-1 analog SEQ ID N0.95.
  • reaction solution was separated and purified using a reverse phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid (2.5 g) as PEX-165.
  • the molecular weight of PEX-165 measured by MALDI-TOF-MS was 24663.5 (theoretical value: 24211 ⁇ 2000).
  • reaction solution was separated and purified using a reverse phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid (2.5 g) as PEX-166.
  • the molecular weight of PEX-166 measured by MALDI-TOF-MS was 25640.8 (theoretical value: 24211 ⁇ 2000).
  • reaction solution was separated and purified using a reversed phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid (2.2 g) as PEX-167.
  • the molecular weight of PEX-167 measured by MALDI-TOF-MS was 24988.0 (theoretical value: 24211 ⁇ 2000).
  • reaction solution was separated and purified using a reverse phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid 4.5 g, which is PEX-168.
  • the molecular weight of PEX-168 measured by MALDI-TOF-MS was 44884.4 (theoretical value: 44211 ⁇ 4000).
  • reaction solution was separated and purified using a reverse phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid 6.2 g, which is PEX-169.
  • the molecular weight of PEX-169 measured by MALDI-TOF-MS was 67630.6 (theoretical value: 64211 ⁇ 6000).
  • reaction solution was separated and purified using a reverse phase HPLC preparative column (Lima, C18), and lyophilized to give a white solid 4.5 g, which is PEX-170.
  • Tested drugs PEX-165, PEX-166, PEX-167, PEX-168, PEX-170. Storage method: Keep away from light and store at -20 °C.
  • Preparation method Weigh a certain amount of the above compound, dilute to 100 ⁇ 8 / ⁇ 1 mother liquor with dimethyl sulfoxide (DMSO), and then use 10-fold gradient dilution with DMSO, the final concentration is 1000 ng / ml, 100 ng /mK 10 ng/mK 1 ng/mK 10 ⁇ g/mK 10 2 ng/ml and 10 ng/ml.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Dosage group All test drugs are set at 7 concentrations, and each concentration is set to 3 duplicate wells.
  • Positive control drug SEQ ID N0.95 o
  • DMEM medium (GIBCO, Cat No 12800017)
  • Glucagon-like Peptide-1 produced by the large intestine is highly specific through the GLP-1 receptor (GLP-1 Receptor, GLP-1 R) of islet ⁇ cells.
  • GLP-1 Receptor GLP-1 Receptor
  • the combination of adenylate cyclase activates cAMP and further activates protein kinase.
  • Metabolic signaling (glycobolism) and kinase signaling (GLP-1 binding) act synergistically at the cell membrane level, ultimately leading to Ca 2+ channel opening, Ca 2+ influx, thereby stimulating insulin secretion, while inhibiting glucagon production, Postprandial blood glucose is lowered to maintain a constant level.
  • a HEK293 cell line stably expressing GLP-1R and a cAMP-driven luciferase reporter gene was constructed for screening of GLP-1R agonists. Selected. When GLP-1R binds to the agonist, the intracellular cAMP concentration increases and the expression of the cAMP-driven luciferase reporter gene is up-regulated. The ability of a compound to agonize GLP-1R activity can be determined by detecting luciferase activity.
  • HEK293 cells stably expressing GLP-1R and luciferase reporter gene were seeded in a 96-well culture plate at a cell volume of 50,000 cells/well in 10% FBS high glucose DMEM at 37 °C. Incubate for 24 hours under 5% C0 2 conditions.
  • the activation rate (%Response) at each concentration of each sample was calculated by the following formula.
  • VoResponse L Sample - LBlank x 1 00%
  • LSEQ NO.95- LBlank a mpfe indicates the detection signal value after sample stimulation
  • L M indicates blank, that is, the detection signal value of DMSO well
  • LSEQ NO. indicates 10 nM positive control sample SEQ ID N0.95 After detection signal value after stimulation .
  • the EC 5Q value is calculated by the non-linear fitting of the sample concentration of ⁇ R ⁇ / ⁇ w by the following formula, ⁇ is the response high value, and SWto is the response low value.
  • Test drugs PEX-165, PEX-166, PEX-167, PEX-168, PEX- 169 ⁇ Storage method: Protected from light, sealed at -20 °C.
  • Preparation method Weigh different amounts of the above compounds, completely dissolve and dilute with PEX special solvent, and prepare 20 ( ⁇ g/ml PEX-165, PEX-166, PEX-167 colorless transparent solution, 40 ( ⁇ g /ml of PEX-168 colorless transparent solution and 60 ( ⁇ g/ml PEX-169 colorless transparent solution (the above molar concentrations are equal:).
  • Dosage group blank control group: PEX special solvent; PEX-165, PEX-166, PEX-167 group (200 g/ml); PEX-168 group (400 g/ml); PEX-169 group (60 ( ⁇ g/ml).
  • Route and volume of administration A single subcutaneous injection is administered at a dose of 10 ml/kg.
  • PEX-168 special solvent Jiangsu Haosen Pharmaceutical Co., Ltd., batch number: 20100719.
  • Type 11 diabetes (3 ⁇ 4/(3 ⁇ 4 mice screening, grouping and dosing)
  • Eighty db/db mice (40 males and 40 females) were purchased from animal houses at 4-5 weeks of age, fed in single cages, fed with high fat diet, and started at 7-8 weeks of age. Mice were fasted at 8:30 am 1 day before dosing (no water:), and fasting blood glucose was measured 6 hours later. Sixty db/db mice were selected, and their fasting blood glucose was between 10.2-24.7mmol/L. According to the fasting blood glucose of mice, the 60 mice were divided into 6 groups, 10 in each group (5 male and 5 female:) , were blank control group and 5 PEX compound administration groups.
  • Fasting blood glucose The fasting blood glucose of each group of mice was measured periodically.
  • the fasting blood glucose of PEX-165 mice was not significantly different from the blank control group (P>0.05).
  • the fasting blood glucose of the other groups was significantly lower than that of the blank control group.
  • the control group (P ⁇ 0.01, P ⁇ 0.001) o
  • the fasting blood glucose of PEX-166 and PEX-167 mice was not significantly different from the blank control group (P>0.05).
  • the fasting blood glucose of the PEX-169 group was significantly lower than that of the blank control group (P ⁇ 0.05).
  • PEX-165 can reduce the duration of fasting blood glucose after a single subcutaneous injection until 1-2 days after administration.
  • PEX-166 and PEX-167 can last 2-3 days after administration.
  • PEX-168 can be administered continuously. After 3-4 days, PEX-169's hypoglycemic effect can be maintained for 4-5 days after administration.
  • Table 2 Effect of single administration on daily fasting blood glucose in db/db mice
  • Test drugs PEX166, PEX168, PEX169, PEX170.
  • Preparation method Weigh different amounts of the above compounds, completely dissolve and dilute with PEX special solvent, prepare 50mg/ml PEX166 colorless transparent solution, 100mg/ml PEX168, PEX 170 colorless transparent solution and 150mg/ml PEX 169 colorless transparent solution (the molar concentration of the above solution is equal:).
  • Route and volume of administration A single subcutaneous injection is administered at a volume of 25 ml/kg.
  • Kunming mice in each test compound group were 10 males and 10 females, and the mice were poisoned and died within 14 days after administration. Toxic reactions focus on symptoms, duration, duration of toxicity, duration, and recovery time. The animals were weighed into the room, d0 (before administration), and dl ⁇ dl4.
  • mice During the administration, after administration, and until the end of the observation period, none of the mice died, and they were all free to move, and no abnormalities were observed in coat color, feces, and other conditions.
  • mice On day 14 after the mice were sacrificed, no abnormalities were observed by necropsy.
  • Table 3 Mean body weight change in mice with acute toxicity test by subcutaneous injection (g) Compound dO dl d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 dlO dl l dl2 dl3 dl4

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Description

分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其可药用盐
技术领域
本发明涉及分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其可药用盐及其 制备方法， 以及含有治疗有效量的该类似物的药物组合物， 及其在治 疗和 /或预防 II型糖尿病方面的应用。 背景技术
近年来， 随着生活水平的提高， 生活模式的现代化和社会的老龄 化， 世界各地糖尿病的患病率正在逐年增加， 尤其是那些由贫变富的 发展中国家上升更为明显。糖尿病继肿瘤、心脑血管疾病之后已成为 第三位严重的慢性非传染疾病， 是造成致死、 致残的主要原因之一。 1997年 WHO报告， 全世界已有糖尿病人 1.35亿， 到 2000年估计将 达 1.75亿人。 中国最新的调查报告显示 20岁以上自然人群中糖尿病 的患病率为 3.21%, 初步估计， 中国糖尿病患者至少在 2000万以上， 其中 95%以上为 II型糖尿病病人。 从 1993年的有关资料统计分析， 当年直接用于糖尿病的治疗费用高达 22.16亿元， 而且这一费用尚不 包括糖尿病所致并发症的治疗费用、医院外的治疗和保健开支以及间 接的社会经济损失。
目前控制 II型糖尿病的方法有节制饮食、注意锻炼、 以及用药物 来调节血糖浓度。 最常用的药物包括胰岛素、 磺酰脲类、 双胍类以及 格列酮类的化合物。这些药物强调促使体内血糖趋于正常， 无法更正 由糖尿病而引起的并发症， 尤其是对肾脏、 心血管***、 视觉及神经 ***产生的损伤。 这些并发症与糖尿病所致死亡率的增加有直接关 系。第一代治疗糖尿病的药物的主要副作用包括低血糖、体重增加以 及水肿。这些药物其作用机理可能有所不同， 但是没有一个机理有保 护具有分泌胰岛素功能的 β-细胞的作用，从而没有可能维持体内正常 的血糖代谢和内分泌调节。在许多情况下， 使用单一药物会慢慢失去 作用， 迫使采用复方治疗方法， 往往病人同时还使用降血压、 降胆固 醇药， 所以这样的方案的长期效果不一。 因此， 研究开发控制血糖新 药， 协同目前现在的药物， 强调保护及修复 β-细胞的功能， 调节内分 泌***对食物摄入的反应， 将会对治疗糖尿病有革命性的推进。
针对胰高血糖素类似肽 -1 (GLP-1) 受体的激动剂方面的研究前 景可观，这一领域的研究和开发有可能掀开治疗 II型糖尿病领域的新 篇章。胰高血糖素类似肽 -1发现于 1984年， 它是一种肠内分泌激素。 如果给予 II型糖尿病人输入此激素， 其血糖浓度可调节至正常水平 (Nathan, DM, 等人. Diabetes Care 1992; 15:270-6; Zander, M, 等人. Lancet 2002; 359:824-30)。 研究表明， 胰高血糖素类似肽及其受体激 动剂的作用主要是激活胰腺 β-细胞表面的胰高血糖素类似物 -1 受体 而分泌胰岛素所致。因为这种效应是由体内本身血糖浓度的高低来决 定的， 所以这样就不会产生会象传统药物一样， 即使在胰高血糖素类 似肽 -1 及其受体激动剂存在的情况下也导致严重低血糖而造成具有 生命危险的低血糖休克。 具体地说， 当体内血糖浓度高于 6mmol/L 时，胰高血糖素类似肽 -1能具有显著的促进胰岛素分泌的作用， 当体 内血糖趋于正常的水平时， 则不再继续作用。 另外， 这类激动剂还具 有刺激啮齿动物 (大鼠：)胰岛 β-细胞的生长， 增加 β-细胞组织的作用。 这种修复胰岛 β-细胞的功能为治愈 II型糖尿病提供了前景，至少可以 推迟从 II型发展成 I型的时间。再者，胰高血糖素类似肽 -1及其受体 激动剂同时能抑制胰高血糖素的分泌从而减少肝脏血糖输出的可能。 更有意义的是，这类激动剂能有效地抑制胃肠道能动性及胃排空从而 导致减少食物的摄入， 使体重减少。这样能帮助控制好 II型糖尿病人 的体重。
CN1976948A 公开了一类长效的用聚乙二醇 （PEG) 修饰的促胰 岛素分泌肽化合物及其可药用盐， 它们具有激活胰高血糖素类似肽 -1 (GLP-1) 受体而促进胰岛素分泌、 降低血糖的作用， 因此可以有效治 疗或预防 II型糖尿病。 该专利申请给出了一系列的 GLP-1 受体激动 剂的序列， 该专利申请中也给出了可通过对序列进行聚乙二醇修饰。 目前修饰用的 PEG有多种结构， 例如两分枝型、 四分枝型等等， 分 枝型 PEG的接头也有多种， 比如甘油接头、 赖氨酸接头等等。 对于 每一种具体结构的生物肽， 哪种 PEG修饰方式最佳并不固定。 通过 对各种不同的方式进行研究后，发明人意外发现对于本发明的具体序 列而言， 一种特定的修饰方式产生了令人意外的良好效果。 发明内容
本发明的目的在于提供分枝型 PEG修饰的式 ω 所示 GLP-1类 似物及其可药用盐：
HdAEGTFTSDL SKQNleEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPC-NH2
(I)
其中， 所述分枝型 PEG选自两分枝型或者四分枝型； 所述分枝 型 PEG的分子量为 20~60KD;所述分枝型 PEG的接头选自甘油或者 赖氨酸。
从本发明实验例一中各受试物激动 GLP-1受体 EC5。 (mM) 可以 看出， 随着 PEG分子量的增加 （从 PEX-167的 20KD到 PEX-168的 40KD) 和 PEG分枝数目增加 （从 PEX-165的直链到 PEX-167的两分 枝， 再到 PEX-166的四分枝：)， 所修饰多肽的体外活性明显下降。 尽 管体内活性随 PEG分子量和 PEG分枝状态的变化未必与体外活性的 变化一致， 然而体外活性的保持是体内活性优良的必要条件。 同时， 关于本发明所提供化合物的体内活性 （降糖作用：)，从本发明实验例二 的表 2可以看出，直链型 PEG修饰所产生的长效作用弱于支链型 PEG 的修饰效果， 而同为两分枝的 PEG修饰， 分子量越大， 体内活性表 现越长， 即大分子量、 分枝型 PEG修饰所产生的长效效果明显。 综 上， 两分枝的 PEG在修饰本发明肽链上具有突出优势。 所以， 本发 明所述分枝型 PEG优选两分枝型；所述分枝型 PEG分子量优选 40KD 或 60KD。
从实验例三的表 3 可以看出， PEX-168 对体重的抑制作用弱于 PEX-170, 这说明赖氨酸 (Lys)接头的 PEG 的修饰效果优于甘油接头 的 PEG的修饰效果。 所以， 本发明所述的分枝型 PEG的接头优选赖 氨酸 (Lys) o
更优选地， 所述分枝型 PEG为 mPEG2-Lys-MAL (40kD)o 更优选地，所述分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物的结构如式 （II ) His— D-Ala—— Glu一 Gly— Thr一 Phe一 Thr— Ser一 Asp— Leu—Ser— Lys — Gin—— Nle—— Glu—— Glu—— Glu—— Ala—— Val—— Arg— Leu—— Phe—— lie— Glu —— Trp—— Leu—— Lys—— Gin— Gly—— Gly—— Pro—— Ser— Ser— Gly—— Ala—— Pro
Figure imgf000005_0001
本发明的另一目的在于提供所述分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似 物及其可药用盐的制备方法， 其中包括合成、 纯化和干燥方法， 所述 合成方法优选固相或液相合成， 所述纯化方法优选反相高效液相、离 子交换或凝胶过滤纯化方法， 所述干燥优选冷冻干燥。
本发明的另一目的在于提供所述分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似 物及其可药用盐在治疗和 /或预防 II型糖尿病方面的应用。
在 CN1976948A的基础上， 本发明对修饰用 PEG进行了优化设 计和广泛筛选， 获得了更加长效且活性更好的 GLP-1 类似物， 且本 发明所提供的化合物的制备工艺简单、成本低，较适合于工业化生产。 附图说明
图 1 : SEQ ID N0.95的 HPLC图谱及分析条件。
图 2： SEQ ID N0.95的 ESI/MS质谱。
图 3 : PEX-168的 Maldi-TOF图谱。
图 4: 单次给药对 db/db小鼠每日空腹血糖的影响 （ n=10)o 具体实施方式
为了更具体地说明本发明， 特提供下述具体实施方式， 但本发明 的范围并不限定于此。本部分所涉及具体化合物的基本情况见具体化 合物列表。
具体化合物列表
Figure imgf000006_0001
实施例 1： GLP-1类似物 SEQ ID N0.95的合成
SEQ ID N0.95 的序列如式（I)所示： HdAEGTFTSDL SKQNleEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPC-NH2
(I)
根据结构特点， 可采用已经比较成熟的固相合成技术进行合成。 1.1合成所用的氨基酸衍生物
Fmoc-His(Trt)-OH， Fmoc-D-Ala-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH ， Fmoc-Leu-OH ， Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH , Fmoc-Nle-OH , Fmoc-Ala-OH , Fmoc-Val-OH , Fmoc-Arg(Pbf)-OH , Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH , Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH。
以上氨基酸衍生物均购自吉尔生化。
1.2树脂和其它试剂
树脂： Rink Amide- AM树脂 (；吉尔生化）。
其它试剂： Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺（DIC) , 羟基苯并三氮唑 (ΗΟΒΤ),二甲基甲酰胺 （DMF),二氯甲垸 （DCM),三氟醋酸 （TFA), Tis， 哌啶 (PIP), 丙烯腈 （ACN)。
1.3合成过程
以 Rink Amide-AM 树脂（0.7mmol/g) 20g 为固相载体， Fmoc-AA-OH (5倍过量， 70mmol) 为原料， DIC (5倍过量， 70mmol)、 HOBT (5倍过量， 70mmol) 为缩合剂， 按照 SEQ ID N0.95的序列从
C端依次往 N端合成， 每步氨基酸缩合时间约 2-4小时， Fmoc保护 基的脱除试剂为 20% 哌啶 /DMF, 缩合及脱 Fmoc终点检测采用茚三 酮检测法 （Kaiser Test)。
缩合完毕， 得到树脂肽。干燥后， 以 TFA/TiS/H20 (95:2.5:2.5:) 为 裂解试剂裂解树脂肽， 室温反应约 3小时， 滤除树脂， 将裂解液于乙
52.0g。 将得到的粗品用纯化水 〇=溶解， 反相 HPLC制备柱 （Luna,C18:> 分 离纯化， 冻干得白色固体 11. HN2g， 即为产品。
ESI-MS测得所得化合物分子量为 4212 (理论值： 4211.7)。
实施例 2: 马来酰亚胺基活性聚乙二醇的合成
本实施例为直链型、 分枝型马来酰亚胺基活性聚乙二醇的合成， 其中主要原料 mPEG-OH (5kD)、 mPEG-OH (10kD)、 mPEG-OH (20kD)、 mPEG-OH (30kD) 均购自韩国 sunbio公司，其余试剂如乙二 胺、 N-羟基琥珀酰亚胺 （HOSi 、 Lys、 甲苯、 二氯甲垸等均为常用试 剂。
2.1 mPEG-MAL (20kD) 的合成
triphosgene 〇
OH
、σ 〇 〇- -CI mPEG-OH(20KD)
〇
〇 NH
H。N
HOSu
TEA
SC-m PEG(20kD)
〇
Figure imgf000007_0001
mPEG-NHCH2CH2NH2(20KD)
mPEG-MAL(20KD) 将 20g (lmmol) mPEG-OH (20kD) 投入到 200ml的单口瓶中，加 入 100ml甲苯，回流分水；然后蒸出甲苯，冷却至室温，再加入 100ml DCM， 随后加入 1.18g (4mmol) 的三光气 （triphosgene)， 室温密闭搅 拌反应过夜； 次日将反应液于通风厨中冲析入 200ml的无水***中， 过滤后真空干燥得白色固体 15g。将 15g该白色固体投入到 200ml的 单口瓶中， 加入 100ml 甲苯 /DCM (2: 1) 的溶液， 再加入 0.25g 的 HOSu, 随后加入 0.3g三乙胺， 室温密闭搅拌反应过夜； 反应结束后， 将反应液过滤， 滤液直接冲析入 100ml的无水***中， 过滤， 真空干 燥得白色固体 14g， 即为 SC-mPEG (20kD)o
将 1.4g无水乙二胺用 50ml DCM于 200ml反应瓶中溶解， 再取 14g SC-mPEG (20kD) 溶解于 100ml的 DCM溶解后加入到上述乙二 胺溶液中， 反应过夜； 次日停止反应过滤， 滤液加入 500ml的饱和食 盐水洗涤， 水层用 DCM提取三次 （200mlx3:>， 合并有机层， 无水硫 酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩， 于无水***中沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 13g， 即为 mPEG-NHCH2CH2NH2 (20kD)。
将 13g mPEG-NHCH2CH2NH2 (20kD) 和 0.8g MAL-ONP用 100ml DCM溶解， 再加入 0.3g的三乙胺， 室温搅拌反应过夜； 然后将反应 液过滤， 滤液减压浓缩至干， 再加入 100ml乙酸乙酯加热溶解， 放置 析出固体，过滤，真空干燥得白色固体 12g，即为 mPEG-MAL (20kD)。
MALDI-TOF-MS 测得产物分子量为 20522.5 (理论值： 20000±2000)。
2.2 mPEG4-Lys-MAL (20kD)的合成
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
将 1.73g(5mmol)BOC-Lys(BOC)-OH溶于 200ml的 DCM和 DMF 的混合溶液中， 冰浴冷却到 0°C左右， 加入 0.69g (6mmol) HOSu后， 再滴加 0.76g (6mmol) DIC的 DCM溶液， 滴加完毕后维持 0°C反应 6h后撤去冰浴， 室温反应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***和正己垸中析晶， 过滤， 真空干燥得白色固体 2g， 即为 BOC-Lys(BOC)-OSu (中间体 1 )， 收率 87%。
将 270mg(1.5mmol)的赖氨酸盐酸盐 （Lysine'HCL) 用 lmol/L的 NaOH 溶液调 PH 值至 8.0 溶解后， 将 1.84g (4mmol)的 BOC-Lys(BOC)-OSu的 DCM和 DMF的混合溶液加入上述溶液中， 维持 pH在 8.0， 反应 4个小时后用草酸调节 pH为 3， 用饱和食盐水 洗涤至中性， 再用 DCM提取完全， 合并有机层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 用无水***和正己垸析晶得白色固体 lg， 即 为中间体 2， 收率 83%。
将 lg的中间体 2用 20ml的 DCM溶解后，加入 5ml的三氟乙酸， 常温搅拌 30min后， 浓缩至干， 即为中间体 3。
将 360mg (0.9mmol) 中间体 3用 100ml的 0.2M的硼酸缓冲液调 PH8.0溶解后， 加入 20g (4mmol) 的 SC-mPEG(5kD)(SC-mPEG(5kD) 的合成参照 2.1)，维持 pH在 8.0，搅拌反应过夜；反应结束后用 600ml 纯化水稀释并用草酸调节 pH为 3， 用 DCM提取完全， 合并有机层， 无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，与无水***中沉降析出固体， 过滤收集后真空干燥得白色固体 17.6g， 即为中间体 4粗品， 粗品用 强碱性阴离子交换剂 QAE-Sephadex A-50纯化， 除去 5kD、 10kD、 15kD组分，合并 20kD组分，用 DCM提取，合并有机层，无水 Na2S04 干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空 干燥得白色固体 12g， 即为中间体 4纯品。
将 8g (0.4mmol) 中间体 4溶于 150ml的 DCM中， 加入 0.6g的 HOSu和 0.65g的 DIC, 室温反应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减 压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体 7.5g， 即为 mPEG4-Lys-NHS (20kD); 收率 90%。
将 7.5g (0.38mmol) 的 mPEG4-Lys-NHS (20kD) 溶解于 80ml的 DCM, 然后搅拌下用滴液漏斗滴加 0.9g溶解于 40ml DCM的无水乙 二胺至上述溶液中， 滴加完毕密闭反应过夜； 次日将反应液过滤， 滤 液加入 100ml的饱和食盐水洗涤， 水层用 DCM提取三次， 合并有机 层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固 体， 过滤， 真空干燥得白色固体 7g， 即为 mPEG4-Lys-NH(CH2)2 NH2 (20kD)， 收率 93%。
将 7g (OJmmol) mPEG4-Lys-NH(CH2)2NH2 (20kD)和 0.4g MAL-ONP用 100ml DCM溶解，再加入 0.15g的三乙胺，室温搅拌反 应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减压浓缩至干， 再加入 100ml乙酸 乙酯加热溶解， 放置析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 6g， 即 为 mPEG4-Lys-MAL (20kD)， 收率 86%。
MALDI-TOF-MS 测得产物分子: 为 21021.7 (理论值：
20000±2000)。
2.3 mPEG2-Lys-MAL (20kD) 的合成
Figure imgf000011_0001
SC-mPEG (10kD) 的合成参照 2.1中 SC-mPEG (20kD) 的合成步 骤。
将 90mg (0.5mmol) 赖氨酸盐酸盐 （Lysine'HCL) 用 100ml 的 0.2M硼酸缓冲液调 PH值至 8.0 溶解后， 加入 12g (1.2mmol) 的 mPEG-OSu (lOkD), 维持 pH在 8.0， 搅拌反应过夜； 反应结束后用草 酸调节 pH为 3， 再加入氯化钠至饱和， 用 DCM提取完全， 合并有 机层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 与无水***中沉降析 出固体， 过滤收集后真空干燥得白色固体 11.5g， 即为中间体 mPEG2-Lys-OH (20kD)粗品， 粗品用强碱性阴离子交换剂 QAE-SephadexA-50纯化，除去 10kD组分，合并 20kD组分，用 DCM 提取， 合并有机层， 无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无 水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 9.3g， 即为 mPEG2-Lys-OH (20kD) 纯品， 收率 93%。
将 8g (0.4mmol) mPEG2-Lys-OH (20kD) 溶于 150ml的 DCM中， 加入 0.6g的 HOSu和 0.65g的 DIC, 室温反应过夜； 然后将反应液过 滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白 色固体 7.7g， 即为 mPEG2-Lys-NHS(20kD); 收率 96%。
将 7.7g (0.38mmol) 的 mPEG4-Lys-NHS (20kD) 溶解于 80ml的 DCM, 然后搅拌下用滴液漏斗滴加 0.9g溶解于 40ml DCM的无水乙 二胺至上述溶液中， 滴加完毕密闭反应过夜； 次日将反应液过滤， 滤 液加入 100ml的饱和食盐水洗涤， 水层用 DCM提取三次， 合并有机 层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固 体，过滤，真空干燥得白色固体 7.0g，即为 mPEG2-Lys-NH(CH2)2NH2 (20kD)， 收率 93%。
将 7.0g (0.7mmol) mPEG2-Lys-NH(CH2)2NH2 (20kD)和 0.4g MAL-ONP用 100ml DCM溶解，再加入 0.15g的三乙胺，室温搅拌反 应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减压浓缩至干， 再加入 100ml乙酸 乙酯加热溶解， 放置析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 6.4g， 即 为 mPEG2-Lys-MAL (20kD)， 收率 91%。
MALDI-TOF-MS 测得产物分子量为 20815.2 (理论值： 20000±2000)。
Figure imgf000012_0001
SC-mPEG (20kD) 的合成参照 2.1中 SC-mPEG (20kD) 的合成步 骤。
将 60mg的赖氨酸盐酸盐 （Lysine'HCl) 用 160ml 的 0.1M硼酸缓 冲液， pH8.0溶解后，加入 21.6g的 SC-mPEG (20kD),维持 pH为 8.0， 室温搅拌反应 24小时； 反应结束后， 用 600ml纯化水稀释并用草酸 调节 pH为 3， 用 DCM提取， 合并有机层， 无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤收集， 真空干燥得白 色固体 19g， 即为 mPEG2-Lys-OH (40kD)粗品； 粗品用强碱性阴离 子交换剂 QAE-Sephadex A-50纯化， 除去 20kD组分， 合并 40kD组 分， 用 DCM提取， 合并有机层， 无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减 压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 llg， 即为 mPEG2-Lys-COOH (40kD) 纯品。
将 10g mPEG2-Lys-OH (40kD) 溶于 200ml的 DCM中，加入 0.3g HOSu和 0.3g DIC， 室温反应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减压浓 缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 10g， 即 为 mPEG2-Lys-NHS (40kD)。
将 mPEG2-Lys-NHS (40kD) 10g溶解于 100ml的 DCM, 然后搅 拌下用滴液漏斗滴加入 0.6g无水乙二胺用 50ml DCM溶解的溶液中， 滴加完毕密闭反应过夜； 次日将反应液过滤， 滤液加入 200ml的饱和 食盐水洗涤， 水层用 DCM提取三次， 合并有机层，无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得 白色固体 10g， 即为 mPEG2-NH(CH2)2NH2 (40kD)。
将 10g mPEG2-NH(CH2)2NH2 (40kD)和 0.3g MAL-ONP用 100ml DCM溶解， 再加入 O.lg的三乙胺， 室温搅拌反应过夜； 然后将反应 液过滤， 滤液减压浓缩至干， 再加入 100ml乙酸乙酯加热溶解， 放置 析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 9g， 即为 mPEG2-Lys-MAL (40kD)。
MALDI-TOF-MS 测得产物分子量为 41135.8(理论值： 40000±4000
2.5 mPEG2-Lys-MAL (60kD) 的合成 SC-mPEG (30kD) 的合成参照 2.1中 SC-mPEG (20kD) 的合成步 骤。
将 40mg的赖氨酸盐酸盐 （Lysine'HCl) 用 160ml 的 0.1M硼酸缓 冲液， pH8.0溶解后，加入 21.6g的 SC-mPEG (30kD),维持 pH为 8.0， 室温搅拌反应 24小时； 反应结束后， 用 600ml纯化水稀释并用草酸 调节 pH为 3， 用 DCM提取， 合并有机层， 无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤收集， 真空干燥得白 色固体 19g， 即为 mPEG2-Lys-OH (60kD)粗品； 粗品用强碱性阴离 子交换剂 QAE-Sephadex A-50纯化， 除去 30kD组分， 合并 60kD组 分， 用 DCM提取， 合并有机层， 无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减 压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 10g， 即为 mPEG2-Lys-OH (60kD) 纯品。
将 10g mPEG2-Lys-COOH (60kD) 溶于 200ml的 DCM中， 加入 0.2g HOSu 0.2g DIC, 室温反应过夜； 然后将反应液过滤， 滤液减 压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 10g， 即为 mPEG2-Lys-NHS (60kD)。
将 mPEG2-Lys-NHS (60kD) 10g溶解于 100ml的 DCM, 然后搅 拌下用滴液漏斗滴加入 0.4g无水乙二胺用 50ml DCM溶解的溶液中， 滴加完毕密闭反应过夜； 次日将反应液过滤， 滤液加入 200ml的饱和 食盐水洗涤， 水层用 DCM提取三次， 合并有机层，无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩， 于无水***沉降析出固体， 过滤， 真空干燥得 白色固体 10g， 即为 mPEG2-NH(CH2)2NH2 (60kD)。
将 10g mPEG2-NH(CH2)2NH2 (60kD) 和 0.2g MAL-ONP用 100ml DCM溶解， 再加入 0.07g的三乙胺， 室温搅拌反应过夜； 然后将反 应液过滤， 滤液减压浓缩至干， 再加入 100ml乙酸乙酯加热溶解， 放 置析出固体， 过滤， 真空干燥得白色固体 9g， 即为 mPEG2-Lys-MAL (60kD)o
MALDI-TOF-MS 测得产物分子量为 62604.8 (理论值： 60000±6000)。
实施例 3 : 聚乙二醇化 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95的合成 分别用实施例 2 制得的活性聚乙二醇 mPEG-MAL (20kD) , mPEG4-Lys-MAL (20kD) 、 mPEG2-Lys-MAL (20kD) 、 mPEG2-Lys-MAL (40kD)、 mPEG2-Lys-MAL (60kD)以及从美国 NEKTAR 公司购买的 mPEG2-glycerol-MAL (40kD) (货号： 2D3Y0T01), 与 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95反应， 通过迈克尔加成 反应后形成硫醚键使多肽和聚乙二醇共价结合，从而得到聚乙二醇化 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95。
Figure imgf000015_0001
mPEG2-glycerol-MAL(40kD)的结构
3.1 PEX-165的制备
称取 5.0g mPEG-MAL (20kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2倍过量)， 加入 300ml 0.1M磷酸钠盐缓冲液 （pH7.7)， 室 温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 2.5g， 即为 PEX-165。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-165 分子量为 24663.5 (理论值： 24211±2000)。
3.2 PEX-166的制备
称取 5.0g mPEG4-Lys-MAL (20kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2倍过量)， 加入 300ml 0.1M磷酸钠盐缓冲液 （pH7.7)， 室温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 2.5g， 即为 PEX-166。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-166 分子量为 25640.8 (理论值： 24211±2000)。
3.3 PEX-167的制备
称取 5.0g mPEG2-Lys-MAL (20kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2倍过量)， 加入 300ml 0.1M磷酸钠盐缓冲液 （pH7.7)， 室温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 2.2g， 即为 PEX-167。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-167 分子量为 24988.0 (理论值： 24211±2000)。
3.4 PEX-168的制备
称取 lO.Og mPEG2-Lys-MAL (40kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2 倍过量）， 加入 300ml 0.1M 磷酸钠盐缓冲液 (pH7.7), 室温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 4.5g， 即为 PEX-168。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-168 分子量为 44884.4 (理论值： 44211±4000)。
3.5 PEX-169的制备
称取 15.0g mPEG2-Lys-MAL (60kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2 倍过量）， 加入 300ml 0.1M 磷酸钠盐缓冲液 (pH7.7), 室温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 6.2g， 即为 PEX-169。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-169 分子量为 67630.6 (理论值： 64211士 6000)。
3.6 PEX-170的制备
称取 10.0g mPEG2-glycerol-MAL (40kD) 和 1.26g的 GLP-1类似物 SEQ ID N0.95 (1.2 倍过量）， 加入 300ml 0.1M 磷酸钠盐缓冲液 (pH7.7), 室温搅拌反应 2小时。
反应液使用反相 HPLC 制备柱 （Lima,C18) 分离纯化， 冻干得白 色固体 4.5g， 即为 PEX-170。
MALDI-TOF-MS 测得 PEX-170 分子量为 44506.9 (理论值： 44211±4000)。 实验例一： 胰高血糖素样肽 -1受体激动活性测定
1. 受试药物及阳性对照药物
1.1 受试药物： PEX-165、PEX-166 、 PEX-167、 PEX-168、 PEX-170。 贮存方法： 避光， -20°C密闭保存。
配制方法： 分别称取一定量的上述化合物， 用二甲亚砜 (DMSO) 稀释为 100 μ8/ηι1的母液， 然后用 DMSO进行 10倍梯度稀释， 终浓 度分别为 1000 ng/ml、 100 ng/mK 10 ng/mK 1 ng/mK 10 ^g/mK 102 ng/ml禾卩 10 ng/ml。
剂量组别： 所有受试药物均设 7个浓度， 每个浓度设 3个复孔。 1.2 阳性对照药物： SEQ ID N0.95 o
贮存方法： 避光， -20°C密闭保存。
配制方法： 称取一定量的 SEQ ID N0.95, 用二甲亚砜 (DMSO)将 化合物稀释为 10 nM阳性对照药物浓度。
2. 试剂与仪器
2.1 主要试剂
DMEM培养基 （GIBCO, Cat No 12800017)
二甲亚砜 （Genebase, Prod No:0231)
荧光素酶活性检测试剂盒 (Promega, Prod No: E2550)
2.2 主要仪器
Envision 2101多功能微孔板酶标仪 (PerkinElmer)
3. 实验原理和方法
3.1 实验原理
由大肠产生的胰高血糖素样肽 -1 (Glucagon-like Peptide- 1, GLP-1), 通过与胰岛 β细胞的 GLP-1受体 （GLP-1 Receptor, GLP-1 R) 高度特异性地结合， 激活腺苷酸环化酶而合成 cAMP, 并进一步激活 蛋白激酶。代谢信号 （糖代谢） 和激酶信号 （GLP-1结合） 在细胞膜水 平协同作用， 最终导致 Ca2+通道开放， Ca2+内流， 从而刺激胰岛素分 泌， 同时抑制胰高血糖素的产生， 使餐后血糖降低以维持恒定水平。
根据 GLP-1R信号转导通路， 建立了稳定表达 GLP-1R和由 cAMP 驱动的荧光素酶报告基因的 HEK293细胞系，用于 GLP-1R激动剂的筛 选。 当 GLP- 1R与激动剂结合， 细胞内 cAMP浓度升高， 由 cAMP驱动 的荧光素酶报告基因的表达就会上调。通过对荧光素酶活性的检测即 可判断化合物激动 GLP- 1R活性的能力。
3.2 实验步骤
(i) 将稳定表达 GLP-1R和荧光素酶报告基因的 HEK293细胞以 50000个 /孔的细胞量， 100 μΐ/孔接种于 96孔培养板内， 在 10% FBS 高 糖 DMEM, 37°C、 5% C02条件下培养 24小时。
(ii) 将待筛化合物按要求浓度以 DMSO稀释， 然后以 1 μΐ/孔加入 上述 96孔微量培养板， 轻微振荡摇匀。 培养板的 1和 12两列做阳性对 照。 在 37°C、 5% C02条件下培养 5小时。
(iii) 每孔吸去 50 μΐ培养基， 加入 50 μΐ荧光素酶活性检测试剂， 振 荡 10分钟。
(iv) 每孔吸取 80 μΐ上述混合物， 转移到 96孔板， 在 Envision2101 多功能微孔板酶标仪检测化学发光计数值。
(v) 数据处理。
4. 数据处理和统计分析
以 SEQ ID N0.95为阳性化合物， 通过以下公式计算得到各样品 各浓度条件下的激活率 (%Response) 。
VoResponse = L Sample - LBlank x 1 00%
LSEQ NO.95- LBlank ampfe表示样品刺激后的检测信号值， LM表示空白， 即 DMSO 孔的检测信号值， LSEQ NO. 表示 10 nM阳性对照样 SEQ ID N0.95 刺激后的检测信号值。
EC5Q值是通过 ^R^/^w 对样品浓度的对数值 X用下面公式进 行非线性拟合计算得到， Γ 为响应高值， SWto 为响应低值。
Top-Bottom
VoResponse = Bottom +
1+10 (LogECso-X)
5. 试验结果
结果如表 1所示。 表 1 各受试物激动 GLP-1受体 EC 标准误差 （nM) 95%可信限 受试物 EC50 (ng/ml) EC5Q (nM)
(nM)
PEX165 1.748 0.087 0.007 0.072 to 0.102
PEX166 7.937 0.397 0.019 0.356 to 0.438
PEX167 2.507 0.125 0.010 0.104 to 0.146
PEX168 8.291 0.207 0.020 0.164 to 0.250
PEX170 34.675 0.254 0.013 0.226 to 0.282 结论： 上述化合物在体外均具有 GLP-1 受体激动活性， 其中， 活性由强到弱的顺序为 PEX-165 , PEX- 167 , PEX- 168 , PEX-170 , PEX- 166 , 这表明， Lys接头的两分枝型 PEG较适合于本发明的具 体序列 SEQ ID N0.95。
实验例二： 单次给药对 2型糖尿病 db/db小鼠每日空腹血糖的影响
1.受试药物： PEX-165, PEX-166, PEX-167, PEX-168, PEX- 169ο 贮存方法： 避光， -20°C密闭保存。
配制方法： 分别称取不同量的上述化合物， 用 PEX专用溶剂完 全溶解并稀释， 配成 20(^g/ml的 PEX-165、 PEX- 166、 PEX-167无色 透明溶液， 40(^g/ml的 PEX-168无色透明溶液和 60(^g/ml PEX-169 无色透明溶液 （上述溶液摩尔浓度相等：)。
剂量组别： 空白对照组： PEX专用溶剂； PEX-165、 PEX- 166, PEX-167 组 （200 g/ml)； PEX-168 组（400 g/ml)； PEX-169 组 (60(^g/ml)。
给药途径和容积： 单次皮下注射给药， 给药容积为 10ml/kg。
2. 试剂与仪器
2.1 主要试剂
PEX-168专用溶剂： 江苏豪森药业股份有限公司， 批号： 20100719。
氯化钠注射液： 上海华源长富药业有限公司， 批号： 10060201。 2.2 主要仪器
ΤΜ TM
强生稳捷基础倍加血糖监测仪 ONE TOUCH BASIC Plus。 3. 试验方法
3.1 11型糖尿病(¾/(¾小鼠的筛选、 分组和给药
80只 db/db小鼠 (；雄性 40只、 雌性 40只：)， 4-5周龄时购入动物房， 单笼饲养， 喂以高脂饲料， 至 7-8周龄时开始实验。 小鼠于给药前 1天 上午 8 : 30禁食 （不禁水：)， 6小时后测定空腹血糖。 选取 60只 db/db小 鼠， 其空腹血糖介于 10.2-24.7mmol/L之间， 根据小鼠空腹血糖将该 60 只小鼠分为 6组， 每组 10只 （5雄 5雌：)， 分别为空白对照组和 5个 PEX 化合物给药组。
从给药次日起至给药后 5天 (120小时：)， 各组小鼠均于每天上午 8:30禁食， 6h后测定空腹血糖。
3.2 观察指标
空腹血糖： 定期测定各组小鼠空腹血糖。
4. 数据处理和统计分析
数据以均值 ±标准差 （ ±s ) 表示， 采用 对数据进行 统计学分析。
5. 试验结果
结果见图 4和表 2。
db/db小鼠单次皮下注射不同 PEX受试物后第 2天， PEX-165组小 鼠空腹血糖与空白对照组无显著差别 （P>0.05)，其余各组小鼠空腹血 糖明显低于对照组 （P<0.01， P<0.001) o 给药后第 3天， PEX-166、 PEX-167组小鼠空腹血糖与空白对照组无显著差别 （P>0.05)。 给药后 第 4天， PEX-169组小鼠空腹血糖仍显著低于空白对照组 （P<0.05)。 至给药后第 5天， 各 PEX给药组小鼠空腹血糖与空白对照组相比均无 显著差别 （P>0.05)。
因此， PEX化合物单次皮下注射后可明显降低 db/db小鼠的空腹血 糖， 该作用维持的时间与化合物结构相关。 PEX-165单次皮下注射后 的降空腹血糖作用可持续到给药后 1-2天， PEX-166、 PEX-167可持续 到给药后 2-3天， PEX-168可持续到给药后 3-4天，而 PEX-169的降空腹 血糖作用则可维持到给药后 4-5天。 表 2 单次给药对 db/db小鼠每日空腹血糖的影响
土 s n=10) 给药后天数
组别 给药前 -
1 2 3 4 5 空白对
17·91±3·46 17.50±3.86 17.98±3.28 18.49±3.53 18.60±2.45 18.26±2.51 昭
PEX-165 17.30±3.48 12.71±2.31 16.06±3.33 17.61±2.66 18.26±2.10 18.69±2.23
PEX-166 17.84±2.20 10.66±2.42 13.07±2.23" 16.94±2.79 17.32±2.65 17.26±3.07
PEX-167 17.44±3.17 9.01±2.80 11.22±2.55 15.45±2.92 18.16±3.03 17.9±2.16
PEX-168 17.73±2.98 9.12±3.13 11.04±2.60 13.38±2.27** 16.05±3.15 16.68±2.12
PEX-169 17.49±3.99 6.39±2.60 8.13±2.49 10.56±2.01 13.99±3.87* 16.22±2.29
*Ρ<0.05 , **Ρ<0.01 , ***Ρ<0.001与空白对照组相比
结论： 上述五个受试物 (等摩尔浓度:)单剂量给药后， PEX-166比 PEX-165长效， PEX-168比 PEX-167长效， PEX-169比 PEX-168长效。 这表明， 对本发明的具体序列而言， 从修饰的长效效果来看， 分枝型 PEG更适合本发明的序列， 大分子量的 PEG更适合本发明的序列。
实验例三： 皮下注射对小鼠的急性毒性试验
1.受试药物： PEX166、 PEX168、 PEX169、 PEX170。
贮存方法： 避光， -20°C密闭保存。
配制方法： 分别称取不同量的上述化合物， 用 PEX专用溶剂完 全溶解并稀释， 配成 50mg/ml的 PEX166无色透明溶液， 100mg/ml 的 PEX168、 PEX 170无色透明溶液和 150mg/ml PEX 169无色透明溶 液 (上述溶液摩尔浓度相等：)。
给药途径和容积： 单次皮下注射给药， 给药容积均为 25ml/kg。
2. 试验方法
每一受试化合物组中的昆明小鼠 （SPF级:） 为雌雄各 10只，观察 给药后 14天内小鼠的中毒和死亡情况。 毒性反应重点观察症状、 程 度，毒性反应起始时间、持续时间及恢复时间等。于动物入室、 d0 (给 药前)、 dl〜dl4每天称重。
3.试验结果
给药期间、 给药后并直到观察期结束， 小鼠无一死亡， 均活动自 如， 毛色、 粪便及其它情况也未见明显异常。
体重： 结果见表 3。
PEX166给药后 241！〜 96h (dl〜d4)， 雌雄小鼠体重均明显降低， d4时达到最低点，之后较快恢复，至 d7时恢复至给药前的体重水平。
PEX168给药后 241！〜 48h (dl〜d2)， 雌雄小鼠体重均明显降低， d2时达到最低点，之后较快恢复，至 d5时恢复至给药前的体重水平。
PEX169给药后 241！〜 120h (dl〜d5)， 雌雄小鼠体重均明显降低， d5时达到最低点， 之后逐渐恢复， 至 dlO时恢复至给药前的体重水 平。
PEX170给药后 241！〜 72h (dl〜d3)， 雌雄小鼠体重均明显降低， d3时达到最低点，之后逐渐恢复，至 d9时恢复至给药前的体重水平。
剖检： 第 14天小鼠处死后经剖检肉眼观察未见异常。 表 3 皮下注射急性毒性试验小鼠平均体重变化 (g) 化合物 dO dl d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 dlO dl l dl2 dl3 dl4
Figure imgf000023_0001
PEX168 20.0 17.9 17.1 17.8 19.0 20.3 20.9 21.8 22.7 23.9 25.2 26.1 27.9 29.1 30.2
PEX169 19.9 18.3 17.7 16.9 16.3 15.7 16.6 17.2 18.3 19.1 20.0 21.3 22.6 24.0 25.5
PEX170 20.5 18.3 17.1 16.3 16.9 17.4 18.2 19.0 19.8 20.7 21.9 23.2 24.7 26.1 27.5
结论： 单次皮下注射 PEX 166〜PEX170 (；等摩尔量）对小鼠食量 与体重有显著的抑制作用， 这种抑制作用可随停药而渐渐恢复， 其中 PEX 168的抑制作用弱于其它三个化合物。

Claims

权利要求书:
1、 分枝型 PEG 修饰的 GLP-1 类似物及其可药用盐， 其中所述 GLP-1类似物的结构如式 （ ) 所示：
HdAEGTFTSDL SKQNleEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPC-NH2
(1)。
2、 根据权利要求 1所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其 可药用盐， 其中所述分枝型 PEG为两分枝型。
3、 根据权利要求 1所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其 可药用盐， 其中所述分枝型 PEG的接头为 Lys。
4、 根据权利要求 1所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其 可药用盐， 其中所述分枝型 PEG的分子量为 20~80KD， 优选 40KD和
5、根据权利要求 2至 4任意一项所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1 类似物及其可药用盐， 其中所述分枝型 PEG为 mPEG2-Lys-MAL。
6、 根据权利要求 5所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其 可药用盐， 其结构如式 （Π )所示：
His— D-Ala ~ Glu— Gly— Thr— Phe— Thr— Ser— Asp— Leu— Ser— Lys
— Gin—— Nle—— Glu—— Glu—— Glu—— Ala—— Val—— Arg— Leu—— Phe—— lie— Glu
— Trp— Leu—— Lys― Gin― Gly― Gly— Pro—— Ser― Ser― Gly— Ala—— Pro
Figure imgf000025_0001
7、 一种制备权利要求 1至 6任意一项所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1类似物及其可药用盐的方法， 其中包括合成、 纯化和干燥方法。
8、 根据权利要求 7所述的方法， 其中所述合成方法选自固相或液 相方法。
9、 根据权利要求 7所述的方法， 其中所述纯化方法选自反相高效 液相、 离子交换或凝胶过滤纯化方法。
10、 根据权利要求 7所述的方法， 其中所述干燥方法为冷冻干燥。
11、根据权利要求 1至 6任意一项所述的分枝型 PEG修饰的 GLP-1 类似物及其可药用盐在治疗和 /或预防 II型糖尿病方面的应用。
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