CN103492412B - 分枝型peg修饰的glp-1类似物及其可药用盐 - Google Patents

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Abstract

提供了分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐、其制备方法、含有治疗有效量的该类似物的药物组合物，及其制备治疗和/或预防Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

Description

分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐
技术领域
本发明涉及分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐及其制备方法，以及含有治疗有效量的该类似物的药物组合物，及其在治疗和/或预防II型糖尿病方面的应用。
背景技术
近年来，随着生活水平的提高，生活模式的现代化和社会的老龄化，世界各地糖尿病的患病率正在逐年增加，尤其是那些由贫变富的发展中国家上升更为明显。糖尿病继肿瘤、心脑血管疾病之后已成为第三位严重的慢性非传染疾病，是造成致死、致残的主要原因之一。1997年WHO报告，全世界已有糖尿病人1.35亿，到2000年估计将达1.75亿人。中国最新的调查报告显示20岁以上自然人群中糖尿病的患病率为3.21％，初步估计，中国糖尿病患者至少在2000万以上，其中95％以上为II型糖尿病病人。从1993年的有关资料统计分析，当年直接用于糖尿病的治疗费用高达22.16亿元，而且这一费用尚不包括糖尿病所致并发症的治疗费用、医院外的治疗和保健开支以及间接的社会经济损失。
目前控制II型糖尿病的方法有节制饮食、注意锻炼、以及用药物来调节血糖浓度。最常用的药物包括胰岛素、磺酰脲类、双胍类以及格列酮类的化合物。这些药物强调促使体内血糖趋于正常，无法更正由糖尿病而引起的并发症，尤其是对肾脏、心血管***、视觉及神经***产生的损伤。这些并发症与糖尿病所致死亡率的增加有直接关系。第一代治疗糖尿病的药物的主要副作用包括低血糖、体重增加以及水肿。这些药物其作用机理可能有所不同，但是没有一个机理有保护具有分泌胰岛素功能的β-细胞的作用，从而没有可能维持体内正常的血糖代谢和内分泌调节。在许多情况下，使用单一药物会慢慢失去作用，迫使采用复方治疗方法，往往病人同时还使用降血压、降胆固醇药，所以这样的方案的长期效果不一。因此，研究开发控制血糖新药，协同目前现在的药物，强调保护及修复β-细胞的功能，调节内分泌***对食物摄入的反应，将会对治疗糖尿病有革命性的推进。
针对胰高血糖素类似肽-1(GLP-1)受体的激动剂方面的研究前景可观，这一领域的研究和开发有可能掀开治疗II型糖尿病领域的新篇章。胰高血糖素类似肽-1发现于1984年，它是一种肠内分泌激素。如果给予II型糖尿病人输入此激素，其血糖浓度可调节至正常水平(Nathan，DM，等人.DiabetesCare1992；15：270-6；Zander，M，等人.Lancet2002；359∶824-30)。研究表明，胰高血糖素类似肽及其受体激动剂的作用主要是激活胰腺β-细胞表面的胰高血糖素类似物-1受体而分泌胰岛素所致。因为这种效应是由体内本身血糖浓度的高低来决定的，所以这样就不会产生会象传统药物一样，即使在胰高血糖素类似肽-1及其受体激动剂存在的情况下也导致严重低血糖而造成具有生命危险的低血糖休克。具体地说，当体内血糖浓度高于6mmol/L时，胰高血糖素类似肽-1能具有显著的促进胰岛素分泌的作用，当体内血糖趋于正常的水平时，则不再继续作用。另外，这类激动剂还具有刺激啮齿动物(大鼠)胰岛β-细胞的生长，增加β-细胞组织的作用。这种修复胰岛β-细胞的功能为治愈II型糖尿病提供了前景，至少可以推迟从II型发展成I型的时间。再者，胰高血糖素类似肽-1及其受体激动剂同时能抑制胰高血糖素的分泌从而减少肝脏血糖输出的可能。更有意义的是，这类激动剂能有效地抑制胃肠道能动性及胃排空从而导致减少食物的摄入，使体重减少。这样能帮助控制好II型糖尿病人的体重。
CN1976948A公开了一类长效的用聚乙二醇(PEG)修饰的促胰岛素分泌肽化合物及其可药用盐，它们具有激活胰高血糖素类似肽-1(GLP-1)受体而促进胰岛素分泌、降低血糖的作用，因此可以有效治疗或预防II型糖尿病。该专利申请给出了一系列的GLP-1受体激动剂的序列，该专利申请中也给出了可通过对序列进行聚乙二醇修饰。目前修饰用的PEG有多种结构，例如两分枝型、四分枝型等等，分枝型PEG的接头也有多种，比如甘油接头、赖氨酸接头等等。对于每一种具体结构的生物肽，哪种PEG修饰方式最佳并不固定。通过对各种不同的方式进行研究后，发明人意外发现对于本发明的具体序列而言，一种特定的修饰方式产生了令人意外的良好效果。
发明内容
本发明的目的在于提供分枝型PEG修饰的式(I)所示GLP-1类似物及其可药用盐：
HdAEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAPPPC-NH2
(I)
其中，所述分枝型PEG选自两分枝型或者四分枝型；所述分枝型PEG的分子量为20～60KD；所述分枝型PEG的接头选自甘油或者赖氨酸。
从本发明实验例一中各受试物激动GLP-1受体EC50(mM)可以看出，随着PEG分子量的增加(从PEX-167的20KD到PEX-168的40KD)和PEG分枝数目增加(从PEX-165的直链到PEX-167的两分枝，再到PEX-166的四分枝)，所修饰多肽的体外活性明显下降。尽管体内活性随PEG分子量和PEG分枝状态的变化未必与体外活性的变化一致，然而体外活性的保持是体内活性优良的必要条件。同时，关于本发明所提供化合物的体内活性(降糖作用)，从本发明实验例二的表2可以看出，直链型PEG修饰所产生的长效作用弱于支链型PEG的修饰效果，而同为两分枝的PEG修饰，分子量越大，体内活性表现越长，即大分子量、分枝型PEG修饰所产生的长效效果明显。综上，两分枝的PEG在修饰本发明肽链上具有突出优势。所以，本发明所述分枝型PEG优选两分枝型；所述分枝型PEG分子量优选40KD或60KD。
从实验例三的表3可以看出，PEX-168对体重的抑制作用弱于PEX-170，这说明赖氨酸(Lys)接头的PEG的修饰效果优于甘油接头的PEG的修饰效果。所以，本发明所述的分枝型PEG的接头优选赖氨酸(Lys)。
更优选地，所述分枝型PEG为mPEG2-Lys-MAL(40kD)。
更优选地，所述分枝型PEG修饰的GLP-1类似物的结构如式(II)所示。
本发明的另一目的在于提供所述分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐的制备方法，其中包括合成、纯化和干燥方法，所述合成方法优选固相或液相合成，所述纯化方法优选反相高效液相、离子交换或凝胶过滤纯化方法，所述干燥优选冷冻干燥。
本发明的另一目的在于提供所述分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐在治疗和/或预防II型糖尿病方面的应用。
在CN1976948A的基础上，本发明对修饰用PEG进行了优化设计和广泛筛选，获得了更加长效且活性更好的GLP-1类似物，且本发明所提供的化合物的制备工艺简单、成本低，较适合于工业化生产。
附图说明
图1：SEQIDNO.95的HPLC图谱及分析条件。
图2：SEQIDNO.95的ESI/MS质谱。
图3：PEX-168的Maldi-TOF图谱。
图4：单次给药对db/db小鼠每日空腹血糖的影响
具体实施方式
为了更具体地说明本发明，特提供下述具体实施方式，但本发明的范围并不限定于此。本部分所涉及具体化合物的基本情况见具体化合物列表。
具体化合物列表
实施例1：GLP-1类似物SEQIDNO.95的合成
SEQIDNO.95的序列如式(I)所示：HdAEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAPPPC-NH2
(I)
根据结构特点，可采用已经比较成熟的固相合成技术进行合成。
1.1合成所用的氨基酸衍生物
Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH。
以上氨基酸衍生物均购自吉尔生化。
1.2树脂和其它试剂
树脂：RinkAmide-AM树脂(吉尔生化)。
其它试剂：N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)，羟基苯并三氮唑(HOBT)，二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，三氟醋酸(TFA)，Tis，哌啶(PIP)，丙烯腈(ACN)。
1.3合成过程
以RinkAmide-AM树脂(0.7mmol/g)20g为固相载体，Fmoc-AA-OH(5倍过量，70mmol)为原料，DIC(5倍过量，70mmol)、HOBT(5倍过量，70mmol)为缩合剂，按照SEQIDNO.95的序列从C端依次往N端合成，每步氨基酸缩合时间约2-4小时，Fmoc保护基的脱除试剂为20％哌啶/DMF，缩合及脱Fmoc终点检测采用茚三酮检测法(KaiserTest)。
缩合完毕，得到树脂肽。干燥后，以TFA/Tis/H2O(95∶2.5∶2.5)为裂解试剂裂解树脂肽，室温反应约3小时，滤除树脂，将裂解液于***中沉降冲析，产生白色沉淀物，过滤收集沉淀，干燥后得粗品52.0g。
将得到的粗品用纯化水溶解，反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体11.2g，即为产品。
ESI-MS测得所得化合物分子量为4212(理论值：4211.7)。
实施例2：马来酰亚胺基活性聚乙二醇的合成
本实施例为直链型、分枝型马来酰亚胺基活性聚乙二醇的合成，其中主要原料mPEG-OH(5kD)、mPEG-OH(10kD)、mPEG-OH(20kD)、mPEG-OH(30kD)均购自韩国sunbio公司，其余试剂如乙二胺、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、Lys、甲苯、二氯甲烷等均为常用试剂。
2.1mPEG-MAL(20kD)的合成
将20g(1mmol)mPEG-OH(20kD)投入到200ml的单口瓶中，加入100ml甲苯，回流分水；然后蒸出甲苯，冷却至室温，再加入100mlDCM，随后加入1.18g(4mmol)的三光气(triphosgene)，室温密闭搅拌反应过夜；次日将反应液于通风厨中冲析入200ml的无水***中，过滤后真空干燥得白色固体15g。将15g该白色固体投入到200ml的单口瓶中，加入100ml甲苯/DCM(2∶1)的溶液，再加入0.25g的HOSu，随后加入0.3g三乙胺，室温密闭搅拌反应过夜；反应结束后，将反应液过滤，滤液直接冲析入100ml的无水***中，过滤，真空干燥得白色固体14g，即为SC-mPEG(20kD)。
将1.4g无水乙二胺用50mlDCM于200ml反应瓶中溶解，再取14gSC-mPEG(20kD)溶解于100ml的DCM溶解后加入到上述乙二胺溶液中，反应过夜；次日停止反应过滤，滤液加入500ml的饱和食盐水洗涤，水层用DCM提取三次(200ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***中沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体13g，即为mPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)。
将13gmPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)和0.8gMAL-ONP用100mlDCM溶解，再加入0.3g的三乙胺，室温搅拌反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩至干，再加入100ml乙酸乙酯加热溶解，放置析出固体，过滤，真空干燥得白色固体12g，即为mPEG-MAL(20kD)。
MALDI-TOF-MS测得产物分子量为20522.5(理论值：20000±2000)。
2.2mPEG4-Lys-MAL(20kD)的合成
将1.73g(5mmol)BOC-Lys(BOC)-OH溶于200ml的DCM和DMF的混合溶液中，冰浴冷却到0℃左右，加入0.69g(6mmol)HOSu后，再滴加0.76g(6mmol)DIC的DCM溶液，滴加完毕后维持0℃反应6h后撤去冰浴，室温反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩，于无水***和正己烷中析晶，过滤，真空干燥得白色固体2g，即为BOC-Lys(BOC)-OSu(中间体1)，收率87％。
将270mg(1.5mmol)的赖氨酸盐酸盐(Lysine.HCL)用1mol/L的NaOH溶液调PH值至8.0溶解后，将1.84g(4mmol)的BOC-Lys(BOC)-OSu的DCM和DMF的混合溶液加入上述溶液中，维持pH在8.0，反应4个小时后用草酸调节pH为3，用饱和食盐水洗涤至中性，再用DCM提取完全，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用无水***和正己烷析晶得白色固体1g，即为中间体2，收率83％。
将1g的中间体2用20ml的DCM溶解后，加入5ml的三氟乙酸，常温搅拌30min后，浓缩至干，即为中间体3。
将360mg(0.9mmol)中间体3用100ml的0.2M的硼酸缓冲液调PH8.0溶解后，加入20g(4mmol)的SC-mPEG(5kD)(SC-mPEG(5kD)的合成参照2.1)，维持pH在8.0，搅拌反应过夜；反应结束后用600ml纯化水稀释并用草酸调节pH为3，用DCM提取完全，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，与无水***中沉降析出固体，过滤收集后真空干燥得白色固体17.6g，即为中间体4粗品，粗品用强碱性阴离子交换剂QAE-SephadexA-50纯化，除去5kD、10kD、15kD组分，合并20kD组分，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体12g，即为中间体4纯品。
将8g(0.4mmol)中间体4溶于150ml的DCM中，加入0.6g的HOSu和0.65g的DIC，室温反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体7.5g，即为mPEG4-Lys-NHS(20kD)；收率90％。
将7.5g(0.38mmol)的mPEG4-Lys-NHS(20kD)溶解于80ml的DCM，然后搅拌下用滴液漏斗滴加0.9g溶解于40mlDCM的无水乙二胺至上述溶液中，滴加完毕密闭反应过夜；次日将反应液过滤，滤液加入100ml的饱和食盐水洗涤，水层用DCM提取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体7g，即为mPEG4-Lys-NH(CH2)2NH2(20kD)，收率93％。
将7g(0.7mmol)mPEG4-Lys-NH(CH2)2NH2(20kD)和0.4gMAL-ONP用100mlDCM溶解，再加入0.15g的三乙胺，室温搅拌反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩至干，再加入100ml乙酸乙酯加热溶解，放置析出固体，过滤，真空干燥得白色固体6g，即为mPEG4-Lys-MAL(20kD)，收率86％。
MALDI-TOF-MS测得产物分子量为21021.7(理论值：20000±2000)。
2.3mPEG2-Lys-MAL(20kD)的合成
SC-mPEG(10kD)的合成参照2.1中SC-mPEG(20kD)的合成步骤。
将90mg(0.5mmol)赖氨酸盐酸盐(Lysine.HCL)用100ml的0.2M硼酸缓冲液调PH值至8.0溶解后，加入12g(1.2mmol)的mPEG-OSu(10kD)，维持pH在8.0，搅拌反应过夜；反应结束后用草酸调节pH为3，再加入氯化钠至饱和，用DCM提取完全，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，与无水***中沉降析出固体，过滤收集后真空干燥得白色固体11.5g，即为中间体mPEG2-Lys-OH(20kD)粗品，粗品用强碱性阴离子交换剂QAE-SephadexA-50纯化，除去10kD组分，合并20kD组分，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体9.3g，即为mPEG2-Lys-OH(20kD)纯品，收率93％。
将8g(0.4mmol)mPEG2-Lys-OH(20kD)溶于150ml的DCM中，加入0.6g的HOSu和0.65g的DIC，室温反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体7.7g，即为mPEG2-Lys-NHS(20kD)；收率96％。
将7.7g(0.38mmol)的mPEG4-Lys-NHS(20kD)溶解于80ml的DCM，然后搅拌下用滴液漏斗滴加0.9g溶解于40mlDCM的无水乙二胺至上述溶液中，滴加完毕密闭反应过夜；次日将反应液过滤，滤液加入100ml的饱和食盐水洗涤，水层用DCM提取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体7.0g，即为mPEG2-Lys-NH(CH2)2NH2(20kD)，收率93％。
将7.0g(0.7mmol)mPEG2-Lys-NH(CH2)2NH2(20kD)和0.4gMAL-ONP用100mlDCM溶解，再加入0.15g的三乙胺，室温搅拌反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩至干，再加入100ml乙酸乙酯加热溶解，放置析出固体，过滤，真空干燥得白色固体6.4g，即为mPEG2-Lys-MAL(20kD)，收率91％。
MALDI-TOF-MS测得产物分子量为20815.2(理论值：20000±2000)。
2.4mPEG2-Lys-MAL(40kD)的合成
SC-mPEG(20kD)的合成参照2.1中SC-mPEG(20kD)的合成步骤。
将60mg的赖氨酸盐酸盐(Lysine.HCl)用160ml的0.1M硼酸缓冲液，pH8.0溶解后，加入21.6g的SC-mPEG(20kD)，维持pH为8.0，室温搅拌反应24小时；反应结束后，用600ml纯化水稀释并用草酸调节pH为3，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤收集，真空干燥得白色固体19g，即为mPEG2-Lys-OH(40kD)粗品；粗品用强碱性阴离子交换剂QAE-SephadexA-50纯化，除去20kD组分，合并40kD组分，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体11g，即为mPEG2-Lys-COOH(40kD)纯品。
将10gmPEG2-Lys-OH(40kD)溶于200ml的DCM中，加入0.3gHOSu和0.3gDIC，室温反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体10g，即为mPEG2-Lys-NHS(40kD)。
将mPEG2-Lys-NHS(40kD)10g溶解于100ml的DCM，然后搅拌下用滴液漏斗滴加入0.6g无水乙二胺用50mlDCM溶解的溶液中，滴加完毕密闭反应过夜；次日将反应液过滤，滤液加入200ml的饱和食盐水洗涤，水层用DCM提取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体10g，即为mPEG2-NH(CH2)2NH2(40kD)。
将10gmPEG2-NH(CH2)2NH2(40kD)和0.3gMAL-ONP用100mlDCM溶解，再加入0.1g的三乙胺，室温搅拌反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩至干，再加入100ml乙酸乙酯加热溶解，放置析出固体，过滤，真空干燥得白色固体9g，即为mPEG2-Lys-MAL(40kD)。
MALDI-TOF-MS测得产物分子量为41135.8(理论值：40000±4000)。
2.5mPEG2-Lys-MAL(60kD)的合成
SC-mPEG(30kD)的合成参照2.1中SC-mPEG(20kD)的合成步骤。
将40mg的赖氨酸盐酸盐(Lysine.HCl)用160ml的0.1M硼酸缓冲液，pH8.0溶解后，加入21.6g的SC-mPEG(30kD)，维持pH为8.0，室温搅拌反应24小时；反应结束后，用600ml纯化水稀释并用草酸调节pH为3，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤收集，真空干燥得白色固体19g，即为mPEG2-Lys-OH(60kD)粗品；粗品用强碱性阴离子交换剂QAE-SephadexA-50纯化，除去30kD组分，合并60kD组分，用DCM提取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体10g，即为mPEG2-Lys-OH(60kD)纯品。
将10gmPEG2-Lys-COOH(60kD)溶于200ml的DCM中，加入0.2gHOSu和0.2gDIC，室温反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体10g，即为mPEG2-Lys-NHS(60kD)。
将mPEG2-Lys-NHS(60kD)10g溶解于100ml的DCM，然后搅拌下用滴液漏斗滴加入0.4g无水乙二胺用50mlDCM溶解的溶液中，滴加完毕密闭反应过夜；次日将反应液过滤，滤液加入200ml的饱和食盐水洗涤，水层用DCM提取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，于无水***沉降析出固体，过滤，真空干燥得白色固体10g，即为mPEG2-NH(CH2)2NH2(60kD)。
将10gmPEG2-NH(CH2)2NH2(60kD)和0.2gMAL-ONP用100mlDCM溶解，再加入0.07g的三乙胺，室温搅拌反应过夜；然后将反应液过滤，滤液减压浓缩至干，再加入100ml乙酸乙酯加热溶解，放置析出固体，过滤，真空干燥得白色固体9g，即为mPEG2-Lys-MAL(60kD)。
MALDI-TOF-MS测得产物分子量为62604.8(理论值：60000±6000)。
实施例3：聚乙二醇化GLP-1类似物SEQIDNO.95的合成
分别用实施例2制得的活性聚乙二醇mPEG-MAL(20kD)、mPEG4-Lys-MAL(20kD)、mPEG2-Lys-MAL(20kD)、mPEG2-Lys-MAL(40kD)、mPEG2-Lys-MAL(60kD)以及从美国NEKTAR公司购买的mPEG2-glycerol-MAL(40kD)(货号：2D3Y0T01)，与GLP-1类似物SEQIDNO.95反应，通过迈克尔加成反应后形成硫醚键使多肽和聚乙二醇共价结合，从而得到聚乙二醇化GLP-1类似物SEQIDNO.95。
mPEG2-glycerol-MAL(40kD)的结构
3.1PEX-165的制备
称取5.0gmPEG-MAL(20kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体2.5g，即为PEX-165。
MALDI-TOF-MS测得PEX-165分子量为24663.5(理论值：24211±2000)。
3.2PEX-166的制备
称取5.0gmPEG4-Lys-MAL(20kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体2.5g，即为PEX-166。
MALDI-TOF-MS测得PEX-166分子量为25640.8(理论值：24211±2000)。
3.3PEX-167的制备
称取5.0gmPEG2-Lys-MAL(20kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体2.2g，即为PEX-167。
MALDI-TOF-MS测得PEX-167分子量为24988.0(理论值：24211±2000)。
3.4PEX-168的制备
称取10.0gmPEG2-Lys-MAL(40kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体4.5g，即为PEX-168。
MALDI-TOF-MS测得PEX-168分子量为44884.4(理论值：44211±4000)。
3.5PEX-169的制备
称取15.0gmPEG2-Lys-MAL(60kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体6.2g，即为PEX-169。
MALDI-TOF-MS测得PEX-169分子量为67630.6(理论值：64211±6000)。
3.6PEX-170的制备
称取10.0gmPEG2-glycerol-MAL(40kD)和1.26g的GLP-1类似物SEQIDNO.95(1.2倍过量)，加入300ml0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.7)，室温搅拌反应2小时。
反应液使用反相HPLC制备柱(Luna，C18)分离纯化，冻干得白色固体4.5g，即为PEX-170。
MALDI-TOF-MS测得PEX-170分子量为44506.9(理论值：44211±4000)。
实验例一：胰高血糖素样肽-1受体激动活性测定
1.受试药物及阳性对照药物
1.1受试药物：PEX-165、PEX-166、PEX-167、PEX-168、PEX-170。
贮存方法：避光，-20℃密闭保存。
配制方法：分别称取一定量的上述化合物，用二甲亚砜(DMSO)稀释为100μg/ml的母液，然后用DMSO进行10倍梯度稀释，终浓度分别为1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、10-1ng/ml、10-2ng/ml和10-3ng/ml。
剂量组别：所有受试药物均设7个浓度，每个浓度设3个复孔。
1.2阳性对照药物：SEQIDNO.95。
贮存方法：避光，-20℃密闭保存。
配制方法：称取一定量的SEQIDNO.95，用二甲亚砜(DMSO)将化合物稀释为10nM阳性对照药物浓度。
2.试剂与仪器
2.1主要试剂
DMEM培养基(GIBCO，CatNo12800017)
二甲亚砜(Genebase，ProdNo：0231)
荧光素酶活性检测试剂盒(Promega，ProdNo：E2550)
2.2主要仪器
Envision2101多功能微孔板酶标仪(PerkinElmer)
3.实验原理和方法
3.1实验原理
由大肠产生的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likePeptide-1，GLP-1)，通过与胰岛β细胞的GLP-1受体(GLP-1Receptor，GLP-1R)高度特异性地结合，激活腺苷酸环化酶而合成cAMP，并进一步激活蛋白激酶。代谢信号(糖代谢)和激酶信号(GLP-1结合)在细胞膜水平协同作用，最终导致Ca2+通道开放，Ca2+内流，从而刺激胰岛素分泌，同时抑制胰高血糖素的产生，使餐后血糖降低以维持恒定水平。
根据GLP-1R信号转导通路，建立了稳定表达GLP-1R和由cAMP驱动的荧光素酶报告基因的HEK293细胞系，用于GLP-1R激动剂的筛选。当GLP-1R与激动剂结合，细胞内cAMP浓度升高，由cAMP驱动的荧光素酶报告基因的表达就会上调。通过对荧光素酶活性的检测即可判断化合物激动GLP-1R活性的能力。
3.2实验步骤
(i)将稳定表达GLP-1R和荧光素酶报告基因的HEK293细胞以50000个/孔的细胞量，100μl/孔接种于96孔培养板内，在10％FBS高糖DMEM，37℃、5％CO2条件下培养24小时。
(ii)将待筛化合物按要求浓度以DMSO稀释，然后以1μl/孔加入上述96孔微量培养板，轻微振荡摇匀。培养板的1和12两列做阳性对照。在37℃、5％CO2条件下培养5小时。
(iii)每孔吸去50μl培养基，加入50μl荧光素酶活性检测试剂，振荡10分钟。
(iv)每孔吸取80μl上述混合物，转移到96孔板，在Envision2101多功能微孔板酶标仪检测化学发光计数值。
(v)数据处理。
4.数据处理和统计分析
以SEQIDNO.95为阳性化合物，通过以下公式计算得到各样品各浓度条件下的激活率(％Response)。
% Response = L Sample - LBlank L SEQ NO . 95 - LBlank × 100 %
Lsample表示样品刺激后的检测信号值，LBlank表示空白，即DMSO孔的检测信号值，LSEQNO.95表示10nM阳性对照样SEQIDNO.95刺激后的检测信号值。
EC50值是通过％Response对样品浓度的对数值X用下面公式进行非线性拟合计算得到，Top为响应高值，Bottom为响应低值。
% Response = Bottom + Top - Bottom 1 + 10 ( LogE C 50 - X )
5.试验结果
结果如表1所示。
表1各受试物激动GLP-1受体EC50
结论：上述化合物在体外均具有GLP-1受体激动活性，其中，活性由强到弱的顺序为PEX-165，PEX-167，PEX-168，PEX-170，PEX-166，这表明，Lys接头的两分枝型PEG较适合于本发明的具体序列SEQIDNO.95。
实验例二：单次给药对2型糖尿病db/db小鼠每日空腹血糖的影响
1.受试药物：PEX-165、PEX-166、PEX-167、PEX-168、PEX-169。
贮存方法：避光，-20℃密闭保存。
配制方法：分别称取不同量的上述化合物，用PEX专用溶剂完全溶解并稀释，配成200μg/ml的PEX-165、PEX-166、PEX-167无色透明溶液，400μg/ml的PEX-168无色透明溶液和600μg/mlPEX-169无色透明溶液(上述溶液摩尔浓度相等)。
剂量组别：空白对照组：PEX专用溶剂；PEX-165、PEX-166、PEX-167组(200μg/ml)；PEX-168组(400μg/ml)；PEX-169组(600μg/ml)。
给药途径和容积：单次皮下注射给药，给药容积为10ml/kg。
2.试剂与仪器
2.1主要试剂
PEX-168专用溶剂：江苏豪森药业股份有限公司，批号：20100719。
氯化钠注射液：上海华源长富药业有限公司，批号：10060201。
2.2主要仪器
强生稳捷基础倍加血糖监测仪ONETOUCHTMBASICTMPlus。
3.试验方法
3.1II型糖尿病db/db小鼠的筛选、分组和给药
80只db/db小鼠(雄性40只、雌性40只)，4-5周龄时购入动物房，单笼饲养，喂以高脂饲料，至7-8周龄时开始实验。小鼠于给药前1天上午8：30禁食(不禁水)，6小时后测定空腹血糖。选取60只db/db小鼠，其空腹血糖介于10.2-24.7mmol/L之间，根据小鼠空腹血糖将该60只小鼠分为6组，每组10只(5雄5雌)，分别为空白对照组和5个PEX化合物给药组。
从给药次日起至给药后5天(120小时)，各组小鼠均于每天上午8∶30禁食，6h后测定空腹血糖。
3.2观察指标
空腹血糖：定期测定各组小鼠空腹血糖。
4.数据处理和统计分析
数据以均值±标准差表示，采用Student-ttest对数据进行统计学分析。
5.试验结果
结果见图4和表2。
db/db小鼠单次皮下注射不同PEX受试物后第2天，PEX-165组小鼠空腹血糖与空白对照组无显著差别(P＞0.05)，其余各组小鼠空腹血糖明显低于对照组(P＜0.01，P＜0.001)。给药后第3天，PEX-166、PEX-167组小鼠空腹血糖与空白对照组无显著差别(P＞0.05)。给药后第4天，PEX-169组小鼠空腹血糖仍显著低于空白对照组(P＜0.05)。至给药后第5天，各PEX给药组小鼠空腹血糖与空白对照组相比均无显著差别(P＞0.05)。
因此，PEX化合物单次皮下注射后可明显降低db/db小鼠的空腹血糖，该作用维持的时间与化合物结构相关。PEX-165单次皮下注射后的降空腹血糖作用可持续到给药后1-2天，PEX-166、PEX-167可持续到给药后2-3天，PEX-168可持续到给药后3-4天，而PEX-169的降空腹血糖作用则可维持到给药后4-5天。
结论：上述五个受试物(等摩尔浓度)单剂量给药后，PEX-166比PEX-165长效，PEX-168比PEX-167长效，PEX-169比PEX-168长效。这表明，对本发明的具体序列而言，从修饰的长效效果来看，分枝型PEG更适合本发明的序列，大分子量的PEG更适合本发明的序列。
实验例三：皮下注射对小鼠的急性毒性试验
1.受试药物：PEX166、PEX168、PEX169、PEX170。
贮存方法：避光，-20℃密闭保存。
配制方法：分别称取不同量的上述化合物，用PEX专用溶剂完全溶解并稀释，配成50mg/ml的PEX166无色透明溶液，100mg/ml的PEX168、PEX170无色透明溶液和150mg/mlPEX169无色透明溶液(上述溶液摩尔浓度相等)。
给药途径和容积：单次皮下注射给药，给药容积均为25ml/kg。
2.试验方法
每一受试化合物组中的昆明小鼠(SPF级)为雌雄各10只，观察给药后14天内小鼠的中毒和死亡情况。毒性反应重点观察症状、程度，毒性反应起始时间、持续时间及恢复时间等。于动物入室、d0(给药前)、d1～d14每天称重。
3.试验结果
给药期间、给药后并直到观察期结束，小鼠无一死亡，均活动自如，毛色、粪便及其它情况也未见明显异常。
体重：结果见表3。
PEX166给药后24h～96h(d1～d4)，雌雄小鼠体重均明显降低，d4时达到最低点，之后较快恢复，至d7时恢复至给药前的体重水平。
PEX168给药后24h～48h(d1～d2)，雌雄小鼠体重均明显降低，d2时达到最低点，之后较快恢复，至d5时恢复至给药前的体重水平。
PEX169给药后24h～120h(d1～d5)，雌雄小鼠体重均明显降低，d5时达到最低点，之后逐渐恢复，至d10时恢复至给药前的体重水平。
PEX170给药后24h～72h(d1～d3)，雌雄小鼠体重均明显降低，d3时达到最低点，之后逐渐恢复，至d9时恢复至给药前的体重水平。
剖检：第14天小鼠处死后经剖检肉眼观察未见异常。
结论：单次皮下注射PEX166～PEX170(等摩尔量)对小鼠食量与体重有显著的抑制作用，这种抑制作用可随停药而渐渐恢复，其中PEX168的抑制作用弱于其它三个化合物。

Claims (9)

1.分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐，其中所述GLP-1类似物的结构如式(I)所示：
HdAEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAPPPC-NH2
(I)，
所述分枝型PEG为两分枝型，其中所述分枝型PEG的接头为Lys，且所述分枝型PEG修饰式(I)的半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐，其中所述分枝型PEG的分子量为20～80KD。
3.根据权利要求1所述的分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐，其中所述分枝型PEG的分子量为40KD和60KD。
4.根据权利要求1至3任一项所述的分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐，其结构如式(Ⅱ)所示：
5.一种制备权利要求1至4任一项所述的分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐的方法，其中包括合成、纯化和干燥方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成方法选自固相或液相方法。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述纯化方法选自反相高效液相、离子交换或凝胶过滤纯化方法。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述干燥方法为冷冻干燥。
9.根据权利要求1至4任意一项所述的分枝型PEG修饰的GLP-1类似物及其可药用盐在制备治疗和/或预防Ⅱ型糖尿病方面药物的应用。
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