WO2012116921A1 - Verfahren zur extraktion von 2,3-butandiol aus einer wässrigen mischung - Google Patents

Verfahren zur extraktion von 2,3-butandiol aus einer wässrigen mischung Download PDF

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WO2012116921A1
WO2012116921A1 PCT/EP2012/053076 EP2012053076W WO2012116921A1 WO 2012116921 A1 WO2012116921 A1 WO 2012116921A1 EP 2012053076 W EP2012053076 W EP 2012053076W WO 2012116921 A1 WO2012116921 A1 WO 2012116921A1
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WO
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butanediol
extraction
methyl acetate
fermentation
phase
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Application number
PCT/EP2012/053076
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Inventor
Rupert Pfaller
Christoph RÜDINGER
Original Assignee
Wacker Chemie Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
    • C07C29/74—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation
    • C07C29/76—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation by physical treatment
    • C07C29/86—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation by physical treatment by liquid-liquid treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the invention relates to a process for the extraction of 2,3- 5 butanediol from an aqueous mixture by means of methyl acetate
  • Examples of chemical raw materials (so-called chemical synthesis building blocks) from renewable raw materials are ethanol (C2 building block), glycerol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, lactic acid (C3 building blocks) or succinic acid, 1-sutanol, 2 Butanol, 1,4-butanediol or 2, 3-butanediol ⁇ C blocks).
  • ethanol C2 building block
  • glycerol 1,3-propanediol
  • 1,2-propanediol 1,2-propanediol
  • lactic acid C3 building blocks
  • succinic acid 1-sutanol
  • 2 Butanol 1,4-butanediol or 2, 3-butanediol ⁇ C blocks.
  • building blocks are the biogenic starting compounds from which further basic chemicals can be produced chemically.
  • the prerequisite for this is the cost-effective fermentative production of the respective synthesis building blocks from renewable raw materials.
  • Cost factors in the production of chemical synthesis units from renewable raw materials are on the one hand the availability of suitable cheaper renewable raw materials and on the other hand efficient microbial fermentation processes, which these
  • Butanediol The state of the art for fermentative 2,3-butanediol production is summarized in Celinska and
  • the object was achieved by a method in which a 2,3-butanediol-containing aqueous mixture is mixed with an organic extractant, wherein 2, 3-butanediol is removed from the aqueous mixture and transferred to the organic extractant, this mixture then separated into an aqueous and an organic phase and the 2,3-butanediol is separated from the organic phase, characterized in that the organic extractant is methyl acetate.
  • the 2, 3-butanediol-containing aqueous mixture is preferably a mixture having a 2,3-butanediol content (defined as g 2, 3-butanediol per 1 aqueous phase) greater than 10 g / l , preferably greater than 50 g / l, particularly preferably greater than 100 g / l and particularly preferably greater than 150 g / l.
  • a 2,3-butanediol content defined as g 2, 3-butanediol per 1 aqueous phase
  • the 2,3-butanediol-containing aqueous mixture contains the isomeric forms of the 2,3-butanediol ⁇ meso-2,3,3-butanediol, R, R-2,3-butanediol and S, 3-2,3-butanediol) either individually or as a mixture in any proportions. It may consist of one phase at room temperature (23 ° C), but may also consist of several phases, including liquid, solid and also gaseous phases.
  • the 2,3-butanediol-containing aqueous mixture is a fermenter broth.
  • a 2, 3-butanediol-containing fermenter broth is prepared by culturing, for example by fermentation, a 2,3-butanediol production strain.
  • a 2,3-butanediol production strain is defined as a microorganism capable of producing 2, 3-butanediol from any C source.
  • the microorganism may be a non-optimized wild-type strain or an optimized strain whose ability to Butanediol production was achieved or improved either by genetic engineering or by mutagenesis and selection or even by a combination of the two methods.
  • it is a microorganism strain selected from 2, 3-butanediol-producing bacteria, more preferably it is a microorganism strain of the genera Klebsiella, Raoultella or Bacillus and particularly preferably a strain of the species Klebsiella (Raoultella) terrigena and Klebsiella planticola.
  • a 2, 3-butanediol-containing fermenter broth contains as a solid phase usually the biomass formed.
  • the biomass is preferably defined as the residue of a fermentation batch which remains after its complete drying, eg at an elevated temperature of 80 ° C. ⁇ dry biomass ⁇ .
  • the dry biomass fraction of the fermenter broth is preferably more than 10 g / l, preferably more than 25 g / l, more preferably more than 50 g / l and especially preferably more than 100 g / l.
  • the fermenter broth may still contain all the constituents which are necessary for the secondary production of 2,3-butanediol.
  • salts of a fermentation medium including cations such as Na, K, NH 4 + , Mg, Ca, Fe, Co, Mn, Zn, Mo, or anions such as phosphate, sulfate, chloride, nitrate, carbonate.
  • complex components of the fermentation medium such as yeast extract, malt extract, CSD (corn steep liquor, in solid or liquid form), soybean extract, C ⁇ sources of fermentation such as glucose, fructose, sucrose, molasses, xylose, mannose, hydrolysates complex , high molecular weight C sources such as starch, lignocellulose or bagasse, or alternative C sources such as glycerine, CO or C0 2 .
  • the fermenter broth may contain ingredients which are produced during the course of the fermentation and which are experienced in their content and composition, depending on the particular production strain and on the fermentation.
  • ingredients which are produced during the course of the fermentation and which are experienced in their content and composition include, for example, by-products of metabolism such as acetate, ethanol, Lactate (lactic acid), acetoin, succinate (succinic acid), 1,2-propanediol, but also amino acids and products of secondary metabolism such as extracellular macromolecules such as polysaccharides, proteins or lipids and fatty acids.
  • the 2,3-butanediol-containing aqueous mixture may contain further phases, for example a liquid phase which is not miscible with methyl acetate, for example in situ Extraction of fermentation products or a different solid phase of the biomass consisting for example of organic or inorganic adsorbents.
  • adsorbents serve as precipitants for the easier removal of, for example, the biomass or the removal of interfering impurities.
  • the 2,3-butanediol-containing aqueous mixture is a single-phase mixture, i. an aqueous solution consisting preferably of a fermenter broth containing 2,3-butanediol, from which all solid constituents have been removed.
  • the methyl acetate extraction can be carried out continuously or batchwise (batch process).
  • the extraction is carried out by the aqueous phase and methyl acetate placed in a separatory funnel, mixed by shaking and isolated after phase separation (separation of the two phases due to their different density), the extracted 2, 3-butanediol methyl acetate phase.
  • The- This extraction process can be repeated, preferably in 10 extractions, more preferably 5 extractions, particularly preferably 3 extractions, until the 2,3-butanediol is quantitatively (up to 99% of the 2,3-butanediol present in the aqueous phase) extracted from the extracted aqueous phase.
  • a well-known also applicable on an industrial scale method of extraction is carried out in a conventional manner in stirred tanks, compared to the separating funnel as a change in addition to the larger scale, the mixing no longer shake, but by an agitator.
  • the volume of the stirred tank is dependent on the production scale and can be any size, preferably> 1 1, more preferably> 100 1, more preferably> 1,000 1 and particularly preferably> 10,000 1.
  • the mixing is preferably carried out in each case over a period of at least 1 minute to 10 hours, more preferably from 5 minutes to 5 hours, particularly preferably from 15 minutes to 1 hour.
  • the mixing is preferably carried out at a pH of the aqueous phase of 1 to 14, preferably from 2 to 10, more preferably from 3 to 9, particularly preferably from 4 to 8 and at a temperature which the distribution equilibrium in favor of the organic methyl acetate phase and to unfavorable the aqueous phase is optimized, preferably from -15 ° C to 50 ° C, more preferably from 0 ° C to 45 ° C, particularly preferably from 20 ° C to 40 ° C.
  • apparatuses known for technical use for extraction can be mixer-settler batteries (mixer-settler batteries) or extraction columns.
  • Suitable designs are known in the art, without limiting the claims are, for example, suitable Au guiding sieve tray columns, packed columns with non-agitated Guange & Instruments (extraction packages), columns with specially shaped trays such as valve trays or cascade floors. All columns can be operated pulsed or unpulsed and other forms of Energy inputs such as by agitators are also according to the invention.
  • phase separation apparatuses of the extraction technique well known to those skilled in the art wherein static settling tanks (with or without packing) or extraction with the aid of centrifugal forces (centrifugal extraction with separation of different dense phases in the acceleration field) are suitable inter alia.
  • Oleylalko ol is the methyl acetate as a solvent significantly inferior.
  • the invention also relates to the use of methyl acetate for the extraction of 2,3-butanediol from aqueous mixtures, preferably aqueous solutions.
  • Example 2 Under the conditions of the method described in Example 2 for determining the extraction efficiency of a given solvent more than 30%, preferably more than 40%, more preferably more than 50% and most preferably more than 60% of the 2, 3-butanediol extracted from the aqueous phase in the methyl acetate phase. This represents a significant improvement over the extraction of 2,3-butanediol with non-water-miscible solvents over the prior art.
  • the yield of the process according to the invention can be increased by repeated extraction with methyl acetate, preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 6 times and particularly preferably 1 to 3 times, or in a continuous process known per se Extraction eg methyl acetate is used as extractant according to the countercurrent principle of a 2, 3-butanediol-containing aqueous mixture.
  • the process according to the invention makes it possible to maximize yield by means of multiple or continuous extraction of the 2,3-butanediol-containing aqueous solution by means of methyl acetate as extractant, the 2,3-
  • each extraction step it is also possible, in each extraction step, to increase the volume of the solvent compared to the volume of the aqueous 2,3-butanediol solution to be extracted and thus to reduce the number of extraction steps required, wherein the increase in the volume of solvent compared to the volume of the aqueous 2,3-butanediol solution is preferred by a factor of 5, more preferably by a factor of 3, and especially preferred by a factor of 2.
  • additives may also be added to the aqueous solution of 2,3-butanediol.
  • Salts with a so-called salting-out effect e.g. Sulfate salts, phosphate salts, carbonate salts, nitrate salts or chloride salts.
  • additives are preferably added in amounts of 1% to 100%, particularly preferably 1% to 70% and particularly preferably 1% to 40%, based on their maximum solubility in water.
  • the additives may also be non-polar organic solvents which are miscible with methyl acetate but immiscible with the aqueous phase.
  • non-polar organic solvents such as n-pentane, n-hexane, n-heptane, cyclopentane, cyclohexane, as well as all isomers of pentane, hexane or heptane.
  • additives are added in amounts of 0.1% to 30%, preferably 0.5% to 20%, more preferably 1% to 10% and especially preferably 1.5% to 5%, based on the volume of methyl acetate used.
  • the 2, 3-butanediol-containing aqueous mixture is a fermenter broth obtained by fermentation of a 2,3-butanediol-producing strain
  • the extract can be used. Von tion of 2, 3-butanediol by methyl acetate without upstream process steps carried out directly from the fermenter broth or already done in situ during the fermentation. Before extraction from the fermenter broth, however, it is also possible to inactivate the microorganisms.
  • the inactivation of the microorganisms can be carried out chemically in a manner known per se (for example by treating the fermenter broth with peroxides, hydrogen peroxide or with bleach, solutions of the hypochlorous acid or its salts) or else thermally by treating the fermenter broth with steam, for example autoclaving at 121 ° C.
  • Preference is given to a process in which the extraction from the fermenter broth takes place without further pretreatment or after thermal inactivation.
  • the fermenter cells are separated from the fermenter broth prior to extraction.
  • the separation of the fermenter cells is carried out in a conventional manner by e.g. Sedimentation, centrifugation, filtration, precipitation, flocculation or else by a pre-extraction in a two-phase mixture (such as, for example, according to the prior art with ammonium sulfate and isopropanol, or
  • Ethanol particularly preferred is the separation of the fermenter cells by centrifugation, filtration or flocculation, particularly preferred is the separation of the fermenter cells by centrifugation or filtration.
  • the process according to the invention can be carried out batchwise or carried out in a continuous process.
  • the extraction in Batchve drive can be repeated as often as required until the 2, 3-butanediol is completely extracted from the aqueous phase.
  • Preference is given to one to six extractions in the batch process, more preferably one to three extractions and particularly preferably one extraction.
  • the process according to the invention can be supplemented by additional process steps, which are carried out either before or after the extraction with methyl acetate.
  • process steps are conventional methods such as centrifugation, sedimentation, sedimentation using flocculants, filtration, distillation, thin-film evaporation, extraction with a solvent other than methyl acetate, crystallization, chromatography, pervaporation, reverse osmosis, steam stripping , It is preferably centrifugation, filtration and distillation,
  • 2,3-butanediol By combining various work-up steps and including the extraction of 2, 3-butanediol from an aqueous solution with methyl acetate, 2,3-butanediol can be obtained in a yield (defined as the amount of 2,3-butanediol in percent relative to that contained in the aqueous solution Amount of 2,3-butanediol)> 60%, preferably> 70%, particularly preferably> 80% and particularly preferably> 90%, the chemical purity of the 2,3-BDL product being determined by the further use and up to> 99% can be.
  • a possible sequence of work-up steps involving the extraction according to the invention with methyl acetate for the production of 2,3-butanediol from fermentation batches is shown in examples 5, 6 and 7. Example described. It is known to the person skilled in the art that the number, sequence and type of work-up steps can be combined as desired, but always have the goal of isolating 2,3-butanediol from
  • the sequence of possible work-up steps described in the examples comprises the extraction according to the invention of a 2, 3-butanediol-containing fermenter broth with methyl acetate, wherein the fermenter broth can either be used directly or after prior separation of the biomass, e.g. by centrifugation or filtration, or a combination of both, and the 2,3-butanediol is subsequently extracted with methyl acetate.
  • the resulting methyl acetate extract is then preferably worked up by a two-stage distillation, preferably in a first step, the low-boiling methyl acetate (5th and 7th Example) is separated (this is preferably reused for the extraction of 2,3-butanediol from a fermenter broth) , preferably followed by a second distillation (fine distillation, 6th example), in which first a middle boiling fraction (acetoin, ethanol, water, acetic acid ⁇ and finally the higher boiling main fraction of 2, -butanediol is recovered.
  • a middle boiling fraction acetoin, ethanol, water, acetic acid ⁇
  • an inoculum of Klebsiella terrigena-pALSbl-tet (disclosed in DE 102011003394) in LBtet medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 g / ml tetracycline) was prepared by mixing 2 ⁇ 100 ml LBtet medium, each in a 1 1 Erlenmeyer flask, each with 0.25 ml of a glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet medium, treated with glycerol in a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C) were inoculated.
  • LBtet medium 10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 g / ml tetracycline
  • Cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density OD 60 o / ml of 0.5 - 2.5). 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium.
  • Prefermenters The fermentation was carried out in two Biostat ® C-DCü 3 fermenters of the company Sartorius BBI Systems GmbH, the fermentation medium was FM2tet. The fermentation took place in Baten mode.
  • FM2tet medium contained glucose 60 g / l; 10g / 1; Yeast Extract (Oxoid) 2.5 g / 1; Ammonium sulf t 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1;
  • the pH of the FM2tet medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / 1; CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / 1; ZnS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1 and Ma 2 Mo0 4 x 2 H 2 0 0.15 g / 1.
  • Main fermenter The fermentation was in a Biostat ® D 500 fermenter (working volume 330 1, boiler volume 500 1 ⁇ Sartorius BBI Systems GmbH carried out the fermentation medium was FM2tet The fermentation took place in the so-called fed-batch mode 180 1 were FM2tet 16.... The fermentation temperature was 30 ° C.
  • the pH of the fermentation was 6.0 and was kept constant with the correction agents 25% NH 4 OH or 6 NH 3 P0 4.
  • the aeration was carried out with compressed air at a relative to The initial volume constant flow of 1 vvm
  • the oxygen partial pressure p02 was adjusted to 50% saturation
  • the oxygen partial pressure was controlled by the stirring speed (stirrer speed 200-500 rpm)
  • Struktol J673 (20-25% v / v in
  • the glucose consumption was determined by off-line glucose measurement with a YSI glucose analyzer concentration of the fermentation mixtures was about 20 g / l (8-10 h after inoculation), the metered addition of a 60% w / w glucose feed solution was started.
  • the flow rate of the feed was chosen so that during the production phase a glucose concentration of 10 - 20 g / 1 could be maintained.
  • the fermenter was sampled periodically to analyze the following parameters:
  • the cell density OD600 as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm ⁇ BioRad photometer SmartSpec TM 3000). To determine the dry biomass, 1 ml of fermentation batch was centrifuged per measurement point in a triple determination, the cell pellet was washed with water and dried at 80 ° C. to constant weight. The content analysis for 2, 3-butanediol and other fermentation products in culture supernatants was carried out in a manner known per se by 1 H-NMR. For this purpose, an aliquot of the fermentation batch was taken from the fermentation and centrifuged (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) to obtain a culture supernatant.
  • the volume in the fermenter was 330.
  • the fermentation batch was drained from the fermenter and stored in aliquots at -20 ° C.
  • the content determination of the fermenter broth gave the following result:
  • a 2, 3-butanediol-containing fermenter broth was prepared and the content of 2,3-butanediol was determined as described in Example 1.
  • the content of 2,3-butanediol was 122.3 g / l.
  • 20 ml of the fermenter broth were extracted once with 20 ml each of methyl acetate, ethyl acetate, MTBE, 1-pentanol, methyl propionate and oleyl alcohol at 22 ° C. by mixing the mixtures for 15 min at 400 rpm on an orbital shaker (Schüttler KL-2 from Bühler) were. The batches were then centrifuged for phase separation (Eppendorf Megafuge, 5 min 3,000 rpm).
  • the upper, organic phase was in each case pipetted off, transferred into a 250 ml glass round bottom flask, the solvent was removed by distillation on a rotary evaporator and the content of 2,3-butanediol determined by NMR (see Example 1). From the approach with oleyl alcohol was due to the high boiling point of 330-360 ° C, the 2, 3-butanediol ⁇ boiling point 180 ° C) distilled off in a rotary evaporator and determines the content in the distillate. From the lower, aqueous phase, the content of 2,3-butanediol was determined directly by NMR. The 2, 3-butanediol yields are listed in Table 1.
  • the 2,3-butanediol concentration of the crude fraction was 323.3 g / l.
  • the 2,3-butanediol yield was 80.8. g, or 82.7% (based on the amount used of 97.8 g).
  • Example 2 60 l of the fermentation batch prepared by fermentation in Example 1 were successively centrifuged in 6 l aliquots for 30 min at 5,000 rpm (Sorvall Centrifuge Evolution RC from Thermo Scientific, equipped with a rotor F8S
  • Pressure limit was set to a maximum pressure of 3 bar.
  • the filtration rate averaged 0.4 1 / h. 40 liters of filtrate were recovered corresponding to a 2. 3-butanediol amount of 4.9 kg.
  • the 40 1 filtrate was extracted three times with 80 l of methyl acetate in a 200 l reaction vessel.
  • the extraction batch was at 1 h each

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Abstract

Verfahren zur Extraktion von 2,3-Butandiol aus einer 2,3-Butandiol-haltigen wässrigen Mischung, bei dem eine 2,3-Butandiol-haltige wässrige Mischung mit einem organischen Extraktionsmittel gemischt wird, und diese Mischung in eine wässrige und eine organische Phase getrennt wird und das 2,3-Butandiol aus der organischen Phase abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Extraktionsmittel Methylacetat ist.

Description

Verfahren zur Extraktion von 2 , 3-Butandiol aus einer wässrigen Mischung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von 2,3- 5 Butandiol aus einer wässrigen Mischung mittels Methylacetat
(Essigsäuremethylester, Methyle hanoat , CAS 79-20-9) als Extraktionsmittel .
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstelle) lungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
15 Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2- Baustein) , Glycerin, 1, 3-Propandiol, 1 , 2 -Propandiol , Milchsäure (C3 -Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Sutanol, 2-Butanol, 1,4- Butandiol oder auch 2, 3-Butandiol {C -Bausteine) . Diese chemi-
20 sehen Bausteine sind die biogenen Ausgangs erbindungen, aus denen auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fer- mentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen.
25
Kostenfaktoren bei der Produktion chemischer Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese
30 Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Daneben ist die Isolierung der fermentativ erzeugten Synthesebausteine aus den Fermentationsansätzen ein entscheidender Kostenfaktor. Da die biogen erzeugten Synthesebausteine oft eine gute Löslichkeit im wässrigen Fermentermedium haben,
35 ist ihre Isolierung meistens mit einem hohen apparativen, energetischen und chemischen Aufwand verbunden, was sich ungünstig auf die Wirtschaftlichkeit auswirkt. Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Bauste
Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusaramengefasst in Celinska und
Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725}.
Der Stand der Technik zur Aufarbeitung von 2 , 3 -Butandiol ist zusammengefasst in Xiu und Heng (Appl. Microbiol. Biotechnol (2008) 78: 917-926) sowie auch in Syu (Appl. Microbiol. Biotechnol (2001) 55: 10-18). 2 , 3 -Butandiol ist charakterisiert durch einen hohen Siedepunkt von 180 °C {bei Normdruck) und eine praktisch unbegrenzte Mischbarkeit mit Wasser. Daher sind z.B. einfache destillative und extraktive Methoden zur 2 , 3 -Butandiol Isolierung mit einem hohen chemischen und energetischen Aufwand verbunden. Entsprechend kommen Xiu und Zeng {Appl. Microbiol. Biotechnol (2008) 78: 917-926) zur Schlussfolgerung, dass die Isolierung von 2 , 3 -Butandiol aus wässrigen Mischungen wie z.B. aus Fermentationsansätzen eine technologische Herausforderung und wirtschaftliche Hürde darstellt auf dem Weg zur industriellen biotechnologischen Produktion von 2 , 3 -Butandiol .
Verschiedene Verfahren zur Anreicherung von 2 , 3 -Butandiol wurden beschrieben, darunter die apparativ aufwändigen Methoden der reversen Osmose und Pervaporation. Dabei wird Wasser aus den Ansätzen entfernt und eine Anreicherung des 2 , 3 -Butandiols im Fermentationsansatz erreicht. Mit dem 2 , 3 -Butandiol werden jedoch auch andere Bestandteile eines Fermentationsansatzes aufkonzentriert , was zusätzliche Verfahrensschritte zur Produktisolierung erfordert. Ein energetisch sehr aufwändiges Verfahren zur 2 , 3 -Butandiol Isolierung stellt das sog. Dampf -Stripping dar (Blom et al . , Industrial and Engineering Chemistry (1945) 37; 865-870), das sich im technischen Maßstab nicht durchsetzen konnte. Verschiedene Verfahren zur flüssig- flüssig Extraktion sind bekannt. Ghosh and Swaminathan (Chem. Biochem. Eng. Q. (2003) 17: 319-325} beschreiben ein extraktives Fermentationsverfahren in einem wässrigen PEG (Polyethylenglykol) /Dextran 2 -Phasensystem. Sun et al . (Biotechnol . Lett. (2009) 31: 371-376) beschreiben ein Extraktionsverfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Isopropanol. Li et al . (Process Biochemistry (2010) 45:
731-737) beschreiben ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Ethanol. Beide Verfahren setzen große Mengen an Ammoniumsulfat zu, was zu einer hohen Salzfracht sowohl im Extrakt als auch im Extraktionsrückstand führt, die in einem technischen Verfahren aufwändig zurückgewonnen werden muss. Ein in situ Extraktionsverfahren unter Verwendung von Oleylalkohol wird von Anvari und Khayati (J. Ind. Microbiol . Biotechnol. (2009) 36: 313-317) beschrieben, wobei der fermen- tative Butandioltiter mit 23 g/1 sehr niedrig war und nur 68 % des Produkts extrahiert wurden. Darüber hinaus stellt sich, in einem technischen Verfahren, die Wiedergewinnung des Extrakti- onsmittels aufgrund des hohen Siedepunkts von 330-360°C als energetisch sehr aufwändig dar.
Die in der Literatur zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol eingesetzten nicht-wassermischbaren Lösemittel, z.B. aus der Klasse der Alkohole und Ester, bedingen wegen der ungünstigen Lage des Verteilungsgleichgewichts einen hohen apparativen Aufwand und den Einsatz großer Mengen Lösemittel. Xiu und Zeng (Appl.
Microbiol. Biotechnol (2008} 78: 917-926) fassen den dazu verfügbaren Stand der Technik zusammen.
Die Bewertung des Standes der Technik in Xiu und Zeng (Appl . Microbiol. Biotechnol. (2008) 78: 917-926} sowie auch in Syu (Appl. Microbiol. Biotechnol (2001) 55: 10-18} ergab, dass die verfügbaren Methoden zum einen eine technische Herausforderung darstellen und andererseits aus wirtschaftlicher Sicht zu kos- tenaufwändig sind. Ein Problem bei der Isolierung von 2,3- Butandiol aus wässrigen Mischungen, speziell Fermenterbrühen, ist dessen hoher Siedepunkt von 180°C. Wegen des hohen Energieaufwandes zur Abtrennung des Wassers verbietet sich eine direk- te Destillation. Die aus wirtschaftlicher Sicht an sich bevorzugte flüssig- flüssig Extraktion bietet keine tragbare Lösung, da die Extraktion mit bekannten Lösemitteln wie Alkoholen oder Estern zu ineffizient erfolgt. Aufgabe der Erfindung war es ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt 2, 3-Butandiol kostengünstig und effizient aus einer 2 , 3 -Butandiol -haltigen wässrigen Mischung zu extrahieren, um dessen nachfolgende Aufarbeitung mittels an sich bekannter Verfahren zu verbessern.
Gelöst wurde die Aufgabe durch ein Verfahren, bei dem eine 2,3- Butandiol -haltige wässrige Mischung mit einem organischen Ex- traktionsmittel gemischt wird, wobei 2 , 3 -Butandiol der wässrigen Mischung entzogen und in das organische Extraktionsmittel überführt wird, diese Mischung dann in eine wässrige und eine organische Phase getrennt und das 2 , 3 -Butandiol aus der organischen Phase abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das organischen Extraktionsmittel Methylacetat ist.
Bei der 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Mischung handelt es sich vorzugsweise um eine Mischung, mit einem 2 , 3 -Butandiol - gehalt (definiert als g 2 , 3 -Butandiol je 1 wässrige Phase) grö- ßer als 10 g/1, bevorzugt größer 50 g/1, besonders bevorzugt größer 100 g/1 und insbesondere bevorzugt größer 150 g/1.
Die 2 , 3 -Butandiol -haltige wässrige Mischung enthält die isomeren Formen des 2 , 3 -Butandiols {Meso-2 , 3 -Butandiol, R,R-2,3- Butandiol und S, 3-2, 3-Butandiol) entweder einzeln oder als Gemisch in beliebigen Verhältnissen. Sie kann bei Raumtemperatur (23°C) aus einer Phase bestehen, kann aber auch aus mehreren Phasen, darunter flüssigen, festen und auch gasförmigen Phasen bestehen. Vorzugsweise handelt es sich bei der 2 , 3 -Butandiol - haltigen wässrigen Mischung um eine Fermenterbrühe .
Eine 2, 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe wird durch Kultivierung, z.B. durch Fermentation, eines 2 , 3 -Butandiol Produktions - Stammes hergestellt. Ein 2 , 3-Butandiol Produktionsstamm ist de- finiert als ein Mikroorganismus, der aus einer beliebigen C- Quelle 2 , 3-Butandiol herstellen kann. Bei dem Mikroorganismus kann es sich um einen nicht optimierten Wildtyp Stamm handeln oder aber um einen optimierten Stamm, dessen Fähigkeit zur 2,3- Butandiolproduktion entweder durch gentechnische Optimierung oder durch Mutagenese und Selektion oder aber auch durch eine Kombination der beiden Methoden erreicht bzw. verbessert wurde. Vorzugsweise handelt es sich um einen Mikroorganismenstamm aus- gewählt aus 2 , 3 -Butandiol produzierenden Bakterien, besonders bevorzugt handelt es sich um einen Mikroorganismenstamm der Gattungen Klebsiella, Raoultella oder Bacillus und insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terri- gena und Klebsiella planticola.
Eine 2 , 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe enthält als feste Phase in der Regel die gebildete Biomasse. Die Biomasse ist vorzugsweise definiert als der Rückstand eines Fermentationsansatzes, der nach dessen vollständiger Trocknung, z.B. bei er- höhter Temperatur von 80°C verbleibt {Biotrockenmasse} . Der Biotrockenmasseanteil der Fermenterbrühe beträgt bevorzugt mehr als 10 g/1, bevorzugt mehr als 25 g/1, besonders bevorzugt mehr als 50 g/1 und insbesondere bevorzugt mehr als 100 g/1. Die Fermenterbrühe kann noch alle Bestandteile, die zur fermen- tativen Herstellung von 2 , 3 -Butandiol erforderlich sind, enthalten. Dazu gehören z.B. alle Salze eines Fermentationsmediums, darunter Kationen wie Na, K, NH4 +, Mg, Ca, Fe, Co, Mn, Zn, Mo, bzw. Anionen wie Phosphat, Sulfat, Chlorid, Nitrat, Carbo- nat . Des weiteren können auch komplexe Bestandteile des Fermentationsmediums wie z.B. Hefeextrakt, Malzextrakt, CSD {Corn Steep Liquor, in fester oder flüssiger Form) , Sojaextrakt, C~ Quellen der Fermentation wie z.B. Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, Xylose, Mannose, Hydrolysate komplexer, hochmole- kularer C-Quellen wie z.B. Stärke, Lignozellulose oder Bagasse oder alternative C-Quellen wie Glycerin, CO oder C02 vorhanden sein.
Ferner kann die Fermenterbrühe Bestandteile, die im Verlauf der Fermentation entstehen und die in ihrem Gehalt und ihrer Zusammensetzung abhängig vom jeweiligen Produktionsstamm und vom Fermentations erfahren sind, enthalten. Dazu gehören beispielsweise Nebenprodukte des Stoffwechsels wie Acetat, Ethanol, Lactat (Milchsäure), Acetoin, Succinat (Bernsteinsäure) , 1,2- Propandiol, aber auch Aminosäuren und Produkte des Sekundärstoffwechsels wie z.B. extrazelluläre Makromoleküle wie Polysaccharide, Proteine oder auch Lipide und Fettsäuren.
Neben der für eine Fermentation typischen, durch die Biomasse gebildeten zweiten festen Phase ist es möglich, dass die 2,3- Butandiol-haltige wässrige Mischung noch weitere Phasen enthält, z.B. eine von Methylacetat verschiedene, mit Wasser nicht mischbare flüssige Phase zur z.B. in situ Extraktion von Fermentationsprodukten oder eine von der Biomasse verschiedene feste Phase bestehend z.B. aus organischen oder aber auch anorganischen Adsorbentien. Diese Adsorbentien dienen als Fällungs- mittel zur einfacheren Entfernung von z.B. der Biomasse oder zur Entfernung störender Verunreinigungen. Dazu gehören z.B. makromolekulare Polysaccharide, Polymere auf Polyacrylamidbasis (z.B. unter den Markennamen Prästol^ oder Zetag® erhältliche Flockungsmittel) Celite*, Bentonite, Kaolin, oder aber auch Aktivkohle .
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der 2 , 3 -Butandiol- haltigen wässrigen Mischung um eine einphasige Mischung, d.h. eine wässrige Lösung bestehend vorzugsweise aus einer Fermenterbrühe enthaltend 2 , 3 -Butandiol , aus der alle festen Bestand- teile entfernt wurden.
Vorzugsweise werden die 2 , 3~Butandiol-haltige wässrige Mischung und Methylacetat in einem Gewichtsverhältnis von 1:0,1 bis 1:5 zusammengegeben, besonders bevorzugt von 1:0,8 bis 1:3, insbe- sondere bevorzugt von 1:1 bis 1:2.
Die Methylacetat-Extraktion kann kontinuierlich oder absatzweise (Batch-Verfahren) erfolgen. In der einfachsten Form erfolgt die Extraktion, indem die wässrige Phase und Methylacetat in einen Scheidetrichter gegeben, durch schütteln durchmischt und nach erfolgter Phasentrennung (Entmischung der beiden Phasen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte) die das extrahierte 2 , 3 -Butandiol enthaltende Methylacetatphase isoliert wird. Die- ser Extraktionsvorgang kann beliebig, bevorzugt in 10 Extraktionen, besonders bevorzugt 5 Extraktionen, insbesondere bevorzugt 3 Extraktionen, wiederholt werden, bis das 2 , 3-Butandiol quantitativ (bis zu 99 % des in der wässrigen Phase enthaltenen 2 , 3 -Butandiols) aus der wässrigen Phase extrahiert ist.
Eine bekannte auch im technischen Maßstab einsetzbare Methode der Extraktion erfolgt in an sich bekannter Form in Rührkesseln, wobei gegenüber dem Scheidetrichter als Änderung neben dem größeren Maßstab die Durchmischung nicht mehr durch schütteln, sondern durch ein Rührwerk erfolgt. Das Volumen des Rührkessels ist abhängig vom Produktionsmaßstab und kann beliebig groß sein, bevorzugt > 1 1, besonders bevorzugt > 100 1, besonders bevorzugt > 1.000 1 und insbesondere bevorzugt > 10.000 1.
Die Vermischung erfolgt jeweils vorzugsweise über eine Zeitraum von mindestens 1 Minute bis 10 h, besonders bevorzugt von 5 Minuten bis 5 h, insbesondere bevorzugt von 15 Minuten bis 1 h. Das Vermischen erfolgt vorzugsweise bei einem pH der wässrigen Phase von 1 bis 14, bevorzugt von 2 bis 10, besonders bevorzugt von 3 bis 9, insbesondere bevorzugt von 4 bis 8 und bei einer Temperatur, welche das Verteilungsgleichgewicht zu Gunsten der organischen Methylacetatphase und zu Ungunsten der wässrigen Phase optimiert, bevorzugt von -15°C bis 50 °C, besonders bevorzugt von 0°C bis 45°C, insbesondere bevorzugt von 20°C bis 40°C.
Als für den technischen Einsatz bekannte Apparate für die Ex~ traktion kommen darüberhinaus Mischer-Abscheider-Batterien (Mi- xer-Settler-Batterien) oder Extraktionskolonnen in Frage. Geeignete Bauformen sind dem Fachmann bekannt, ohne die Ansprüche einzuschränken sind z.B. geeignete Au führungsformen Siebbodenkolonnen, Füllkörperkolonnen mit reglosen Füllkörperschüttun- gen, Kolonnen mit regelmäßigen, statischen Mischer-Einbauten (Extraktionspackungen) , Kolonnen mit speziell geformten Böden wie z.B. Ventilböden oder Kaskadenböden. Alle Kolonnen können gepulst oder ungepulst betrieben werden und andere Formen des Energieeintrages wie z.B. durch Rührwerke sind ebenfalls erfin- dungsgemäß .
Die Trennung von organischer und wässriger Phase wird erreicht durch dem Fachmann allgemein bekannte Phasentrennapparate der Extraktionsverfahrenstechnik wobei statische Absetzbehälter (mit oder ohne Packung) oder die Extraktion unter Zuhilfenahme von Zentrifugalkräften (Zentrifugalextraktion mit Trennung der unterschiedlich dichten Phasen im Beschleunigungsfeld} unter anderem geeignet sind.
Wie im Rahmen der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, überraschend gefunden wurde und wie exemplarisch in den Beispielen gezeigt, kann 2, 3-Butandiol aus wassrigen Mi- schungen mittels Methylacetat im Vergleich zu anderen nicht wassermischbaren Lösemitteln aus den Klassen der Alkohole, Ester und Ether mit deutlich erhöhter Effizienz extrahiert werden. Unter den Carbonsäureestern ist nur Methylacetat nicht {bzw. nur in geringem Umfang) in Wasser löslich und zugleich ein gutes Lösemittel für 2 , 3 -Butandiol . Die weniger polaren Vertreter der niederen Carbonsäureester, Ethylacetat, Methyl- propionat und Methylbutyrat sind nicht, bzw, nur in begrenztem Umfang zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus wassrigen Lösungen geeignet. Das war nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten. So wurden unter den Bedingungen des im 2. Beispiel beschriebenen Verfahrens zum Vergleich der Extraktionseffizienz verschiedener Lösemittel mit Methylacetat ca. 42 % des in der wässrigen Phase enthaltenen 2 , 3 -Butandiols extrahiert, dagegen mit Ethylacetat nur ca. 20 , mit MTBE ca. 5 %, mit 1-Pentanol ca. 25 %, mit Methylpropionat ca. 7 % und mit Oleylalkohol ca. 10 %. 1- Butanol war mit der Fermenterbrühe mischbar und es konnte keine Phasentrennung erzielt werden. Mit einem weiteren Methylester, Methylbutyrat, war die Extraktion von 2 , 3 -Butandiol kaum nachweisbar. Überraschend wurde gefunden, dass mit Oleylalkohol nur ca. 10 % des 2 , 3 -Butandiols extrahiert werden konnten. Unter den speziellen von Anvari und Khayati (J. Ind. Microbiol. Bio- technol. (2009) 36: 313-317) beschriebenen Bedingungen einer in situ Extraktion während der Fermentation war bei vergleichswei- se sehr niedrigen Produktionsraten von 2 , 3-Butandiol (23 g/1) eine Gesamtausbeute der Extraktion von 68 % berichtet worden. Unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung, bei der die Effi ienz von Lösemitteln bei der Extraktion von Fermentations- mischungen mit einem 2 , 3-Butandiol Gehalt deutlich über 100 g/1 verglichen wurden, ist Oleylalko ol dem Methylacetat als Lösemittel deutlich unterlegen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Methylacetat zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus wässrigen Mischungen, vorzugsweise wässrigen Lösungen.
Unter den Bedingungen des im 2. Beispiel beschriebenen Verfahrens zur Ermittlung der Extraktionseffizienz eines gegebenen Lösemittels werden in einem einmal durchgeführten Extraktions- schritt mehr als 30 %, bevorzugt mehr als 40 %, besonders bevorzugt mehr als 50 % und insbesondere bevorzugt mehr als 60 % des 2 , 3-Butandiol aus der wässrigen Phase in die Methylacetat Phase extrahiert. Dies stellt eine signifikante Verbesserung der Extraktion von 2 , 3 -Butandiol mit nicht-wassermischbaren Lösemitteln gegenüber dem Stand der Technik dar.
Die Ausbeute des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich dadurch erhöhen, dass die Extraktion mit Methylacetat mehrfach, vorzugsweise 1 bis 10-fach, besonders bevorzugt 1 bis 6-fach und insbesondere bevorzugt 1 bis 3 -fach wiederholt wird, oder dass in einer an sich bekannten kontinuierlichen Extraktion z.B. nach dem Gegenstromprinzip einer 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Mischung Methylacetat als Extraktionsmittel einge- setzt wird.
Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Ausbeu- temaximierung mittels mehrfacher oder kontinuierlicher Extraktion der 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Lösung mittels Me- thylacetat als Extraktionsmittel, wobei die 2,3-
Butandiolausbeute im Extrakt >70 %, bevorzugt >80 %, besonders bevorzugt >90 % und insbesondere bevorzugt 100 % der zur Ex- JO traktion eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge (ausgedrückt in g 2,3- Butandiol) beträgt.
Es ist ferner möglich, in jedem Extraktionsschritt das Volumen des Lösemittels im Vergleich zum Volumen der zu extrahierenden wässrigen 2 , 3 -Butandiollösung zu erhöhen und auf diese Weise die Zahl der nötigen Extraktionsschritte zu reduzieren, wobei die Erhöhung des Lösemittelvolumens im Vergleich zum Volumen der wässrigen 2 , 3 -Butandiollösung um den Faktor 5 bevorzugt, um den Faktor 3 besonders bevorzugt und um den Faktor 2 insbesondere bevorzugt ist.
Zur Erhöhung der Extraktionseffizienz können der wässrigen 2,3- Butandiol-Lösung auch Zusätze zugefügt werden. Dabei handelt es sich z. B. um Salze mit einem sog. Aussalzeffekt wie z.B. Sulfatsalze, Phosphatsalze, Carbonatsalze, Nitratsalze oder Chloridsalze.
Diese Zusätze werden vorzugsweise zugefügt in Mengen von 1 % bis 100 %, besonders bevorzugt 1 % bis 70 % und insbesondere bevorzugt 1 % bis 40 % bezogen auf ihre maximale Löslichkeit in Wasser .
Bei den Zusätzen kann es sich aber auch um unpolare organische Lösemittel handeln, die mit Methylacetat mischbar, mit der wässrigen Phase aber nicht mischbar sind. Beispiele dafür, aber nicht darauf beschränkt, sind organische Lösemittel wie n- Pentan, n-Hexan, n-Heptan, Cyclopentan, Cyclohexan, sowie alle Isomere des Pentans, Hexans oder Heptans .
Diese Zusätze werden zugefügt in Mengen von 0,1 % bis 30 %, bevorzugt 0,5 % bis 20 %, besonders bevorzugt 1 % bis 10 % und insbesondere bevorzugt 1,5 % bis 5 % bezogen auf das eingesetzte Volumen Methylacetat.
Wenn es sich bei der 2 , 3 -Butandiol -haltigen wässrigen Mischung um eine durch Fermentation eines 2, 3 -Butandiol produzierenden Stammes erhaltenen Fermenterbrühe handelt, so kann die Extrak- Π tion von 2 , 3-Butandiol durch Methylacetat ohne vorgeschaltete Verfahrensschritte direkt aus der Fermentertarühe erfolgen oder bereits in situ während der Fermentation erfolgen. Vor der Extraktion aus der Fermenterbrühe ist es jedoch auch möglich, die Mikroorganismen zu inaktivieren. Die Inaktivierung der Mikroorganismen kann in an sich bekannter Weise chemisch erfolgen (z.B. durch Behandlung der Fermenterbrühe mit Peroxiden, Wasserstoffperoxid oder mit Bleichlauge, Lösungen der hy- pochlorigen Säure oder ihrer Salze} oder aber auch thermisch durch Behandlung der Fermenterbrühe mit Wasserdampf, wie z.B. autoklavieren bei 121°C.
Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Extraktion aus der Fermenterbrühe ohne weitere Vorbehandlung oder nach thermischer Inaktivierung erfolgt.
Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Extraktion aus der Fermenterbrühe ohne weitere Vorbehandlung erfolgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Fermenterzellen vor der Extraktion aus der Fermenterbrühe abgetrennt. Die Abtrennung der Fermenterzellen erfolgt dabei in an sich bekannter Weise durch z.B. Sedimentation, Zentrifugati- on, Filtration, Fällung, Flockung oder aber auch durch eine Vorextraktion in einem Zweiphasengemisch (wie z.B. nach dem Stand der Technik mit Ammoniumsulfat und Isopropanol, bzw.
Ethanol) . Besonders bevorzugt ist die Abtrennung der Fermenterzellen durch Zentrifugation, Filtration oder Flockung, insbesondere bevorzugt ist die Abtrennung der Fermenterzellen durch Zentrifugation oder Filtration. Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Batchve fahren oder im kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Die Extraktion im Batchve fahren kann dabei beliebig oft wiederholt werden, bis das 2 , 3-Butandiol vollständig aus der wässrigen Phase extrahiert ist. Bevorzugt sind ein bis sechs Extraktionen im Batchverfahren, besonders bevorzugt eine bis drei Extraktionen und insbesondere bevorzugt eine Extraktion.
Die Extraktion von 2 , 3-Butandiol mit Methylacetat aus einer wässrigen Lösung im kontinuierlichen Verfahren wird in an sich bekannter Weise vorzugsweise mit einer Extraktionskolonne im Gegenstrom durchgeführt wobei sowohl eine Siebbodenkolonne wie auch eine Füllkörperkolonne zur Anwendung kommen können.
Je nach gewünschtem Reinheitsgrad des 2 , 3 -Butandiolprodukts kann das erfindungsgemäße Verfahren durch zusätzliche Verfah- rensschritte, die entweder vor oder nach der Extraktion mit Methylacetat durchgeführt werden, ergänzt werden.
Bei diesen Verfahrensschritten handelt es sich um an sich bekannte Methoden wie Zentrifugation, Sedimentation, Sedimentati- on unter Einsatz von Flockungsmitteln, Filtration, Destillation, Dünnschichtverdampfen, Extraktion mit einem von Methylacetat verschiedenen Lösemittel, Kristallisation, Chromatographie, Pervaporation, Reverse Osmose, Dampf -Strippen. Bevorzugt handelt es sich um Zentrifugation, Filtration und Destillation,
Durch Kombination verschiedener Aufarbeitungsschritte und unter Einbeziehung der Extraktion von 2 , 3-Butandiol aus einer wässrigen Lösung mit Methylacetat kann 2 , 3 -Butandiol in einer Ausbeute (definiert als die Menge 2 , 3 -Butandiol in Prozent bezogen auf die in der wässrigen Lösung enthaltene Menge 2 , 3 -Butandiol) >60 %, bevorzugt >70 %, besonders bevorzugt >80% und insbesondere bevorzugt >90 % isoliert werden, wobei die chemischen Reinheit des 2,3-BDL Produktes durch die weitere Verwendung bestimmt ist und bis >99 % betragen kann. Eine mögliche Abfolge von Aufarbeitungsschritten unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen Extraktion mit Methylacetat zur Gewinnung von 2,3- Butandiol aus Fermentationsansätzen ist exemplarisch im 5. , 6. und 7 . Beispiel beschrieben. Dabei ist dem Fachmann bekannt, dass Zahl, Abfolge und Art der Aufarbeitungsschritte beliebig kombiniert werden können, aber immer zum Ziel haben, 2,3- Butandiol zu den geringst möglichen Kosten aus einer Fermenterbrühe zu isolieren.
Die in den Beispielen beschriebene Abfolge möglicher Aufarbeitungsschritte umfasst die erfindungsgemäße Extraktion einer 2, 3 -Butandiol enthaltenden Fermenterbrühe mit Methylacetat , wobei die Fermenterbrühe entweder direkt eingesetzt werden kann oder aber nach vorheriger Abtrennung der Biomasse, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, bzw. eine Kombination aus beiden, und das 2 , 3 -Butandiol anschließend mit Methylacetat extrahiert wird. Der resultierende Methylacetat Extrakt wird anschließend vorzugsweise durch eine zweistufige Destillation aufgearbeitet, wobei vorzugsweise in einem ersten Schritt das niedrig siedende Methylacetat (5. und 7. Beispiel) abgetrennt wird (dieses wird bevorzugt zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus einer Fermenterbrühe wiederverwendet) , vorzugsweise gefolgt von einer zweiten Destillation {Feindestillation, 6. Beispiel), bei der zuerst eine Fraktion mit mittlerem Siedepunkt (Acetoin, Ethanol, Wasser, Essigsäure} und schließlich die höher siedende Hauptfraktion des 2, -Butandiol gewonnen wird.
Zur Quantifizierung, bzw. Bestimmung der Reinheit des isolier- ten 2,3-BDL Produkts stehen verschiedene analytische Methoden zur Verfügung, darunter GC, HPLC, NMR, Bestimmung des Siedepunktes, Elementaranalyse oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden . Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung :
Beispiel 1:
2,3-BDL Produktion mittels eines K. terrigena Stammes durch Fed-Batch Fermentation
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulu von Klebsiella terrigena-pALSbl-tet (offenbart in DE 102011003394) in LBtet Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 g/ml Tetracyclin) wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, jeweils in einem 1 1 Erlenmeyer- kolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD60o/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCü 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt, Fermentationsmedium war FM2tet. Die Fermentation erfolgte im Baten Modus .
FM2tet Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulf t 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1;
MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; H2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt. Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/1; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 x 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; ZnS04 x 7 H20 0,3 g/1 und Ma2Mo04 x 2 H20 0,15 g/1.
2 x 8 1 FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermenta- tionstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (vvm: Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute) . Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (Schill & Seilacher, 20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Wach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD^o/rol von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet. Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1} der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet. Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. 180 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentations- temperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem, bezogen auf das Anfangsvolumen konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser} verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Glu- coseverbrauch durch off-line Glucose-Messung mit einem Glucose- Analysator der Fa. YSI bestimmt. Sobald die Glukosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feed- lösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glukosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt {BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) . Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Gehaltsanalyse für 2 , 3 -Butandiol und andere Fermentations- produkte in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR. Dazu wurde aus der Fermentation ein Aliquot des Fermentationsansatzes entnommen und zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) , um einen Kulturüberstand zu gewinnen. 0,1 ml des Kulturüberstandes wurden mit 0,6 ml TSP (3- Trimethylsilyl) Propionsäure-2 , 2 , 3 , 3-d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D20 gemischt. Die 1H~NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analysen in folgenden Bereichen integriert:
TSP: 0,140 - - 0,145 ppm (9H)
2 , 3 -Butandiol : 1,155 - - 1,110 ppm (6H)
Ethanol : 1,205 - - 1,157 ppm (3H)
Essigsäure : 2, 000 - - 1,965 ppm (3H)
Acetoin: 2,238 - - 2,200 ppm (3H)
Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1. Der Fermentationsansatz wurde aus dem Fermenter abgelassen und in Aliquots bei -20°C aufbewahrt. Die Gehaltsbestimmung der Fermenterbrühe ergab folgendes Ergebnis:
2 , 3 -Butandiol : 122,3 g/1
Ethanol : 6,7 g/1
Essigsäure : 9,0 g/1
Acetoin: 8,2 g/1
Beispiel 2
Vergleichende Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus Fermenterbrühen mit Methylacetat , Ethylacetat, MTBE, 1-Pentanol, Methylpropio™ nat und Oleylalkohol
Eine 2 , 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe wurde hergestellt und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol wurde bestimmt wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol betrug 122,3 g/1. 20 ml der Fermenterbrühe wurden einmal mit je 20 ml Methylacetat, Ethylacetat, MTBE, 1-Pentanol, Methylpropionat und Oleylalkohol bei 22°C extrahiert, indem die Ansätze 15 min bei 400 rpm auf einem Orbitalschüttler (Schüttler KL- 2 der Fa. Bühler) gemischt wurden. Die Ansätze wurden anschließend zur Phasentrennung jeweils zentrifugiert (Eppendorf Megafuge, 5 min 3.000 rpm). Die obere, organische Phase wurde jeweils abpipettiert, in einen 250 ml Glasrundkolben überführt, das Lösemittel durch Destillation an einem Rotationsverdampfer abgezogen und der Gehalt an 2, 3-Butandiol durch NMR bestimmt (siehe 1. Beispiel) . Vom Ansatz mit Oleylalkohol wurde wegen des hohen Siedepunkts von 330-360°C das 2 , 3 -Butandiol {Siedepunkt 180°C) im Rotationsverdampfer abdestilliert und der Gehalt im Destillat bestimmt. Von der unteren, wassrigen Phase wurde der Gehalt an 2 , 3-Butandiol direkt durch NMR bestimmt. Die 2 , 3-Butandiol Ausbeuten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1:
Extraktionseffizienz verschiedener Lösemittel bei der Extrakti- on von 2 , 3 -Butandiol aus Fermenterbrühen
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(E) erfindungsgemäßes Verfahren; (V) Vergleichsverfahren Beispiel 3 :
Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus einer Fermenterbrühe durch Mehrfachextraktion mit Methylacetat, Ethylacetat, MTBE und 1- Pentanol Eine 2 , 3-Butandiol-haltige Permenterbrühe wurde hergestellt und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol wurde bestimmt wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol betrug 122,3 g/1. Die Fermenterbrühe wurde mit Methylacetat , Ethylacetat, MTBE oder 1-Pentanol extrahiert. Dazu wurden 25 ml der Fermenterbrühe dreimal mit je 25 ml des betreffenden Lösemittels bei 22°C extrahiert, indem die Ansätze 15 min bei 400 rpm auf einem Orbitalschüttler (Schüttler KL-2 der Fa. Bühler) gemischt wurden. Die Ansätze wurden anschließend zur Phasentrennung jeweils zentrif giert (Eppendorf Megafuge, 5 min 3.000 rpm) . Die oberen, organischen Phasen der drei Extraktionsschritte wurden jeweils abpipettiert und in einen 250 ml Glasrundkolben vereinigt. Anschließend wurde das Lösemittel durch Destillation an einem Rotationsverdampfer abgezogen. Vom Destillationsrückstand wurde das Volumen und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol bestimmt
(siehe 1. Beispiel) . Die 2 , 3 -Butandiolausbeuten sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2:
2 , 3 -Butandiol Ausbeute nach Extraktion von Fermenterbrühe mit verschiedenen Lösemitteln
2 , 3 -Butandiol (g) Ausbeute (%)
Fermenterbrühe 3 , 06 100
ethylacetatextrakt 11 SX 59,3
Ethylacetatextrakt 0, 75 24 , 5
ΜΤΒΞ- Extrakt 0, 13 4,2
1 - Pentanolextrakt 1,30 42,5
Mit 1-Pentanol konnten 42,5 % 2 , 3 -Butandiol extrahiert werden, wobei aufgrund des hohen Siedepunkts von 1-Pentanol von 138°C (zum Vergleich: Siedepunkt von 2 , 3-Butandiol 180°C) ca. 40 % des extrahierten 2 , 3 -Butandiols in der abdestillierten Lösemittelfraktion wiedergefunden wurden. Dies bedeutet bei der Verwendung von l-Pentanol als Lösemittel zur Extraktion, dass ein größerer Aufwand zur destillativen Gewinnung des extrahierten 2 , 3 -Butandiols betrieben werden muss, Beispiel 4
Extraktion von 2,3-BDL mit Methylacetat, Methylpropionat und Methylbutyrat 0,1 1 des im 1. Beispiel hergestellten Fermentationsansatzes wurde 15 min bei 15.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) . Drei Aliquots von je 20 ml des Zentrifugationsüberstandes (2 , 3 -Butandiol Einsatzmenge 2,4 g} wurden in 50 ml Falconröhrchen überführt und mit je- weils 20 ml Methylacetat, Methylpropionat und Methylbutyrat extrahiert. Dazu wurden die verschlossenen Falcon Reaktionsgefäs~ se 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung zentrifugiert (5 min 3.000 rpm, Eppendorf Me™ gafuge) . Von der unteren, wässrigen Phase wurde jeweils ein Aliquot zur Bestimmung des 2 , 3 -Butandiol Gehalts verwendet.
Nach Extraktion mit Methylacetat wurden 1,4 g 2 , 3 -Butandiol in der wässrigen Phase wiedergefunden, entsprechend 60 % der eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge von 2,4 g. 40 % der eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge wurden somit unter den gewählten Bedingungen der einfachen Extraktion durch Methylacetat extrahiert. Mit Methylpropionat konnten 5 %, mit Methylbutyrat hingegen kein 2,3- Butandiol extrahiert werden.
Beispiel 5
Präparative Extraktion von 2,3-BDL aus zellfreien Fermentationsüberständen mit Methylacetat
1 1 des im 1. Beispiel hergestellten Fermentationsansatzes wurde 30 min bei 8.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem GS- 3 Rotor) . 800 ml des Zentrif gationsüberstandes (2 , 3 -Butandiol Einsatzmenge 97,8 g) wurden dreimal mit je 1,6 1 Methylacetat extrahiert, indem der Extraktionsansatz jeweils 30 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die organische Phase wurde jeweils über einen Scheidetrichter von der wässrigen Phase abgetrennt. Die organischen Phasen wurden vereinigt und das Methylacetat destillativ in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Dadurch wurden 250 ml einer 2 , 3-Butandiol Rohfraktion gewonnen. Die 2 , 3-Butandiolkonzentration der Roh- fraktion betrug 323,3 g/1. Die 2 , 3 -Butandiolausbeute betrug 80,8. g, bzw. 82,7 % {bezogen auf die Einsatzmenge von 97,8 g) .
Beispiel 6
Destillative Aufarbeitung von 2,3-BDL Extrakten
Die im 6. Beispiel durch Extraktion mit Methylacetat gewonnene Rohfraktion (250 ml, 80,8 g 2 , 3-Butandiol) wurde durch Destillation fraktioniert. Die Rohfraktion wurde in einen 0,5 1 Glas- rundkolben überführt und über einen 30 cm Rückflusskühler fraktioniert destilliert. Dabei wurde ohne Vakuum destilliert
(Heiztemperatur 118 °C) , um niedriger siedende Fraktionen abzutrennen (Dauer ca. 30 min) , Anschließend wurde ein Vakuum von 100 mbar angelegt und die Heiztemperatur bis auf 192 °C erhöht (Dauer ca. 60 min). Die 2 , 3 -Butandiol Fraktion wurde bei einer Kopftemperatur von 120 °C aufgefangen und ausgewogen. Die Aus- waage der Fraktion betrug 75 g. Die Fraktion wurde durch NMR analysiert (siehe 1. Beispiel). Der Anteil an Verunreinigungen war < 1 %. Bezogen auf die eingesetzte Menge 2, 3-Butandiol in der Rohfraktion von 80,8 g betrug die Ausbeute 92,8 %.
Beispiel 7
Praparative Extraktion von 2,3-BDL aus zellfreien Fermentationsüberständen mit Methylacetat im Pilot-Maßstab
60 1 des im 1. Beispiel fermentativ hergestellten Fermentationsansatzes wurden sukzessive in je 6 1 Aliquots 30 min bei 5.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge Evolution RC der Fa. Thermo Scientific, ausgestattet mit einem Rotor F8S
SxlOOOy) . Vom gesammelten Zentrifugationsüberstand wurde anschließend in 17 Chargen zu je 3 1 durch Querstromfiltration ein zellfreies Filtrat hergestellt.
Zur Filtration wurde eine kommerziell erhältliche Querstrom Filtrationseinheit der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH (Sar- tocon® Slice, ausgestattet mit drei 0,2 m Hydrosart Microfil- termembranmodulen von je 0,1 m2 Filtrationsfläche und betrieben mit einer Sartojet Membranpumpe des gleichen Herstellers) ein- gesetzt und entsprechend den Empfehlungen des Herstellers betrieben. Die Pumpgeschwindigkeit betrug dabei 38 1/h, die
Druckbegrenzung war auf einen Maximaldruck von 3 bar eingestellt. Die Filtrationsrate betrug durchschnittlich 0,4 1/h. 40 1 Filtrat wurden gewonnen entsprechend einer 2 , 3-Butandiolmenge von 4,9 kg.
Zur Extraktion des 2 , 3 -Butandiols wurden die 40 1 Filtrat in einem 200 1 Reaktionskessel dreimal mit je 80 1 Methylacetat extrahiert. Dazu wurde der Extraktionsansatz jeweils 1 h bei
Raumtemperatur gerührt und die Methylacetatphasen nach der Phasentrennung in einem 500 1 Reaktionskessel vereinigt. Das Lösemittel wurde anschließend abdestilliert {bei 50 °C und einem Vakuum von 100 rnbar) und ein Rohextrakt erhalten. Das Volumen des Rohextraktes betrug 13,1 1. Die Ausbeute an 2 , 3 -Butandiol betrug 4 kg (82 % Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge 2,3- Butandiol von 4,9 kg) . Die analytisch bestimmte Zusammensetzung des Rohextraktes war: 2 , 3-Butandiol 305,9 g/1, H20 656,9 g/1, Acetoin 38,3 g/1, Ethanol 5,7 g/1, Essigsäure 1,1 g/1.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Extraktion von 2, 3~Butandiol aus einer 2,3- Butandiol-haltigen wässrigen Mischung, bei dem eine 2,3- Butandiol-haltige wässrige Mischung mit einem organischen Extraktionsmittel gemischt wird, und diese Mischung in eine wässrige und eine organische Phase getrennt wird und das 2 , 3 -Butandiol aus der organischen Phase abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Extraktionsmittel Methylacetat ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 2, 3 -Butandiol -haltige wässrige Mischung einen 2,3- Butandiolgehalt größer als 10 g/1, bevorzugt größer 50 g/1, besonders bevorzugt größer 100 g/1 und insbesondere bevorzugt größer 150 g/1 besitzt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die 2 , 3 -Butandiol-haltige wässrige Mischung bei Raumtemperatur (23°C) aus einer Phase oder aus mehreren Phasen, bevorzugt aus einer Phase besteht.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die 2 , 3 -Butandiol-haltige wässrige Mischung eine Fermenterbrühe ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Fermenterbrühe alle festen Bestandteile entfernt wurde .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekenn- zeichnet, dass die 2 , 3 -Butandiol-haltige wässrige Mischung und Methylacetat in einem Gewichtsverhältnis von 1:0,1 bis 1:5, besonders bevorzugt von 1:0,8 bis 1:3, insbesondere bevorzugt von 1:1 bis 1:2 zusammengegeben werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6/ dadurch gekennzeichnet, dass das Mischen bei einem pH der wässrigen Phase von 1 bis 14, besonders bevorzugt von 2 bis 10, ins besondere bevorzugt von 3 bis 9, bzw. von 4 bis 8 erfolgt
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mischen bei einer Temperatur, welche das Verteilungsgleichgewicht zu Gunsten der organischen Methylacetatphase und zu Ungunsten der wässrigen Phase optimiert, bevorzugt von -15°C bis 50 °C, besonders bevorzugt von 0°C bis 45°C, insbesondere bevorzugt von 20°C bis 40°C erfolgt.
9. Verwendung von Methylacetat zur Extraktion von 2,3- Butandiol aus einer wässrigen Mischung.
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