DE3248167C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Gemische aus Trehalose-2,2′3,4- tetraestern und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Trehaloselipide sind bekanntlich Glycolipide, die als Disaccharidanteil Trehalose enthalten und grenzflächenaktiv wirksam sind. Die Trehaloselipide können durch Mikroorganismen hergestellt werden, wie beispielsweise aus der DE-PS 28 05 823 bekannt ist. Danach werden in einem Bioreaktor eine Nährstofflösung in Wasser und n-Alkane der Kettenlänge von C₈ bis C₂₄ oder Rohöl vermischt und dieses Gemisch mit einem Mikroorganismus beimpft. Die Züchtung wird unter einer Belüftungsrate von 0,5 bis 1,0 V/V/m und einer Umdrehungszahl von 400 bis 1200 cm^-1 bei einer Temperatur von 30°C bis 50°C durchgeführt, wobei der pH-Wert der Flüssigkultur durch Zusatz von Ammoniaklösung auf 6,8 bis 7,0 gehalten wird. Die Züchtung wird durch einen Temperaturschock, d. h. kurzfristiges Erhitzen der Flüssigkultur mit einer Temperatur um 60°C, beendet. Aus der Kultursuspension wird die Zellmasse abgetrennt. Die hierbei hinterbleibende wäßrige Phase kann dann direkt einer technischen Verwendung zugeführt oder in an sich bekannter Weise auf Glykolipide aufgearbeitet werden, beispielsweise durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, das aus dem abgetrennten Extrakt abgedampft wird.

Nach diesem bekannten Verfahren werden Trehalose- 6,6′-diester der allgemeinen Formeln und erhalten, wenn als Mikroorganismen Nocardia rhodochrous bzw. Mycobacterium phlei eingesetzt worden sind. Die Ausbeuten an Trehalose-6,6′-diestern liegen bei diesem Verfahren zwischen 600 und 700 mg/l der aus der Flüssigkultur isolierten wäßrigen Phase.

Diese Trehaloselipide sind bisher allein als nichtionogene, grenzflächenaktive Substanzen angesehen worden, deren in C₆-Positionen liegende CH₂OH- Gruppen durch je eine Fettsäure verestert sind, so daß die Trehaloselipide zutreffend auch als Trehalose- 6,6′-diester bezeichnet werden.

Diese bekannten Trehalose-6,6′-diester können durch die allgemeine Formel dargestellt werden, worin R₁ für H oder R₂ steht und R₂ folgende Reste bedeuten kann: mit m = 8 bis 10 und n = 18 bis 21 oder mit m = 20 bis 22 und n = 14 bis 17.

Diese Verbindungen sind Diester der Trehalose, die als nichtionogene grenzflächenaktive Substanzen wirksam sind.

In einer Veröffentlichung von S. G. Batrakov et al in "Chemistry and Physics of Lipids" 29 (1981), Seiten 241 bis 266, wird über neue Typen von Trehaloselipiden berichtet, die aus der Zellmasse des Paraffin oxidierenden Bakteriums Mycobacterium paraffinicum isoliert werden können. Neben den bekannten Fettsäureestern der Trehalose, wie 6,6′-Di-O-mycolyl-αα-D-trehalose, 6-O-Mycolyl-α, α-D-trehalose und 6,6′-Di-O-acyl (C₁₂-C₁₆)-α,α-D- trehalose, sind aus der Zellmasse noch die Verbindungen 6-O-Mycolyl-6′-O-acyl (C₁₂-C₁₆)-a,α-D-trehalose und 2-O-Octanoyl-3,2′-Di-O-decanoyl-6-0-succinoyl- α,α-D-trehalose isoliert und identifiziert worden.

Bei der Fermentation von Torulopsis bombicola entstehen nach J.F.T. Spencer et al in "Canadian Journal of Chemistry" 39 (1961), Seite 846, Sophorolipide der allgemeinen Formel: in der R¹ und R² = H oder eine R³ = H oder eine -CH₃-Gruppe und R⁴ ein gesättigter oder ungesättigter Kohlenwasserstoffrest mit C₁₁ bis C₁₆ sind. Diese Sophorolipide werden in der dargestellten Lactonbindung und in der damit im Gleichgewicht stehenden freien Säure erhalten, die sich durch die hydrolytische Aufspaltung der Lactonbindung daraus bildet. Diese Sophorolipide sind demnach zum Teil Diacetylester.

Nach der DE-OS 29 05 252 kann ein Glycolipidmethylester mit Grenzflächenaktivität und wachsähnlichen Eigenschaften erhalten werden, wenn ein durch Fermentation von Torulopsis bombicola erhaltenes und hydratisiertes Sophorolipid mit bestimmten Ätheralkoholen vermischt und aus diesem Gemisch das Wasser abdestilliert wird, worauf das wasserfreie System aus Sophorolipid und Ätheralkohol durch Umsetzung mit Methanol in Gegenwart einer starken Säure einer Methanolyse und Methylierungsreaktion unterzogen wird. Dadurch werden die beiden Acetylreste abgespalten und die Säuregruppe mit Methanol verestert. Dieser Ester weist im Sophoroseteil seines Moleküls keine Esterbindungen mehr auf, sondern nur noch eine mit einem niederen Alkohol veresterte Carbonsäuregruppe der den Lipidanteil des Moleküls bildenden Fettsäure. Da die Hydroxylgruppen des Sophoroseteils dieses Esters frei sind, weist dieser Ester als nichtionogenes Tensid eine hohe Grenzflächenaktivität auf, die durch Austausch des esterartig gebundenen alkoholischen Methylrests gegen andere Alkohole mit längerer Kohlenstoffkette im Molekül im Wege der Umesterung verändert werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Gemische aus neuen Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, wobei hohe Ausbeuten an den Trehalose-2,2′-3,4-tetraestern erhalten werden.

Diese Aufgabe wird gelöst mit Gemischen aus Trehalose-2,2′3,4-tetraestern der allgemeinen Formel: mit den Bedeutungen: und R₃ Wasserstoff oder Alkyl

x = 4 bis 22
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22

mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R₁ ein Dicarbonsäurerest ist, und einem Verfahren zur Herstellung der Gemische mit den Merkmalen des Anspruchs 2.

Diese Trehalose-2,2′,3,4-tetraester sind anionische grenzflächenaktive Substanzen, die gegenüber den nichtionogenen, grenzflächenaktiven Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester eine höhere Grenzflächen-Aktivität besitzen.

Zur Herstellung dieser Trehalose-2,2′3,4-tetraester hat sich ein Verfahren bewährt, das von der Züchtung von Trehaloseestern produzierenden und Alkane verwertenden Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoff enthaltenden, wäßrigen Medium mit bestimmten pH-Wert bei einer Temperatur von unter 50°C und anschließender Isolierung der Trehaloseester aus der Kultursuspension ausgeht. Erfindungsgemäß werden die Mikroorganismen aerob bei einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 50°C unter Limitierung der Wachstumsgeschwindigkeit gezüchtet.

Die Produktion der gewünschten Trehalose-2,2′-3,4- tetraester kann dadurch erreicht werden, daß in die Kultursuspension im Verlauf der logarithmischen Wachstumsphase Kohlenwasserstoffe, nämlich Kerosin oder ein Gemisch aus etwa 89 Vol.% Kohlenwasserstoffen mit 14 C-Atomen und etwa 9 Vol.% Kohlenwasserstoffen mit 15 C-Atomen (nachstehend als n-Paraffin S bezeichnet) in mehreren das Wachstum des Mikroorganismus nicht beeinträchtigenden Teilmengen in zeitlichem Abstand nacheinander eingerührt wird. Das Kerosin enthält vorteilhaft etwa 85 Vol.% gesättigte und etwa 15 Vol.% aromatische Kohlenwasserstoffe.

Als Züchtungsbasis wird hierzu eine wäßrige Nährsalzlösung eingesetzt, die in der Zusammensetzung auf den Nährstoffbedarf des zu züchtenden und Trehaloseester produzierenden Mikroorganismus abgestellt ist. Dieser Nährstofflösung werden nach Sterilisation die sterilen und assimilierbaren Kohlenwasserstoffe, insbesondere n-Paraffin S, zugesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes der Flüssigkultur auf einen Wert zwischen 3 und 8 mit der wäßrigen Lösung einer alkalisch wirkenden Verbindung, z. B. Ammoniaklösung, wird diese Kulturlösung mit einer Submerskultur des Trehaloseester produzierenden Mikroorganismus beimpft. Unter Konstanthaltung des anfänglich eingestellten pH-Wertes wird die auf einer Temperatur von 15 bis 50°C gehaltene Kultursuspension bei einer Umdrehungszahl von etwa 1500 cm^-1 mit auf 40 Vol-% Sauerstoff angereicherter Luft mit einer Belüftungsrate von 0,5 V/V/m begast. Im Verlauf der logarithmischen Wachstumsphase können im zeitlichen Abstand nacheinander mehrere Teilmengen der Kohlenwasserstoffe in die Kultursuspension eingerührt werden. Bei Verwendung von Kerosin als Substrat und Lösungsmittel hat es sich bewährt, nach einer anfänglichen Kultivierungszeit von etwa 14 Stunden der Kultursuspension 10 g/l, nach weiteren 11 Stunden 16 g/l, nach weiteren 5 Stunden 18 g/l und nach weiteren 10 Stunden 10 g/l Kerosin zuzusetzen. Durch diese Teilmengen an Kerosin wird das Wachstum der Mikroorganismen nicht gehemmt. Das Kerosin steigert aber offenbar die Permeabilität der lipophilen Zellwandungen und löst die an der Zellwand haftenden Trehaloseester ab, wodurch der Mikroorganismus offensichtlich zur Produktion weiterer Mengen an Trehaloseestern angeregt wird.

Analog kann als Substrat und organisches Lösungsmittel auch n-Paraffin S nach dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden. Hierbei hat es sich bewährt, die erste Teilmenge von 20 g/l Kultursuspension nach einer anfänglichen Kultivierungszeit von etwa 17 Stunden in die Kultursuspension einzurühren. Die weiteren Teilmengen von 12 g/l werden nach weiteren 32 Stunden und von 12 g/l nach weiteren 10 Stunden in die Kultursuspension eingerührt. Nach dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung werden Ausbeuten an Trehaloseestern von über 2000 mg/l erhalten.

Nach einer anderen Möglichkeit der Limitierung bei dem Verfahren der Erfindung wird in die Kultursuspension in Abhängigkeit von dem Wachstum des Trehaloseester produzierenden Mikroorganismus ein Komplexbildner für mehrwertige anorganische Kationen, vorzugsweise Ethylendiamintetraessigsäure, in Mengen eingerührt, die das Wachstum des Mikroorganismus einschränken, aber nicht beenden. Es hat sich bewährt, die Zugabe der Ethylendiamintetraessigsäure, vorzugsweise als Di-natriumsalz, mit der Zugabe der den pH-Wert der Kultursuspension regelnden wäßrigen Lösung einer alkalisch wirkenden Verbindung, wie beispielsweise Ammoniak, dergestalt zu koppeln, daß die Ethylendiamintetraessigsäure in diese wäßrige Lösung in entsprechender Menge inkorporiert wird. Vorzugsweise werden in der verwendeten 10 Vol-% Ammoniak enthaltenden Lösung mindestens 46 bis 47 g/l Ethylendiamintetraessigsäure bzw. eine entsprechende Menge des Di-natriumsalzes dieser Säure gelöst. Auf diese Weise werden der Kultursuspension im Verlauf der Züchtung etwa 3,75 g/l des Di-natriumsalzes der Ethylendiamintetraessigsäure zugesetzt. Die Ausbeuten an Trehaloseestern liegen bei dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung bei etwa 3250 mg/l Kultursuspension.

Als Standardregel kann hier gelten, daß pro Mol der in der Kultursuspension gelöst vorliegenden zweiwertigen Kationen und pro Mol der dreiwertigen Kationen zumindest ein Mol Ethylendiamintetraessigsäure eingesetzt wird. Durch die Zugabe der Ethylendiamintetraessigsäure werden im Verlauf der Züchtung zunehmend die in der Kultursuspension gelöst vorliegenden mehrwertigen Kationen komplexiert und stehen dadurch als Nährstoff für den Mikroorganismus nur in limitierten Konzentrationen zur Verfügung.

Eine weitere Möglichkeit der Steigerung der Ausbeute an Trehaloseestern besteht erfindungsgemäß in einer Limitierung der Stickstoffquelle in der Kultursuspension, die durch entsprechende Voreinwaage erreicht und dadurch aufrechterhalten wird, daß der pH-Wert der Kultursuspension durch Zugabe einer stickstoffreien alkalischen Verbindung, wie beispielsweise einer Alkalihydroxidlösung, auf dem vorbestimmten Wert gehalten wird. Hierdurch wird der Stickstoffgehalt der Kultursuspension auf die Menge limitiert, die in der ursprünglich eingesetzten Nährsalzlösung in Form einer Ammoniumverbindung gelöst ist. Die Ausbeuten an Trehaloseestern liegen bei dieser Alternative des Verfahrens der Erfindung bei etwa 5000 mg/l Kultursuspension.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Limitierungsmaßnahmen kann auch die Temperatur der Kultursuspension nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase um 15°C angehoben oder abgesenkt werden. Bei beispielsweise gleichzeitiger Stickstofflimitierung werden nach dieser Variante des Verfahrens der Erfindung über 7800 mg Trehaloseestern pro l Kultursuspension erhalten.

Eine weitere Steigerung der Ausbeute an Trehaloseestern kann erfindungsgemäß dadurch erreicht werden, daß der Nährsalzlösung nach deren Sterilisation zusätzlich mindestens 0,01 bis 0,02 g/l d-N,N′-Bis (l-hydroximethylpropyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid (Ethambutol) zugesetzt werden. Unter gleichzeitiger Anwendung der Stickstofflimitierung und der Temperaturabsenkung während der Züchtung steigt die Ausbeute an Trehaloseestern nach dieser Variante des Verfahrens der Erfindung auf über 10 000 mg/l Kultursuspension.

Die Isolierung der nach den verschiedenen Varianten des Verfahrens der Erfindung gebildeten Trehaloseester- Gemische aus der Kulturlösung erfolgt nach an sich bekannter Arbeitsweise. So kann die Kulturlösung erschöpfend mit einem Gemisch aus Methylenchlorid/ Methanol im Volumenverhältnis 2 : 1 extrahiert werden. Die erhaltenen Extrakte werden dann im Vakuum zum Rohextrakt konzentriert, aus dem der nicht umgesetzte Kohlenwasserstoff abgetrennt wird, der dann erneut gemäß dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann. Es bleibt ein Gemisch aus Trehaloseestern zurück, das je nach Verfahrensvariante zu 10 bis 40 Gew-% aus nichtionogenen Trehalosemono- bzw. -diestern und zu 60 bis 90 Gew-% aus anionischen Trehalose-2,2′,3,4-Tetraestern besteht und in seiner Menge 0,75 bis 10,5 g/l Kultursuspension beträgt.

Die Trennung dieses Gemisches in seine Komponenten kann mittels an sich bekannter Maßnahmen durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Beispiel 10 angegeben sind.

Als Trehaloselipide produzierende Mikroorganismen können für das Verfahren der Erfindung Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 sowie Arthrobacter spec. DSM 2567 und Corynebacterium spec. DSM 2568 eingesetzt werden.

Mit den Maßnahmen der Erfindung sind die Möglichkeiten gegeben, die Ausbeute an Trehaloseestern in biotechnologischen Herstellungsverfahren entscheidend zu erhöhen und gleichzeitig die bisher noch nicht bekannten anionischen, grenzflächenaktiven Trehalose- 2,2′,3,4-tetraester zu erzeugen, wobei die Kettenlänge der Säurereste dieser Ester in Abhängigkeit von dem Substrat variiert. Durch Auswahl geeigneter Varianten des Verfahrens der Erfindung ist es ferner möglich, das Verhältnis der erfindungsgemäß erzeugten Trehaloseester zu ändern und damit auch die grenzflächenaktive Wirkung dieser Produkte zu beeinflussen, da die neuen anionischen Trehalose-2,2′,3,4-tetraester im Vergleich mit nichtionogenen Mono- bzw. Diestern eine höhere Hydrophilität haben. Die grenzflächenaktive Wirkung der erfindungsgemäßen Produkte kann durch chemische Derivatisierung, wie beispielsweise Veresterung, weiter beeinflußt werden. Aus den erfindungsgemäßen Produkten kann durch Verseifung der Esterbindung auch Trehalose gewonnen werden.

Beispiel 1 Zusatz von Kerosin in Teilmengen

Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor- System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung: 500 g Hefeextrakt, 62 g Zitronensäure × 1 H₂O, 100 g (NH₄)₂SO₄, 25 g KH₂PO₄, 25 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 50 g 85%ige H₃PO₄, 2,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1 g FeCl₃ × 6 H₂O, 10 g FeSO₄ × 7 H₂O, 55 g MgSO₄ × 7 H₂O und 50 l Leitungswasser) versetzt, bei pH 3.0 und einer Temperatur von 121°C 30 min sterilisiert, nach Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit 2200 g sterilem Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt, der pH-Wert mit 5%iger NH₄OH-Lösung auf 5,8 eingestellt und mit 5000 ml einer 24 Std. alten Submerskultur von Rhodoccus erythopolis DSM 43 215 beimpft. Während der Züchtung wird die Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Titration mit 5-volumenprozentiger Ammoniak-Lösung bei pH 5,8 konstant gehalten und bei einer Temperatur von 30°C, einer Umdrehungszahl von 1500 cm^-1 und einer Belüftungsrate von 0,5 V/V/m mit 40 Vol-%- sauerstoffangereicherter Luft begast. Nach einer Kultivierungszeit von 14 Std. werden 500 g, nach 25 Std. 800 g, nach 30 Std. 900 g und nach 40 Std. 500 g Kerosin (Zusammensetzung: 85 Vol-% gesättigte Kohlenwasserstoffe, 15 Vol-% Aromate) zugesetzt. Die Züchtung ist nach 50 Std. beendet, danach wird die erhaltene Submerskultur (enthaltend 1150 g Zelltrockenmasse) in bekannter Weise erschöpfend mit Methylenchlorid/Methanol (2 : 1 Vol./Vol.) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden im Vakuum konzentriert. Der Rückstand (2700 g) wird in 10 l Chloroform aufgenommen, mit 5000 g Kieselgel 60 versetzt und die erhaltene Suspension abfiltriert. Das Filtrat enthält nach Konzentrierung im Vakuum 2650 g Kohlenwasserstoff, der recyclisiert wird. Die am Kieselgel adsorbierten Glykolipide werden erschöpfend mit CH₃OH extrahiert und die vereinigten CH₃OH-Extrakte im Vakuum eingeengt. Der Rückstand enthält 20,2 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 40%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 18,6 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 60%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 2 Zusatz von n-Paraffin S in Teilmengen

Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird, wie in Beispiel 1, gezüchtet, jedoch werden anstelle von Kerosin nach einer Kultivierungszeit von 17 Std. 1000 g, nach 49 Std. 600 g und nach 59 Std. 600 g n-Paraffin S (Zusammensetzung: 89% C-14, 9% C-15) zugesetzt. Die Züchtung ist nach 64 Std. beendet. Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der erhaltene organische Rohextrakt enthält neben n-Paraffin S (450 g), das recyclisiert wird, 31,65 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 20%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 77,86 g Trehalose- 2,2′,3,4-tetraester = 80%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 3 Limitierung der mehrwertigen Kationen durch kontinuierlichen Zusatz von Ethylendiamintetraessigsäure

Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor- System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung: 50 g Hefeextrakt, 121 g Zitronensäure × 1 H₂O, 23,5 g (NH₄)₂SO₄, 184 g KH₂PO₄, 71,5 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 50 g 85%ige H₃PO₄, 21,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 12,5 g FeCl₃ × 6 H₂O, 76,5 g MgSO₄ × 7 H₂O, 2 g KCl und 50 l Leitungswasser) versetzt, bei pH 3,0 und einer Temperatur von 121°C 30 min sterilisiert, nach Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit 4900 g sterilem n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt, der pH-Wert mit 5%iger NH₄OH-Lösung auf pH 5,8 eingestellt und mit 5000 ml einer 24 Std. alten Submerskultur von Rhodococcus eryhtropolis DSM 43 215 beimpft. Während der Züchtung wird die Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Titration mit 10-Vol.%-iger Ammoniaklösung, die 46,74 g Ethylendiamintetraessigsäure pro Liter enthält, bei pH 5,8 konstant gehalten und bei einer Temperatur von 30°C, einer Umdrehungszahl von 2000 cm^-1 und einer Belüftungsrate von 1,5 V/V/m mit Luft begast bei einem konstanten Reaktordruck von 2 bar. Insgesamt werden 187 g Ethylendiamintetraessigsäure zugesetzt. Die Züchtung ist nach 130 Std. beendet. Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der erhaltene Rohextrakt enthält neben 3200 g n-Paraffin S, das recyclisiert wird, 84,85 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 40%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 78,28 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 60%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 4 Stickstoff-Limitierung

Ein 100-l-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem Intensor- System, wird mit 50 l Nährsalzlösung (Zusammensetzung: 50 g Hefeextrakt, 62 g Zitronensäure × 1 H₂O, 235,5 g (NH₄)₂SO₄, 25 g KH₂PO₄, 25 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 50 g 85%ige H₃PO₄, 2,5 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1 g FeCl₃ × 6 H₂O, 10 g FeSO₄ × 7 H₂O, 55 g MgSO₄ × 7 H₂O und 50 l Leitungswasser) versetzt, bei pH 3,0 und bei einer Temperatur von 121°C 30 min sterilisiert, nach Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit 4900 g n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt, der pH-Wert mit 10%iger NaOH-Lösung auf pH 5,8 eingestellt und mit 3000 ml einer 24 Std. alten Submerskultur von Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 beimpft. Während der Züchtung wird die Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Titration mit einer 10%igen NaOH-Lösung bei pH 5,8 konstant gehalten und bei einer Temperatur von 30°C, einer Umdrehungszahl von 2000 cm^-1 und einer Belüftungsrate von 1,5 V/V/m mit Luft begast bei einem konstanten Reaktordruck von 2 bar. Die Züchtung ist nach 140 Std. beendet. Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der erhaltene organische Rohextrakt enthält neben 3300 g n-Paraffin S, das recyclisiert werden kann, 37,9 g Trehalosee-6,6′-di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 209,6 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 5 Stickstoff-Limitierung und Temperaturshift

Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird wie in Beispiel 4 gezüchtet, jedoch wird die Züchtungstemperatur von 30°C nach 45 Std. Reaktionszeit innerhalb 20 min auf eine Temperatur von 21°C gesenkt und weitere 85 Std. bei dieser Temperatur die Submerskultur geführt. Die Extraktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der erhaltene organische Rohextrakt enthält neben 3500 g n-Paraffin S, das recyclisiert werden kann, 59,8 g Trehalose-6,6′-di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 330,9 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 6 Stickstoff-Limitierung, Temperaturshift und Ethambutolzusatz

Rhodococcus erythropolis DSM 43 215 wird wie in Beispiel 4 gezüchtet, jedoch wird nach Sterilisation der Nährsalzlösung aseptisch 0,75 g Ethambutol (d-N,N′-Bis(1-hydroxymethyl-propyl)-ethylendiamindihydrochlorid) zugesetzt und die Züchtungstemperatur von 30°C nach 70 Std. Reaktionszeit innerhalb 20 min auf eine Temperatur von 21°C gesenkt und weitere 115 Std. bei dieser Temperatur geführt. Die nach Beispiel 1 durchgeführte Extraktion ergibt einen organischen Rohextrakt, der neben 3400 g n-Paraffin S, das recyclisiert werden kann, 215,2 g Tetrahalose- 6,6′-di- und 6-monoester = 30%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, und 308,8 g Trehalose-2,2′,3,4- tetraester = 70%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid enthält.

Beispiel 7 Stickstoff-Limitierung

Arthrobacter spec. DSM 2567 wird bei 100 cm^-1 und 30°C in sieben 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen, die jeweils 100 ml eines Vorkulturmediums (Zusammensetzung: 30 g Saccharose, 10 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 3 g NaCl und 1 l destilliertes Wasser; pH 7 vor der Sterilisation) enthalten, angezüchtet. Nach 72 Std. Inkubation wird diese Kultursuspension in einen mit einem Blattrührer ausgerüsteten 10 l Bioreaktor übertragen, der mit 7 l folgender Nährlösung für 30 min bei einer Temperatur von 121°C sterilistiert worden ist: 11,5 g Maisquellwasser, 16,9 g Zitronensäure × 1 H₂O, 35 g (NH₄)₂SO₄, 25,8 g KH₂PO₄, 10 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 7 g 85%ige H₃PO₄, 10,7 g MgSO₄ × 7 H₂O, 0,28 g KCl, 3 g CaCl₂ × 2 H₂O, 1,75 g FeCl₃ × 6 H₂O und 7 l deionisiertes Wasser; pH 3,0. Nach Abkühlen auf eine Temperatur von 30°C ist dieses Medium vor der Beimpfung mit 540 g sterilem n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt und der pH-Wert mit 10%-iger NaOH-Lösung auf pH 6,2 eingestellt worden.

Während der Kultivierung wird die Submerskultur automatisch mit einer pH-Regulierstation durch Titration mit einer 10%-igen NaOH-Lösung bei pH 6,2 konstant gehalten und bei einer Temperatur von 30°C, einer Rührgeschwindigkeit von 350 cm^-1 und einer Belüftungsrate von 0,8 V/V/m mit Luft begast. Nach 144 Std. wird die Kultursuspension zweimal mit 14 l des Lösungsmittelgemisches Ch₂Cl₂/CH₃OH = 2 : 1 extrahiert und nach Einengen der organischen Phase 595 g Rückstand erhalten. Dieser Rohextrakt wird in 2 l CHCl₃ gelöst und anschließend mit 1 kg Kieselgel 60 30 min lang verrührt. Danach wird filtriert und das verbleibende Kieselgel zweimal mit 2 l CHCl₃ nachgespült. Nach Vereinigung der CHCl₃-Lösungen und Evakuieren des Lösungsmittels unter Vakuum resultieren 27 g n-Paraffin S, die recyclisiert werden können. Das Kieselgel wird zweimal mit 2 l CH₃OH gerührt, und nach Filtration werden die vereinigten organischen Extrakte eingeengt. Der Rückstand enthält 8,3 g Trehalose- 6,6′-di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, sowie 74,8 g Trehalose-2,2′,3,4- tetraester = 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid.

Beispiel 8 Stickstoff-Limitierung

Die Züchtung von Corynebacterium spec. DSM 2568 erfolgt bei 100 cm^-1 und pH 6,5 in insgesamt zehn 500 ml- Erlenmeyerkolben mit Schikanen, die jeweils 100 ml Kultursuspension enthalten (Zusammensetzung 0,2 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O, 0,05 g FeSO₄ × 7 H₂O, 0,3 g Maisquellwasser, 0,2 g KH₂PO₄, 0,5 g (NH₄)₂SO₄, 0,002 g MnSO₄ × 1 H₂O, 0,1 g MgSO₄ × 7 H₂O, 0,01 g CaCl₂ × 2 H₂O, 0,001 g ZnSO₄ × 7 H₂O und 100 ml destilliertes Wasser), die 20 min bei einer Temperatur von 121°C sterilisiert und nach Abkühlung auf eine Temperatur von 30°C mit 10 g sterilem n-Paraffin S (89% C-14, 9% C-15) versetzt werden. Jede 100 ml Kultur wird dabei mit 2 ml einer 72 Std. alten Vorkultur (Medium: wie in Beispiel 7 beschrieben) von Corynebacterium spec. DSM 2568 beimpft.

Während der Kultivierung wird der pH-Wert der Submerskultur täglich einmal mit steriler 1 N NaOH-Lösung auf pH 6,5 korrigiert. Eine nach 12 Tagen Inkubation erfolgte Extraktion der vereinigten Reaktionsansätze mit zweimal 2 l des Lösungsmittelgemisches CH₂Cl₂/CH₃OH = 2 : 1 führt nach Verdampfen der Lösungsmittel zu 70 g Rückstand, der an einer mit Kieselgel 60 gefüllten Glassäule (d _i = 4,5 cm, 40 cm hoch gepackt) chromatographiert wird. Mit CHCl₃ als Eluierungsmittel werden 65 g n-Paraffin S erhalten, die recyclisiert werden können. Aus der Eluierung mit CHCl₃/CH₃OH-Gemischen im Volumenverhältnis 5 : 1 bis 1 : 2 gehen 0,3 g Trehalose-6,6′- di- und 6-monoester = 10%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, sowie 2,6 g Trehalose-2,2′,3,4-tetraester = 90%, bezogen auf Gesamttrehaloselipid, hervor.

Das Gemisch aus Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern weist die folgenden ¹H-NMR spektroskopischen Daten auf (nachgereicht):

Die Kennzeichnung des Trehalose-2,2′3,4-tetraestergemischs über IR-Spektroskopie ergibt folgende Daten (nachgereicht):

Claims (3)

1. Gemische aus Trehalose-2,2′,3,4-tetraestern der allgemeinen Formel mit den Bedeutungen: und R₃ Wasserstoff oder Alkyl x = 4 bis 22
y = 1 bis 4
z = 4 bis 22mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R₁ ein Dicarbonsäurerest ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Gemische aus Trehalose- 2,2′,3,4-tetraestern nach Anspruch 1 durch Züchtung von Trehaloselipiden produzierenden und n-Alkan verwertenden Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoffe enthaltenden, wäßrigen Nährmedium mit einem bestimmten pH-Wert bei einer Temperatur von unter 50°C und anschließender Isolierung der Trehaloseester aus der Kultursuspension, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aerob bei einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 50°C unter Limitierung der Wachstumsgeschwindigkeit gezüchtet werden und daß als Mikroorganismen Rhodococcus erythropolis DSM 43215, Arthrobacter spec. DSM 2567 oder Corynebacterium spec. DSM 2568, eingesetzt werden und daß man als Kohlenwasserstoff Kerosin oder ein Gemisch aus etwa 89 Vol.% Kohlenwasserstoffen mit 14 C-Atomen und etwa 9 Vol.% Kohlenwasserstoffen mit 15 C-Atomen einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Kultursuspension durch Zugabe der wäßrigen Lösung einer stickstofffreien alkalischen Verbindung auf dem vorbestimmten Wert gehalten wird.