DE102013205986A1

DE102013205986A1 - Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern

Info

Publication number: DE102013205986A1
Application number: DE102013205986.8A
Authority: DE
Inventors: Rupert Pfaller
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2014-10-23
Also published as: WO2014161723A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten, herstellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketolase (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen).
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein), Glycerin, 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure (C3-Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4-Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2,3-Butandiol (C4-Bausteine). Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Baustein (C4-Plattformchemikalie) ist 2,3-Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3-Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 und in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351–364).
Aus dem mikrobiellen 2,3-Butandiol Biosyntheseweg (siehe Gleichungen (I) bis (III)) sind neben 2,3-Butandiol noch weitere Verbindungen mit vier C-Atomen fermentativ zugänglich, nämlich Acetoin und davon durch Oxidation abgeleitet auch Diacetyl. 2,3-Butandiol, Acetoin und Diacetyl werden daher im Folgenden zusammenfassend auch als C4-Produkte bezeichnet.
2,3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK). Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure ( US 2012288908 AA ) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2,3-Butandiol sind auch C8-Verbindungen denkbar, die Verwendung z. B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2,3-Butandiol ist bekannt (siehe Reviews von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 und Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351–364) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2,3-Butandiol: Reaktion der Acetolactatsynthase: Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von CO₂.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase: Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2,3-Butandioldehydrogenase): NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol.
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z. B. WO 12104234 A1 ). Um 2,3-Butandiol und auch andere C4- und C2-Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirtschaftlich, d. h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemischen Rohstoffen, herstellen zu können, ist Glucose nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff. Glucose ist eines der Basisprodukte in der Nahrungsmittelindustrie (vor allem hergestellt aus Stärke, Zuckerrohr oder Zuckerrübe) und wird mittlerweile auch verstärkt zur Bioethanol Herstellung eingesetzt. Bei der dadurch hervorgerufenen steigenden Nachfrage ist mit einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose zu rechnen. Da der Fermentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird verstärkt nach Alternativen gesucht. Da großtechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungsmittel darstellen, gibt es auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentationsrohstoffen.
Unter den alternativen Fermentationsrohstoffen fällt lignozellulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der Holzverarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Bestandteile der Lignozellulose zu finden.
Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Schwerpunkt bei der Verwertung von Lignozellulose ist die Gewinnung von Glucose aus Cellulose, v. a. zur fermentativen Gewinnung von Bioethanol. Die Gewinnung von Glucose aus Cellulose ist ein vergleichsweise aufwendiger und teurer Prozess, der gegenwärtig mit der konventionellen Herstellung aus Nahrungsmittelpflanzen nicht konkurrieren kann.
Hemicellulose ist nach der Cellulose das am häufigsten in der Natur vorkommende Polysaccharid (Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291) und daher als Quelle zur Gewinnung von Zucker für die Fermentation von großem Interesse.
Vergleichsweise einfach zugänglich sind die in der Hemicellulose enthaltenen Zucker, darunter vor allem die am häufigsten vorkommende Xylose und auch Arabinose. Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Hemicellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem pH oder enzymatisch mit Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Hemicellulose beruhen (Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291).
Xylose (vor allem D-Xylose, CAS Nummer 58-86-6) als Hauptbestandteil der Hemicellulose ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Kohlenhydrate. Xylose ist an sich ein Abfallstoff, der nur begrenzt Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie findet (z. B. zur Herstellung des Süßstoffes Xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol. Biotecanol. (2003) 30: 279–291) und wegen fehlender Verstoffwechslung der Xylose durch die industriell eingesetzten Fermentationshefen auch nicht zur Herstellung von Bioethanol im großtechnischen Maßstab geeignet ist.
Diese Faktoren, billiger und in großen Mengen verfügbarer Rohstoff, vergleichsweise einfache Isolierung und geringe Nachfrage nach alternativer Verwertung machen Xylose zu einem attraktiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol oder Acetoin und hier insbesondere bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3-Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation.
Verschiedene natürliche Produzenten von 2,3-Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z. B. Bäckerhefe).
Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2,3-Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725). Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe” und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z. B. in „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", S. 9 ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4-Produkten, insbesondere 2,3-Butandiol, sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-Butandiol Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe S1 sind Stämme der Art Raoultella terrigena oder Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis. In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gattung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analysiert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe in Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt. Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiella.
Nur für wenige der bekannten 2,3-Butandiol produzierenden Stämme ist eine fermentative Herstellung aus Xylose beschrieben. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologischen Sicherheitsstufe S2, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Die dabei erzielten C4-Ausbeuten betrugen 88 g/l für Xylose als C-Quelle und 112 g/l für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4-Ausbeute mit 6–8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^–1h^–1 (siehe 3 und 4 in Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Mit Xylose wurden also einerseits deutlich niedrigere 2,3-Butandiolausbeuten erzielt als mit Glucose als Fermentationsrohstoff und darüber hinaus war die für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wichtige Raum-Zeitausbeute niedrig.
Aufgrund der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege, Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosephosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2,3-Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose (Jansen et al., Biotechnol. Bioeng. (1984) 26: 362–369). Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4-Produkten Acetoin und 2,3-Butandiol als die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse.
US 7998722 offenbart rekombinante Stämme der Gattungen Zymomonas und Zymobacter mit verbesserter Xylose Verwertung. Die verbesserte Xylose Verwertung wird primär erreicht durch Expression eines Gens codierend eine Xyloseisomerase. Durch zusätzliche Expression der Gene einer Xylulokinase, sowie der Gene für eine Transketolase und eine Transaldolase wird die Xylose Verwertung weiter verbessert. Die so optimierten Stämme können für die Produktion der C2-Verbindung Ethanol aus Xylose verwendet werden. Offenbart werden Genkonstrukte, die vor allem die Expression der Xyloseisomerase verbessern und dadurch zu einer verbesserten Xylose Verwertung führen. US 7998722 offenbart, dass in Stämmen der Gattungen Zymomomonas und Zymobacter mindestens vier Gene, darunter die Gene der Transketolase und Transaldolase, überexprimiert werden müssen, um die Xylose Verwertung zu verbessern und solche Stämme für die Ethanolproduktion zu verwenden, die Produktion von C4-Produkten wird nicht angesprochen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketolase (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm. Solche Wildtypstämme sind z. B. offenbart in Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms").
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit ein bezüglich der 2,3-Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression der für die Enzyme Transketolase und Transaldolase kodierenden Gene gekennzeichnet ist. Der Produktionsstamm wird vorzugsweise aus dem Ausgangsstamm hergestellt.
Bevorzugte Ausgangsstämme sind Mikroorganismenstämme ausgewählt aus der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, Paenibacillus, Serratia oder Lactobacillus.
Besonders bevorzugte Ausgangsstämme sind Mikroorganismenstämme ausgewählt aus der Gattung Raoultella oder Klebsiella, insbesondere bevorzugt Raoultella terrigena. Diese Stämme sind käuflich erhältlich z. B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (38124 Braunschweig, Inhoffenstraße 7B). Dies gilt auch für den in den Beispielen verwendeten Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, welcher ein insbesondere bevorzugter Ausgangsstamm ist.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol, Acetoin oder Diacetyl, bevorzugt um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Bei den aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zuckern handelt es sich bevorzugt um Pentosen (C5-Zucker) und insbesondere bevorzugt um Xylose.
Transketolase (EC 2.2.1.1) und Transaldolase (EC 2.2.1.2) sind beides Enzyme aus dem nicht-oxidativen Teil des Pentosephosphatwegs. Sie sind unter anderem beteiligt an der Verstoffwechslung von D-Xylose. D-Xylose wird zuerst durch die Enzyme Xyloseisomerase und Xylulokinase zu D-Xylulose-5-Phosphat umgewandelt. Von D-Xylulose-5-Phosphat ausgehend erfolgt dann die weitere Verstoffwechslung, an der neben den Enzymen Ribulose-5-Phosphat Epimerase und Ribose-5-Phosphat Isomerase auch Transketolase und Transaldolase beteiligt sind. Es laufen folgende, in den Gleichungen (IV) bis (VIII) geschilderte Reaktionen ab.
Ribulose-5-Phosphat Epimerase:

D-Xylulose-5-Phosphat → D-Ribulose-5-Phosphat (IV)

Ribose-5-Phosphat Isomerase:

D-Ribulose-5-Phosphat → D-Ribose-5-Phosphat (V)

Transketolase:

D-Xylulose-5-Phosphat + D-Ribose-5-Phosphat → D-Seduheptulose-7-Phosphat + Glycerinaldehyd-3-Phosphat (VI)

Transaldolase:

D-Seduheptulose-7-Phosphat + Glycerinaldehyd-3-Phosphat → Fructose-6-Phosphat + Erythrose-4-Phosphat (VII)

Transketolase:

Erythrose-4-Phosphat + D-Xylulose-5-Phosphat → Fructose-6-Phosphat + Glycerinaldehyd-3-Phosphat (VIII)

In Summe entstehen bei der Transketolase und Transaldolase beinhaltenden Reaktionssequenz also aus drei Molekülen D-Xylose (C5-Zucker) zwei Moleküle Fructose-6-Phosphat (C6-Zucker) und ein Molekül Glyerinaldehyd-3-Phosphat (C3-Verbindung), beides Zwischenstufen der Glykolyse und somit dem zentralen Stoffwechsel verfügbar.
Bei den gleichzeitig überexprimierten Genen der Transketolase (Tkt Gen) und Transaldolase (Tal Gen) handelt es sich um Gene, die für Enzyme der Enyzmklassen EC 2.2.1.1 (Transketolase) und EC 2.2.1.2 (Transaldolase) kodieren und entsprechend der Gleichungen (VI), (VII) und (VIII) an der Verstoffwechslung von D-Xylose zu Fructose-6-Phosphat und Glycerinaldehyd-3-Phosphat beteiligt sind. Dabei kann es sich bei den überexprimierten Genen der Transketolase und Transaldolase entweder um homologe oder heterologe Gene handeln. Bevorzugt handelt es sich um homologe Gene.
Wie im 4. und 6. Beispiel offenbart, ist die alleinige Expression entweder einer Transketolase noch einer Transaldolase nicht ausreichend, um die Ausbeute an C4-Produkten zu erhöhen. Eine Verbesserung der Ausbeute an C4-Produkten wird erst durch gleichzeitige Überexpression einer Transketolase und Transaldolase erreicht.
In einer bevorzugten Ausführung stammen das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammen das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt sind das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687. Das Tkt Gen hat die SEQ ID NO: 1 und kodiert für ein Transketolase Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2.
Das Tal Gen hat die SEQ ID NO: 3 und kodiert für ein Transaldolase Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4.
Die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolasegene führt zu Produktionsstämmen mit erhöhten Enzymaktivitäten der Transketolase und Transaldolase, wie im 3. Beispiel beschrieben. Dabei sind Stämme bevorzugt, bei denen die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolasegene die Enzymaktivität der Transketolase und Transaldolase jeweils um mindestens den Faktor 2, bevorzugt um mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 im Vergleich zur Enzymaktivität im Ausgangsstamm erhöht.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt (5. und 7. Beispiel), ist die gleichzeitige Überexpression der Gene einer Transketolase und einer Transaldolase im erfindungsgemäßen Produktionsstamm dazu geeignet, bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation oder der Anzucht im Schüttelkolben die Ausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin, und davon bevorzugt 2,3-Butandiol, um mehr als 20%, bevorzugt 40% und insbesondere bevorzugt um mehr als 60% im Vergleich zum Ausgangsstamm zu steigern. Gleichzeitig verringert sich in der Fermentation der Anteil des Nebenprodukts Acetat um mindestens 30%, bevorzugt um mindestens 60% und besonders bevorzugt um 80% im Vergleich zum Ausgangsstamm.
Die Erhöhung der Expression der Transketolase- und Transaldolasegene im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes (z. B. die Promotoraktivitäten steigernde Mutationen) oder durch gleichzeitige Überexpression homologer oder aber auch heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm.
Bevorzugt ist die gleichzeitige Überexpression homologer oder heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm.
Insbesondere bevorzugt ist die gleichzeitige Überexpression homologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm.
Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen natürlicherweise zur 2,3-Butandiol Produktion befähigten Wildtypstamm (wie z. B. zusammengefasst in Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725, Kapitel 4, „Microorganisms"), der darüberhinaus bereits anderweitig in Bezug auf die 2,3-Butandiol Produktion optimiert worden sein kann. Bei einem bereits z. B. durch einen gentechnischen Eingriff optimierten Wildtypstamm ist die Expression der Transketolase und der Transaldolase jedoch nicht von der Optimierung betroffen.
Die Erhöhung der Expression der Transketolase- und Transaldolasegene im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes (z. B. die Promotoraktivitäten steigernde Mutationen) oder durch gleichzeitige Überexpression homologer oder aber auch heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstrukts in einen der genannten Ausgangsstämme.
Das Genkonstrukt besteht in seiner einfachsten Form aus den für eine Transketolase und eine Transaldolase kodierenden Strukturgenen, denen operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Transketolase, bzw. Transaldolase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläufige „Tac-Promotor”.
Die Strukturgene der Transketolase und Transaldolase können in sog. Operonform auch zusammen in einem Genkonstrukt angeordnet sein (Konstrukt pTkt-Tal, siehe 6).
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können.
Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstammes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist.
Das Genkonstrukt, wird in an sich bekannter Weise durch genetische Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85: 1301–1313), darunter beispielsweise die Elektroporation.
Zur Selektion transformierter Produktionsstämme enthält das Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen Selektionsmarker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus Antibiotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarkern.
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol, Neomycin oder Zeocin verleihen.
Insbesondere bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, die Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin verleihen.
In der vorliegenden Erfindung enthält der erfindungsgemäße Produktionsstamm gleichzeitig die Genkonstrukte einer Transketolase und einer Transaldolase, entweder als Einzelkonstrukte in einem Zweiplasmidsystem oder in einem Einplasmidsystem. Dabei können in einem Einplasmidsystem die Genkonstrukte der Transketolase und Transaldolase getrennt oder in Operonstruktur (siehe 1. Beispiel und 6, Plasmid pTkt-Tal) angeordnet sein. Bei getrennter Anordnung erfolgt die Transkription der beiden Gene jeweils von einem eigenen Promotor, bei einer Operonstruktur werden beide Gene zusammen von einem Promotor transkribiert.
Dem Fachmann ist geläufig, dass in einem Zweiplasmidsystem die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte unterschiedliche Selektionsmarker enthalten müssen, bevorzugt unterschiedliche Antibiotika-Resistenzmarker, um Stämme zu selektieren, die gleichzeitig die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte enthalten.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform gleichzeitig die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte, entweder als Einzelkonstrukte oder in Operonform. Diese Konstrukte liegen im Produktionsstamm entweder in Plasmidform vor oder in das Genom integriert und produzieren gleichzeitig ein Transketolase Enzym und ein Transaldolaseenzym, jeweils in rekombinanter Form. Bevorzugt ist die Plasmidform.
Die rekombinanten Transketolase und Transaldolase Enzyme sind in der Lage, C-5 Zucker, bevorzugt Xylose, über den Pentosephosphatweg in C6- und C3-Verbindungen umzuwandeln und in den Glykolyse Stoffwechselweg einzuschleusen. Nun wurde überraschend gefunden, dass durch gleichzeitige rekombinante Expression der Transketolase- und Transaldolase Enzyme im Produktionsstamm die Ausbeute an C4-Produkten, insbesondere 2,3-Butandiol, gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Die Erfindung betrifft ferner ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von C4-Produkten aus C5-Zuckern.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm in einem Anzuchtsmedium kultiviert, wird. Dabei werden einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits die C4-Produkte, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4-Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab).
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 l besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 l insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die C4-Produktbildung, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, optimiert werden.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Pentosen wie z. B. Xylose, Arabinose, oder Ribose sowie Pentosen enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse wie z. B. Zuckerrohrbagasse, Getreidestroh oder Abfällen der Mais- oder Holzverarbeitung, bzw. der darin enthaltenen Hemicellulose gewonnen werden können. Dabei kann die Hydrolyse der Lignozellulose-haltigen Biomasse dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Xylose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
Für das erfindungsgemäße Produktionsverfahren geeignete C-Quellen umfassen somit sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydrolysate durch thermischen, chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können.
Die Verwendung der bevorzugten und besonders bevorzugten C-Quellen schließt also nicht aus, dass die erfindungsgemäßen C-Quellen im Gemisch mit anderen, nicht erfindungsgemäßen C-Quellen im Anzuchtsmedium vorkommen. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z. B. Glucose, Mannose oder Fructose. Die C-Quellen umfassen aber auch Disaccharide, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose. Weiter betroffen sind alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N-Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO₃, NaNO₃, Ammoniumnitrat, Ca(NO₃)₂, Mg(NO₃)₂ sowie andere N-Quellen wie z. B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z. B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C4-Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Xylose oder Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltigen Biomasseabfällen gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO₃, NaNO₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der geeignete pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur C4-Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4-Produkt, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C4-Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4-Produkts, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z. B. DE 10 2011 004 915 ), Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das C4-Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4-Produkte, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide.
1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 2,9 kb großen Expessionsvektor pKKj.
2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5 kb großen Transketolase Expessionsvektor pTkt.
3 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,8 kb großen Transaldolase Expessionsvektor pTal.
4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 4,3 kb großen Transaldolase Expessionsvektor pTal-tet.
5 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,3 kb großen Expessionsvektor pKKj-tet.
6 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 6 kb großen Expessionsvektor pTkt-Tal für die gleichzeitige Expression des Transketolase- und Transaldolase Gens.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
1. Beispiel: Herstellung von Transketolase und Transaldolase Expressionsvektoren
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stammentwicklung wurde Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
Verwendet wurden die Transketolase und Transaldolase Gene aus R. terrigena. Die DNS-Sequenzen der Gene aus R. terrigena sind offenbart in SEQ ID NO: 1 (Tansketolase), kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, und in SEQ ID NO: 3 (Transaldolase), kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4.
Gene der Transketolase (Tkt-Gen) und Transaldolase (Tal-Gen) wurden in PCR-Reaktionen (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus genomischer R. terrigena DNS (Stamm DSM 2687,) isoliert.
Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von R. terrigena DSM 2687 in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) gewonnen worden.
Für die PCR-Reaktionen wurden folgende Primer verwendet:
Transketolase (Tkt-Gen): Primer Tkt-1f (SEQ ID NO: 5) und Tkt-2r (SEQ ID NO: 6)
Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen:
Transaldolase (Tal-Gen): Primer Tal-1f (SEQ ID NO: 7) und Tal-2r (SEQ ID NO: 8)
Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen:
Das Tansketolase Gen wurde bei der PCR-Reaktion als 2100 bp DNS-Fragment isoliert. Zur nachfolgenden Klonierung in den mit Eco RI und Hind III geschnittenen Expressionsvektor pKKj wurden das Tkt PCR-Produkt mit Mfe I (in Primer Tkt-1f enthalten, kompatibel mit Eco RI) und Hind III (in Primer Tkt-2r enthalten) nachverdaut. Expressionsvektor pKKj ist offenbart in DE 10 2011 003 394 . pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugriffnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262–1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz), wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj (1) entstand.
Bei der Klonierung des Transketolase Gens in den pKKj Vektor entstand der 5 kb große Vektor pTkt (2), in dem das Transketolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft ist und der zur Expression des Transketolase Gens in R. terrigena geeignet ist.
Das Tansaldolase Gen wurde bei der PCR-Reaktion als 950 bp DNS-Fragment isoliert. Zur nachfolgenden Klonierung in den mit Eco RI und Pst I geschnittenen Expressionsvektor pKKj wurde das Tal PCR-Produkt mit Eco RI (in Primer Tal-1f enthalten) und Pst I (in Primer Tal-2r enthalten) nachverdaut. Es entstand der 3,8 kb große Vektor pTal (3), in dem das Transaldolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft ist und der zur Expression des Transaldolase Gens in R. terrigena geeignet ist.
Expressionsvektor pTal-tet:
Das mit Eco RI und Pst I nachverdaute 950 bp PCR-Produkt des Transaldolase Gens wurde zusätzlich in den zuvor mit Eco RI und Pst I geschnittenen Expressionsvektor pKKj-tet kloniert. Dabei entstand der 4,3 kb große Expessionsvektor pTal-tet (4).
pKKj-tet ist offenbart in DE 10 2011 003 386 . Zu dessen Herstellung wurde zuerst aus pKKj das Ampicillin Resistenzgen als 1 kb Fragment durch Verdau mit Bsp HI entfernt. In das verbliebene 1,9 kb Vektorfragment wurde das Tetracyclin Resistenzgen als 1,45 kb Fragment kloniert. Das Tetracyclin Resistenzgen war vorher aus dem Plasmid pACYC184 durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) isoliert worden. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zugänglich in der „Genbank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer X06403.1. Es entstand der 3,3 kb große Expressionsvektor pKKj-tet (5).
Expressionsvektor pTkt-Tal:
Der Expressionsvektor pTal wurde mit Eco RI verdaut und das 3,8 kb linearisierte Vektorfragment isoliert. Das Tkt Genfragment wurde, wie beim Expressionsvektor pTkt beschrieben, in einer PCR-Reaktion aus genomischer R. terrigena DNS mit den Primern Tkt-1f (SEQ ID NO: 5) und Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) als 2,1 kb Fragment isoliert. Primer Tkt-3r enthielt neben einer Mfe I Schnittstelle (kompatibel mit Eco RI zur nachfolgenden Klonierung in den Vektor pTal) und dem 3'-Ende des Tkt-Gens auch eine Ribosomenbindestelle (RBS, siehe 6) für die Produktion des sich im Vektor pTkt-Tal anschließenden Tal-Gens (sog. künstliches Operon).
Primer Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) hatte folgende DNS-Sequenz:
Das 2,1 kb Tkt-Genfragment wurde mit Mfe verdaut und in den mit Eco RI geschnittenen Vektor pTal kloniert. Es entstand der 6 kb große Expressionsvektor pTkt-Tal (6). Von den erhaltenen Klonen wurden solche ausgewählt, bei denen das Transketolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft war, d. h. das Transketolase Gen war in der gleichen Orientierung wie das Transaldolase Gen eingebaut (siehe 6).
In pTkt-Tal sind das Transketolase- und das Transaldolase Gen als künstliches Operon angeordnet. Ihre Expression steht unter Kontrolle des tac-Promotors.
2. Beispiel: Vergleichende Fermentation des Ausgangsstammes Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Verwendet wurden „Labfors II” Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 l (3 l Fermentervolumen). Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des PO₂ und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlösung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm), Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute), pO₂ (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100% kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt), pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenterhersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73% Glucose, w/v oder 75% Xylose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose, bzw. Xylose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20–25% v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
Der in der Fermentation eingesetzte Stamm war Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 (Kontrollstamm R.t.-WT). Batch-Fermentationsmedien waren FM2-G (C-Quelle Glucose) und FM2-X (C-Quelle Xylose).
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/l; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeSO₄ × 7H₂O 75 mg/l; Na₃Citrat × 2H₂O 1 g/l; CaCl₂ × 2H₂O 14,7 mg/l; MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l; KH₂PO₄ 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/l. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/l) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H₃BO₃ 2,5 g/l; CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l; CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l; MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l; ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l und Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l.
Je 1,35 l FM2-G, bzw. FM2-X Medium wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD₆₀₀ als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec^TM 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Fermenterproben wurde bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose.
Die Bestimmung des Gehalts an C4-Produkten (2,3-Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹H-NMR (siehe z. B. DE 10 2011 003 394 ). Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5.000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D₂O gemischt. Die ¹H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140–0,145 ppm (9H)

2,3-Butandiol: 1,155–1,110 ppm (6H)

Ethanol: 1,205–1,157 ppm (3H)

Essigsäure: 2,000–1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238–2,200 ppm (3H)
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose, bzw. Xylose verbraucht waren, wurden jeweils über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) Feedlösungen von Glucose (73% w/v), bzw. Xylose (75% w/v) zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose-, bzw. Xylose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 1 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT mit Glucose und Xylose als C-Quelle der Fermentation. Tabelle 1: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose und Xylose als C-Quelle

		C-Quelle Glucose	C-Quelle Xylose
Zeit (h)	Produkt	(g/l)	(g/l)
24	2,3-BDL	72,5	44,6
	Acetoin	2,6	13,1
	Acetat	1,5	9,1
	Ethanol	6,3	2,2
48	2,3-BDL	109,7	61,8
	Acetoin	6,3	16,0
	Acetat	3,5	19,9
	Ethanol	5,3	1,7
72	2,3-BDL	117,1	62,1
	Acetoin	6,9	17,7
	Acetat	3,7	23,0
	Ethanol	5,4	1,6

Bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation anstelle von Glucose wurde eine deutliche Verschiebung des Produktspektrums beobachtet. Mit Xylose als C-Quelle wurde deutlich weniger 2,3-Butandiol gebildet, während sich der Anteil des zweiten C4-Produkts Acetoin (das dritte mögliche C4-Produkt Diacetyl war nicht nachweisbar) erhöhte. Jedoch war mit Xylose als C-Quelle die Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin nach 72 h mit 1,1 gl^–1h^–1 deutlich höher als nach dem Stand der Technik bei Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 (ca. 0,6 gl^–1h^–1, wie dort aus 3 und 4 entnommen).
Bei den C2-Produkten wurde eine starke Zunahme von Acetat beobachtet und eine Abnahme von Ethanol. Die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentose Phosphatweg führt offensichtlich zu einem deutlich anderen Produktspektrum als die von Glucose über die Glykolyse.
3. Beispiel: Expression der Transketolase und Transaldolase Gene in Raoultella terrigena
Ausgangsstamm war Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687. Die Transformation mit den Plasmiden pKKj (Leervektor), pTkt, pTal, pTal-tet und pTkt-Tal erfolgte in an sich bekannter Weise (siehe z. B. DE 10 2011 003 394 ), analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Die dabei erhaltenen Stämme erhielten die Bezeichnungen R.t.-pKKj (Kontrollstamm), R.t.-pTkt (Transketolase), R.t.-pTal (Transaldolase), R.t.-pTal-tet (Transaldolase), R.t.-pTkt-Tal (Transketolase-Transaldolase Operonkonstrukt) sowie R.t.-pTkt-pTal. Beim Stamm R.t.-pTkt-pTal handelte es sich um ein Zweiplasmidsystem zur gleichzeitigen Expression der Transketolase und Transaldolase in einem Stamm, erhalten durch Transformation von R. terrigena mit den Vektoren pTkt (Ampicillin Selektion) und pTal-tet (Tetracyclin Selektion).
Transformanten wurden isoliert und die rekombinante Expression der Tkt- und Tal Gene durch Schüttelkolbenanzucht untersucht, indem einerseits die jeweilige Enzymaktivität und andererseits die Produktion der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol bestimmt wurde. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert. Abhängig vom Stamm enthielten die Medien als selektive Antibiotika entweder Ampicillin (FM2-G-amp, bzw. FM2-X-amp) oder Tetracyclin (FM2-G-tet, bzw. FM2-X-tet), bzw. Ampicillin und Tetracyclin (FM2-G-tet+amp, bzw. FM2-X-tet+amp). FM2-G Medium und FM2-X Medium sind im 2. Beispiel beschrieben. Abhängig vom Expressionsvektor enthielten die Medien Ampicillin (200 mg/l, FM2-G-amp und FM2-X-amp), Tetracyclin (15 mg/l, FM2-G-tet und FM2-X-tet), bzw. beide Antibiotika zusammen (FM2-G-tet+amp und FM2-X-tet+amp).
In einem ersten Experiment wurde die Expression der Transketolase- und Transaldolase Gene exemplarisch überprüft für R. terrigena DSM 2687, transformiert entweder mit pKKj (Stamm R.t.-pKKj, Kontrollstamm), pTkt (Stamm R.t.-pTkt) oder mit pTal (Stamm R.t.-pTal). Je 50 ml FM2-G-amp wurden beimpft mit dem Kontrollstamm R.t.-pKKj (Negativkontrolle) sowie mit R.t.-pTkt und R.t.-pTal.
Nach 24 h Inkubation bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) wurde das Zellwachstum photometrisch bei 600 nm Wellenlänge (OD₆₀₀) bestimmt und in an sich bekannter Weise die Proteinzusammensetzung der drei Stämme durch SDS-PAGE bestimmt (SDS-PAGE: Natrium-Dodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese). Verwendet wurde das käuflich erhältliche SDS-PAGE System Novex^® NuPAGE mit 12% Bis-Tris Gelen der Fa. LifeTechnologies.
Zur Probenvorbereitung für die SDS-PAGE wurde aus den Schüttelkolbenkulturen jeweils ein Aliquot entsprechend einer Zelldichte OD₆₀₀ von 2 entnommen (ca. 0,2 ml), in 0,4 ml SDS- und β-Mercaptoethanol-haltigem Probenpuffer (Novex^® „Tris-Glycine SDS Sample Buffer” der Fa. Invitrogen) aufgelöst, 3 min bei 94°C inkubiert und dann 10 μl einer jeden Probe auf benachbarten Spuren eines Polyacrylamidgels aufgetragen und in bekannter Weise durch Elektrophorese getrennt. Als Größenstandard wurde ein Mix von Proteinen bekannter Größe in einer weiteren Spur aufgetragen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die im Gel entsprechend ihrer Größe getrennten Proteine in bekannter Weise durch den Farbstoff Coomassie Brilliant Blue gefärbt.
Ein Vergleich der Proteinmuster ergab, dass gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj (Negativkontrolle) bei den Stämmen R.t.-pTkt, R.t.-pTkt-Tal und R.t.-pTkt-pTal die Überexpression des Transketolasegens zur Verstärkung einer Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 70 kD (relatives Molekulargewicht von 70.000 Dalton) und bei den Stämmen R.t.-pTal-tet, R.t.-pTkt-Tal und R.t.-pTkt-pTal die Überexpression des Transaldolasegens zur Verstärkung einer Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 35 kD (relatives Molekulargewicht von 35.000 Dalton) führte.
Die restlichen Zellen der Schüttelkolbenanzuchten (ca. 50 ml Volumen) wurden in einem zweiten Experiment zur Bestimmung der Enzymaktivitäten der rekombinant exprimierten Transketolase und Transaldolase im Vergleich zum Kontrollstamm verwendet. Die Bestimmung der Enzymaktivitäten der Transketolase und Transaldolase erfolgte entsprechend dem Stand der Technik (Josephson and Fraenkel, J. Bacteriol. (1969) 100: 1289–1295).
Der Transketolase Enzymtest beruht auf Gleichung (VI), bei der aus D-Xylulose-5-Phosphat und D-Ribose-5-Phosphat als eines der Reaktionsprodukte Glycerinaldehyd-3-Phosphat entsteht. Glycerinaldehd-3-Phosphat wird durch das im Test enthaltene Enzym Triosephosphatisomerase zu Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt, welches schließlich durch das ebenfalls im Test enthaltene Enzym Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH reduziert wird.
Der Transaldolase Enzymtest beruht auf der Rückreaktion von Gleichung (VII), bei der aus Fructose-6-Phosphat und Erythrose-4-Phosphat als eines der Reaktionsprodukte Glycerinaldehyd-3-Phosphat entsteht. Glycerinaldehyd-3-Phosphat wird durch das im Test enthaltene Enzym Triosephosphatisomerase zu Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt, welches schließlich durch das ebenfalls im Test enthaltene Enzym Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH reduziert wird.
Je 50 ml der Zellen aus der Schüttelkolbenanzucht wurden zentrifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor), das Zellpellet in 2 ml Tris-Puffer (0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,01 M MgCl₂ × 6H₂O) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog. „French^®Press” Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Transketolase-, bzw. Transaldolase-Aktivität verwendet.
Spektralphotometrische Bestimmung der Transketolase-Aktivität:
Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung der Transketolase-Aktivität (Komponenten des Enzymtests alle von der Fa. Sigma-Aldrich) war zusammengesetzt aus Tris-Puffer, 0,5 mM Ribose-5-Phosphat, 0,5 mM Xylulose-5-Phosphat, 0,2 mM NADH und 10 μg einer Enyzmmischung bestehend aus α-Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase und Triosephosphatisomerase (Sigma-Aldrich) sowie Transketolase-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe eines Mixes der Substrate Ribose-5-Phosphat und Xylulose-5-Phosphat (Mix jeweils 20-fach konzentriert) und die Extinktionsabnahme infolge des Verbrauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADH: ε = 0,63 × 10⁴ l × Mol^–1 × cm^–1). Ein Unit Transketolase-Aktivität ist definiert als der Verbrauch von 1 μmol NADH/min unter Testbedingungen.
Spektralphotometrische Bestimmung der Transaldolase-Aktivität:
Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung der Transaldolase-Aktivität (Komponenten des Enzymtests alle von der Fa. Sigma-Aldrich) war zusammengesetzt aus Tris-Puffer, 0,3 mM Erythrose-4-Phosphat, 0,4 mM Fructose-6-Phosphat, 0,2 mM NADH und 10 μg einer Enyzmmischung bestehend aus α-Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase und Triosephosphatisomerase (Sigma-Aldrich) sowie Transaldolase-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe eines Mixes der Substrate Erythrose-4-Phosphat und Fructose-6-Phosphat (Mix jeweils 20-fach konzentriert) und die Extinktionsabnahme infolge des Verbrauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADH: ε = 0,63 × 10⁴ l × Mol^–1 × cm^–1). Ein Unit Transaldolase-Aktivität ist definiert als der Verbrauch von 1 μmol NADH/min unter Testbedingungen.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay” der Fa. BioRad bestimmt.

Die unter Messbedingungen bestimmten Enzymaktivitäten sind in Tabelle 2 und 3 aufgeführt. Tabelle 2: Enzymaktivität rekombinanter, Transketolase überexprimierender R. terrigena Stämme

Stamm	Konstrukt	Transketolase (U/mg)	relative Aktivität
R.t.-pKKj	pKKj, Kontrolle	0,06	1
R.t.-pTkt	pTkt	1,63	27,2
R.t.-pTkt-Tal	pTkt-Tal	1,47	24,5
R.t.-pTkt-pTal	pTkt + pTal-tet	1,58	26,3

Tabelle 3: Enzymaktivität rekombinanter, Transaldolase überexprimierender R. terrigena Stämme

Stamm	Konstrukt	Transaldolase (U/mg)	relative Aktivität
R.t.-pKKj	pKKj, Kontrolle	0,12	1
R.t.-pTal-tet	pTal-tet	2,94	24,5
R.t.-pTkt-Tal	pTkt-Tal	2,27	18,9
R.t.-pTkt-pTal	pTkt + pTal-tet	2,51	20.9

Wie in den Tabellen 2 und 3 angegeben, wird die Transketolaseaktivität in rekombinanten R. terrigena Stämmen durch Überexpression um den Faktor 24,5–27,2 erhöht, die Transaldolaseaktivität in rekombinanten R. terrigena Stämmen um den Faktor 18,9–24,5.
4. Beispiel: Vergleichende Schüttelkolbenanzucht rekombinanter R. terrigena Stämme mit Glucose und Xylose als C-Quelle

Die Kultivierung der Stämme R.t.-pKKj, R.t.-pTkt und R.t.-pTal erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Kulturmedien (siehe 2. Beispiel) waren jeweils FM2-G-amp (Glucosemedium), bzw. FM2-X-amp (Xylosemedium). Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose- und Xylosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40% (w/v) Stocklösungen nachgefüttert. In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht. Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 4, für die C-Quelle Xylose in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 4: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle

Zeit (h)	Produkt	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt (g/l)	R.t.-pTal (g/l)
48	2,3-BDL	26,4	21,0	29,0
	Acetoin	6,8	7.5	5,2
	Acetat	2,0	1,8	1,7
	Ethanol	4,0	2,8	4,2
72	2,3-BDL	43,5	37,0	39,5
	Acetoin	8,1	7,5	6,9
	Acetat	2,4	2,0	2,1
	Ethanol	5,2	3,7	5,0
96	2,3-BDL	57,1	57,2	50,8
	Acetoin	7,6	6,4	6,9
	Acetat	2,3	2,0	2,1
	Ethanol	6,1	5,0	5,7

Tabelle 5: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle

Zeit (h)	Produkt	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt (g/l)	R.t.-pTal (g/l)
48	2,3-BDL	25,0	24,2	24,1
	Acetoin	3,3	4,5	3,1
	Acetat	3,5	3,8	2,9
	Ethanol	3,6	3,9	3,7
72	2,3-BDL	26,8	26,7	28,6
	Acetoin	3,9	5,1	4,2
	Acetat	5,0	5,1	4,8
	Ethanol	3,3	3,2	3,5
96	2,3-BDL	26,1	26,6	25,1
	Acetoin	4,5	5,7	6,4
	Acetat	5,3	5,9	5,4
	Ethanol	3,0	3,0	3,1

Wie aus den Tabellen 4 und 5 ersichtlich, resultierte die alleinige Überexpression des Transketolase Gens wie auch des Transaldolase Gens in keiner signifikanten Veränderung des Spektrums an C4-Produkten (2,3-Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol). Dies war unabhängig davon, welche C-Quelle verwendet wurde. Xylose als C-Quelle führte in der Schüttelkolbenanzucht jedoch zu deutlich niedrigeren Ausbeuten an C4-Produkten, insbesondere von 2,3-Butandiol, als Glucose (siehe auch 2. Beispiel).
5. Beispiel: Schüttelkolbenanzucht des rekombinanten R. terrigena Stammes R.t.-pTkt-Tal mit Glucose und Xylose als C-Quelle

Die Kultivierung der Stämme R.t.-pKKj und R.t.-pTkt-Tal (Operon Konstrukt, siehe 1. Beispiel) erfolgte wie im 4. Beispiel beschrieben. Kulturmedien (2. Beispiel) waren jeweils FM2-G-amp (Glucosemedium), bzw. FM2-X-amp (Xylosemedium). Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose- und Xylosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40% (w/v) Stocklösungen nachgefüttert. In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht. Die Produktionsverläufe sowohl für die C-Quelle Glucose wie für Xylose sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6: Produktionsverlauf der rekombinanten Raoultella terrigena Stämme R.t.-pKKj und R.t.-pTkt-Tal mit Glucose, bzw. Xylose als C-Quelle

	C-Quelle	Glucose		Xylose
Zeit (h)	Produkt	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt-Tal (g/l)	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt-Tal (g/l)
48	2,3-BDL	26,6	25,9	20,9	18,5
	Acetoin	6,1	7,6	2,2	4,8
	Acetat	2,2	2,4	3,1	2,4
	Ethanol	3,3	3,2	3,7	3,4
72	2,3-BDL	38,5	38,9	25,2	29,2
	Acetoin	9,1	9,1	3,4	3,7
	Acetat	2,3	2,6	4,2	3,9
	Ethanol	4,0	4,0	4,0	3,3
96	2,3-BDL	50,8	49,1	28,2	37,7
	Acetoin	9,3	10,1	3,8	3,9
	Acetat	2,6	2,6	4,6	4,1
	Ethanol	4,7	4,8	3,6	3,3

Wie in Tabelle 6 dargestellt, waren die Ausbeuten an C4- und C2-Produkten des Transketolase und Transaldolase gleichzeitig rekombinant produzierenden Stammes R.t.-pTkt-Tal vergleichbar mit dem Kontrollstamm R.t.-pKKj, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde. Wurde hingegen Xylose als C-Quelle verwendet war im Ansatz mit Stamm R.t.-pTkt-Tal, in dem gleichzeitig die Gene der Transketolase und Transaldolase überexprimiert wurden (Operonkonstrukt), eine signifikante Steigerung der 2,3-Butandiol Ausbeute von 30 bis 40% gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj zu beobachten. Diese unerwartete Steigerung war besonders ausgeprägt für die 2,3-Butandiol Produktion, da die Ausbeuten der anderen Produkte, Acetoin, Acetat und Ethanol unter diesen Bedingungen kaum verändert waren.
6. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit Transketolase und Transaldolase überexprimierenden R. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fermentation erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren die im 3. Beispiel beschriebenen R.t.-pKKj (Kontrollstamm), R.t.-pTkt (Transketolasestamm) und R.t.-pTal (Transaldolasestamm). Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X-amp Medium.
1,35 l des FM2-X-amp Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G-amp hergestellt (siehe 2. Beispiel). Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 75% (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 7 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-pKKj und in den rekombinanten, Transketolase, bzw. Transaldolase überproduzierenden Raoultella terrigena Stämmen R.t.-pTkt, bzw. R.t.-pTal. Tabelle 7: Produktionsverlauf rekombinanter R. terrigena Stämme in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle

Zeit (h)	Produkt	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt (g/l)	R.t.-pTal (g/l)
24	2,3-BDL	46,4	45,56	38,3
	Acetoin	8,0	7,3	8,2
	Acetat	11,9	7,3	10,3
	Ethanol	3,2	1,4	0,0
48	2,3-BDL	59,7	53,8	52,7
	Acetoin	17,1	21,4	12,4
	Acetat	22,1	11,7	12,0
	Ethanol	1,4	1,3	1,0
72	2,3-BDL	60,6	61,2	55,1
	Acetoin	18,9	17,6	13,9
	Acetat	29,9	16,3	15,2
	Ethanol	1,9	2,1	1,5

Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4. Beispiel), führte die alleinige Überexpression des Transketolase- bzw. Tansaldolase Gens zu keiner signifikanten Veränderung des Produktspektrums. Durch alleinige Überexpression der Transketolase, bzw. Transaldolase konnte die Ausbeute an 2,3-Butandiol oder der anderen Produkte nicht signifikant verbessert werden. Im Gegenteil wurde die Produktausbeute im Transaldolase überexprimierenden Stamm R.t.-pTal eher verringert.
7. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit den gleichzeitig Transketolase und Transaldolase überexprimierenden rekombinanten R. terrigena Stämmen R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fed-Batch Fermentation der Stämme R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal mit Xylose als C-Quelle wurde durchgeführt wie im 6. Beispiel beschrieben. Als Kontrollstamm wurde R.t.-pKKj verwendet. Die Herstellung der verwendeten rekombinanten Stämme wurde im 3. Beispiel beschrieben. Vorkultur (FM2-G-amp) und Batchmedium (FM2-X-amp) der Stämme R.t.-pKKj und R.t.-pTkt-Tal enthielten Ampicillin (siehe 3. Beispiel). Vorkultur (FM2-G-tet+amp) und Batchmedium (FM2-X-tet+amp) bei der Fermentation des mit den beiden Plasmiden pTkt und pTal-tet transformierten Stammes R.t.-pTkt-pTal enthielten sowohl Ampicillin und Tetracyclin (siehe 3. Beispiel).

Tabelle 8 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-pKKj und in den rekombinanten, gleichzeitig Transketolase und Transaldolase überproduzierenden Raoultella terrigena Stämmen R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal. Tabelle 8 Produktionsverlauf der rekombinanten R. terrigena Stämme R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle

Zeit (h)	Produkt	R.t.-pKKj (g/l)	R.t.-pTkt-pTal (g/l)	R.t.-pTkt-Tal (g/l)
24	2,3-BDL	44,6	43,8	58,8
	Acetoin	13,1	6,9	4,5
	Acetat	9,1	7,0	6,8
	Ethanol	2,2	2,4	2,9
48	2,3-BDL	56,7	69,7	68,8
	Acetoin	14,2	16,0	13,3
	Acetat	13,2	3,2	10,2
	Ethanol	1,9	2,2	2,6
72	2,3-BDL	57,5	104,1	89
	Acetoin	21,3	10,1	15,9
	Acetat	28,3	4,7	19,5
	Ethanol	2,0	2,2	1,6

Im Gegensatz zu den rekombinanten Stämmen R.t.-pTkt und R.t.-pTal, in denen jeweils nur eines der beiden Gene überexprimiert war (6. Beispiel), zeichneten sich die erfindungsgemäßen Stämme R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal, in denen sowohl das Transketolase- und das Transaldolase Gen überexprimiert wurden, bei der Fermentation mit Xylose als C-Quelle durch eine signifikant verbesserte C4-Produktion aus. Dabei betrug, speziell bezogen auf 2,3-Butandiol, die Steigerung gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj für den Stamm R.t.-pTkt-Tal 54% und für den Stamm R.t.-pTkt-pTal 80%. Bezogen auf die Summe der C4-Produkte Acetoin und 2,3-Butandiol betrug die Steigerung gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj für den Stamm R.t.-pTkt-Tal 33% und für den Stamm R.t.-pTkt-pTal 45%. Diacetyl konnte bei keinem der Stämme nachgewiesen werden. Neben der absoluten Ausbeute wurde auch die Raum-Zeitausbeute für die C4-Produkte (Summe von 2,3-Butandiol und Acetoin) signifikant verbessert, und zwar (nach 72 h Fermentationsdauer) von 1,09 gl^–1h^–1 für den Kontrollstamm R.t.-pKKj auf 1,49 gl^–1h^–1 für den Stamm R.t.-pTkt-pTal sowie 1,46 gl^–1h^–1 für den Stamm R.t.-pTkt-Tal. Demgemäß zeichnen sich die erfindungsgemäßen Stämme nicht nur durch eine deutlich verbesserte C4-Produktivität gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pkkj aus, sondern sind auch signifikant verbessert gegenüber dem bei Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 offenbarten Stand der Technik (ca. 0,6 gl^–1h^–1, wie dort aus 3 und 4 entnommen).
Weiterhin wurde in der Fermentation die Produktion des Nebenprodukts Acetat deutlich reduziert, und zwar um 31% für den Stamm R.t.-pTkt-Tal und um 83% für den Stamm R.t.-pTkt-pTal.
Aus Tabelle 8 geht also hervor, dass sich das Spektrum der C4 und C2-Produktion durch die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolase Gene in den Stämmen R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal verändert, wodurch sich der Anteil des 2,3-Butandiols an der Gesamtproduktion (Summe der C2- und C4-Produkte) von 52,7% für den Kontrollstamm R.t.-pKKj auf 86% für den Stamm R.t.-pTkt-pTal, bzw. 70,6% für den Stamm R.t.-pTkt-Tal erhöht. Die erfindungsgemäßen Produktionsstämme zeichnen sich somit nicht nur durch eine insgesamt höhere C4-Produktion aus, sondern auch durch einen höheren Anteil des 2,3-Butandiols an der Gesamtmenge produzierter C2- und C4-Verbindungen (Selektivität).
Diese überraschende Verschiebung des Produktspektrums zugunsten von 2,3-Butandiol bei der Fermentation von Xylose ist unerwartet, da einerseits die jeweilige Überexpression von Tansketolase und Transaldolase alleine keinen Einfluss auf die 2,3-Butandiol Produktion hatte (6. Beispiel) und nach dem Stand der Technik für andere Mikroorganismen ( US 7998722 und US 8034591 ) mindestens noch zusätzlich zwei weitere Gene überexprimiert werden mussten, um die Xyloseverwertung in diesen Stämmen zu verbessern und die Produktion von Ethanol zu steigern.
Weiterhin war überraschend, dass es sich bei der Transketolase und Transaldolase um zwei Enzyme des Pentosephosphatwegs handelt, welche an der Verstoffwechslung der C-Quelle Xylose beteiligt sind und von denen ein direkter Einfluss auf die Biosynthese von 2,3-Butandiol nicht erwartet wurde. Ausgangspunkt der 2,3-Butandiol Biosynthese ist Pyruvat, das Endprodukt der Glykolyse. Pyruvat ist ebenfalls die Ausgangsverbindung für die anderen Produkte Acetoin, Acetat und Ethanol, sodass ein denkbarer direkter Einfluss der Transketolase- und Transaldolase Überexpression auf die Verfügbarkeit von Pyruvat auch die Produktion dieser Verbindungen beeinflusst haben müsste. Dies wurde nicht beobachtet, sodass die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolase Gene in den Produktionsstämmen R.t.-pTkt-pTal und R.t.-pTkt-Tal bei der Fed-Batch Fermentation mit der C-Quelle Xylose selektiv die Produktion von 2,3-Butandiol verbesserte.
8. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Xylose im 330 l Maßstab
Fermentiert wurde der Stamm Raoultella terrigena R.t.-pTkt-pTal, der sowohl den Transketolase Expressionsvektor pTkt sowie den Transaldolase Expressionsvektor pTal-tet enthielt (siehe 3. und 7. Beispiel).
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von R.t.-pTkt-pTal in LBtet+amp Medium (LB Medium, das zusätzlich 15 mg/l Tetracyclin und 200 mg/l Ampicillin enthielt) wurde hergestellt, indem 2 × 100 ml LBtet+amp Medium, jeweils in einem 1 l Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet+amp Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20% v/v versetzt und bei –20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 0,5–2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 l Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 l Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat^® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G-tet+amp (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 × 8 l FM2-G-tet+amp wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck pO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450–1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 30–40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet.
Hauptfermenter: Die Fermentation wurde in einem Biostat^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 l, Kesselvolumen 500 l) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-X-tet+amp mit Xylose als C-Quelle (siehe 3. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 l FM2-X-tet+amp wurden mit 16 l Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck pO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200–500 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Xyloseverbrauch durch off-line Xylose-Messung mit einem Analysator der Fe. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel). Sobald die Xylosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/l betrug (8–10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 75% w/v Xylose Feedlösung gestartet. Die Flussrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Xylosekonzentration von 10–20 g/l eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 300 l.

Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9 Produktion von 2,3-Butandiol durch Fed-Batch Fermentation im 330 l Maßstab

Zeit (h)	Produkt	R.t.-pTkt-pTal (g/l)
24	2,3-BDL	59,9
	Acetoin	8,4
	Acetat	3,5
	Ethanol	3,4
48	2,3-BDL	79,5
	Acetoin	17,7
	Acetat	3,8
	Ethanol	2,2
72	2,3-BDL	91,5
	Acetoin	20,7
	Acetat	9,9
	Ethanol	2,2

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2012288908 AA [0006]
WO 12104234 A1 [0008]
US 7998722 [0021, 0021, 0146]
DE 102011004915 [0077]
DE 102011003394 [0094, 0112, 0117]
DE 102011003386 [0098]
US 8034591 [0146]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 und in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351–364) [0004]
Reviews von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 [0007]
Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351–364 [0007]
Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291 [0011]
Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291 [0012]
Herstellung des Süßstoffes Xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol. Biotecanol. (2003) 30: 279–291 [0013]
Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 [0016]
„Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, S. 9 ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U.S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10: 0160850428 [0017]
Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932 [0018]
Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932 [0018]
Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 [0019]
Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 [0019]
Jansen et al., Biotechnol. Bioeng. (1984) 26: 362–369 [0020]
Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms”) [0024]
Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725, Kapitel 4, „Microorganisms” [0043]
Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85: 1301–1313 [0050]
Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 [0115]
Josephson and Fraenkel, J. Bacteriol. (1969) 100: 1289–1295 [0123]
Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 [0143]

Claims

Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten, herstellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketolase (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist.
Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem Ausgangsstamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, Paenibacillus, Serratia oder Lactobacillus hergestellt wurde.
Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den C4-Produkten um 2,3-Butandiol, Acetoin oder Diacetyl handelt.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zucker um Pentosen (C5-Zucker), insbesondere bevorzugt um Xylose handelt.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Überexpression der Transketolase- und Transaldolasegene derart verstärkt ist, dass die Enzymaktivität der Transketolase und Transaldolase jeweils um mindestens den Faktor 2, bevorzugt um mindestens den Faktor 5 und insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 im Vergleich zur Enzymaktivität im Ausgangsstamm erhöht ist.
Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle in der Fermentation oder der Anzucht im Schüttelkolben die Ausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin, um mehr als 20% im Vergleich zum Ausgangsstamm gesteigert ist.
Verfahren zur Herstellung von C4-Produkten aus C5-Zuckern, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C und anaerob oder aerob mit einer Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur C4-Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen grösser als 300 l erfolgt.