WO2012115120A1 - ５－ｈｔ神経細胞の製造方法 - Google Patents

５－ｈｔ神経細胞の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012115120A1
WO2012115120A1 PCT/JP2012/054175 JP2012054175W WO2012115120A1 WO 2012115120 A1 WO2012115120 A1 WO 2012115120A1 JP 2012054175 W JP2012054175 W JP 2012054175W WO 2012115120 A1 WO2012115120 A1 WO 2012115120A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
receptor
tgf
nerve
kinase inhibitor
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/054175
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
橋本　均
明道 馬場
淳史 山▲崎▼
Original Assignee
国立大学法人 大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 大阪大学 filed Critical 国立大学法人 大阪大学
Publication of WO2012115120A1 publication Critical patent/WO2012115120A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/825—Serotonine (5-HT); Melatonine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 5-HT nerve cells.
  • Serotonin (5-HT) nervous system in the brain uses the raphe nucleus of the brainstem as the nucleus of origin, and has a wide range of central nervous systems such as the limbic cortex, basal ganglia, hypothalamus, lower brainstem and spinal cord Projecting. It is functionally diverse, such as controlling aggression, feeding behavior, and memory learning, and some psychiatric treatments regulate the function of the 5-HT nervous system. Is considered to be closely related.
  • the 5-HT nervous system is recognized from the early stage of the embryonic period and has been shown to regulate cell division / differentiation, migration of neural cells, synapse formation, and the like. Moreover, it has been shown that abnormal development of the brain occurs along with abnormalities in the 5-HT nervous system during development.
  • Non-patent Documents 1 and 2 disclose the neurotransmitter 5-HT itself has a function of promoting differentiation of 5-HT nerves.
  • Many subtypes are known to exist in 5-HT receptors, but their role in 5-HT neuronal differentiation is unknown.
  • the 5-HT 7 receptor has been pointed out to be possibly involved in depression, anxiety, pain, schizophrenia and the like.
  • Non-patent Documents 3-5 As a useful tool for studying the developmental stage of nerve cells, attention has been focused on a nerve induction system from embryonic stem cells (ES cells) (Non-patent Documents 3-5).
  • the present inventors have found that neuronal cells are induced by culturing ES cells on Matrigel, which is a basement membrane preparation (Matrigel method), and further directly binds to BMP (bone morphogenic protein).
  • BMP bone morphogenic protein
  • An object of the present invention is to provide a 5-HT nerve cell production method using the novel 5-HT nerve cell induction factor obtained by a 5-HT nerve differentiation induction system from ES cells and the production kit.
  • the differentiation induction mechanism was examined using the Matrigel-Noggin method. As a result, it was found that the action of Noggin is caused by blocking of the BMP signal, although it is not caused by other BMP antagonists. In addition, the inventors have succeeded in clarifying that differentiation from ES cells into 5-HT nerves can be promoted by the action via 5-HT 7 receptor. Furthermore, in the present invention, an inhibitor of BMP receptor kinase can promote differentiation into 5-HT nerves, and Noggin's 5-HT neuronal differentiation-inducing action is inhibited by type I TGF- ⁇ receptor kinase inhibitors. It was found that type I TGF- ⁇ receptor signal is involved in differentiation into 5-HT nerves. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention [1] A 5-HT neuron culturing a stem cell on a polymerized extracellular matrix protein in the presence of a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand Production method; [2]
  • the BMP receptor kinase inhibitor is 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline or 4- [6-- 4- (1-Methylethoxy) phenyl] pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] -quinoline, the production method according to [1], [3]
  • the BMP receptor kinase inhibitor is 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline, [2] Manufacturing method of [4] A 5-HT 7
  • the 5-HT nerve cell production kit [14] The 5-HT neuron according to [9], wherein the type I TGF- ⁇ receptor ligand is selected from at least one of TGF- ⁇ , Activin, Nodal, GDF-1, GDF-8, or GDF-11 Production kit; [15] The 5-HT nerve cell production kit according to any one of [9] to [14], further comprising noggin; [16] The 5-HT neuronal cell production kit according to any one of [9] to [15], wherein the stem cells are ES cells or iPS cells; [17] A 5-HT nerve cell regenerative agent comprising a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand; [18] A 5-HT nerve cell regeneration method comprising administering to a patient an effective amount of a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand; [19] BMP receptor kinase inhibitor
  • a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand newly found as a 5-HT nerve cell inducer Can be used to efficiently differentiate stem cells into 5-HT neurons.
  • FIG. 1 shows the results of culturing ES cells on Matrigel for 14 days in the presence of various concentrations of LDN-193189.
  • Luminescence intensity is the activity of the enhancer region of ETS (Pet1), which is an index of 5-HT neuronal differentiation, and is shown as 100% when no drug is added. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. * P ⁇ 0.05 by Dunnett test.
  • FIG. 2 shows the results of culturing ES cells on Matrigel for 14 days in the presence of various concentrations of 5-HT agonist, antagonist or SSRI. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. * P ⁇ 0.05 by Dunnett test.
  • FIG. 1 shows the results of culturing ES cells on Matrigel for 14 days in the presence of various concentrations of 5-HT agonist, antagonist or SSRI. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. * P ⁇ 0.05 by Dunnett test.
  • FIG. 3A shows the results of culturing ES cells for 14 days on Matrigel when Noggin was added in the presence of various concentrations of 5-HT 7 agonists or antagonists. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean.
  • FIG. 3B shows nuclei by Hoechst 33258 and 5-HT by anti-5-HT polyclonal antibody in cells cultured on Matrigel for 14 days in the presence of Noggin (left) and Noggin + 5-HT 7 antagonist SB269970 10 ⁇ M (right); It is a figure which shows a co-stained image. Scale bar; 200 ⁇ m FIG.
  • FIG. 4 shows the results of measuring dopamine (DA) and serotonin (5-HT) concentrations when ES cells were cultured on Matrigel for 18 days in the presence or absence of a 5-HT 7 agonist (AS-19). Indicates. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean.
  • FIG. 5 shows the result of measuring the mRNA expression level of 5-HT 1A receptor when ES cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of Noggin. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. ** p ⁇ 0.01 by two-way repeated ANOVA. , #P ⁇ 0.05, ## p ⁇ 0.01 by Turkey-Kramer test.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the mRNA expression level of 5-HT 7 receptor when ES cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of Noggin. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. ** p ⁇ 0.01 by two-way repeated ANOVA. , #P ⁇ 0.05, ## p ⁇ 0.01 by Turkey-Kramer test.
  • FIG. 7 shows the results when ES cells were cultured for 14 days on Matrigel when Noggin was added in the presence of various concentrations of SB431542. Luminescence intensity is the activity of the enhancer region of ETS (Pet1), which is an index of 5-HT neuronal differentiation, and is shown as 100% when no drug is added. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean.
  • FIG. 8 shows the ratio of 5-HT cells to total neurons when ES cells were cultured for 14 days on Matrigel when Noggin was added in the presence of various concentrations of SB431542. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean.
  • the left figure shows the ratio of 5-HT cells to neurons by anti-Tuj1 monoclonal antibody which is a neuronal differentiation marker and anti-5-HT polyclonal antibody in the presence of Noggin and Noggin + type I TGF- ⁇ receptor antagonist SB431542 .
  • FIG. 9 shows the results of measuring the mRNA expression level of each downstream gene of BMP receptor and type I TGF- ⁇ receptor when ES cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of Noggin. Data were expressed as mean ⁇ standard error of the mean. ** p ⁇ 0.01 by Student's test.
  • the present invention comprises culturing stem cells on polymerized extracellular matrix protein in the presence of a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand.
  • a BMP receptor kinase inhibitor for producing HT neurons.
  • 5-HT neurons produced by the method of the present invention is not particularly limited, and model cells used for all tests and research on 5-HT neurons, schizophrenia, depression, autism,
  • the present invention provides a use as a cell for transplantation used for treatment / amelioration of mental disorders such as eating disorders and sleep disorders, motor dysfunction after spinal cord injury, and symptoms accompanied by pain.
  • the stem cell used in the 5-HT nerve cell production method of the present invention refers to a cell that can be cultured in vitro and can differentiate into a plurality of cells constituting a living body.
  • ES cells fetal primordial germ cell-derived pluripotent stem cells (EG cells: Proc Natl Acad Sci US A. 1998, 95: 13726-31), testis-derived pluripotent stem cells (GS cells: Nature, 2008, 456: 344-9), somatic cell-derived induced pluripotent stem cells (iPS cells), human somatic stem cells (tissue stem cells), preferably iPS cells, ES cells It is.
  • ES cells ES cells derived from any warm-blooded animal, preferably a mammal, can be used.
  • mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, and humans.
  • Preferable examples of ES cells include ES cells derived from humans or mice.
  • ES cells such as mammals established by culturing early embryos before implantation, ES established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei, etc.
  • ES cells obtained by modifying cells and genes on the chromosomes of these ES cells using genetic engineering techniques.
  • Each ES cell can be prepared according to a method commonly practiced in the art or a known literature.
  • Mouse ES cells were obtained in 1981 from Evans et al. (1981, Nature 292: 154-6) and Martin et al. (Martin GR. Et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8). And can be purchased from, for example, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • Human ES cells were established in 1998 by Thomson et al. (Science, 1998, 282: 1145-7) and are available from the WiCell Research Institute (WiCell Research Institute, website: http: // www. available from Wisell.org/, Madison, Wisconsin, USA, National Institute of Health, Kyoto University, etc., for example, Cellaritis (website: http://www.cellaritis.com). /, Sweden).
  • an iPS cell an iPS cell derived from any warm-blooded animal, preferably a mammal can be used.
  • the mammal include mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, sheep, pig, cow, horse, goat, monkey and human.
  • Preferable examples of iPS cells include iPS cells derived from humans or mice.
  • Specific examples of iPS cells include cells obtained by introducing a plurality of genes into somatic cells such as skin cells and having acquired multipotency similar to ES cells.
  • Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C- Examples include iPS cells obtained by introducing Myc gene and Sox2 gene, iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene (Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106).
  • a method in which a transgene is further reduced (Nature. 2008 Jul 31; 454 (7204): 646-50), a method using a low molecular weight compound (Cell Stem Cell. 2009 Jan 9; 4 (1): 16 -9, Cell Stem Cell. 2009 Nov 6; 5 (5): 491-503), a method using a transcription factor protein instead of a gene (Cell Stem Cell.
  • iPS cell lines include the 253G1 strain (iPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 in skin fibroblasts of a 36-year-old female), 201B7 strain (skin fiber of a 36-year-old female).
  • IPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in blast cells
  • 1503-iPS (297A1) (skinned fibroblasts of a 73 year old female with OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC IPS cell line prepared by expression)
  • 1392-iPS iPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in 56-year-old male skin fibroblasts
  • NHDF- iPS (297L1) i created by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in newborn male skin fibroblasts S cell line
  • the stem cells are cultured on a polymerized extracellular matrix protein.
  • an extracellular matrix protein is a protein that constitutes a space outside a cell and has a cell adhesion action, and the cells cultured therein perform normal cell function maintenance, self-proliferation and differentiation.
  • the type is not particularly limited, but an extracellular matrix protein constituting the basement membrane is preferable.
  • extracellular matrix proteins include laminin, collagen, entactin, proteoglycan, glycosaminoglycan, nidogen, fibronectin, gelatin, vitronectin, elastin, and tenascin.
  • extracellular matrix proteins constituting the basement membrane.
  • extracellular matrix proteins can be used.
  • Matrigel composed of basement membrane components extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma It can be preferably used in the invention.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • the extracellular matrix protein is polymerized in advance on a cell culture vessel when used in the method for producing 5-HT nerve cells of the present invention.
  • Polymerization can be easily carried out by dissolving the extracellular matrix protein in advance at a low temperature and incubating at 22 to 35 ° C.
  • the cell culture vessel coated with the extracellular matrix protein to be polymerized include, for example, a flask, a flask for tissue culture, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, Examples include multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles. Preferred are a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, a multiwell plate, and the like.
  • the stem cells may be seeded at a density of 1.0 ⁇ 10 3 on the polymerized extracellular matrix protein by suspending the cells suspended as monocells in a medium.
  • the culture is usually carried out in an incubator at 5% CO 2 /95% air at 37 ° C. for 7 to 20 days, preferably 12 to 20 days to differentiate stem cells into nervous system cells.
  • the medium to be used may be a medium usually used for culturing stem cells (hereinafter referred to as a basal medium).
  • the medium used in the 5-HT nerve cell production method of the present invention may be a serum-containing medium, but is preferably a serum-free medium.
  • the serum-free medium means a basal medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and there is no medium in which purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) are mixed. It shall correspond to serum medium.
  • the medium used in the 5-HT nerve cell production method of the present invention may also contain a serum replacement.
  • Serum substitutes include, for example, albumin (eg, lipid-rich albumin), transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace elements (eg, zinc, selenium), B-27 supplement, N2 supplement, knockout sealum replacement, 2-mercapto Ethanol, 3 ′ thiol glycerol, or the equivalent thereof.
  • concentration in these media is, for example, usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • Knockout sealum replacements can be purchased from Life Technologies.
  • Other serum substitutes can be purchased from Life Technologies, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., etc. Regardless.
  • the medium used in the 5-HT nerve cell production method of the present invention also includes lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, Inorganic salts, antibiotics (for example, penicillin and streptomycin), antibacterial agents (for example, amphotericin B), and the like may be contained.
  • concentrations in these media are the same as those in the serum replacement medium described above.
  • stem cell culture is carried out using a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand as a 5-HT nerve cell inducer. It is performed by adding to the medium.
  • BMP receptors are receptor-type serine / threonine kinases of BMP (Bone Morphogenic Protein), a protein secreted extracellularly, and are roughly classified into type I receptors and type II receptors.
  • ALK Activate like kinase is known as a BMP receptor.
  • BMP receptor kinase inhibitors include 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline (LDN-193189), 4- [ 6- [4- (1-Methylethoxy) phenyl] pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] -quinoline (DMH-1) and the like.
  • 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline is preferably used.
  • 5-HT 7 receptor is one of serotonin receptor subtypes with serotonin synthesized from tryptophan as a ligand, and is a G protein-coupled receptor.
  • 5-HT 7 receptor agonists (2S)-(+)-5- (1,3,5-Trimethylpyrazol-4-yl) -2- (dimethylamino) tetralin (AS-19), 4- (2 -Diphenyl) -N- (1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl) -1-piperazine hexanamide hydrochloride (LP12), 4- [2- (Methylthio) phenyl] -N- (1,2,3,3) 4-tetrahydro-1-naphthalenyl) -1-piperazine hexaneamide hydrochloride (LP44) and the like.
  • the TGF- ⁇ receptor is a receptor type serine / threonine kinase of TGF- ⁇ that forms a family with BMP, and, like the BMP receptor, is roughly divided into a type I receptor and a type II receptor.
  • Examples of the type I TGF- ⁇ receptor ligand include TGF- ⁇ , Activin, Nodal, GDF-1, GDF-8, and GDF-11.
  • TGF- ⁇ , Activin, Nodal, GDF-1, GDF-8 or GDF-11 can be purchased, for example, from R & D Systems, Inc.
  • the ligand is an accession number (GenBank), for example, NC in the case of TGF- ⁇ 1. 0000199.9 (NP 000651.3) (human), NC 000073.5 (NP 03577.1) (mouse), in the case of TGF- ⁇ 2, NC 00000.10 (NP 001129071.1) (human), NC 000067.5 (NP 03393.2) (mouse), in the case of TGF- ⁇ 3, NC 000001.8 (NP003230.1) (human), NC 0000785.5 (NP 03394.2) (mouse), Activin is NC 000007.13 (NP 002183.1) (human), NC 000001.5 (NP 03406.1) (mouse), Nodal is NC 000010.10 (NP 060525.3) (human), NC 000076.5 (NP 03839.3) (mouse), GDF-1 is 0000199.9 (NP 001483.3) (human), NC 000074.5 (NP 001156754.1) (mouse), GDF-8 is NC 000002.11 (NP 00 00
  • the BMP receptor kinase inhibitor, 5-HT 7 receptor agonist, or type I TGF- ⁇ receptor ligand may be added at any point in the stem cell culture, but for BMP receptor kinase inhibitors, It is preferable to add to the medium from 0 to 5 days after the start of the culture, and the 5-HT 7 receptor agonist is preferably added 6 to 14 days after the start of the culture. In the production method of the present invention, Since mature neurons are induced after the 8th day of culture, in the case of AS-19 among 5-HT 7 receptor agonists, it is preferable to add them after the 6th to 7th days after the start of the culture.
  • the type I TGF- ⁇ receptor ligand is preferably added 0 to 5 days after the start of culture.
  • the BMP receptor kinase inhibitor, 5-HT 7 receptor agonist, or type I TGF- ⁇ receptor ligand may be added alone or at the same time. Furthermore, two or more agents and ligands may be added simultaneously to the BMP receptor kinase inhibitor, 5-HT 7 receptor agonist, or type I TGF- ⁇ receptor ligand, respectively.
  • the amount of the BMP receptor kinase inhibitor, 5-HT 7 receptor agonist, or type I TGF- ⁇ receptor ligand added to the medium can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline is 1 nM to 1000 nM, preferably 10 nM to 300 nM. Is added. If (2S)-(+)-5- (1,3,5-Trimethylpyrazol-4-yl) -2- (dimethylamino) tetralin is added, 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M is added. Is exemplified. Those skilled in the art can also use the above-mentioned ranges by changing them.
  • noggin may further coexist.
  • Noggin can be purchased from, for example, R & D Systems, Inc., like the type I TGF- ⁇ receptor ligand.
  • noggin can easily obtain the amino acid sequence and base sequence of a protein as an accession number (GenBank), for example, Np_032737 (mouse) or AAH34027 (human), those skilled in the art can use well-known recombinant proteins.
  • GenBank for example, Np_032737 (mouse) or AAH34027 (human)
  • those skilled in the art can use well-known recombinant proteins.
  • Noggin can be easily produced using technology.
  • 5-HT nerve cells induced to differentiate from stem cells are confirmed as a result of the culture. Confirmation that differentiation was induced in the 5-HT neuron, This can be confirmed by measuring at least one of (1) measuring the amount of 5-HT and (2) immunostaining a marker of 5-HT neuronal cells, but it is limited to these methods. First, it is only necessary to verify that 5-HT neurons are present.
  • Measurement of the 5-HT amount is not limited to this, but can be performed using an existing method for measuring the amount of biogenic amine (Matsuda et al., European Journal of Pharmacology 1989, 170: 75-82). That is, it can be carried out by adding a solution containing K + at a high concentration (for example, 56 mM) to the cultured ES cells and incubating, and measuring the solution by HPLC / ECD or the like.
  • a buffer salt solution such as Hanks solution can be used as the solution containing K + , but is not limited thereto.
  • 5-HT or 5-HT synthase can be used as a marker for 5-HT neurons, but is not limited thereto.
  • a known marker that is specifically expressed in the serotonin nerve may be used.
  • 5-HT and 5-HT synthase are not expressed on the cell surface, so the cells to be stained are immobilized by a well-known method. After that, it is preferable to allow the antibody molecule to reach the inside of the cell by increasing the permeability of the cell membrane with a surfactant or the like.
  • 5-HT neuronal cells since there is no appropriate marker expressed on the cell surface of 5-HT neuronal cells, for example, when concentrated using FACS, GFP (green fluorescent protein) or the like is expressed specifically in 5-HT neurons. It is necessary to use a method for transformation in advance. However, if a 5-HT neuronal cell preparation prepared using the method according to the present invention is used, there is a possibility that an appropriate cell surface marker can be found.
  • the present invention also provides a kit for producing 5-HT neuron as an extracellular matrix protein, a stem cell, a BMP receptor kinase inhibitor as a 5-HT neuron inducer, a 5-HT 7 receptor agonist, or type I
  • a kit for producing a 5-HT neuron cell comprising a TGF- ⁇ receptor ligand is provided.
  • the 5-HT nerve cell production kit of the present invention is not particularly limited as long as it contains reagents, instruments, devices and the like. Extracellular matrix proteins, BMP receptor kinase inhibitors as 5-HT neuron inducers, 5-HT 7 receptor agonists, or type I TGF- ⁇ receptor ligands are described in the method for producing 5-HT neurons.
  • the 5-HT nerve cell inducer may further contain noggin as in the 5-HT nerve cell production method. Moreover, they may be provided in a dry state or a solution state. By using the kit and carrying out the method for producing 5-HT neurons, 5-HT neurons can be prepared.
  • BMP receptor kinase inhibitors include 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline, 4- [6-- 4- (1-Methylethoxy) phenyl] pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] -quinoline and the like may be preferably included, and among them 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) ) Phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline is more preferred.
  • the 5-HT 7 receptor agonists include (2S)-(+)-5- (1,3,5-Trimethylpyrazol-4-yl) -2- (dimethylamino) tetralin, 4- (2-Diphenyl) -N -(1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl) -1-piperazynehexanamide hydrochloride, 4- [2- (Methylthio) phenyl] -N- (1,2,3,4-tetrahydr-1-yl) -1-piperazine hexanamide hydrochloride and the like may be preferably included, among which (2S)-(+)-5- (1,3,5-Trimethylpyrazole-4-yl) 2- (dimethylamino) tetralin is more preferable.
  • the type I TGF- ⁇ receptor ligand preferably includes TGF- ⁇ , Activin, Nodal, GDF-1, GDF-8, GDF-11, and the like. Two or more BMP receptor kinase inhibitors, 5-HT 7 receptor agonists, or type I TGF- ⁇ receptor ligands may be included. Furthermore, the present kit can use the same stem cells as those described in the above-mentioned 5-HT neuron production method, and may preferably be included as ES cells or iPS cells.
  • 5-HT nerve dysfunction is known to contribute to increased aggression and impulsivity, eating disorders, and other mental disorders (eg, schizophrenia, depression, autism) Disease, eating disorder, sleep disorder, etc.), motor dysfunction after spinal cord injury, and pain.
  • BMP receptor signaling the 5-HT 7 receptor signaling or type I TGF-beta receptor signaling
  • the present invention provides a 5-HT nerve cell regenerative agent comprising a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand.
  • the administration form and dosage form of the 5-HT nerve cell regenerative agent of the present invention may be either oral or parenteral administration.
  • oral administration agent include solids such as powders, granules, capsules, tablets and chewable agents.
  • Liquids such as pills, solutions, syrups, and parenteral agents include injections, ointments, sprays, and the like.
  • parenteral administration more preferably an injection.
  • the component added as necessary in the preparation of the 5-HT nerve cell regenerating agent of the present invention includes an appropriate pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a binder, a lubricant, a solvent, Disintegrants, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, soothing agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, coloring agents and the like can be mentioned.
  • excipients include sugars such as lactose, glucose, D-mannitol, organic excipients such as starches and celluloses such as crystalline cellulose, and inorganic excipients such as calcium carbonate and kaolin.
  • pregelatinized starch gelatin, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, D-mannitol, trehalose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc.
  • Is stearic acid, fatty acid salts such as stearate, talc, silicates, etc., solvent is purified water, physiological saline, etc.
  • disintegrator is low substituted hydroxypropyl cellulose, chemically modified Cellulose, starch, etc., as solubilizers, polyethylene glycol, propylene glycol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, sodium acetate, etc. are used as suspending agents or emulsifiers.
  • isotonic agents examples include sodium lauryl sulfate, gum arabic, gelatin, lecithin, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.
  • Sodium chloride, potassium chloride, saccharides, glycerin, urea, etc., stabilizers include polyethylene glycol, sodium dextran sulfate, and other amino acids
  • a soothing agent glucose, calcium gluconate, procaine hydrochloride, etc.
  • preservatives paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, etc. are antioxidants.
  • As sulfites, ascorbic acid and the like, as flavoring agents, sweeteners and fragrances commonly used in the pharmaceutical field, and as coloring agents, colorants commonly used in the pharmaceutical field are mentioned. .
  • aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents and the like.
  • aqueous and non-aqueous sterile suspensions can be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • Antioxidants, isotonic agents, suspending agents, stabilizers, solubilizers and preservatives include those described above.
  • TE buffer solution 10 mM Tris, 1 mM EDTA [pH 8.0]
  • PBS phosphate buffer solution
  • a buffer solution having a pH of 6 to 9 is preferable.
  • Antibacterial agents include oxophosphate, olmetoprim, trimethoprim, sulfa, fosfomycin, penicillin antibacterial, cephalosporin antibacterial, vancomycin, tetracycline antibacterial, rifampicin, fluoroquinone antibacterial, etc.
  • the agent include gum arabic, lipiodol, sodium polyacrylate, sodium hyaluronate, sodium carboxymethyl cellulose and the like.
  • the 5-HT nerve cell regenerative agent of the present invention can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
  • the dose and frequency of administration of the 5-HT nerve cell regenerative agent of the present invention vary depending on the age, body weight, disease state, administration method and the like of the administration subject, but usually, for example, a BMP receptor kinase inhibitor per dosage unit dosage form
  • the 5-HT 7 receptor agonist or type I TGF- ⁇ receptor ligand is usually contained in an amount of usually 5 to 500 mg, particularly 5 to 100 mg for injections and 10 to 250 mg for other dosage forms. Administration may be a single dose or multiple doses.
  • the 5-HT nerve cell regenerating agent of the present invention may be directly administered into the brain.
  • the 5-HT nerve cell regenerating agent of the present invention suspended in an appropriate buffer for example, phosphate buffered saline (PBS) or the like
  • PBS phosphate buffered saline
  • the present invention is also obtained by culturing stem cells on polymerized extracellular matrix protein in the presence of a BMP receptor kinase inhibitor, a 5-HT 7 receptor agonist, or a type I TGF- ⁇ receptor ligand.
  • Transplant compositions for the treatment of mental disorders eg, schizophrenia, depression, autism, eating disorders, sleep disorders, etc.
  • motor dysfunction after spinal cord injury including 5-HT neurons Offer things. It is effective when in vivo differentiation induction of neural stem cells cannot be achieved by the regenerative agent by transplanting and establishing 5-HT nerve cells themselves.
  • the composition for transplantation containing 5-HT nerve cells of the present invention has low toxicity.
  • the method for producing 5-HT nerve cells of the present invention does not require the use of feeder cells or serum. This is preferable in that there is no concern of introducing an exogenous factor to the ent.
  • iPS cells derived from the patient itself are used as stem cells, there is no problem of HLA mismatch and rejection due to immune response can be avoided. Therefore, the 5-HT nerve cells obtained by the production method of the present invention may be transplanted as they are, or may be frozen and stored and thawed before use. Examples of patients (subjects) to be transplanted include humans or other mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the transplant composition containing 5-HT nerve cells of the present invention can be prepared by suspending in a sterile aqueous solution suitable for transplantation in addition to 5-HT neurons.
  • a sterile aqueous liquid suitable for transplantation in addition to 5-HT neurons.
  • examples of the sterile aqueous liquid include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • the number of cells contained in the transplant composition containing 5-HT nerve cells of the present invention varies depending on the transplant subject, transplant range, target disease, severity thereof, etc., for example, in the case of an adult psychiatric patient,
  • the transplant composition containing 5-HT nerve cells of the present invention can be transplanted in a number of about 10 to 100,000 cells, preferably about 100 to 10,000 cells, as a single transplant.
  • transplantation may be performed multiple times over a number of days in view of the degree of establishment.
  • ES cells Mouse ES cells (E14 strain) were cultured in 10 cm tissue culture dish coated with 0.1% gelatin in the presence of 1000 U / mL LIF (Leukemia Inhibitory Factor), 10% fetal bovine serum, Seed using ESM [GMEM (Glasgow) containing 0.1 mM NEAA (non-essential amino acid; Sigma), 1 mM sodium pyruvate (Sigma), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (Sigma)], 5% CO 2 / 95% air at 37 ° C. incubator. Passaging was performed every other day using trypsin-EDTA (0.25% trypsin, 1 mM EDTA ⁇ 4Na) (GIBCO BRL).
  • Noggin prepared by the inventors
  • BMP receptor kinase inhibitor LDN-193189 SEMGENT
  • 5-HT agonist as serotonin hydrochloride Sigma-Aldrich
  • GR 127935 Hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich
  • cisapride monohydrate Sigma-Aldrich
  • AS 19 Tocris
  • SB 269970 hydrochloride Tocris
  • fluoxetine hydrochloride (LKT laboratories)
  • type I TGF- ⁇ receptor SB431542 was used as a kinase inhibitor.
  • the cells were washed twice with PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C. for 10 minutes. This was washed once with PBS and subjected to blocking treatment with PBST (0.1 mM PBS with 0.3% Triton) / 10% FBS.
  • Mouse anti-GFP monoclonal antibody 500-fold dilution, Clontech
  • rabbit anti-serotonin polyclonal antibody 1000-fold dilution, DiaSorin
  • mouse anti-Tuj1 monoclonal antibody 500-fold dilution, Covance
  • rabbit anti-Map2 antibody 500-fold dilution
  • the plate was washed twice with PBST at 37 ° C. for 10 minutes. Then, as secondary antibodies, Alexa594-conjugated anti-mouse IgG (1000-fold diluted, Molecular Probes), Alexa488-conjugated anti-rabbit IgG (1000-fold diluted, Jackson ImmunoResearch Laboratories), Hoechst 33258 (1000-fold diluted with BIOCH33EM, Block-L diluted with BIOCH33EM) And reacted at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the plate was washed 3 times with PBST at 37 ° C. for 10 minutes, mounted on a slide glass, and observed using a fluorescence microscope.
  • ES cells were cultured with addition of AS-19 from the 10th day of culturing on matrigel, washed twice with HBSS (Hanks balanced salt solution), and HBSS containing 56 mM K +. Was added at 500 ⁇ l / well, incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and collected as a sample on the 18th day of culture. For the measurement, 10 ⁇ l of a sample was manually injected into a high performance liquid chromatography / electrochemical detector (HPLC / ECD) system to simultaneously detect dopamine and serotonin.
  • HPLC / ECD high performance liquid chromatography / electrochemical detector
  • Eicompak CA-50DS (2.1 mm id ⁇ 150 mm, Eicom) was used for the column, and 500 mg / l sodium decanesulfonate, 134 ⁇ M EDTA, 20% (v / v) was used for the mobile phase of HPLC.
  • Real-Time PCR RNA extraction was performed by the guanidine thiocyanate acidic phenol method.
  • reverse transcription was performed using reverse transcriptase M-MLV (GIBCO BRL) using 1.0 ⁇ g of total RNA extracted from ES cells or differentiation-induced cells as a template to prepare a cDNA pool.
  • a cDNA pool diluted 20-fold as a template, using primers specific to each gene, GoTaq (registered trademark) qPCR Master Mix (Promega), CFX 96 Real time System (BIO-RAD) Time PCR was performed.
  • Rat ⁇ -actin was used as an internal standard.
  • the reaction conditions were 95 ° C. for 15 seconds and 58 to 66 ° C. for 60 seconds for 40 cycles.
  • the sequences of the specific primers used and the annealing temperatures thereof are as follows.
  • ⁇ -actin 60 ° C 5′-ACCCACACTGTGCCCCATCTA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) 5'-GCCACAGGATTCCATACCCA-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • 5-HT 7 receptor 66 ° C 5′-TCCAGGTCAGTACCGGAATACAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) 5′-TACTCTTTCTCCCAGGGTTCCGCCTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • 5-HT 1A receptor 60 ° C.
  • Example 1 Induction of 5-HT Neuronal Differentiation by BMP Receptor Kinase Inhibitors
  • BMP Receptor Kinase Inhibitors Similar applied other major BMP antagonists, Chordin and Follistatin. It was clarified that no significant effect was observed. Therefore, in this example, a 5-HT neuronal differentiation-inducing action was examined using LDN-193189, which is a selective inhibitor of BMP receptor kinase, which causes BMP signal blockade from an action point different from that of the BMP antagonist.
  • LDN-193189 (STEMGENT) was added to the culture solution on the 0th to 5th days of culture, and ES cells were cultured on Matrigel.
  • the ES cells and culture method used were as described above, and 5-HT neuronal differentiation on the 14th day of culture was evaluated. As a result, it was revealed that LDN-193189 (3 to 100 nM) has an action of inducing differentiation of 5-HT nerve (FIG. 1).
  • Example 2 Effect of 5-HT on 5-HT nerve differentiation Reported by studies using primary cultured cells of rodent fetal brain that 5-HT can influence 5-HT nerve differentiation
  • 5-HT can influence 5-HT nerve differentiation
  • pluripotent undifferentiated stem cells such as ES cells and iPS cells
  • 5-HT receptor agonists and antagonists on 5-HT neuronal differentiation was examined.
  • the HT 7 receptor antagonist SB 269970 strongly inhibited the action by Noggin (FIG. 3A). Further, at this time, it was confirmed by immunostaining using an anti-5-HT antibody that SB 269970 decreased the number of 5-HT neurons in colonies containing 5-HT nerves induced by Noggin (Fig. 3B).
  • Example 3 Induction of 5-HT Neuronal Differentiation with 5-HT 7 Receptor Agonist (AS-19) ES cells were cultured on Matrigel for 18 days in the presence or absence of 5-HT 7 receptor agonist AS-19 Cultured and 5-HT neuronal differentiation was assessed by measuring dopamine and serotonin concentrations. AS-19 was added at 10 ⁇ M from the 10th day of Matrigel culture. As a result, it was clarified that the serotonin concentration was significantly higher when AS-19 was added than when AS-19 was not added (control) (FIG. 4).
  • Example 4 Induction of 5-HT neuronal differentiation by Noggin ES cells were cultured on Matrigel in the presence or absence of Noggin, and 5-HT neuronal differentiation was induced by mRNA of 5-HT 1A receptor and 5-HT 7 receptor. The expression level was evaluated by measuring. Noggin started to be added at an amount equivalent to 200 ng / mL from the start of Matrigel culture to the 5th day, and cells were collected on the 8th, 10th, 12th, and 14th days after the culture, and Real-Time was obtained using mRNA extracted from the cells as a template. PCR was performed. As a result, it was revealed that the mRNA expression levels of 5-HT 1A receptor and 5-HT 7 receptor were significantly higher when Noggin was added than when Noggin was not added (control). (FIGS. 5 and 6).
  • 5-HT 7 receptor agonist is influenced 5-HT 7 receptor agonists applied to the 5-HT neuronal differentiation, differentiation of ES cells into efficient 5-HT neurons AS-19 is on matrigel Induced and antagonists suppressed Noggin's effect of inducing 5-HT neurons, suggesting that 5-HT 7 receptors are involved in differentiation into 5-HT neurons. Therefore, it is examined whether ES cells can be efficiently differentiated into 5-HT neurons on Matrigel using various 5-HT 7 receptor agonists.
  • 5-HT 7 receptor agonists include 4- (2-Diphenyl) -N- (1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl) -1-piperazine hexaneamide hydrochloride (LP12) , 4- [2- (Methylthio) phenyl] -N- (1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalenyl) -1-piperazine hexaneamide (LP44) or the like is used.
  • 5-HT neuronal differentiation is significantly promoted in the presence of the 5-HT 7 receptor agonist as compared to untreated cells, it can be selected as a 5-HT neuronal inducer.
  • a 5-HT 7 receptor agonist may be selected as a 5-HT nerve cell inducer by adding Noggin and further enhancing its 5-HT nerve cell induction effect. Such evaluation can also be performed by immunostaining for 5-HT or measuring the amount of 5-HT.
  • Example 6 Effect of SB431542 on serotonin neuronal differentiation (luciferase assay) It has been reported that the inhibitor of TGF- ⁇ signal SB431542 promotes differentiation from human ES cells to nerve cells alone or in combination with the BMP antagonist Noggin. Therefore, it was decided to examine what effect SB431542 would have on 5-HT neuronal differentiation. Noggin and SB431542 were added at 48 well plate from the beginning of the culture until the fifth day, Noggin was added in an amount equivalent to 200 ng / mL, and SB431542 was added at 0.1 to 10 ⁇ M. On the 14th day of culture, each culture solution was collected and luciferase assay was performed.
  • Example 7 Effect of SB431542 on serotonin neuronal differentiation (immunostaining)
  • Noggin was equivalent to 200 ng / mL
  • SB431542 was added at 1 to 10 ⁇ M from the start of the culture to the fifth day, and cultured for 14 days.
  • 2 units / mL Dispase (Gibco) was added at 400 ⁇ L / well, allowed to stand in an incubator at 5% CO 2 /95% air, 37 ° C. for 2 hours, and then 1.5 mL of detached colonies were obtained. It was collected in a tube and centrifuged (5000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed.
  • Trypsin-EDTA (0.25% Trypsin, 1 mM EDTA ⁇ 4Na) was added at 100 ⁇ L / tube and pipetting was performed well. Three minutes later, 500 ⁇ L of ESM / 10% FBS was added to stop the reaction, and the mixture was centrifuged again (5000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. Then, suspension is performed with ESM / 10% knockout sealant replacement to 4 ⁇ 10 6 cells / mL, and 500 ⁇ L is placed on a 24-well plate with a cover glass coated with 0.075% poly-L-lysine. / Well.
  • Example 8 Effect of Noggin on downstream gene expression of TGF- ⁇ and BMP signal ES cell culture on Matrigel in the presence or absence of Noggin and the effect of TGF- ⁇ and BMP signal on downstream gene expression Were assessed by measuring mRNA expression levels.
  • Noggin was added in an amount equivalent to 200 ng / mL from the start of Matrigel culture to the second day, cells were collected on the second day after the culture, and Real-Time PCR was performed using mRNA extracted from the cells as a template.
  • the expression of the Id gene known as the downstream gene of the BMP signal was reduced by the addition of Noggin, and the expression of Lefty known as the downstream gene of TGF- ⁇ was increased.
  • 5-HT 7 receptor was first found to be involved in 5-HT neuronal differentiation, and 5-HT neuron was used in schizophrenia, depression, autism, eating disorders, sleep disorders. It is suspected that it may be involved in mental illness such as psychiatric disorders or dysfunction after spinal injury, pain-related symptoms, etc., so that BMP receptor, 5-HT 7 receptor, type I TGF- ⁇ receptor Elucidation of the relationship between the disease and symptoms can be used for the development of a therapeutic agent for the disease in the future.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2011-035192 (filing date: February 21, 2011) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

Abstract

　本発明は、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの存在下、重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において幹細胞を培養する、５－ＨＴ神経細胞製造方法などを提供する。

Description

５－ＨＴ神経細胞の製造方法
　本発明は、５－ＨＴ神経細胞の製造方法などに関する。
　脳内のセロトニン（５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ；５－ＨＴ）神経系は脳幹の縫線核を起始核とし、大脳皮質辺縁系、基底核、視床下部、下位脳幹や脊髄など広範囲の中枢神経系に投射している。機能的にも、攻撃性、摂食行動、記憶学習を制御するなど様々であり、いくつかの精神疾患の治療薬が、５－ＨＴ神経系の機能を調節することなどから、精神疾患の病態との関連性が深いと考えられている。
　５－ＨＴ神経系は、胎生期の早期から認められ、細胞の***・分化、神経系細胞の遊走、シナプス形成などを調節することが示されている。また、発達期の５－ＨＴ神経系の異常に伴い、脳の発達異常が起こることが示されている。さらに、神経伝達物質５－ＨＴそのものが、５－ＨＴ神経の分化を促進する働きを有することが知られている（非特許文献１、２）。５－ＨＴ受容体には多くのサブタイプの存在が知られているが、これらの５－ＨＴ神経分化での役割については分かっていない。これら５－ＨＴ受容体のうち、５－ＨＴ７受容体は、うつ病、不安、疼痛、統合失調症などに関わる可能性が指摘されている。
　神経細胞の発生段階を研究する上で有用なツールとして、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）からの神経誘導系が注目されている（非特許文献３－５）。本発明者らは、基底膜調製品であるマトリゲル上でＥＳ細胞を培養することによって、神経細胞が誘導されることを見出しており（マトリゲル法）、さらにはＢＭＰ（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に直接結合してその作用を遮断するＢＭＰアンタゴニストであるＮｏｇｇｉｎをその培養系に添加することで、ＥＳ細胞からの５－ＨＴ神経分化誘導系（マトリゲル－Ｎｏｇｇｉｎ法）を確立することに成功している（特許文献１）。この誘導系は、フィーダー細胞や血清を用いないシンプルな系であるため、分子基盤解析を行いやすく、また生体の発達過程と類似の機構で５－ＨＴ神経分化が進行することから、この誘導系のメカニズムの解析は、生体の５－ＨＴ神経分化メカニズムの解明に結び付くものであると考えられる。しかし、ＥＳ細胞からの５－ＨＴ神経分化における、５－ＨＴ受容体に作用する薬物あるいはＢＭＰ受容体シグナルに作用する薬物の作用については知られていない。
特開２００８－１２５４４８号
De Vitry F et al., Proc Natl Acad Sci USA., Vol. 83, 8629-8633, 1986 Parga J et al., Dev Neurobiol., Vol. 67, 10-22, 2007 Lee SH et al., Nat Biotechnol., Vol. 18, 675-679, 2000 Perrier AL et al., Proc Natl Acad Sci USA., Vol. 101, 12543-12548, 2004 Zhang SC., Brain Pathol., Vol. 16, 132-142, 2006
　本発明の目的は、ＥＳ細胞からの５－ＨＴ神経分化誘導系によって得られた新規５－ＨＴ神経細胞誘導因子を用いた５－ＨＴ神経細胞製造方法および該製造キットを提供することである。
　本発明では、５－ＨＴ神経分化メカニズムの解明を目指し、マトリゲル－Ｎｏｇｇｉｎ法を用いて分化誘導機構の検討を行った。その結果、Ｎｏｇｇｉｎの作用は他のＢＭＰアンタゴニストでは引き起こされない作用ではあるが、ＢＭＰシグナルの遮断を介して引き起こされることを見出した。また、５－ＨＴ７受容体を介した作用により、ＥＳ細胞からの５－ＨＴ神経への分化を促進できることを明らかにすることに成功した。さらに、本発明では、ＢＭＰ受容体キナーゼの阻害剤が５－ＨＴ神経への分化を促進できること、ならびにＮｏｇｇｉｎの５－ＨＴ神経分化誘導作用が、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体キナーゼ阻害剤によって阻害されることを見出し、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体シグナルが５－ＨＴ神経への分化に関与していることを見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの存在下、重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において幹細胞を培養する、５－ＨＴ神経細胞製造方法；
［２］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅまたは４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅから少なくとも１つ選択される、［１］記載の製造方法；
［３］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅである、［２］記載の製造方法；
［４］５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅから少なくとも１つ選択される、［１］記載の製造方法；
［５］５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎである、［４］記載の製造方法；
［６］Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドが、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１から少なくとも１つ選択される、［１］記載の製造方法；
［７］ｎｏｇｇｉｎの共存在下において培養する、［１］－［６］のいずれか１つに記載の製造方法；
［８］幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［１］－［７］のいずれか１つに記載の製造方法；
［９］細胞外マトリクスタンパク質、幹細胞、５－ＨＴ神経細胞誘導剤としてのＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１０］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅまたは４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅから少なくとも１つ選択される、［９］記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１１］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅである、［１０］記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１２］５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅから少なくとも１つ選択される、［９］記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１３］５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎである、［１２］記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１４］Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドが、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１から少なくとも１つ選択される、［９］記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１５］ｎｏｇｇｉｎをさらに含む、［９］－［１４］のいずれか１つに記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１６］幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、［９］－［１５］のいずれか１つに記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット；
［１７］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞再生剤；
［１８］ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを患者に有効量投与することを含む、５－ＨＴ神経細胞再生方法；
［１９］５－ＨＴ神経細胞再生剤として使用するための、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンド；
［２０］［１］－［８］のいずれか１つに記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞を含む、精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療のための移植用組成物；
［２１］［１］－［８］のいずれか１つに記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞を患者に有効量移植することを含む、精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療方法；
［２２］精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療のための移植用組成物として使用するための、［１］－［８］のいずれか１つに記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞；
を提供する。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法によれば、５－ＨＴ神経細胞誘導剤として新たに見出したＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを用いることで、幹細胞を効率的に５－ＨＴ神経細胞へ分化させることができる。
図１は、各種濃度のＬＤＮ－１９３１８９の存在下、マトリゲル上でＥＳ細胞を１４日間培養した際の結果を示す。Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、５－ＨＴ神経分化の指標となる、ＥＴＳ（Ｐｅｔ１）のエンハンサー領域の活性であり、薬物非添加時を１００％として示している。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊ｐ＜０．０５　ｂｙ　Ｄｕｎｎｅｔｔ　ｔｅｓｔ． 図２は、各種濃度の５－ＨＴアゴニスト、アンタゴニストまたはＳＳＲＩの存在下、マトリゲル上でＥＳ細胞を１４日間培養した際の結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊ｐ＜０．０５　ｂｙ　Ｄｕｎｎｅｔｔ　ｔｅｓｔ． 図３Ａは、各種濃度の５－ＨＴ７アゴニストまたはアンタゴニストの存在下、Ｎｏｇｇｉｎの添加時のマトリゲル上でＥＳ細胞を１４日間培養した際の結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。；図３Ｂは、Ｎｏｇｇｉｎ（左）およびＮｏｇｇｉｎ＋５－ＨＴ７アンタゴニストＳＢ２６９９７０　１０μＭ（右）の存在下、マトリゲル上で１４日間培養した細胞における、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８による核と、抗５－ＨＴポリクローナル抗体による５－ＨＴの共染色像を示す図である。スケールバー；２００μｍ 図４は、５－ＨＴ７アゴニスト（ＡＳ－１９）の存在下または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で１８日間培養した際のドパミン（ＤＡ）およびセロトニン（５－ＨＴ）濃度を測定した結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。 図５は、Ｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養した際の５－ＨＴ１Ａ受容体のｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊＊ｐ＜０．０１　ｂｙ　ｔｗｏ－ｗａｙ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ＡＮＯＶＡ．, ＃ｐ＜０．０５, ＃＃ｐ＜０．０１　ｂｙ　Ｔｕｒｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔ． 図６は、Ｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養した際の５－ＨＴ７受容体のｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊＊ｐ＜０．０１　ｂｙ　ｔｗｏ－ｗａｙ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ＡＮＯＶＡ．, ＃ｐ＜０．０５, ＃＃ｐ＜０．０１　ｂｙ　Ｔｕｒｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔ． 図７は、各種濃度のＳＢ４３１５４２の存在下、Ｎｏｇｇｉｎの添加時のマトリゲル上でＥＳ細胞を１４日間培養した際の結果を示す。Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、５－ＨＴ神経分化の指標となる、ＥＴＳ（Ｐｅｔ１）のエンハンサー領域の活性であり、薬物非添加時を１００％として示している。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊＊ｐ＜０．０１, ＃＃ｐ＜０．０１　ｂｙ　Ｄｕｎｎｅｔｔ　ｔｅｓｔ． 図８は、各種濃度のＳＢ４３１５４２の存在下、Ｎｏｇｇｉｎの添加時のマトリゲル上でＥＳ細胞を１４日間培養した際の全神経細胞に対する５－ＨＴ細胞の割合を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。；左図は、ＮｏｇｇｉｎおよびＮｏｇｇｉｎ＋Ｉ型ＴＧＦ－β受容体アンタゴニストＳＢ４３１５４２の存在下、神経分化マーカーである抗Ｔｕｊ１モノクローナル抗体と、抗５－ＨＴポリクローナル抗体による、神経細胞に対する５－ＨＴ細胞の割合を示す。右図は、ＮｏｇｇｉｎおよびＮｏｇｇｉｎ＋ＳＢ４３１５４２の存在下、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、神経分化マーカーである抗Ｔｕｊ１モノクローナル抗体および抗Ｍａｐ２抗体染色による全細胞に対する神経細胞の割合を示す。＊＊ｐ＜０．０１　ｂｙ　Ｄｕｎｎｅｔｔ　ｔｅｓｔ． 図９は、Ｎｏｇｇｉｎの存在下または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養した際のＢＭＰ受容体およびＩ型ＴＧＦ－β受容体のそれぞれの下流遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果を示す。データを平均値±平均値標準誤差として表した。＊＊ｐ＜０．０１　ｂｙ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔｅｓｔ．
　本発明は、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの存在下、重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において幹細胞を培養することを含む、５－ＨＴ神経細胞製造方法を提供する。また、本発明の方法により製造された５－ＨＴ神経細胞の用途は特に限定されず、５－ＨＴ神経細胞に関するあらゆる試験・研究に用いるモデル細胞、または統合失調症、うつ病、自閉症、摂食障害、睡眠障害などの精神疾患もしくは脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛などを伴う症状の治療・改善に用いる移植用細胞としての用途が提供される。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法において用いられる幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的にはＥＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられ、好ましくは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞である。
　ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するＥＳ細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ＥＳ細胞の好ましい例としては、ヒトまたはマウスに由来するＥＳ細胞が挙げられる。
　ＥＳ細胞の具体例として、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。
　各ＥＳ細胞は当該分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
　マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ　ＧＲ．ｅｔ　ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　７８：７６３４－８）によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）などから購入可能である。
　ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）などから購入可能である。
　ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するｉＰＳ細胞を使用できる。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ｉＰＳ細胞の好ましい例としては、ヒトまたはマウスに由来するｉＰＳ細胞が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞の具体例として、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２００８；２６：１０１－１０６）が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８　Ｊｕｌ　３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｊａｎ　９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｎｏｖ　６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｍａｙ　８；４（５）：３８１－４）などが挙げられる。
　作成されたｉＰＳ細胞は、その作出方法によらずいずれも本発明に用いられうる。
　ヒトｉＰＳ細胞株としては、具体的には、２５３Ｇ１株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、２０１Ｂ７株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ－ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１５０３－ｉＰＳ（２９７Ａ１）（７３歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ－ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、１３９２－ｉＰＳ（２９７Ｆ１）（５６歳男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ－ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）、ＮＨＤＦ－ｉＰＳ（２９７Ｌ１）（新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ－ＭＹＣを発現させて作成されたｉＰＳ細胞株）等が挙げられる。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法では、前記幹細胞を重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において培養する。
　本発明において、細胞外マトリクスタンパク質は、細胞の外側の空間を構成するタンパク質であって、細胞接着作用を有し、そこで培養される細胞が正常な細胞の機能維持、自己増殖及び分化を行うことができるものであれば、その種類は特に制限されないが、基底膜を構成する細胞外マトリクスタンパク質が好ましい。そのような細胞外マトリクスタンパク質としては、例えば、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ナイドジェン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチンおよびテネイシンなどが挙げられ、そのうち、コラーゲン中でもＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカンの中でもヘパラン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、ナイドジェン、エンタクチンおよびフィブロネクチンは基底膜を構成する細胞外マトリクスタンパク質として好ましい。また、細胞外マトリクスタンパク質としては市販されているものも用いることができ、例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜成分で構成されるマトリゲル（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、本発明において好ましく用いることができる。
　前記細胞外マトリクスタンパク質は、本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法に用いる際に、予め細胞培養器上で重合化される。重合化は、前記細胞外マトリクスタンパク質を、予め低温で溶解させておき、２２～３５℃でインキュベートすることによって、容易に重合化させることができる。重合化される細胞外マトリクスタンパク質でコートされる細胞培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。好ましくは、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート等である。
　幹細胞は、モノセルとして懸濁した該細胞を、培地中に懸濁し、前記の重合化された細胞外マトリクスタンパク質上に１．０×１０３の密度で播種すればよい。培養は、通常、５％ＣＯ２／９５％　ａｉｒ、３７℃のインキュベーター内で７～２０日間、好ましくは１２～２０日間培養し、幹細胞を神経系細胞へと分化させることができる。
　用いられる培地としては、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下、基礎培地）であってよく、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の培地であれば培地の組成は製造元によらず同等である。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法で用いられる培地は、血清含有培地であってもよいが、無血清培地であることが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない基礎培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、又はこれらの均等物が挙げられる。これらの培地中の濃度は、例えば、通常０．０１～２０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。
　ノックアウトシーラムリプレースメントはＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の試薬あるいは添加物であれば組成は製造元によらず同等である。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法で用いられる培地はまた、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）又は抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）等を含有してもよい。これらの培地中の濃度は、前記した血清代替物の培地中の濃度と同様である。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法においては、幹細胞の培養は５－ＨＴ神経細胞誘導剤としてＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを培地中に添加して行われる。
　ＢＭＰ受容体は、細胞外に分泌されるタンパク質であるＢＭＰ（骨形成タンパク質：Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体型セリン／スレオニンキナーゼであり、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体に大別される。ＢＭＰ受容体としてＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ）が知られている。ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤としては、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（ＬＤＮ－１９３１８９）、４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（ＤＭＨ－１）などが挙げられる。その中でも、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅが好ましく用いられる。
　５－ＨＴ７受容体は、トリプトファンから合成されるセロトニンをリガンドとしたセロトニン受容体サブタイプの１つであり、Ｇタンパク質結合型受容体である。５－ＨＴ７受容体アゴニストとしては、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ（ＡＳ－１９）、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬＰ１２）、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬＰ４４）などが挙げられる。その中でも、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎが好ましく用いられる。
　ＴＧＦ－β受容体は、ＢＭＰとファミリーを形成するＴＧＦ－βの受容体型セリン／スレオニンキナーゼであり、ＢＭＰ受容体と同様、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体に大別される。Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドとしては、例えば、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１が挙げられる。ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１は、例えばＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから購入することができる。また、上記リガンドはアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）として、例えば、ＴＧＦ－β１の場合、ＮＣ　００００１９．９（ＮＰ　０００６５１．３）（ヒト）、ＮＣ　００００７３．５（ＮＰ　０３５７０７．１）（マウス）として、ＴＧＦ－β２の場合、ＮＣ　０００００１．１０（ＮＰ　００１１２９０７１．１）（ヒト）、ＮＣ　００００６７．５（ＮＰ　０３３３９３．２）（マウス）として、ＴＧＦ－β３の場合、ＮＣ　００００１４．８（ＮＰ００３２３０．１）（ヒト）、ＮＣ　００００７８．５（ＮＰ　０３３３９４．２）（マウス）として、Ａｃｔｉｖｉｎは、ＮＣ　０００００７．１３（ＮＰ　００２１８３．１）（ヒト）、ＮＣ　００００７９．５（ＮＰ　０３２４０６．１）（マウス）として、Ｎｏｄａｌは、ＮＣ　００００１０．１０（ＮＰ　０６０５２５．３）（ヒト）、ＮＣ　００００７６．５（ＮＰ　０３８６３９．２）（マウス）として、ＧＤＦ－１は、ＮＣ　００００１９．９（ＮＰ　００１４８３．３）（ヒト）、ＮＣ　００００７４．５（ＮＰ　００１１５６７５４．１）（マウス）として、ＧＤＦ－８は、ＮＣ　０００００２．１１（ＮＰ　００５２５０．１）（ヒト）、ＮＣ　００００６７．５（ＮＰ　０３４９６４．１）（マウス）として、ＧＤＦ－１１は、ＮＣ　００００１２．１１（ＮＰ　００５８０２．１）（ヒト）、ＮＣ　００００７６．５（ＮＰ　０３４４０２．１）（マウス）として、タンパク質の塩基配列（アミノ酸配列）を容易に入手することができるので、当業者は周知の組換えタンパク質技術を用いて各種リガンドを容易に作製することができる。
　前記ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドは、幹細胞培養中のいかなる時点において添加してもよいが、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤については、培養開始後０～５日目までに培地に添加することが好ましく、５－ＨＴ７受容体アゴニストについては、培養開始後６～１４日に添加することが好ましいが、本発明の製造方法においては、成熟神経細胞は培養８日目以降に誘導されるため、５－ＨＴ７受容体アゴニストのうちＡＳ－１９の場合は、培養開始後６～７日目以降に添加することが好ましい。また、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドについては、培養開始後０～５日に添加することが好ましい。
　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドは、それぞれ単独で添加されてもよいし、同時に添加されてもよい。さらに、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドはそれぞれ２種類以上の剤、リガンドが同時に添加されてもよい。
　前記ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの培地中への添加量は、当業者が適宜決定することができる。しかし、例えば、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅであれば、１ｎＭ～１０００ｎＭ、好ましくは、１０ｎＭ～３００ｎＭで添加することが例示される。また、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎであれば、０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは、１μＭ～１０μＭで添加することが例示される。当業者は前記の範囲を変更して用いることもできる。
　また、前記５－ＨＴ神経細胞誘導剤としては、さらにｎｏｇｇｉｎを共存させていてもよい。ｎｏｇｇｉｎは、前記Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドと同様、例えばＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから購入することができる。また、ｎｏｇｇｉｎはアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ）として、例えば、Ｎｐ＿０３２７３７（マウス）、ＡＡＨ３４０２７（ヒト）として、タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列を容易に入手することができるので、当業者は周知の組換えタンパク質技術を用いてｎｏｇｇｉｎを容易に作製することができる。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造方法においては、前記の培養の結果、幹細胞から分化誘導された５－ＨＴ神経細胞の確認を行う。
　上記５－ＨＴ神経細胞に分化誘導されたことの確認は、
（１）５－ＨＴ量を計測すること、又は
（２）５－ＨＴ神経細胞のマーカーを免疫染色すること
の少なくともいずれか一方を行うことで確認することができるが、これらの方法に限定されず、５－ＨＴ神経細胞が存在することを検証できればよい。
　５－ＨＴ量の計測は、これに限るものではないが、既存の生体アミン量の測定方法（Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８９，１７０：７５－８２）を用いて行うことができる。すなわち、培養したＥＳ細胞に対し、高濃度（例えば５６ｍＭ）のＫ＋を含む溶液を加えてインキュベートし、該溶液をＨＰＬＣ／ＥＣＤ等により測定することで行うことができる。Ｋ＋を含む溶液としてはＨａｎｋｓ液等の緩衝塩類溶液を用いることができるが、これに限られない。
　また、５－ＨＴ神経細胞のマーカーとしては、５－ＨＴまたは５－ＨＴ合成酵素を用いることができるがこれに限られない。セロトニン神経に特異的に発現している公知のマーカーを用いればよい。
　５－ＨＴ及び５－ＨＴ合成酵素に対する抗体を用いて免疫染色する場合、５－ＨＴ及び５－ＨＴ合成酵素は細胞表面には発現していないため、染色すべき細胞を周知の方法により固定化した後、界面活性剤等により細胞膜の透過性を増大させることにより抗体分子を細胞内に到達できるようにすることが好ましい。
　なお、５－ＨＴ神経細胞の細胞表面に発現している適切なマーカーが存在しないため、例えばＦＡＣＳを用いて濃縮する場合、５－ＨＴ神経特異的にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等を発現するように予め形質転換する方法等を用いる必要がある。ただし、本発明に係る方法を用いて作製した５－ＨＴ神経細胞標品を用いれば、適当な細胞表面マーカーを見出すことができる可能性がある。
　本発明はまた、５－ＨＴ神経細胞を製造するキットとして、細胞外マトリクスタンパク質、幹細胞、５－ＨＴ神経細胞誘導剤としてのＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞製造キットを提供する。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞製造キットは試薬、器具、装置等が含まれていればよく、特に限定されるものではない。細胞外マトリクスタンパク質、５－ＨＴ神経細胞誘導剤としてのＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドは、前記５－ＨＴ神経細胞製造方法において述べたものと同一のものを用いることができ、５－ＨＴ神経細胞誘導剤としては、前記５－ＨＴ神経細胞製造方法と同様にｎｏｇｇｉｎをさらに含んでいてよい。また、それらは、乾燥状態で提供されても、溶液状態で提供されてもよい。該キットを用いて、前記５－ＨＴ神経細胞製造方法を実施することにより、５－ＨＴ神経細胞を作製することができる。また、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤としては、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅなどが好ましく含まれてよく、その中でも、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅがより好ましい。５－ＨＴ７受容体アゴニストとしては、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどが好ましく含まれてよく、その中でも、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎがより好ましい。Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドとしては、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１などが好ましく含まれる。また、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドは２種類以上が含まれていてもよい。さらに、本キットは幹細胞として、前記５－ＨＴ神経細胞製造方法において述べたものと同一のものを用いることができ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞として含まれてよい。
　５－ＨＴ神経の機能不全は、攻撃性及び衝動性の増加や摂食障害等の一因であることが知られており、幾つかの精神疾患（例えば、統合失調症、うつ病、自閉症、摂食障害、睡眠障害など）、脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の原因の一つとして挙げられている。前記疾患、症状を改善・緩和するストラテジーとしては、機能不全に陥った５－ＨＴ神経細胞を新たな５－ＨＴ神経細胞に代替させることが想定される。本発明では、ＢＭＰ受容体シグナル、５－ＨＴ７受容体シグナルまたはＩ型ＴＧＦ－β受容体シグナルが、幹細胞からの５－ＨＴ神経細胞への分化に関与していることを見出した。従って、本発明は、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞再生剤を提供する。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤の投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、軟膏、スプレー剤などが挙げられる。好ましくは非経口投与、さらに好ましくは注射剤である。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤の製剤上の必要に応じて添加される成分としては、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などが挙げられる。賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ－マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
　特に好ましい剤形である水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤には抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
　抗酸化剤、等張化剤、懸濁剤、安定化剤、溶解補助剤及び防腐剤としては、前記されたものが、それぞれ挙げられる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）等を適宜選択し使用できるが、ｐＨが６～９の緩衝液が好ましい。制菌剤としては、オキソリン酸、オルメトプリム、トリメトプリム、サルファ剤、ホスホマイシン、ペニシリン系抗菌剤、セファロスポリン系抗菌剤、バンコマイシン、テトラサイクリン系抗菌剤、リファンピシン、フルオロキノン系抗菌剤などが挙げられ、増粘剤としてはアラビアゴム、リピオドール、ポリアクリル酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。
　注射剤であった場合、本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤の投与量及び投与回数は、投与対象の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、通常、例えば、投薬単位剤形当たりＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニストまたはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを通常５～５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５～１００ｍｇ、その他の剤形では１０～２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。投与は単回投与でもよく、また複数回投与してもよい。
　また投与の一態様において、本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤は、脳内に直接投与されてもよい。投与方法としては、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）に懸濁した本発明の５－ＨＴ神経細胞再生剤を、手術腔へ注射により投与する方法、カテーテルを通じて投与する方法などが挙げられる。
　本発明はまた、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの存在下、重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において幹細胞を培養することによって得られる５－ＨＴ神経細胞を含む、精神疾患（例えば、統合失調症、うつ病、自閉症、摂食障害、睡眠障害など）または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療のための移植用組成物を提供する。５－ＨＴ神経細胞自体を移植、定着させることで、前記再生剤によって神経幹細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ分化誘導が達成できない場合に、有効である。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞を含む移植用組成物は低毒性であり、特に、本発明の５－ＨＴ神経細胞の製造方法はフィーダー細胞や血清を用いる必要がないため、移植の際にレシピエント側に外来性因子を持ち込む懸念がない点で好適である。また、幹細胞として患者自身に由来するｉＰＳ細胞を用いれば、ＨＬＡの不一致の問題がなく免疫応答による拒絶反応を回避できる。従って、本発明の製造方法で得られた５－ＨＴ神経細胞をそのまま移植してもよいし、または一旦凍結保存し、用時に解凍して用いることもできる。移植される患者（対象）としては、ヒトまたは他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）などが挙げられる。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞を含む移植用組成物は、５－ＨＴ神経細胞のほかに移植上適切な無菌の水性液に懸濁することによって調製できる。無菌の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が挙げられる。
　本発明の５－ＨＴ神経細胞を含む移植用組成物に含まれる細胞数は、移植対象、移植範囲、対象疾患、その重篤度などによっても異なるが、例えば、成人の精神疾患患者の場合、本発明の５－ＨＴ神経細胞を含む移植用組成物を１回移植量として、通常１０～１００，０００細胞数程度、好ましくは１００～１０，０００細胞数程度を移植することができる。また、移植は定着の程度をみて、日数を置いて複数回実施してもよい。
　以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
材料および方法
（１）ＥＳ細胞の培養
　マウスＥＳ細胞（Ｅ１４株）を、０．１％ゼラチンによりコーティングした１０ｃｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈに１０００Ｕ／ｍＬ　ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ）存在下、１０％牛胎児血清、ＥＳＭ［０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ；Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含むＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ）］を用いて播種し、５％ＣＯ２／９５％　ａｉｒ、３７℃のインキュベーター内で培養した。継代はｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％　ｔｒｙｐｓｉｎ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ）（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて１日おきに行った。
（２）マトリゲルを用いたＥＳ細胞培養系
　マトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｄｕｃｅｄ）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）３０μｌ／ｗｅｌｌを４８－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに入れて広げ、過剰に残るマトリゲル約１５μｌを除いた後、３７℃、３０分の静置により重合化させたものを用いて培養を行った。シングルセルに分散し懸濁した未分化ＥＳ細胞を、８×１０２ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、ＥＳ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ［ＥＳＭ／１０％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）］中に懸濁し、１５０μＬ／ｗｅｌｌを播種した。これを、５％ＣＯ２／９５％　ａｉｒ、３７℃のインキュベーター内で１４日間培養し、ＥＳ細胞を神経系細胞に分化させた。培養開始から、毎日培地を交換した。
（３）各種因子の添加
　因子として、Ｎｏｇｇｉｎ（発明者らが作製）、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤のＬＤＮ－１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）、５－ＨＴ作動薬としてセロトニン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＲ　１２７９３５　塩酸塩水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、シサプリド一水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＳ　１９（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＢ　２６９９７０　塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ）、フルオキセチン塩酸塩（ＬＫＴ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体キナーゼ阻害剤としてＳＢ４３１５４２をそれぞれ用いた。Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤は培養０～５日、５－ＨＴ作動性薬は培養６～１４日、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体キナーゼ阻害剤は培養０～５日に培養液中に添加した。
（４）ルシフェラーゼアッセイ
　５－ＨＴ神経分化の指標となる、Ｐｅｔ－１（ＦＥＶ（ＥＴＳ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ））遺伝子のエンハンサー領域の配列（マウスＰｅｔ１　ｅｘｏｎ　１の５’末端の６５ｂｐ上流から始まる１，８４５ｂｐ）の下流にＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子を機能可能に連結した融合遺伝子をトランスフェクションしたＥＳ細胞を前記各種因子の存在下または非存在下において培養し、該培養液からルシフェラーゼタンパク質を回収し、ＢｉｏＬｕｘ　Ｇａｕｓｓｉａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｆｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。まず１サンプルにつき、Ｂｕｆｆｅｒ　２５μｌ、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ　４μｌ、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　０．２５μｌを混合し、２５分間、室温、遮光条件下で静置した。そしてその溶液を、測定するサンプル　５μｌを入れておいた９６ｗｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）に２５μｌ添加し、１０分後にマイクロルミノメーター（Ｌｕｍｉ　Ｃｏｕｎｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて各サンプルの発光量を計測した。
（５）細胞免疫染色
　２４－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで分化培養を行い、培養１４日目の細胞に対して免疫染色した。まず細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで４℃、１０分間固定化した。これをＰＢＳで１回洗浄後、ＰＢＳＴ（０．１ｍＭ　ＰＢＳ　ｗｉｔｈ　０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ）／１０％ＦＢＳでブロッキング処理を行った。一次抗体としてマウス抗ＧＦＰモノクローナル抗体（５００倍希釈，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ラビット抗セロトニンポリクローナル抗体（１０００倍希釈，ＤｉａＳｏｒｉｎ）、マウス抗Ｔｕｊ１モノクローナル抗体（５００倍希釈，Ｃｏｖａｎｃｅ）、ラビット抗Ｍａｐ２抗体（５００倍希釈，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をブロッキング溶液で希釈し、４℃で一晩反応させた。　
　一次抗体反応後は、ＰＢＳＴで３７℃、１０分間、２回洗浄した。そして、二次抗体としてＡｌｅｘａ５９４－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　抗マウスＩｇＧ（１０００倍希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　抗ラビットＩｇＧ（１０００倍希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０００倍希釈、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）をブロッキング溶液で希釈し、３７℃、１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴで３７℃、１０分間、３回洗浄した後、スライドグラス上にマウントし、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
（６）ドパミン、セロトニン濃度の測定
　ＥＳ細胞をマトリゲル上での培養１０日目からＡＳ－１９を添加して培養し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄し、５６ｍＭ　Ｋ＋を含むＨＢＳＳを５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートして、培養１８日目にサンプルとして回収した。測定は高速液体クロマトグラフィー／電気化学検出器（ＨＰＬＣ／ＥＣＤ）システムにサンプル１０μｌをマニュアルインジェクションし、ドパミンおよびセロトニンを同時検出した。測定条件として、カラムにはＥｉｃｏｍｐａｋ　ＣＡ－５０ＤＳ（２．１ｍｍ　ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ，Ｅｉｃｏｍ）を、ＨＰＬＣの移動相には５００ｍｇ／ｌデカンスルホン酸ナトリウム、１３４μＭ　ＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、流速０．２３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度２５℃、ＥＣＤの加圧電圧は４５０ｍＶとし、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極、作用電極にはグラファイト標準電極（Ｅｉｃｏｍ）を用いて測定した。
（７）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
　ＲＮＡ抽出はグアニジンチオシアネート酸性フェノール法により行った。また、逆転写反応はＥＳ細胞あるいは分化誘導した細胞より抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１．０μｇを鋳型として、逆転写酵素Ｍ－ＭＬＶ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて行い、ｃＤＮＡプールを作製した。得られたｃＤＮＡプールを２０倍希釈したものを鋳型として、各遺伝子に特異的なプライマー、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣＦＸ　９６　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行った。内部標準としてはラットβ－ａｃｔｉｎを用いた。反応条件は９５℃　１５秒、５８～６６℃　６０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。用いた特異的プライマーの配列と、それぞれのアニーリング温度は、下記の通りである。
β－ａｃｔｉｎ：６０℃　
５’－ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ－３’　（配列番号１）
５’－ＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＡ－３’　（配列番号２）
５－ＨＴ７受容体：６６℃
５’－ＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＧＡＡＴＡＴＣＡＡＣ－３’　（配列番号３）
５’－ＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＧＣＴＣＴ－３’　（配列番号４）
５－ＨＴ１Ａ受容体：６０℃
５’－ＴＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴ－３’　（配列番号５）
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＴＧＣＧ－３’　（配列番号６）
Ｉｄ－１：６４℃　
５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧＡＣＣＡＣ－３’　（配列番号７）
５’－ＧＡＴＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＣ－３’　（配列番号８）
Ｉｄ－２：５８℃
５’－ＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＣＣＡＧ－３’　（配列番号９）
５’－ＡＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧ－３’　（配列番号１０）
Ｉｄ－３：６６℃
５’－ＣＡＴＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡ－３’　（配列番号１１）
５’－ＣＡＣＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＡＧＣ－３’　（配列番号１２）
Ｓｍａｄ７：６６℃　
５’－ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣ－３’　（配列番号１３）
５’－ＴＴＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧ－３’　（配列番号１４）
Ｐｉｔｘ２：６４℃
５’－ＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧ－３’　（配列番号１５）
５’－ＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣ－３’　（配列番号１６）
Ｌｅｆｔｙ１：６６℃
５’－ＴＣＧＡＴＣＡＡＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧ－３’　（配列番号１７）
５’－ＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣ－３’　（配列番号１８）
Ｌｅｆｔｙ２：６４℃
５’－ＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧ－３’　（配列番号１９）
５’－ＣＣＴＣＴＣＧＡＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡ－３’　（配列番号２０）
実施例１：ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤による５－ＨＴ神経分化誘導
　発明者らはＮｏｇｇｉｎが５－ＨＴ神経分化誘導作用をもつことと同時に、他の主なＢＭＰアンタゴニストであるＣｈｏｒｄｉｎやＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎには同様な作用が全く認められないことを明らかにした。
　そこで、本実施例ではＢＭＰアンタゴニストとは異なる作用点からＢＭＰシグナルの遮断を引き起こす、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤の選択的阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９を用いて、５－ＨＴ神経分化誘導作用を検討した。
　ＬＤＮ－１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）を培養０～５日に培養液中に添加し、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養した。用いたＥＳ細胞および培養方法は前記に従い、培養１４日目における５－ＨＴ神経分化を評価した。その結果、ＬＤＮ－１９３１８９（３～１００ｎＭ）が、５－ＨＴ神経の分化誘導作用をもつことが明らかになった（図１）。
実施例２：５－ＨＴが５－ＨＴ神経分化に与える影響
　５－ＨＴが５－ＨＴ神経の分化に影響を与えうることが、げっ歯類の胎児脳の初代培養細胞を用いた研究によって報告されているが、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性の未分化幹細胞からの神経分化系において、５－ＨＴや５－ＨＴ受容体に作用する薬物が５－ＨＴ神経分化にどのような作用をもつのかについては、全く不明であった。そこで、各種５－ＨＴ受容体アゴニスト、アンタゴニストが５－ＨＴ神経分化に与える影響を検討した。
５－ＨＴが５－ＨＴ神経分化に与える影響
　５－ＨＴ、５－ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体アンタゴニスト、ＳＳＲＩ、５－ＨＴ４，７受容体アゴニストを加え、培養１４日後の５－ＨＴ神経分化を評価した（図２）。５－ＨＴ、５－ＨＴ１Ｂ／１Ｄ受容体アンタゴニストであるＧＲ　１２７９３５、ＳＳＲＩであるＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、５－ＨＴ４受容体アゴニストであるＣｉｓａｐｒｉｄｅは５－ＨＴ神経分化を促進しなかった。これに対して、５－ＨＴ７受容体アゴニストであるＡＳ－１９（１～１０μＭ）は、５－ＨＴ神経分化を促進することが明らかになった。次に、５－ＨＴ７受容体のアゴニスト、アンタゴニストを、Ｎｏｇｇｉｎの添加時でも調べたところ、５－ＨＴ７受容体アゴニストＡＳ－１９はＮｏｇｇｉｎ単独の効果をさらに促進する傾向を示し、逆に５－ＨＴ７受容体アンタゴニストＳＢ　２６９９７０は、Ｎｏｇｇｉｎによる作用を強く阻害した（図３Ａ）。またこのとき、抗５－ＨＴ抗体を用いた免疫染色によって、ＳＢ　２６９９７０が、Ｎｏｇｇｉｎによって誘導された５－ＨＴ神経を含むコロニー内の５－ＨＴ神経細胞数を減少させることが確認された（図３Ｂ）。
実施例３：５－ＨＴ７受容体アゴニスト（ＡＳ－１９）による５－ＨＴ神経分化誘導
　５－ＨＴ７受容体アゴニストであるＡＳ－１９の存在または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で１８日培養し、５－ＨＴ神経分化をドパミン、セロトニン濃度の測定することによって評価した。ＡＳ－１９はマトリゲル培養１０日目から１０μＭで添加を開始した。その結果、ＡＳ－１９を添加した場合は、ＡＳ－１９を添加しなかった場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、セロトニン濃度が有意に高いことが明らかとなった（図４）。
実施例４：Ｎｏｇｇｉｎによる５－ＨＴ神経分化誘導
　Ｎｏｇｇｉｎの存在または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養し、５－ＨＴ神経分化を５－ＨＴ１Ａ受容体および５－ＨＴ７受容体のｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって評価した。Ｎｏｇｇｉｎはマトリゲル培養開始から５日目まで２００ｎｇ／ｍＬ相当量で添加を開始し、培養後８、１０、１２、１４日目に細胞を回収し、該細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを実施した。その結果、Ｎｏｇｇｉｎを添加した場合は、Ｎｏｇｇｉｎを添加しなかった場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、５－ＨＴ１Ａ受容体および５－ＨＴ７受容体のｍＲＮＡ発現レベルが有意に高いことが明らかとなった（図５、６）。
実施例５：５－ＨＴ７受容体アゴニストが５－ＨＴ神経分化に与える影響
　５－ＨＴ７受容体アゴニストである、ＡＳ－１９がマトリゲル上でＥＳ細胞を効率的に５－ＨＴ神経細胞に分化誘導し、またアンタゴニストがＮｏｇｇｉｎの５－ＨＴ神経細胞誘導効果を抑制したことから、５－ＨＴ７受容体が５－ＨＴ神経細胞への分化に関与することをうかがわせる。
　そこで、各種５－ＨＴ７受容体アゴニストを用いて、マトリゲル上でＥＳ細胞を５－ＨＴ神経細胞に効率的に分化させうるか否かの検討を行う。５－ＨＴ７受容体アゴニストとしては、ＡＳ－１９以外にも、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬＰ１２）、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬＰ４４）などを用いる。前記５－ＨＴ７受容体アゴニストの存在下、未処理細胞に比して、有意に５－ＨＴ神経分化が促進されれば、５－ＨＴ神経細胞誘導剤として選抜できる。また、Ｎｏｇｇｉｎを添加し、その５－ＨＴ神経細胞誘導効果をさらに高める５－ＨＴ７受容体アゴニストを５－ＨＴ神経細胞誘導剤として選抜してもよい。また、かかる評価は、５－ＨＴに対する免疫染色や５－ＨＴ量の計測によっても評価することができる。
実施例６：ＳＢ４３１５４２がセロトニン神経分化に与える影響（ルシフェラーゼアッセイ）
　ＴＧＦ－βシグナルの阻害剤ＳＢ４３１５４２は単独またはＢＭＰアンタゴニストＮｏｇｇｉｎとの共処置でヒトＥＳ細胞から神経細胞への分化を促進することが報告されている。そこで、５－ＨＴ神経分化に対してはＳＢ４３１５４２がどのような作用を示すのか検討を行うことにした。
　４８　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅでＮｏｇｇｉｎとＳＢ４３１５４２は培養開始から５日目まで添加を行い、Ｎｏｇｇｉｎは２００ｎｇ／ｍＬ相当量で、ＳＢ４３１５４２は０．１～１０μＭで添加した。培養１４日目にそれぞれの培養液を回収しルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、ＳＢ４３１５４２の１０μＭはＮｏｇｇｉｎの５－ＨＴ神経分化誘導作用を有意に抑制することが明らかとなった。このことから、ＴＧＦ－βシグナルを抑制することで５－ＨＴ神経への分化が抑制されることが明らかとなった（図７）。
実施例７：ＳＢ４３１５４２がセロトニン神経分化に与える影響（免疫染色）
　２４　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅでＮｏｇｇｉｎは２００ｎｇ／ｍＬ相当量、ＳＢ４３１５４２は１～１０μＭで培養開始から５日目まで添加を行い１４日間培養を行った。培養１４日目に２ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＤｉｓｐａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を４００μＬ／ｗｅｌｌで加え、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ，３７℃のインキュベーター内で２時間静置させた後、剥離したコロニーを１．５ｍＬ　ｔｕｂｅに回収して遠心（５０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除いた。そしてＰＢＳで洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ）を１００μＬ／ｔｕｂｅで加えよくピペッティングを行った。その３分後、ＥＳＭ／１０％ＦＢＳを５００μＬ加え反応を止め、再び遠心（５０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除いた。そして、ＥＳＭ／１０％ノックアウトシーラムリプレースメントで４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁を行い、０．０７５％ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅでコーティングしたカバーガラスをのせた２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅの上に５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。そして５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ，３７℃のインキュベーター内で６時間静置させた後免疫染色を行った。その結果、ＳＢ４３１５４２を１μＭ以上の濃度で添加すると有意に神経細胞における５－ＨＴ神経細胞の割合が低下した（図８）。しかし、全細胞における神経細胞の割合はいずれの濃度においても変化しなかった。これよりＳＢ４３１５４２によりＴＧＦ－βシグナルを阻害すると、５－ＨＴ神経細胞への分化が特異的に阻害されることが明らかとなった。
実施例８：ＮｏｇｇｉｎがＴＧＦ－βおよびＢＭＰシグナルの下流遺伝子の発現に与える影響
　Ｎｏｇｇｉｎの存在または非存在下、ＥＳ細胞をマトリゲル上で培養し、ＴＧＦ－βおよびＢＭＰシグナルの下流遺伝子の発現に対する影響をｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって評価した。Ｎｏｇｇｉｎはマトリゲル培養開始から２日目まで２００ｎｇ／ｍＬ相当量で添加し、培養後２日目に細胞を回収し、該細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを実施した。その結果、Ｎｏｇｇｉｎの添加によりＢＭＰシグナルの下流遺伝子として知られるＩｄ遺伝子はいずれも発現が減少しており、逆にＴＧＦ－βの下流遺伝子として知られるＬｅｆｔｙの発現が上昇していた。ただし、同じくＴＧＦ－βの下流遺伝子として知られているＳｍａｄ７やＰｉｔｘ２はＮｏｇｇｉｎによる発現変化が認められなかった（図９）。以上より、ＮｏｇｇｉｎによりＢＭＰシグナルが抑制されているだけでなく、ＴＧＦ－βシグナルが少なくとも部分的に活性化していることが明らかになり、また、実施例６，７の通り、ＴＧＦ－βシグナルの阻害剤ＳＢ４３１５４２がＴＧＦ－βシグナルを阻害すると、５－ＨＴ神経分化が特異的に抑制されることから、Ｎｏｇｇｉｎの５－ＨＴ神経分化促進作用にＴＧＦ－βシグナルの活性化が関与している可能性が新たに示唆された。
　本発明において、５－ＨＴ７受容体の５－ＨＴ神経細胞分化への関与が初めて見出され、５－ＨＴ神経細胞が、統合失調症、うつ病、自閉症、摂食障害、睡眠障害などの精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛などを伴う症状への関与の可能性が疑われることから、ＢＭＰ受容体、５－ＨＴ７受容体、Ｉ型ＴＧＦ－β受容体の該疾患、症状との関わりを解明することは将来的な該疾患の治療剤の開発に利用可能である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１１－０３５１９２（出願日：平成２３年２月２１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (22)

  1. 　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドの存在下、重合化した細胞外マトリクスタンパク質上において幹細胞を培養する、５－ＨＴ神経細胞製造方法。
  2. 　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅまたは４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅから少なくとも１つ選択される、請求項１記載の製造方法。
  3. 　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅである、請求項２記載の製造方法。
  4. 　５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅから少なくとも１つ選択される、請求項１記載の製造方法。
  5. 　５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎである、請求項４記載の製造方法。
  6. Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドが、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１から少なくとも１つ選択される、請求項１記載の製造方法。
  7. 　ｎｏｇｇｉｎの共存在下において培養する、請求項１－６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１－７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　細胞外マトリクスタンパク質、幹細胞、５－ＨＴ神経細胞誘導剤としてのＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  10. 　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅまたは４－［６－［４－（１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅから少なくとも１つ選択される、請求項９記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  11. 　ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤が、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅである、請求項１０記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  12. 　５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎ、４－（２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、４－［２－（Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－（１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈｅｘａｎａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅから少なくとも１つ選択される、請求項９記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  13. 　５－ＨＴ７受容体アゴニストが、（２Ｓ）－（＋）－５－（１，３，５－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｔｅｔｒａｌｉｎである、請求項１２記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  14. Ｉ型ＴＧＦ－β受容体リガンドが、ＴＧＦ－β、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１から少なくとも１つ選択される、請求項９記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  15. 　ｎｏｇｇｉｎをさらに含む、請求項９－１４のいずれか１項に記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  16. 　幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項９－１５のいずれか１項に記載の５－ＨＴ神経細胞製造キット。
  17. ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを含む、５－ＨＴ神経細胞再生剤。
  18. ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンドを患者に有効量投与することを含む、５－ＨＴ神経細胞再生方法。
  19. ５－ＨＴ神経細胞再生剤として使用するための、ＢＭＰ受容体キナーゼ阻害剤、５－ＨＴ７受容体アゴニスト、またはＩ型ＴＧＦ－β受容体リガンド。
  20. 請求項１－８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞を含む、精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療のための移植用組成物。
  21. 請求項１－８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞を患者に有効量移植することを含む、精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療方法。
  22. 精神疾患または脊椎損傷後の運動機能障害、疼痛の治療のための移植用組成物として使用するための、請求項１－８のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される５－ＨＴ神経細胞。
PCT/JP2012/054175 2011-02-21 2012-02-21 ５－ｈｔ神経細胞の製造方法 WO2012115120A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-035192 2011-02-21
JP2011035192 2011-02-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012115120A1 true WO2012115120A1 (ja) 2012-08-30

Family

ID=46720896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/054175 WO2012115120A1 (ja) 2011-02-21 2012-02-21 ５－ｈｔ神経細胞の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2012115120A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016515119A (ja) * 2013-03-14 2016-05-26 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． Ｂｍｐ阻害剤およびその使用方法
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
WO2017161001A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
US11499138B2 (en) 2016-10-21 2022-11-15 National University Corporation Gunma University Method for manufacturing peripheral nerve cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008125448A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Osaka Univ セロトニン神経の作製方法
WO2011019092A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008125448A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Osaka Univ セロトニン神経の作製方法
WO2011019092A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALENINA N. ET AL.: "Specification and differentiation of serotonergic neurons", STEM CELL REV., vol. 2, no. 1, 2006, pages 5 - 10 *
GALTER D. ET AL.: "Developmental regulation of the serotonergic transmitter phenotype in rostral and caudal raphe neurons by transforming growth factor-betas", J.NEUROSCI. RES., vol. 56, no. 5, 1999, pages 531 - 538 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016515119A (ja) * 2013-03-14 2016-05-26 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． Ｂｍｐ阻害剤およびその使用方法
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
WO2017161001A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
EP4049665A1 (en) 2016-03-15 2022-08-31 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
US11499138B2 (en) 2016-10-21 2022-11-15 National University Corporation Gunma University Method for manufacturing peripheral nerve cells

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6419073B2 (ja) ドパミン神経細胞の製造方法
JP6974180B2 (ja) 中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方法
US20190169576A1 (en) Generation of midbrain-specific organoids from human pluripotent stem cells
JP7236114B2 (ja) 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物
KR20190039434A (ko) 만능 세포를 분화시키는 방법
KR20200010279A (ko) 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법
US20230233617A1 (en) Methods for differentiating stem cells into dopaminergic progenitor cells
WO2012115120A1 (ja) ５－ｈｔ神経細胞の製造方法
AU2020336221A1 (en) Methods of generating and isolating midbrain dopamine neurons
US20030082802A1 (en) Method for neural stem cell differentiation using 5ht1a agonists
JP2023169391A (ja) 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法
US20240050486A1 (en) Methods of generating cortical excitatory neurons
WO2023201229A1 (en) Methods for making and using differentiated neural cells
EP3778871A1 (en) Method for producing stem cell-derived lacrimal gland tissue
US20230126711A1 (en) Enteric nitrergic neurons and methods of using the same
CA3177525A1 (en) Methods of generating midbrain dopamine neurons, midbrain neurons and uses thereof
JP2022041601A (ja) 骨又は軟骨関連疾患のスクリーニング方法
US20190093074A1 (en) Methods of diffrentiating stem cell-derived proprioceptors
WO2021015245A1 (ja) 繊毛関連疾患モデルおよびその利用
US20240150709A1 (en) Compositions and methods for making parasympathetic neurons
JP2022127433A (ja) マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地及びその使用
CA3233545A1 (en) Methods for producing cartilage and bones
JP2023028848A (ja) シナプス形成促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12749059

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12749059

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP