WO2021015245A1 - 繊毛関連疾患モデルおよびその利用 - Google Patents

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WO2021015245A1
WO2021015245A1 PCT/JP2020/028474 JP2020028474W WO2021015245A1 WO 2021015245 A1 WO2021015245 A1 WO 2021015245A1 JP 2020028474 W JP2020028474 W JP 2020028474W WO 2021015245 A1 WO2021015245 A1 WO 2021015245A1
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cells
renal
inhibitor
ips
cyst formation
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PCT/JP2020/028474
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English (en)
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健二 長船
清水　達也
利和 荒岡
伸一 前
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国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a cyst formation model obtained from a renal organoid derived from induced pluripotent stem (iPS) cells derived from a patient with a cilia-related disease, and a method for screening or evaluating a therapeutic agent for a cilia-related disease using the cyst formation model.
  • iPS induced pluripotent stem
  • ADPKD Autosomal dominant polycystic kidney disease
  • Non-Patent Documents 1 to 4 it is unclear whether or not the developmental process of the kidney is accurately reproduced.
  • forskolin administration did not show a significant difference in cyst formation compared to healthy controls.
  • the iPS cell line derived from ADPKD patients (PKD1 heterozygous deletion) is not stable in inducing differentiation into renal tissue, and no obvious pathological trait is observed as compared with the healthy iPS cell line.
  • An object of the present invention is to develop a cyst formation model that can be used for screening and evaluation of therapeutic agents for ciliated diseases such as autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD).
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • Patent Document 1 the group of inventors has developed a method for producing renal organoids from iPS cells. Then, in order to solve the above-mentioned problems, iPS cells were established from fibroblasts of ADPKD patients, and renal tissues prepared by using the differentiation induction method described in Patent Document 1 were present with forscolin, brevisstatin, etc. By culturing underneath, we succeeded in creating a renal cyst model. Then, using this model, it was found that by using the shape of the cyst, the dynamics of calcium, etc. as indicators, it is possible to efficiently screen and evaluate candidate substances for therapeutic agents for ciliary-related diseases such as ADPKD. Was completed.
  • Kidney organoids obtained by inducing differentiation of artificial pluripotent stem (iPS) cells obtained from somatic cells derived from patients with ciliary-related diseases or tubule cells (including tubule epithelial cells) contained therein. Hair-related, including contacting renal constituent cells such as (similarly) with a drug candidate and measuring calcium dynamics and / or cyst formation in renal constituent cells such as the renal organoid or tubule cells.
  • iPS pluripotent stem
  • Pluripotent stem cells are cultured in a medium containing FGF (fibroblast growth factor) 2, BMP (bone morphogenetic protein) 4, GSK (glycogen synthase kinase) -3 ⁇ inhibitor and retinoic acid or a derivative thereof.
  • FGF fibroblast growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • GSK glycosogen synthase kinase
  • the renal cyst model produced by the present invention reflects the pathophysiology of ciliary-related diseases such as cyst formation and decreased calcium release in a state closer to the living body, and is extremely excellent as an in vitro model of renal cyst formation.
  • ciliary-related diseases such as cyst formation and decreased calcium release in a state closer to the living body
  • the renal cyst model of the present invention it is possible to develop a therapeutic agent that suppresses renal cyst formation with unprecedented accuracy.
  • the pathological condition of cilia-related diseases such as ADPKD can be elucidated by using the pathological condition model produced by the present invention.
  • Fluorescence micrographs showing the results of immunostaining (LTL, ARL13B) on cilia in renal organoids (aggregate formation culture day 10) induced to differentiate from iPS cells derived from ADPKD patients.
  • the figure which shows the result of having induced the cyst formation by culturing the renal organoid which was induced to differentiate from the iPS cell derived from the ADPKD patient in the presence of forskolin (10 ⁇ M) or brevistatin (25 ⁇ M) (micrograph: bright field image).
  • cysts whose size falls within a certain order of higher rank are targeted for analysis, and the horizontal axis shows the number of cysts to be included in the analysis.
  • DMSO was used as the control.
  • kidney organoids including cysts formed by culturing a kidney organoid derived from an ADPKD patient (Patient-A) -derived iPS cell line in the presence of forskolin. Fluorescence micrograph (upper) showing the results of immunostaining and optical micrograph of the corresponding hematoxylin / eosin staining (lower). Statistics of the area ratio of renal cysts (Cystic Area) when renal organoids induced to differentiate from iPS cell lines derived from ADPKD patients (Patient-A) are cultured in the presence of forskolin and various drugs to induce cyst formation. A graph showing the results of a test. For control, only forskolin was added.
  • Forskolin presents renal organoids induced to differentiate from healthy-derived iPS cell lines (Wild-type) and mutation-introduced iPS cell lines (PKD1 heterozygous line (PKD1 +/- ) and PKD1 homozygous line (PKD1 -/- ))
  • the figure which shows the result which induced the cyst formation by culturing under the (micrograph: bright field image).
  • Forskolin presents renal organoids induced to differentiate from healthy subject-derived iPS cell lines (Wild-type) and mutation-introduced iPS cell lines (PKD1 heterostrain (PKD1 +/- ) and PKD1 homostrains (PKD1 -/- ))
  • the graph which shows the result of the statistical test of the area ratio (Cystic Area) of a renal cyst when it was cultured under the culture and induced cyst formation.
  • Immunostaining analyzed the expression of markers in renal organoids including cysts formed by culturing renal organoids induced to differentiate from mutant-introduced iPS cell lines (PKD1 homozygous strain (PKD1 -/- )) in the presence of forskolin. Fluorescence micrograph showing the results. The two images are immunostaining images of the same renal organoid, and the right figure is an enlarged photograph of the left figure.
  • the method for screening or evaluating a therapeutic agent for cilia-related diseases of the present invention is a renal composition such as renal organoids obtained by inducing differentiation of iPS cells obtained from somatic cells derived from patients with cilia-related diseases or tubule cells contained therein. It comprises contacting cells with a drug candidate and measuring calcium kinetics and / or cyst formation in the renal organoid or tubule cells and the like.
  • ciliopathy-related diseases include a disease called ciliopathy (ciliopathy or ciliopathy-related disease), which includes a disease in which cysts are formed in the kidney. More specifically, autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) ), Autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), and nephronophthisis.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • ARPKD Autosomal recessive polycystic kidney disease
  • nephronophthisis nephronophthisis
  • ADPKD diseases are generally caused by genetic abnormalities.
  • the causative genes of ADPKD include the PKD1 gene and the PKD2 gene.
  • the PKD1 gene encodes the membrane protein “Polycystin (PC) 1, transient receptor potential channel interacting” (Ensembl gene ID: ENSG00000008710) (formerly known as polycystic kidney disease 1 (autosomal dominant)).
  • Examples of PKD1 include proteins having an amino acid sequence registered in accession number: P98161 of the UniProtKB database. However, since the amino acid sequence of PKD1 differs depending on race, etc., it is not limited to this specific amino acid sequence, and has 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence.
  • the PKD2 gene encodes “polycystin (PC) 2, transient receptor potential cation channel” (Ensembl gene ID: ENSG00000118762) (formerly known as polycystic kidney disease 2 (autosomal dominant)).
  • Examples of PKD2 include proteins having an amino acid sequence registered in accession number: Q13563 of the UniProtKB database. However, since the amino acid sequence of PKD2 differs depending on race, etc., it is not limited to this specific amino acid sequence, and has 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more identity with the amino acid sequence. It may be an amino acid sequence.
  • patients with ciliary-related diseases preferably have mutations (including missense mutations, nonsense mutations, frameshift mutations, etc.) in these genes. It may be a heterozygous mutant individual having a mutation in one of the alleles, or a homomutant individual having a mutation in both alleles.
  • a heterozygous mutant individual having a mutation in one of the alleles
  • a homomutant individual having a mutation in both alleles.
  • ADPKD it develops in a heterozygous mutant individual, and since a homomutant individual does not give birth, a heterozygous mutant individual is preferable, and in the case of ARPKD and nephronophthisis, it develops in a homomutant individual, so a homomutant individual is preferable.
  • iPS cells may be produced using somatic cells derived from patients as they are, but iPS cells obtained from somatic cells derived from healthy humans (normal).
  • iPS cells obtained from somatic cells derived from healthy humans normal.
  • iPS cells obtained from somatic cells derived from cilia-related disease patients are reproduced and used. You may.
  • the somatic cells are not particularly limited, but include not only mature somatic cells but also fetal (pup) and neonatal (pup) somatic cells, and are any of primary cultured cells, passaged cells, and established cells. Is also included.
  • the somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, and (3) blood cells (peripheral).
  • Blood cells umbilical cord blood cells, etc.
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.) Etc.
  • differentiated cells such as brain cells, lung cells, renal cells and fat cells are exemplified.
  • the iPS cells can be produced, for example, by introducing a reprogramming factor into somatic cells.
  • the reprogramming factors are, for example, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, ECAT15.
  • Genes or gene products such as -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Is also good.
  • Combinations of reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010 / 102267, WO2010
  • a known method can be used for inducing differentiation of iPS cells into renal organoids, but a method including the following steps (i) to (vi) described in Patent Document 1 can be preferably used.
  • (I) A step of culturing iPS cells in a medium containing FGF2, BMP4, GSK-3 ⁇ inhibitor and retinoic acid or a derivative thereof;
  • (Ii) The step of culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor and BMP7;
  • (Iv) The step of culturing the cells obtained in step (iii) in a medium containing FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor, BMP7, activin and ROCK inhibitor;
  • (V) The step of culturing the cells obtained in step (iv) in a medium containing retinoic acid
  • Steps (i) to (vi) are preferably carried out by adhesive culture.
  • Adhesive culture means that cells are cultured in a state of being adhered to a culture substrate, and for example, they are cultured in a coated culture dish.
  • the coating agent is preferably extracellular matrix, and examples thereof include substances such as collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrin and laminin, or fragments thereof. These extracellular matrices may be used in combination and may be preparations from cells such as BD Matrigel TM.
  • the extracellular matrix is preferably laminin or a fragment thereof.
  • laminin is a protein having a heterotrimer structure having one ⁇ chain, one ⁇ chain, and one ⁇ chain, and is an extracellular matrix protein in which isoforms having different subunit chain compositions are present. ..
  • Laminin is a combination of 5 ⁇ -chains, 4 ⁇ -chains and 3 ⁇ -chain heterotrimers and has about 15 isoforms.
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4 or ⁇ 5
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 or ⁇ 4
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2 or ⁇ 3.
  • Laminin is more preferably laminin 511 consisting of ⁇ 5, ⁇ 1 and ⁇ 1 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
  • Laminin may be a fragment, and is not particularly limited as long as it has integrin-binding activity.
  • E8 fragment laminin 511E8 (EMBO J.), which is a fragment obtained by digestion with elastase. , 3: 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987, WO 2011/043405).
  • Laminin 511E8 is commercially available and can be purchased from, for example, Nippi Co., Ltd.
  • the medium used in each step can be prepared by adding cytokines and drugs necessary for each step to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimium Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulvecco's Modern Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12) medium, Ham's F12 (F12) medium , Fisher's medium, and a mixed medium thereof and the like are included.
  • the medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • albumin transferase, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum substitute during ES cell culture) (ThermoFisherScientific), N2 supplement (ThermoFisherScientific), B27 supplement (ThermoFisherScient) , Insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, etc.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement ThermoFisherScientific
  • B27 supplement ThermoFisherScient
  • Insulin may contain one or more serum substitutes, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), It may also contain one or more substances such as non-essential amino acids (NEAAs), vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and their equivalents.
  • a medium pre-optimized for stem cell culture, such as ReproFF2
  • step (I) The step of culturing iPS cells in a medium containing FGF2, BMP4, GSK-3 ⁇ inhibitor and retinoic acid or a derivative thereof.
  • iPS cells are separated by a method known in the art. And can be cultivated.
  • Methods for separating iPS cells include, for example, mechanical separation, separation solutions having protease activity and collagenase activity (eg, Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc)) or collagenase. Separation using a separation solution having only activity can be mentioned.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor used in step (i) is not particularly limited as long as it can inhibit the function of GSK-3 ⁇ , for example, kinase activity, and is, for example, BIO (also known as GSK-3 ⁇ ) which is an insilvin derivative.
  • Inhibitor IX 6-bromoindylvin-3'-oxym
  • maleimide derivative SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indol-3-yl) -1H- Pyrol-2,5-dione
  • GSK-3 ⁇ inhibitor VII ⁇ ,4-dibromoacetophenone
  • GSK-3 ⁇ L803-mts
  • Peptide inhibitors and CHIR99021 (Nature (2008) 453: 519-523), which have high selectivity.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the GSK-3 ⁇ inhibitor used, and is, for example, 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M. More preferably, it is 0.5 ⁇ M to 3 ⁇ M, and particularly preferably 0.5 ⁇ M to 1.5 ⁇ M.
  • the FGF2 (basic FGF: bFGF) used in the step (i) is preferably human FGF2, and the human FGF2 has, for example, the amino acid sequence of NCBI (National Center for Biotechnology Information) accession number: ABO43041.1. Examples include proteins. Fragments and functional variants of FGF2 are included as long as they have differentiation-inducing activity. Commercially available FGF2 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. You may.
  • the concentration of FGF2 used in this step is from 1 ng / ml to 1000 ng / ml, preferably from 10 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably from 50 ng / ml to 250 ng / ml.
  • the BMP4 used in step (i) is preferably human BMP4, and examples of human BMP4 include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: AAH20546.1. As long as BMP4 has differentiation-inducing activity, its fragments and functional variants are included. BMP4 may be commercially available, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. You may.
  • the concentration of BMP4 used in this step is 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 0.5 ng / ml to 50 ng / ml, more preferably 0.5 ng / ml to 5 ng / ml.
  • the retinoic acid used in the step (i) may be the retinoic acid itself or a retinoic acid derivative having the differentiation-inducing function of the natural retinoic acid.
  • a retinoic acid derivative for example, 3-dehydroretinoic acid, 4-[[(5,6,7,8-terahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbonyl] amino] -Benzoic acid ( AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev.
  • retinoic acid or a derivative thereof used in step (i) is, for example, 1 nM to 100 nM, preferably 5 nM to 50 nM, and more preferably 5 nM to 25 nM.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time in step (i) may be a period sufficient for the late posterior epiblast to be induced to differentiate, but is, for example, 1 to 2 days of culture, preferably 1 day.
  • step (Ii) The step of culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor and BMP7.
  • FGF2 used in step (ii) is described in step (i). The same is true for the above, and the preferred concentration range is also the same.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (ii) As the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (ii), the GSK-3 ⁇ inhibitor exemplified in the above-mentioned step (i) can be used, and CHIR99021 is mentioned as a preferable GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in step (ii) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the GSK-3 ⁇ inhibitor used, and is, for example, from 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably from 0.1 ⁇ M. It is 50 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M, and particularly preferably 2 to 10 ⁇ M.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in step (ii) is preferably higher than the concentration in step (i).
  • the BMP7 used in step (ii) is preferably human BMP7, and examples of human BMP7 include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NM_001719.2. As long as BMP7 has differentiation-inducing activity, fragments and functional variants thereof are included. BMP7 may be commercially available, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. You may.
  • the concentration of BMP7 used in this step is 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 0.5 ng / ml to 50 ng / ml, more preferably 0.5 ng / ml to 5 ng / ml.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of step (ii) may be a period sufficient for the mesoderm lineage primitive streak to be induced to differentiate, but is, for example, 10 hours to 2 days, or 1 to 2 days, preferably. 0.5 to 1 day.
  • step (Iii) The step of culturing the cells obtained in step (iii) in a medium containing FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor, BMP7 and TGF ⁇ inhibitor FGF2, GSK- used in step (iii).
  • the 3 ⁇ inhibitor, BMP7 is similar to step (ii), and the preferred concentration range thereof is also the same, but the concentration range of the GSK-3 ⁇ inhibitor is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, and further. It is preferably 1 ⁇ M to 7.5 ⁇ M, and particularly preferably 2 to 5 ⁇ M.
  • the TGF ⁇ inhibitor used in step (iii) is a substance that inhibits the signal transduction of TGF ⁇ from binding to the receptor to SMAD, and is a substance that inhibits the binding to the ALK family of receptors, or ALK.
  • substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by the family include Lefty-1 (NCBI Accession No. includes mouse: NM_010094 and human: NM_020997), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor can preferably be A83-01.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor in the culture medium is not particularly limited as long as it inhibits ALK, but is 0.5 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 25 ⁇ M.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (iii) may be a period sufficient for inducing differentiation of the late mesoderm lineage primitive streak, but is, for example, 0.25 to 3 days, preferably 0.5 to 2. It is a day, more preferably 0.75 to 1.5 days.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor, BMP7 is the same as in step (ii), and the preferred concentration range thereof is also the same, but the concentration range of the GSK-3 ⁇ inhibitor is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M. More preferably, it is 1 ⁇ M to 7.5 ⁇ M, and particularly preferably 2 to 5 ⁇ M.
  • Activins used in step (iv) include activins from humans and other animals as well as functional variants thereof, with activin A being preferred and human activin A being more preferred.
  • human activin A include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NP_002183.1 or UniProt accession number P08476.2.
  • the concentration of activin used in the step (iv) is 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 5 ng / ml to 50 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 25 ng / ml.
  • the ROCK inhibitor used in the step (iv) is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK), and is, for example, Y-27632 (eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57,976-983 (2000); see Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil / HA1077 (eg, see Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152. (See, eg, Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • Y-27632 eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57,976-983 (2000); see Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)
  • Fasudil / HA1077 eg, see Uenata et al.,
  • Wf-536 eg, Nakajima et al., Cancer Chemother, Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003).
  • Wf-536 eg, Nakajima et al., Cancer Chemother, Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003).
  • antisense nucleic acids against ROCK eg, siRNA
  • RNA interference-inducing nucleic acids eg, siRNA
  • dominant negative variants eg, and their expression vectors.
  • other known low molecular weight compounds can also be used as the ROCK inhibitor (for example, US Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508).
  • ROCK inhibitors include Y-27632.
  • concentration of the ROCK inhibitor used in the step (iv) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used, and is, for example, 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 75 ⁇ M, and more preferably. Is from 5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (iv) may be a period sufficient for the late renal lineage late primitive streak to be induced to differentiate, but is, for example, 1 to 5 days, preferably 3 days.
  • step (V) The step of culturing the cells obtained in step (iv) in a medium containing retinoic acid or a derivative thereof, a BMP inhibitor and FGF9.
  • the retinoic acid or a derivative thereof used in step (v) is As described in step (i), the preferred concentration range thereof is, for example, 10 nM to 500 nM, preferably 50 nM to 250 nM.
  • the FGF9 used in step (v) is preferably human FGF9, and examples of human FGF9 include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NP_002001.1. Fragments and functional variants of FGF9 are included as long as they have differentiation-inducing activity. Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of FGF9 used in this step is, for example, 1 ng / ml to 500 ng / ml, 10 ng / ml to 500 ng / ml, 50 ng / ml to 300 ng / ml, or 150 ng / ml to 250 ng / ml.
  • the medium used in step (v) further comprises a BMP inhibitor.
  • BMP inhibitors include proteinin inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin (ie, 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl- pyrazolo [1,5-a] pyrimidine), its derivatives (PB Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41 J. Hao et al.
  • LDN 193189 ie 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a ] Pyrimidin-3-yl) quinoline) is illustrated. More preferably, it is NOGGIN as a BMP inhibitor, the concentration thereof being, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml, 5 ng / ml to 50 ng / ml, 10 ng / ml to 30 ng / ml.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time may be a period sufficient for inducing differentiation of the late posterior intermediate mesoderm, but is, for example, 1 to 3 days, preferably 2 days.
  • step (Vi) The step of culturing the cells obtained in step (v) in a medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor and FGF9.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor and FGF9 used in step (vi) are each step.
  • the preferred concentration range thereof is also the same.
  • the number of culture days in the step (vi) is not particularly limited as long as renal progenitor cells can be obtained, and examples thereof include 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, and 5 days or more.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 to 5%. is there.
  • step (Vii) A step of forming a cell mass by non-adhesive culture of cells (renal progenitor cells) obtained in step (vi). From renal progenitor cells to renal organoids, that is, glomerules, tubules, and collecting tubes.
  • renal progenitor cells obtained by the above method are non-adhesively cultured to prepare a cell mass, which is then used as 3T3-Wnt4 cells or the like.
  • a method of co-culturing with feeder cells, mouse fetal spinal cells, or mouse fetal kidney cells, or a method of semi-gastric culture using a basal medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor such as CHIR99021 (Reference Nature, 526, 564-568 (2015)) can be mentioned.
  • the medium can contain FGF9, FGF2, and even a ROCK inhibitor in addition to the GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the preferred concentrations of FGF9, FGF2, and ROCK inhibitor are the same as above.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor or FGF2 is used, for example, from the start of the culture to 1 day after the start of the culture, to 2 days after the start of the culture, and to 3 days after the start of the culture.
  • a method including containing only the number of days in the medium can be mentioned.
  • the number of days of culturing in the step (vii) is not particularly limited as long as renal organoids are formed, and examples thereof include 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, and 8 days or more.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is carried out in an atmosphere of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is determined. It is preferably about 2-5%.
  • the renal organoids obtained as described above can be used for screening and evaluation of therapeutic agents for cilia-related diseases.
  • test substance can be used, for example, cell extract, cell culture supernatant, microbial fermentation product, marine organism-derived extract, plant extract, purified protein or crude protein, and the like. Peptides, non-peptide compounds, synthetic low molecular weight compounds, and natural compounds are exemplified.
  • the test substance is also (1) a biological library method, (2) a synthetic library method using deconvolution, (3) a "one-bead one-compound” library method, And (4) can be obtained using any of the many approaches in combinatorial library methods known in the art, including synthetic library methods using affinity chromatography sorting.
  • Biological library methods using affinity chromatography sorting are limited to peptide libraries, but the other four approaches are applicable to small molecule libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des). . 12: 145-67).
  • Examples of methods for synthesizing molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. . Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al.
  • Compound libraries include solutions (see Houghten (1992) Bio / Techniques 13: 412-21) or beads (Lam (1991) Nature 354: 82-4), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-6). ), Bacteria (US Pat. No. 5,223,409), Spores (US Pat. Nos.
  • renal organoid obtained as described above a cyst formation promoting substance for a certain period of time, for example, 1 to 30 days, preferably 5 to 15 days, renal cyst formation can be induced, and cilia can be induced. It can be a related disease model.
  • Cyst formation promoters include cAMP pathway activators such as forskolin and 8-Bromo-cAMP and myosin II inhibitors such as brevisstatin.
  • concentration of forskolin is preferably 1 to 100 ⁇ M, more preferably 5 to 20 ⁇ M.
  • concentration of 8-Bromo-cAMP is preferably 10 to 1000 ⁇ M, more preferably 50 to 200 ⁇ M.
  • concentration of blevisstatin is preferably 1 to 100 ⁇ M, more preferably 10 to 50 ⁇ M.
  • cyst formation When screening or evaluating drugs using cyst formation as an index, for example, when culturing renal organoids in the presence of a cyst formation-promoting substance such as forskolin and / or before and after that, the test substance is contacted for a certain period of time. After culturing (for example, 1 hour to 72 hours), cyst formation is measured and compared with the case where the test substance is not contacted. Measurement of cyst formation includes not only measurement of cyst size and number, but also measurement of cyst shape such as roundness. The size of the cyst can be measured, for example, by the area ratio described below.
  • cysts are significantly compared to the case of renal organoids induced to differentiate from healthy subjects-derived iPS cells.
  • the number of cysts increases, the size increases, and the roundness decreases.
  • the test substance when the test substance is brought into contact with the test substance, if the number of cysts is reduced, the size is reduced, or the roundness is improved, the test substance has the ability to reduce or inhibit cyst formation. It can be evaluated as having or selected as a candidate substance for a therapeutic agent for ciliary-related diseases.
  • the effect of the test substance can also be evaluated by comparing it with the effect of a positive control having a cyst formation inhibitory effect.
  • mTOR inhibitors such as rapamycin and everolimus
  • CFTR inhibitors such as CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) inhibitor II and CFTR inhibitor 172 can be used.
  • drug screening and evaluation can also be performed by measuring intracellular calcium dynamics using renal organoids.
  • intracellular calcium dynamics measurement it is preferable to isolate and use renal constituent cells such as tubular epithelial cells and proximal tubular cells from renal organoids. Isolation of tubular epithelial cells from renal organoids can be performed, for example, by sorting with an antibody against a tubular epithelial cell marker such as CD326 (EpCAM).
  • EpCAM tubular epithelial cell marker
  • proximal tubular cells from renal organoids is performed, for example, by antibodies against proximal tubular cell markers such as CD10, CD13 (PLoS ONE 8: e66750.2013), or proximal urine such as LTL (Lotus tetragonolobus lectin). This can be done by sorting with a specific lectin for tubular cells.
  • intracellular calcium dynamics can be measured in the state of renal organoids. By using a renal organoid that endogenously expresses Ca indicator in a specific renal constituent cell, it is possible to measure intracellular calcium dynamics using a change in fluorescence intensity in the specific renal constituent cell as an index.
  • the intracellular calcium dynamics measurement can be performed according to a conventional method. Specifically, Fura-2 (Dojin Kagaku Kenkyusho), Fluo4, Fluo3, Fura2, Indo1, Rhod2, Quin2, Fura-PE3, Fura Red, calcium green1, calcium crimson, Oregon green 488 BAPTA-1, fluo-3FF , Fluoro-5N, mag-fura-5, mag-indo-1, rhod-5N, Calbryte-590, Cal-520, etc.
  • Renal constituent cells such as tubule epithelial cells and proximal tubule cells obtained from renal organoids prepared by inducing differentiation from iPS cells derived from diseased patients are prepared by inducing differentiation from iPS cells derived from healthy subjects.
  • Thapsigargin has reduced calcium release.
  • Renal constituent cells such as tubular epithelial cells and proximal tubular cells obtained from renal organoids prepared by inducing differentiation from iPS cells derived from diseased patients were used as test substances for a certain period of time (for example, 1 to 72 hours). After incubation, the intracellular calcium concentration is measured, and as a result, if the calcium concentration is increased compared to when it is not incubated with the test substance or when it is incubated with the negative control, the test substance has the ability to increase the intracellular calcium concentration. It can be evaluated as having or selected as a candidate substance for a therapeutic agent for ciliary-related diseases.
  • the effect of the test substance can also be evaluated by comparing it with the effect of a positive control having an effect of increasing the calcium concentration in the cytoplasm.
  • the measurement results of renal organoids induced to differentiate from iPS cells derived from disease patients or renal constituent cells such as tubule epithelial cells and proximal tubule cells were induced to differentiate from gene mutation repair iPS cells. It is preferable to compare with the measurement results of renal organoids or renal constituent cells such as tubule epithelial cells and proximal tubule cells.
  • the measurement results of renal organoids induced to differentiate from a strain in which a PKD gene mutation was introduced into normal iPS cells or renal constituent cells such as tubule epithelial cells and proximal tubule cells were differentiated from the parent strain of normal iPS cells. It is also preferable to compare the results with the induced renal organoids or renal constituent cells such as tubule epithelial cells and proximal tubule cells.
  • the above-mentioned gene mutation repair iPS cells mean iPS cells in which the mutation site of the causative gene of a patient with a cilia-related disease is normally replaced, and the person with the cilia-related disease except that the mutation site is replaced with a normal sequence. Means iPS cells having the same genetic information as. By comparing with renal organoids from such gene-repaired iPS cells or renal constituent cells such as tubular epithelial cells and proximal tubular cells, the effect of the drug on ciliary-related diseases can be evaluated more accurately. Gene mutation repair iPS cells can be prepared by known gene repair techniques.
  • genome editing techniques such as CRISPR / Cas9, TALEN, and ZFN can be used to replace the genes responsible for ciliary-related diseases in patient-derived iPS cells with normal forms.
  • CRISPR / Cas9 it can be carried out by introducing an oligonucleotide having a normal sequence together with Cas9 and gRNA into patient-derived iPS cells and substituting the mutant sequence.
  • Example 1 Induction of renal progenitor cells from iPS cells IPS cells were prepared by introducing the OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC genes into somatic cells of ADPKD patients with mutations in the PKD1 gene using a retroviral vector (CiRA00009 strain, CiRA00007 strain).
  • the obtained iPS cells were cultured by the method described in the examples of WO 2018/216743 to obtain renal (nephron) progenitor cells.
  • renal (nephron) progenitor cells were obtained from healthy human-derived iPS cells in the same manner.
  • the CiRA00009 strain has a Q3895X, Nonsense mutation
  • the CiRA00007 strain has a G3818R, Missense mutation (Ameku et al. Sci Rep 2016; 6: 30013).
  • renal (nephron) progenitor cells were also induced from the following iPS cells in the same manner.
  • iPS cells prepared by introducing the OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC genes into somatic cells of ADPKD patients with mutations in the PKD2 gene using a retroviral vector Ameku et al. Sci Rep 2016; 6: 30013.
  • Kidney organoid cyst formation assay by kidney organoid preparation and drug treatment (experimental method) 1.
  • nephron progenitor cells were prepared from undifferentiated human iPS cells (derived from patients or healthy individuals) using the differentiation-inducing system described in the examples of WO 2018/216743, and the nephron progenitor cells were prepared using the cells according to the following procedure. Kidney organoids were made.
  • the nephron progenitor cells on day 11-12 are dissociated into single cells using Accumax. Add 100 ⁇ L Accumax per well on a 24-well plate and incubate at 37 ° C. for 10-15 minutes at 5% CO 2 .
  • step 4 Discard the supernatant and use the medium prepared in step 4 to resuspend the cells to 50-100 ⁇ L per cell aggregate. 7. Take 50-100 ⁇ L of cell suspension on a 96 well plate (non-adherent) at the bottom of the U and centrifuge at 300 G x 3 min. 8. After culturing for 1-2 days, the formed cell aggregates are transferred onto the insert of 24-well transwell and used for gas-phase liquid-phase interfacial culture (day 0: organoid culture started).
  • KR5 medium (DMEM / F12 Glutamax containing 0.1 mM non-essential amino acids, 500 U / ml PS, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 5% KSR) with 200 ng / ml FGF2 and 5 ⁇ M CHIR99021 added to the medium. (Change medium at 120 ⁇ L per well). 9. After 48 hours, change the medium to KR5 medium (day 2), and then change the medium to KR5 medium every 2 days thereafter. On day 8, it differentiates into nephron organoids with glomerular and tubular structures. 10. Induction of cyst formation and measurement of cysts were performed according to the following procedure.
  • Y-27632 to Renal Epithelial Cell Growth Medium 2, RECGM2 (PromoCell) to a final concentration of 50 ⁇ M, and prepare a cell suspension to a final concentration of 50 ⁇ L per 5.0 ⁇ 10 4 cells.
  • EpCAM + cells are seeded in a clear-bottomed half-area 96-well plate (Greiner, 675090) at 5.0 ⁇ 10 4 cells (50 ⁇ L) per well and incubated overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 . 9. Since it will be confluent the next day, Ca flux measurement by FDSS- ⁇ CELL will be performed.
  • Acid Red 27 (Tokyo Kasei, A0583) of water soluble probenecid 1.25 mM and 0.05 to 0.5 mg / mL as a quencher may be added.
  • 11. Set the FDSS- ⁇ CELL imaging protocol to measure Ca influx after Ca release with two-step chemical injection (20 ⁇ L each). 12.
  • drugs that cause Ca release such as Thapsigargin (final concentration 10 ⁇ M), Angiotensin II, human (final concentration 10 ⁇ M), and [Arg8] -Vasopressin (final concentration 10 ⁇ M), were dissolved in Ca-free HBSS. Inject something.
  • the second step CaCl 2 at a final concentration of 2 mM is injected to measure store-operated Ca influx (measure the ratio of fluorescence intensity to baseline). 13.
  • store-operated Ca influx measure the ratio of fluorescence intensity to baseline. 13
  • the change in intracellular Ca concentration can be measured using the final concentration of 5 ⁇ M ionomycin in the first step and the final concentration of 30 mM EGTA in the second step. 14.
  • the peak value of the first stage (Ca release), the AUC (area under the curve) value, the peak value of the second stage (Ca influx), the AUC value, and the plateau value are analyzed.
  • renal organoids containing renal tubules could be prepared from iPS cell lines derived from ADPKD patients, and primary cilia were confirmed in the renal tubules by the expression of the proximal tubule marker LTL and the ciliary marker ARL13B.
  • forskolin or blevisstatin was added on the 8th day from the start of the organoid culture and the culture was continued, the formation of renal cysts was observed on the 15th day (Fig. 2).
  • marker staining When confirmed by marker staining, glomerular-derived cysts were hardly conspicuous, and renal tubular-derived cysts were confirmed (Fig. 3).
  • cysts of nephron organoids actually increase up to about 30-40 days.
  • the area ratio (Cystic Area) and roundness of renal cysts were measured using an image analyzer.
  • the area ratio was calculated as follows.
  • Area ratio of renal cyst (%) total area of renal cyst / total area of organoid ⁇ 100
  • the results are shown in Fig. 4.
  • the area ratio of renal cysts is remarkably increased in patient-derived renal organoids, and the roundness is lower than that of healthy subjects-derived renal organoids (the cyst morphology is irregular).
  • Renal cyst formation and quantitative evaluation of the effect of the drug were found to be possible.
  • the intracellular Ca influx of renal cells of patients with the same disease is lower than that of healthy subjects.
  • the above Ca inflow measurement system it is possible to reproduce the decrease in Ca inflow in tubular cells derived from iPS cells of ADPKD patients, and by adding a drug here, the effect of the drug on the decrease in Ca inflow can be evaluated. ..
  • the proximal tubule cells and renal tubules of the renal organoid derived from the iPS cell line derived from ADPKD patients were compared with the renal organoid proximal tubule cells and tubular epithelial cells derived from the healthy iPS cell line. It was found that in epithelial cells, the release of calcium from the endoplasmic reticulum by Thapsigargin was reduced, and the time to peak tended to be slow.
  • Example 2 IPS cells were prepared from ADPKD patients (Patient-A, B) in the same manner as in Example 1.
  • Patient-A and B correspond to CiRA00009 and CiRA00007 of Example 1, respectively.
  • renal organoids were induced from iPS cells derived from ADPKD patients (Patient-A, B) according to the same procedure as in Example 1.
  • renal organoids were also induced from healthy subjects (Normal Subject-A and B) in the same manner.
  • Forskolin 10 ⁇ M was added from the 10th day after the start of organoid culture, and cyst formation was evaluated at the 17th day. The results are shown in FIG. It was confirmed that forskolin formed cysts in renal organoids that were induced to differentiate from iPS cell lines derived from any patient.
  • Example 3 Mutant-introduced iPS cell lines (PKD1 heterogeneous strain (PKD1 +/- ) and PKD1 homozygous strain (PKD1 -/- )) in which the mutant PKD1 gene was introduced into a healthy person-derived iPS cell line using genome editing technology using CRISPR / Cas9 It was prepared and analyzed.
  • a disease-specific iPS cell line was established using CRISPR / Cas9 genome editing technology according to the following procedure. Using the method described in Ishida et al. (Site-specific randomization of the endogenous genome by a regulatable CRISPR-Cas9 piggyBac system in human cells, Sci. Rep. 8 (2016) 310.), Exxon 34 of the PKD1 gene Mutations were introduced into the splicing acceptor site by non-homologous end joining (NHEJ). Specifically, healthy subjects described in Okita et al. (An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells, Stem Cells 31 (2013) 458-466.).
  • TetO-Cas9- using the 585A1 strain which is a human iPS cell line of origin, as a wild-type strain and using piggyBac transposon vectors (Addgene ID 100596 and Addgene ID 100598 and PiggyBac Transposase expression vector) for this wild-type strain.
  • piggyBac transposon vectors Additional genes that are involved in the splicing receptor site of Exxon 34 of the GR gene and PKD1 gene was introduced, and Cas9 activity was induced inducibly by drug administration to cause genome editing by non-homologous end binding (NHEJ).
  • Genome-edited iPS cells were isolated into single colonies by flow cytometry, and then sequence analysis was performed to confirm frameshift mutations in one allele and PKD1 heterogeneous strains, and frameshift mutations in both alleles.
  • the PKD1 homozygous strain was used.
  • Organoids were induced, forskolin 10 ⁇ M was added from the 10th day of organoid culture, and cyst formation was evaluated at the 17th day. The results are shown in FIG. Cyst formation was not formed by forskolin addition in renal organoids induced to differentiate from healthy iPS cell lines, but cyst formation was promoted by addition of forskolin in renal organoids differentiated from mutant-introduced iPS cell lines. The degree was remarkable in the PKD1 homozygous strain. This was also confirmed by a statistical test (Fig. 12) of the area ratio (Cystic Area) of renal cysts.
  • renal organoids induced to differentiate from healthy subject-derived iPS cell lines or disease-specific iPS cell lines were cultured in the presence of forskolin, and renal organoids containing cysts formed were formed.
  • PPD1 homozygous strain PPD1 -/-
  • renal organoids containing cysts formed were formed.
  • GenBank accession numbers and related sequence information and other data available through databases such as patents, publications and other publications, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) referred to herein are one of them. Part or whole is incorporated by reference.

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Abstract

繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られた人工多能性幹（iPS）細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる尿細管細胞などの腎構成細胞を薬剤候補物質と接触させる工程、および当該腎臓オルガノイドまたは尿細管細胞などの腎構成細胞における、カルシウム動態、および／または嚢胞形成を測定する工程、を含む、繊毛関連疾患治療薬のスクリーニングまたは評価方法。

Description

繊毛関連疾患モデルおよびその利用
本発明は繊毛関連疾患患者由来の人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された腎臓オルガノイドから得られる嚢胞形成モデルおよびそれを用いて繊毛関連疾患治療薬をスクリーニングまたは評価する方法に関する。
難治遺伝性疾患である常染色体優性多発性嚢胞腎(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADPKD)は、腎臓に進行性に多数の嚢胞を形成し、中年期以降に末期腎不全に進行する。ADPKDの原因遺伝子は、85%の症例がPKD1, 15%の症例がPKD2であり、これらの遺伝子を改変した疾患モデルマウスやラットなどの実験動物を用いた研究が行われてきたが、完全な病態解明には至らず、根治的な治療法も開発されていない。
近年、難治性疾患の患者体細胞から樹立したiPS細胞または健常者由来のiPS細胞に原因遺伝子変異を導入した疾患特異的iPS細胞を樹立し、in vitroにおいて罹患細胞種に分化誘導することによって、病態を再現する疾患モデルを作製し、詳しい病態解析や治療薬探索を行う研究が盛んに行われている。しかし、ADPKDの腎嚢胞については、未だ病態解析や治療薬探索に使用可能なiPS細胞を用いた疾患モデルは確立されていない。
Freedmanらのグループは、健常ヒトES細胞株にゲノム編集にてPKD1またはPKD2のホモ欠失変異を導入したADPKD特異的ES細胞株から腎組織を分化誘導して腎嚢胞の再現を試みているが（非特許文献１～４）、腎臓の発生過程を正確に再現しているか否かは不明である。また、フォルスコリン投与では健常コントロールと比べ嚢胞形成に有意差が出ていない。さらに、ADPKD患者由来iPS細胞株(PKD1ヘテロ欠失)では腎組織への分化誘導が安定せず、健常iPS細胞株と比較して明らかな病的形質を認めていない。
WO 2018/216743
Freedman BS. et al., J Am Soc Nephrol 2013 Freedman BS. et al., Nat Commun 2015 Cruz NM. et al., Nat Mater 2017 Czerniecki SM. et al., Cell Stem Cell 2018
本発明は、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)などの繊毛関連疾患の治療薬のスクリーニングや評価に使用可能な嚢胞形成モデルを開発することを課題とする。
発明者らのグループは、特許文献１において、iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製する方法を開発した。そして、今回、上記課題を解決するために、ADPKD患者の線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、特許文献１に記載の分化誘導法を用いて作製した腎組織をフォルスコリンやブレビスタチン等の存在下で培養することによって、腎嚢胞モデルを作製することに成功した。そして、このモデルを利用し、嚢胞の形状やカルシウムの動態等を指標とすることで、ADPKDなどの繊毛関連疾患の治療薬候補物質のスクリーニングや評価を効率よく行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られた人工多能性幹（iPS）細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる尿細管細胞（尿細管上皮細胞を含む、以下同様）などの腎構成細胞を、薬剤候補物質と接触させる工程、および当該腎臓オルガノイドまたは尿細管細胞などの腎構成細胞における、カルシウム動態、および／または嚢胞形成を測定する工程、を含む、繊毛関連疾患治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
［２］前記体細胞が変異型PKD（Polycystic Kidney Disease）遺伝子を保持する、［１］に記載の方法。
［３］前記体細胞がPKD1遺伝子および／またはPKD2遺伝子に変異を有する繊毛関連疾患患者由来である、［２］に記載の方法。
［４］前記繊毛関連疾患が常染色体優性多発性嚢胞腎である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］嚢胞形成促進物質による刺激により嚢胞形成を誘導したのち、嚢胞形成を測定する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］嚢胞形成促進物質がフォルスコリン、8-Bromo-cAMPまたはブレビスタチンである、［５］に記載の方法。
［７］嚢胞形成の測定が嚢胞のサイズ、数、もしくは真円度の測定である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］mTOR阻害剤またはCFTR阻害剤を陽性コントロールとして使用する、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］測定結果を、健常者由来の体細胞から得られたiPS細胞または遺伝子変異修復iPS細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる腎構成細胞のカルシウム動態、および／または嚢胞形成と比較する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］腎臓オルガノイドが、以下の工程により得られたものである、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、FGF（線維芽細胞増殖因子）2、BMP（骨形成タンパク質）4、GSK（グリコーゲン合成酵素キナーゼ）-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGF（トランスフォーミング増殖因子）β阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK阻害剤を含む培地で培養する工程； 
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体、BMP阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；および
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた細胞を非接着培養することにより細胞塊を形成させて培養する工程。
［１１］繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られたiPS細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドを含む繊毛関連疾患モデルであって、嚢胞形成促進物質による刺激により嚢胞形成を生じた、繊毛関連疾患モデル。
本発明により作製される腎嚢胞モデルは、嚢胞形成やカルシウム放出低下など繊毛関連疾患の病態をより生体に近い状態で反映しており、腎嚢胞形成のインビトロモデルとして極めて優れている。本発明の腎嚢胞モデルを使用することで、腎嚢胞形成を抑える治療薬開発をこれまでにない高い精度で行うことができる。また、本発明により作製される病態モデルを用いて、ADPKDなどの繊毛関連疾患の病態解明を行うことができる。
ADPKD患者由来のiPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイド（凝集体形成培養10日目）内の繊毛に対する免疫染色（LTL、ARL13B）結果を示す蛍光顕微鏡写真。 ADPKD患者由来のiPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン（10μM）またはブレビスタチン（25μM）存在下で培養し嚢胞形成を誘導した結果を示す図（顕微鏡写真：明視野像）。 ADPKD患者由来のiPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養して形成された嚢胞を含む腎臓オルガノイドの免疫染色（PODXL（糸球体マーカー）、LTL（近位尿細管マーカー）、CDH１（遠位尿細管マーカー））の結果を示す蛍光顕微鏡写真。2枚は異なる腎臓オルガノイドの免疫染色画像である。 腎臓オルガノイド（ADPKD患者由来および健常者由来）をフォルスコリン存在下で培養して嚢胞形成を誘導したときの、腎嚢胞の面積比（Cystic Area）と真円度を示すグラフ。それぞれの腎臓オルガノイドにおいて、サイズが上位の一定順位内に入る嚢胞を解析対象とし、横軸は解析に含める嚢胞の個数を示している。 フォルスコリンによる嚢胞形成に対する各種薬剤の効果を評価した結果を示す図（写真）。コントロールはDMSOを使用した。 蛍光標識されたヒトiPS細胞（ADPKD患者由来および健常者由来）から分化誘導された近位尿細管細胞のCa flux測定を示す。t=20で、10μM Thapsigarginを投与し、2秒毎に2分40秒後(t=180)まで撮影した。 健常者(Normal Subject-AおよびB)由来iPS細胞株およびADPKD患者(Patient-AおよびB)由来iPS細胞株からそれぞれ分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養し嚢胞形成を誘導した結果を示す図（顕微鏡写真：明視野像）。 健常者(Normal Subject-AおよびB)由来iPS細胞株およびADPKD患者(Patient-AおよびB)由来iPS細胞株からそれぞれ分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養して嚢胞形成を誘導したときの、腎嚢胞の面積比（Cystic Area）の統計学的検定の結果を示すグラフ。 ADPKD患者（Patient-A）由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養して形成された嚢胞を含む腎臓オルガノイドにおけるマーカー（マーカーは図３と同じ）の発現を経時変化に免疫染色で解析した結果を示す蛍光顕微鏡写真（上段）、および対応するヘマトキシリン・エオジン染色の光学顕微鏡写真（下段）。 ADPKD患者（Patient-A）由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリンおよび各種薬剤存在下で培養して嚢胞形成を誘導したときの、腎嚢胞の面積比（Cystic Area）の統計学的検定の結果を示すグラフ。コントロールはフォルスコリンのみを添加した。 健常者由来iPS細胞株(Wild-type)、および変異導入iPS細胞株（PKD1ヘテロ株(PKD1+/-)およびPKD1ホモ株(PKD1-/-)）から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養し嚢胞形成を誘導した結果を示す図（顕微鏡写真：明視野像）。 健常者由来iPS細胞株(Wild-type)、および変異導入iPS細胞株（PKD1ヘテロ株(PKD1+/-)およびPKD1ホモ株(PKD1-/-)）から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養して嚢胞形成を誘導したときの、腎嚢胞の面積比（Cystic Area）の統計学的検定の結果を示すグラフ。 変異導入iPS細胞株（PKD1ホモ株(PKD1-/-)）から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養して形成された嚢胞を含む腎臓オルガノイドにおけるマーカーの発現を免疫染色で解析した結果を示す蛍光顕微鏡写真。2枚は同じ腎臓オルガノイドの免疫染色画像であり、右図は左図の拡大写真である。
本発明の繊毛関連疾患治療薬のスクリーニングまたは評価方法は、繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られたiPS細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる尿細管細胞などの腎構成細胞を薬剤候補物質と接触させる工程、および当該腎臓オルガノイドまたは尿細管細胞などにおける、カルシウム動態、および／または嚢胞形成を測定する工程、を含む。
繊毛関連疾患としては、ciliopathy（繊毛病あるいは繊毛関連疾患）と呼ばれる疾患が挙げられ、腎臓に嚢胞が形成される疾患が挙げられるが、より具体的には、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）、常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)、およびネフロン癆(nephronophthisis)が例示される。
これらの疾患は一般に遺伝子異常によって引き起こされる。例えば、ADPKDの原因遺伝子はPKD1遺伝子およびPKD2遺伝子が挙げられる。
　PKD1遺伝子は膜蛋白質“Polycystin (PC)1, transient receptor potential channel interacting”（Ensembl gene ID:ENSG00000008710）（旧称：polycystic kidney disease 1 (autosomal dominant)）をコードする。PKD1としては、例えば、UniProtKBデータベースのアクセッション番号:P98161に登録されているアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ただし、PKD1のアミノ酸配列は人種などにより異なるため、この特定のアミノ酸配列には限定されず、当該アミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってよい。
　PKD2遺伝子は“polycystin（PC）2, transient receptor potential cation channel”（Ensembl gene ID:ENSG00000118762）（旧称：polycystic kidney disease 2 (autosomal dominant)）をコードする。PKD2としては、例えば、UniProtKBデータベースのアクセッション番号:Q13563に登録されているアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ただし、PKD2のアミノ酸配列は人種などにより異なるため、この特定のアミノ酸配列には限定されず、当該アミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってよい。
　これらのPKD遺伝子の変異は、例えば、Cell 77: 881-94, 1994及びScience 272: 1339-1342, 1996に報告されている。また、Ameku et al. Sci Rep 2016;6:30013のTable 1に記載の変異でもよい。
PKD1
W429S, S2235L, V3008M, S3404Y, S3405Y, Missense
G3818R, Missense
E2111K, R2327W, Missense
Q3895X Nonsense
PKD2
A190T, Missense
したがって、繊毛関連疾患患者はこれらの遺伝子に変異（ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異などを含む）を有することが好ましい。対立遺伝子の一方に変異を有するヘテロ変異個体でもよいが、対立遺伝子の両方に変異を有するホモ変異個体でもよい。例えば、ADPKDの場合はヘテロ変異個体で発症し、ホモ変異個体は出生しないのでヘテロ変異個体が好ましく、ARPKDおよびネフロン癆の場合はホモ変異個体で発症するのでホモ変異個体が好ましい。
繊毛関連疾患患者由来の体細胞からiPS細胞を作製するにあたっては、患者由来の体細胞をそのまま使用してiPS細胞を作製してもよいが、健常人由来体細胞から得られたiPS細胞（正常iPS細胞とも呼ぶ）に繊毛関連疾患患者由来の変異型PKD遺伝子をヘテロ又はホモで導入することで、「繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られたiPS細胞」を再現し、それを使用してもよい。
体細胞としては、特に限定されないが、成熟した体細胞だけでなく、胎児（仔）や新生児（仔）の体細胞も包含され、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知の方法を採用することができ、例えば、体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３－７２０、Ｍａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５－９．に記載の組み合わせが例示される。
iPS細胞から腎臓オルガノイドへの分化誘導は公知の方法を使用することができるが、好ましくは特許文献1に記載された以下の工程（ｉ）～（ｖｉ）を含む方法を使用することができる。
（ｉ）iPS細胞を、FGF2、BMP4、GSK-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK阻害剤を含む培地で培養する工程； 
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体、BMP阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；および
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた細胞を非接着培養により細胞塊を形成させて培養する工程。
工程（i）～（vi）は接着培養で行うことが好ましい。
接着培養とは、細胞が培養基材に接着した状態で培養されることを意味し、例えば、コーティング処理された培養皿にて培養することを意味する。コーティング剤としては、細胞外基質が好ましく、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリンおよびラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、BD Matrigel(商標)などの細胞からの調製物であってもよい。細胞外基質は好ましくは、ラミニンまたはその断片である。本発明においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。ラミニンは、5種のα鎖、4種のβ鎖および3種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約15種類のアイソフォームを有する。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４またはα５であり、β鎖は、β１、β２、β３またはβ４であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２またはγ３が例示される。ラミニンは、より好ましくは、α５、β１およびγ１からなるラミニン511である（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）。ラミニンは断片であってもよく、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるE8フラグメント（ラミニン511E8）（EMBO J., 3:1463-1468, 1984、J. Cell Biol., 105:589-598, 1987、WO2011/043405）であってもよい。ラミニン511E8は市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
各工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へ各工程で必要なサイトカインや薬剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Thermo Fisher Scientific）、Ｎ２サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、Ｂ２７サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Thermo Fisher Scientific）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル）など、あらかじめ幹細胞培養用に最適化された培地を使用してもよい。
以下、各工程についてさらに説明する。
（ｉ）iPS細胞を、FGF2、BMP4、GSK-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程
工程（ｉ）では、iPS細胞を当該分野で公知の方法で分離し、培養することができる。iPS細胞の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase（TM）およびAccumax（TM）（Innovative Cell Technologies，Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
工程（ｉ）において使用されるGSK-3β阻害剤は、GSK-3βの機能、例えば、キナーゼ活性を阻害できるものである限り特に限定されず、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニル－α－ブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（α，４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（GSK-3βペプチド阻害剤）および高い選択性を有するCHIR99021（Nature（2008）453：519-523）が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Stemgent社、Calbiochem社、Biomol社等から入手可能である。GSK-3β阻害剤としては、CHIR99021が挙げられる。本工程で用いるGSK-3β阻害剤の濃度は、使用するGSK-3β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから３μＭであり、特に好ましくは０．５μＭから１．５μＭである。
工程（ｉ）で使用されるFGF2（塩基性FGF：bFGF）はヒトFGF2が好ましく、ヒトFGF2としては、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号：ABO43041.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。FGF2は分化誘導活性を有する限りその断片および機能的改変体が包含されるFGF2は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるFGF2の濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｉ）で使用されるBMP4はヒトBMP4が好ましく、ヒトBMP4としては、例えば、NCBIのアクセッション番号：AAH20546.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。BMP4は分化誘導活性を有する限りその断片および機能的改変体が包含されるBMP4は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるBMP4の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｉ）において使用されるレチノイン酸は、レチノイン酸そのものでもよいし、天然のレチノイン酸が有する分化誘導機能を保持するレチノイン酸誘導体でもよい。レチノイン酸誘導体として、例えば、３－デヒドロレチノイン酸、４－［［（５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２：１７－２６（１９９０））、４－［（１Ｅ）－２－（５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｙｌ］－Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：５２６８－５２７２（１９８３））、およびＴａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：９１４－９１９（１９８０）に記載されている化合物、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３－デヒドロレチノール、３－デヒドロレチナール等が挙げられる。
工程（ｉ）で用いるレチノイン酸またはその誘導体の濃度は、例えば、１ｎＭから１００ｎＭ、好ましくは、５ｎＭから５０ｎＭ、より好ましくは、５ｎＭから２５ｎＭである。
工程（ｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉ）の培養時間は後期後方エピブラストが分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～２日の培養であり、好ましくは１日である。
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程
工程（ｉｉ）で使用されるFGF2は工程（ｉ）で説明したものと同様であり、その好ましい濃度範囲も同様である。
工程（ｉｉ）において使用されるGSK-3β阻害剤は、前述の工程（ｉ）において例示したGSK-3β阻害剤を使用することができ、好ましいGSK-3β阻害剤としては、CHIR99021が挙げられる。工程（ｉｉ）で用いるGSK-3β阻害剤の濃度は、使用するGSK-3β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから２０μＭであり、特に好ましくは２から１０μＭである。工程（ｉｉ）で用いるGSK-3β阻害剤の濃度は工程（ｉ）における濃度より増加させることが好ましい。
工程（ｉｉ）で使用されるBMP7はヒトBMP7が好ましく、ヒトBMP7としては、例えば、NCBIのアクセッション番号：NM_001719.2のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。BMP7は分化誘導活性を有する限りその断片および機能的改変体が包含されるBMP7は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるBMP7の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｉｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば、１０時間～２日、または１～２日の培養であり、好ましくは０．５～１日である。
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程
工程（ｉｉｉ）において使用されるFGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7は工程（ｉｉ）と同様であり、その好ましい濃度範囲も同様であるが、GSK-3β阻害剤の濃度範囲は０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから７．５μＭであり、特に好ましくは２から５μＭである。
工程（ｉｉｉ）において使用されるTGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO2009146408) およびこれらの誘導体などが例示される。TGFβ阻害剤は、好ましくは、A83-01であり得る。
培養液中におけるTGFβ阻害剤の濃度は、ALKを阻害する濃度であれば特に限定されないが、０．５μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２５μＭである。
工程（ｉｉｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば０．２５～３日の培養であり、好ましくは０．５～２日であり、さらに好ましくは０．７５～１．５日である。
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK阻害剤を含む培地で培養する工程
工程（ｉｖ）において使用されるFGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7は工程（ｉｉ）と同様であり、その好ましい濃度範囲も同様であるが、GSK-3β阻害剤の濃度範囲は０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから７．５μＭであり、特に好ましくは２から５μＭである。
工程（ｉｖ）において使用されるアクチビンには、ヒトおよび他の動物由来のアクチビンならびにこれらの機能的改変体が包含されるが、アクチビンAが好ましく、ヒトアクチビンAがより好ましい。ヒトアクチビンAとしては、例えば、NCBIのアクセッション番号：NP_002183.1またはUniProtのアクセション番号P08476.2 のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社等の市販されているものを使用することができる。工程（ｉｖ）で用いるアクチビンの濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｉｖ）において使用されるROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al．，Mol．Pharmacol．57,976-983（2000）；Narumiya et al．，Methods Enzymol．325,273-284（2000）参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al．，Nature 389：990－994（1997）参照）、H-1152（例、Sasaki et al．，Pharmacol．Ther．93：225－232（2002）参照）、Wf-536（例、Nakajima et al．，Cancer Chemother Pharmacol．52（4）：319-324（2003））参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、および国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。好ましいROCK阻害剤としてはY-27632が挙げられる。工程（ｉｖ）において使用されるROCK阻害剤の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、５μＭから５０μＭである。
工程（ｉｖ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｖ）の培養時間は後腎系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～５日の培養であり、好ましくは３日である。
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体、BMP阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程
工程（ｖ）において使用されるレチノイン酸またはその誘導体は工程（ｉ）で説明したとおりであり、その好ましい濃度範囲は例えば、１０ｎＭから５００ｎＭ、好ましくは、５０ｎＭから２５０ｎＭである。
工程（ｖ）において使用されるFGF9はヒトFGF9が好ましく、ヒトFGF9としては、例えば、NCBIのアクセッション番号：NP_002001.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。FGF9は分化誘導活性を有する限りその断片および機能的改変体が包含される。FGF9は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるFGF9の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌ、または１５０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｖ）において使用される培地は、さらに、BMP阻害剤を含む。
BMP阻害剤としては、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo [1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。
BMP阻害剤としてより好ましくはNOGGINであり、その濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌである。
工程（ｖ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｖ）培養時間は後期後方中間中胚葉が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～３日の培養であり、好ましくは２日である。
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程
工程（ｖｉ）において使用されるGSK-3β阻害剤およびFGF9はそれぞれ工程（ｉ）および工程（ｖ）で説明したとおりであり、その好ましい濃度範囲も同様である。
工程（ｖｉ）の培養日数は、腎前駆細胞が得られる限り特に制限はないが、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ2濃度は、好ましくは約２～５％である。
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた細胞（腎前駆細胞）を非接着培養することにより細胞塊を形成する工程
腎前駆細胞から腎臓オルガノイド、すなわち糸球体、尿細管、集合管、血管、間質組織を内包する細胞凝集体を得る方法としては、例えば、上記方法で得られた腎前駆細胞を非接着培養して細胞塊を作製し、それを、3T3-Wnt4細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、またはマウス胎仔腎細胞と共培養する方法、またはCHIR99021などのGSK-3β阻害剤を含む基礎培地を使用して半気相培養を行う方法（参考文献 Nature, 526, 564-568 (2015)）が挙げられる。培地は、GSK-3β阻害剤に加えて、FGF9やFGF2、さらにはROCK阻害剤を含むことができる。FGF9やFGF2、ROCK阻害剤の好ましい濃度は上記と同様である。なお、半気相培養を行う場合のある態様においては、GSK-3β阻害剤やFGF2を、例えば、当該培養開始～1日後まで、当該培養開始～2日後まで、当該培養開始～3日後までの日数のみ培地に含有させることを含む方法があげられる。
工程（ｖｉｉ）の培養日数は、腎臓オルガノイドが形成される限りにおいて特に制限はないが、例えば、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上が挙げられる。腎前駆細胞分化誘導工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ2濃度は、好ましくは約２～５％である。
上記のようにして得られた腎臓オルガノイドは、繊毛関連疾患治療薬のスクリーニングや評価に使用できる。
本発明のスクリーニング方法においては、任意の被験物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、および天然化合物が例示される。本発明において、被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリ法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリ法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリ法、および（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリ法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993)Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059;Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994)J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、および同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith(1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
上記のようにして得られた腎臓オルガノイドに、嚢胞形成促進物質を一定期間、例えば、１～３０日間、好ましくは５～１５日間与えることで、腎嚢胞形成を誘導することができ、これを繊毛関連疾患モデルとすることができる。
嚢胞形成促進物質としては、フォルスコリンや8-Bromo-cAMPなどのcAMP経路の活性化剤やブレビスタチンなどのミオシンII阻害剤が挙げられる。フォルスコリンの濃度は１～１００μMが好ましく、５～２０μMがより好ましい。8-Bromo-cAMPの濃度は１０～１０００μMが好ましく、５０～２００μMがより好ましい。ブレビスタチンの濃度は１～１００μMが好ましく、１０～５０μMがより好ましい。
嚢胞形成を指標にして薬剤のスクリーニングまたは評価を行う場合、例えば、腎臓オルガノイドをフォルスコリンなどの嚢胞形成促進物質の存在下で培養する際および／またはその前後に、被験物質を接触させて一定期間（例えば、1時間～72時間）培養したのちに、嚢胞形成を測定し、それを、被験物質を接触させない場合と比較する態様が挙げられる。嚢胞形成の測定には、嚢胞のサイズや数の測定だけではなく、真円度などの嚢胞形状の測定も含まれる。嚢胞のサイズは、例えば、後述の面積比で測定することが可能である。
患者由来のiPS細胞から分化誘導した腎臓オルガノイドをフォルスコリンなどの嚢胞形成促進物質の存在下で培養すると、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した腎臓オルガノイドの場合と比較しても顕著に、嚢胞の数が増加したり、サイズが大きくなったり、真円度が低下したりする。ここで、被験物質を接触させたときに、嚢胞の数が減少したり、サイズが小さくなったり、真円度が向上したりした場合に、その被験物質は嚢胞形成を低減または阻害する能力を有すると評価したり、繊毛関連疾患治療薬の候補物質として選択したりすることができる。
また、被験物質の効果を、嚢胞形成阻害効果を有する陽性コントロールの効果と比較することにより、評価することもできる。陽性コントロールとしては、ラパマイシン（Rapamycin）やエベロリムス（Everolimus)などのmTOR阻害剤や、CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator ) inhibitor II やCFTR inhibitor 172などのCFTR阻害剤が使用できる。
一方、腎臓オルガノイドを用いて細胞内カルシウム動態を測定することで、薬剤のスクリーニングや評価を行うこともできる。細胞内カルシウム動態測定のためには、腎臓オルガノイドから尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞を単離して用いることが好ましい。腎臓オルガノイドから尿細管上皮細胞の単離は、例えば、CD326 (EpCAM)などの尿細管上皮細胞マーカーに対する抗体を用いたソーティングなどにより行うことができる。腎臓オルガノイドから近位尿細管細胞の単離は、例えば、CD10,CD13などの近位尿細管細胞マーカーに対する抗体(PLoS ONE 8: e66750.2013)、あるいはLTL (Lotus tetragonolobus Lectin)などの近位尿細管細胞に対する特異的レクチンを用いたソーティングなどにより行うことができる。あるいは、腎臓オルガノイドの状態で細胞内カルシウム動態を測定することもできる。特定の腎構成細胞において内在性にCa indicatorを発現する腎臓オルガノイドを用いることで、特定の腎構成細胞における蛍光強度の変化を指標として細胞内カルシウム動態を測定することもできる。
細胞内カルシウム動態測定は常法に従って行うことができる。
具体的には、Fura-2（同仁化学研究所）、Fluo4、Fluo3、Fura2、Indo1、Rhod2、Quin2、Fura-PE3、Fura Red、calcium green1、calcium crimson、Oregon green 488 BAPTA-1、fluo-3FF、fluo-5N、mag-fura-5、mag-indo-1、rhod-5N、Calbryte-590、Cal-520等（R. Y. Tsien, Methods Cell Biol., 1989, 30, 127）のカルシウム感受性色素（カルシウム指示薬）を細胞にロードし、蛍光強度の変化を指標として細胞内カルシウム動態をFDSS（浜松ホトニクス社）などの測定器で測定する方法が挙げられる。薬剤によるカルシウム放出を測定する過程と、その後細胞外からのカルシウム流入を測定する過程の両者の測定が好ましい。
疾患患者由来のiPS細胞から分化誘導して調製された腎臓オルガノイドから得られた尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞では、健常者由来のiPS細胞から分化誘導して調製された腎臓オルガノイドから得られた尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞と比較して、Thapsigarginによるカルシウム放出が低下している。
疾患患者由来のiPS細胞から分化誘導して調製された腎臓オルガノイドから得られた尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞を一定期間（例えば、1時間～72時間）被験物質とインキュベートしたのち、細胞内カルシウム濃度を測定し、その結果、カルシウム濃度が被験物質とインキュベートしない場合や陰性コントロールとインキュベートしたときと比べて増加する場合、その被験物質は細胞内カルシウム濃度を増加させる能力を有すると評価したり、繊毛関連疾患治療薬の候補物質として選択したりすることができる。
また、被験物質の効果を、細胞質内カルシウム濃度の上昇作用を有する陽性コントロールの効果と比較することにより、評価することもできる。
本発明においては、疾患患者由来のiPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイドまたは尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞での測定結果を、遺伝子変異修復iPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイドまたは尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞での測定結果と比較することが好ましい。また、正常iPS細胞にPKD遺伝子変異を導入した株から分化誘導された腎臓オルガノイドまたは尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞での測定結果を、親株である正常iPS細胞から分化誘導された腎臓オルガノイドまたは尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞での測定結果と比較することも好ましい。
なお、上記遺伝子変異修復iPS細胞とは、繊毛関連疾患患者の原因遺伝子の変異箇所を正常に置換したiPS細胞を意味し、当該変異箇所が正常配列に置換された以外は、当該繊毛関連疾患者と同じ遺伝子情報を有するiPS細胞を意味する。このような遺伝子修復iPS細胞からの腎臓オルガノイドまたは尿細管上皮細胞や近位尿細管細胞などの腎構成細胞と比較することにより、より正確に薬剤の繊毛関連疾患に対する効果を評価することができる。遺伝子変異修復iPS細胞は公知の遺伝子修復技術により調製することができる。例えば、CRISPR/Cas9、TALEN、ZFNなどのゲノム編集技術により、患者由来iPS細胞における繊毛関連疾患原因遺伝子を正常型に置換することで行うことができる。具体的には、CRISPR/Cas9の場合、患者由来iPS細胞に、Cas9およびgRNAとともに、正常型配列を有するオリゴヌクレオチドを導入し、変異配列を置換することにより、行うことができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の態様は以下の実施例には限定されない。
実施例１
＜実験手順＞
iPS細胞からの腎前駆細胞の誘導
PKD1遺伝子に変異を有するADPKD患者の体細胞にレトロウイルスベクターによってOCT4, SOX2, KLF4, c-MYC遺伝子を導入してiPS細胞を作製した(CiRA00009株、CiRA00007株)。得られたiPS細胞をWO 2018/216743の実施例に記載の方法で培養し、腎（ネフロン）前駆細胞を得た。コントロールとして、健常人由来iPS細胞から同様にして腎（ネフロン）前駆細胞を得た。なお、CiRA00009株はQ3895X, Nonsense変異を有し、CiRA00007株はG3818R, Missense変異を有する（Ameku et al. Sci Rep 2016 ;6:30013）。
また、以下のiPS細胞からも同様にして腎（ネフロン）前駆細胞を誘導した。
１）PKD2遺伝子に変異を有するADPKD患者の体細胞にレトロウイルスベクターによってOCT4, SOX2, KLF4, c-MYC遺伝子を導入して作製したiPS細胞(Ameku et al. Sci Rep 2016;6:30013)。
２）PKD1またはPKD2遺伝子に変異を有するADPKD患者の体細胞にエピゾーマルベクターによって、OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shp53またはp53DDを導入して作製したiPS細胞。
３）健常人体細胞由来のiPS細胞に変異型PKD1およびPKD2遺伝子を導入して作製したiPS細胞。
腎臓オルガノイド作製と薬剤処理による腎臓オルガノイド嚢胞形成アッセイ
（実験方法）
１．上記の通り、未分化ヒトiPS細胞（患者由来又は健常人由来）から、WO 2018/216743の実施例に記載の分化誘導系を用いてネフロン前駆細胞を作製し、それを用いて以下の手順で腎臓オルガノイドを作製した。
２．day 11-12のネフロン前駆細胞を、Accumaxを用いて単一の細胞に解離する。24 well plateの1 wellあたり100 μLのAccumaxを加え、37℃、5% CO2で10-15分間インキュベートする。10% FBS 900 μLを加え反応停止した後、P-1000ピペットマンでgentle pipettingを行い、単一の細胞まで解離する。
３．細胞懸濁液の細胞数を測定する。
４．DMEM/F12 Glutamax 培地(Thermo Fisher Scientific)、ビタミンA不含有B27サプリメント(Thermo Fisher Scientific)、500 U/ml PSからなる無血清培地に200 ng/ml FGF9および1 μM CHIR99021を添加した培地にY-27632を終濃度10 μMになるように加え、細胞凝集体作製時の培地とする。
５．細胞凝集体1個あたり1.0-1.5 x 105 cellsとなるように細胞懸濁液をエッペンドルフチューブにとり、300 G x 3 minで遠心する。
６．上清を捨て、4で作製した培地を用いて、細胞凝集体1個あたり50-100 μLとなるように、細胞を再懸濁する。
７．U底の96 well plate（非接着）に50-100 μLずつ細胞懸濁液をとり、300 G x 3 minで遠心する。
８．1-2日培養後、形成された細胞凝集体を24-wellトランズウェルのinsert上に移し、気相液相界面培養とする(day 0：オルガノイド培養開始)。KR5 medium (DMEM/F12 Glutamax containing 0.1 mM non-essential amino acids, 500 U/ml PS, 55 μM 2-mercaptoethanol and 5% KSR)に、200 ng/ml FGF2、5 μM CHIR99021を加えたものを培地とする(1 wellあたり120 μLで培地交換する)。
９．48時間後にKR5 mediumに培地交換し(day 2)、その後は2日ごとにKR5 mediumで培地交換を行う。day 8には、糸球体および尿細管様構造を持つネフロンオルガノイドまで分化する。
１０．嚢胞形成誘導と嚢胞の測定は以下の手順で行った。
day 8から、KR5 mediumに10 μM フォルスコリン（あるいは100 μM 8-Br-cAMP）を加えたものに変更する(2日ごとに培地交換)。コントロールは、同濃度のDMSOを使用する。
１１．day 15まで培養を継続し、KEYENCE BZ-X700で位相差像を撮影して、画像データを取得する。
１２．画像データの解析は、IN Cell Developer Toolbox (GE healthcare)を用いる。嚢胞の指標としては、オルガノイド全体に占める嚢胞部分の面積率(cystic area)、嚢胞の真円度を用いる。嚢胞のサイズが上位の一定順位内に入るものだけに限定して解析するプロトコルが有用である。
１３．CFTR阻害薬(Yang B et al. JASN 2008)、およびmTOR阻害薬(Shillingford J et al. Proc Natl Acad Sci USA 2006)等を用いて、嚢胞形成に対する効果を調べた。day 8でフォルスコリンを開始する3時間前から、100 μM CFTR inhibitor 172、50 μM CFTR inhibitor II、10 μM ラパマイシンまたは10 μM エベロリムスをプレインキュベーションする。その後、これらの薬剤とともに10 μM フォルスコリンを含む培地に変更し、2日ごとに培地交換を行う。前述のプロトコルを用いて、day15での嚢胞部分の面積率、および真円度を測定する。
ヒトiPS細胞由来尿細管上皮細胞のCa flux測定
（実験方法）
１．上記の手順1-9に従ってトランズウェル上で腎臓オルガノイドを作製する。KR5 mediumでの培地交換を続けることにより、day 12まで腎臓オルガノイドを維持することができる。
２．day 8-12の腎臓オルガノイドをエッペンドルフチューブに回収する。P-1000ピペットマンを用いてPBS(-)を適度な強さで吹きかけ、insertに接着しているオルガノイドをはがし、1.5 mLのエッペンドルフチューブあたり約10個のオルガノイドを回収する。
３．上清部分のPBS(-)を捨てる。
４．TrypLE select （Thermo Fisher Scientific）500 μLを加え、37℃、5% CO2で30分間インキュベートする。約15分の時点で一度、P-1000ピペットマンを用いてgentle pipettingを行う。
５．10% FBS 500 μLを加え、gentle pipettingで単一の細胞に解離する。
６．セルストレーナー(35 μm)を通した後、細胞数を計測する。
７．CD326 (EpCAM) MicroBeads (ミルテニー, 130-061-101)を用いて、EpCAM+ MACSによる尿細管上皮細胞の濃縮を行う(Forbes T et al. Am J Hum Genet 2018)。manufacturer's protocolに従いつつ、細胞数に応じてbufferの量は適宜調節する。既報と同様に、1回のMACSでEpCAM+細胞の十分な純化(98.5%)が可能である。
８．Renal Epithelial Cell Growth Medium 2, RECGM2 (PromoCell)に、Y-27632を終濃度50 μMになるように加え、5.0×104 cellあたり50 μLとなるよう細胞懸濁液を作製する。透明底のハーフエリア96 well plate (Greiner, 675090)に、1 wellあたり5.0×104 cell (50μL)でEpCAM+細胞を播種し、37℃、5% CO2で一晩インキュベートする。
９．翌日にはコンフルエントとなるため、FDSS-μCELLによるCa flux測定を行う。RECGM2にCa指示薬であるCal-520 (AAT Bioquest, 21131)を4 μM、water soluble probenecid (Thermo Fisher Scientific, P36400)を2.5 mMとなるように加える。このRECGM2混合液をそれぞれのwellに50 μLずつ加えていく（終濃度は、Cal-520 2 μM、probenecid 1.25 mMとなる。）。37℃、5% CO2で、30分間インキュベートする。
１０．測定の直前に、それぞれのwellを200μL のHBSS (Ca、Mg、およびフェノールレッドを含まない)で洗浄する。その後、各wellにHBSS (Ca、Mg、およびフェノールレッドを含まない)を 80 μLずつ入れる。この際、water soluble probenecid 1.25 mM、クエンチャーとして0.05～0.5 mg/mLのAcid Red 27（東京化成, A0583）を加えてもよい。
１１．2段階の薬液注入（それぞれ20 μLずつ）で、Ca releaseの後、Ca influxを測定するように、FDSS-μCELLの撮影プロトコルを設定する。
１２．第一段階では、Thapsigargin（終濃度10 μM）、Angiotensin II, human（終濃度10 μM）、[Arg8]-Vasopressin（終濃度10 μM）など、Ca releaseを引き起こす薬剤をCa-free HBSSに溶解したものを注液する。第二段階では、終濃度2 mMのCaCl2を注液してストア作動性Ca流入を測定する（ベースラインに対する蛍光強度の比を測定する）。
１３．ポジティブコントロールとして、第一段階で終濃度5 μM ionomycin、第二段階で終濃度30 mM EGTAを用いて、細胞内Ca濃度の変化を測定できていることを示す。
１４．第一段階 (Ca release)のピーク値、AUC (area under the curve)値、第二段階 (Ca influx)のピーク値、AUC値、プラトー値を解析する。
蛍光標識されたヒトiPS細胞由来近位尿細管細胞のCa flux測定
（実験方法）
１．上記手順1-6と同様に、day 8-12のネフロンオルガノイドから細胞を調製する。
２．Renal Epithelial Cell Growth Medium 2, RECGM2 (PromoCell)に、Y-27632を終濃度50 μMになるように加え、1.0×105 cellあたり100 μLで細胞懸濁液を作製する。透明底の96 well plateに、1 wellあたり1.0×105cell (100 μL)で細胞を播種し、37℃、5% CO2で一晩インキュベートする。96 well plateへのコーティングは不要である。
３．翌日にはコンフルエントとなるため、IN Cell Analyzer 6000 (GE healthcare)によるCa flux測定を行う。
４．近位尿細管細胞を標識するため、RECGM2に20 μMの6-carboxyfluorescein (6-CF)を加え、100 μLずつwellに加えていく（終濃度10 μM）。37℃、5% CO2で1時間インキュベートする。
５．1時間後、RECGM2にCa指示薬であるCalbryte-590 (AAT Bioquest, 20700)を4 μM、water soluble probenecid (Thermo Fisher Scientific, P36400)を2.5 mMで加え、1 wellあたり100 μLで培地交換を行う。37℃、5% CO2で、1時間インキュベートする。
６．測定の直前に、各wellを200μL のHBSS (Ca、Mgおよびフェノールレッドを含まない) で洗浄する。その後、HBSS (Ca、 Mgおよびフェノールレッドを含まない) 100 μLずつ各wellに加える。
７．IN Cell Analyzer 6000のLiquid Handling機能を用いて、2段階の薬液注入（それぞれ100 μLずつ）によるCa fluxを測定する。第一段階の撮影が終了した後、ピペットマンを用いてwell中の溶液を100 μLに減らす。
８．Ca fluxの測定対象を、6-CFで蛍光標識された細胞に限定することで、近位尿細管細胞のCa flux測定が可能である。上記12-13と同様の計測を行う。
＜結果＞
図1に示すように、ADPKD患者由来iPS細胞株から尿細管を含む腎臓オルガノイドを作製でき、近位尿細管マーカーLTLと繊毛マーカーARL13Bの発現により、尿細管に一次繊毛が確認できた。
オルガノイド培養開始から8日目にフォルスコリンまたはブレビスタチンを添加し、培養を継続したところ、15日目の時点で、腎嚢胞の形成が見られた（図２）。マーカー染色により確認したところ、糸球体由来の嚢胞はほとんど目立たず、尿細管由来の嚢胞が確認された（図３）。なお、フォルスコリン処理を行うことで、実際はday 30-40程度までネフロンオルガノイドの嚢胞増大がみられる。
イメージアナライザを用いて、腎嚢胞の面積比（Cystic Area）と真円度を測定した。
なお、面積比は以下の通り算出した。
腎嚢胞の面積比 (%) = 腎嚢胞総面積 / オルガノイド総面積 × 100
結果を図4に示す。このように、腎嚢胞の面積比は、患者由来腎臓オルガノイドにおいて顕著に増加しており、また、真円度は健常者由来腎臓オルガノイドよりも低い（嚢胞の形態が不整である）ことが確認でき、腎嚢胞形成および薬剤の効果の定量評価が可能であることが分かった。
次に、フォルスコリンによる嚢胞形成に対する薬剤の効果を調べた。その結果、図5に示すように、数種の薬剤、特にmTOR阻害剤やCFTR阻害剤がフォルスコリンによる腎嚢胞形成を抑制した 。
また、同疾患の患者腎細胞では健常者のものと比べて細胞内へのCa流入が低下していることが報告されている。上記のCa流入測定系を用いることで、ADPKD患者iPS細胞由来の尿細管細胞において、Caの流入低下を再現でき、ここに薬剤を添加することで、Caの流入低下に対する薬剤の効果を評価できる。図６の結果から、健常iPS細胞株由来の腎臓オルガノイド近位尿細管細胞や尿細管上皮細胞と比較して、ADPKD患者由来iPS細胞株から分化誘導した腎臓オルガノイドの近位尿細管細胞や尿細管上皮細胞では、Thapsigarginによる小胞体からのカルシウム放出が低下しており、ピークに至るまでの時間も遅い傾向があることがわかった。
実施例２
実施例１と同様にしてADPKD患者（Patient-A、B）からiPS細胞を作製した。
なお、Patient-A、Bはそれぞれ、実施例１のCiRA00009、CiRA00007に相当する。
作製されたiPS細胞を用い、ADPKD患者（Patient-A、B）由来のiPS細胞から、実施例１と同様の手順に従って腎臓オルガノイドを誘導した。
また、健常者(Normal Subject-AおよびB)からも同様にして腎臓オルガノイドを誘導した。
オルガノイド培養開始10日目からフォルスコリン10μMを添加し17日目の時点で嚢胞形成を評価した。結果を図７に示す。いずれの患者由来のiPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドもフォルスコリンにより嚢胞が形成されたことが確認された。
腎嚢胞の面積比(Cystic Area)の統計学的検定の結果を図８に示す。Patient-A(nonsense), Patient-B(missense)いずれの患者由来のiPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドも、健常者由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドと比較して、統計学的に有意な嚢胞の増大が認められた。
また、ADPKD患者（Patient-A）由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドに対して、フォルスコリン10μMを添加した際の嚢胞形成の経時的な変化を評価した。結果を図９に示す。この結果から、ADPKD患者由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドでは、フォルスコリンの投与開始後、わずか1時間で尿細管の拡張が始まることがわかった。さらに6時間後には、拡張していない尿細管と拡張して上皮が扁平化している尿細管の差が明らかになった。
次に、フォルスコリンによる嚢胞形成に対する各種薬剤の効果を評価するために、ADPKD患者（Patient-A）由来iPS細胞株から腎臓オルガノイドを誘導し、オルガノイド培養の10日目からフォルスコリン10μMとともに各種薬剤を添加し17日目の時点で腎嚢胞の面積比(Cystic Area)を計測した。結果を図１０に示す。Tolvaptan（臨床的に使用されているADPKDの嚢胞増大抑制薬）では、コントロール（フォルスコリン単剤）と比較して、嚢胞のサイズに統計学的有意差を認めなかったが、CFTR inhibitor 172およびエベロリムスでは統計学的に有意に嚢胞増大を抑制した。
実施例３
CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いて健常者由来iPS細胞株に変異PKD1遺伝子を導入した変異導入iPS細胞株（PKD1ヘテロ株(PKD1+/-)およびPKD1ホモ株(PKD1-/-)）を作製し、解析した。
CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いた疾患特異的iPS細胞株の樹立は以下の手順で行った。
Ishida et al. （Site-specific randomization of the endogenous genome by a regulatable CRISPR-Cas9 piggyBac system in human cells, Sci. Rep. 8 (2018) 310.)に記載の方法を用いて、PKD1遺伝子のエクソン34のスプライシング受容部位(splicing acceptor site)に、非相同末端結合(non-homologous end joining (NHEJ))により変異を導入した。
具体的には、Okita et al. （An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells, Stem Cells 31 (2013) 458-466.)に記載された健常者由来ヒトiPS細胞株である585A1株をwild-type株として、このwild-type株に対してpiggyBacトランスポゾンベクター(Addgene ID 100596およびAddgene ID 100598およびPiggyBac Transposase発現用ベクター)を用いて、TetO-Cas9-GR遺伝子およびPKD1遺伝子のエクソン34のスプライシング受容部位をターゲットとしたgRNA発現用配列を導入し、薬剤投与によりinducibleにCas9活性を誘導して非相同末端結合(NHEJ)によるゲノム編集を生じさせた。
ゲノム編集後のiPS細胞は、フローサイトメトリーによりシングルコロニーに単離され、その後シークエンス解析を行うことで、片アレルにフレームシフト変異を確認したものをPKD1ヘテロ株、両アレルにフレームシフト変異を確認したものをPKD1ホモ株とした。
健常者由来iPS細胞株(Wild-type)、および疾患特異的iPS細胞株（PKD1ヘテロ株(PKD1+/-)およびPKD1ホモ株(PKD1-/-)）から実施例２と同様の手順で腎臓オルガノイドを誘導し、オルガノイド培養の10日目からフォルスコリン10μMを添加し17日目の時点で嚢胞形成を評価した。結果を図１１に示す。健常者由来iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドではフォルスコリン添加によって嚢胞は形成されなかったが、変異導入iPS細胞株から分化誘導された腎臓オルガノイドではフォルスコリン添加によって嚢胞形成が促進され、その程度はPKD1ホモ株で顕著であった。このことは、腎嚢胞の面積比(Cystic Area)の統計学的検定（図１２）でも確かめられた。
また、健常者由来iPS細胞株または疾患特異的iPS細胞株（PKD1ホモ株(PKD1-/-)）から分化誘導された腎臓オルガノイドをフォルスコリン存在下で培養し、形成された嚢胞を含む腎臓オルガノイドを免疫染色で解析した。結果を図１３に示す。糸球体由来の嚢胞はほとんど目立たず、尿細管由来の嚢胞が確認された。
本明細書中に言及される、特許、公開出願及びその他の刊行物、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）などのデータベースを通して入手可能なＧｅｎＢａｎｋ受託番号及び関連する配列情報並びに他のデータは、その一部または全体が、参照により組み込まれる。

Claims (11)

  1. 繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られた人工多能性幹（iPS）細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる腎構成細胞を、薬剤候補物質と接触させる工程、および当該腎臓オルガノイドまたは腎構成細胞における、カルシウム動態、および／または嚢胞形成を測定する工程、を含む、繊毛関連疾患治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
  2. 前記体細胞が変異型PKD（Polycystic Kidney Disease）遺伝子を保持する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記体細胞がPKD1遺伝子および／またはPKD2遺伝子に変異を有する繊毛関連疾患患者由来である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記繊毛関連疾患が常染色体優性多発性嚢胞腎である、請求項1～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 嚢胞形成促進物質による刺激により嚢胞形成を誘導したのち、嚢胞形成を測定する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 嚢胞形成促進物質がフォルスコリン、8-Bromo-cAMPまたはブレビスタチンである、請求項５に記載の方法。
  7. 嚢胞形成の測定が嚢胞のサイズ、数、もしくは真円度の測定である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. mTOR阻害剤またはCFTR阻害剤を陽性コントロールとして使用する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 測定結果を、健常者由来の体細胞から得られたiPS細胞または遺伝子変異修復iPS細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドまたはそれに含まれる腎構成細胞のカルシウム動態、および／または嚢胞形成と比較する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 腎臓オルガノイドが、以下の工程により得られたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
    （ｉ）多能性幹細胞を、FGF（線維芽細胞増殖因子）2、BMP（骨形成タンパク質）4、GSK（グリコーゲン合成酵素キナーゼ）-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程；
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGF（トランスフォーミング増殖因子）β阻害剤を含む培地で培養する工程；
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK阻害剤を含む培地で培養する工程； 
    （ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体、BMP阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；
    （ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程；および
    （ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた細胞を非接着培養することにより細胞塊を形成させて培養する工程。
  11. 繊毛関連疾患患者由来の体細胞から得られたiPS細胞を分化誘導して得られた腎臓オルガノイドを含む繊毛関連疾患モデルであって、嚢胞形成促進物質による刺激により嚢胞形成を生じた、繊毛関連疾患モデル。
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