JP2023169391A - 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、移植に適したドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞凝集体、その混合物及びそれらの製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の細胞凝集体は、ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞を含み、１０００個以上の細胞を含む。【選択図】図５

Description

本発明は、細胞凝集体等の接着性細胞集団、当該細胞集団の混合物及びそれらの製造方法に関する。

パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン産生神経細胞の脱落によって起きる神経変性疾患であり、現在、世界中で約４００万人の罹患者がいる。パーキンソン病の治療として、Ｌ－ＤＯＰＡもしくはドーパミンアゴニストによる薬物治療、定位脳手術による凝固術、深部電気刺激治療、及び胎児中脳移植などが行われている。胎児中脳移植は、その供給源の組織の倫理的な問題があるとともに、感染の危険性も高い。

近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞から分化誘導したドーパミン産生神経細胞又はその前駆細胞であるドーパミン産生神経前駆細胞を用いた治療法が提案されており（非特許文献１）、その製造方法が報告されている。具体的には、ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法として、ドーパミン産生神経細胞又はドーパミン産生神経前駆細胞のマーカーとなる因子（具体的にはＣｏｒｉｎ又はＬｒｔｍ１）により移植に適した細胞を選別する工程を含む方法が提案されているが（特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）、ロット差の影響を少なくして品質均一性を確保し、産生効率を上げるために、更なる改良が求められている。

国際公開第２０１５／３４０１２号

Wernig M, et al., Proc Natl AcadSci U S A. 2008, 105: 5856-5861 Doi D, et al., Stem Cell Reports.2014, 2: 337-350 Samata B, et al., Naturecommunication. 2016, 7: 1-11

本発明は、大きさ及び形状の点において良好な神経細胞の細胞凝集体等の接着性細胞集団、当該細胞集団を含む高い均一性を有する細胞凝集体もしくは細胞集団の混合物及びそれらの製造方法、具体的にはドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞凝集体、高い均一性を有する当該細胞凝集体の混合物、及びそれらの製造方法等を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、液体媒体の連続的な流れの中に、複数の細胞を浮遊させ、当該細胞を目的の神経前駆細胞とそうでない細胞とに、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離する工程を経て目的の神経前駆細胞を選別し、これを培養して神経系細胞を含む細胞凝集体を製造することにより、細胞数や細胞の状態を適正に管理することが求められる、ヒト移植用に適した数の神経系細胞を含む細胞凝集体、及び当該細胞凝集体の均一な混合物を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞を含み、
１０００個以上の細胞を含む、細胞凝集体。
［２］
ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞を、全細胞数の約７０％以上含む、［１］に記載の細胞凝集体。
［３］
培養時に細胞死が抑制され得る、［１］又は［２］に記載の細胞凝集体。
［４］
以下から選択される少なくとも一つの特徴を更に有する、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞凝集体：
（ａ１）円相当径が１００μｍ～２０００μｍであること、
（ａ２）包絡度が０．５以上であること、
（ａ３）フェレ径比が０．５以上であること、及び
（ａ４）円形度が０．３以上であること。
［５］
表面にデブリ層を有さず顕微鏡下で細胞凝集体の境界線が明瞭である、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞凝集体。
［６］
複数の細胞凝集体の混合物であって、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞凝集体を全細胞凝集体数の５０％以上含む、細胞凝集体の混合物。
［７］
円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選択される指標のうち１以上の指標において、１５％以下の変動係数を有する、［６］に記載の細胞凝集体の混合物。
［８］
接着性細胞集団の混合物の製造方法であって、
（１）複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を１以上含む複数の細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程（１）で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程；並びに
（３）工程（２）で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程であって、
接着性細胞集団の混合物は、以下の（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の５０％以上含む工程を備える、製造方法：
（ｂ１）第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、及び
（ｂ２）１０００個以上の細胞を含むこと。
［９］
（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団が、培養時に細胞死が抑制され得る、［８］に記載の製造方法。
［１０］
接着性細胞集団を１４～２０日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の５％以上、好ましくは１０％以上である、［９］に記載の製造方法。
［１１］
接着性細胞集団の混合物が細胞凝集体の混合物である、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
接着性細胞集団が細胞凝集体であり、上記（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する細胞凝集体の円相当径が１００μｍ～２０００μｍである、［１１］に記載の製造方法。
［１３］
（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団が細胞凝集体であって、以下の特徴を更に有する、［１２］に記載の製造方法：
（ｂ３）包絡度が０．５以上であること
（ｂ４）フェレ径比が０．５以上であること、及び
（ｂ５）円形度が０．３以上であること。
［１４］
細胞凝集体の混合物が、円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選ばれる指標のうち１以上の指標において、１５％以下の変動係数を有する、［１１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
工程（２）において、第一分化段階にある神経前駆細胞が、マイクロ流路方式セルソーターを用いて分離される、［８］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
工程（２）において、第一分化段階にある神経前駆細胞が閉鎖系で分離される、［８～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
幹細胞が多能性幹細胞である、［８］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
第一分化段階にある神経前駆細胞が、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞である、［８］～［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］
第一分化段階にある神経前駆細胞が、Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞である、［１８］に記載の製造方法。
［２０］
第二分化段階にある神経系細胞が、ＴＵＪ１、ＯＴＸ２、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２及びＴＨからなる群より選ばれるマーカーの少なくとも１つについて陽性の神経系細胞である、［８］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
第二分化段階にある神経系細胞が、ＦＯＸＡ２陽性かつＴＵＪ１陽性のドーパミン産生神経前駆細胞である、［２０］に記載の製造方法。
［２２］
［８］～［２１］のいずれかに記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物。
［２３］
接着性細胞集団の製造方法であって、
［８］～［２１］のいずれかに記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物から、上記（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を分離する工程を備える、製造方法。
［２４］
［２３］に記載の製造方法により得られる接着性細胞集団。
［２５］
［１］～［５］のいずれかに記載の細胞凝集体、［６］もしくは［７］に記載の細胞凝集体の混合物、［２２］に記載の接着性細胞集団の混合物、又は［２４］に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、移植用医薬組成物。
［２６］
［１］～［５］のいずれかに記載の細胞凝集体、［６］もしくは［７］に記載の細胞凝集体の混合物、［２２］に記載の接着性細胞集団の混合物、又は［２４］に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療剤。
［２７］
［１］～［５］のいずれかに記載の細胞凝集体、［６］もしくは［７］に記載の細胞凝集体の混合物、［２２］に記載の接着性細胞集団の混合物、又は［２４］に記載の接着性細胞集団のいずれかを、患者の中枢神経に移植する工程を含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療方法。

本発明によれば、大きさ及び形状の点において良好な神経細胞の細胞凝集体等の接着性細胞集団、当該細胞集団を含む高い均一性を有する接着性細胞集団の混合物及びそれらの製造方法を提供することができる。本発明によれば、医薬品として求められる程度の、細胞凝集体等の接着性細胞集団の均一性を達成することが可能となり、例えばヒトへの移植に適した神経系細胞を提供することが可能となる。

図１は、ヒトｉＰＳ細胞をドーパミン産生神経前駆細胞へ分化誘導するためのプロトコールを示す。 図２は、Ｊａｚｚ又はＧｉｇａｓｏｒｔを用いてソーティングを行った各細胞群について、第二分化段階の浮遊培養時の１６、２０、２４、２８日目（ｄａｙ １６、ｄａｙ ２０、ｄａｙ ２４、ｄａｙ ２８）の細胞凝集体顕微鏡観察像（ｎ＝３）を示す。 図３は、分化誘導開始後２８日目（ｄａｙ ２８）の細胞凝集体のデジタルマイクロスコープでの形態観察像を示す。（Ａ）はＪａｚｚ、（Ｂ）はＧｉｇａｓｏｒｔの結果を示す。 図４は、図３における各細胞凝集体について、各円相当径（Ａ）、包絡度（Ｂ）、面積（Ｃ）、フェレ径比（Ｄ）及び円形度（Ｅ）を測定し、Ｊａｚｚ（薄灰色）とＧｉｇａｓｏｒｔ（濃灰色）で比較したグラフを示す。 図５は、図３における各細胞凝集体について、各最小径、周囲長、フェレ径（水平）、フェレ径（垂直）、フェレ径比、包絡度（面積）、包絡度（周囲長）面積、最大径、円形度、円相当径をそれぞれ測定し、変動係数（ＣＶ値）を算出し、Ｊａｚｚ（薄灰色）とＧｉｇａｓｏｒｔ（濃灰色）で比較したグラフを示す。 図６は、分化誘導開始後２８日目（ｄａｙ ２８）の抗ＦＯＸＡ２抗体、抗Ｎｕｒｒ１抗体、抗ＴＨ抗体及びＤＡＰＩを用いて得られた免疫染色像を示す。

Ｉ．定義
〔細胞集団〕
本明細書において、接着性細胞集団とは、複数の細胞同士が接着して形成される細胞の塊をいい、細胞が三次元方向に生物学的に結合（すなわち接着）した三次元の接着性細胞集団、及び細胞が二次元方向に生物学的に結合した二次元の接着性細胞集団を含む概念である。

三次元の接着性細胞集団は、細胞凝集体（Ｃｅｌｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）ともいい、立体構造を形成している細胞の塊であれば特に限定は無く、球状であっても非球状であってもよい。本明細書における細胞凝集体は、好ましくは球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体である。球状に近い立体的な形は、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す。

二次元の接着性細胞集団は、細胞シートともいい、単層又は重層の細胞が平面的に接着して形成される単層又は重層の構造体であれば、特に限定はない。接着培養で製造されたものも、非接着培養で製造されたものも共に、本明細書における細胞シートに含まれる。

本明細書において、「接着性細胞集団の混合物」又は「細胞凝集体の混合物」とは、接着性細胞集団もしくは細胞凝集体が２以上存在している態様（組成物）を表す。接着性細胞集団もしくは細胞凝集体は、それぞれ容器内において培地等の液体状媒体に浮遊しているか、容器に付着しているか、及び容器の底に沈降しているか、いずれの状態であってもよい。また、凍結された接着性細胞集団もしくは細胞凝集体も、本明細書における接着性細胞集団もしくは細胞凝集体の混合物に含まれる。

本明細書における細胞（細胞凝集体、細胞シート、細胞集団等における細胞を含む）とは、哺乳動物の細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の細胞であり、より好ましくはヒトの細胞である。

〔神経系細胞〕
本明細書において、神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌ）としては、例えば中枢神経系の神経系細胞、又は、自律神経の神経系細胞もしくは運動神経や感覚器系の神経系細胞などの末梢神経系細胞など、あらゆる神経系細胞が挙げられ、神経系細胞には、神経細胞、神経堤由来細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及びそれらの幹細胞もしくは前駆細胞等が含まれる。

本明細書において、ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞は、ＦＯＸＡ２又はＴＵＪ１を検出可能なレベルで発現している神経系細胞であれば特に限定はない。当該神経系細胞としては神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、中脳腹側部由来神経前駆細胞、ドーパミン産生神経前駆細胞、ドーパミン産生神経細胞、ＧＡＢＡ神経前駆細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、コリン神経前駆細胞、コリン神経細胞、グルタミン酸神経前駆細胞、グルタミン酸神経細胞、網膜細胞（視細胞、視細胞前駆細胞、網膜色素上皮細胞等を含む）、角膜細胞等が挙げられる。

詳しくは、ＦＯＸＡ２陽性でＴＵＪ１陰性の神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、及び中脳腹側部由来神経前駆細胞が挙げられる。
ＦＯＸＡ２陰性でＴＵＪ１陽性の神経系細胞としては、例えば、ＧＡＢＡ神経前駆細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、コリン神経前駆細胞、コリン神経細胞、グルタミン酸神経前駆細胞、グルタミン酸神経細胞、網膜細胞（視細胞、視細胞前駆細胞、網膜色素上皮細胞等を含む）、及び角膜細胞が挙げられる。
ＦＯＸＡ２陽性及びＴＵＪ１陽性の神経系細胞としては、ドーパミン産生神経前駆細胞及びドーパミン産生神経細胞等の神経細胞が挙げられる。

本明細書において、ドーパミン産生神経前駆細胞は、特に断りがなければ、ドーパミン産生神経細胞又はドーパミン作動性ニューロンなどを含んでもよい。ドーパミン産生神経前駆細胞は、ＦＯＸＡ２陽性及びＴＵＪ１陽性であり、更に好ましくは、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２及びＴＨのうちの１以上が陽性の細胞を含有する。

神経系細胞の他の態様として、ＦＯＸＡ２、ＴＵＪ１、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２及びＴＨの少なくとも１つが陽性の神経系細胞が挙げられる。

ヒトＦＯＸＡ２としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１７８４又はＮＭ＿１５３６７５で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＴＵＪ１（Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６０８６又はＮＭ＿００１１９７１１８で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＯＴＸ２としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１７２８、ＮＭ＿１７２３３７、ＮＭ＿００１２７０５２３、ＮＭ＿００１２７０５２４又はＮＭ＿００１２７０５２５で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＬＭＸ１Ａとしては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１７４０６９又はＮＭ＿１７７３９８で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＬＭＸ１Ｂとしては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３１６、ＮＭ＿００１１７４１４６又はＮＭ＿００１１７４１４７で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＥＮ１としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１４２６で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＮｕｒｒ１としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６１８６で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＰＩＴＸ３としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０２９で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＤＡＴ（ＳＬＣ６Ａ３）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０４４で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＧＩＲＫ２（ＫＣＮＪ６）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２２４０で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトＴＨとしては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３６０、ＮＭ＿１９９２９２又はＮＭ＿１９９２９３で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。

〔神経前駆細胞〕
神経前駆細胞とは、より分化が進んだ神経系細胞に分化誘導され得る前駆細胞を意味する。神経前駆細胞は、中枢神経系の神経系細胞、又は、自律神経の神経系細胞もしくは運動神経や感覚器系の神経系細胞などの末梢神経系の神経系細胞等、神経細胞を含むあらゆる神経系細胞へ分化され得る。

〔幹細胞〕
本明細書において、幹細胞とは、多分化能（複数種類の細胞へ分化し得る能力）と自己複製能の両方を有し、際限なく増殖可能な細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）；骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）由来の細胞から遺伝子導入等により人工的に作製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞、並びに、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉及びその他の組織に存在し、特定された複数種類の細胞に分化する体性の幹細胞が挙げられる。

〔多能性幹細胞〕
本明細書における多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されない。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）及び生殖細胞（例えば精巣）から作製される***幹細胞（ＧＳ細胞）も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦ（白血病抑制因子）を含む培地中で培養することによって製造することができる。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＲｘ：：ＧＦＰ株（ＫｈＥＳ－１株由来）は、国立研究開発法人理化学研究所から入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞株及びＤ３細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びＡＴＣＣから入手可能である。

胚性幹細胞の一つである核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することによって製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７，１９９２）。

本明細書における「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等によって初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することで、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞、又は末梢血単核球等の分化した体細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現によって初期化して、多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。

人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによってマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１－１０６）。

人工多能性幹細胞は、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等によって体細胞から人工多能性幹細胞を誘導する方法によっても製造することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性幹細胞細胞株が、京都大学から入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４細胞、ＱＨＪ－Ｉ０１及びＦｆ－Ｉ１４細胞が、京都大学から入手可能である。

人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現によって初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。上記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、又はエピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、又はエレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法）等が挙げられる。

人工多能性幹細胞は、フィーダー細胞存在下又はフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地、又はフィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｅ８培地）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ－Ｅ８培地、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地等のフィーダーフリー培地を挙げることができる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダーフリーで体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃの４因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。

本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス又はラット）又は霊長類（例、ヒト又はサル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト又はマウス多能性幹細胞、さらに好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。

〔分化誘導因子〕
分化誘導因子としては、幹細胞から神経系細胞（第一分化段階にある神経前駆細胞及び第二分化段階にある神経系細胞を含む）へ分化誘導させるために細胞内シグナル伝達を調整する因子を意味する。神経系細胞の種類によって、当業者に周知の分化誘導因子を適宜選択することができる。

例えば、多能性幹細胞からＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性細胞への分化誘導に用いられる分化誘導因子としては、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＳＨＨシグナル刺激剤、ＦＧＦ８及びＧＳＫ３β阻害剤を例示することができる。

また、Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性細胞からドーパミン産生神経前駆細胞への分化誘導に用いられる分化誘導因子としては、神経栄養因子等を挙げることができる。

〔ＢＭＰ阻害剤〕
本明細書において、ＢＭＰ阻害剤とは、ＢＭＰに起因するシグナル伝達を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、又は低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７が挙げられる。ＢＭＰ阻害剤として、ＢＭＰに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ）とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰＲとして、ＡＬＫ２又はＡＬＫ３を挙げることができる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、コルジン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）などのタンパク質性阻害剤、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（すなわち、６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）及びその誘導体（Ｐ． Ｂ． Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００７）， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １１６：ＩＩ＿６０； Ｐ．Ｂ． Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ４：３３－４１； Ｊ． Ｈａｏ ｅｔ ａｌ． （２００８）， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ３（８）：ｅ２９０４）、並びにＬＤＮ１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ；４－［６－（４－ピペラジン－１－イルフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン）が例示される。ここでＬＤＮ１９３１８９は、ＢＭＰＲ（ＡＬＫ２／３）阻害剤（以下、ＢＭＰＲ阻害剤）として周知であり、例えば塩酸塩の形態で市販されている。ドルソモルフィン及びＬＤＮ１９３１８９は、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社及びＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。ＢＭＰ阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。本発明で使用されるＢＭＰ阻害剤は、好ましくは、ＬＤＮ１９３１８９であり得る。

〔ＴＧＦβ阻害剤〕
本明細書において、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβのＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、又は低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、ＴＧＦβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、及びＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、ＴＧＦβ受容体の阻害剤、Ｓｍａｄの阻害剤等）を挙げることができる。受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩアクセッション番号として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、Ｌｅｆｔｙ－２（ＮＣＢＩアクセッション番号として、マウス：ＮＭ＿１７７０９９、ヒト：ＮＭ＿００３２４０及びＮＭ＿００１１７２４２５が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ， ２００３， ２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８３－０１（ＷＯ２００９／１４６４０８）及びこれらの誘導体などが例示される。本発明で使用されるＴＧＦβ阻害剤として、好ましくはＳＢ４３１５４２（４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド）又はＡ－８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド）が挙げられ、これらは、ＴＧＦβ受容体（ＡＬＫ５）及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤として公知である。ＴＧＦβ阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。本発明で使用されるＴＧＦβ阻害剤は、更に好ましくは、Ａ８３－０１であり得る。

尚、ＴＧＦβ阻害剤やＢＭＰ阻害剤等のＳＭＡＤシグナル伝達阻害活性は、当業者に周知の方法、例えばＳｍａｄのリン酸化をウェスタンブロッティング法で検出することで決定できる（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． （２００４） ３， ７３７－４５．）。

〔ＳＨＨシグナル刺激剤〕
本明細書において、ＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ；ソニック・ヘッジホッグ）シグナル刺激剤としては、ＳＨＨが受容体であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ１）に結合して引き起こされるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の脱抑制及びさらに続くＧｌｉ２の活性化を引き起こす物質として定義され、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質、具体的にはＳＨＨもしくはＩＨＨ（Ｉｎｄｉａｎ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ；インディアン・ヘッジホッグ）、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５（Ｌｉ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２３， ２１５～ ２２１ （２００５）．）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ、ＳＡＧ（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ；Ｎ－メチル－Ｎ’－（３－ピリジニルベンジル）－Ｎ’－（３－クロロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボニル）－１，４－ジアミノシクロヘキサン）、２０－ヒドロキシコレステロール（２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、パルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＰＭＡ；９－シクロヘキシル－Ｎ－［４－（４－モルホリニル）フェニル］－２－（１－ナグタレニルオキシ）－９Ｈ－プリン－６－アミン）、及びこれらの誘導体などが例示される（Ｓｔａｎｔｏｎ ＢＺ， Ｐｅｎｇ ＬＦ．， Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ． ６：４４－５４， ２０１０）。ＳＨＨシグナル刺激剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。

本発明で使用されるＳＨＨシグナル刺激剤として、好ましくは、ＳＨＨタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００１９３、ＮＰ＿０００１８４）、パルモルファミン、及びＳＡＧが挙げられる。本発明で使用されるＳＨＨシグナル刺激剤として、更に好ましくは、パルモルファミンであり得る。

〔ＦＧＦ８〕
本明細書において、ＦＧＦ８とは、特に限定されないが、ヒトＦＧＦ８の場合、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｅ又はＦＧＦ８ｆの４つのスプライシングフォームが例示され、より好ましくは、ＦＧＦ８ｂである。ＦＧＦ８は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。

〔ＧＳＫ３β阻害剤〕
本明細書において、ＧＳＫ３β阻害剤とは、ＧＳＫ３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱｐＳＰ－ＮＨ_２（配列番号１））及び高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。本発明で使用されるＧＳＫ３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。

〔細胞外マトリクス〕
本明細書において、細胞外マトリクス（細胞外基質ともいう）とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン及びラミニンといった物質又はこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの細胞からの調製物であってもよい。好ましくは、ラミニン又はその断片である。本明細書においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖及び３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４又はα５であり、β鎖は、β１、β２、β３又はβ４であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２又はγ３が例示される。本発明において用いられるラミニンは、より好ましくは、α５、β１及びγ１からなるラミニン５１１である（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８， ６１１－６１５ （２０１０））。

本発明では、ラミニンは断片であってもよく、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメント（ＥＭＢＯ Ｊ．， ３：１４６３－１４６８， １９８４、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０５：５８９－５９８， １９８７）であってもよい。従って、本発明では、好ましくは、ラミニン５１１をエラスターゼで消化して得られる、ＷＯ２０１１／０４３４０５に記載されたラミニン５１１Ｅ８（好ましくはヒトラミニン５１１Ｅ８）が例示される。尚、本発明で用いられるラミニン５１１Ｅ８等のラミニンＥ８フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。またラミニン５１１Ｅ８は市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。

未同定成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、好ましくは単離されている。

〔神経栄養因子〕
本明細書において、神経栄養因子とは、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、神経栄養因子３（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３、ＮＴ－３）、神経栄養因子４／５（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４／５；ＮＴ－４／５）、神経栄養因子－６（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ６；ＮＴ－６）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－５（ＦＧＦ－５）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １；ＩＧＦ １）、インスリン様成長因子２（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２；ＩＧＦ ２）、グリア細胞株由来神経栄養因子（Ｇｌｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＤＮＦ）、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＩＬ－６）、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ）及びＬＩＦなどが挙げられる。また、これらの一種又は二種以上を適宜選択して用いてもよい。本発明において好ましい神経栄養因子は、ＧＤＮＦ及びＢＤＮＦから成るグループより選択される因子である。神経栄養因子は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。

〔ＲＯＣＫ阻害剤〕
本発明において、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ－２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７， ９７６－９８３ （２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２５，２７３－２８４ （２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９： ９９０－９９４ （１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ９３： ２２５－２３２ （２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５２（４）： ３１９－３２４ （２００３）参照）及びそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、Ｙ－２７６３２であり得る。

〔培地〕
本明細書おいて細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができ、基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。これらの基礎培地から、本発明の製造方法の各工程において使用される培地を調製することができる。

本明細書において、多能性幹細胞を含む細胞集団の培養には用いられる培地は、多能性幹細胞の細胞死を抑制すべく、未分化維持因子を含む培地（未分化維持培地）であることが望ましい。また、多能性幹細胞を含む細胞集団の培養に用いられる培地は、フィーダーフリーの無血清培地であることが望ましい。当該培地は、例えば、基礎培地に未分化維持因子、血清代替物及び適宜栄養源等を添加することにより、調製することができる。具体的には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にｂＦＧＦ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸（ｎｏｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ；ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン及び２－メルカプトエタノールを添加することにより、調製することができる。

本明細書における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）製の、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが挙げられる。

無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。

調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、ＧＭＥＭ培地に約８％ＫＳＲ、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄを添加した培地）、又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に市販のＢ－２７を適量（例えば、約０．１～５％）添加した無血清培地を使用してもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１－５０８３０２公報に開示された培地が挙げられる。

培養は、好ましくは無血清培地中で行われる。無血清培地として、好ましくはＫＳＲ、又はＢ－２７を含む無血清培地、又は、ゼノフリー条件の培地中で行われる。ここで「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。

本明細書において、フィーダー細胞とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞のことである。フィーダー細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（ＭＥＦ等）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞、ＳＴＯ細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理されたフィーダー細胞でもよく、ここで、増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンＣ）処理又はガンマ線照射もしくはＵＶ照射等による処理が挙げられる。ただし、本発明ではフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で培養を行うことが好ましい。

本明細書において、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えば、上記のようなフィーダー細胞を添加していない条件、又は、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下、好ましくは０．５％以下）の条件が挙げられる。
未分化維持培地として使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／ｌ）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ_３（５４３ｍｇ／ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＴＧＦβ阻害剤（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８， ４２４－４２９ （２０１１））。市販のフィーダーフリー培地としては、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｓｅｐ ９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地としては、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）が挙げられる。上記工程（１）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。

尚、本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地又は外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌もしくは産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないと解する。

ＩＩ．細胞凝集体及びその混合物
本発明の一態様として、ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞を含み、細胞凝集体１個あたりの細胞数が１０００個以上である、細胞凝集体が挙げられる。細胞凝集体の混合物としては、複数の細胞凝集体の混合物であって、本発明の細胞凝集体を全細胞凝集体数の５０％以上含む混合物である。

当該細胞凝集体において、ＦＯＸＡ２陽性の神経系細胞又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞の数は、当該細胞凝集体又は当該細胞凝集体の由来物が生体に移植された場合に、当該神経系細胞の機能を発揮することができれば、特に限定はなく、当該神経系細胞の種類に依存するが、全細胞数の、好ましくは約７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である。

本発明の一態様として、ＦＯＸＡ２陽性かつＴＵＪ１陽性の神経細胞を含み、細胞凝集体１個あたりの細胞数が１０００個以上である、細胞凝集体が挙げられる。

神経系細胞がドーパミン産生神経前駆細胞の場合、本発明における細胞凝集体は、好ましくは、ＦＯＸＡ２陽性かつＴＵＪ１陽性の神経細胞を全細胞数の約５０％以上、更に好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上含む。

本発明の一態様において、細胞凝集体は、培養時に細胞死が抑制され得ることを特徴とする。ここで「培養時に細胞死が抑制され得る」とは、分化誘導因子等の存在下に３７℃程度で細胞培養を行ったときに通常起こる神経細胞の細胞死が抑制され得ることを意味する。

例えば、細胞凝集体を３７℃で、分化誘導因子の存在下に１４～２０日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の５％以上、好ましくは８％以上、更に好ましくは１０％以上、更に好ましくは１５％以上、更に好ましくは３０％以上である場合に、当該細胞凝集体が「培養時に細胞死が抑制され得る」と判定することができる。

本発明の一態様において、細胞凝集体は、以下の（ａ１）～（ａ４）から選択される少なくとも１つの特徴を有する。細胞凝集体は、（ａ１）～（ａ４）の特徴を全て有していてもよい。
（ａ１）円相当径が１００μｍ～２０００μｍであること、
（ａ２）包絡度が０．５以上であること、
（ａ３）フェレ径比が０．５以上であること、及び
（ａ４）円形度が０．３以上であること。

ここで上記（ａ１）～（ａ４）は、顕微鏡又はデジタルマイクロスコープにおいて、観察面に対して垂直方向からの平行な透過照明により生成する像をカメラで撮影し、得られた図形（すなわち、細胞凝集体を平面に投影した場合に形成される図形）を解析することによって測定することができる。

ここで円相当径とは、上記図形の面積と同じ面積を持つ円の直径である。円相当径は、好ましくは１００μｍ～１０００μｍ、更に好ましくは２００μｍ～６００μｍ、好ましくは３００μｍ～６００μｍ、更により好ましくは４５０μｍ～６００μｍである。

包絡度とは、上記図形とその図形を包絡する凸多角形との周囲長又は面積の比を表す。具体的には、包絡度には、周囲長の包絡度及び面積の包絡度があり、周囲長の包絡度は、包絡図形の周囲長に対する図形の周囲長の比、面積の包絡度は、包絡図形の面積に対する図形の面積の比である。包絡度は、好ましくは０．７～１．０、更に好ましくは０．８～１．０である。

フェレ径比とは、上記図形に外接する四角形の、水平方向の長さと、これに直行する垂直方向の長さとの比であり、水平方向の長さに対する垂直方向の長さの比で表される。フェレ径比は、好ましくは０．６～１．０、更に好ましくは、０．７～１．０である。

円形度とは、上記図形が真円の時１となり、細長くなるほど０に近づく、４π×（面積）÷（周囲長）^２であらわされる値である。円形度は、好ましくは０．５～１．０、更に好ましくは０．７～１．０である。

本発明の細胞凝集体の一態様として、孤立した細胞凝集体の表面にデブリ層が形成されておらず、顕微鏡下で細胞凝集体の境界線が明瞭である細胞凝集体が挙げられる。
ここで用いられる顕微鏡は、倍率４～１０倍程度の当業者に周知の顕微鏡であれば特に限定はないが、具体的には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＥＶＯＳ ＸＬが挙げられる。

「孤立した細胞凝集体」とは、他の細胞凝集体と接触せず、細胞凝集体の外縁を観察可能な状態の細胞凝集体をいう。

デブリ層とは、細胞凝集体の表面に存在し、単一の粒子として観察可能な粒子群（例えば、死細胞の群）が層状に、連続的に集合している構造のことをいう。細胞凝集体の表面にデブリ層が形成されている場合には、当該細胞凝集体の境界線が、デブリ層を有さない又は少量のデブリ層を有する細胞凝集体に比べて不明瞭である。

上記の本発明の細胞凝集体を複数含む細胞凝集体の混合物もまた、本発明の範疇である。本明細書において、細胞凝集体の混合物は、少なくとも２個以上、好ましくは５個以上の細胞凝集体を含み、本発明の細胞凝集体を、全細胞凝集体数の約２０％以上、好ましくは約４０％以上、更に好ましくは約５０％以上、特に好ましくは６０％以上を含む。細胞凝集体の混合物は、サテライト状に存在する測定可能な大きさの微小な細胞群を含んでもよい。

ここで「サテライト状に存在する微小な細胞群」とは、細胞凝集体と結合せずに独立して存在し、複数の細胞（例えば、死細胞）からなる小さな細胞群のことを意味する。

本発明の細胞凝集体の混合物は、少なくとも大きさ及び形状の点において良好な均一性を有し、円形度、最小径、周囲長、フェレ径（垂直フェレ径又は水平フェレ径）、フェレ径比、最大径、包絡度（周囲長包絡度又は面積包絡度）、面積及び円相当径からなる群より選ばれる指標のうち、１以上の指標において、変動係数（ＣＶ値）が１５％以下、好ましくは１２％以下又は１０％以下、より好ましくは８％以下又は５％以下である。ここで各指標は、顕微鏡又はデジタルマイクロスコープにおいて、観察面に対して垂直方向からの平行な透過照明により生成する像をカメラで撮影し、得られた図形を解析することによって測定することができるが、この方法と同程度の精度で測定できる方法であれば、測定方法には限定は無い。

ここで、最小径とは、平行な２直線で図形をはさんだ時の、２直線間の距離の最小値である。本発明の細胞凝集体の最小径は、例えば２００μｍ～６００μｍ、好ましくは３００μｍ～６００μｍ、更に好ましくは４００μｍ～６００μｍである。

周囲長とは、図形の周囲の長さであり、すなわち、細胞凝集体を平面に投影した場合に形成される図形の周囲の長さを意味する。本発明の細胞凝集体の周囲長さは、例えば８００μｍ～２７００μｍ、好ましくは１６００μｍ～２７００μｍである。

フェレ径（垂直フェレ径又は水平フェレ径）とは、図形に外接する四角形の垂直方向又はまたは水平方向の長さである。すなわち、フェレ径とは、細胞凝集体を平面に投影した場合に形成される図形が外接する四角形を想定した場合の、当該四角形のそれぞれの辺の長さを意味する。本発明の細胞凝集体の垂直フェレ径又は水平フェレ径は、例えば２００μｍ～８００μｍ、好ましくは３００μｍ～６００μｍ、更に好ましくは４００μｍ～８００μｍである。

最大径とは、図形の内周上の任意の２点間距離が最大となる長さである。すなわち、最大径とは、細胞凝集体を平面に投影した場合に形成される図形の内周の任意の２点間距離のうち最大のものの長さを意味する。本発明の細胞凝集体の最大径は、例えば２００μｍ～９００μｍ、好ましくは３００μｍ～６００μｍ、更に好ましくは４００μｍ～９００μｍである。

面積とは、２次元で計算した図形の面積であり、すなわち、細胞凝集体を平面に投影した場合に形成される図形の面積を意味する。本発明の細胞凝集体の面積は、例えば４６０００μｍ^２～２７８０００μｍ^２、好ましくは１６５０００μｍ^２～２７８０００μｍ^２である。

上述の各指標は、細胞凝集体を平面に投影する場合の方向によって複数の値を有するが、便宜的に、任意の方向で測定した値を採用すればよい。各指標のうち、フェレ径比、包絡度及び円形度は、細胞凝集体が真の球体に近い、すなわち平面に投影した場合の図形が真円に近いほど、均一な値を示す。

ＩＩＩ．接着性細胞集団の混合物の製造方法
本発明の一態様として、以下の工程を含む、神経系細胞を含む接着性細胞集団の混合物の製造方法が挙げられる：
（１）複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を１以上含む複数の細胞を得る工程；
（２）工程（１）で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、液体媒体の連続的な流れの中に、工程（１）で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び、第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程；並びに
（３）工程（２）で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程であって、
接着性細胞集団の混合物は、以下の（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の５０％以上含む工程を備える、方法：
（ｂ１）第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、
（ｂ２）１０００個以上の細胞を含むこと。

〔工程（１）〕
工程（１）は複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を１以上含む複数の細胞を得る工程である。本明細書において、第一分化段階にある神経前駆細胞とは、幹細胞、好ましくは多能性幹細胞から第二分化段階にある神経系細胞へと分化誘導する際の、中間体に相当する神経前駆細胞であれば特に限定はないが、例えば、神経細胞へ分化可能である神経前駆細胞が挙げられる。

神経前駆細胞として、具体的には、中脳底板（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ）へ運命づけられた神経前駆細胞等が挙げられる。中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞として、Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞が挙げられる。当該細胞は、当業者に周知の方法で製造することができる。

幹細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を得るための分化誘導方法は、適宜、神経前駆細胞の種類に合わせて、当業者に公知の方法を用いればよい。すなわち、当業者に周知の第一分化誘導因子の存在下に適切な培地で培養すればよい。ここで第一分化誘導因子は、細胞の分化状態（分化に関連する転写因子や遺伝子、タンパク質の発現）に影響を与える因子を意味し、低分子化合物、タンパク質、タンパク質のペプチド断片、及び、炭酸ガス、酸素分圧もしくは圧力などの物理的因子が挙げられる。具体的には、ＳＭＡＤ阻害剤（ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤）、ＳＨＨシグナル刺激剤、ＧＳＫ３β阻害剤や神経栄養因子を用いる方法等が知られている。

例えば、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞の場合、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ， ｖｏｌ．２ ３３７－３５０， ２０１４に記載の公知の方法が挙げられる。

本明細書において、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞として、具体的には、Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞が挙げられる。Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞とは、Ｃｏｒｉｎタンパク質及び／又はＬｒｔｍ１タンパク質が、抗Ｃｏｒｉｎ抗体又は抗Ｌｒｔｍ１抗体により認識できる量発現している細胞である。

第一分化段階にある神経前駆細胞がＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞を含む神経前駆細胞である場合を例に挙げて、幹細胞の分化誘導方法について具体的に説明する。

多能性幹細胞からＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞への分化誘導は、第一の分化誘導因子を含む培地を用いて行うことができる。第一の分化誘導因子としては、例えば上述の、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＳＨＨシグナル刺激剤、ＦＧＦ８及びＧＳＫ３β阻害剤を例示することができる。多能性幹細胞からＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞への分化誘導は、次の多段階の工程によって行われることが望ましい；
（１ａ）多能性幹細胞を細胞外基質（細胞外マトリクスともいう）上でＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地中で接着培養する工程、
（１ｂ）上記工程（１ａ）で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＳＨＨシグナル刺激剤及びＦＧＦ８を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（１ｃ）上記工程（１ｂ）で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＳＨＨシグナル刺激剤、ＦＧＦ８及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（１ｄ）上記工程（１ｃ）で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程。

ここで用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＧＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＧＭＥＭ培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（血清代替物）、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい培地は、ＫＳＲ、２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸及びピルビン酸を含有するＧＭＥＭ培地である。この培地へ適宜ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＳＨＨシグナル刺激剤、ＦＧＦ８及びＧＳＫ３β阻害剤から成る群より選択される試薬を加えて培養することができる。
尚、培地の組成は、培養の途中で、適宜調整又は変更してもよい。

細胞外基質上にて接着培養するとは、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。

通常は、上記工程（１ａ）はＲＯＣＫ阻害剤を含む更に培地で行われる。すなわち、工程（１ａ）は、「多能性幹細胞を細胞外基質上でＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地中で接着培養する工程」であってもよい。

培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２～５％である。

培養期間は、Ｃｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞が出現する期間であれば、特に限定されないが、上記工程（１）の終了後に得られる細胞集団中に含まれるＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１陽性の細胞の割合が、１０％以上となる期間培養を行うことが好ましく、少なくとも１０日間、より好ましくは、１２日間から１６日間行うことが望ましい。

複数の多能性幹細胞としては、細胞同士が解離されたものを用いてもよい。細胞同士を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（商標）及びアキュマックス（Ａｃｃｕｍａｘ）（商標）など）又はコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、トリプシンはその代替物（ＴｒｙｐＬＥ ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が例示される）を用いてヒト多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。細胞を解離させた場合、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜、解離後に添加して培養することが望ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、少なくとも１日間添加して培養すればよく、より好ましくは１日間である。

尚、一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトｉＰＳ細胞）は、上記工程（１）の前に、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦ及びＳＨＨシグナル刺激剤を含有する無血清培地中で、接着培養してもよい。当該接着培養は、好ましくは、ラミニン５１１、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくは、フィーダーフリー培地としてＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ－Ｅ８培地、又はＳｔｅｍＦｉｔ培地、更に好ましくはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８又はＳｔｅｍＦｉｔ培地を用いて実施される（ＷＯ２０１７／１８３７３６）。

〔工程（２）〕
工程（２）は、液体媒体の連続的な流れの中に、工程（１）で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む。

本発明において、工程（１）で得られた複数の細胞より、第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離するためには、当該神経前駆細胞を、特定の指標に基づき識別する。ここで用いる指標には特に限定はなく、当業者に周知の指標を適宜用いることができる。すなわち、第一分化段階にある神経前駆細胞に特異的に発現するマーカー遺伝子・タンパク質、細胞大きさ、細胞の密度等が挙げられる。

当該神経前駆細胞に特異的に発現するマーカーを指標とする場合には、これに特異的に結合する物質及び細胞分離装置（セルソーター）を用いてマーカー陽性細胞を分離すればよい。

マーカーとしては、目的とする第一分化段階にある神経前駆細胞の表面に発現しているタンパク質を用いることができる。当該マーカーに特異的に結合する物質としては、抗体、アプタマーを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片を用いることができる。

上記抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体は、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２－１１．１３）。具体的には、抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌または哺乳類細胞株等で発現し精製したマーカーのタンパク質、マーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドあるいは糖脂質を精製して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、上述の免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４－１１．１１）。抗体の抗原結合断片としては、抗体の一部（たとえばＦａｂ断片）または合成抗体断片（たとえば、一本鎖Ｆｖ断片「ＳｃＦｖ」）が例示される。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）_２断片などの抗体の断片もまた、遺伝子工学的に周知の方法によって作製することができる。

マーカーを発現する細胞を認識または分離することを目的として、当該結合する物質は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンまたはストレプトアビジン等の検出可能な物質またはプロテインＡ、プロテインＧ、ビーズまたは磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合または接合されていてもよい。

当該結合する物質はまた、間接的に標識してもよい。当業者に公知の様々な方法を使用して行い得るが、例えば、当該抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。

本明細書において、マーカーに特異的に結合するアプタマーは、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法：Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ， Ａ．Ｄ． ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｊ．Ｗ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８－８２２．， Ｔｕｅｒｋ， Ｃ． ＆ Ｇｏｌｄ， Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９， ５０５－５１０） 。

第一分化段階にある神経前駆細胞が、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞である場合、マーカーとしてはＣｏｒｉｎ及び／又はＬｒｔｍ１を用いることができる。ヒトＣｏｒｉｎは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００６５８７によりその配列を得ることができる。同様に、ヒトＬｒｔｍ１は、ＮＭ＿０２０６７８によりその配列を得ることができる。例えば、Ｃｏｒｉｎに対する抗体はＷＯ２００４／０６５５９９、ＷＯ２００６／００９２４１に記載の作製法により、Ｌｒｔｍ１に対する抗体はＷＯ２０１３／０１５４５７に記載の作製法により得ることができる。

工程（２）において用いられる細胞分離装置は、液体媒体の連続的な流れの中に、工程（１）で得られた複数の細胞を浮遊させ、第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離する機構を含む。

本明細書において、前記細胞分離装置（セルソーターともいう）は、マーカー等第一分化段階にある神経前駆細胞に特徴的な指標を検出するための装置及び液滴を形成せず連続的な送液が可能な液体流路を具備した装置である。当該細胞分離装置を使用することにより、液滴を形成しない連続的な溶液系内で細胞を分離することができる。

本明細書における細胞分離装置は、好ましくは完全閉鎖系である。当該細胞分離装置として、具体的には、Ｈｕｌｓｐａｓ Ｒら著、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． ２０１４ Ｏｃｔ；１６（１０）：１３８４－９（Ｈｕｌｓｐａｓ文献）に記載されたマイクロ流路方式セルソーターを挙げることができる。当文献の細胞分離装置は完全閉鎖系のマイクロ流路方式であり、液滴を形成せずに細胞を分離することができる。また、当該細胞分離装置としては、高速（例えば、５０００粒子／秒程度以上、一回の施行総量で１０００万細胞以上を処理）で細胞を分離することができる装置が好ましい。

具体的には、Ｃｙｔｏｎｏｍｅ社Ｇｉｇａｓｏｒｔセルソーターを利用することができる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25065635（Ｈｕｌｓｐａｓ文献）、及びhttp://www.cytonome.com/を参照）。当該セルソーターは完全閉鎖系のマイクロ流路方式であり、マーカー等の検出装置通過後の分離対象細胞の流路を空気圧で曲げることにより、液滴を形成しない連続的な溶液系内で細胞を分離することができる。

〔工程（３）〕
工程（３）は、工程（２）で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程である。該接着性細胞集団の混合物は、以下の（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の５０％以上含む：
（ｂ１）第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、
（ｂ２）１０００個以上の細胞を含むこと。

本明細書において、第二分化段階にある神経系細胞とは、工程（２）の選別を行った後、さらに培養を継続して分化段階が進んだ細胞であって、特定の神経系細胞へ分化することが運命づけられた前駆細胞を含む。ここで第二分化段階にある神経系細胞は、第一分化段階にある神経前駆細胞よりも分化が進んだ状態であれば特に限定はなく、分化の進み具合は、目的とする神経系細胞に依存する。

第二分化段階にある神経系細胞として、ＴＵＪ１、ＯＴＸ２、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、Ｅｎ１、Ｎｕｒｒ１、ＰＩＴＸ３、ＤＡＴ、ＧＩＲＫ２及びＴＨの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、更に好ましくは少なくとも３個が陽性の神経細胞が挙げられる。第二分化段階にある神経系細胞の一態様として、ＦＯＸＡ２陽性及び／又はＴＵＪ１陽性の細胞が挙げられる。

好ましくは、第二分化段階にある神経系細胞として、中脳腹側由来神経細胞、具体的には、ドーパミン産生神経前駆細胞もしくはドーパミン産生神経細胞が挙げられる。第二分化段階にある神経系細胞として、好ましくは、ＦＯＸＡ２陽性かつＴＵＪ１陽性のドーパミン産生神経前駆細胞が挙げられる。

工程（２）で得られる細胞から第二分化段階にある神経系細胞を得るための分化誘導方法は、目的とする神経系細胞の種類に応じて、適宜当業者に公知の方法を用いればよい。すなわち、当業者に周知の第二分化誘導因子の存在下に適切な培地で培養すればよい。ここで第二分化誘導因子としては、細胞の分化状態（分化に関連する転写因子や遺伝子、タンパク質の発現）に影響を与える因子を意味し、低分子化合物、タンパク質、タンパク質のペプチド断片、及び、炭酸ガス、酸素分圧もしくは圧力などの物理的因子が挙げられる。例えば、ドーパミン産生神経前駆細胞の場合、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ， ｖｏｌ．２ ３３７－３５０， ２０１４に記載の公知の方法が挙げられる。

第二分化段階の神経系細胞がドーパミン産生神経前駆細胞を含む神経細胞である場合を例に挙げて、分化誘導方法について具体的に説明する。
ここで用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＧＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ；現ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、核酸（例えば、Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ））などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい培地は、Ｂ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、アスコルビン酸及びｄｂｃＡＭＰを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍである。この培地へ適宜神経栄養因子を加えて培養することができる。

分化誘導は浮遊培養で行うことができ、ここで浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７等）又はリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。

培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２～５％である。

培養期間は、Ｆｏｘａ２陽性細胞が出現する期間であれば、特に限定されないが、培養は、少なくとも７日間行われることが望ましい。より好ましくは、７日間から３０日間であり、さらに好ましくは、１４日間から２１日間、又は１４日間から２０日間、又は１４日間から１８日間、又は１４日間から１６日間であり、最も好ましくは、１６日間である。

培養は、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜添加して培養することが望ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、少なくとも１日間添加して培養すればよく、より好ましくは１日間である。

ＩＶ．接着性細胞集団及びその混合物
接着性細胞集団の混合物の製造方法により、以下の（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の５０％以上含む接着性細胞集団の混合物を製造することができる：
（ｂ１）第二分化段階にある神経系細胞を含み、
（ｂ２）１０００個以上の細胞を含む。
また、上記接着性細胞集団の混合物の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物から、上記（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を分離する工程を備える接着性細胞集団の製造方法によって、上記（ｂ１）及び（ｂ２）の特徴を有する接着性細胞集団を得ることができる。

接着性細胞集団の混合物が、三次元の接着性細胞集団の混合物（すなわち細胞凝集体の混合物）であってもよく、二次元の単層もしくは重層の接着性細胞集団の混合物（すなわち細胞シートであってもよい。三次元の接着性細胞集団においては、円相当径が１００μｍ～２０００μｍ、好ましくは１００μｍ～１０００μｍ、更に好ましくは、２００μｍ～６００μｍ、更に好ましくは、３００μｍ～６００μｍである。
該接着性細胞集団又はその混合物は、培養時に細胞死が抑制され得る。当該接着性細胞集団を１４－２０日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の５％以上、好ましくは８％以上、更に好ましくは１０％以上、更に好ましくは１５％以上、更に好ましくは６０％以上、更に好ましくは約１００％である。

尚、培養による細胞数の変動は、細胞の種類に依存し、第二分化段階における神経系細胞がドーパミン産生神経前駆細胞である場合、通常約８０％以上の細胞が死滅することが知られている。しかし、本発明の製造方法を用いることにより、第二分化段階において１４－２０日間培養した場合に培養終了時における細胞数は、第二分化段階の培養開始時における細胞数の５％以上、好ましくは８％以上、更に好ましくは１０％以上、更に好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、具体的には例えば１５％～８０％、又は１５％～５０％である。

一方、第二分化段階における神経系細胞が神経幹細胞である場合、通常一旦細胞数が減ってもその後細胞数は回復することが知られている。そのような神経系細胞の場合には、第二分化段階において１４－２０日間培養した場合に培養終了時における細胞数は、第二分化段階の培養開始時における細胞数の８０％以上、又は約１００％である。

三次元の接着性細胞集団の一態様として、細胞凝集体を挙げることができ、当該細胞凝集体は、好ましくは更に以下の特徴を有する：
（ｂ３）包絡度が０．５以上、好ましくは０．７～１．０、更に好ましくは、０．８～１．０であること、
（ｂ４）フェレ径比が０．５以上、好ましくは０．６～１．０、更に好ましくは、０．７～１．０であること、及び
（ｂ５）円形度が０．３以上、好ましくは０．５～１．０、更に好ましくは０．７～１．０であること。

好ましい一態様として、以下の特徴を有する細胞凝集体が挙げられる：
・円相当径が１００μｍ～１０００μｍであり、
・包絡度が０．８～１．０であり、
・フェレ径比が０．７～１．０であり、
・円形度が０．７～１．０である。

当該細胞凝集体は、更に好ましくは、以下の特徴を有する：
得られる細胞凝集体の混合物において、円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選ばれる指標のうち、１以上の指標において変動係数が１５％以下である。

上記製造方法において、原料となる幹細胞としては、神経系細胞へ分化可能な幹細胞であれば特に限定はないが、好ましくは、多能性幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、Ｍｕｓｅ細胞等が挙げられる。

幹細胞として、更に好ましくは多能性幹細胞が挙げられ、更により好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。

上記本発明の製造方法により得られる接着性細胞集団もまた、本発明の概念である。

更に、上記製造方法における工程（２）で得られる神経前駆細胞は、第二分化誘導因子の存在下に培養することにより、本発明の細胞凝集体や接着性細胞集団へ分化誘導可能な非接着性細胞集団、すなわち孤立した細胞の混合物である。当該細胞の混合物もまた本発明の範疇である。

具体的には、ＣｏｒｉｎもしくはＬｒｔｍ１陽性の細胞を約７０％以上含み、第二分化誘導因子の存在下に培養することにより、本発明の細胞凝集体や接着性細胞集団へ分化誘導可能な細胞の混合物が挙げられる。

当該細胞の混合物を浮遊培養に付すことにより上記本発明の第二分化段階における神経系細胞の細胞凝集体を得ることができる。また、当該細胞の混合物を接着培養に付すことにより、単層の細胞シートを製造することができ、当該細胞シートもまた本発明の範疇である。

Ｖ．医薬組成物
本発明の細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団は、神経細胞もしくは神経細胞に分化し得る神経系細胞の移植を必要とする疾患に罹患した患者のための、移植用医薬組成物として有用であり、神経細胞の変性、損傷もしくは機能障害を伴う疾患の治療薬等の医薬として使用することができる。すなわち、本発明の細胞凝集体もしくは接着性細胞集団、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。

神経細胞の移植を必要とする疾患、又は神経細胞の損傷もしくは機能障害を伴う疾患としては、例えば、脊髄損傷、運動神経疾患、多発性硬化症、筋委縮性側軸硬化症委縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏症病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、アルツハイマー病、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、パーキンソン症候群が挙げられ、好ましくはパーキンソン病が挙げられる。

本発明の一態様として、本発明のドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団を含むパーキンソン病治療薬が挙げられる。当該パーキンソン病治療剤に含まれるドーパミン産生神経前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されないが、例えば、１回の移植あたり１．０×１０^４個以上含まれ得る。また、症状や体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。ドーパミン産生神経前駆細胞の疾患部位への移植は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）もしくはＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ；３４４：７１０－９（２００１）に記載されるような手法によって行うことができる。

医薬として許容される担体としては、細胞の生存を維持するために用いられる物質であれば特に限定はなく当業者に周知の物質を用いることができる。具体的には、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清、培地等）を用いることができる。必要に応じて、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

本発明の医薬組成物は、本発明に係る細胞凝集体もしくはその混合物、又は接着性細胞集団を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、洗浄し、移植に用いてもよい。

ＶＩ．治療方法
本発明の一態様として、本発明の細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団を、神経系細胞の移植を必要とする疾患に罹患した患者に移植する工程を含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療方法が挙げられる。

本発明の一態様として、本発明で得られるドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団は、製剤、具体的には移植用製剤としてパーキンソン病患者に投与することができる。得られたドーパミン産生神経前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者のドーパミン神経が不足している領域、例えば線条体に移植することによって行われる。

ＶＩＩ．移植
移植に際して、本発明の細胞凝集体を該細胞凝集体の生存能力を維持するために必要な媒体において保存してもよい。「生存能力を維持するために必要な媒体」としては、培地、生理学的緩衝溶液等が挙げられるが、ドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞集団が生存する限りにおいて特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、ＧＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。

ここで、本明細書における「生着」とは、移植された細胞が生体内に長期間（例：３０日以上、６０日以上、９０日以上）生存し、臓器内に接着して留まることを意味する。
本明細書における「機能的生着」とは、移植された細胞が生着し、生体内で本来の機能を果たしている状態を意味する。

本明細書における「機能的生着率」とは、移植した細胞のうち、機能的生着を果たした細胞の割合を意味する。移植されたドーパミン産生神経前駆細胞の機能的生着率は、例えば移植片中のＴＨ陽性細胞数の計測により求めることができる。

上記細胞凝集体を移植することによって、移植された細胞（ドーパミン産生神経前駆細胞及び移植後に誘導されるドーパミン産生神経前駆細胞を含む）の機能的生着率は０．１％以上、好ましくは０．２％以上、さらに好ましくは０．４％以上、さらに好ましくは０．５％以上、さらに好ましくは０．６％以上である。

本明細書において移植の対象となる哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル等が挙げられ、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）が、より好ましくはヒトが挙げられる。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

（試験１）
＜細胞及び培養＞
ヒトｉＰＳ細胞をドーパミン産生神経前駆細胞へ分化誘導するためのプロトコールを図１に示す。分化誘導開始まで拡大培養（ｄａｙ －７～０）、分化誘導開始から１２日目まで（ｄａｙ ０～１２）の第一分化段階、及び、分化誘導開始後１２日目～２８日間（ｄａｙ １２～２８）第二分化段階における培養条件は、それぞれ図１に示されている。なお、ソーティングは分化誘導開始後１２日目（ｄａｙ１２）に行われた。

ヒトｉＰＳ細胞であるＱＨＪ－Ｉ０１は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びｐ５３のドミナントネガティブ体（Ｏｋｉｔａ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，４５８－６６，２０１３）をヒトＰＢＭＣにエピソーマルベクターにより導入して得られた細胞として、京都大学の山中教授らより受領した。
このｉＰＳ細胞を、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．３：１２３６，２０１２の記載に準拠した方法で培養した。すなわち簡潔には、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８でコーティングされた６ウェルプレート上にてＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を含む未分化維持培地（ＡＫ０３Ｎ）により、ｉＰＳ細胞を維持培養した。

ｉＰＳ細胞を維持培養して得られた細胞集団を、ＴｒｙｐＬＥ ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解離し、別途用意したＬａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、Ｎｉｐｐｉ）でコーティングした６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０^６個播種し、培地を分化培地に交換した（分化誘導開始：ｄａｙ０）。分化培地としては、基本培地Ａに、１０μＭ Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ）、０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）及び０．５μＭ Ａ８３－０１（ＷＡＫＯ）を添加して使用した。尚、基本培地Ａは、８％ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を含有するＧＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。翌日（ｄａｙ１）、０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９、０．５μＭ Ａ８３－０１、２μＭパルモルファミン（ＷＡＫＯ）及び１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８（ＷＡＫＯ）を含有する基本培地Ａへ培地を交換した。２日後（ｄａｙ３）、０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９、０．５μＭ Ａ８３－０１、２μＭパルモルファミン、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８及び３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＷＡＫＯ）を含有する基本培地Ａへ培地を交換した。４日後（ｄａｙ７）、０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９及び３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有する基本培地Ａへ培地を交換した。これらの期間、培地交換は１日に一度行った。分化誘導開始後１２日目（ｄａｙ１２）に、抗Ｃｏｒｉｎ抗体を用いたセルソーティングを実施した。

＜ソーティング前処理＞
０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９及び３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有する基本培地Ａでの培養から５日後、すなわち分化誘導開始後１２日目（ｄａｙ１２）、ＴｒｙｐＬＥ ＣＴＳを用いて細胞を解離し、２％ＦＢＳ、３０μＭ Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ）、２０ｍＭ Ｄグルコース及び５０μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン）を含有するＣａ２＋Ｍｇ２＋－ｆｒｅｅ ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ懸濁させた。上記の抗Ｃｏｒｉｎ抗体を添加し、４℃で２０分間インキュベートし、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行い、Ｃｏｒｉｎ陽性細胞を回収し、種々の解析を実施した。
尚、抗Ｃｏｒｉｎ抗体は以下の方法で作製した。カニクイザルＣｏｒｉｎ遺伝子のうち、細胞外領域の一部（７９－４５３アミノ酸）をコードする遺伝子配列を２９３Ｅ細胞に導入して、Ｃｏｒｉｎタンパク質の細胞外領域断片を発現させて回収した。回収したタンパク質をマウスに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞とフュージョンさせた。フュージョンさせた細胞集団より、Ｃｏｒｉｎに反応性を持つクローンを選択した。このクローンの培養上清を抗Ｃｏｒｉｎモノクローナル抗体として蛍光ラベルを施した後に用いた。
＜ソーティング＞
ＦＡＣＳのためのセルソーターとして、Ｓｔｒｅａｍ－Ｉｎ－Ａｉｒ方式の機種であるＢＤ社のＦＡＣＳＪａｚｚ（商標）、又はマイクロ流路方式の機種であるＣｙｔｏｎｏｍｅ社のＧｉｇａｓｏｒｔを用いた。Ｃｏｒｉｎ陽性細胞を回収し、種々の解析を実施した。
ＦＡＣＳＪａｚｚ（商標）の場合、ソーティング条件は、一般に神経細胞のセルソーティングに用いられるノズル径１００μｍ、シース圧力は２９ ＰＳＩである。また、Ｇｉｇａｓｏｒｔの場合、ソーティング条件はメーカー標準の流路内径約２００μｍ、シース圧力は１４－２０ＰＳＩである。

＜ソーティング後の浮遊培養＞
回収したＣｏｒｉｎ陽性細胞をＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｕプレート（住友ベークライト）に２００００個／ウェルにて移し、基本培地Ｂ（Ｂ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（ＷＡＫＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（ＷＡＫＯ）、２００ｍＭ Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（ＷＡＫＯ）及び０．４ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて浮遊培養した。この時、最初の培地としては、３０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地を用いたが、３日に一度、半量ずつ培地を交換した際には、Ｙ－２７６３２を添加しない培地を用いた。ソーティングから１６日後（分化誘導終了：ｄａｙ２８）まで浮遊培養を実施してドーパミン産生神経前駆細胞を分化誘導した。この期間に、顕微鏡を用いて培養４日毎に浮遊培養細胞凝集体の撮影を行った観察像を図２に示す。

Ｊａｚｚを用いて選別した群の細胞凝集体においては、分化誘導開始後１６日目から２８日目（ｄａｙ １６～ｄａｙ ２８）まで浮遊培養細胞凝集体の大きさに変化が見られなかった。対照的に、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体においては、分化誘導開始後２０日目（ｄａｙ ２０）付近から細胞凝集体の径が大きくなることが分かった。また、ｄａｙ １６、ｄａｙ ２０、ｄａｙ ２４、及びｄａｙ ２８の全てにおいてＪａｚｚを用いた細胞凝集体はＧｉｇａｓｏｒｔを用いた細胞凝集体よりも死細胞、デブリ、サテライトの細胞集団が多かった。例えば、Ｊａｚｚを用いた場合における「ｄａｙ １６」左から３番目の凝集体では、細胞凝集体以外に小さな黒い粒（すなわちサテライトの細胞集団）や、細胞凝集体を囲むようなデブリが観察された。それに対して、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いた場合には、デブリ及びサテライトの細胞集団は有意に少ない。Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体を観察すると、細胞凝集体の境界線が明瞭であり、Ｊａｚｚを用いて選別した細胞凝集体の周囲に見られるデブリ層や、サテライト状に存在する微細な細胞集団の形成が見られず、細胞凝集体の周囲に存在する死細胞や死細胞の細胞集団が少ないことが分かった。さらに、Ｇｉｇａｓｏｒｔ由来のｄａｙ ２４以降の細胞凝集体は直径が約４５０μｍ～約６００μｍであり、Ｊａｚｚ由来の細胞凝集体（外縁が不明瞭でありデブリ部分を除いた細胞凝集体の直径は約３５０μｍ～約４００μｍ）に比べて大きかった。

＜細胞数計測＞
Ｄａｙ２８にて表１に記載の数の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて９６ウェルＵ底プレートから培地ごと回収し、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清培地を除去し、ＰＢＳ １ｍＬを添加して、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清を除去し、神経細胞分散キットの酵素液１ｍＬを添加して３７℃水浴でインキュベートした。１０分おきにピペッティングし、インキュベート開始から３０分経過した時点で細胞懸濁液を１０μＬ採取し、トリパンブルー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μＬと混合して血球計算盤に注入した。顕微鏡下で細胞数を計測した。その結果を表１の「酵素液中」の欄に示す。また、トリパンブルー非陽性細胞数／全細胞数を算出し、細胞の生存率とした。次に、神経細胞分散キットの分散液、除去液を加えて遠心した。上清除去した後、ＰＢＳ １ｍＬで再懸濁し、１０μＬをトリパンブルー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μＬと混合して血球計算盤に注入した。顕微鏡下で細胞数を計測した。その結果を表１の「洗浄後［血球計算盤］」の欄に示す。また再懸濁したサンプルを自動セルカウンター（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，ＮＣ－２００）により測定した。その結果を表１の「洗浄後［ＮＣ－２００］」の欄に示す。

表１に示されるように、何れの測定法においても、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体は、１細胞凝集体あたりの細胞数が、Ｊａｚｚを用いて選別した群の細胞凝集体の約３倍だったことが分かった。尚、細胞数計測時の生存率は全て１００パーセントであった。

＜細胞形態計測＞
Ｄａｙ２８にて４８個の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて９６ウェルＵ底プレートから培地ごと回収し、６ｃｍ低接着ディッシュ（住友ベークライト）に移した。デジタルマイクロスコープ（キーエンス；ＶＨＸ－５０００）を用いて透過照明により細胞凝集体を撮影し、図３の画像を得た。視野内にＧｉｇａｓｏｒｔにより選別された細胞の細胞凝集体は４７個（Ｂ）、Ｊａｚｚにより選別された細胞の細胞凝集体は４８個（Ａ）であった。

デジタルマイクロスコープに内蔵のＶＨＸ－５０００（Ｖｅｒ１．３．２．４）ソフトウェアにより取得した画像の解析を行い、細胞凝集体の円形度、最小径、周囲長、フェレ径（水平）、フェレ径（垂直）、フェレ径比、包絡度（面積）、最大径、包絡度（周囲長）、面積、及び円相当径を測定した（図４）。そのうち、円相当径、包絡度、面積、フェレ径比、円形度について、Ｊａｚｚ（薄灰色）とＧｉｇａｓｏｒｔ（濃灰色）で比較したグラフを図４示す。また、取得したデータより標準偏差及び変動係数（ＣＶ値）を計算した。ＣＶ値は図５に示す。

図３に示されるように、Ｊａｚｚを用いて選別した群の細胞凝集体に比べ、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体は、視覚的にも大きいことが分かった。また、図４に示されるように、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体は、Ｊａｚｚを用いて選別した群の細胞凝集体に比べ、円相当径及び面積が大きく、球形の周囲の滑らかさの指標である、欠けや突起を示す包絡度のばらつきが著しく小さかった。

これらの結果より、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて細胞を選別することで、より多くの細胞をダメージ少なく生存させることが可能で、それらの細胞から形成される細胞凝集体はより大きくかつ真球に近く、またなめらかな球形であることが示された。

また、測定した各パラメーターの変動係数（ＣＶ値）を算出したところ、図５に示されるように、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体の方がＪａｚｚを用いて選別した群の細胞凝集体と比較して、大きさ（最小径、周囲長、フェレ径、フェレ径比、最大径、面積、及び円相当径）、球形状（円形度）、表面の状態（包絡度）などすべてのパラメーターにおいてＣＶ値が小さかった。すなわち、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別した群の細胞凝集体は均一性が高いことが分かった。

＜フローサイトメトリー解析＞
Ｄａｙ２８にて細胞数計測用に酵素液添加後に分散した細胞に、分散液及び除去液を加えて遠心した。上清を除去し、ＰＢＳで再懸濁し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｆｏｘａ２（Ｒ＆Ｄ）／Ａｌｅｘａ６４７－ａｎｔｉ－ｇｏａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｌｅｘａ４８８－Ｔｕｊ１（ＢＤ）、Ａｌｅｘａ６４７－Ｏｃｔ３／４（ＢＤ）、ＦＩＴＣ－ＴＲＡ２－４９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－Ｓｏｘ１（ＢＤ）、Ａｌｅｘａ６４７－Ｐａｘ６（ＢＤ）、Ａｌｅｘａ４８８－Ｋｉ６７（ＢＤ）で染色した。フローサイトメーターＧａｌｌｉｏｓ（ベックマンコールター）を用いて、細胞懸濁液に含まれる全細胞に対する、ＦＯＸＡ２陽性かつＴＵＪ１陽性の細胞、ＦＯＸＡ２陽性細胞、又はＴＵＪ１陽性細胞の割合を算出した（表２）。Ｊａｚｚ及びＧｉｇａｓｏｒｔのいずれを用いた場合でも、ＦＯＸＡ２及び／又はＴＵＪ１マーカーの陽性率が高く、また、多能性マーカーであるＯＣＴ３／４及び／又はＴＲＡ－２－４９の陽性率が低かった。

表２より、Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別後成熟培養した細胞において、Ｊａｚｚを用いた細胞群と比較しても、発現遺伝子の陽性率が同程度であることが分かった。

＜免疫染色＞
Ｄａｙ２８にて１０個の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて９６ウェルＵ底プレートから培地ごと回収し、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清培地を除去し、ＰＢＳ １ｍＬを添加して自重で沈殿するのを待った。上清を除去した後、ＰＦＡにて細胞凝集体を固定し、ＯＣＴコンパウンドで包埋及び凍結した。次いで、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて細胞凝集体を１０μｍに薄切し、切片をスライドガラスに張り付けた。ブロッキングバッファー（２％正常ロバ血清、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／ＰＢＳ）によりブロッキングを行い、抗Ｎｕｒｒ１マウスＩｇＧ抗体（ペルセウスプロテオミクス）、抗Ｆｏｘａ２ヤギＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び抗ＴＨウサギＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で一次染色、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ５９４標識抗ヤギ抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ウサギ抗体、及びＤＡＰＩ（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で二次染色を行った。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｈａｒｄ ｓｅｔで染色後の切片を封入し、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１２００）で観察した（図６）。

Ｇｉｇａｓｏｒｔを用いて選別後成熟培養した細胞において、Ｊａｚｚを用いた細胞群と比較しても、マーカーの発現量に大きな差がないことが分かった。すなわち、分化度は同等であった。

本発明は、再生医療、特にパーキンソン病の治療に有用である。

Claims (1)

1. ＦＯＸＡ２陽性又はＴＵＪ１陽性の神経系細胞を含み、
   １０００個以上の細胞を含む、細胞凝集体。