WO2012102260A1 - 核酸分子の多型識別方法 - Google Patents

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probe
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秀孝 中田
和孝 西川
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オリンパス株式会社
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses a genetic polymorphism such as a somatic mutation or a single nucleotide polymorphism. And a method for identifying nucleic acids having similar base sequences.
  • nucleic acid identification methods using a FRET probe for example, the 5 ′ end side and the 3 ′ end side have complementary base sequences, and both ends are labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, respectively.
  • molecular beacon method using a single-stranded nucleic acid molecular beacon probe
  • both ends associate to form an intramolecular loop, which is in a quenching state, but the intramolecular loop is resolved by hybridizing with the target nucleic acid molecule. And emits fluorescence.
  • a genetic polymorphism can be identified by using a molecular beacon that specifically hybridizes with a specific genotype of the genetic polymorphism (see Non-Patent Document 2, for example).
  • Non-Patent Document 3 there is a method for detecting a nucleic acid using FRET using a fluorescent intercalator and a fluorescent probe.
  • a fluorescent probe labeled with a fluorescent substance is hybridized with another single-stranded nucleic acid
  • a fluorescent intercalator enters between the base pairs of the formed double-stranded nucleic acid.
  • FRET that occurs between this fluorescent intercalator and a fluorescent substance that labels the fluorescent probe, it is possible to distinguish between a fluorescent probe that exists alone and a fluorescent probe that forms a double-stranded nucleic acid. it can.
  • a probe that specifically hybridizes with a specific genotype among genetic polymorphisms and a probe that specifically hybridizes with another genotype are labeled with different fluorescent substances, respectively.
  • the gene polymorphism can be identified by detecting FRET occurring between each fluorescent substance and the fluorescent intercalator (see, for example, Non-Patent Document 4).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • a micro area a focal area where a laser beam of a microscope is collected, called a confocal volume
  • Information such as the speed or magnitude of movement, concentration, etc.
  • Fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution FIDA: see, for example, Patent Document 3
  • photon counting histogram Photon Counting Histogram: PCH, for example, see Patent Document 4
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume is generated, and by fitting a statistical model equation to the histogram distribution, the average value of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules, etc. And the average number of molecules staying in the confocal volume is calculated.
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique, and the fluorescent fine particles in the flow or on the substrate are measured.
  • a signal processing technique for detecting the presence of the signal has been proposed.
  • the sample required for the measurement has a very low concentration and A small amount is sufficient (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (second measurement is repeated several times in one measurement). .) Therefore, these techniques are particularly useful when analyzing rare or expensive samples that are often used in the field of R & D in medicine and biology, as well as for clinical diagnosis of diseases and screening of bioactive substances. When the number of specimens is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or tests at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. In order for the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time to enter and exit the micro area, it is preferable that there is always approximately one fluorescent molecule in the micro area.
  • the volume of the confocal volume is typically about 1 fL, so that the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than possible for statistical processing (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the statistical value of the fluorescence intensity as described above is used.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of fluorescent molecules to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of generation of a fluorescent signal with a significant intensity.
  • the frequency of the fluorescent signal with a significant intensity and the number of fluorescent molecules or the like in the sample It is disclosed that a correlation can be obtained.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • these methods are also limited to detecting the presence of fluorescent molecules or the like that enter the microregion stochastically by diffusion or random flow.
  • Patent Document 7 is to individually detect the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate, and in a normal state in a sample solution. This is not a technique for detecting molecules or colloidal particles dissolved or dispersed in the sample solution, that is, particles moving randomly in the sample solution, so the concentration of particles dissolved or dispersed in the sample solution or Quantitative calculation of number density has not been achieved.
  • Patent Document 7 since the technique of Patent Document 7 includes a process such as measurement in a flow cytometer or immobilization of fluorescent particles on a substrate, the amount of sample required for inspection is optical analysis such as FCS, FIDA, PCH, etc. Compared to the case of technology, the number is significantly increased, and it is considered that a complicated and high-level operation technique is required for the practitioner.
  • genome samples that are targets for detecting genetic polymorphism are often very small, such as specimens in clinical examinations. For this reason, it is desired to develop a method for identifying a nucleic acid that is contained in a very small amount in a sample.
  • genotype identification is performed by using a nucleic acid probe that specifically recognizes a specific genotype and examining whether or not the genomic DNA to be examined forms an aggregate with the nucleic acid probe. . Even when the concentration of the association between the nucleic acid probe and the genomic DNA in the sample solution is extremely thin, a method capable of detecting the association with high accuracy is very useful for clinical examination.
  • Non-Patent Document 2 a molecular beacon is used at 300 nM, which cannot be said to be a measurement in a sparse state.
  • the base sequence is identified for a relatively high concentration of nucleic acid of about several tens to several hundreds nM.
  • polymorphism has not been identified for a nucleic acid sample having a relatively low concentration on the order of pM.
  • the present invention does not include statistical processing such as that performed in optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc., and therefore the concentration or number density of the particles to be observed is handled in those optical analysis techniques.
  • An object of the present invention is to provide a method for identifying a nucleic acid having a polymorphic sequence such as a gene polymorphism by a novel optical analysis technique capable of detecting the state or characteristics of particles to be observed in a sample solution lower than the level.
  • the present inventors have used a nucleic acid probe that specifically hybridizes with one type of nucleic acid molecule of the polymorphic sequence to form an association with the nucleic acid probe.
  • a nucleic acid probe that specifically hybridizes with one type of nucleic acid molecule of the polymorphic sequence to form an association with the nucleic acid probe.
  • two types of labeled nucleic acid probes having different base sequences are used, and an aggregate containing a nucleic acid probe is detected by a scanning molecule counting method. It was found that the polymorphism can be accurately identified even when the concentration of the nucleic acid molecule to be analyzed in the sample is very low, and the present invention has been completed.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed by the present applicant in Japanese Patent Application No. 2010-044714.
  • the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule of the present invention is the following (1) to (19).
  • (1) (a) a first nucleic acid probe that is labeled with a fluorescent substance and specifically hybridizes with a single-stranded nucleic acid molecule having a base sequence of the first type in the polymorphic sequence; Preparing a sample solution containing a nucleic acid molecule of (B) associating nucleic acid molecules in the sample solution prepared in step (a);
  • C After the step (b), the number of molecules of the aggregate containing the first nucleic acid probe in the sample solution prepared in the step (a) is determined.
  • a step of calculating by (D) preparing a sample solution containing a second nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance and having a base sequence different from that of the first nucleic acid probe, and the nucleic acid molecule to be analyzed; (E) associating nucleic acid molecules in the sample solution prepared in the step (d); (F) After the step (e), the number of molecules of the aggregate containing the second nucleic acid probe in the sample solution prepared in the step (d) is determined.
  • a method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule comprising: (2) The method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to (1), wherein, in the step of moving the position of the light detection region, the position of the light detection region is moved at a predetermined speed.
  • the position of the light detection region is moved at a speed faster than the diffusion movement speed of the aggregate.
  • the nucleic acid molecule polymorphism identification method of (2) In the step of individually detecting optical signals from the individual aggregates from the detected light and detecting the aggregates individually, based on the shape of the detected time-series optical signals.
  • the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of (1) to (3), wherein it is detected that one aggregate has entered the photodetection region.
  • nucleic acid molecule according to any one of (1) to (4), wherein the sample solution contains one or more selected from the group consisting of a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, and urea. Polymorphism identification method.
  • a fluorescent substance that is an energy donor and a substance that is an energy acceptor are combined.
  • the fluorescence emitted from the aggregate containing the nucleic acid probe is the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as the energy donor, and the nucleic acid molecule of any one of (1) to (5) above Type identification method.
  • the sample solution further includes a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance,
  • One of the fluorescent substance labeling the first nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance is a fluorescent substance that serves as an energy donor in a fluorescence energy transfer phenomenon, and the other is the fluorescent energy.
  • the fluorescence emitted from the aggregate containing the first nucleic acid probe is between the fluorescent substance labeled with the first nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance.
  • the sample solution further contains a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance
  • Either one of the fluorescent substance labeling the second nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance is a fluorescent substance that serves as an energy donor in a fluorescence energy transfer phenomenon, and the other is the fluorescent energy. It is a substance that becomes an energy acceptor in the transfer phenomenon
  • the fluorescence emitted from the aggregate containing the second nucleic acid probe is between the fluorescent substance labeled with the second nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance.
  • the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of the above (1) to (7), wherein the method is fluorescence emitted by a fluorescence energy transfer phenomenon occurring in (1).
  • the light emitted from the aggregate containing the first nucleic acid probe and the light emitted from the aggregate containing the second nucleic acid probe have different optical properties from each other (1) )
  • a method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule In the step (a), a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to a base sequence other than the first type in the polymorphic sequence is added to the sample solution.
  • the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of (1) to (9) above.
  • (11) The (1) to (10), wherein the second nucleic acid probe specifically hybridizes with a single-stranded nucleic acid molecule having a second type base sequence in the polymorphic sequence.
  • a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to a base sequence other than the second type in the polymorphic sequence is added to the sample solution.
  • the nucleic acid molecule polymorphism identification method according to (11), (13) The method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of (1) to (12), wherein the steps (a) and (d) are performed in one sample solution.
  • the second nucleic acid probe specifically hybridizes with a single-stranded nucleic acid molecule having a second type base sequence in the polymorphic sequence; Performing the steps (a) and (d) in one sample solution; A nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the first type base sequence and a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the second type base sequence are added to the sample solution.
  • the second nucleic acid probe is specific to a single-stranded nucleic acid molecule containing the base sequence of the first type or a single-stranded nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the single-stranded nucleic acid molecule.
  • Hybridize to The method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of (1) to (10), wherein the steps (a) and (d) are carried out in one sample solution.
  • the step (b) or (e) After denaturing the nucleic acid molecules in the sample solution by setting the temperature of the sample solution prepared in the step (a) or (d) to 70 ° C. or higher, the liquid temperature of the sample solution is set to 0.05 ° C. / The method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to any one of (1) to (15), wherein the method is performed by associating nucleic acid molecules in the sample solution by lowering at a temperature lowering rate of 2 seconds or more.
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe are configured by combining two or more molecules selected from the group consisting of DNA, RNA, and nucleic acid-like substances.
  • the polymorphic sequence is a base sequence including a polymorphic site of a gene polymorphism or a base sequence including a mutation site of somatic mutation.
  • a method for identifying polymorphisms of nucleic acid molecules (19) The method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule according to (18), wherein the somatic mutation is a K-ras gene mutation.
  • the scanning molecule counting method used in the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention does not perform statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity. Therefore, according to the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule of the present invention, a polymorphism is identified even when a nucleic acid molecule having a polymorphic sequence to be analyzed is present in a trace amount in a sample. be able to.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer for a scanning molecule counting method.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic view of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 and moving the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 2A is a schematic diagram illustrating the principle of light detection by an optical analysis technique for the scanning molecule counting method.
  • FIG. 2B is a schematic diagram of a temporal change in light intensity measured by an optical analysis technique for the scanning molecule counting method.
  • FIG. 3A is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region while performing Brownian motion.
  • FIG. 3A is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region while performing Brownian motion.
  • FIG. 3B is a diagram illustrating an example of a temporal change in photon count (light intensity) when the observation target particle crosses the light detection region while performing Brownian motion.
  • FIG. 4A is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle.
  • FIG. 4B shows a photon count (light intensity) time when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle. It is a figure which shows the example of a change.
  • FIG. 4A is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle.
  • FIG. 4B shows a photon count (light intensity) time when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at
  • FIG. 5 is a flowchart showing a processing procedure for counting particles from a temporal change in photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method.
  • FIG. 6A is a diagram schematically showing a temporal change in photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method.
  • FIG. 6B is a diagram for explaining an example of the signal processing step of the detection signal in the processing procedure for counting particles from the time change of the photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method.
  • FIG. 7 shows an actual measurement example (bar graph) of photon count data measured by the scanning molecule counting method, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the peak existence region. Show.
  • FIG. 10A is a diagram showing the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution to which no decoy nucleic acid was added in Reference Example 2.
  • FIG. 10A is a diagram showing the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution to which no decoy nucleic acid was added in Reference Example 2.
  • 10B is a diagram showing the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution to which the decoy nucleic acid was added in Reference Example 2.
  • the vertical axis is the number of molecules of the aggregate containing the mutant (GTT) molecular beacon probe (the number of mutant (GTT) peaks), and the horizontal axis is the molecule of the aggregate including the wild type (GGT) molecular beacon probe. It is the figure which showed the value of the counted peak number for every mutation rate in the nucleic acid molecule of the analysis object added to the sample solution as number (wild type (GGT) peak number).
  • Example 2 the vertical axis represents the number of molecules containing mutant (GTT) molecular beacon probes (mutant type (GTT) peak number), and the horizontal axis represents molecules of aggregates containing wild type (GGT) molecular beacon probes. It is the figure which showed the value of the counted peak number for every mutation rate in the nucleic acid molecule of the analysis object added to the sample solution as number (wild type (GGT) peak number).
  • FIG. 13A shows the number of counted peaks of aggregates containing mutant (GTT) molecule beacon probes for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution in Example 3.
  • FIG. 13B is a diagram showing the number of counted peaks of aggregates including a common molecule beacon probe for each GTT mutation rate in a nucleic acid molecule to be analyzed added to a sample solution in Example 3.
  • the reference example 3 it is the figure which showed the value of the number of peaks counted for every variation
  • Example 4 for each mutation rate of the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution, the value of the counted number of peaks of the aggregate including the mutant (GTT) probe and the aggregate including the wild type (GGT) probe.
  • the scanning molecule counting method will be described.
  • particles that emit light that moves in a sample solution and moves randomly while traversing the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region.
  • the light emitted from the luminescent particles in the micro area is detected, whereby each luminescent particle in the sample solution is individually detected to count the luminescent particles and the concentration of the luminescent particles in the sample solution.
  • the sample necessary for the measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L), and the measurement time is short.
  • the luminescent particle means a particle in which a particle to be observed and a luminescent probe are bonded or associated.
  • a “luminescent probe” is a substance (usually a molecule or an aggregate thereof) that has a property of binding or associating with a particle to be observed and emits light, and is typically a fluorescent particle. However, it may be a particle that emits light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe used in the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention correspond to a luminescent probe.
  • the “light detection region” of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in those microscopes, and illumination light is given from the objective lens. Corresponds to a region where the illumination light is condensed. In the confocal microscope, such a region is determined particularly by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution with the light detection region.
  • the moving photodetection region includes a luminescent probe bound or associated with a randomly moving particle
  • light from the luminescent probe is detected, thereby detecting the presence of a single particle
  • the luminescent probe may once dissociate from the particle upon detection of light after once binding to the particle to be detected.
  • the light signals from the luminescent probes are individually detected in the sequentially detected light, thereby detecting the presence of particles (coupled with the luminescent probe) one by one individually, Various information about the state in the solution is obtained.
  • the number of particles detected individually may be counted to count the number of particles detected during movement of the position of the light detection region (particle counting). ).
  • information relating to the number density or concentration of particles in the sample solution can be obtained by combining the number of particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the total volume of the movement locus of the position of the light detection region is specified by an arbitrary method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the particles is concrete. Can be calculated automatically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the optical detection path is moved by changing the optical path of the optical system, so that the movement of the light detection area is quick and the mechanical movement of the sample solution is performed. Vibration and hydrodynamic action are not substantially generated.
  • a light emitting probe coupled to one particle is detected from sequentially detected optical signals (if one light emitting probe is coupled to one particle, a plurality of light emitting probes are In the case of binding to one particle and the case where it is a luminescent probe dissociated from the particle after binding to one particle according to the experimental mode. This may be done based on the shape of the optical signal detected in time series. In the embodiment, typically, when an optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it is detected that a luminescent probe bound to one particle has entered the light detection region. Good.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is based on the characteristics of the luminescent probe bound to the particles or the number density or concentration in the sample solution. It may be changed as appropriate. As will be appreciated by those skilled in the art, the manner of light detected from a luminescent probe bound to a particle can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution. In particular, when the moving speed of the light detection region is increased, the amount of light obtained from the light emitting probe bonded to one particle is reduced, so that light from the light emitting probe bonded to one particle is measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed of the light detection region is appropriately changed so that it can be performed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set so that the luminescent probe bound to the particles to be detected (that is, of the present invention).
  • the nucleic acid molecule polymorphism identification method it is set higher than the diffusion movement speed (average particle movement speed due to Brownian motion) of the aggregate including the first nucleic acid probe and the aggregate including the second nucleic acid probe. Is done.
  • the scanning molecule counting method when the photodetection region passes through the position of the luminescent probe bonded to one particle, the light emitted from the luminescent probe is detected, and the luminescent probe is individually detected. To detect.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent probe bound to the particles (specifically, the aggregate including the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe). And set the luminescent probe bound to one particle to one optical signal (representing the presence of the particle). Is possible. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent probe bonded to the particle, as described above, the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics (particularly, the diffusion constant) of the luminescent probe bonded to the particle. It is preferable.
  • the change of the optical path of the optical system for moving the position of the light detection area may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope, as in the case of the optical analysis technology such as FIDA, the light detection mechanism itself, The amount of sample solution may be trace as well. Furthermore, in the scanning molecule counting method, since statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not performed, the optical analysis technology of the scanning molecule counting method is necessary for the optical analysis technology in which the number density or concentration of particles is FIDA or the like. Applicable to sample solutions that are significantly lower than
  • each particle dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, the information is used to quantitatively count the particles or the particles in the sample solution. It is possible to calculate the concentration or number density of the material and to acquire information on the concentration or number density. That is, according to the scanning molecule counting method, the particles passing through the light detection region and the detected light signals are detected one by one so that the particles are detected one by one. It is possible to count the particles to be determined, and to determine the concentration or number density of the particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention that individually detects aggregates and the like containing the first nucleic acid probe and counts the number thereof to determine the particle concentration, these associations in the sample solution are determined.
  • Polymorphic nucleic acids can be identified even when the concentration of the combination is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader.
  • the hydrodynamic action of the flow can alter or denature particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution.
  • the scanning molecule counting method according to the aspect in which the optical path of the optical system is changed and the sample solution is scanned in the light detection region, mechanical vibration or hydrodynamic action is applied to the sample solution. Without giving, the sample solution can be observed uniformly or in a state where the sample solution is mechanically stable.
  • the reliability of the quantitative detection result is improved as compared with the case where the flow is generated in the sample, and the particles to be detected in the sample solution (in the present invention, the first nucleic acid probe is used). Measurement can be performed without any influence or artifacts caused by mechanical action on the associated aggregates.
  • the scanning molecule counting method is a combination of an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, etc. and a photodetector as schematically illustrated in FIG. 1A. It can be realized by an analyzer.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser beam is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region (excitation region) having a high light intensity.
  • particles to be observed and luminescent probes that bind to the particles typically molecules to which luminescent labels such as fluorescent dyes have been added are dispersed or dissolved, and are bound to the luminescent probes.
  • an associated particle a luminescent probe that is once bonded to the particle and then dissociated from the particle depending on the mode of experiment
  • the luminescent probe is excited and light is emitted during that time.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, thereby schematically showing in FIG. 1B. Only the light emitted from the focal region of the laser light, that is, the excitation region as shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is at the top of the region center).
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere with the surface where the light intensity is 1 / e 2 as the boundary.), And is called the confocal volume.
  • light from a conjugate of one particle and a luminescent probe or light from a luminescent probe for example, faint light from one or several fluorescent dye molecules is detected.
  • an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the optical path of the optical system is changed to scan the sample solution with the light detection region, that is, the position of the focal region (ie, the light detection region) in the sample solution.
  • a mechanism for moving is provided.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. 1C.
  • the mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope. Further, in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region, the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (in the program in the computer 18, various movement patterns can be selected. Good.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • mechanical vibrations and hydrodynamic actions are substantially caused in the sample solution. It is possible to eliminate the influence of the dynamic action on the observation object and to achieve stable measurement.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • the optical analyzer 1 may be provided with a plurality of excitation light sources 2 as shown in the figure, and the wavelength of the excitation light is appropriately selected according to the wavelength of the light that excites the combined particle or luminescent probe or the luminescent probe. You may be able to do it.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a combination of luminescent probes or a luminescent probe, the light from them is changed depending on the wavelength. It may be possible to detect them separately.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of particles to be observed are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity, so in order to obtain accurate measurement results, observation in a sample solution
  • the concentration or number density of the target particles is a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity, and a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time. It is required to be done.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, if the observation target particles are at a level that rarely enters the light detection region CV, a significant light intensity (photon count) is measured. It appears only in a part of time, and it becomes difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy.
  • the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which about one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the influence of the background in the calculation of the fluctuation of light intensity will be reduced.
  • the measurement time is lengthened.
  • the scanning molecule counting method can detect characteristics such as the number density or concentration of particles to be observed even when the concentration of particles to be observed is lower than the level required by spectroscopic techniques such as FIDA. It is.
  • a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, and FIG.
  • light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • a region where one particle a fluorescent dye is bound as a luminescent probe in the drawing
  • t1 a significant light intensity (Em) is detected as depicted in FIG. 2B.
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are performed, and the significant light intensity as illustrated in FIG. 2B appearing in the meantime is detected one by one.
  • the number thereof is counted, so that the number of particles existing in the measured region, or information on the density or number density can be acquired.
  • analysis with sufficient accuracy is performed by FIDA or the like. It should be understood that information regarding the concentration or number density of particles can be obtained even in sample solutions where the concentration of particles to be observed is so low.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is measured from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when doing so.
  • concentration of fluorescently labeled particles with a fluorescence spectrophotometer or a plate reader, it is usually assumed that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the concentration of fluorescently labeled particles is sufficiently low, the amount of noise signal relative to the amount of signal due to light emitted from fluorescently labeled particles increases (deterioration of the S / N ratio), and fluorescently labeled particles The proportional relationship between the concentration of particles and the amount of optical signal is lost, and the accuracy of the determined concentration value is deteriorated.
  • the noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. For the calculation, it is possible to detect a concentration lower than that in the case of detecting the concentration on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the fluorescence intensity is fluorescently labeled. Therefore, the measurement accuracy of the particle concentration on the higher particle concentration side is improved as compared with the conventional method of determining the concentration under the assumption that the concentration is proportional to the concentration of the generated particles.
  • the luminescence that binds to the particles relatively when the concentration of the observation target particle increases. The number of probes is reduced.
  • the fluorescence intensity per observation target particle is reduced, the proportional relationship between the concentration of the fluorescently labeled particles and the light amount is lost, and the accuracy of the determined concentration value is deteriorated.
  • the scanning molecule counting method in the process of detecting a signal corresponding to each particle from the detected optical signal, there is little influence of a decrease in fluorescence intensity per particle, and the concentration is calculated from the number of particles. Assuming that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles, it is possible to detect even higher concentrations than when detecting the concentration.
  • the measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement step in FCS or FIDA.
  • the computer 18 is a program stored in a storage device (not shown) (procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region) In accordance with the procedure for detecting light, irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanomirror) to move the position of the light detection region in the well 10.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18, and the computer 18 performs time-series light intensity data from the transmitted optical signal in an arbitrary manner. Generate and save.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon. Therefore, the light detection is performed sequentially for a predetermined unit time over a predetermined time.
  • time-series light intensity data is time-series photon count data. It may be.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so the moving distance is grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in the manner.
  • the movement speed is preferably basically a constant speed, It is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately perform individual detection of the observation target particles from the measured time-series light intensity data or counting of the number of observation target particles.
  • the moving speed is determined by the random movement of the observation target particle (more precisely, the combination of the particle and the luminescent probe or the luminescent probe which is decomposed and released after the binding to the particle), that is, the moving speed due to Brownian movement It is preferable to set a faster value. Since the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely at random, the position moves with time by Brownian motion.
  • the particle randomly moves in the region as schematically illustrated in FIG.
  • the light intensity changes randomly as shown in FIG. 3B (as already mentioned, the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), and corresponds to each observation target particle. It becomes difficult to identify a significant change in light intensity. Therefore, preferably, as illustrated in FIG. 4A, the particles cross the light detection region in a substantially straight line, and thereby correspond to individual particles as illustrated in FIG. 4B in the time-series light intensity data.
  • the profile of the change in the light intensity becomes substantially uniform (when the particle passes through the light detection region substantially linearly, the profile of the change in the light intensity is substantially the same as the excitation light intensity distribution).
  • the moving speed of the position of the light detection region is set faster than the average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the observation target particles and the light intensity can be easily identified.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the Vdif.
  • Wo is about 0.62 ⁇ m
  • Vdif is 1.0 ⁇ Since it is 10 ⁇ 3 m / s
  • the moving speed of the position of the photodetection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 may execute the following light intensity analysis by the processing according to the program stored in the storage device.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle).
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, and the binding between the observation target particle and the luminescent probe It may be selectively determined by the properties of the body (or the luminescent probe that has been degraded and released after binding to the particle).
  • Counting of observation target particles may be performed by counting the number of particles detected by the above-described detection target particle detection method using an arbitrary method. When the number of particles is large, for example, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B may be performed.
  • the light intensity measurement described above that is, depending on the light detection region
  • the time series optical signal data photon count data
  • the time series optical signal data (FIG. 6B, uppermost stage “detection result (unprocessed) ”) Is subjected to a smoothing process (step 110,“ smoothing ”in the upper part of FIG. 6B).
  • the light emitted from the combination of the particle and the luminescent probe or the light emitted from the luminescent probe is stochastically emitted, and data values may be lost in a very short time.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for performing the smoothing process are the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of optical signal data acquisition, It may be set as appropriate according to BIN TIME.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in the value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 6B.
  • the start and end points of a significant signal (peak signal) can be determined advantageously.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • peak signal a significant signal
  • the start point and the end point of one peak signal are searched and determined, A peak presence region is identified (step 130).
  • the bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series optical signal data in the peak existence area (“bell-shaped function fitting” in the lower part of FIG. 6B).
  • Parameters such as the peak intensity Imax of the function, the peak width (full width at half maximum) w, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range, that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range (step 150).
  • the range that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range
  • the calculated bell-shaped function parameter is within an expected range in the optical signal corresponding to the combination of one particle and the luminescent probe or the luminescent probe.
  • the signal is determined to be a signal corresponding to one observation target particle, whereby one observation target particle is detected and counted as one particle (the number of particles is counted up).
  • Step 160 On the other hand, as shown in the right side of FIG. 7, a peak signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly performed over the entire time-series optical signal data, and is counted as a particle every time one observation target particle is detected.
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of time-series optical signal data is used.
  • the number density or concentration of the particles is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or the detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. It is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution (reference solution) with a known particle concentration, the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed that is, the relationship between the number of detected particles and the concentration is determined from the number of detected particles and the concentration of the reference solution particles. It's okay.
  • a plurality of solutions having different concentrations are prepared as reference solutions, and measurement is performed on each of the solutions.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the optical analyzer of the present embodiment information on the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles (formula (5)) is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • the information stored in advance in the storage device of the computer 18 may be used by the user of the device when the optical analysis is performed.
  • the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleic acid probe that specifically binds to a specific type (first type) nucleic acid molecule in a polymorphic sequence, and a nucleic acid having a different base sequence from the nucleic acid probe.
  • a method for identifying the type of nucleic acid molecule to be analyzed based on the amount of aggregates formed by hybridizing each nucleic acid probe and the nucleic acid molecule to be analyzed using at least two types of nucleic acid probes. It is. Furthermore, in the present invention, the association is detected by the scanning molecule counting method described above.
  • the scanning molecule counting method is a measurement method capable of measuring particles having fluorescence for each particle in a state where the molecules are discrete, and therefore, even for a nucleic acid molecule having a relatively low concentration of pM order or less. Measurement is possible. Therefore, according to the method for identifying a polymorphism of a nucleic acid molecule of the present invention, formed aggregates can be counted with high sensitivity even when the concentration of the nucleic acid molecule to be analyzed in the sample solution is very low. .
  • a “polymorphic sequence” is a base sequence having two or more similar base sequences, and a nucleic acid molecule having a polymorphic sequence is referred to as a polymorphic nucleic acid.
  • base sequences are similar means that, for example, 1 to several nucleobases out of 10 to 20 are different by substitution, deletion, insertion, or duplication.
  • identifying polymorphism means a nucleic acid molecule having a specific type of base sequence in the polymorphic sequence, and a nucleic acid molecule having a base sequence of a type other than the specific type in the polymorphic sequence; Means to distinguish.
  • the polymorphic sequence to be analyzed in the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention may be a base sequence on a gene such as a single gene polymorphism (SNP) or the like, or an artificial base sequence. May be.
  • SNP single gene polymorphism
  • somatic mutations include K-ras gene mutations.
  • a nucleic acid probe specifically binds to a single-stranded nucleic acid molecule having a specific type in a polymorphic sequence
  • the nucleic acid probe has a single-stranded nucleic acid molecule having the polymorphic sequence.
  • it means preferentially hybridizing with a single-stranded nucleic acid molecule of a specific type over a single-stranded nucleic acid molecule of a type other than the specific type.
  • the nucleic acid probe may have a base sequence that is completely complementary to a specific type of base sequence, and has a base sequence having a mismatch other than a polymorphic site where the bases differ between the polymorphic sequences. It may be.
  • At least a first nucleic acid probe (hereinafter, referred to as a first nucleic acid probe that hybridizes specifically with a single-stranded nucleic acid molecule labeled with a fluorescent substance and having a first type base sequence in a polymorphic sequence).
  • a first nucleic acid probe that hybridizes specifically with a single-stranded nucleic acid molecule labeled with a fluorescent substance and having a first type base sequence in a polymorphic sequence.
  • Two types of nucleic acid probes are used: a first nucleic acid probe) and a second nucleic acid probe (hereinafter referred to as a second nucleic acid probe) that is labeled with a fluorescent substance and has a base sequence different from that of the first nucleic acid probe.
  • the mutant type is the first type and specifically hybridizes with the mutant single-stranded nucleic acid molecule.
  • the first nucleic acid probe is designed so that the nucleic acid molecule to be analyzed is mutant or wild type by designing the second nucleic acid probe to specifically hybridize with the wild-type single-stranded nucleic acid molecule. Can be identified.
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is a mutant type, an aggregate is preferentially formed with the first nucleic acid probe. Therefore, the number of molecules of the aggregate including the first nucleic acid probe is greater than the aggregate including the second nucleic acid probe. Significantly more than.
  • the first nucleic acid probe is designed so that the mutant type is the first type and specifically hybridizes with the single-stranded nucleic acid molecule of the mutant type, and includes the base sequence of the mutant type (first type).
  • the second nucleic acid probe can also be designed to specifically hybridize with a single-stranded nucleic acid molecule.
  • the second nucleic acid probe associates with the mutant single-stranded nucleic acid molecule in a region other than the polymorphic sequence.
  • both the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe are added to the sample solution, and the steps (a), ( By performing b), (d), and (e), an aggregate including the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe is formed in the sample solution.
  • the wild-type single-stranded nucleic acid molecule does not form an aggregate with the first nucleic acid probe, but associates with the second nucleic acid probe.
  • the second nucleic acid probe designed in this manner binds to a nucleic acid molecule having a polymorphic sequence in a region other than the polymorphic sequence
  • the nucleic acid molecule having a genotype other than the first type in the polymorphic sequence is also used. This is to form an aggregate. That is, when the nucleic acid molecule to be analyzed is a wild type, an aggregate including the second nucleic acid probe is formed in the sample solution, but an aggregate including the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe is formed. Not.
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is of the first type (in this case, a mutant type)
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is a type other than the first type in the polymorphic sequence (in this case, the wild type) Can be identified.
  • the second nucleic acid probe is a single-stranded nucleic acid containing the first type base sequence as described above.
  • a single-stranded nucleic acid molecule having a base sequence complementary to a single-stranded nucleic acid molecule containing a first type of base sequence ie, a polymorphic sequence can be designed to specifically hybridize with the molecule. It can also be designed to specifically hybridize with a single-stranded nucleic acid molecule that associates with a single-stranded nucleic acid molecule that has a polymorphic sequence. .
  • the second nucleic acid probe associates with a complementary strand of a single-stranded nucleic acid molecule having a polymorphic sequence in a region where the base sequence is common between the polymorphic nucleic acids. That is, the second nucleic acid probe forms an association with a complementary strand of a single-stranded nucleic acid molecule having a polymorphic sequence regardless of the type of the polymorphic sequence.
  • a single-stranded nucleic acid molecule containing the first type base sequence exists as a double-stranded nucleic acid molecule (associate) with a complementary strand of the single-stranded nucleic acid molecule
  • One containing the base sequence of the first type by adding both one nucleic acid probe and the second nucleic acid probe and performing the steps (a), (b), (d) and (e) described below
  • the strand nucleic acid molecule is associated with the first nucleic acid probe
  • the complementary strand of the single-stranded nucleic acid molecule is associated with the second nucleic acid probe.
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is a type other than the first type in the polymorphic sequence, only the aggregate containing the second nucleic acid probe is formed by the same process, and the first nucleic acid probe Aggregates containing are not formed. Therefore, when both an aggregate including the first nucleic acid probe and an aggregate including the second nucleic acid probe are formed in the sample solution, the nucleic acid molecule to be analyzed is the first type, and the second nucleic acid When the aggregate containing the probe is formed, but the aggregate containing the first nucleic acid probe is not formed, the nucleic acid molecule to be analyzed is of a type other than the first type in the polymorphic sequence. Can be identified.
  • the second nucleic acid probe By designing the second nucleic acid probe so as to form an association with a single-stranded nucleic acid molecule having a polymorphic sequence or a complementary strand of the single-stranded nucleic acid molecule, regardless of the type of the polymorphic sequence, The ratio of the single-stranded nucleic acid molecule containing the first type base sequence in the polymorphic nucleic acid present therein can be calculated.
  • the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention is applied to a sample solution containing genomic DNA of a subject, wherein a SNP having two types, a wild type and a mutant type, is a polymorphic sequence, the mutant type is a first type.
  • the genotype of the subject is identified as a mutant homozygote. be able to.
  • the genotype of the subject is heterogeneous and the aggregate containing the first nucleic acid probe is If little is detected, it can be identified that the subject's genotype is wild-type homo.
  • the second nucleic acid probe so as to form an aggregate with a single-stranded nucleic acid molecule having a polymorphic sequence or a complementary strand of the single-stranded nucleic acid molecule, regardless of the type of the polymorphic sequence, It can also be used for accuracy evaluation of measurement systems. For example, when an aggregate containing the second nucleic acid probe is hardly detected, the sample solution used does not contain a sufficient amount of polymorphic nucleic acid for measurement, or the measurement system functions well. This may indicate that the results are not reliable.
  • a nucleic acid probe previously labeled with a fluorescent substance is used to measure an aggregate formed by a nucleic acid probe and another single-stranded nucleic acid molecule by a scanning molecule counting method using fluorescence as an index.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence by emitting light of a specific wavelength, and is appropriately selected from fluorescent dyes used in FCS, FIDA, and the like. be able to.
  • the nucleic acid probe can be labeled with a fluorescent substance by a conventional method.
  • the fluorescence intensity is different between a state in which a nucleic acid probe is present alone and a state in which an aggregate is formed with other single-stranded nucleic acid molecules. Both are detected separately.
  • a molecular beacon probe can be used as the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe.
  • a molecular beacon probe is an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule, and a fluorescent substance that serves as an energy donor and a substance that serves as an energy acceptor in fluorescence energy transfer (FRET) ( A fluorescent substance or a quenching substance) is bound so that FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule and does not occur in the state of an aggregate formed by hybridizing with another single-stranded nucleic acid molecule. It is a probe.
  • FRET fluorescence energy transfer
  • the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe present alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the aggregate including the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe is detected separately from the nucleic acid probe present alone. Can do.
  • the molecular beacon probe used as the first nucleic acid probe or the second nucleic acid probe has a base sequence capable of hybridizing with a specific type of polymorphic sequence, and has a 3 ′ end region and a 5 ′ end side region.
  • Examples include oligonucleotides having base sequences complementary to each other in the region.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, one remaining on the 5 ′ end side is bound, and a region on the 3 ′ end side And 5 ′ terminal side have complementary base sequences, and base pairs are formed in these base sequences to form an intramolecular structure (so-called stem-loop structure).
  • the mutually complementary regions forming the intramolecular base pair of the molecular beacon probe are regions that specifically bind to a specific type of nucleic acid molecule in the polymorphic sequence (for example, a base complementary to the polymorphic sequence).
  • the region on the 3 ′ end side and the region on the 5 ′ end side may be a region including the 3 ′ end or the 5 ′ end, respectively, as long as it is present so as to sandwich the region comprising the sequence)
  • the area may not be included.
  • the number of bases and the base sequence of the region forming the base pair are such that the stability of the formed base pair is lower than the stability of the aggregate with the nucleic acid molecule having the target polymorphic sequence, and the measurement conditions It is sufficient that the base pair can be formed below.
  • the second nucleic acid probe is two fluorescent substances of the same type as the first nucleic acid probe. May be a molecular beacon probe in which a fluorescent substance serving as an energy donor and a substance serving as an energy acceptor are combined in a different combination from the first nucleic acid probe.
  • the light emitted from the aggregate including the first nucleic acid probe by combining the fluorescent substance serving as an energy donor and the substance serving as an energy acceptor for labeling the second nucleic acid probe in a different combination from the first nucleic acid probe;
  • the optical properties of the light emitted from the aggregate including the second nucleic acid probe are made different from each other, and the aggregate including the first nucleic acid probe and the aggregate including the second nucleic acid probe are changed by the emitted light. It can be distinguished and detected.
  • a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure is used, and FRET is caused between the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance labeled with the nucleic acid probe. It is possible to distinguish between nucleic acid probes present alone and aggregates. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the nucleic acid probe serves as an FRET energy donor, and the other serves as the FRET energy acceptor. Fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the nucleic acid probe is detected from the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe that are present alone.
  • Examples of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator, a groove binder to which a fluorescent substance is bound, and the like. If the amount of the fluorescent intercalator entering between the base pairs of the aggregate is too large, the background when detecting the fluorescence emitted by FRET becomes too high, which may affect the detection accuracy. is there. For this reason, it is preferable to design the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe so that the region forming the double strand in the aggregate is 400 bp or less.
  • the second nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance of the same type as the first nucleic acid probe.
  • the FRET that occurs between the fluorescent double-stranded nucleic acid-binding substance and an energy donor may be labeled with a fluorescent substance that is different from the first nucleic acid probe. It may be labeled with a fluorescent substance serving as an energy acceptor in FRET occurring between the strand nucleic acid binding substance.
  • either one of the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe may be a molecular beacon probe, and the other may be a probe labeled with a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and a fluorescent substance that causes FRET.
  • the second nucleic acid probe is designed to specifically hybridize with a single-stranded nucleic acid molecule containing the first type base sequence in a state adjacent to the first nucleic acid probe, and the first nucleic acid probe Either one of the fluorescent substance labeled with the fluorescent substance and the fluorescent substance labeled with the second nucleic acid probe is a fluorescent substance serving as an energy donor in FRET, and the other is a substance serving as an energy acceptor in the FRET It can also be.
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe hybridize adjacent to each other to the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence.
  • assembly containing a 1st nucleic acid probe and a 2nd nucleic acid probe is detectable by detecting the fluorescence discharge
  • the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe used in the present invention may be an oligonucleotide composed of DNA, an oligonucleotide composed of RNA, or a chimeric oligonucleotide composed of DNA and RNA. Alternatively, it may contain a part or all of a nucleic acid analog capable of forming a nucleotide chain or base pair in the same manner as a natural nucleobase. Nucleic acid analogues include those in which side chains of natural nucleotides (naturally occurring nucleotides) such as DNA and RNA are modified with functional groups such as amino groups, and labeled with proteins, low molecular compounds, etc. And the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups.
  • Nucleotides Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • the nucleic acid to be analyzed may be DNA, RNA, or artificially amplified such as cDNA.
  • the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention comprises the following steps.
  • A a first nucleic acid probe (first nucleic acid probe) that is specifically labeled with a fluorescent substance and hybridizes specifically with a single-stranded nucleic acid molecule having a base sequence of the first type in the polymorphic sequence; Preparing a sample solution containing the nucleic acid molecule to be analyzed;
  • B associating nucleic acid molecules in the sample solution prepared in step (a);
  • D preparing a sample solution containing a second nucleic acid probe (second nucleic acid probe) labeled with a fluorescent substance and having a base sequence different from that of the first nucleic acid probe, and the nucleic acid molecule to be analyzed;
  • Process (E) associating nucleic acid molecules in the sample solution prepared in
  • a sample solution containing the first nucleic acid probe and the nucleic acid molecule to be analyzed is prepared.
  • the sample solution is prepared by adding the first nucleic acid probe and the nucleic acid molecule to be analyzed to an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the detection of fluorescence emitted from the first nucleic acid probe and the detection of aggregates by the scanning molecule counting method. It can be used by appropriately selecting from the buffers used.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution prepared in the step (a) are associated.
  • the nucleic acid molecule in the sample solution is a double-stranded nucleic acid molecule
  • it is preferably denatured before associating.
  • “denaturing a nucleic acid molecule” means dissociating base pairs.
  • a base pair formed by mutually complementary base sequences in a molecular beacon probe is dissociated and the intramolecular structure is released to form a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted to a single-stranded nucleic acid molecule. It means to do.
  • the nucleic acid probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the nucleic acid molecule is a double-stranded nucleic acid molecule, the aggregate containing the nucleic acid probe is not subjected to any special denaturation treatment. It may be possible to form.
  • thermo denaturation can denature nucleic acid molecules in the sample solution by subjecting the sample solution to high temperature treatment. Generally, it can be denatured by keeping it at 90 ° C. for DNA and 70 ° C. for RNA for several seconds to 2 minutes, but the denaturation temperature varies depending on the length of the base of the nucleic acid molecule. If it can be modified, it is not limited to this temperature.
  • denaturation by low salt concentration treatment can be performed by adjusting the sample solution to have a sufficiently low salt concentration by, for example, dilution with purified water or the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution are associated.
  • the temperature of the sample solution is set to a temperature at which the first nucleic acid probe and the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence can specifically hybridize.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution can be associated with each other as appropriate.
  • the salt concentration of the sample solution is changed to the first nucleic acid probe and the single-stranded nucleic acid having the first type base sequence by adding a salt solution or the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution can be associated with each other by raising the concentration to a level at which the molecules can specifically hybridize.
  • the temperature at which the first nucleic acid probe and the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence can be specifically hybridized is such that the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence and the nucleic acid probe are hybridized. It can be determined from the melting curve of the aggregate consisting of For example, the melting curve is obtained by changing the temperature of a solution containing only the first nucleic acid probe and the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence from a high temperature to a low temperature, and changing the absorbance and fluorescence intensity of the solution. It can be determined by measuring.
  • the temperature in the range can be a temperature at which the first nucleic acid probe and the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence can specifically hybridize.
  • the melting curve is similarly determined by changing the salt concentration in the solution from the low concentration to the high concentration instead of the temperature, and the first nucleic acid probe and the first nucleic acid probe having the first type base sequence are determined. The concentration at which the strand nucleic acid molecule can specifically hybridize can be determined.
  • the temperature at which the first nucleic acid probe can specifically hybridize with the single-stranded nucleic acid molecule having the first type base sequence can be generally substituted with the Tm value (melting temperature).
  • the Tm value of a region that hybridizes with a single-stranded nucleic acid molecule having a first type base sequence can be obtained from the base sequence information of the first nucleic acid probe ( The temperature at which 50% of the double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA can be calculated.
  • the temperature of the sample solution is set such that the Tm value of the region having a base sequence complementary to the single-stranded nucleic acid molecule having the base sequence of the first type in the first nucleic acid probe is ⁇ 3 ° C. Reduce to about temperature.
  • the temperature of the sample solution when forming an aggregate.
  • the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a rate of temperature decrease of 0.05 ° C./second or slower.
  • step (c) the number of molecules of the aggregate containing the first nucleic acid probe in the sample solution is calculated by a scanning molecule counting method. Specifically, the sample solution after forming the aggregate is placed in the optical analyzer for the scanning molecule counting method, and the fluorescence emitted from the aggregate is detected and analyzed by the above method. Thus, the number of molecules of the aggregate is calculated.
  • nonspecific hybridization is performed.
  • an oligonucleotide having a base sequence complementary to a base sequence of a type other than the type to which the nucleic acid probe specifically hybridizes among the polymorphic sequences to be analyzed is previously added to the sample solution. It is preferable to keep it. Excessive amounts of oligonucleotides that specifically hybridize with other types of nucleic acid molecules effectively suppress non-specific hybridization between the added nucleic acid probe and other types of nucleic acid molecules can do.
  • the sample solution to which the first nucleic acid probe is added contains the wild type base sequence and It is preferable to add an oligonucleotide having a complementary base sequence.
  • the sample solution to which the second nucleic acid probe is added contains a mutant base sequence and It is preferable to add an oligonucleotide having a complementary base sequence.
  • the oligonucleotide only needs to be added to the sample solution before forming the aggregate, and may be added to the sample solution together with the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe. It may be added later.
  • a surfactant such as a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance in order to suppress non-specific hybridization.
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • Steps (d) to (f) can be performed in the same manner as steps (a) to (c) except that the second nucleic acid probe is used instead of the first nucleic acid probe.
  • each of the types other than the first type and the second type has a base sequence of each type.
  • Steps (a) to (c) and steps (d) to (f) may be performed substantially simultaneously or separately. For example, after preparing a sample solution to which a first nucleic acid probe and a nucleic acid molecule to be analyzed are added and a sample solution to which a second nucleic acid probe and a nucleic acid molecule to be analyzed are added, the temperature of both sample solutions is increased simultaneously. Then, the sample is gradually lowered to simultaneously form an aggregate of nucleic acid molecules in the solution, and then each sample solution can be placed in an optical analyzer and sequentially analyzed.
  • the steps (a) and (d) can be performed in one sample solution. Specifically, after preparing a sample solution in which the first nucleic acid probe, the second nucleic acid probe, and the nucleic acid molecule to be analyzed are added to one sample solution, the nucleic acid molecules in the sample solution are associated. Thereafter, the number of molecules of the aggregate including the first nucleic acid probe and the number of molecules of the aggregate including the second nucleic acid probe in the sample solution are calculated by a scanning molecule counting method.
  • the second nucleic acid probe specifically hybridizes with a single-stranded nucleic acid molecule containing a first-type base sequence or a single-stranded nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution are associated with each other. . Thereafter, the number of molecules of the aggregate containing the first nucleic acid probe and the second nucleic acid probe in the sample solution is calculated by a scanning molecule counting method.
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is determined based on the counting result of the number of molecules of the aggregate including the first nucleic acid probe and the counting result of the number of molecules including the aggregate including the second nucleic acid probe. , Identifying whether the polymorphism to be analyzed is the first type or another type (for example, the second type).
  • a single-stranded nucleic acid molecule for control whose polymorphic sequence is known is used instead of the nucleic acid molecule to be analyzed, and specifically hybridizes with a wild-type nucleic acid molecule.
  • the number of molecules of the aggregate containing the wild-type probe formed when the wild-type probe (Wt probe) is added and the mutant probe (Mt probe) that specifically hybridizes with the mutant nucleic acid molecule were added.
  • the number of molecules of the aggregate containing the mutant probe formed in the case is calculated.
  • a single-stranded nucleic acid molecule for control As a single-stranded nucleic acid molecule for control, a wild-type nucleic acid molecule, a mutant nucleic acid molecule, or a mixture of a wild-type nucleic acid molecule and a mutant nucleic acid molecule in equimolar amounts, respectively, and a nucleic acid as a negative control are used. Add probe only. Information necessary for clustering the relationship between the polymorphism of the single-stranded nucleic acid molecule for control and the number of molecules of the aggregate can be obtained from the results of each measurement.
  • FIG. 8 schematically shows an example of clustering based on the number of molecules of polymorphisms and aggregates.
  • the sample solution to which only the nucleic acid probe is added there are few aggregates containing the wild type probe and aggregates containing the mutant probe (cluster 1 in FIG. 8).
  • the number of molecules of the aggregate containing the wild type probe is clearly larger than the number of molecules of the aggregate containing the mutant probe (in FIG. 8, Cluster 2).
  • the mutant nucleic acid molecule is added, the number of molecules of the aggregate containing the mutant probe is clearly larger than the number of molecules of the aggregate including the wild type probe (in FIG. 8, cluster 3).
  • both the number of molecules containing the wild-type probe and the number of molecules containing the mutant-type probe are both Both increase (in FIG. 8, cluster 4).
  • wild type (GGT) nucleic acid SEQ ID NO: 2 having the base sequence shown in Table 1 (mutation rate: 0%), wild type (GGT) nucleic acid and mutant type (GTT) ) Nucleic acid (SEQ ID NO: 3) mixed at a molar ratio of 9: 1 (mutation rate: 10%), and mutant (GTT) nucleic acid alone (mutation rate: 100%) were used.
  • a non-fluorescent labeled probe wild type (GGT) decoy nucleic acid
  • SEQ ID NO: 4 having a base sequence complementary to the wild type (GGT) nucleic acid was used.
  • oligonucleotides were synthesized at the request of Sigma Genosys.
  • Table 1 the right column shows the sequence number.
  • bold bases are bases that form base pairs with mutation sites or mutation sites.
  • underlined bases in mutant (GTT) molecular beacon probes are regions that hybridize to each other when forming intramolecular structures.
  • Tris buffer (GTT) molecular beacon probe nucleic acid molecule to be analyzed, and wild-type decoy nucleic acid are tris buffer solution (concentration of wild type and mutant type) and 500 nM, respectively.
  • a sample solution was prepared by dissolving in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0). The prepared sample solution was denatured by heating at 95 ° C. for 5 minutes, and then the liquid temperature was gradually lowered to 20 ° C. to form an aggregate. Specifically, the cooling rate is 0.1 ° C./second, 90 ° C. for 5 minutes, 80 ° C. for 10 minutes, 70 ° C. for 10 minutes, 60 ° C. for 10 minutes, 50 ° C. for 10 minutes, 40 ° C. for 10 minutes. For 10 minutes at 30 ° C. for 10 minutes.
  • the number of molecules of the aggregate in the sample solution after the temperature lowering treatment was counted by a scanning molecule counting method.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used. Time-series photon count data was obtained. At that time, the excitation light was irradiated at 300 ⁇ W using 543 nm laser light, and the detection light wavelength was 560 to 620 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second, the BIN TIME was 10 ⁇ sec, and the measurement time was 2 seconds. The measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated. After the measurement of the light intensity, the optical signals detected in the time series data were counted from the time series photon count data acquired for each sample solution. In the smoothing of the data by the moving average method, the number of data points averaged at a time was set to nine, and the moving average process was repeated five times. In the fitting, a Gaussian function was fitted to the time series data by the least square method, and the peak intensity (in the Gaussian function), the peak width (full width at half maximum), and the correlation coefficient were determined.
  • the following conditions 20 ⁇ sec ⁇ peak width ⁇ 400 ⁇ sec peak intensity> 1 (photon / 10 ⁇ sec) Correlation coefficient> 0.95 Only the peak signal that satisfies the above condition is determined to be an optical signal corresponding to the observation target nucleic acid molecule, while the peak signal that does not satisfy the above condition is ignored as noise and is determined to be the optical signal corresponding to the observation target nucleic acid molecule. The number of detected signals was counted as “peak number”.
  • FIG. 9 shows the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution.
  • a sample solution containing a wild type (GGT) decoy nucleic acid was prepared by dissolving in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0) to 1 ⁇ M.
  • Tris buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0
  • a sample solution containing no wild type (GGT) decoy nucleic acid was prepared in the same manner except that no wild type (GGT) decoy nucleic acid was added.
  • the liquid temperature was raised and lowered to denature nucleic acid molecules in the sample solution, and then an aggregate was formed. Further, under the same conditions as in Reference Example 1, The number of molecules of the aggregate containing the mutant (GTT) molecular beacon probe in the sample solution was counted.
  • FIG. 10 shows the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution.
  • FIG. 10A shows the result of the sample solution to which the wild type (GGT) decoy nucleic acid was not added
  • FIG. 10B shows the result of the sample solution to which the wild type (GGT) decoy nucleic acid was added.
  • the mutant (GTT) molecular beacon probe hybridized non-specifically to the wild type (GGT) nucleic acid.
  • FIG. 10A shows the mutant (GTT) molecular beacon probe hybridized non-specifically to the wild type (GGT) nucleic acid.
  • Each genotype was identified using the mutant type (GTT) molecular beacon probe and the wild type (GGT) molecular beacon probe used in Reference Example 1.
  • GTT mutant type
  • GGT wild type molecular beacon probe
  • SEQ ID NO: 5 a nucleic acid molecule having the base sequence shown in Table 2 (SEQ ID NO: 5) in which TAMRA was added to the 5 ′ end and BHQ-2 was added to the 3 ′ end was used.
  • GTT mutant-type nucleic acid
  • a type (GGT) nucleic acid and a mutant (GTT) nucleic acid mixed at a molar ratio of 1: 1 (GTT mutation rate: 50%) were used.
  • the wild-type (GGT) decoy nucleic acid used in Reference Example 1 and a non-fluorescently labeled probe having a base sequence complementary to the mutant (GTT) nucleic acid (mutant) (GTT) decoy nucleic acid (SEQ ID NO: 6) was used.
  • Table 2 shows the sequence of the mutant (GTT) decoy nucleic acid.
  • the right column indicates the SEQ ID No.
  • the bold base is the base that forms a base pair with the mutation site or mutation site, and the underlined bases are mutually attached when forming the intramolecular structure. It is a region that hybridizes.
  • the oligonucleotides used in this example were synthesized upon request from Sigma Genosys.
  • the mutant type (GTT) molecular beacon probe, the nucleic acid molecule to be analyzed, and the wild type (GGT) decoy nucleic acid are 100 pM, 100 nM (concentration of the wild type and the mutant type), and 500 nM, respectively.
  • a sample solution containing a mutant (GTT) molecular beacon probe and a wild type (GGT) decoy nucleic acid is prepared by dissolving in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0). did.
  • a control sample solution was prepared in the same manner except that the nucleic acid molecule to be analyzed was not added.
  • the wild type (GGT) molecular beacon probe, the nucleic acid molecule to be analyzed, and the mutant (GTT) decoy nucleic acid are 100 pM, 100 nM (concentration of the wild type and mutant), and 500 nM, respectively.
  • a sample solution containing a wild type (GGT) molecular beacon probe and a mutant (GTT) decoy nucleic acid was prepared by dissolving in Tris buffer.
  • a control sample solution was prepared in the same manner except that the nucleic acid molecule to be analyzed was not added.
  • the liquid temperature was raised and lowered to denature nucleic acid molecules in the sample solution, and then an aggregate was formed. Then, the number of molecules in the sample solution containing the mutant (GTT) molecular beacon probe and the number of molecules in the aggregate containing the wild type (GGT) molecular beacon probe were counted.
  • the vertical axis represents the number of molecules of an aggregate containing mutant (GTT) molecular beacon probes (mutant type (GTT) peak number) (“peak number (GTT)” in the figure), and the horizontal axis represents wild type ( GGT)
  • GTT mutant molecular beacon probes
  • wild type (GGT) As the number of molecules of the aggregate containing the beacon probe (number of wild-type (GGT) peaks) (“peak number (GGT)” in the figure)), for each mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution Shows the value of the number of peaks counted.
  • nucleic acid molecule to be analyzed for each mutation rate by identifying the gene mutation using the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention, in particular, single nucleotide polymorphism, etc.
  • the genotype of the genomic DNA to be analyzed is a wild type homozygote, a heterozygote or a mutant homozygote.
  • Example 2 In the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention, the codon 12_GTT mutation of the K-ras gene was identified by carrying out steps (a) and (d) in one sample solution.
  • As a mutant (GTT) molecular beacon probe ATTO (registered trademark) 647N was added to the 5 ′ end of an oligonucleotide having the same base sequence (SEQ ID NO: 1) as the mutant (GTT) molecular beacon probe described in Table 1. What added BHQ-3 to 3 'terminal was used.
  • the wild type (GGT) molecular beacon probe and the nucleic acid molecule to be analyzed were those used in Example 1.
  • wild type (GGT) decoy nucleic acid (SEQ ID NO: 7) and mutant type (GTT) decoy nucleic acid (SEQ ID NO: 8) described in Table 3 were used.
  • the oligonucleotides used in this example were synthesized upon request from Sigma Genosys.
  • a mutant (GTT) molecular beacon probe, a wild type (GGT) molecular beacon probe, a nucleic acid molecule to be analyzed, a wild type (GGT) decoy nucleic acid, and a mutant (GTT) decoy nucleic acid are each 100 pM. , 100 pM, 100 nM (concentration of total wild type and mutant), 500 nM, 500 nM by dissolving in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0) A solution was prepared. A control sample solution was prepared in the same manner except that the nucleic acid molecule to be analyzed was not added.
  • the liquid temperature was raised and lowered to denature nucleic acid molecules in the sample solution, and then aggregates were formed.
  • the number of molecules of the aggregate in the sample solution after the temperature lowering treatment was counted by a scanning molecule counting method.
  • the excitation light is irradiated at 300 ⁇ W using 543 nm laser light, and the detection light wavelength is measured using a bandpass filter. It was 565 to 595 nm.
  • the excitation light was irradiated at 300 ⁇ W using a 633 nm laser beam, and the detection light wavelength was 650 to 690 nm using a bandpass filter. Other than that, measurement was performed by the scanning molecule counting method under the same conditions as in Example 1, and the analysis was performed.
  • the vertical axis represents the number of molecules of the aggregate containing the mutant (GTT) molecular beacon probe (number of mutant (GTT) peaks) (“peak number (GTT)” in the figure), and the horizontal axis represents the wild type ( GGT) As the number of molecules of the aggregate containing the beacon probe (number of wild-type (GGT) peaks) (“peak number (GGT)” in the figure)), for each mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution Shows the value of the number of peaks counted.
  • Example 3 Using a nucleic acid probe having a base sequence different from that of the first nucleic acid probe as a second nucleic acid probe and not recognizing a polymorphic site consisting of the polymorphic sequence to be analyzed, the codon 12_GTT mutation of the K-ras gene is changed. Identified.
  • a base sequence (common sequence) (SEQ ID NO: 9) of a region in the K-ras gene that does not include codon 12 and is common to the wild type and the mutant type
  • a common molecular beacon probe in which ATTO (registered trademark) 647N was added to the 5 ′ end and BHQ-3 was added to the 3 ′ end was used for the oligonucleotide (SEQ ID NO: 10) that specifically hybridizes.
  • the oligonucleotide which consists of the said common sequence was used as a common nucleic acid.
  • Table 4 shows the common molecular beacon probe and the base sequence of the common sequence. In Table 4, the right column shows the sequence number.
  • the underlined bases in the common molecular beacon probe are regions that hybridize with each other when forming an intramolecular structure.
  • mutant (GTT) molecular beacon probe used in Reference Example 1 was used as the first nucleic acid probe. Moreover, only the wild type (GGT) nucleic acid used in Reference Example 1 (mutation rate: 0%) and only the mutant type (GTT) nucleic acid (GTT mutation rate: 100%) were used as nucleic acid molecules to be analyzed. Furthermore, in order to suppress non-specific hybridization, the wild type (GGT) decoy nucleic acid used in Reference Example 1 was used. The oligonucleotides used in this example were synthesized upon request from Sigma Genosys.
  • a mutant (GTT) molecular beacon probe, a common molecular beacon probe, a wild type (GGT) nucleic acid or a mutant (GTT) nucleic acid, a common nucleic acid, and a wild type (GGT) decoy nucleic acid are 100 pM and 100 pM, respectively.
  • Sample solutions were prepared by dissolving in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0) so as to be 100 nM, 100 nM, and 500 nM.
  • a control sample solution was prepared in the same manner except that neither wild type (GGT) nucleic acid nor mutant type (GTT) nucleic acid was added.
  • FIG. 13 shows the number of peaks counted for each GTT mutation rate in the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution.
  • FIG. 13A shows the results of counting aggregates containing mutant (GTT) molecular beacon probes
  • FIG. 13B shows the results of counting aggregates containing common molecular beacon probes.
  • the common nucleic acid was added to the sample solution separately from the wild type (GGT) nucleic acid and the mutant type (GTT) nucleic acid.
  • the nucleic acid molecule to be analyzed is genomic DNA
  • the common sequence and the polymorphic sequence are present on the same single-stranded nucleic acid molecule or the complementary strand of the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the second nucleic acid probe is a probe that hybridizes to a region common to polymorphic nucleic acids as in this example, the sample solution depends on the presence or absence of an aggregate containing the second nucleic acid probe.
  • nucleic acid molecule containing the polymorphic sequence to be analyzed Whether or not a nucleic acid molecule containing the polymorphic sequence to be analyzed is present can be confirmed. Moreover, the amount of nucleic acid molecules due to variation in the amount of PCR amplification can be corrected by the detected amount of the aggregate containing the second nucleic acid probe, and the accuracy of polymorphism identification can be improved.
  • a sample solution containing wild type (GGT) decoy nucleic acid was prepared by dissolving in (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0).
  • a sample solution containing no wild type (GGT) decoy nucleic acid was prepared in the same manner except that no wild type (GGT) decoy nucleic acid was added.
  • the prepared sample solution was denatured by heating at 94 ° C. for 5 minutes, and then the temperature was lowered at 0.1 ° C./second, followed by a constant temperature treatment at 68.8 ° C. for 5 minutes to form an aggregate.
  • a solution obtained by diluting PicoGreen (manufactured by Molecular Probe) 1000 times with the above Tris buffer was added to each of these concentrated sample solutions to prepare a 10-fold dilution of the concentrated sample solution, and these sample solutions were obtained. These sample solutions were allowed to stand for 30 minutes or more after the addition of the PicoGreen diluent.
  • the number of molecules of the aggregate in the sample solution was counted by a scanning molecule counting method.
  • the optical analysis device a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used. Time-series photon count data was obtained.
  • the excitation light was irradiated with a laser beam of 488 nm at a rotation speed of 6,000 rpm and 100 ⁇ W, and the detection light wavelength was 560 to 620 nm using a bandpass filter.
  • the signal obtained from the avalanche photodiode was BIN TIME of 10 ⁇ s, and the measurement time was 2 seconds.
  • the time series data obtained by the measurement was smoothed by the Savinzky-Golay algorithm, and then the peak was detected by differentiation. Of the regions regarded as peaks, a region that can be approximated to a Gaussian function was extracted as a signal. The number of peaks obtained was compared between the sample solution with and without the wild type (GGT) decoy nucleic acid.
  • FIG. 14 shows the number of peaks counted for each nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution.
  • GTT nucleic acid the sample solution to which the mutant type (GTT) nucleic acid was added.
  • GGT mutant type nucleic acid
  • the K-ras gene codon 12_GTT mutation was identified by scanning molecule counting using the mutant type (GTT) probe, wild type (GGT) probe, and fluorescent intercalator used in Reference Example 3.
  • GTT mutant type
  • GGT wild type
  • fluorescent intercalator used in Reference Example 3.
  • a wild-type (GGT) probe a nucleic acid molecule having the base sequence (SEQ ID NO: 12) described in Table 6 in which ROX was added to the 5 ′ end was used.
  • the right column shows the sequence number, and the base in bold type is the base that forms a base pair with the mutation (polymorphism) site or mutation site.
  • a mutant (GTT) probe, a nucleic acid molecule to be analyzed, and a wild-type (GGT) decoy nucleic acid are respectively added to a Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM) so as to be 100 pM, 100 pM, and 1 nM, respectively.
  • a sample solution containing a mutant (GTT) probe and a wild type (GGT) decoy nucleic acid was prepared by dissolving in EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0).
  • a wild type (GGT) probe, a nucleic acid molecule to be analyzed, and a mutant (GTT) decoy nucleic acid are dissolved in the Tris buffer so as to be 100 pM, 100 pM, and 1 nM, respectively.
  • a sample solution containing a probe and a mutant (GTT) decoy nucleic acid was prepared. The prepared sample solution was denatured by heating at 94 ° C. for 5 minutes, and then the temperature was lowered at 0.1 ° C./second, followed by a constant temperature treatment at 68.8 ° C. for 5 minutes to form an aggregate.
  • a solution obtained by diluting PicoGreen (manufactured by Molecular Probe) 1000 times with the above Tris buffer was added to each of these concentrated sample solutions to prepare a 10-fold dilution of the concentrated sample solution, and these sample solutions were obtained. These sample solutions were allowed to stand for 30 minutes or more after the addition of the PicoGreen diluent.
  • FIG. 15 shows, for each mutation rate of the nucleic acid molecule to be analyzed added to the sample solution, the counted peak number (“GTT probe” in the figure) of the aggregate containing the mutant (GTT) probe and the wild type (GGT). ) The number of counted peaks (“GGT probe” in the figure) of the aggregate containing the probe is shown.
  • a sample solution containing a mutant type (GTT) probe and a wild type (GGT) decoy nucleic acid can be obtained as the mutation rate increases (that is, the concentration of the mutant type (GTT) nucleic acid in the sample solution increases). It was found that the number of peaks increased and the amount of aggregates containing mutant (GTT) probes increased. Similarly, in a sample solution containing a wild type (GGT) probe and a mutant (GTT) decoy nucleic acid, the lower the mutation rate (that is, the higher the wild type (GGT) nucleic acid concentration in the sample solution), the more obtainable It was found that the number of peaks increased and the amount of aggregates containing wild type (GGT) probe increased. From these results, it is clear that polymorphisms can be identified by the nucleic acid molecule polymorphism identification method of the present invention, even though they are very similar nucleic acid molecules that differ by only one base.
  • PCR products were removed from these PCR products using Wizard V Gel and PCR Clean-Up System (Promega), and the presence and concentration of PCR products were measured by electrophoresis using Bioanalyzer (Agilent). These PCR products (fluorescent labels) are an association of a single-stranded nucleic acid molecule whose 5 ′ end is labeled with Rox and an unlabeled single-stranded nucleic acid molecule.
  • An unlabeled single-stranded nucleic acid molecule between the unlabeled single-stranded nucleic acid molecules was used in the same manner as described above, except that an oligonucleotide not modified at the 5 ′ end was used instead of the oligonucleotide modified at the 5 ′ end with Rox.
  • a PCR product (unlabeled) as an aggregate was obtained. Thereafter, each PCR product was adjusted to 100 pM using Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0).
  • the prepared PCR product solution was added to PicoGreen (manufactured by Invitrogen) solution diluted 10,000 times with the above Tris buffer at an arbitrary concentration to obtain a sample solution. These sample solutions were allowed to stand for 30 minutes or more after the addition of the PicoGreen diluent.
  • a polymorphic nucleic acid present at a very low concentration in a sample solution is identified using a fluorescently labeled nucleic acid probe and counted by a scanning molecule counting method. Therefore, it can be used in fields such as clinical examinations that identify genetic polymorphisms and somatic mutations.

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Abstract

本発明は、観測対象である核酸の濃度又は数密度が従来の光分析技術よりも低い試料溶液中の核酸の多型を識別する方法を提供する。すなわち、本発明は、蛍光物質により標識されており、かつ多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸とを含む試料溶液を調製し、当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる工程と、蛍光物質により標識されており、かつ第１の核酸プローブとは塩基配列が異なる第２の核酸プローブと、前記解析対象の核酸とを含む試料溶液を調製し、当該試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、各試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数及び第２の核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する工程と、算出結果に基づき、解析対象の核酸の多型を識別する工程と、を有する核酸分子の多型識別方法に係る。

Description

核酸分子の多型識別方法
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子多型のような、塩基配列が類似する核酸を識別する方法に関する。
　本願は、２０１１年１月２６日に日本国に出願された特願２０１１－０１４０６３号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。特に、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子解析では、検出感度に優れていることから、蛍光を用いた様々な手法が開発されている。
　ＦＲＥＴプローブを用いた核酸の識別方法の１つとして、例えば、５’末端側と３’末端側が互いに相補的な塩基配列を有しており、かつ両末端が蛍光物質と消光物質によってそれぞれラベルされている１本鎖核酸（分子ビーコンプローブ）を用いる、いわゆる分子ビーコン法がある（例えば、非特許文献１参照。）。分子ビーコンは、単独で存在している場合には、両末端が会合して分子内ループを形成しているため消光状態であるが、標的核酸分子とハイブリダイズすることにより、分子内ループが解消されて蛍光を発する。遺伝子多型のうちの特定の遺伝子型と特異的にハイブリダイズする分子ビーコンを用いることによって、遺伝子多型を識別することができる（例えば、非特許文献２参照。）。
　その他にも、蛍光性インターカレーターと蛍光プローブによるＦＲＥＴを用いて核酸を検出する方法がある（例えば、非特許文献３参照。）。蛍光物質で標識されている蛍光プローブが他の１本鎖核酸とハイブリダイズすると、形成された２本鎖核酸の塩基対間に蛍光性インターカレーターが入りこむ。この蛍光性インターカレーターと蛍光プローブを標識する蛍光物質との間に起こるＦＲＥＴを利用して、単独で存在している蛍光プローブと、２本鎖核酸を形成している蛍光プローブを識別することができる。この原理を利用して、例えば、遺伝子多型のうちの特定の遺伝子型と特異的にハイブリダイズするプローブと、別の遺伝子型と特異的にハイブリダイズするプローブとを、それぞれ異なる蛍光物質で標識し、それぞれの蛍光物質と蛍光性インターカレーターとの間に起こるＦＲＥＴを検出することにより、遺伝子多型を識別することができる（例えば、非特許文献４参照。）。
　一方で、近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となった。そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献５～７参照。）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域。コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子からの蛍光強度が測定される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報が取得されたり、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象が検出される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３参照。)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４参照。）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７では、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測して、フロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いる方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度かつ微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度である。）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料について分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなどのように検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 特許第４０２３５２３号公報 国際公開第２００８／０８０４１７号 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報
タャギ（Tyagi）、他１名、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature  Biotechnology）、１９９６年、第１４巻、第３０３～３０８ページ。 ジッセンドルフ（Giesendorf）、他５名、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９８年、第４４巻、第３号、４８２～４８６ページ。 ハウエル（Howell）、他２名、ゲノム・リサーチ（Genome Research）、２００２年、第１２巻、第１４０１～１４０７ページ。 タカツ（Takatsu）、他３名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid Research）、２００４年、第３２巻、第１９号、ｅ１５６。 金城政孝、「蛋白質 核酸 酵素」、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、「遺伝子医学」、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。観測対象物が微小領域内に計測時間中に稀にしか進入しない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるためである。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態で溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中でランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出することは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなると共に、複雑で高度な操作技術が実施者に要求されると考えられる。
　一方で、遺伝子多型を検出する対象となるゲノム試料は、臨床検査における検体等のように、微量である場合が多い。このため、試料中に非常に微量しか含有されていない核酸を識別する方法の開発が望まれている。一般的に、遺伝子型の識別は、特定の遺伝子型を特異的に認識する核酸プローブを用い、検査対象であるゲノムＤＮＡが当該核酸プローブと会合体を形成するか否かを調べることにより行われる。試料溶液中の核酸プローブとゲノムＤＮＡとの会合体の濃度が極薄い場合でも、当該会合体を高精度に検出可能な方法は、臨床検査に非常に有益である。
　しかしながら、例えば非特許文献２において実施されている遺伝子変異解析では、分子ビーコンを３００ｎＭで用いており、希薄な状態での計測とは言えない。
　また、非特許文献４においても、数十～数百ｎＭ程度の比較的高濃度の核酸について塩基配列の識別が行われている。このように、一般的に、ｐＭオーダーの比較的低濃度の核酸検体に対して多型を識別するには至っていない。
　かくして、本発明は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されているような統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、遺伝子多型等の多型配列を有する核酸を識別する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、多型配列のうちの１の型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて、当該核酸プローブとの会合体の形成の有無により試料中の核酸分子の多型を識別する方法において、互いに異なる塩基配列を有する２種類の標識された核酸プローブを用い、かつ、核酸プローブを含む会合体の検出を走査分子計数法を用いて行うことにより、試料中の解析対象の核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、精度よく多型を識別することができることを見出し、本発明を完成させた。
　ここで、走査分子計数法は、特願２０１０－０４４７１４に於いて、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。
　すなわち、本発明の核酸分子の多型識別方法は下記（１）～（１９）である。
（１）　（ａ）蛍光物質により標識されており、かつ多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する工程と、
により算出する工程と、
（ｄ）蛍光物質により標識されており、かつ前記第１の核酸プローブとは塩基配列が異なる第２の核酸プローブと、前記解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の、第２の核酸プローブを含む会合体の分子数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する工程と、
により算出する工程と、
（ｇ）前記工程（ｃ）及び（ｆ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する工程と、
を有することを特徴とする核酸分子の多型識別方法。
（２）　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とする前記（１）の核酸分子の多型識別方法。
（３）　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする前記（１）又は（２）の核酸分子の多型識別方法。
（４）　前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする前記（１）～（３）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（５）　前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする前記（１）～（４）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（６）　前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブの少なくとも一方は、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されており、
当該核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光であることを特徴とする前記（１）～（５）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（７）　前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
前記工程（ｃ）において、前記第１の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光であることを特徴とする前記（１）～（６）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（８）　前記工程（ｄ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
前記第２の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
前記工程（ｆ）において、前記第２の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第２の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光であることを特徴とする前記（１）～（７）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（９）　第１の核酸プローブを含む会合体から放出される光と、第２の核酸プローブを含む会合体から放出される光とが、互いに光学的特性が異なることを特徴とする前記（１）～（８）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１０）　前記工程（ａ）において、前記試料溶液に、前記多型配列のうちの前記第１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする前記（１）～（９）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１１）　前記第２の核酸プローブが、前記多型配列中の第２の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズすることを特徴とする前記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の核酸分子の多型識別方法、
（１２）　前記工程（ｄ）において、前記試料溶液に、前記多型配列のうちの前記第２の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする前記（１１）に記載の核酸分子の多型識別方法、
（１３）　前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行うことを特徴とする前記（１）～（１２）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１４）　前記第２の核酸プローブが、前記多型配列中の第２の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズし、
前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行い、
前記試料溶液に、前記第１の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子、及び前記第２の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする前記（１）～（９）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１５）　前記第２の核酸プローブが、前記第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子、又は前記１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズし、
前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行うことを特徴とする前記（１）～（１０）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１６）　前記工程（ｂ）又は（ｅ）を、
前記工程（ａ）又は（ｄ）において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることによって当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることによって当該試料溶液中の核酸分子を会合させることにより行うことを特徴とする前記（１）～（１５）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１７）　前記第１の核酸プローブ及び前記第２の核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されていることを特徴とする前記（１）～（１６）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１８）　前記多型配列が、遺伝子多型の多型部位を含む塩基配列、又は体細胞変異の変異部位を含む塩基配列であることを特徴とする前記（１）～（１７）のいずれかの核酸分子の多型識別方法。
（１９）　前記体細胞変異がＫ－ｒａｓ遺伝子の変異であることを特徴とする前記（１８）の核酸分子の多型識別方法。
　本発明の核酸分子の多型識別方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。このため、本発明の核酸分子の多型識別方法により、解析対象である多型配列を有する核酸分子が、試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、多型を識別することができる。
図１Ａは、走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 図１Ｂは、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 図１Ｃは、ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２Ａは、走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 図２Ｂは、走査分子計数法のための光分析技術により計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３Ａは、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ｂは、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図４Ａは、試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ｂは、試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 図５は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図６Ａは、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化を模式的に示した図である。 図６Ｂは、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 図７は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 多型と会合体の分子数によるクラスタリングの一例を模式的に示した図である。 参考例１において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 図１０Ａは、参考例２において、デコイ核酸を添加しなかった試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 図１０Ｂは、参考例２において、デコイ核酸を添加した試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例１において、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例２において、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 図１３Ａは、実施例３において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の計数されたピーク数の値を示した図である。 図１３Ｂは、実施例３において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、共通分子ビーコンプローブを含む会合体の計数されたピーク数の値を示した図である。 参考例３おいて、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した図である。 実施例４において、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子の変異率ごとに、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体及び野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数の値を示した図である。
　まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、測定時間も短い。しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能である。
　発光粒子は、観測対象となる粒子と発光プローブとが結合又は会合した粒子を意味する。「発光プローブ」とは、観測対象となる粒子に結合又は会合する性質を有し、且つ、光を発する物質（通常、分子又はそれらの凝集体）であり、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。本発明の核酸分子の多型識別方法において用いられる第１の核酸プローブ及び第２の核酸プローブは、発光プローブに相当する。
　本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出され、これにより、一つの粒子の存在が検出される（実験の態様によっては、発光プローブは、検出したい粒子と一旦結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出して、これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。このため、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成は必要ないため、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブ（１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合を含む。以下同様。）が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本発明の核酸分子の多型識別方法においては、第１の核酸プローブを含む会合体や、第２の核酸プローブを含む会合体）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、光検出領域に複数回出入りする場合には、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が１つの発光プローブから複数回検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し（具体的には、第１の核酸プローブを含む会合体や、第２の核酸プローブを含む会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動するように設定し）、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるため、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。さらに、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した各々の粒子を個別に検出するようになっているため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや、試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定、濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、第１の核酸プローブを含む会合体等を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本発明の核酸分子の多型識別方法によれば、試料溶液中のこれらの会合体の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、多型核酸を識別することが可能である。
　また、例えば、試料に流れを発生させる場合には、常に一様な流速を与えることは困難である上に装置構成が複雑となり、必要な試料量が大幅に増大する。更に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。これに対して、走査分子計数法では、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測できる。このため、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる粒子（本発明においては、第１の核酸プローブを含む会合体等）に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるため、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子が稀にしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が計測時間の一部にしか現れず、光強度のゆらぎを精度よく算定することが困難となる。また、観測対象粒子の濃度が、計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に充分な量の有意な光強度データを得るために、計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
　走査分子計数法の光分析技術において実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２Ａの如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０～ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるため、ＦＩＤＡ等では充分な精度で分析できないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度は蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出するため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定して濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できる。
　更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合に、或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出するため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定して濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できることとなる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるため、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるため、移動速度は、基本的に一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるため、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３Ｂの如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４Ａに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　 …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ 　　…（２）
となるため、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるため、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められるところ、具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２ ） 　　…（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。）。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
　図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、かかる時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は、確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数などは、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるため、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　 …（５）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ 　　…（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
＜核酸分子の多型識別方法＞
　本発明の核酸分子の多型識別方法は、多型配列のうちの特定の型（第１の型）の核酸分子と特異的に結合する核酸プローブと、当該核酸プローブとは塩基配列が異なる核酸プローブの少なくとも２種類の核酸プローブを用いて、各核酸プローブと解析対象の核酸分子とをそれぞれハイブリダイズさせ、形成された会合体の量に基づいて、解析対象の核酸分子の型を識別する方法である。さらに本発明においては、会合体の検出を、上記の走査分子計数法により測定する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、蛍光を有する粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の核酸分子に対しても測定が可能である。このため、本発明の核酸分子の多型識別方法により、試料溶液中の解析対象の核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、形成された会合体を高感度に計数することができる。
　本発明及び本願明細書において、「多型配列」とは、２以上の互いに類似する塩基配列が存在する塩基配列であり、多型配列を有する核酸分子を多型核酸という。ここで、「塩基配列が類似する」とは、例えば、１０～２０個中、１～数個の核酸塩基が置換、欠損、挿入、又は重複することにより相違していることを意味する。また、「多型を識別する」とは、多型配列中の特定の型の塩基配列を有する核酸分子と、当該多型配列中の当該特定の型以外の型の塩基配列を有する核酸分子とを区別することを意味する。
　本発明の核酸分子の多型識別方法において解析対象とされる多型配列は、一遺伝子多型（ＳＮＰ）等のような遺伝子上の塩基配列であってもよく、人工的な塩基配列であってもよい。本発明においては、先天的な多型である遺伝子多型の多型部位や、後天的に生ずる多型である体細胞変異の変異部位を識別することが好ましい。体細胞変異としては、Ｋ－ｒａｓ遺伝子の変異等が挙げられる。
　本発明において、「核酸プローブが、多型配列中の特定の型を有する１本鎖核酸分子と特異的に結合する」とは、当該核酸プローブが、当該多型配列を有する１本鎖核酸分子のうち、当該特定の型以外の型の１本鎖核酸分子よりも、当該特定の型の１本鎖核酸分子と優先的にハイブリダイズすることを意味する。このため、核酸プローブは、特定の型の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、多型配列間で塩基が異なる多型部位以外にミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　本発明においては、少なくとも、蛍光物質により標識されており、かつ多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブ（以下、第１核酸プローブ）と、蛍光物質により標識されており、かつ前記第１核酸プローブとは塩基配列が異なる第２の核酸プローブ（以下、第２核酸プローブ）との２種類の核酸プローブを用いる。
　例えば、野生型と変異型の２つの型が知られている一遺伝子多型を識別する場合には、変異型を第１の型とし、変異型の１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように第１核酸プローブを設計し、野生型の１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように第２核酸プローブを設計することにより、解析対象の核酸分子が変異型か野生型かを識別することができる。解析対象の核酸分子が変異型の場合には、第１核酸プローブと優先的に会合体を形成するため、第１核酸プローブを含む会合体の分子数のほうが、第２核酸プローブを含む会合体よりも有意に多くなる。
　また、変異型を第１の型とし、変異型の１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように第１核酸プローブを設計し、当該変異型（第１の型）の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように第２核酸プローブを設計することもできる。第２核酸プローブは、変異型の１本鎖核酸分子と、多型配列以外の領域において会合する。このため、試料溶液中に存在する解析対象の核酸分子が変異型の場合には、当該試料溶液に第１核酸プローブと第２核酸プローブの両方を添加し、以降に述べる工程（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）を行うことにより、当該試料溶液中に、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体が形成される。一方で、野生型の１本鎖核酸分子は、第１核酸プローブとは会合体を形成しないが、第２核酸プローブと会合する。このように設計された第２核酸プローブは、多型配列を有する核酸分子に多型配列以外の領域で結合するため、多型配列のうちの第１の型以外の遺伝子型を有する核酸分子とも会合体を形成するためである。つまり、解析対象の核酸分子が野生型の場合には、当該試料溶液には、第２核酸プローブを含む会合体は形成されるものの、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体は形成されない。したがって、試料溶液中に、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体が形成された場合には、解析対象の核酸分子は第１の型（この場合は、変異型）であり、第２核酸プローブは含むが第１核酸プローブは含まない会合体が形成された場合には、解析対象の核酸分子は、多型配列中の第１の型以外の型（この場合は、野生型）であると識別することができる。
　解析対象の核酸分子が、ゲノムＤＮＡのように２本鎖核酸分子を形成している場合には、第２核酸プローブを、前述のように、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように設計することもでき、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸分子（すなわち、多型配列を有する１本鎖核酸分子と会合する１本鎖核酸分子。以下、多型配列を有する１本鎖核酸分子の相補鎖ということがある。）と特異的にハイブリダイズするように設計することもできる。後者の場合にも、第２核酸プローブは、多型配列を有する１本鎖核酸分子の相補鎖と、多型核酸の間で塩基配列が共通する領域において会合する。つまり、第２核酸プローブは、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子の相補鎖と、会合体を形成する。このため、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子が、当該１本鎖核酸分子の相補鎖との２本鎖核酸分子（会合体）として存在している試料溶液中に、第１核酸プローブと第２核酸プローブの両方を添加し、以降に述べる工程（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）を行うことにより、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子は第１核酸プローブと会合し、当該１本鎖核酸分子の相補鎖は第２核酸プローブと会合する。一方で、解析対象の核酸分子が多型配列中の第１の型以外の型であった場合には、同様の処理によって、第２核酸プローブを含む会合体のみが形成され、第１核酸プローブを含む会合体は形成されない。したがって、試料溶液中に、第１核酸プローブを含む会合体と第２核酸プローブを含む会合体の両方が形成された場合には、解析対象の核酸分子は第１の型であり、第２核酸プローブを含む会合体は形成されたが、第１核酸プローブを含む会合体は形成されなかった場合には、解析対象の核酸分子は、多型配列中の第１の型以外の型であると識別することができる。
　第２核酸プローブを、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子の相補鎖と会合体を形成するように設計することにより、試料溶液中に存在する多型核酸中に占める、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子の割合を算出することができる。例えば、野生型と変異型の２型を有するＳＮＰを多型配列とし、変異型を第１の型とし、被験者のゲノムＤＮＡを含む試料溶液に対して本発明の核酸分子の多型識別方法を行った場合に、第１核酸プローブを含む会合体の数と、第２核酸プローブを含む会合体の数がほぼ等しかった場合には、当該被験者の遺伝子型は変異型ホモである、と識別することができる。第１核酸プローブを含む会合体の数が、第２核酸プローブを含む会合体の数よりも有意に少ない場合には、当該被験者の遺伝子型はヘテロであり、第１核酸プローブを含む会合体がほとんど検出されなかった場合には、当該被験者の遺伝子型は野生型ホモである、と識別することができる。
　また、第２核酸プローブを、多型配列の型に関わらず、多型配列を有する１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子の相補鎖と会合体を形成するように設計することにより、測定系の精度評価にも用いることができる。例えば、第２核酸プローブを含む会合体がほとんど検出されなかった場合には、用いた試料溶液中に、測定のために十分な量の多型核酸が含まれていないか、測定系が上手く機能していない可能性があり、信頼できる結果が得られていないことが示唆される。
　本発明においては、予め蛍光物質により標識された核酸プローブを用いて、核酸プローブと他の１本鎖核酸分子とにより形成された会合体を、蛍光を指標として走査分子計数法により測定する。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。また、核酸プローブの蛍光物質による標識は、常法により行うことができる。
　また、本発明においては、核酸プローブが単独で存在している状態と、他の１本鎖核酸分子と会合体を形成している状態とで蛍光強度を異ならせることにより、走査分子計数法において両者を区別して検出する。
　例えば、分子ビーコンプローブを、第１核酸プローブや第２核酸プローブとして用いることができる。分子ビーコンプローブは、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドであり、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）においてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質と、エネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させたプローブである。単独で存在している第１核酸プローブや第２核酸プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、第１核酸プローブや第２核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。
　第１核酸プローブや第２核酸プローブとして用いる分子ビーコンプローブとしては、多型配列の特定の型とハイブリダイズし得る塩基配列を有しており、かつ３’末端側の領域及び５’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成するものが好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、多型配列のうちの特定の型の核酸分子と特異的に結合する領域（例えば、多型配列と相補的な塩基配列からなる領域）を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的とする多型配列を有する核酸分子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
　第１核酸プローブを、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質を結合させた分子ビーコンプローブとした場合、第２核酸プローブは、第１核酸プローブと同種の２つの蛍光物質を結合させた分子ビーコンプローブとしてもよく、第１核酸プローブとは異なる組み合わせのエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質を結合させた分子ビーコンプローブとしてもよい。第２核酸プローブを標識するエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質を、第１核酸プローブとは異なる組み合わせとすることにより、第１核酸プローブを含む会合体から放出される光と、第２核酸プローブを含む会合体から放出される光の光学的特性を、互いに異なるようにし、放出される光によって、第１核酸プローブを含む会合体と第２核酸プローブを含む会合体とを区別して検出することができる。
　また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、当該蛍光性２本鎖核酸結合物質と核酸プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している核酸プローブと会合体とを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と核酸プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が当該ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している第１核酸プローブや第２核酸プローブからは、当該核酸プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、会合体には蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、会合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。
　２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。なお、会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、第１核酸プローブや第２核酸プローブを設計することが好ましい。
　蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こるＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質により第１核酸プローブを標識した場合、第２核酸プローブは、第１核酸プローブと同種の蛍光物質により標識してもよく、当該蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こるＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成るが、第１核酸プローブとは種類が異なる蛍光物質により標識してもよく、当該蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こるＦＲＥＴにおいてエネルギー・アクセプターと成る蛍光物質により標識してもよい。
　また、第１核酸プローブと第２核酸プローブのいずれか一方を分子ビーコンプローブとし、他方を、蛍光性２本鎖核酸結合物質とＦＲＥＴを起こす蛍光物質により標識されたプローブとしてもよい。
　その他、第２核酸プローブを、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子と、第１の核酸プローブと隣接する状態で特異的にハイブリダイズするように設計し、かつ第１核酸プローブを標識している蛍光物質と、第２核酸プローブを標識している蛍光物質とのいずれか一方が、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が当該ＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質とすることもできる。この場合、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子に、第１核酸プローブと第２核酸プローブは互いに隣接してハイブリダイズするため、これら３者からなる会合体では、第１核酸プローブを標識している蛍光物質と第２核酸プローブを標識している蛍光物質との間にＦＲＥＴが起こる。このため、当該ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体を検出することができる。
　本発明において用いられる第１核酸プローブ及び第２核酸プローブは、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。また、解析対象とする核酸も、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。
　本発明の核酸分子の多型識別方法は、具体的には、下記の工程を有する。
（ａ）蛍光物質により標識されており、かつ多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブ（第１核酸プローブ）と、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する工程と、
（ｄ）蛍光物質により標識されており、かつ前記第１核酸プローブとは塩基配列が異なる第２の核酸プローブ（第２核酸プローブ）と、前記解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の、第２核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する工程と、
（ｇ）前記工程（ｃ）及び（ｆ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する工程。
　まず、工程（ａ）として、第１核酸プローブと解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する。具体的には、第１核酸プローブと解析対象の核酸分子を適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。該溶媒は、第１核酸プローブから放出される蛍光の検出、及び、走査分子計数法による会合体の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる。試料溶液中の核酸分子が２本鎖核酸分子である場合には、会合させる前に、変性させることが好ましい。本発明において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、核酸プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、核酸分子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該核酸プローブを含む会合体を形成することができる場合がある。
　本発明においては、蛍光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該試料溶液を、高温処理をすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、核酸分子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該試料溶液の温度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該試料溶液の塩濃度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。
　なお、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と核酸プローブとからなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、第１核酸プローブと第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した第１核酸プローブと第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　第１核酸プローブと、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、第１核酸プローブの塩基配列情報から、第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。本発明においては、好ましくは、試料溶液の温度を、第１核酸プローブ中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体を形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を、０．０５℃／秒またはそれより遅い降温速度で低下させることができる。
　その後、工程（ｃ）として、試料溶液中の、第１核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する。具体的には、会合体を形成させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、会合体から放出される蛍光を検出し解析することにより、会合体の分子数を算出する。
　なお、走査分子計数法による会合体の検出を、多型配列を有する核酸分子と核酸プローブとが特異的にハイブリダイズし得る温度よりも低い温度で行う場合には、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、解析対象の多型配列のうち、核酸プローブが特異的にハイブリダイズする型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加しておくことが好ましい。その他の型を有する核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが過剰量存在していることにより、添加した核酸プローブとその他の型の核酸分子との非特異的なハイブリダイゼーションを効果的に抑制することができる。例えば、野生型と変異型とが有る体細胞変異を識別するために、第１の型を変異型とした場合には、第１核酸プローブを添加した試料溶液には、野生型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加することが好ましい。同様に、第２核酸プローブを、野生型の１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように設計した場合には、第２核酸プローブを添加した試料溶液には、変異型の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加することが好ましい。なお、当該オリゴヌクレオチドは、会合体形成前に試料溶液に添加されていればよく、第１核酸プローブや第２核酸プローブとともに試料溶液に添加してもよく、変性処理を行う場合には、変性後に添加してもよい。
　その他、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
　工程（ｄ）～（ｆ）は、第１核酸プローブに代えて第２核酸プローブを用いた以外は、前記工程（ａ）～（ｃ）と同様にして行うことができる。なお、解析対象の多型配列に、３種以上の型が存在している場合には、第１の型及び第２の型以外の型に対しても、それぞれ、各型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的に結合する核酸プローブを用いて前記工程（ａ）～（ｃ）と同様に行うことにより、全ての型を識別することができる。
　工程（ａ）～（ｃ）と工程（ｄ）～（ｆ）は、実質的に同時に行ってもよく、別個独立に行ってもよい。例えば、第１核酸プローブと解析対象の核酸分子とを添加した試料溶液と、第２核酸プローブと解析対象の核酸分子とを添加した試料溶液とを調製した後、両試料溶液の温度を同時に上昇させた後、徐々に低下させることにより、溶液内の核酸分子の会合体形成を同時に行った後、各試料溶液を光分析装置に設置し、順次、解析することができる。
　その他、前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行うこともできる。具体的には、一の試料溶液に、第１核酸プローブと第２核酸プローブと解析対象の核酸分子とを添加した試料溶液を調製した後、当該試料溶液中の核酸分子を会合させる。その後、当該試料溶液中の、第１核酸プローブを含む会合体の分子数及び第２核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する。
　特に、第２核酸プローブを、第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子、又は当該１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズするように設計した場合には、一の試料溶液に、第１核酸プローブと第２核酸プローブと解析対象の核酸分子とを添加した試料溶液を調製した後、当該試料溶液中の核酸分子を会合させる。その後、当該試料溶液中の、第１核酸プローブ及び第２核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する。
　最後に工程（ｇ）として、第１核酸プローブを含む会合体の分子数の計数結果と、第２核酸プローブを含む会合体を含む分子数の計数結果とに基づいて、解析対象の核酸分子が、解析対象の多型のうちの第１の型であったのか、その他の型（例えば、第２の型）であったのかを識別する。
　例えば、一塩基多型を識別する場合には、解析対象の核酸分子に代えて多型配列が既知である対照用１本鎖核酸分子を用いて、野生型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする野生型プローブ（Ｗｔプローブ）を添加した場合に形成された野生型プローブを含む会合体の分子数と、変異型の核酸分子と特異的にハイブリダイズする変異型プローブ（Ｍｔプローブ）を添加した場合に形成された変異型プローブを含む会合体の分子数とを算出する。対照用１本鎖核酸分子として、野生型の核酸分子、変異型の核酸分子、又は野生型の核酸分子と変異型の核酸分子を等モル量ずつ混合したものをそれぞれ用い、さらにネガティブコントロールとして核酸プローブのみを添加する。各測定の結果から、対照用１本鎖核酸分子の多型と会合体の分子数との関係をクラスタリングするために必要な情報を得ることができる。
　図８に、多型と会合体の分子数によるクラスタリングの一例を模式的に示す。核酸プローブのみを添加した試料溶液では、野生型プローブを含む会合体と変異型プローブを含む会合体のいずれも少ない（図８中、クラスター１）。これに対して、野生型の核酸分子を添加した試料溶液では、野生型プローブを含む会合体の分子数が、変異型プローブを含む会合体の分子数よりも明らかに多くなる（図８中、クラスター２）。逆に、変異型の核酸分子を添加した試料溶液では、変異型プローブを含む会合体の分子数が、野生型プローブを含む会合体の分子数よりも明らかに多くなる（図８中、クラスター３）。野生型の核酸分子と変異型の核酸分子を等モル量ずつ混合したものを添加した試料溶液では、野生型プローブを含む会合体の分子数と変異型プローブを含む会合体の分子数とは両方とも多くなる（図８中、クラスター４）。クラスタリングの結果と、解析対象の核酸分子を添加した場合の結果とを比較し、解析対象の核酸分子がどの多型に当てはまるかを識別することができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　１種類の分子ビーコンプローブを用いて、走査分子計数法により、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別可能であることを検証した。
　変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブとして、５’末端にＴＡＭＲＡが付加され、３’末端にＢＨＱ－２が付加された表１に記載の塩基配列（配列番号１）を有する核酸分子を用いた。また、解析対象の核酸分子として、同じく表１に記載の塩基配列を有する野生型（ＧＧＴ）核酸（配列番号２）のみ（変異率：０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を９：１のモル比で混合したもの（変異率：１０％）、及び変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（変異率：１００％）用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、野生型（ＧＧＴ）核酸と相補的な塩基配列を有する非蛍光標識プローブ（野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸）（配列番号４）を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。表１中、右欄には配列番号を示す。また、表１中、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。さらに、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、試料溶液を調製した。
　調製された試料溶液を、９５℃で５分間加熱することにより変性させた後、２０℃まで徐々に液温を低下させて会合体を形成させた。具体的には、降温速度を０．１℃／秒とし、９０℃で５分間、８０℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、４０℃で１０分間、３０℃で１０分間の降温処理を行った。
　降温処理後の試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０～６２０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。また測定は各試料５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９５
を満たすピーク信号のみを観測対象核酸分子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象核酸分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
　図９に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、ＧＴＴ変異率依存的にピーク数が増加していることから、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブがＧＴＴ変異配列特異的にハイブリダイゼーションしていることが確認された。
［参考例２］
　試料溶液中に、核酸プローブが特異的に結合する型以外の型の多型配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することによる、当該核酸プローブを含む会合体の検出精度を調べた。
　具体的には、参考例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、１μＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しない以外は同様にして、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有しない試料溶液を調製した。
　これらの試料溶液に対して、参考例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、参考例１と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数を計数した。
　図１０に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。図１０Ａは野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しなかった試料溶液の、図１０Ｂは野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加した試料溶液の結果である。この結果、図１０Ａに示すように、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸非存在下では、変異率が０％のときにピーク数がすでに増加していた。これは、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブが野生型（ＧＧＴ）核酸にも非特異的にハイブリダイゼーションしたことを示唆している。一方、図１０Ｂに示すように、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸存在下では、変異率依存的にピーク数が増加したことから、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブが変異型（ＧＴＴ）核酸に特異的にハイブリダイゼーションしたことを示唆している。これらの結果から、デコイ核酸を試料溶液中に添加することにより、分子ビーコンプローブの非特異的なハイブリダイゼーションを抑制できることが明らかである。
［実施例１］　
　参考例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブとを用いて、各遺伝子型を識別した。
　野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブとして、５’末端にＴＡＭＲＡが付加され、３’末端にＢＨＱ－２が付加された表２に記載の塩基配列（配列番号５）を有する核酸分子を用いた。
　また、解析対象の核酸分子として、参考例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸のみ（変異率：０％）、変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（ＧＴＴ変異率：１００％）に加えて、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸を１：１のモル比で混合したもの（ＧＴＴ変異率：５０％）を用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、参考例１で用いた野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸と、変異型（ＧＴＴ）核酸と相補的な塩基配列を有する非蛍光標識プローブ（変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸）（配列番号６）を用いた。表２に、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸の配列を示す。表２中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基であり、下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。
　一方、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭとなるように、前記トリス緩衝液に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。
　これらの試料溶液に対して、それぞれ、参考例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、参考例１と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数及び野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数をそれぞれ計数した。
　図１１に、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＴＴ）」）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＧＴ）」）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、解析対象の核酸分子が存在していなかった対照用試料溶液（図中、「Ｎ．Ｃ．」）では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数と野生型（ＧＧＴ）ピーク数のいずれも非常に少なかった。一方で、ＧＴＴ変異率０％の試料溶液（図中、「０％」）では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は非常に多かった。逆に、ＧＴＴ変異率１００％の試料溶液（図中、「１００％」）では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は非常に多かった。これに対して、ＧＴＴ変異率５０％の試料溶液（図中、「５０％」）では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数のいずれも多かった。このように、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数から、ＧＴＴ変異率の異なる３種類の試料溶液は、互いに区別することができた。これらの結果から、本発明の核酸分子の多型識別方法を用いて遺伝子変異を識別することにより、解析対象の核酸分子を、変異率ごとに識別可能であること、特に、一塩基多型等の解析において、解析対象のゲノムＤＮＡの遺伝子型が、野生型ホモなのか、ヘテロなのか、変異型ホモなのかを、容易にタイピング可能であることがわかった。
［実施例２］　
　本発明の核酸分子の多型識別方法において、工程（ａ）と工程（ｄ）を一の試料溶液中で行うことにより、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
　変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブとして、表１に記載の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブと同じ塩基配列（配列番号１）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎを付加し、３’末端にＢＨＱ－３を付加したものを用いた。野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、及び解析対象の核酸分子は、実施例１で用いたものを用いた。また、表３に記載されている野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸（配列番号７）及び変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸（配列番号８）を用いた。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸、及び変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｎＭ（野生型と変異型を合計した濃度）、５００ｎＭ、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより試料溶液を調製した。また、解析対象の核酸分子を添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。
　これらの試料溶液に対して、それぞれ、参考例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後に会合体を形成した。降温処理後の試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、ＴＡＭＲＡ標識された野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを励起するために、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６５～５９５ｎｍとした。ＡＴＴＯ６４７Ｎ標識された変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを励起するために、励起光は６３３ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６５０～６９０ｎｍとした。それ以外は、実施例１と同様の条件で走査分子計数法にて計測を行い、解析を行った。
　図１２に、縦軸を変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（変異型（ＧＴＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＴＴ）」）、横軸を野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数（野生型（ＧＧＴ）ピーク数）（図中、「ピーク数（ＧＧＴ）」）として、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中の変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、解析対象の核酸分子が存在していなかった対照用試料溶液では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数と野生型（ＧＧＴ）ピーク数のいずれも非常に少なかった。一方で、ＧＴＴ変異率０％の試料溶液では、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は非常に多かった。逆に、ＧＴＴ変異率１００％の試料溶液では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数は対照用試料溶液とほぼ同程度しかなかったが、変異型（ＧＴＴ）ピーク数は非常に多かった。これに対して、ＧＴＴ変異率５０％の試料溶液では、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数のいずれも多かった。このように、本実施例においても、実施例１の場合と同様に、野生型（ＧＧＴ）ピーク数と変異型（ＧＴＴ）ピーク数から、ＧＴＴ変異率の異なる３種類の試料溶液は、互いに区別することができた。これらの結果から、本発明の核酸分子の多型識別方法において、工程（ａ）と工程（ｄ）を別個の試料溶液中で行った実施例１と同様に、工程（ａ）と工程（ｄ）を一の試料溶液中で行った場合でも、解析対象の核酸分子を、変異率ごとに識別可能であることが明らかである。
［実施例３］　　
　第２核酸プローブとして、第１核酸プローブとは異なる塩基配列を有し、かつ、解析対象の多型配列からなる多型部位を認識しない核酸プローブを用いて、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
　具体的には、第２核酸プローブとして、Ｋ－ｒａｓ遺伝子中の領域であって、コドン１２を含まず、野生型と変異型に共通する領域の塩基配列（共通配列）（配列番号９）と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１０）に対して、５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎを付加し、３’末端にＢＨＱ－３を付加した共通分子ビーコンプローブを用いた。また、前記共通配列からなるオリゴヌクレオチドを、共通核酸として用いた。表４に、共通分子ビーコンプローブ及び共通配列の塩基配列を示す。表４中、右欄には配列番号を示す。また、共通分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その他、第１核酸プローブとして、参考例１で用いた変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを用いた。また、解析対象の核酸分子として、参考例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸のみ（変異率：０％）、変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（ＧＴＴ変異率：１００％）を用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、参考例１で用いた野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を用いた。なお、本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。
　具体的には、変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブ、共通分子ビーコンプローブ、野生型（ＧＧＴ）核酸又は変異型（ＧＴＴ）核酸、共通核酸、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、試料溶液を調製した。また、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸のいずれも添加しなかった以外は同様にして対照用試料溶液を調製した。
　これらの試料溶液に対して、それぞれ、参考例１と同様に、液温を上昇及び下降させて試料溶液中の核酸分子を変性させた後会合体を形成し、さらに、実施例２と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数及び野生型（ＧＧＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の分子数をそれぞれ計数した。
　図１３に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子中のＧＴＴ変異率ごとに、計数されたピーク数の値を示した。図１３Ａは変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の計数結果であり、図１３Ｂは共通分子ビーコンプローブを含む会合体の計数結果である。５４３ｎｍで励起してＴＡＭＲＡの蛍光を検出した場合、変異率０％（野生型（ＧＧＴ）核酸のみ添加）と変異率１００％（変異型（ＧＴＴ）核酸のみ添加）とで、計数された変異型（ＧＴＴ）分子ビーコンプローブを含む会合体の数に有意に差が出ており、両者を識別できた。また、６３３ｎｍで励起してＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光を検出した場合、変異率０％と変異率１００％は、解析対象の核酸分子を添加しなかった対照試料溶液（図中、「Ｎ．Ｃ．」）の結果と比べて有意に差が出ていた。
　本実施例では、野生型（ＧＧＴ）核酸や変異型（ＧＴＴ）核酸とは別個に、共通核酸を試料溶液中へ添加したが、解析対象の核酸分子がゲノムＤＮＡである場合や、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ等によって増幅したＤＮＡである場合には、共通配列及び多型配列は、同一の１本鎖核酸分子又は当該１本鎖核酸分子の相補鎖上に存在している。このため、本実施例のように、第２核酸プローブを、多型核酸間で共通する領域にハイブリダイズするプローブとした場合には、当該第２核酸プローブを含む会合体の有無により、試料溶液中に解析対象の多型配列を含む核酸分子が存在しているか否かを確認することができる。また、第２核酸プローブを含む会合体の検出量により、ＰＣＲの増幅量のばらつきによる核酸分子の量を補正し、多型識別の精度を向上することができる。
［参考例３］
　１種類の核酸プローブと蛍光性インターカレーターを用いて、走査分子計数法により、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別可能であることを検証した。
　変異型（ＧＴＴ）プローブとして、５’末端にＲＯＸが付加された表５に記載の塩基配列（配列番号１１）を有する核酸分子を用いた。表５中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。さらに、解析対象の核酸として、参考例１で用いた野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸を、それぞれ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　具体的には、変異型（ＧＴＴ）プローブ、野生型（ＧＧＴ）核酸又は変異型（ＧＴＴ）核酸、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しない以外は同様にして、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有しない試料溶液を調製した。
　調製された試料溶液を、９４℃で５分間加熱することにより変性させた後、０．１℃／秒で降温させ、６８．８℃で５分間恒温処理させて会合体を形成させた。
　これらの濃縮試料溶液に、それぞれ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を前記トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液を添加し、当該濃縮試料溶液の１０倍希釈を調製し、これらの試料溶液とした。
　これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。
　その後、試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて、回転速度６，０００ｒｐｍ、１００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０～６２０ｎｍとした。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルを、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。
　測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を加えた試料溶液と加えない試料とで得られるピーク数を比較した。
　図１４に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子ごとに、計数されたピーク数の値を示した。この結果、変異型（ＧＴＴ）核酸を添加した試料溶液（図中、「ＧＴＴ核酸」）では、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸の添加の有無によるピーク数にあまり相違はなかったが、野生型（ＧＧＴ）核酸を添加した試料溶液（図中、「ＧＧＴ核酸」）では、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加した試料溶液よりも、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を添加しなかった試料溶液のほうが、ピーク数が明らかに多かった。この結果は、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸が野生型（ＧＧＴ）核酸と特異的に結合したことにより、変異型（ＧＴＴ）プローブとが野生型（ＧＧＴ）核酸との非特異的な結合を阻害し、配列特異的な結合が促されたためと考えられる。すなわち、これらの結果から、多型配列のうちの、核酸プローブが特異的に結合する型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を試料溶液に添加することにより、核酸プローブの識別精度を向上させられることが明らかである。
［実施例４］　
　参考例３で用いた変異型（ＧＴＴ）プローブと、野生型（ＧＧＴ）プローブと、蛍光性インターカレーターを用いて、走査分子計数法により、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のコドン１２＿ＧＴＴ変異を識別した。
　野生型（ＧＧＴ）プローブとして、５’末端にＲＯＸが付加された表６に記載の塩基配列（配列番号１２）を有する核酸分子を用いた。表６中、右欄には配列番号を示し、太字の塩基が変異（多型）部位又は変異部位と塩基対を形成する塩基である。また、解析対象の核酸分子として、表１に記載の塩基配列を有する野生型（ＧＧＴ）核酸（配列番号２）のみ（変異率：０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を９：１のモル比で混合したもの（変異率：１０％）、野生型（ＧＧＴ）核酸と変異型（ＧＴＴ）核酸（配列番号３）を１：１のモル比で混合したもの（変異率：５０％）、及び変異型（ＧＴＴ）核酸のみ（変異率：１００％）用いた。さらに、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、実施例１で用いた変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　具体的には、変異型（ＧＴＴ）プローブ、解析対象の核酸分子、野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解することにより、変異型（ＧＴＴ）プローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。一方、野生型（ＧＧＴ）プローブ、解析対象の核酸分子、変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を、それぞれ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭとなるように、前記トリス緩衝液に溶解することにより、野生型（ＧＧＴ）プローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液を調製した。
　調製された試料溶液を、９４℃で５分間加熱することにより変性させた後、０．１℃／秒で降温させ、６８．８℃で５分間恒温処理させて会合体を形成させた。
　これらの濃縮試料溶液に、それぞれ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を前記トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液を添加し、当該濃縮試料溶液の１０倍希釈を調製し、これらの試料溶液とした。
　これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。
　これらの試料溶液に対して、参考例３と同じ条件で、当該試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体又は野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の分子数を計数した。図１５に、試料溶液に添加した解析対象の核酸分子の変異率ごとに、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数（図中、「ＧＴＴプローブ」）及び野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体の計数されたピーク数（図中、「ＧＧＴプローブ」）の値を示した。この結果、変異型（ＧＴＴ）プローブと野生型（ＧＧＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液では、変異率が高いほど（すなわち、試料溶液中の変異型（ＧＴＴ）核酸濃度が高いほど）、得られるピーク数が多くなり、変異型（ＧＴＴ）プローブを含む会合体量が多くなることがわかった。同様に、野生型（ＧＧＴ）プローブと変異型（ＧＴＴ）デコイ核酸を含有する試料溶液では、変異率が低いほど（すなわち、試料溶液中の野生型（ＧＧＴ）核酸濃度が高いほど）、得られるピーク数が多くなり、野生型（ＧＧＴ）プローブを含む会合体量が多くなることがわかった。これらの結果から、本発明の核酸分子の多型識別方法により、一塩基のみ異なる極めて類似した核酸分子であるにも関わらず、多型の識別できることが明らかである。
［参考例４］
　核酸プローブと蛍光性インターカレーターを用いて、当該核酸プローブを含む会合体を走査分子計数法により計数する場合における、会合体中の２本鎖構造の塩基対長が与える影響を調べた。
　まず、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型とし、５’末端をＲｏｘで修飾したオリゴヌクレオチド、非標識のオリゴヌクレオチド、及びＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、１００ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐ、８００ｂｐ、及び１．５ｋｂｐの鎖長の異なるＰＣＲ産物を調製した。これらのＰＣＲ産物からＷｉｚａｒｄ　Ｖ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ社製)を用いてプライマー除去し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いた電気泳動により、ＰＣＲ産物の有無及び濃度を測定した。これらのＰＣＲ産物（蛍光標識）は、５’末端がＲｏｘで標識された１本鎖核酸分子と、非標識の１本鎖核酸分子との会合体である。
　上記で用いた５’末端をＲｏｘで修飾したオリゴヌクレオチドに代えて、５’末端が修飾されていないオリゴヌクレオチドを用いた以外は、上記と同様にして、非標識の１本鎖核酸分子同士の会合体であるＰＣＲ産物（非標識）を得た。
　その後、トリス緩衝液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、各ＰＣＲ産物が１００ｐＭとなるように調製した。この調製されたＰＣＲ産物の溶液を、前記トリス緩衝液で１００００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)溶液に任意の濃度で加え、試料溶液とした。
　これらの試料溶液を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ希釈液添加後３０分間以上放置した。
　その後、試料溶液中のＰＣＲ産物の分子数を、参考例３と同じ条件で、走査分子計数法により計数した。この結果、ＰＣＲ産物の鎖長によって、蛍光標識されたＰＣＲ産物から測定されたピーク数と、非標識のＰＣＲ産物から測定されたピーク数との間に差が生じた。ＰＣＲ産物の鎖長が長くなるに連れ、得られるピーク数差が小さくなっていた。この結果は、鎖長が長いほどインターカレーターのパルス強度が強まり、本来のインターカレーターの蛍光波長より長波長領域でも非特異的なシグナルとしてピークが発生することによると考えられる。逆に言えば、鎖長が短い方が、非特異的なシグナルが少ない事となる。これらの結果より、およそ４００ｂｐ程度の鎖長以下であれば、充分な非特異シグナルの低減が成されていると見ることができる。
　本発明の核酸分子の多型識別方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない多型核酸を、蛍光標識された核酸プローブを用いて識別し、走査分子計数法により計数することができるため、遺伝子多型や体細胞変異等を識別するような臨床検査等の分野で利用が可能である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

Claims (19)

  1. 　（ａ）蛍光物質により標識されており、かつ多型配列中の第１の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の核酸プローブと、解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、第１の核酸プローブを含む会合体の分子数を、
    共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する工程と、
    前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程と、
    前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する工程と、
    により算出する工程と、
    （ｄ）蛍光物質により標識されており、かつ前記第１の核酸プローブとは塩基配列が異なる第２の核酸プローブと、前記解析対象の核酸分子とを含む試料溶液を調製する工程と、
    （ｅ）前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる工程と、
    （ｆ）前記工程（ｅ）の後、前記工程（ｄ）において調製された試料溶液中の、第２の核酸プローブを含む会合体の分子数を、
    共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する工程と、
    前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程と、
    前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する工程と、
    により算出する工程と、
    （ｇ）前記工程（ｃ）及び（ｆ）の結果に基づき、前記解析対象の核酸分子の多型を識別する工程と、
    を有することを特徴とする核酸分子の多型識別方法。
  2. 　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子の多型識別方法。
  3. 　前記光検出領域の位置を移動する工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子の多型識別方法。
  4. 　前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  5. 　前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  6. 　前記第１の核酸プローブと前記第２の核酸プローブの少なくとも一方は、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されており、
    当該核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光であることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  7. 　前記工程（ａ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
    前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
    前記工程（ｃ）において、前記第１の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第１の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光であることを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  8. 　前記工程（ｄ）において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
    前記第２の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、
    前記工程（ｆ）において、前記第２の核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記第２の核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光であることを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  9. 　第１の核酸プローブを含む会合体から放出される光と、第２の核酸プローブを含む会合体から放出される光とが、互いに光学的特性が異なることを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  10. 　前記工程（ａ）において、前記試料溶液に、前記多型配列のうちの前記第１の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  11. 　前記第２の核酸プローブが、前記多型配列中の第２の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  12. 　前記工程（ｄ）において、前記試料溶液に、前記多型配列のうちの前記第２の型以外の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする請求項１１に記載の核酸分子の多型識別方法。
  13. 　前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行うことを特徴とする請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  14. 　前記第２の核酸プローブが、前記多型配列中の第２の型の塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズし、
    前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行い、
    前記試料溶液に、前記第１の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子、及び前記第２の型の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を添加することを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  15. 　前記第２の核酸プローブが、前記第１の型の塩基配列を含む１本鎖核酸分子、又は前記１本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸分子と特異的にハイブリダイズし、
    前記工程（ａ）及び（ｄ）を一の試料溶液中で行うことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  16. 　前記工程（ｂ）又は（ｅ）を、
    前記工程（ａ）又は（ｄ）において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることによって当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることによって当該試料溶液中の核酸分子を会合させることにより行うことを特徴とする請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  17. 　前記第１の核酸プローブ及び前記第２の核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されていることを特徴とする請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  18. 　前記多型配列が、遺伝子多型の多型部位を含む塩基配列、又は体細胞変異の変異部位を含む塩基配列であることを特徴とする請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸分子の多型識別方法。
  19. 　前記体細胞変異がＫ－ｒａｓ遺伝子の変異であることを特徴とする請求項１８に記載の核酸分子の多型識別方法。
     
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