WO2012144485A1 - 生体試料中の核酸分子の検出方法 - Google Patents

生体試料中の核酸分子の検出方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid molecule in a biological sample using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the fluorescence correlation spectroscopic analysis is based on the average residence time (translational diffusion time) of fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity and the average value of the number of staying molecules. Information on the speed or magnitude of movement of fluorescent molecules, etc., and concentration is acquired.
  • the fluorescence correlation spectroscopic analysis is based on the average residence time and the average number of staying molecules such as the above-described fluorescent molecules, and the like, such as changes in the structure or size of molecules, binding / dissociation reactions or dispersion / aggregation of molecules. Detect various phenomena. Fluorescence-Intensity Distribution Analysis (FIDA, for example, Patent Document 3) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 4) are measured in the same manner as FCS. A histogram of fluorescence intensities of fluorescent molecules entering and leaving the volume is generated.
  • FIDA Fluorescence-Intensity Distribution Analysis
  • PCH Photon Counting Histogram
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique to determine the presence of fluorescent fine particles in the flow or on the substrate.
  • a signal arithmetic processing technique for detection is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method.
  • the amount used may be about several tens of microliters at a time.
  • the measurement time is also greatly reduced (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). Therefore, these technologies are expected to be powerful tools that can be used for experiments or inspections at low cost or quickly compared to conventional biochemical methods, for example, in the following cases. : ⁇ When analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development. ⁇ When the number of specimens is large, such as clinical diagnosis of diseases and screening of physiologically active substances.
  • a method for detecting a nucleic acid having a specific base sequence a number of methods for examining a nucleic acid base sequence using artificially synthesized short oligonucleotides such as probes and primers have been reported.
  • a biological sample is generally a very small amount, such as a specimen in a clinical test. Therefore, when analyzing a nucleic acid in a biological sample, the nucleic acid contained in the biological sample is amplified after using a general molecular biological technique such as PCR, or simultaneously with the amplification. Methods for detecting nucleic acids are widely used.
  • Patent Document 8 discloses that a nucleic acid is extracted from a biological sample by a nucleic acid recovery method using magnetic particles, and then the target nucleic acid is extracted from the extracted nucleic acid using a general molecular biological technique such as a nucleic acid amplification method. A method for detecting a nucleic acid is disclosed.
  • Patent Document 9 discloses that after coagulating blood, the obtained serum is subjected to nucleic acid amplification treatment to remove an inhibitory substance for nucleic acid amplification reaction contained in the blood, and the target nucleic acid Has been disclosed.
  • Patent Document 10 discloses a method for detecting a target nucleic acid by performing a nucleic acid amplification process on a sample after the blood is diluted and heated.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the optical analysis technique described above, the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is measured once in the order of seconds in the equilibrium state.
  • the number of fluorescent molecules that can be statistically processed is prepared so as to enter and exit the minute region.
  • the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level capable of statistical processing (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the observation target is measured in a minute region. A state that rarely enters in time occurs, and in the fluorescence intensity measurement result, a state where the observation target is not present in the minute region is included for a long period of time, and significant fluorescence The amount of intensity observation decreases.
  • the optical analysis technique based on the statistical fluctuation of the fluorescence intensity as described above cannot obtain a significant or accurate analysis result.
  • Patent Documents 5 and 6 In the method for detecting a fluorescent substance using an optical system of a confocal microscope described in Patent Documents 5 and 6, the frequency of a fluorescent signal having a significant intensity without performing the statistical processing related to the fluctuation of the fluorescent intensity as described above. And the number of particles such as fluorescent molecules in the sample is disclosed. This is because the presence / absence of a fluorescent molecule or the like to be observed in the sample can be specified by the presence / absence of generation of a fluorescent signal having a significant intensity during a measurement time of several seconds. In particular, Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • Patent Document 7 is a technique for individually detecting the presence of fluorescent fine particles in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate, and in a normal state in a sample solution. It is not a technique for detecting dissolved or dispersed particles such as molecules or colloids.
  • Patent Document 7 since the technique described in Patent Document 7 is not a technique for detecting particles moving randomly in a sample solution, the concentration or number density of particles dissolved or dispersed in the sample solution is determined. Quantitative calculation has not been achieved. Moreover, the technique of patent document 7 includes processes, such as the measurement in a flow cytometer, or the fixation process of the fluorescent particle on a board
  • the target nucleic acid can be detected directly from a biological sample containing only a very small amount of the target nucleic acid to be detected without performing a nucleic acid amplification reaction in advance. Be expected. However, among the impurities contained in the biological sample together with the nucleic acid, there is a substance having autofluorescence. For this reason, when it is going to detect the nucleic acid in a biological sample directly with an optical analysis technique, there exists a subject that a nonspecific signal generate
  • the presence of contaminants that hinder optical measurement is a greater challenge as the detection sensitivity of optical analysis techniques increases. That is, when the target nucleic acid is detected from a sample derived from a living body such as blood or tissue using a highly sensitive optical analysis technique, the concentration of only the measurement target is accurately determined due to impurities other than the measurement target. It is very difficult to measure.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting nucleic acid molecules in a biological sample containing a wide variety of substances.
  • the method provided by the present invention uses a novel optical analysis technique.
  • This new optical analysis technique does not include statistical processing as is done in optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH. Therefore, it is possible to detect the state or characteristics of the observation target particles in the sample solution whose concentration or number density of the observation target particles is lower than the level handled by those optical analysis techniques.
  • the novel optical analysis technique used by the detection method provided by the present invention has the following characteristics. That is, as a method for detecting a nucleic acid, there is a method for detecting a nucleic acid molecule in a biological sample by using a nucleic acid probe that specifically hybridizes with the nucleic acid molecule, based on the presence or absence of an association with the nucleic acid probe. . In this method, the detection of aggregates including nucleic acid probes is performed using a scanning molecule counting method, so that even when the concentration of nucleic acid molecules to be analyzed in a sample is very low, nucleic acid molecules can be detected with high sensitivity. Can be detected.
  • the nucleic acid molecule can be detected with high accuracy by removing contaminants derived from the biological sample in advance before detecting the aggregate containing the nucleic acid probe.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed by the applicant of the present application in Japanese Patent Application No. 2010-044714.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule according to the first aspect of the present invention includes a preparing step, an associating step, and a calculating step.
  • the preparing step prepares a sample solution including a nucleic acid probe that specifically hybridizes with a nucleic acid molecule to be analyzed and a biological sample.
  • the nucleic acid molecule in the sample solution prepared in the preparing step is associated with the nucleic acid probe.
  • the calculating step after the associating step, the number of molecules of the aggregate including the nucleic acid probe in the sample solution prepared in the preparing step is calculated.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule includes a step of moving the position of the light detection region, a step of detecting fluorescence, a step of individually detecting aggregates, and a step of counting. Removing.
  • the step of moving the position of the light detection region moves the position of the light detection region of the optical system of the confocal microscope or multiphoton microscope in the sample solution in the calculating step.
  • the fluorescence emitted from the aggregate in the light detection region is detected while moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution.
  • the optical signals from the individual aggregates are individually detected from the detected light, and the aggregates are individually detected.
  • the counting step counts the number of particles detected during the movement of the position of the light detection region by counting the number of individually detected aggregates.
  • the protein is removed from the sample solution before the calculating step.
  • the removing step removes the protein from the biological sample before the preparing step.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule according to the second aspect of the present invention includes a step of removing proteins from the sample solution after the associating step and before the calculating step.
  • the removal of the protein from the sample solution or the biological sample is performed by adsorbing the nucleic acid molecule in the sample solution or the biological sample to an inorganic support. Thereafter, the adsorbed nucleic acid is eluted from the inorganic support.
  • the biological sample is subjected to proteolytic enzyme treatment after being collected from the living body.
  • the nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance.
  • the nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance.
  • the sample solution further contains a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance.
  • One of the fluorescent substance labeling the nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance is a fluorescent substance that serves as an energy donor in the fluorescence energy transfer phenomenon, and the other is in the fluorescence energy transfer phenomenon. It is a substance that becomes an energy acceptor.
  • the fluorescence emitted from the aggregate containing the nucleic acid probe is a fluorescence energy transfer phenomenon that occurs between the fluorescent substance labeled with the nucleic acid probe and the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance. Is the fluorescence emitted by.
  • the fluorescence energy transfer occurs, and when the nucleic acid probe is associated with another single-stranded nucleic acid molecule, the fluorescence energy transfer occurs.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor and a substance serving as an energy acceptor are combined.
  • the fluorescence emitted from the aggregate containing the nucleic acid probe is the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as the energy donor.
  • the position of the light detection region is moved at a predetermined speed.
  • the position of the light detection region is moved at a speed higher than the diffusion movement speed of the aggregate.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule according to the tenth aspect of the present invention includes a step of individually detecting an optical signal from each aggregate from the detected light, and detecting the aggregate individually. Based on the shape of the time-series optical signal, it is detected that one aggregate has entered the light detection region.
  • the sample solution contains one or more selected from the group consisting of a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, and urea.
  • the temperature of the sample solution prepared in the preparing step is set to 70 ° C. or higher in the associating step, whereby the nucleic acid in the sample solution is detected.
  • the liquid temperature of the sample solution is lowered at a rate of temperature decrease of 0.05 ° C./second or more to associate nucleic acid molecules in the sample solution.
  • the nucleic acid probe is configured by binding two or more molecules selected from the group consisting of DNA, RNA, and nucleic acid analogs.
  • the scanning molecule counting method used in the above-described nucleic acid molecule detection method does not execute statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity. Therefore, according to the above-described method for detecting a nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule to be analyzed can be detected even when only a very small amount is present in the sample.
  • the nucleic acid molecule detection method described above further removes the protein derived from the biological sample from the sample solution before detecting the aggregate of the nucleic acid probe and the nucleic acid molecule to be analyzed in the biological sample by the scanning molecule counting method. To do. Therefore, the nucleic acid molecule to be analyzed can be detected with higher accuracy by the scanning molecule counting method.
  • FIG. 1A It is a schematic diagram of the internal structure of the optical analyzer for the scanning molecule counting method in the embodiment of the present invention. It is a schematic diagram of the confocal volume (observation area
  • FIG. 6 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle. It is a figure which shows the example of the time change of the photon count (light intensity) in the case of FIG. 4A. It is a figure showing the processing procedure for counting particles from the time change of photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method in the form of a flowchart.
  • Example 1 of this invention it is the figure which showed the value of the number of peaks counted in each sample solution.
  • Example 1 of this invention in each sample solution, it is the figure which showed the relationship between the density
  • Example 2 of this invention it is the figure which showed the value of the number of peaks counted in each sample solution.
  • the scanning molecule counting method In the scanning molecule counting method, particles that emit light that moves in a sample solution and moves randomly while traversing the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region. In addition, the light emitted from the light emitting particles in the minute region is detected. That is, the scanning molecule counting method individually detects each luminescent particle in a sample solution, and makes it possible to obtain information regarding the counting of the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • a sample necessary for measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the case of an optical analysis technique such as FIDA.
  • the scanning molecule counting method has a short measurement time, and quantitatively characterizes the characteristics such as concentration or number density of luminescent particles having a lower concentration or number density than those of optical analysis techniques such as FIDA. Can be detected.
  • the luminescent particle means a particle in which a particle to be observed and a luminescent probe are bonded or associated.
  • a “luminescent probe” is a substance (usually a molecule or an aggregate thereof) that has a property of binding or associating with a particle to be observed and emits light.
  • the luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the nucleic acid probe used in the nucleic acid molecule detection method of the present embodiment corresponds to a luminescent probe.
  • the “light detection region” of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in those microscopes.
  • illumination light is given from the objective lens, it corresponds to a region where the illumination light is collected. Note that, in the confocal microscope, the above region is determined by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution. That is, light is detected while scanning the sample solution with the light detection region. Then, when the moving light detection region includes a light emitting probe that is bound or associated with a randomly moving particle, light from the light emitting probe is detected. Thereby, the presence of one particle is detected.
  • the light-emitting probe may be dissociated from the particles after detecting the light after binding to the particles to be detected.
  • the optical signal from a light emission probe is detected separately. As a result, the presence of particles (coupled to the luminescent probe) is individually and sequentially detected, and various information regarding the state of the particles in the solution is acquired.
  • the above configuration may be configured to count individually detected particles and count the number of particles detected during the movement of the position of the light detection region (the number of particles). Counting).
  • grains in a sample solution is obtained by combining the number of particle
  • an arbitrary method for example, a method of specifying the total volume of the movement locus of the position of the light detection region by moving the position of the light detection region at a predetermined speed
  • the relative number density or concentration ratio to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated.
  • the scanning molecule counting method is configured to move the position of the light detection region by changing the optical path of the optical system. Therefore, the movement of the light detection region is rapid, and mechanical vibration and hydrodynamic action are not substantially generated in the sample solution, so that the particles to be detected are affected by the mechanical action.
  • the light can be measured in a stable state (the physical properties of the particles may change when vibration or flow acts on the sample solution). Further, since a configuration in which the sample solution is circulated is not necessary, measurement and analysis can be performed with a very small amount of sample solution (about 1 to several tens of ⁇ L) as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the “luminescent probe bonded to one particle” includes the following cases: • One luminescent probe is bound to one particle. • When multiple luminescent probes are bound to one particle. -In the case of a luminescent probe dissociated from a particle after binding to one particle according to the experimental mode. In the present embodiment, typically, when an optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it is configured that a luminescent probe coupled to one particle is detected to have entered the light detection region. May be.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is based on the characteristics of the luminescent probe bound to the particles or the number density or concentration in the sample solution. It may be changed as appropriate. As will be appreciated by those skilled in the art, the manner of light detected from a luminescent probe bound to a particle can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution. In particular, as the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from the luminescent probe bonded to one particle decreases. Therefore, it is preferable that the moving speed of the light detection region is appropriately changed so that light from the light emitting probe bonded to one particle can be measured with high accuracy or sensitivity.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably a light emitting probe coupled to the particles to be detected (that is, the present embodiment).
  • the diffusion movement speed of the aggregate including the nucleic acid probe (the average movement speed of the particles due to Brownian motion) is set higher.
  • the scanning molecule counting method detects the light emitted from the luminescent probe when the photodetection region passes through the position of the luminescent probe bound to one particle, and detects the luminescent probe. Detect individually.
  • the movement speed of the light detection region is set higher than the diffusion movement speed of the luminescent probe bonded to the particles. Specifically, the moving speed is set so that the moving speed is higher than the diffusion moving speed of the aggregate including the nucleic acid probe.
  • the luminescent probe coupled to one particle can be made to correspond to one optical signal (an optical signal indicating the presence of particles). Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent probe bonded to the particle, as described above, the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics (particularly, the diffusion constant) of the luminescent probe bonded to the particle. It is preferable.
  • the optical path of the optical system for moving the position of the light detection region may be changed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be set arbitrarily.
  • the movement locus of the position of the light detection region can be selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the light detection mechanism of the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of a confocal microscope or a multiphoton microscope, as in the case of an optical analysis technique such as FIDA. For this reason, the amount of the sample solution used in the scanning molecule counting method may be as small as that in the optical analysis technique such as FIDA. However, in the scanning molecule counting method, statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not executed. Therefore, the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method can be applied to a sample solution in which the number density or concentration of particles is significantly lower than the level required for an optical analysis technique such as FIDA.
  • the scanning molecule counting method is configured to individually detect each particle dispersed or dissolved in the solution, the information is used to quantitatively count particles or particles in the sample solution.
  • the concentration or number density can be calculated or information on the concentration or number density can be obtained. That is, in the scanning molecule counting method, particles passing through the light detection region and detected light signals are made to correspond one-to-one to detect particles one by one. Therefore, it is possible to count particles that are dispersed in the solution and move randomly, and the concentration or number density of particles in the sample solution can be determined with higher accuracy than before.
  • the concentration of these aggregates in the sample solution is The nucleic acid molecule can be identified even at a concentration lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader.
  • the mode in which the optical path of the optical system is changed and the sample solution is scanned in the light detection region is uniform in the sample solution without giving mechanical vibration or hydrodynamic action to the sample solution.
  • the sample solution is observed in a mechanically stable state. Therefore, for example, the reliability of the quantitative detection result is improved as compared with the case where a flow is generated in the sample. This is because it is difficult to always provide a uniform flow rate when a flow is applied, and the apparatus configuration is complicated.
  • the required amount of sample is greatly increased, and particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution may be altered or denatured due to the hydrodynamic action of the flow. Because there is.
  • measurement can be performed in a state where there is no influence or artifact due to a dynamic action on particles (in this embodiment, an aggregate including a nucleic acid probe) to be detected in a sample solution.
  • the scanning molecule counting method is configured by combining an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, and the like with a photodetector as schematically illustrated in FIG. 1A.
  • This can be realized by an optical analyzer.
  • the optical analyzer 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope.
  • the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is emitted as light that diverges at an angle determined by a specific NA at the output end of the fiber, and is collimated. It becomes parallel light by the meter 4.
  • the parallel light is reflected by the dichroic mirror 5 and the reflection mirrors 6 and 7 and enters the objective lens 8.
  • a microplate 9 in which sample containers or wells 10 into which 1 to several tens of microliters of a sample solution is dispensed is arranged.
  • the laser light emitted from the objective lens 8 is focused in the sample solution in the sample container or well 10, and a region (excitation region) having a high light intensity is formed.
  • particles that are observation objects and luminescent probes that are bonded to the particles are dispersed or dissolved.
  • molecules to which a luminescent label such as a fluorescent dye is added are dispersed or dissolved.
  • the barrier filter 14 When light (Em) passes through the barrier filter 14, only light components in a specific wavelength band are selected. Then, light in which only a light component in a specific wavelength band is selected is introduced into the multimode fiber 15 and reaches the photodetector 16. The light that has reached the photodetector 16 is converted into a time-series electrical signal and then input to the computer 18 where processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is arranged at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8. Thereby, only the light emitted from the focal region of the laser light schematically shown in FIG. 1B, that is, the excitation region, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser light illustrated in FIG. 1B is a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL, and is referred to as a confocal volume.
  • the focal region of the laser light typically has a Gaussian distribution or a Lorentzian distribution in which the light intensity has a vertex at the center of the region.
  • the effective volume of the focal region of the laser beam is a volume of a substantially elliptical sphere having a boundary where the light intensity is 1 / e 2 as a boundary.
  • the scanning molecule counting method light from a conjugate of a particle and a luminescent probe or a luminescent probe, for example, weak light from one or several fluorescent dye molecules is detected.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on the stage (not shown) of the microscope.
  • the stage position changing device 17a is used to change the well 10 for observing particles and the like.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18.
  • the optical system of the above-described optical analyzer is provided with a mechanism for changing the optical path of the optical system and scanning the sample solution with the light detection region. That is, a mechanism for moving the position of the focal region (ie, the light detection region) in the sample solution is provided.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. 1C.
  • the mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device equipped in a normal laser scanning microscope. In order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region, the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof.
  • the program in the computer 18 may be configured so that various movement patterns can be selected.
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • mechanical vibrations and hydrodynamic actions are generated in the sample solution. No substantial occurrence. Therefore, it is possible to eliminate the influence of the dynamic action on the observation object, and stable measurement is achieved.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided as illustrated. Further, the optical analyzer 1 may be configured such that the wavelength of the excitation light can be appropriately selected according to the wavelength of the light that excites the conjugate of the particle and the luminescent probe or the luminescent probe. Similarly, a plurality of photodetectors 16 may be provided. In addition, when the sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a combination of luminescent probes or a luminescent probe, the light detector 16 can be configured to separately detect the light depending on the wavelength. May be.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. Therefore, in order to obtain an accurate measurement result, the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. It is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that (for example, when the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV), a significant light intensity (photon count) is obtained. It appears only in a part of the measurement time, and it is difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity. Also, if the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the light intensity fluctuation calculation is affected by the background. The measurement time is long in order to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation. On the other hand, in the scanning molecule counting method, characteristics such as the number density or concentration of the observation target particles can be detected even when the concentration of the observation target particles is lower than a level required by a spectroscopic analysis technique such as FIDA.
  • the process executed is, in short, changing the optical path by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the photodetection region.
  • a mechanism mirror deflector 17
  • FIG. 2 light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • one particle a fluorescent dye is bound as a luminescent probe in the figure
  • the light detection region CV moves (time t0 to t2 in the figure).
  • a significant light intensity (Em) as depicted in FIG. 2B is detected.
  • the position of the light detection region CV is moved and the light detection is performed, and the significant light intensity as illustrated in FIG. Particles are detected individually.
  • the number of individually detected particles By counting the number of individually detected particles, the number of particles existing in the measured region, or information on the concentration or number density can be acquired.
  • statistical calculation processing is not performed as in the calculation of fluctuations in fluorescence intensity, and particles are detected one by one.
  • information on the concentration or number density of particles can be obtained even in a sample solution having a concentration of particles to be observed that is so low that it cannot be analyzed.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is measured from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when doing so.
  • concentration of a fluorescently labeled particle by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader, it is usually assumed that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particle.
  • the scanning molecule counting method is a step of detecting a signal corresponding to each particle from the detected optical signal, and a noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. calculate. Therefore, the scanning molecule counting method can detect a concentration lower than that when detecting the concentration on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the fluorescence intensity is fluorescently labeled according to the method of individually detecting and counting the particles in the sample solution as in the scanning molecule counting method. Therefore, the measurement accuracy of the particle concentration on the higher particle concentration side is improved as compared with the conventional method of determining the concentration under the assumption that the particle concentration is proportional to the particle concentration.
  • the scanning molecule counting method is a step of detecting signals corresponding to individual particles from the detected optical signal, and is less affected by the reduction in fluorescence intensity per particle, and calculates the concentration from the number of particles. Therefore, the scanning molecule counting method can detect a higher concentration than when detecting the concentration on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement step in FCS or FIDA. In the operation process, the following procedure is typically performed. That is, the sample solution is injected into the well 10 of the microplate 9 and placed on the microscope stage. Thereafter, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 to which the instruction is input starts irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution according to a program stored in a storage device (not shown).
  • This program includes a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and a procedure for detecting light from the light detection region during movement of the position of the light detection region.
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanomirror) and moves the position of the light detection region in the well 10 under the control of the processing operation according to the program of the computer 18. .
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18.
  • the computer 18 generates and stores time-series light intensity data from the transmitted optical signal in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon.
  • the detection of light is photon counting that is performed sequentially for a predetermined unit time (BINTIME) over a predetermined time. For example, the detection of light is performed in such a manner that the number of photons arriving at the photodetector is measured every 10 ⁇ s.
  • the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the moving distance is grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in the manner. Note that it is easier to interpret the measurement result when the elapsed time during measurement and the movement distance of the position of the light detection region are in a proportional relationship. Therefore, the moving speed is basically preferably a constant speed, but is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately perform individual detection of the observation target particles from the measured time-series light intensity data or counting of the number of observation target particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the observation target particle, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the observation target particle is a conjugate of the particle and the luminescent probe or a luminescent probe that has been decomposed and released after binding to the particle. Since the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in the solution and moves freely at random, the position of the observation target particle moves with time by Brownian motion.
  • the particle randomly moves in the region as schematically illustrated in FIG. 3A.
  • the light intensity changes randomly as shown in FIG. 3B, and it becomes difficult to specify a significant change in light intensity corresponding to each observation target particle.
  • the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex. Therefore, preferably, as shown in FIG. 4A, the particles may be set so as to cross the light detection region in a substantially straight line. As a result, in the time-series light intensity data, as illustrated in FIG.
  • the profile of the change in light intensity corresponding to each particle becomes substantially uniform, and the correspondence between each observation target particle and the light intensity is easy.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set faster than the average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particles.
  • the profile of the change in light intensity is substantially the same as the excitation light intensity distribution.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the Vdif.
  • Wo is about 0.62 ⁇ m
  • Vdif is 1.0 ⁇ Since it is 10 ⁇ 3 m / s
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 may execute the following light intensity analysis by the processing according to the program stored in the storage device.
  • grain may be detected when time width (DELTA) (tau) in which the light intensity exceeding the said threshold value exists in a predetermined range.
  • DELTA time width
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle). It is determined based on the profile assumed as the intensity of light emitted from a free luminescent probe. The specific value of the profile may be arbitrarily set experimentally.
  • the specific value of a profile may be selectively determined by the characteristic of the conjugate
  • the intensity A and the width a calculated by fitting Equation (4) to a significant light intensity profile are within a predetermined range
  • the light intensity profile May correspond to the fact that one observation target particle has passed through the light detection region, and one observation target particle may be detected.
  • the intensity A and the width a are outside the predetermined range, the light intensity profile may be ignored in the analysis as noise or foreign matter.
  • Counting of observation target particles may be performed by counting the number of particles detected by the above-described detection target particle detection method using an arbitrary method. However, when the number of particles is large, the observation target particles may be counted by, for example, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B.
  • time-series optical signal data photon count data
  • the time-series optical signal data (FIG. 6B, uppermost stage “detection result (unprocessed) ”) Is subjected to a smoothing process (step 110,“ smoothing ”in the upper part of FIG. 6B).
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameter for executing the smoothing process may be set as appropriate according to the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of optical signal data acquisition and BIN TIME.
  • the parameters described above are, for example, the number of data points averaged at a time in the moving average method, the number of moving averages, and the like.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differentiation” in FIG. 6B.
  • the start and end points of a significant signal (peak signal) can be advantageously determined.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • time differential values are sequentially referred to on time-series time differential value data of time-series optical signal data.
  • a start point and an end point of one peak signal are searched and determined, and a peak existence region is specified (step 130).
  • the bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series optical signal data in the peak existence area (“bell-shaped function fitting” in the lower part of FIG. 6B).
  • Parameters such as the peak intensity Imax of the function, the peak width (full width at half maximum) w, and the correlation coefficient in fitting (correlation coefficient of the least squares method) are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function.
  • the bell-shaped function to be fitted may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range (step 150). That is, in this determination, it is determined whether or not the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are within a predetermined range.
  • the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the optical signal corresponding to the combination of one particle and the luminescent probe or the luminescent probe.
  • the signal determined to be present is determined to be a signal corresponding to one observation target particle. Thereby, one observation target particle is detected, and one particle is counted (the number of particles is counted up, step 160).
  • a peak signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly performed over the entire time-series optical signal data, and is counted as a particle every time one observation target particle is detected.
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of time-series optical signal data is used.
  • the number density or concentration of the particles is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. Accordingly, it is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution (reference solution) with a known particle concentration, the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed is determined from the number of detected particles and the concentration of the reference solution particles. May be.
  • information on the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • the information may be configured to be stored in advance in a storage device of the computer 18 so that the user of the device can use the information of the relationship appropriately stored when performing optical analysis.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule of the present embodiment uses a nucleic acid probe that specifically binds to the nucleic acid molecule as a target of analysis for the nucleic acid molecule having a specific base sequence.
  • the target nucleic acid molecule may be referred to as a target nucleic acid molecule), and the nucleic acid molecule to be analyzed is detected based on the amount of the formed aggregate. Further, in the present embodiment, the detection of the aggregate is measured by the scanning molecule counting method described above.
  • the scanning molecule counting method is a measurement method capable of measuring particles having fluorescence for each particle in a state where the molecules are discrete, and therefore, even for a nucleic acid molecule having a relatively low concentration of pM order or less. It can be measured. For this reason, the formed aggregates can be counted with high sensitivity even when the concentration of the target nucleic acid molecule in the sample solution is very low by the nucleic acid molecule detection method of the present embodiment.
  • the nucleic acid probe specifically binds to the target nucleic acid molecule means that the nucleic acid probe preferentially hybridizes with the target nucleic acid molecule over other single-stranded nucleic acid molecules.
  • the target nucleic acid molecule is a single-stranded nucleic acid molecule, it means preferentially hybridizing with the single-stranded nucleic acid molecule over other single-stranded nucleic acid molecules.
  • the target nucleic acid molecule when the target nucleic acid molecule is a double-stranded nucleic acid molecule, it means that the target nucleic acid molecule preferentially hybridizes with one of the two single-stranded nucleic acid molecules constituting the target nucleic acid molecule. Therefore, the nucleic acid probe may have a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target nucleic acid molecule, or may have a base sequence having a mismatch.
  • This embodiment uses a nucleic acid probe that specifically hybridizes with a target nucleic acid molecule.
  • the target nucleic acid molecule can be detected separately from other nucleic acid molecules contained in the biological sample.
  • an aggregate containing the nucleic acid probe is detected from the sample solution in which the biological sample and the nucleic acid probe are mixed.
  • the target nucleic acid molecule is not present in the biological sample, the aggregate containing the nucleic acid probe is not detected from the sample solution.
  • the nucleic acid probe used in this embodiment may be an oligonucleotide made of DNA.
  • the nucleic acid probe may be an oligonucleotide made of RNA.
  • the nucleic acid probe may be a chimeric oligonucleotide composed of DNA and RNA.
  • the nucleic acid probe may be a substance that partially or entirely contains a nucleic acid-like substance capable of forming a nucleotide chain or base pair in the same manner as a natural nucleobase.
  • Nucleic acid-like substances are labeled with a substance in which the side chain of a natural nucleotide (naturally occurring nucleotide) such as DNA or RNA is modified with a functional group such as an amino group, or a protein or a low molecular weight compound. Substances and the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the nucleic acid to be analyzed may be DNA.
  • the nucleic acid to be analyzed may be RNA.
  • the nucleic acid to be analyzed may be artificially amplified DNA such as cDNA.
  • the nucleic acid probe in the scanning molecule counting method, is different from the state in which the nucleic acid probe is present alone and the state in which the nucleic acid probe is in association with other single-stranded nucleic acid molecules.
  • An association formed from a probe and other single-stranded nucleic acid molecules can be distinguished from a nucleic acid probe that does not form an association.
  • a molecular beacon probe can also be used as a nucleic acid probe.
  • a molecular beacon probe is an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule.
  • FRET a fluorescent substance that serves as an energy donor and a substance that serves as an energy acceptor (fluorescent substance or quenching substance) are combined such that FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule and does not occur in the state of an aggregate formed by hybridizing with other single-stranded nucleic acid molecules.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor is detected from the nucleic acid probe forming the aggregate.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from the nucleic acid probe present alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the aggregate including the nucleic acid probe can be detected separately from the nucleic acid probe present alone.
  • the molecular beacon probe used as a nucleic acid probe in this embodiment has a base sequence capable of hybridizing with a target nucleic acid molecule, and is complementary to the 3 ′ end region and the 5 ′ end region.
  • Examples include oligonucleotides having a base sequence.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, and the remaining one is bound to the 5 ′ end side,
  • the 3 'end region and the 5' end side have complementary base sequences, and base pairs are formed in these base sequences to form an intramolecular structure (so-called stem-loop structure). To do.
  • region which forms the intramolecular base pair of a molecular beacon probe should just exist so that the area
  • the region on the 3'-end side and the region on the 5'-end side may include a 3'-end or a 5'-end, respectively.
  • the region on the 3 ′ end side and the region on the 5 ′ end side may not include the 3 ′ end or the 5 ′ end, respectively.
  • the number of bases and the base sequence of the region forming the base pair are lower in stability of the formed base pair than the stability of the aggregate with the target nucleic acid molecule, and can form a base pair under measurement conditions. Any degree is acceptable.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it emits light by emitting light of a specific wavelength, and may be appropriately selected from fluorescent dyes used in FCS, FIDA, and the like. it can.
  • the nucleic acid probe can be labeled with a fluorescent substance by a conventional method.
  • the aggregate containing the nucleic acid probe can be distinguished from the nucleic acid probe present alone. Can be detected. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the nucleic acid probe serves as an FRET energy donor, and the other serves as the FRET energy acceptor. Fluorescence emitted from a fluorescent substance that labels the nucleic acid probe is detected from a nucleic acid probe such as the first nucleic acid probe that exists alone.
  • Examples of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator, a groove binder to which a fluorescent substance is bound, and the like. If the amount of fluorescent intercalator entering between the base pairs of the aggregate is too large, the background when detecting the fluorescence emitted by FRET becomes too high, which may affect the detection accuracy. There is. For this reason, it is preferable to design the nucleic acid probe so that the region forming the double strand in the aggregate is 400 bp or less.
  • the target nucleic acid molecule can also be detected using two or more nucleic acid probes.
  • two nucleic acid probes are designed to specifically hybridize in a state adjacent to each other with respect to the target nucleic acid molecule.
  • two nucleic acid probes that hybridize are labeled with a fluorescent substance in which one nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance and the other nucleic acid probe is FRET between the fluorescent substance labeled with one of the nucleic acid probes. Label with quencher.
  • the method for detecting a nucleic acid molecule of the present embodiment includes the following steps (a) to (c), and the step of removing proteins from the following sample solution before the following step (c), or Before the following step (a), there is a step of removing proteins from the following biological sample:
  • B A step of associating the nucleic acid molecule in the sample solution prepared in the step (a) with the nucleic acid probe.
  • C A step of calculating the number of molecules of the aggregate containing the nucleic acid probe in the sample solution prepared in the step (a) after the step (b).
  • a sample solution containing a nucleic acid probe and a biological sample is prepared.
  • a sample solution is prepared by adding a nucleic acid probe and a biological sample to an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is the following solvent, and can be appropriately selected from buffers generally used in the technical field. That is, the solvent may not inhibit the formation of the aggregate by the nucleic acid probe and the detection of the aggregate by the scanning molecule counting method.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance is similar to a nucleic acid probe or the like. Added to the sample solution.
  • the biological sample provided in the present embodiment includes a tissue piece collected from a living body. Specifically, blood, lymph fluid, bone marrow fluid, ascites, exudate, amniotic fluid, sputum, saliva, semen, bile, pancreatic fluid, urine and other body fluids, tissue fragments collected from living bodies, feces, intestinal lavage fluid, lung lavage fluid , Bronchial lavage fluid, or bladder lavage fluid.
  • the biological sample may be a cell component obtained by separating and collecting cells.
  • the cell components separated and collected by centrifugation, chromatography, etc. the solution of disaggregating the connective tissue of the tissue pieces and disaggregating the cells, disaggregating the tissue pieces
  • the cell component include plasma and serum separated and collected from blood.
  • the biological sample may be a sample obtained by deparaffinizing a prepared paraffin block or a section thereof after embedding a tissue piece collected from the living body with paraffin. The collection from a living body, centrifugation, chromatography, paraffin embedding, and deparaffinization can be performed by conventional methods.
  • the biological sample may be subjected to proteolytic enzyme treatment in advance.
  • the proteolytic enzyme include proteinase K.
  • the enzyme is inactivated after the enzyme reaction.
  • proteinase K is generally subjected to an inactivation treatment at 70 ° C. for 5 to 15 minutes after an enzyme reaction at 50 to 60 ° C. for 30 minutes to several hours.
  • the inactivation process can be omitted.
  • step (b) the nucleic acid molecules in the sample solution prepared in step (a) are associated.
  • the nucleic acid molecule in the sample solution is a double-stranded nucleic acid molecule, it is preferably denatured before associating.
  • “denaturing a nucleic acid molecule” means dissociating base pairs.
  • a base pair formed by mutually complementary base sequences in a single-stranded nucleic acid molecule is dissociated to release the intramolecular structure into a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted into a single-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the nucleic acid molecule is a double-stranded nucleic acid molecule, the aggregate containing the nucleic acid probe is not subjected to any special denaturation treatment. It may be possible to form.
  • heat denaturation can denature nucleic acid molecules in the sample solution by subjecting the sample solution to high temperature treatment.
  • DNA can be denatured by incubating at 90 ° C. for several seconds to about 2 minutes.
  • RNA can be denatured by incubating at 70 ° C. for several seconds to 2 minutes.
  • the temperature at which the nucleic acid molecule is denatured varies widely depending on the length of the base of the target nucleic acid molecule and the like, and is not limited to the above temperature as long as it can be denatured.
  • denaturation by low salt concentration treatment can be performed by adjusting the sample solution to have a sufficiently low salt concentration by, for example, dilution with purified water or the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution are associated after being denatured as necessary.
  • heat denaturation after the high temperature treatment, the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule can specifically hybridize, thereby reducing the nucleic acid molecule in the sample solution.
  • Meetings can be made as appropriate.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration at which the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule can specifically hybridize by adding a salt solution or the like.
  • the nucleic acid molecules in the sample solution can be appropriately associated.
  • the temperature at which the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule can specifically hybridize can be determined from the melting curve of the aggregate consisting of the target nucleic acid molecule and the nucleic acid probe.
  • the melting curve can be obtained, for example, by changing the temperature of a solution containing only the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule from a high temperature to a low temperature and measuring the absorbance and fluorescence intensity of the solution. From the obtained melting curve, the temperature between the temperature at which the denatured nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule started to form an aggregate to the temperature at which almost all became an aggregate is determined between the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule. It can be set as the temperature which can hybridize specifically.
  • the melting curve is determined in the same manner, and the concentration at which the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule can specifically hybridize is obtained. be able to.
  • the Tm value (melting temperature) can be substituted for the temperature at which the nucleic acid probe and the target nucleic acid molecule can specifically hybridize.
  • the Tm value (50% of the double-stranded DNA is converted into single-stranded DNA) from the nucleotide sequence information of the nucleic acid probe.
  • Dissociation temperature can be calculated.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature of about Tm ⁇ 3 ° C. of a region having a base sequence complementary to the target nucleic acid molecule in the nucleic acid probe.
  • the temperature of the sample solution in order to suppress non-specific hybridization, it is preferable to lower the temperature of the sample solution relatively slowly when forming an aggregate. For example, after denaturing nucleic acid molecules by setting the temperature of the sample solution to 70 ° C. or higher, the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a temperature decrease rate of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant in order to suppress non-specific hybridization, it is preferable to add a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance before the step (c).
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • These compounds may be included in the sample solution when preparing the sample solution in step (a). These compounds may be added to the sample solution after step (b) and before step (c).
  • Removal of the protein derived from the biological sample may be performed before the measurement by the scanning molecule counting method in the step (c).
  • a biological sample that has been subjected to protein removal processing after being collected from the living body may be mixed with a nucleic acid probe to prepare a sample solution.
  • this embodiment can reduce the labor and time for sample preparation, it is preferable to perform a protein removal treatment on the sample solution in the following cases, and in the subsequent step (b) of step (a) More preferably, the previous sample solution is subjected to protein removal treatment: -Before the post-process (b) of a process (a). -Before the post-process (c) of a process (b).
  • the protein removal treatment can be appropriately selected from methods known in the art. For example, by bringing a biological sample before mixing with a nucleic acid probe, a sample solution prepared in step (a), or a sample solution after step (b) (hereinafter referred to as a biological sample) into contact with an inorganic support. Then, after the nucleic acid molecules contained in the biological sample or the like are adsorbed on the inorganic support, the adsorbed nucleic acid molecules are eluted from the inorganic support to obtain a biological sample or the like from which the protein has been removed.
  • the inorganic support a known inorganic support capable of adsorbing nucleic acid molecules can be used. Moreover, the shape of the said inorganic support body is not specifically limited, A particle form may be sufficient and a film
  • the inorganic support include silica-containing particles (beads) such as silica gel, siliceous oxide, glass, and diatomaceous earth, and porous membranes such as nylon, polycarbonate, polyacrylate, and nitrocellulose.
  • a solvent usually used for eluting nucleic acid molecules from these known inorganic supports can be appropriately used.
  • the elution solvent is particularly preferably purified water.
  • cleaning buffer it is preferable to elute a nucleic acid molecule from the said inorganic support body.
  • the protein contained in the biological sample or the like may be denatured before the protein removal treatment.
  • Protein denaturation can be performed by known methods.
  • a protein in a biological sample or the like can be denatured by adding a compound usually used as a protein denaturant such as a chaotropic salt, an organic solvent, or a surfactant to the biological sample or the like.
  • a compound usually used as a protein denaturant such as a chaotropic salt, an organic solvent, or a surfactant to the biological sample or the like.
  • a chaotropic salt, an organic solvent, a surfactant, or the like one type of compound may be added, or two or more types of compounds may be added.
  • chaotropic salts examples include guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, sodium iodide, sodium perchlorate, and sodium trichloroacetate.
  • the surfactant that can be contained in a biological sample or the like is preferably a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant include Tween 80, CHAPS (3- [3-Colamidopropyldimethylammonio] -1-propanesulfonate), Triton X-100, Tween 20, and the like.
  • the organic solvent that can be contained in a biological sample or the like is preferably phenol. Phenol may be neutral or acidic. When acidic phenol is used, RNA can be selectively extracted into the aqueous layer rather than DNA.
  • the denatured protein can be removed by, for example, centrifuging to precipitate the denatured protein and recovering only the supernatant. In addition, after adding chloroform and thoroughly stirring and mixing by vortexing, etc., centrifugation is performed, and the denatured protein is precipitated and only the supernatant is recovered. Protein can be removed. The obtained supernatant may be further brought into contact with the inorganic support, and further protein removal treatment may be performed.
  • the protein when the biological sample is a biological sample with relatively low protein content, such as plasma and serum, the protein is aggregated using a protein remover and then the liquid component is recovered by solid-liquid separation processing. By doing so, the protein can be removed. Specifically, after adding a protein removing agent to a biological sample, the protein is aggregated by stirring or standing, and then a centrifugation treatment is performed, and the supernatant is collected.
  • a protein removing agent for example, a substance having high affinity for proteins such as an ion exchange resin can be used.
  • the number of molecules of the aggregate including the nucleic acid probe in the sample solution is calculated by a scanning molecule counting method.
  • the sample solution after forming the aggregate is placed in an optical analyzer for the scanning molecule counting method, and the fluorescence emitted from the aggregate is detected and analyzed by the above method.
  • the number of molecules in the aggregate is calculated.
  • the calculated number of molecules of the aggregate is the number of target nucleic acid molecules contained in the measurement sample. That is, the target nucleic acid molecule can be detected by detecting the aggregate.
  • Test Example 1 uses artificially synthesized oligonucleotides as single-stranded target nucleic acid molecules and nucleic acid probes, and samples obtained by adding these to horse whole blood or horse plasma are simulated samples of biological samples. ⁇ Target nucleic acid molecules in pseudo biological samples were detected by scanning molecule counting method. Table 1 shows the base sequences of the target nucleic acid molecule A and nucleic acid probe A used for the measurement.
  • the nucleic acid probe A is a molecular beacon probe. Underlined bases are regions that hybridize to each other when forming intramolecular structures.
  • a target nucleic acid molecule A and a nucleic acid probe A were mixed in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0) so as to be 50 pM, respectively.
  • Tris buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0
  • a 5 pM nucleic acid probe solution was prepared by mixing the target nucleic acid molecule A and the nucleic acid probe A in the Tris buffer so that each would be 5 pM.
  • the obtained nucleic acid probe solution was annealed at 95 ° C. for 10 minutes, 70 ° C. for 10 minutes, 60 ° C. for 10 minutes, 50 ° C. for 10 minutes, and 20 ° C.
  • nucleic acid extract was prepared from 50 ⁇ l of whole horse blood or 50 ⁇ l of horse plasma using a nucleic acid extraction kit (product name: QIAamp DNA Micro kit, manufactured by QIAGEN).
  • the nucleic acid extract corresponds to the biological sample after the protein removal treatment in the embodiment of the present invention.
  • the whole horse blood or horse plasma before the treatment with the nucleic acid extraction kit corresponds to a biological sample before the protein removal treatment.
  • sample preparation (+) 50 ⁇ l each of the annealed 50 pM nucleic acid probe solution or 5 pM nucleic acid probe solution was added to prepare a sample solution (sample preparation (+)).
  • Test Example 1 the number of molecules of the aggregate composed of the target nucleic acid molecule A and the nucleic acid probe A in each sample solution was counted by a scanning molecule counting method. Specifically, in the measurement, a single-molecule fluorescence measuring device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device. Series photon count data was obtained. At that time, excitation light is irradiated at a rotational speed of 6,000 rpm and 300 ⁇ W using a laser beam of 543 nm. The detection light wavelength was 560 to 620 nm using a band pass filter.
  • a single-molecule fluorescence measuring device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device. Series photon count data was obtained. At that time, excitation light is irradiated at a rotational speed
  • BINTIME was set to 10 ⁇ s, and the measurement time was set to 2 seconds.
  • the time series data obtained by the measurement was smoothed by the Savinzky-Golay algorithm, and then a peak was detected by differentiation. Of the regions regarded as peaks, a region that can be approximated to a Gaussian function is extracted as a signal.
  • each concentration indicates the concentration of the target nucleic acid molecule A in each sample solution.
  • the number of peaks counted in the sample solution (Control) to which the biological sample is not added is a highly reliable counting result that is not affected by contaminants derived from the biological sample.
  • sample preparation ( ⁇ ) sample preparation
  • the sample solution both in the blood and plasma, regardless of the number of target nucleic acid molecules in the sample solution
  • the number of peaks was significantly higher than that of Control). This is presumably because non-specific signals were generated in the measurement by the scanning molecule counting method due to contaminants in the biological sample, and the peak increased.
  • sample preparation (+) the number of peaks is the same as that of the sample solution to which no biological sample is added (Control). It was done. From these results, contaminants derived from biological samples that may cause non-specific signal generation in the measurement by the scanning molecule counting method can be removed by performing protein removal treatment in advance, and more accurate It is suggested that measurement is possible.
  • Example 1 In Example 1, out of PCR products obtained by PCR using a fluorescently labeled primer and an unlabeled primer, a single-stranded nucleic acid molecule extended from the unlabeled primer was used as the target nucleic acid. A single-stranded nucleic acid molecule extended from a fluorescently labeled primer was used as a nucleic acid probe. These were added to a biological sample obtained by deparaffinization from a paraffin-embedded tissue section as a pseudo biological sample, and target nucleic acid molecules in the pseudo biological sample were detected by a scanning molecule counting method.
  • Example 1 ⁇ Preparation of target nucleic acid molecule B and nucleic acid probe B>
  • plasmid pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • TAMRA-labeled oligonucleotide primer, oligonucleotide primer not labeled with a fluorescent substance, and PCR kit (product name: AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) ) was used to prepare a PCR product having a chain length of 800 bp.
  • PCR was performed by electrophoresis using an electrophoresis apparatus Bioanalyzer (Agilent). The presence and concentration of the product was measured. PCR product solutions were prepared using Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0) so that the concentration of the PCR product was 2 pM, 20 pM, or 200 pM. Of the two single-stranded nucleic acid molecules constituting the PCR product, the fluorescently labeled nucleic acid molecule was designated as nucleic acid probe B. A nucleic acid molecule that was not fluorescently labeled was designated as target nucleic acid molecule B.
  • Example 1 4% formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections of rat liver and kidney were deparaffinized with xylene, proteinase K was added, and enzyme reaction treatment was performed at 56 ° C. for 10 minutes.
  • the solution after the enzyme reaction treatment was a proteinase K-treated biological sample solution.
  • a proteinase K-treated biological sample solution and an equal amount of each PCR product solution or Tris buffer were added to prepare sample solutions having PCR product concentrations of 0, 1, 10, and 100 pM (protein removal treatment). None).
  • Each sample solution was further annealed by maintaining at 95 ° C. for 10 minutes, 55 ° C. for 10 minutes and then at room temperature.
  • the proteinase K-treated biological sample solution was further treated at 70 ° C. for 10 minutes, an equal amount of the PCR product solution or the Tris buffer was added, respectively, and the PCR product concentrations were 0, 1, 10, and 100 pM.
  • Each solution was prepared.
  • Each sample solution was further subjected to an annealing treatment in the same manner as the sample solution (without protein removal treatment). Thereafter, the sample solution subjected to the annealing treatment was purified using a nucleic acid purification kit (product name: MinElute PCR purification kit, manufactured by QIAGEN), and the obtained nucleic acid extract was used as a measurement sample (with protein removal treatment 1). . Further, without performing the treatment at 70 ° C.
  • the proteinase K-treated biological sample solution and the PCR product solution of each concentration or the Tris buffer are added in equal amounts, and the PCR product concentration is 0, 1, 10 , And 100 pM sample solutions were prepared, respectively.
  • Each sample solution is further annealed in the same manner as the sample solution (with protein removal treatment 1), and then purified using a nucleic acid purification kit, and the resulting nucleic acid extract is used as a measurement sample.
  • With protein removal treatment 2 As a control, equal amounts of the PCR product solution at each concentration and the Tris buffer were added to prepare sample solutions having PCR product concentrations of 0, 1, 10, and 100 pM, respectively (Control).
  • Each sample solution was further subjected to an annealing treatment in the same manner as the sample solution (without protein removal treatment).
  • Example 1 In Example 1, in the same manner as in Test Example 1, the number of aggregates composed of the target nucleic acid molecule B and the nucleic acid probe B present in each sample solution was counted by the scanning molecule counting method. The counting results are shown in FIG. Furthermore, in FIG. 9, the approximate straight line of the relationship between the density
  • the relationship between the concentration of the target nucleic acid molecule in the sample solution and the number of detected peaks was significantly lost in linearity compared to the sample solution (Control).
  • the sample solution (with protein removal treatment 1) and the sample solution (with protein removal treatment 2) both have almost the same number of peaks as the sample solution (Control), and both are targets in the measurement sample. It was shown that nucleic acid molecules can be detected quantitatively with high accuracy.
  • the sample solution (with protein removal treatment 2) in which the enzyme deactivation treatment after the proteinase K treatment is omitted can detect the target nucleic acid molecule with high accuracy in the same manner as the sample solution (with protein removal treatment 1). It is apparent that measurement by the scanning molecule counting method can be performed even when the enzyme deactivation treatment or the like is omitted by the nucleic acid molecule detection method of the embodiment.
  • Example 2 In Example 2, out of PCR products obtained by PCR using a fluorescently labeled primer and an unlabeled primer, a single-stranded nucleic acid molecule extended from the unlabeled primer was used as the target nucleic acid. A single-stranded nucleic acid molecule extended from a fluorescently labeled primer was used as a nucleic acid probe. A sample obtained by adding these to horse plasma was used as a pseudo biological sample, and target nucleic acid molecules in the pseudo biological sample were detected by a scanning molecule counting method.
  • Example 2 ⁇ Preparation of target nucleic acid molecule C and nucleic acid probe C>
  • plasmid pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • oligonucleotide primer labeled with ATTO647N oligonucleotide primer not labeled with a fluorescent substance
  • PCR kit product name: AmpliTaq Gold, Applied Biosystems
  • PCR was performed by electrophoresis using an electrophoresis apparatus Bioanalyzer (Agilent). The presence and concentration of the product was measured. PCR product solutions were prepared using Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0) so that the concentration of the PCR product was 2 pM, 20 pM, or 200 pM. Of the two single-stranded nucleic acid molecules constituting the PCR product, a nucleic acid molecule that was fluorescently labeled was used as a nucleic acid probe C. A nucleic acid molecule that was not fluorescently labeled was designated as target nucleic acid molecule C.
  • Example 2 equine plasma and 2 pM, 20 pM, or 200 pM PCR product solution prepared in Example 1 or the Tris buffer were added in equal amounts to a 1.5 ml tube so that the PCR product concentration was 0.
  • Two 100 ⁇ l sample solutions of 1, 10, and 100 pM were prepared respectively.
  • 200 ⁇ l of a protein removing agent product name: BindPro (registered trademark), manufactured by Biotech Support Group
  • 200 ⁇ l of PBS pH 7.2
  • Example 2 a scanning molecule counting method was used in the same manner as in Test Example 1 except that 633 nm laser light was used as excitation light and the detection light wavelength was 660 to 710 nm using a bandpass filter. The number of aggregates composed of the target nucleic acid molecule C and the nucleic acid probe C present in each supernatant was counted. The counting results are shown in FIG. In FIG. 10, “no removal” indicates the result of the sample solution to which PBS was added instead of the protein removal agent (no protein removal treatment). In FIG. 10, “with removal” indicates the result of the sample solution to which the protein removing agent is added (with protein removal treatment). In FIG.
  • the concentration indicates the concentration of the target nucleic acid molecule in each sample solution.
  • the number of peaks was remarkably large regardless of the concentration of the target nucleic acid molecule.
  • the concentration of the target nucleic acid molecule is 0 pM, and the number of peaks depending on the concentration of the target nucleic acid molecule is 1 to 100 pM. Increase was confirmed. From these results, it is clear that a non-specific signal disappears and the target nucleic acid molecule can be detected with high accuracy by performing the removal treatment of the protein derived from the biological sample before the measurement by the scanning molecule counting method.
  • a nucleic acid molecule derived from a biological sample that exists only in a very low concentration in the sample solution is specifically detected using a nucleic acid probe that specifically hybridizes to the nucleic acid molecule.
  • a nucleic acid probe that specifically hybridizes to the nucleic acid molecule.
  • Optical analyzer confocal microscope
  • Light source 3 Single mode optical fiber
  • Collimator lens 5 Dichroic mirror 6, 7, 11 Reflection mirror 8
  • Objective lens 9
  • Microplate 10 Well (sample solution container)
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 12
  • Condenser lens 13
  • Pinhole 14
  • Barrier filter 15
  • Multimode optical fiber 16
  • Photo detector 17 Mirror deflector 17a
  • Stage position change apparatus 18 Computer

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Abstract

この核酸分子の検出方法は、解析対象の核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブと、生体試料とを含む試料溶液を調製する工程と、前記調製する工程において調製された試料溶液中の核酸分子と前記核酸プローブとを会合させる工程と、前記会合させる工程の後、前記調製する工程において調製された試料溶液中の前記核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する工程と、を有し、前記算出する工程の前に、前記試料溶液からタンパク質を除去する工程、又は前記調製する工程の前に、前記生体試料からタンパク質を除去する工程、を有する。

Description

生体試料中の核酸分子の検出方法
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、生体試料中の核酸分子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１１年４月２０日に日本に出願された特願２０１１－０９４２９３号に基づいて優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、前述したような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１～３参照）では、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域,コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為される。蛍光相関分光分析は、測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内における蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度の情報を取得する。あるいは、蛍光相関分光分析は、前述の蛍光分子等の平均の滞留時間及び滞留する分子の数の平均値に基づいて分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象を検出する。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。蛍光強度分布分析では、生成されたヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。蛍光強度分布分析では、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６では、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータにおいて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよい（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度でよい。）。また、上述した方法によれば、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、例えば以下の場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、あるいは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている：
　　・　医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少なあるいは高価な試料についての分析を行う場合。
　　・　病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合。
　一方で、特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。特に、生体試料は、一般的に、臨床検査における検体等のように、微量である場合が多い。そこで、生体試料中の核酸を解析する際には、当該生体試料中に含まれている核酸を、ＰＣＲ等の一般的な分子生物学的手法を用いて増幅させた後に、もしくは増幅と同時に標的核酸を検出する方法が汎用されている。また、生体試料中には、通常、核酸以外にも多種多様な物質が含まれており、核酸増幅反応に対する阻害物質も含まれている場合がある。このため、核酸増幅反応を利用して核酸を精度よく検出する場合には、核酸増幅反応に対する阻害物質をはじめとする夾雑物の影響を低減するために、予め生体試料から核酸を選択的に抽出し回収する必要がある。例えば、特許文献８には、磁性粒子を用いた核酸回収方法により生体試料から核酸を抽出し、次いで抽出された核酸から、核酸増幅法といった一般的な分子生物学的手法を用いて、目的の核酸を検出する方法が開示されている。また、特許文献９には、血液を凝固させた後、得られた血清に対して核酸増幅処理を行うことにより、血液中に含まれていた核酸増幅反応に対する阻害物質を除去し、目的の核酸を増幅し、検出する方法が開示されている。その他、特許文献１０には、血液を希釈後、加熱した後の試料に対して核酸増幅処理を行い、目的の核酸を検出する方法が開示されている。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開第２００８－０８０４１７号公報 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報 日本国特許第２９６５１３１号公報 日本国特許第３５７５６３３号公報 特開２００６－１８７２２１号公報
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術において有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態において、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調製されていることが好ましい。好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい。典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度もしくはそれ以上であることが好ましい。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果において、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。その結果、上記のような蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果が得られなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。これは、数秒間に亘る計測時間における有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中における観測対象となる蛍光分子等の有無が特定できることによる。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法では、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することしかできず、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができない。例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータにおけるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出する技術であり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子を検出するための技術ではない。即ち、特許文献７に記載された技術は、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータにおける計測あるいは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。そのため、特許文献７の技術では、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に対しては、複雑で高度な操作技術を要求していると考えられる。
　また、十分な検出感度を備える検出方法であれば、予め核酸増幅反応を行うことなく、検出対象とする目的の核酸を極微量にしか含有していない生体試料から直接目的の核酸が検出できると期待される。しかしながら、生体試料に核酸とともに含まれている夾雑物の中には、自家蛍光を有する物質がある。このため、生体試料中の核酸を直接、光分析技術によって検出しようとした場合には、生体試料由来の各種夾雑物により、非特異的なシグナルが発生する課題がある。また、前記生体試料由来の各種夾雑物により、透過する光が阻害されてしまうという課題もある。光学的測定の障害となる夾雑物の存在は、光分析技術の検出感度が高くなるほど、より大きな課題である。すなわち、血液や組織等の生体由来の試料から目的の核酸の検出を高感度な光分析技術により行う場合には、測定対象以外の測定の障害となる夾雑物により、測定対象のみの濃度を正確に測ることは非常に困難である。
　本発明は、多種多様な物質を含んでいる生体試料中の核酸分子を検出する方法を提供することを目的とする。本発明が提供する方法は、新規な光分析技術を用いる。この新規な光分析技術は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されているような、統計的処理を含まない。従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能である。
　本発明が提供する検出方法が用いる新規な光分析技術は、以下の特徴を有する。すなわち、核酸を検出する方法として、生体試料中の核酸分子を、当該核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて、当該核酸プローブとの会合体の形成の有無により検出する方法がある。この方法において、核酸プローブを含む会合体の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料中の解析対象の核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、感度よく核酸分子を検出することができる。さらに、核酸プローブを含む会合体を検出する前に、予め生体試料由来の夾雑物を除去することにより、精度よく核酸分子を検出することができる。
　上記走査分子計数法は、特願２０１０－０４４７１４において、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。
　上記の課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
　本発明の第一の態様に係る核酸分子の検出方法は、調製する工程と、会合させる工程と、算出する工程と、を有する。
前記調製する工程は、解析対象の核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブと、生体試料とを含む試料溶液を調製する。
前記会合させる工程は、前記調製する工程において調製された試料溶液中の核酸分子と前記核酸プローブとを会合させる。
前記算出する工程は、前記会合させる工程の後、前記調製する工程において調製された試料溶液中の、前記核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する。
さらに、本発明の第一の態様に係る核酸分子の検出方法は、光検出領域の位置を移動する工程と、蛍光を検出する工程と、会合体を個別に検出する工程と、計数する工程と除去する工程、を有する。
前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記算出する工程における前記試料溶液内の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する。前記蛍光を検出する工程は、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する。
前記会合体を個別に検出する工程は、前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する。
前記計数する工程は、前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する。

前記除去する工程は、前記算出する工程の前に、前記試料溶液からタンパク質を除去する。又は、前記除去する工程は、前記調製する工程の前に、前記生体試料からタンパク質を除去する。　本発明の第二の態様に係る核酸分子の検出方法は、前記会合させる工程の後、前記算出する工程の前に、前記試料溶液からタンパク質を除去する工程を有する。
　本発明の第三の態様に係る核酸分子の検出方法は、前記試料溶液又は前記生体試料からのタンパク質の除去を、当該試料溶液又は当該生体試料中の核酸分子を、無機支持体に吸着させた後、吸着させた核酸を無機支持体から溶出させることにより行う。
　本発明の第四の態様によれば、前記生体試料が、生体から採取された後、タンパク質分解酵素処理がなされる。
　本発明の第五の態様によれば、前記核酸プローブが、蛍光物質により標識されている。
　本発明の第六の態様によれば、前記核酸プローブが、蛍光物質により標識されている。前記調製する工程において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれている。前記核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質である。前記算出する工程において、前記核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光である。
　本発明の第七の態様によれば、前記核酸プローブは、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されている。当該核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光である。
　本発明の第八の態様によれば、前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される。
　本発明の第九の態様によれば、前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される。
　本発明の第十の態様に係る核酸分子の検出方法は、前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出される。　本発明の第十一の態様によれば、前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含む。
　本発明の第十二の態様に係る核酸分子の検出方法は、前記会合させる工程を、前記調製する工程において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を会合させる。
　本発明の第十三の態様によれば、前記核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されている。
　上述の核酸分子の検出方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、上述の核酸分子の検出方法によれば、解析対象である核酸分子が、試料中に極微量にしか存在していない場合であっても検出することができる。
　上述の核酸分子の検出方法は、さらに、核酸プローブと生体試料中の解析対象である核酸分子との会合体の走査分子計数法による検出を行う前に、試料溶液から生体試料由来のタンパク質を除去する。そのため、解析対象の核酸分子を走査分子計数法によってより精度よく検出することができる。
本発明の実施形態における走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 図１Ａの光分析装置のコンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 図１Ａの光分析装置のミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術によって計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ａの場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ａの場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示した図である。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 本発明の試験例１において、各試料溶液において計数されたピーク数の値を示した図である。 本発明の実施例１において、各試料溶液中において、試料溶液中の会合体の濃度と計数されたピーク数の値との関係を示した図である。 本発明の実施例２において、各試料溶液において計数されたピーク数の値を示した図である。
　まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。すなわち、走査分子計数法は、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。走査分子計数法は、ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、走査分子計数法は、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と比較して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することができる。
　発光粒子は、観測対象となる粒子と発光プローブとが結合又は会合した粒子を意味する。「発光プローブ」とは、観測対象となる粒子に結合又は会合する性質を有し、且つ、光を発する物質（通常、分子又はそれらの凝集体）である。発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。本実施形態の核酸分子の検出方法において用いられる核酸プローブは、発光プローブに相当する。
　本発明の実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域である。対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、上記の領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、逐次的に、光の検出が行われる。即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される。実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出したい粒子と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。そして、逐次的に検出された光において、発光プローブからの光信号が個別に検出される。これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成は、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するように構成してもよい（粒子のカウンティング）。上記の構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法（例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定する手法）によれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度もしくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度もしくは濃度の比が算出されるように構成してもよい。また、走査分子計数法は、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されている。そのため、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測ができる（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないため、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて行ってよい。なお、本実施形態において、「１つの粒子に結合した発光プローブ」とは、以下の場合を含む：
　　・　１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合。
　　・　複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合。
　　・　実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合。
本実施の形態では、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるように構成してもよい。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解されるように、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化することがある。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減する。そのため、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本実施形態の核酸分子の検出方法においては、核酸プローブを含む会合体）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されているように、走査分子計数法は、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、光信号（検出したい粒子の存在を表す光信号）が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上述したように、光検出領域の移動速度は粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定される。具体的には、移動速度は、核酸プローブを含む会合体の拡散移動速度よりも高い速度にて移動されるように設定される。これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの光信号（粒子の存在を表す光信号）に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上述したように、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度を適宜変更することが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるように構成してもよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよい。例えば、光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能である。
　走査分子計数法の光検出機構は、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されている。このため走査分子計数法で用いる試料溶液の量は、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用できる。
　また、走査分子計数法は、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するように構成されているので、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報が取得できる。すなわち、走査分子計数法は、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出する。そのため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度が決定できる。実際に、核酸プローブを含む会合体等を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の核酸分子の検出方法によれば、試料溶液中のこれらの会合体の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、核酸分子を識別できる。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様は、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様にあるいは試料溶液が機械的に安定した状態で観測する。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合と比較して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。それは、流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となるからである。また、流れを与える場合には、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブもしくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性があるためである。また、試料溶液中の検出対象となる粒子（本実施形態においては、核酸プローブを含む会合体等）に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、基本的な構成において、図１Ａに模式的に例示されているように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせて構成される光分析装置により実現できる。図１Ａに示すように、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。この光学系では、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端において固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となる。この平行光は、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブが分散又は溶解されている。典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様では、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過する。光（Ｅｍ）が、バリアフィルター１４を透過するとき、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。そして、特定の波長帯域の光成分のみが選択された光は、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達する。光検出器１６に到達した光は、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。上記の構成において、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されているレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。レーザ光の焦点領域は、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。さらに、レーザ光の焦点領域の実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。
また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出される。そのため、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。このステージ位置変更装置１７ａは、粒子等を観察するためのウェル１０を変更するために用いられる。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。上記構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成できる。
　更に、上記の光分析装置の光学系は、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する機構が設けられている。即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。上記の光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されているように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。上記ミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するために、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい。また、コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるように構成してもよい。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるように構成してもよい。上記のように、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなる。そのため、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示のように、複数の励起光源２が設けられていてもよい。また、光分析装置１においては、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるように構成してもよい。同様に、光検出器１６は複数個備えられていてもよい。また、光検出器１６は、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるように構成してもよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。そのため、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合（例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合）には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れず、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性が検出できる。
　走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理は、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）の駆動による光路の変更である。図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
そうすると、例えば、図２Ａのように、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０～ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれているような有意な光強度（Ｅｍ）が検出される。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されているような有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出される。個別に検出した前記粒子の数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、あるいは、濃度もしくは数密度に関する情報が取得できる。前記走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出のように、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液であっても、粒子の濃度もしくは数密度に関する情報が取得できる。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することができる。蛍光分光光度計やプレートリーダーによってある蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法は、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出する。そのため、走査分子計数法は、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できる。
　また、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度が向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合である量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法は、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出する。そのため、走査分子計数法は、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、以下の手順が行われる。すなわち、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置する。その後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。指示が入力されたコンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラムに従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。このプログラムは、試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順とを含む。前記計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御のもと、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、実行されるフォトンカウンティングである。例えば、光の検出は、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。また、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となる。そのため、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、あるいは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、前記移動速度は、観測対象粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。観測対象粒子とは、より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブである。
走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって観測対象粒子の位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれているように、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が図３Ｂのようにランダムに変化し、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。なお、前述したように、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。
そこで、好適には、図４Ａに描かれているように、粒子が光検出領域を略直線に横切るように設定されるとよい。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示のように、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。なお、粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２ ＝６Ｄ・Δｔ　　 …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２ ／６Ｄ 　　…（２）
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、前記Ｖdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されているように略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれているように、光検出領域（光学系により決定される光検出領域）の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定される。その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定される。また、前記閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、一つの観測対象粒子が検出されるように構成してもよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。プロファイルの具体的な値は、実験的に任意に設定されてよい。もしくは、プロファイルの具体的な値は、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２ ／ａ２ ） 　　…（４）
であると仮定できるときには、以下のような手法が用いられる。有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。なお、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、その光強度のプロファイルは、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により観測対象粒子のカウンティングが為されてよい。
　図５及び図６Ｂに示すように、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、前記時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるためであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じる可能性がある。しかしながら、前記スムージング処理によって、前記データ値の欠落を無視できる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータは、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。なお、前述したパラメータとは、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数などである。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されているように、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、前記時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　その後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値が参照される。次に、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける相関係数（最小二乗法の相関係数）等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数である。また、フィッティングされる釣鐘型関数は、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、判定される（ステップ１５０）。即ち、この判定では、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等を判定する。このようにして、図７左に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子がカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるように構成されてもよい。
参照溶液の粒子は、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　 …（５）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるように構成されてもよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ 　　…（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて与えられる。例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして、総体積が与えられてもよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶し、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるように構成されてもよい。
＜核酸分子の検出方法＞
　本実施形態の核酸分子の検出方法は、特定の塩基配列を有する核酸分子を解析対象とし、当該核酸分子と特異的に結合する核酸プローブを用いて、当該核酸プローブと解析対象の核酸分子（以下、標的核酸分子、と称することがある。）とをハイブリダイズさせ、形成された会合体の量に基づいて解析対象の核酸分子を検出する方法である。さらに本実施形態は、会合体の検出を、上記の走査分子計数法により測定する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、蛍光を有する粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の核酸分子に対しても測定できる。このため、本実施形態の核酸分子の検出方法により、試料溶液中の標的核酸分子の濃度が非常に低い場合であっても、形成された会合体を高感度に計数することができる。
　本実施形態において、「核酸プローブが、標的核酸分子と特異的に結合する」とは、当該核酸プローブが、その他の１本鎖核酸分子とよりも、当該標的核酸分子と優先的にハイブリダイズすることを意味する。具体的には、当該標的核酸分子が１本鎖核酸分子の場合は、その他の１本鎖核酸分子とよりも、当該１本鎖核酸分子と優先的にハイブリダイズすることを意味する。また、当該標的核酸分子が２本鎖核酸分子の場合は、当該標的核酸分子を構成する２本の１本鎖核酸分子のうちの一方と優先的にハイブリダイズすることを意味する。このため、核酸プローブは、標的核酸分子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、ミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　本実施形態は、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いる。標的核酸分子と核酸プローブとをハイブリダイズさせ、形成された会合体を検出することにより、生体試料中に含まれるその他の核酸分子と区別して、標的核酸分子を検出できる。生体試料中に標的核酸分子が存在していた場合には、当該生体試料と核酸プローブとを混合させた試料溶液中から、当該核酸プローブを含む会合体が検出される。一方で、当該生体試料中に標的核酸分子が存在していなかった場合には、当該試料溶液中から当該核酸プローブを含む会合体は検出されない。
　なお、本実施形態において用いられる核酸プローブは、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、核酸プローブは、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、核酸プローブは、ＤＮＡとＲＮＡとからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。また、核酸プローブは、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含む物質であってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾された物質や、タンパク質や低分子化合物等で標識された物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、核酸類似物質としては、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。また、解析対象とする核酸は、ＤＮＡであってもよい。また、解析対象とする核酸は、ＲＮＡであってもよい。また、解析対象とする核酸は、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたＤＮＡであってもよい。
　本実施形態は、核酸プローブが単独で存在している状態と、他の１本鎖核酸分子と会合体を形成している状態とで蛍光強度を異ならせることにより、走査分子計数法において、核酸プローブ及び他の１本鎖核酸分子から形成された会合体と、会合体を形成していない核酸プローブとを区別して検出することができる。
　また、本実施形態は、分子ビーコンプローブを、核酸プローブとして用いることもできる。分子ビーコンプローブは、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドであり、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させたプローブである。会合体を形成している核酸プローブからはエネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光が検出される。それに対して、単独で存在している核酸プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。
　本実施形態において核酸プローブとして用いる分子ビーコンプローブとしては、標的核酸分子とハイブリダイズが可能な塩基配列を有しており、かつ３’末端側の領域及び５’末端側の領域に互いに相補的な塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。本実施形態の分子ビーコンプローブは、好ましくは、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成する。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的核酸分子と相補的な塩基配列からなる領域を挟むようにして存在していればよい。例えば、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいてもよい。また、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含まなくてもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的核酸分子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成できる程度であればよい。
　なお、蛍光物質は、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されず、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。また、核酸プローブの蛍光物質による標識は、常法により行うことができる。
　また、蛍光性２本鎖核酸結合物質との間でＦＲＥＴが起こる蛍光物質により標識された核酸プローブを用いることによっても、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブと区別して検出することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と核酸プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が当該ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している第１核酸プローブ等の核酸プローブからは、当該核酸プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、会合体には蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、会合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している核酸プローブとは区別して検出することができる。
　２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。なお、会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を与える可能性がある。このため、会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、核酸プローブを設計することが好ましい。
　その他、本実施形態は、２本以上の核酸プローブを用いて、標的核酸分子を検出することもできる。例えば、２本の核酸プローブは、標的核酸分子に対して互いに隣接する状態で特異的にハイブリダイズするように設計する。特異的にハイブリダイズした２本の核酸プローブは、一方の核酸プローブを蛍光物質で標識し、他方の核酸プローブを一方の核酸プローブを標識している蛍光物質との間でＦＲＥＴが起こる蛍光物質もしくは消光物質により標識する。２本の核酸プローブをそれぞれ標識することによって、核酸プローブを含む会合体を、単独で存在している核酸プローブと区別して検出することができる。すなわち、標的核酸分子に、２本の核酸プローブが互いに隣接してハイブリダイズするため、これら３者からなる会合体ではＦＲＥＴが起こる。このため、当該ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、核酸プローブを含む会合体を検出することができる。
　本実施形態の核酸分子の検出方法は、具体的には、下記の工程（ａ）～（ｃ）を有し、下記工程（ｃ）の前に、下記試料溶液からタンパク質を除去する工程、又は下記工程（ａ）の前に、下記生体試料からタンパク質を除去する工程、を有する：
（ａ）標的核酸分子（解析対象の核酸分子）と特異的にハイブリダイズする核酸プローブと、生体試料とを含む試料溶液を調製する工程。
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子と前記核酸プローブとを会合させる工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の、前記核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する工程。
　まず、工程（ａ）は、核酸プローブと生体試料とを含む試料溶液を調製する。具体的には、核酸プローブと生体試料を適当な溶媒に添加して、試料溶液が調製される。該溶媒は、以下のような溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。すなわち、溶媒は、核酸プローブによる会合体の形成、及び、走査分子計数法による会合体の検出を阻害しなければよい。該バッファーは、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等である。
　核酸プローブを含む会合体の検出に、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用いる場合には、核酸プローブ等と同様に、蛍光性２本鎖核酸結合物質は試料溶液中に添加される。
　本実施形態において提供される生体試料としては、生体から採取された組織片などが挙げられる。具体的には、血液、リンパ液、骨髄液、腹水、滲出液、羊膜液、喀痰、唾液、***、胆汁、膵液、尿等の体液、生体から採取された組織片、糞便、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、又は膀胱洗浄液等が挙げられる。また、生体試料は、細胞を分離回収した細胞成分であってもよい。具体的には、生体から採取された後、遠心分離処理、クロマトグラフィー法等により分離回収された細胞成分、組織片の結合組織を分解して細胞をばらばらにした溶液、組織片をばらばらにした後に分離回収された細胞成分等が挙げられる。当該細胞成分としては、血液から分離回収された血漿や血清等が挙げられる。また、生体試料は、生体から採取された組織片をパラフィン包埋した後、作製されたパラフィンブロック又はその切片を脱パラフィンすることによって得られた試料であってもよい。なお、生体からの採取、遠心分離処理、クロマトグラフィー法、パラフィン包埋、及び脱パラフィンは、常法により行うことができる。
　生体試料は、予め、タンパク質分解酵素処理を行っていてもよい。当該タンパク質分解酵素としては、例えばプロテイナーゼＫ等が挙げられる。なお、通常、前処理としてタンパク質分解酵素処理を行った場合には、酵素反応後、当該酵素の不活性化処理が行われる。例えば、プロテイナーゼＫの場合、一般的には、５０～６０℃で３０分間～数時間の酵素反応を行った後、７０℃で５～１５分間の不活性化処理が行われる。しかしながら、本実施形態では、当該不活性化処理を省略することができる。
　次いで、工程（ｂ）では、工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を会合させる。試料溶液中の核酸分子が二本鎖核酸分子である場合には、会合させる前に、変性させることが好ましい。本実施形態において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、１本鎖核酸分子中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、核酸プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、核酸分子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該核酸プローブを含む会合体を形成することができる場合がある。
　本実施形態は、蛍光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。特に、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該試料溶液を、高温処理をすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性することができる。一般的には、ＤＮＡは９０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができる。また、一般的には、ＲＮＡは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができる。しかしながら、核酸分子を変性させる温度は、標的核酸分子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、上記温度に限定されるものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　本実施形態は、必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の核酸分子を会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該試料溶液の温度を、核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該試料溶液の塩濃度を、核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。
　なお、核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、標的核酸分子と核酸プローブとからなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、核酸プローブと標的核酸分子のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した核酸プローブと標的核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　核酸プローブと標的核酸分子とが特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、核酸プローブの塩基配列情報から、標的核酸分子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出できる。本実施形態においては、好ましくは、試料溶液の温度を、核酸プローブ中の標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　その他、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、工程（ｃ）の前に、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことが好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。これらの化合物は、工程（ａ）において試料溶液を調製する際に試料溶液に含ませてもよい。また、これらの化合物は、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の前に、試料溶液に添加してもよい。
　生体試料中に含まれている自家蛍光を有するタンパク質を初めとする様々な夾雑物は、走査分子計数法による測定において、非特異的なシグナルの発生や透過する光路の阻害等の障害の原因となる。本実施形態においては、工程（ｃ）における走査分子計数法による測定を、生体試料由来のタンパク質を除去した状態で行うため、生体試料由来の夾雑物による影響が顕著に抑制され、低濃度の標的核酸分子を精度よく検出することができる。
　生体試料由来のタンパク質の除去は、工程（ｃ）における走査分子計数法による測定の前に行われていればよい。例えば、本実施形態は、工程（ａ）において、生体から採取後にタンパク質の除去処理がなされた生体試料を、核酸プローブと混合して試料溶液を調製してもよい。また、工程（ａ）の後工程（ｂ）の前に、試料溶液に対してタンパク質の除去処理を行ってもよい。また、工程（ｂ）の後工程（ｃ）の前に、試料溶液に対してタンパク質の除去処理を行ってもよい。本実施形態は、試料調製の手間や時間を削減することができるため、以下の場合に、試料溶液に対してタンパク質の除去処理を行うことが好ましく、工程（ａ）の後工程（ｂ）の前の試料溶液に対してタンパク質の除去処理を行うことがより好ましい：
　　・　工程（ａ）の後工程（ｂ）の前の場合。
　　・　工程（ｂ）の後工程（ｃ）の前の場合。
　タンパク質の除去処理は、当該技術分野において公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。例えば、核酸プローブと混合する前の生体試料、工程（ａ）において調製された試料溶液、又は工程（ｂ）の後の試料溶液（以下、生体試料等）を、無機支持体に接触させることにより、生体試料等に含まれていた核酸分子を当該無機支持体に吸着させた後、吸着させた核酸分子を無機支持体から溶出させることにより、タンパク質が除去された生体試料等が得られる。
　当該無機支持体は、核酸分子を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、当該無機支持体の形状は特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。当該無機支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。吸着させた核酸分子を無機支持体から溶出させる溶媒は、これらの公知の無機支持体から核酸分子を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。当該溶出用溶媒としては、特に精製水であることが好ましい。なお、核酸分子を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄した後に、当該無機支持体から核酸分子を溶出させることが好ましい。
　本実施形態においては、タンパク質の除去処理を行う前に、生体試料等に含まれているタンパク質を変性させてもよい。タンパク質の変性は、公知の手法で行うことができる。例えば、生体試料等にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を添加することにより、生体試料等中のタンパク質が変性できる。生体試料等にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等を添加する場合には、１種類の化合物が添加されてもよく、２種類以上の化合物が添加されてもよい。生体試料等に含有させることができるカオトロピック塩として、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等が挙げられる。生体試料等に含有させることができる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。該非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３－［３－コラミドプロピルジメチルアンモニオ]－１－プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。生体試料等に含有させることができる有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。
　変性させたタンパク質は、例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより除去することができる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質が除去できる。得られた上清を前記無機支持体にさらに接触させ、さらにタンパク質除去処理が行われてもよい。
　その他、生体試料が血漿や血清等のように、比較的タンパク質含有量が少ない生体試料である場合には、タンパク質除去剤を用いてタンパク質を凝集させた後、固液分離処理によって液体成分を回収することによって、タンパク質を除去することができる。具体的には、生体試料にタンパク質除去剤を添加した後、攪拌もしくは静置することによってタンパク質を凝集させた後、遠心分離処理を行い、上清が回収される。タンパク質除去剤としては、例えば、イオン交換樹脂等のタンパク質に対して親和性の高い物質を用いることができる。
　その後、本実施形態は、工程（ｃ）として、試料溶液中の、核酸プローブを含む会合体の分子数を、走査分子計数法により算出する。具体的には、会合体を形成させた後の試料溶液を、前記走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記手法により、会合体から放出される蛍光を検出し解析することにより、会合体の分子数が算出される。算出された会合体の分子数が、測定試料中に含まれている標的核酸分子の数である。すなわち、当該会合体を検出することにより、標的核酸分子が検出できる。
　次に実施例等を示して本発明の実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明の実施形態は以下の実施例等に限定されるものではない。
［試験例１］
　試験例１は、一本鎖の標的核酸分子及び核酸プローブとして、人工的に合成したオリゴヌクレオチドを用い、これらをウマ全血又はウマ血漿に添加した試料を、生体試料の摸擬試料とし、当該摸擬生体試料中の標的核酸分子を走査分子計数法により検出した。
　測定に用いた標的核酸分子Ａ及び核酸プローブＡの塩基配列を表１に示す。核酸プローブＡは分子ビーコンプローブである。下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜試料溶液の調製＞
　試験例１は、標的核酸分子Ａ及び核酸プローブＡを、それぞれ５０ｐＭとなるようにトリスバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で混合することにより、５０ｐＭ核酸プローブ溶液を調製した。また、標的核酸分子Ａ及び核酸プローブＡを、それぞれ５ｐＭとなるように前記トリスバッファー中で混合することにより、５ｐＭ核酸プローブ溶液を調製した。得られた核酸プローブ溶液を、９５℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、２０℃で１０分間のアニーリング処理し、標的核酸分子Ａと核酸プローブＡとからなる会合体を形成した。
　一方で、５０μｌのウマ全血又は５０μｌのウマ血漿から、核酸抽出キット（製品名：ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて核酸抽出液を調製した。当該核酸抽出液は、本発明の実施形態におけるタンパク質除去処理後の生体試料に相当する。また、核酸抽出キットによる処理前のウマ全血又はウマ血漿は、タンパク質除去処理前の生体試料に相当する。
　調製された核酸抽出液に、それぞれ５０μｌずつ、アニーリング処理後の５０ｐＭ核酸プローブ溶液又は５ｐＭ核酸プローブ溶液を添加し、試料溶液を調製した（試料調製（＋））。また、５０μｌのウマ全血及び５０μｌのウマ血漿に、それぞれ５０μｌずつ、アニーリング処理後の５０ｐＭ核酸プローブ溶液又は５ｐＭ核酸プローブ溶液を添加し、試料溶液を調製した（試料調製（－））。さらに、対照として、５０μｌの前記トリスバッファーに、それぞれ５０μｌずつ、アニーリング処理後の５０ｐＭ核酸プローブ溶液又は５ｐＭ核酸プローブ溶液を添加し、試料溶液を調製した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。
＜走査分子計数法による計数＞
　試験例１は、各試料溶液中の標的核酸分子Ａ及び核酸プローブＡからなる会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測においては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて、回転速度６，０００ｒｐｍ、３００μＷで照射する。また、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０～６２０ｎｍとした。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルは、ＢＩＮＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。
　測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークが検出された。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域は、シグナルとして抽出される。
　計数結果を図８及び表２に示す。図８中、各濃度は、各試料溶液中の標的核酸分子Ａの濃度を示す。生体試料を添加していない試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）において計数されたピーク数が、生体試料由来の夾雑物による影響を受けていない信頼性の高い計数結果である。タンパク質除去処理を行わなかった生体試料を添加した試料溶液（試料調製（－））の場合には、血液と血漿の両方において、試料溶液中の標的核酸分子の数とは無関係に、試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも顕著にピーク数が多かった。これは、生体試料中の夾雑物により、走査分子計数法による測定で非特異的なシグナルが発生し、ピークが増加したためと考えられる。これに対して、タンパク質除去処理を行った生体試料を添加した試料溶液（試料調製（＋））の場合には、生体試料を添加していない試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と同程度のピーク数が計数された。これらの結果から、走査分子計数法による測定で非特異的なシグナルの発生原因と成る可能性がある生体試料由来の夾雑物は、予めタンパク質除去処理を行うことにより除くことができ、より正確な測定が可能になったことが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１］
　実施例１においては、蛍光標識されたプライマーと非標識のプライマーを用いてＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物のうち、非標識のプライマーから伸長した一本鎖核酸分子を標的核酸とした。蛍光標識されたプライマーから伸長した一本鎖核酸分子を核酸プローブとした。これらをパラフィン包埋組織切片から脱パラフィン処理により得られた生体試料に添加したものを擬似生体試料とし、当該擬似生体試料中の標的核酸分子を走査分子計数法により検出した。
＜標的核酸分子Ｂ及び核酸プローブＢの調製＞
　実施例１においては、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＴＡＭＲＡ標識のオリゴヌクレオチドプライマー、蛍光物質で標識されていないオリゴヌクレオチドプライマー、及びＰＣＲキット（製品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、８００ｂｐの鎖長からなるＰＣＲ産物を調製した。Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製)を用いて、当該ＰＣＲ産物から未反応のオリゴヌクレオチドプライマーを除去した後、電気泳動装置Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用いた電気泳動により、ＰＣＲ産物の有無及び濃度を測定した。トリスバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、当該ＰＣＲ産物の濃度が２ｐＭ、２０ｐＭ、又は２００ｐＭとなるように調整したＰＣＲ産物溶液をそれぞれ調製した。なお、当該ＰＣＲ産物を構成する２本の１本鎖核酸分子のうち、蛍光標識されている核酸分子を核酸プローブＢとした。また、蛍光標識されていない核酸分子を標的核酸分子Ｂとした。
＜試料溶液の調製＞
　実施例１においては、ラット肝臓及び腎臓の４％ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、キシレンによる脱パラフィンした後、プロテイナーゼＫを添加し、５６℃で１０分間酵素反応処理を行った。酵素反応処理後の溶液は、プロテイナーゼＫ処理済生体試料溶液とした。
　プロテイナーゼＫ処理済生体試料溶液と、各濃度のＰＣＲ産物溶液又は前記トリスバッファーとを等量ずつ添加し、ＰＣＲ産物濃度が０、１、１０、及び１００ｐＭの試料溶液をそれぞれ調製した（タンパク質除去処理無し）。各試料溶液は、さらに、９５℃で１０分間、５５℃で１０分間、その後室温に維持することにより、アニーリング処理を行った。
　一方で、プロテイナーゼＫ処理済生体試料溶液をさらに７０℃で１０分間処理した後、等量のＰＣＲ産物溶液又は前記トリスバッファーをそれぞれ添加し、ＰＣＲ産物濃度が０、１、１０、及び１００ｐＭの試料溶液をそれぞれ調製した。各試料溶液に対しては、さらに、試料溶液（タンパク質除去処理無し）と同様にアニーリング処理を行った。その後、核酸精製キット（製品名：ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、前記アニーリング処理した試料溶液を精製し、得られた核酸抽出液を測定試料とした（タンパク質除去処理あり１）。
　また、７０℃で１０分間の処理を行うことなく、プロテイナーゼＫ処理済生体試料溶液と、各濃度のＰＣＲ産物溶液又は前記トリスバッファーとを等量ずつ添加し、ＰＣＲ産物濃度が０、１、１０、及び１００ｐＭの試料溶液をそれぞれ調製した。各試料溶液に対しては、さらに、試料溶液（タンパク質除去処理あり１）と同様にして、アニーリング処理を行った後、核酸精製キットを用いて精製し、得られた核酸抽出液を測定試料とした（タンパク質除去処理あり２）。
　対照として、各濃度のＰＣＲ産物溶液と前記トリスバッファーとを等量ずつ添加し、ＰＣＲ産物濃度が０、１、１０、及び１００ｐＭの試料溶液をそれぞれ調製した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。各試料溶液に対しては、さらに、試料溶液（タンパク質除去処理無し）と同様にアニーリング処理を行った。
＜走査分子計数法による計数＞
　実施例１においては、試験例１と同様にして、走査分子計数法により、上記の各試料溶液中に存在する標的核酸分子Ｂと核酸プローブＢからなる会合体の数を計数した。
　計数結果を図９及び表３に示す。さらに、図９において、各試料溶液における標的核酸分子の濃度と、計数されたピーク数の関係の近似直線を表４に示す。生体試料を添加していない試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）において計数されたピーク数が、生体試料由来の夾雑物による影響を受けていない信頼性の高い計数結果である。試料溶液（タンパク質除去処理無し）では、試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べて極端な高値を示した。また、試料溶液中の標的核酸分子の濃度と検出されるピーク数との関係は、試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、著しく直線性が失われていた。一方で、試料溶液（タンパク質除去処理あり１）及び試料溶液（タンパク質除去処理あり２）は、いずれも試料溶液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等のピーク数が検出されており、いずれも測定試料中の標的核酸分子を定量的に精度よく検出できることが示された。特に、プロテイナーゼＫ処理後の酵素失活処理を省略した試料溶液（タンパク質除去処理あり２）は、試料溶液（タンパク質除去処理あり１）と同様に精度よく標的核酸分子を検出できることから、本発明の実施形態の核酸分子の検出方法により、酵素の失活処理等を省略した場合であっても、走査分子計数法による計測ができることは明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例２］
　実施例２においては、蛍光標識されたプライマーと非標識のプライマーを用いてＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物のうち、非標識のプライマーから伸長した一本鎖核酸分子を標的核酸とした。蛍光標識されたプライマーから伸長した一本鎖核酸分子を核酸プローブとした。これらをウマ血漿に添加した試料を擬似生体試料とし、当該擬似生体試料中の標的核酸分子を走査分子計数法により検出した。
＜標的核酸分子Ｃ及び核酸プローブＣの調製＞
　実施例２においては、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型とし、ＡＴＴＯ６４７Ｎ標識のオリゴヌクレオチドプライマー、蛍光物質で標識されていないオリゴヌクレオチドプライマー、及びＰＣＲキット（製品名：ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、８００ｂｐの鎖長からなるＰＣＲ産物を調製した。Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製)を用いて、当該ＰＣＲ産物から未反応のオリゴヌクレオチドプライマーを除去した後、電気泳動装置Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用いた電気泳動により、ＰＣＲ産物の有無及び濃度を測定した。トリスバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、当該ＰＣＲ産物の濃度が２ｐＭ、２０ｐＭ、又は２００ｐＭとなるように調整したＰＣＲ産物溶液をそれぞれ調製した。なお、当該ＰＣＲ産物を構成する２本の１本鎖核酸分子のうち、蛍光標識されている核酸分子を核酸プローブＣとした。また、蛍光標識されていない核酸分子を標的核酸分子Ｃとした。
＜試料溶液の調製＞
　実施例２においては、１．５ｍｌのチューブに、ウマ血漿と、実施例１で調製した２ｐＭ、２０ｐＭ、又は２００ｐＭのＰＣＲ産物溶液又は前記トリスバッファーとを等量ずつ添加し、ＰＣＲ産物濃度が０、１、１０、及び１００ｐＭである試料溶液１００μｌを、２本ずつそれぞれ調製した。
　２本ずつ調製した試料溶液のうち、１本にはタンパク質除去剤（製品名：ＢｉｎｄＰｒｏ（登録商標）、Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｇｒｏｕｐ社製）を２００μｌ加え、懸濁させた。一方には、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を２００μｌ加え、懸濁させた。その後、各試料溶液を１０分間静置した後、１６，０００×ｇで５分間遠心分離処理を行い、上清を分取した。
＜走査分子計数法による計数＞
　実施例２においては、励起光として６３３ｎｍのレーザ光を用い、検出光波長を、バンドパスフィルターを用いて６６０～７１０ｎｍとした以外は、試験例１と同様にして、走査分子計数法により、上記の各上清中に存在する標的核酸分子Ｃと核酸プローブＣからなる会合体の数を計数した。
　計数結果を図１０及び表５に示す。図１０中、「除去なし」はタンパク質除去剤に代えてＰＢＳを添加した試料溶液の結果（タンパク質除去処理無し）を示す。また、図１０中、「除去あり」はタンパク質除去剤を添加した試料溶液の結果（タンパク質除去処理あり）を示す。
また、図１０中、濃度は、各試料溶液中の標的核酸分子の濃度を示す。この結果、タンパク質除去処理を行わなかった試料溶液では、標的核酸分子の濃度に関わらず、いずれも顕著にピーク数が多かった。これに対して、タンパク質除去処理を行った試料溶液では、標的核酸分子の濃度が０ｐＭの場合にはほとんどピークが検出されず、かつ、１～１００ｐＭにおいて、標的核酸分子の濃度に依存したピーク数の増加が確認された。これらの結果から、走査分子計数法による測定の前に、生体試料由来のタンパク質の除去処理を行うことにより、非特異的なシグナルが消失し、標的核酸分子を精度よく検出できることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記核酸分子の検出方法によれば、試料溶液中に非常に低濃度にしか存在していない生体試料由来の核酸分子を、当該核酸分子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて特異的に発光させることにより、走査分子計数法により検出することができる。このため、生体試料中の核酸分子を検出する臨床検査等の分野で利用が可能である。
　１　光分析装置（共焦点顕微鏡）
　２　光源
　３　シングルモードオプティカルファイバー
　４　コリメータレンズ
　５　ダイクロイックミラー
　６、７、１１　反射ミラー
　８　対物レンズ
　９　マイクロプレート
　１０　ウェル（試料溶液容器）
　１２　コンデンサーレンズ
　１３　ピンホール
　１４　バリアフィルター
　１５　マルチモードオプティカルファイバー
　１６　光検出器
　１７　ミラー偏向器
　１７ａ　ステージ位置変更装置
　１８　コンピュータ

Claims (13)

  1. 　解析対象の核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プローブと、生体試料とを含む試料溶液を調製する工程と、
    　前記調製する工程において調製された試料溶液中の核酸分子と前記核酸プローブとを会合させる工程と、
    　前記会合させる工程の後、前記調製する工程において調製された試料溶液中の、前記核酸プローブを含む会合体の分子数を算出する工程と、
    を有し、
    　　前記算出する工程における前記試料溶液内の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
    　　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記会合体から放出される蛍光を検出する工程と、
    　　前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程と、
    　　前記個別に検出された会合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記粒子の数を計数する工程と、
    　　により行い、
    　　　前記算出する工程の前に、前記試料溶液からタンパク質を除去する工程、又は前記調製する工程の前に、前記生体試料からタンパク質を除去する工程、を有する核酸分子の検出方法。
  2. 　前記会合させる工程の後、前記算出する工程の前に、前記試料溶液からタンパク質を除去する工程を有する請求項１に記載の核酸分子の検出方法。
  3. 　前記試料溶液又は前記生体試料からのタンパク質の除去を、前記試料溶液又は前記生体試料中の核酸分子を、無機支持体に吸着させた後、吸着させた核酸を無機支持体から溶出させることにより行う請求項１又は２に記載の核酸分子の検出方法。
  4. 　前記生体試料が、生体から採取された後、タンパク質分解酵素処理がなされている請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  5. 　前記核酸プローブが、蛍光物質により標識されている請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  6. 　前記核酸プローブが、蛍光物質により標識されており、
    　前記調製する工程において、前記試料溶液中に、蛍光性２本鎖核酸結合物質がさらに含まれており、
    　前記核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質とのいずれか一方が、蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質であり、他方が前記蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・アクセプターと成る物質であり、前記算出する工程において、前記核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記核酸プローブを標識している蛍光物質と前記蛍光性２本鎖核酸結合物質との間に起こった蛍光エネルギー移動現象により放出される蛍光である請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  7. 　前記核酸プローブは、単独で存在している状態では蛍光エネルギー移動が起こり、かつ他の１本鎖核酸分子と会合体を形成した状態では蛍光エネルギー移動が起こらないように、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とが結合されており、
    　前記核酸プローブを含む会合体から放出される蛍光は、前記エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光である請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  8. 　前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  9. 　前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記会合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  10. 　前記検出された光から、個々の会合体からの光信号を個別に検出して、会合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの会合体が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  11. 　前記試料溶液が、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び尿素からなる群より選択される１種以上を含む請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  12. 　前記会合させる工程を、
    　前記調製する工程において調製された試料溶液の温度を７０℃以上にすることにより、前記試料溶液中の核酸分子を変性させた後、前記試料溶液の液温を０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることにより、前記試料溶液中の核酸分子を会合させることにより行う請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。
  13. 　前記核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似物質からなる群より選択される２以上の分子が結合して構成されている請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子の検出方法。 
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