CN101220395A - 一种检测dna单核苷酸多态性的方法 - Google Patents
一种检测dna单核苷酸多态性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101220395A CN101220395A CNA2008100575696A CN200810057569A CN101220395A CN 101220395 A CN101220395 A CN 101220395A CN A2008100575696 A CNA2008100575696 A CN A2008100575696A CN 200810057569 A CN200810057569 A CN 200810057569A CN 101220395 A CN101220395 A CN 101220395A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- nucleotide
- fluorescent substance
- polymorphic site
- mononucleotide polymorphic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种DNA单核苷酸多态性的检测方法。本发明提供的方法是用荧光物质标记待测样本的DNA，通过所述荧光物质与水溶性共轭聚合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸。本发明处理简便，省略了各种分离、纯化步骤，利用少量DNA就能够检测到单核苷酸多态位点的核苷酸，对于药物开发和遗传病的临床诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测DNA单核苷酸多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的***或缺失所致。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。基因组DNA中单核苷酸多态性的分析和测定是遗传病诊断和药物开发的重要工具，还可用来绘制基因图谱、分析人口结构、进行基因联合研究。
单核苷酸多态性分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如：DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，需要繁琐的分离或洗涤程序，增加了检测时间。采用均相检测方法可以避免上述问题，目前的均相检测方法均基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高；基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA单核苷酸多态性的检测方法。
本发明所提供的检测DNA单核苷酸多态性的方法，依次包括以下步骤：
1)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；
2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱有较好的重叠，光谱重叠积分范围为1.0×10-15～3.0×10-13M-1cm3；
式(I)中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；
所述式(I)化合物的数均分子量为5000-100000。
所述式(I)中，R具体可为6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一种。
所述式(I)中，X具体可为氯、溴和碘中的任意一种。
所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法可为：用荧光物质标记的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dUTP)或ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddUTP)对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻(上游或下游)的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。
所述单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端(5′或3′)核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端(5′或3′)核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻(上游或下游)20-25bp的序列互补。
确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法可为：若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法还可为：用荧光物质A标记与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dUTP)或ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddUTP)，用荧光物质B标记与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸的互补的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dUTP)或ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddUTP)，用所述荧光物质A标记的dNTP或ddNTP和荧光物质B标记的dNTP或ddNTP同时对PCR扩增产物进行单碱基延伸；
在同一激发光的作用下，所述荧光物质A和所述荧光物质B产生的荧光的波长至少相差40nm。
所述单碱基延伸中，所用的引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻(上游或下游)20-25bp的序列互补。
确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法可为：若单独出现PFP到荧光物质A的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若单独出现PFP到荧光物质B的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若两种荧光共振能量转移都出现，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
所述荧光物质具体可为荧光素、罗丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。
式(I)所示的PFP为水溶性共轭聚合物或寡聚物，具有与DNA结合强、荧光量子产率高、能对DNA上标记的荧光物质有显著的荧光增幅等特性。本发明利用具有优越荧光性能的PFP，使用荧光物质标记的单核苷三磷酸，PCR技术在引物或扩增片段上标记荧光物质，观察标记的荧光物质与PFP的荧光共振能量转移(FRET)情况进而了解待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸。
本发明所提供的检测DNA单核苷酸多态性的方法克服了现有DNA单核苷酸多态性检测技术的种种不足，具有高效、灵敏、简便、快速、无需分离等优点。与应用最广泛的电泳分析方法相比，本发明处理简便，省略了各种分离、纯化步骤，利用少量DNA(基因组DNA小于25纳克，PCR产物小于100纳克)就能够检测到待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸，对于药物开发和遗传病的临床诊断具有重要意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为应用PFP1检测野生型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
图2为应用PFP1检测突变型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
图3为应用PFP1检测杂合型样本RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
图4为应用PFP1检测RS1800469位点单核苷酸多态性的荧光强度比率图。
图5为应用PFP2检测野生型DNA序列RS28934574位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
图6为应用PFP2检测突变型DNA序列RS28934574位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
图7为应用PFP2检测杂合型DNA序列RS28934574位点单核苷酸多态性的荧光光谱。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明具体提供了两种检测DNA单核苷酸多态性的方法：
方法一：引物特异性的单碱基延伸
1、合成PFP。
2、提取待测样本的基因组DNA。
3、PCR扩增
按常规PCR方法扩增基因组DNA，扩增片断中含有目标单核苷酸多态位点。
4、单碱基延伸
PCR扩增产物经核酸外切酶I和磷酸水解酶消化后，不经分离取少量按常规方法进行单碱基延伸。使用的单核苷三磷酸为荧光素标记的单核苷三磷酸。引物与目标序列匹配时，成功延伸，这样荧光素就被标记在引物上；引物与目标序列不匹配(在引物3’端最后一个碱基)时则不能延伸，荧光素不能被标记在引物上。
5、荧光光谱测定
延伸产物经碱性磷酸酶消化后，不经分离取少量稀释100倍后与PFP聚合物或寡聚物作用，只有标记到DNA上的荧光素才能与PFP发生荧光共振能量转移(FRET)，这是因为PFP聚合物或寡聚物的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重叠，长链的DNA与聚合物或寡聚物形成静电复合物使DNA上的荧光素距离PFP很近而发生有效的能量转移。若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
方法二：单核苷三磷酸特异性的单碱基延伸
1、合成PFP。
2、提取待测样本的基因组DNA。
3、PCR扩增
按常规PCR方法扩增基因组DNA。
4、单碱基延伸
PCR扩增产物经核酸外切酶I和磷酸水解酶消化后，不经分离取少量按常规方法进行单碱基延伸。用Cy3标记与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补的单核苷三磷酸，用荧光素标记与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补的单核苷三磷酸。当加入的待测DNA所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生型时，Cy3标记的单核苷三磷酸成功延伸，Cy3被标记到引物上；当加入的待测DNA所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变型时，荧光素标记的单核苷三磷酸成功延伸，荧光素被标记到引物上。当加入的待测DNA所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型时，Cy3标记的单核苷三磷酸和荧光素标记的单核苷三磷酸都能成功延伸，Cy3和荧光素都被标记到引物上。
5、荧光光谱测定
延伸产物经碱性磷酸酶消化后，不经分离取少量稀释100倍后与PFP聚合物或寡聚物作用，只有标记到DNA上的Cy3或荧光素才能与PFP发生荧光共振能量转移(FRET)，这是因为PFP聚合物或寡聚物的发射光谱与Cy3或荧光素的吸收光谱有较好的重叠，长链的DNA与聚合物或寡聚物形成静电复合物使DNA上的Cy3或荧光素距离PFP很近而发生有效的能量转移。若单独出现PFP到Cy3的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若单独出现PFP到荧光素的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若两种荧光共振能量转移都出现，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
实施例1、应用PFP1检测野生型样本RS1800469位点的单核苷酸多态性
一、PFP1的合成
PFP1的结构如式(II)所示，合成方法如下：
向100mL的单口瓶加入50mL甲苯、5.2克新戊二醇和0.5克对甲苯磺酸，回流24小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂：二氯甲烷)后得到4.8克1，4-苯二硼酸新戊二酯。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)7.78(4H，s)，3.77(8H，s)，1.02(12H，s)。
向25mL的二口瓶中加入5.4mL甲苯和3.6mL 2M碳酸钾，鼓入氮气30分钟后，加入325毫克2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴，165毫克1，4-苯二硼酸新戊二酯和20毫克四(三苯基膦)钯，于氮气下95℃搅拌反应24小时，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩，丙酮沉淀，得到210毫克浅黄色固体。将固体溶于20毫升二氯甲烷，加入1毫升三乙胺于室温搅拌24小时后离心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚合物PFP1，Mn＝3.5×104。1H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)7.3-8.0(10H，m)，2.9-3.2(16H，m)，2.2-2.3(4H，m)，1.5-1.6(4H，m)，0.9-1.2(30H，m)。
二、待测样本DNA的提取
用TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)从人血液样本中提取基因组DNA，按照说明书进行操作。
三、含有目标位点的DNA片段的扩增
从数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝snp)中查得RS1800469位点上下游序列信息，设计一对引物，以基因组DNA为模板按常规PCR方法扩增含有RS1800469位点的DNA片段。引物序列如下：
引物1序列(正义引物)：5’-GATGGCACAGTGGTCAAGAG-3’，
引物2序列(反义引物)：5’-ACCCAGAACGGAAGGAGAGT-3’。
四、单碱基延伸反应
1、对PCR扩增产物进行酶消化处理以除去未反应的引物和单核苷三磷酸。
2、向20μL PCR产物中加入6μL酶消化液(2.6μL 10×碱性磷酸酶反应缓冲液，1单位碱性磷酸酶(宝生物工程(大连)有限公司)，10单位核酸外切酶I(宝生物工程(大连)有限公司))于37℃反应40分钟，再于80℃加热15分钟使酶失活。
3、单碱基延伸
单碱基延伸对应RS1800469位点。单碱基延伸总体积为10μL，含2μL酶消化过的PCR产物，20pmol荧光素标记的dGTP(铂金埃尔默公司)，10pmol野生型特异性引物3或10pmol突变型特异性引物4(上海英骏生物技术有限公司)，1个单位Taq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)。
引物3序列：5’-AGGAGGGGGCAACAGGACACCTGAG-3’，
引物4序列：5’-AGGAGGGGGCAACAGGACACCTGAA-3’。
在表层覆盖一层矿物油，反应条件：95℃、4分钟变性后→30个循环：95℃、30秒，60℃、30秒。
五、荧光光谱测定
先对单碱基延伸产物进行酶消化处理以除去未反应的荧光素标记的dGTP。加入2μL酶消化液(1μL 10×碱性磷酸酶反应缓冲液，0.5单位碱性磷酸酶)，在37℃反应20分钟，接着80℃加热15分钟使酶失活。向含有PFP1(0.20μM)的1mL N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液(HEPES，25mM，pH 8)加6μL酶处理的反应液，扫描荧光光谱，激发波长为380纳米。
图1为分别用引物1和引物2做单碱基延伸得到的荧光光谱，使用引物1时有显著的能量转移而使用引物2时只出现了背景信号，说明待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为野生纯合型。
六、结果验证
将步骤三获得的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，用TIANgel Midi普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收目标片段。由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。
结果证明，PCR产物的序列见序列表的序列1，待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为野生纯合型。
实施例2、应用PFP1检测突变型样本RS1800469位点的单核苷酸多态性
一、PFP1的合成
同实施例1的步骤一。
二、待测样本DNA的提取
同实施例1的步骤二。
三、含有目标位点的DNA片段的扩增
同实施例1的步骤三。
四、单碱基延伸反应
同实施例1的步骤四。
五、荧光光谱测定
同实施例1的步骤五。
图2为分别用引物1和引物2做单碱基延伸得到的荧光光谱，使用引物2时有显著的能量转移而使用引物1时只出现了背景信号，说明待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为突变纯合型。
六、结果验证
同实施例1的步骤六。
结果证明，PCR产物的序列见序列表的序列2，待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为突变纯合型。
实施例3、应用PFP1检测杂合型样本RS1800469位点的单核苷酸多态性
一、PFP1的合成
同实施例1的步骤一。
二、待测样本DNA的提取
同实施例1的步骤二。
三、含有目标位点的DNA片段的扩增
同实施例1的步骤三。
四、单碱基延伸反应
同实施例1的步骤四。
五、荧光光谱测定
同实施例1的步骤五。
图3为分别用引物1和引物2做单碱基延伸得到的荧光光谱，使用引物1和2时均出现显著的能量转移，说明待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为杂和型。
六、结果验证
同实施例1的步骤六。
结果证明，PCR产物有两种，两种序列PCR产物的序列分别见序列表的序列1和序列表的序列2，待测DNA的RS1800469位点的核苷酸为杂合型。
实施例4、应用PFP1检测15个人类样本RS1800469位点的单核苷酸多态性
一、PFP1的合成
同实施例1的步骤一。
二、提取基因组DNA
用TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明书分别提取15个人血液样本中的基因组DNA。
三、含有目标位点的DNA片段的扩增
分别以15个样本的基因组DNA为模板，用引物1、2(上海英骏生物技术有限公司)进行PCR扩增，引物及反应条件如下：
引物1序列(正义引物)：5’-GATGGCACAGTGGTCAAGAG-3’，
引物2序列(反义引物)：5’-ACCCAGAACGGAAGGAGAGT-3’。
95℃、4分钟变性→13个循环：95℃、30秒，62.5℃、30秒，72℃、1分钟→32个循环：95℃、30秒，56.5℃、30秒，72℃、1分钟。
四、单碱基延伸反应
同实施例1的步骤四。
五、荧光强度比率测定
先对单碱基延伸产物进行酶消化处理以除去未反应的荧光素标记的dGTP。除去油层后，加入2μL酶消化液(1μL 10×碱性磷酸酶反应缓冲液，0.5单位碱性磷酸酶)，在37℃反应20分钟，接着80℃加热15分钟使酶失活。向含有PFP1(0.20μM)的1mL N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液(HEPES，25mM，pH 8)加6μL酶处理的反应液，以380纳米为激发光波长，分别测量混合物在425纳米和530纳米的荧光发射强度。样品的荧光强度比率值由530纳米的荧光发射强度除以425纳米的荧光发射强度得到。
结果见图4，图4中，横坐标的1-15编号表示第1-15个样本，第16个编号表示背景。由图可见，样本1～5的RS1800469位点的核苷酸为突变纯合型，样本8～11的RS1800469位点的核苷酸为野生纯合型，样本6～7以及12～15的RS1800469位点的核苷酸为杂合型。
实施例5、应用PFP2检测野生型DNA序列RS28934574位点的单核苷酸多态性
一、PFP2的合成
PFP2的结构如式(III)所示，合成方法如下：
1，4-苯二硼酸新戊二酯的制备同实施例1中的步骤一。
向50mL的单口瓶加入10mL干燥的四氢呋喃和0.65克2，7-二溴芴(郑州太平洋化源公司)，低温冷却至-78℃后加入2mL 2M丁基锂溶液(Alfa Aesar公司)低温搅拌1小时，加入0.67克1，6-二碘己烷(北京偶合公司)于室温反应过夜，结束反应。向反应液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有机层经水洗、无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂，硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯：20/1，体积/体积)得到0.6克2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)7.82(d，2H)，7.42(m，4H)，3.29(m，4H)，2.06(m，4H)，1.67(m，4H)，1.22(m，8H)，0.69(m，4H)。
向25mL的二口瓶中加入6mL四氢呋喃和3mL 2M碳酸钠，鼓入氮气30分钟后，加入390毫克2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴，182毫克1，4-苯二硼酸新戊酯和23毫克四(三苯基膦)钯，于氮气下80℃搅拌反应48小时，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩，丙酮沉淀，得到230毫克浅黄色固体。将固体溶于25毫升二氯甲烷，加入1毫升33％三甲胺醇溶液于室温搅拌24小时后离心，收集沉淀并干燥，得到222毫克聚合物PFP2，Mn＝4.1×104。1HNMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)7.1-8.0(10H，m)，3.2(4H，m)，3.1(12H，m)，2.1(4H，m)，1.2(16H，m)。
二、待测样本的制备
从数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝snp)查得RS28934574位点上下游序列信息，由宝生物工程(大连)有限公司合成一段含有RS28934574位点的DNA片段如下：
5’-CCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCA-3’。
序列中下横线标注为RS28934574位点。
三、单碱基延伸反应
根据合成的DNA序列设计引物如下：
引物5序列：5’-TGCCTGTCCTGGGAGAGAC-3’。
单碱基延伸对应RS28934574位点。单碱基延伸总体积为10μL，含1pmol人工合成的DNA，20pmol荧光素标记的dUTP(Fermentas公司)，20pmol Cy3标记的dCTP(铂金埃尔默公司)，10pmol引物5(宝生物工程(大连)有限公司))，2个单位Taq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)。
在表层覆盖一层矿物油，反应条件：30个循环：80℃、15秒，57℃、1分钟。
四、荧光光谱测定
先对单碱基延伸产物进行酶消化处理以除去未反应的荧光素标记的dUTP和Cy3标记的dCTP。加入2μL酶消化液(1μL 10×碱性磷酸酶反应缓冲液，0.5单位碱性磷酸酶)，在37℃反应20分钟，接着80℃加热15分钟使酶失活。向含有PFP2(0.20μM)的1mL N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液(HEPES，25mM，pH 8)加6μL酶处理的反应液，扫描荧光光谱，激发波长为380纳米。
图5为单碱基延伸得到的荧光光谱，只有单独PFP2到Cy3的能量转移，说明待测DNA的RS28934574位点的核苷酸为野生型。
实施例6、应用PFP2检测突变型DNA序列RS28934574位点的单核苷酸多态性
一、PFP2的合成
同实施例5的步骤一。
二、待测样本的制备
从数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝snp)查得RS28934574位点上下游序列信息，由宝生物工程(大连)有限公司合成一段含有RS28934574位点的DNA片段如下：
5’-CCTCTGTGCGCCAGTCTCTCCCAGGACAGGCA-3’。
序列中下横线标注为RS28934574位点。
三、单碱基延伸反应
同实施例5的步骤三。
四、荧光光谱测定
同实施例5的步骤四。
图6为单碱基延伸得到的荧光光谱，只有单独PFP2到荧光素的能量转移，说明待测DNA的RS28934574位点的核苷酸为突变型。
实施例7、应用PFP2检测杂合型DNA序列RS28934574位点的单核苷酸多态性
一、PFP2的合成
同实施例5的步骤一。
二、待测样本的制备
将实施例5的步骤二制备的DNA片段和实施例6的步骤二制备的DNA片段等量混合。
三、单碱基延伸反应
同实施例5的步骤三。
四、荧光光谱测定
同实施例5的步骤四。
图7为单碱基延伸得到的荧光光谱，PFP2到荧光素的能量转移和PFP2到Cy3的能量转移都存在，说明待测DNA的RS28934574位点的核苷酸为杂合型。
序列表
Claims (10)
1.一种DNA单核苷酸多态性的检测方法，依次包括以下步骤：
1)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；
2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱有较好的重叠，光谱重叠积分范围为1.0×10-15～3.0×10-13M-1cm3；
式(I)中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；
所述式(I)化合物的数均分子量为5000-100000。
2.如权利要求1所述的方法，其特征为：所述式(I)中，R为6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征为：所述式(I)中，X为氯、溴和碘中的任意一种。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征为：所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法为：用荧光物质标记的dNTP或ddNTP对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。
5.如权利要求4所述的方法，其特征为：所述单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与目标单核苷酸多态位点相邻20-25bp的序列互补。
6.如权利要求5所述的方法，其特征为：确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为：若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
7.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征为：所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法为：用荧光物质A标记与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补的dNTP或ddNTP，用荧光物质B标记与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸的互补dNTP或ddNTP，用所述荧光物质A标记的dNTP或ddNTP和荧光物质B标记的dNTP或ddNTP同时对PCR扩增产物进行单碱基延伸；
在同一激发光的作用下，所述荧光物质A和所述荧光物质B产生的荧光的波长至少相差40nm。
8.如权利要求7所述的方法，其特征为：所述单碱基延伸中，所用的引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻(上游或下游)20-25bp的序列互补。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征为：确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法为：若单独出现PFP到荧光物质A的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若单独出现PFP到荧光物质B的荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若两种荧光共振能量转移都出现，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。
10.如权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述荧光物质为荧光素、罗丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100575696A CN101220395A (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种检测dna单核苷酸多态性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100575696A CN101220395A (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种检测dna单核苷酸多态性的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101220395A true CN101220395A (zh) | 2008-07-16 |
Family
ID=39630470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100575696A Pending CN101220395A (zh) | 2008-02-03 | 2008-02-03 | 一种检测dna单核苷酸多态性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101220395A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102382892A (zh) * | 2011-11-18 | 2012-03-21 | 中国科学院化学研究所 | 一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法 |
| CN102384978A (zh) * | 2011-08-30 | 2012-03-21 | 南京邮电大学 | 一种检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法 |
| CN103328956A (zh) * | 2011-01-26 | 2013-09-25 | 奥林巴斯株式会社 | 鉴别核酸分子多态性的方法 |
| CN103882114A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-06-25 | 华晶基因技术有限公司 | 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法 |
| CN103988079A (zh) * | 2011-11-29 | 2014-08-13 | 农业基因遗传学有限公司 | 高通量单核苷酸多态性测定法 |
| CN104031979A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 常州欣宏科生物化学有限公司 | 一种利用荧光探针检测dna单核苷酸多态性的方法 |
| CN106939336A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-11 | 国家体育总局体育科学研究所 | 检测氧化损伤dna的方法 |
| CN107119122A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-01 | 苏州先达基因科技有限公司 | 一种单核苷酸多态性检测用试剂盒及检测方法 |
-
2008
- 2008-02-03 CN CNA2008100575696A patent/CN101220395A/zh active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103328956A (zh) * | 2011-01-26 | 2013-09-25 | 奥林巴斯株式会社 | 鉴别核酸分子多态性的方法 |
| CN103328956B (zh) * | 2011-01-26 | 2015-08-12 | 奥林巴斯株式会社 | 鉴别核酸分子多态性的方法 |
| CN102384978A (zh) * | 2011-08-30 | 2012-03-21 | 南京邮电大学 | 一种检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法 |
| CN102382892A (zh) * | 2011-11-18 | 2012-03-21 | 中国科学院化学研究所 | 一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法 |
| CN102382892B (zh) * | 2011-11-18 | 2014-07-09 | 中国科学院化学研究所 | 一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法 |
| CN103988079A (zh) * | 2011-11-29 | 2014-08-13 | 农业基因遗传学有限公司 | 高通量单核苷酸多态性测定法 |
| CN104031979A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 常州欣宏科生物化学有限公司 | 一种利用荧光探针检测dna单核苷酸多态性的方法 |
| CN103882114A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-06-25 | 华晶基因技术有限公司 | 一种检测单核苷酸多态性或者点突变的方法 |
| CN106939336A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-11 | 国家体育总局体育科学研究所 | 检测氧化损伤dna的方法 |
| CN107119122A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-01 | 苏州先达基因科技有限公司 | 一种单核苷酸多态性检测用试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101220395A (zh) | 一种检测dna单核苷酸多态性的方法 | |
| JP6734887B2 (ja) | 核酸配列変種を検出するための方法 | |
| US20090029478A1 (en) | Detection of target molecules through interaction with probes | |
| JP5632476B2 (ja) | 核酸の違いを検出するためのプローブの形式 | |
| CN104846085A (zh) | 人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒 | |
| PT1715063E (pt) | Farol de hibridização e método para a detecção e discriminação rápida de sequência | |
| US11293050B2 (en) | Method for marking 5-formyl cytosine and use thereof in single base resolution sequencing | |
| US9279146B2 (en) | Compounds and methods for the enrichment of mutated nucleic acid from a mixture | |
| CN101230399A (zh) | 一种检测dna甲基化的方法 | |
| EP2971147A1 (en) | Multiplex allele detection | |
| CA2894932C (en) | Labeled oligonucleotide probes used for nucleic acid sequence analysis | |
| WO1990008838A1 (en) | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers | |
| Zhang et al. | Thermodynamics-guided two-way interlocking DNA cascade system for universal multiplexed mutation detection | |
| CN102382892B (zh) | 一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法 | |
| JP2003506068A (ja) | 蛍光エネルギー移動を含む標的核酸を検出するための増幅方法 | |
| CN110885887B (zh) | 检测C8orf34基因rs1517114位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒 | |
| CN104031979B (zh) | 一种利用荧光探针检测dna单核苷酸多态性的方法 | |
| CN103103248A (zh) | 检测基因点突变的液相芯片和方法 | |
| Fenati et al. | Single nucleotide polymorphism discrimination with and without an ethidium bromide intercalator | |
| CN103882128A (zh) | 常温下对目标dna序列进行信号放大和检测的方法 | |
| WO2023116575A1 (zh) | 用于表征目标多核苷酸的衔接体、方法及其用途 | |
| WO2023108145A1 (en) | Universal probes for amplification and detection of nucleic acids | |
| US8158345B2 (en) | Labeled oligonucleotide | |
| CN105925712A (zh) | 一种用XmnI鉴定人食管癌RAD51基因rs45549040多态性的方法 | |
| US20110104762A1 (en) | Detection probe acting by molecular recognition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080716 |