JP5940651B2 - 標的粒子の検出方法 - Google Patents
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Description
本願は、2012年4月18日に、日本に出願された特願2012−095101号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
(1)本発明の一態様における標的粒子の検出方法は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、
(a)標的粒子と、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の15%未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子1分子当たり、2分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の15%以上である発光しない複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
により算出する工程と、
を有する。
(2) 前記(1)の標的粒子の検出方法において、前記複合体の外径が、前記光検出領域の直径の35%以上であってもよい。
(3) 前記(1)又は(2)の標的粒子の検出方法において、前記標的粒子と前記標識用粒子が特異的に結合してもよい。
(4) 前記(1)〜(3)のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記標的粒子が核酸であってもよい。
(5) 前記(1)〜(4)のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってもよい。
(6) 前記(1)〜(4)のいずれかの標的粒子の検出方法において、前記背景光が照明光であってもよい。
(7) 前記(1)〜(6)のいずれかの標的粒子の検出方法における前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されてもよい。
(8) 前記(1)〜(7)のいずれかの標的粒子の検出方法における前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内における前記光検出領域の位置を移動してもよい。
(9) 前記(1)〜(8)のいずれかの標的粒子の検出方法における前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに1つの複合体が前記光検出領域に入ったと判定してもよい。
(10) 前記(1)〜(9)のいずれかの標的粒子の検出方法における前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記複合体の存在を表す信号として検出してもよい。
(11) 前記(1)〜(10)のいずれかの標的粒子の検出方法は、さらに、前記工程(b)において検出された計数された前記複合体の数に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の数密度又は濃度を決定する工程を有してもよい。
(12) 前記(1)〜(10)のいずれかの標的粒子の検出方法の前記工程(b)において、前記複合体の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記複合体の存在を表す信号の検出とを繰り返し、
前記複合体の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を決定してもよい。
<反転型走査分子計数法のための光分析装置の構成>
反転型走査分子計数法は、基本的な構成において、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1Aを参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。光分析装置1の光学系において、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザ光(Ex)が、ファイバーの出射端において固有のNA(Numerical Aperture)にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1μL〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されている。対物レンズ8から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中に、観測対象である発光しない粒子(本実施形態の方法においては、標的粒子)等の発光しない粒子のほかに、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されていてもよい。この場合、発光しない粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、発光しない粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。
反転型走査分子計数法は、端的に述べれば、単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法にて、即ち、背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、発光しない単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出され、その計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。
α=4π∫r2 f(r)dr [積分区間は、0〜a] …(1)
一方、光検出領域内に、半径bの発光しない単一粒子が進入し、図2Cの下段の如く光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなる。よって、図2Cの上段の斜線領域に相当する光量が低減することとなる。その排除される発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、式(2)で与えられる。
β=4π∫r2 f(r)dr [積分区間は、0〜b] …(2)
かくして、光強度の低下の割合は、β/αにより概算することが可能となる。
f(r)=0.684exp(−2r2 ) …(3)
図2Dは、式(3)を用いて、半径比b/aに対する光強度の低下の割合β/αをプロットした図である。図2Dを参照して、典型的には、背景光の変動率が1%程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が1%以下であると、信号の検出が不可能となるので、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比b/aは、0.15以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を10%以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比b/aは、0.35となる。
反転型走査分子計数法では、観測対象となる粒子を含む試料溶液の光強度が測定された後、分析される。図3に、反転型走査分子計数法における処理手順の一態様を、フローチャートの形式で表す。
反転型走査分子計数法による光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行う他は、FCS又はFIDAにおける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内において光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aは、ミラー7(ガルバノミラー)又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート9を駆動して、ウェル10内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2 =6D・Δt …(4)
Δt=(2Wo)2 /6D …(5)
従って、粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、式(6)で表される。
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(6)
そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に速い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2 /s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3 m/sとなる。よって、光検出領域の位置の移動速度は、その略10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ18において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
以下、より詳細に説明する。
時系列の光強度データにおいて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4Bに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号における光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する(図4C最上段参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ibgから下に凸のガウス分布である式(7)であると仮定できるとする。
I=Ibg−A・exp(−2t2 /a2 ) …(7)
有意な光強度の低下のプロファイル(背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(7)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。
強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等において無視されてよい。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>4.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号において想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい(粒子のカウンティング)。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される(ステップS170)。
Vt=N/C …(8)
また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子濃度cは、式(9)により与えられる。
c=n/Vt …(9)
なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(6))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子の検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
上記の単一粒子検出処理においては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。つまり、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。このように、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。
そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。つまり、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果におけるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。
粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Cの試料溶液中において、時間τに亘って、光検出領域を走査速度uにて移動させた場合、光検出領域の断面積をSとすると、検出される粒子信号の数Xは、式(10)で表される。
X=CSuτNA …(10)
ここで、NA は、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数XEに達するのに時間Tを要したとすると、粒子濃度Cは、式(11)により時間Tの関数として与えられる。
C=XE/(STuNA ) …(11)
なお、式(11)において、単位時間当たりの粒子の検出速度Vは、信号数が予め定められた数XEに達するのに要した時間Tと粒子検出数XEとに基づいて、式(12)により与えられる。
V=XE/T …(12)
よって粒子濃度Cは、式(13)で表される。
C=V/(SuNA ) …(13)
この式(13)においては、粒子濃度Cが、検出速度Vに一次に比例し、粒子濃度Cと検出速度Vとの対応関係がわかり易いので、実際の実験においては、粒子濃度Cは、検出速度Vを用いて決定されてもよい。
一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図5のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。図5の例においては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔t(所定の時間間隔)毎に、検出された粒子数Xが終了粒子数XE(発光粒子数が到達すべき予め定められた数)に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ18の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
図5を参照して、操作処理について、具体的に説明する。まず、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して、顕微鏡のステージ上に載置する。その後、使用者がコンピュータ18に対して、光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、初期設定として、終了粒子数XEの設定(ステップ10)及び解析時間間隔tの設定(ステップ20)を行う。終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数XEは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔tとしては、処理の開始後から粒子数(X)が終了粒子数(XE)に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置1における処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置1において記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
上記の如く終了粒子数XEと解析時間間隔tの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔t毎に、解析時間間隔tに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数xの検出(ステップS30)と、ステップS30にて検出された粒子数xを累積して粒子の総数X(tn)を算定する処理(ステップS40)とが粒子の総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで(ステップS50)、反復して実行される。なお、ステップS30〜S50の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Tsが記憶されてよい(ステップS25)。
X(tn )=X(tn−1 )+x …(14)
なお、X(tn−1 )は、前回の解析時間間隔tまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は0である。そして、ステップS30〜S40は、発光粒子の検出総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで、即ち、式(15)が成立するまで(ステップ50)、解析時間間隔t毎に繰り返される。
X(tn )≧XE …(15)
そして、ステップS30〜S50を反復しているうちに、式(15)が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップS30〜S50の反復処理が終了すると、終了時間TEが記憶されてよい(ステップS60)。
ところで、解析時間間隔t毎にステップS30〜S50の反復実行期間において(式(15)が成立するまで)、コンピュータ18のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数X(tn )及び/又は測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
v=X(tn )/(Tp−Ts) …(16)
ここで、Tpは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度vを用いて、測定残り時間Tr(ステップS30〜S50の処理終了までの時間)が、式(17)により推定される。
Tr=(XE−X(tn ))/v …(17)
また、測定終了時間TE(ステップS30〜S50の処理が終了する時間)が、式(18)により推定される(ステップS56)。
TE=Tp+Tr …(18)
そして、推定された測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示器上に表示される(ステップS58)。なお、既にステップS30〜S50の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、X(tn )=0のときは、式(17)又は(18)は、演算されずに、Tr及びTEは、不明であると表示されてよい。
かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間T(=TE−Ts)或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい(ステップS70)。粒子濃度は、既に述べた如く、式(12)を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Tと終了粒子数XEとから、粒子の検出速度Vを算出し、粒子の検出速度Vから、式(13)の関係を用いて決定される。
S=N/(C・NA ・uo・τo) …(19)
また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたSの平均値が光検出領域の断面積Sとして採用されるようになっていてよい。
上記の試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出並びに計数の処理において、別の態様として、解析時間間隔tは、固定値ではなく、発光粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図6Aは、解析時間間隔tを粒子の検出状況に応じて修正する処理(ステップS20’)を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出並びに計数の処理をフローチャートの形式で表したものである。図6Bは、ステップS20’における解析時間間隔tの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図6Aにおいて、図5と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
t=Tr/(N−k) …(20)
なお、算定される解析時間間隔tには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔tが下限値tminを下回るときには、解析時間間隔tは、下限値tminに設定されてよい(ステップS250、S260)。上記の如く、解析時間間隔tが修正される態様によれば、測定残り時間Trには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔tがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
本実施形態の検出方法では、反転型走査分子計数法を利用して、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する。前述のように、反転型走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、pMオーダー以下の比較的低濃度の粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、標識用粒子と結合した標的粒子を高感度に計数することができる。
(a)標的粒子と、外径が前記光学系の光検出領域の直径の15%未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子1分子当たり、2分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の15%以上である発光しない複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
により算出する工程である。
また、標的粒子がタンパク質である場合には、標識用粒子としては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを用いることができる。
光検出領域の直径が約2.8μmの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、直径の異なる発光しない粒子を、反転型走査分子計数法により計測した。
まず、平均粒子径(平均外径)が0.32μm、0.41μm、又は0.92μmであるポリスチレン粒子(Sphero Tech社製)を、20容量% PEG溶液を用いて、各20fMに調製し、ポリスチレン粒子溶液を調製した。これとは別に、蛍光物質ATTO(登録商標)488(ATTO社製)を、10mM トリスバッファー(pH8)を用いて6nMに調製し、蛍光物質溶液を調製した。その後、前記ポリスチレン粒子溶液と前記蛍光物質溶液を等量ずつ混合し、測定用の試料溶液を調製した。これらの試料溶液を、反転型走査分子計数法により測定した。
光検出領域の直径が約2.8μmの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、1分子当たり多数のビオチン化部位を有するデキストラン(デキストランビオチン)を標的粒子とし、ストレプトアビジン粒子を標識用粒子として用い、試料溶液中の標的粒子を反転型走査分子計数法により検出した。
まず、粒子表面にストレプトアビジンがコートされたストレプトアビジン粒子(平均粒子径:0.32μm、Spherotech社製)を、20容量% PEG溶液を用いて、各4pMに調製した(ストレプトアビジン粒子溶液)。また、デキストランビオチン(Invitrogen社製)を、10mM トリスバッファー(pH8)を用いて、0pM、20pM、200pM、2nMに調製した(デキストランビオチン溶液)。さらにこれらとは別に、蛍光物質ATTO(登録商標)488(ATTO社製)を、10mM トリスバッファー(pH8)を用いて、6nMに調製した(蛍光物質溶液)。
ストレプトアビジン粒子溶液及びデキストランビオチン溶液を、等量で混合し、得られた混合液を30分間室温で静置した。その後、前記混合液に、等量の蛍光物質溶液を加え、測定用の試料溶液を調製した。
光検出領域の直径が約2.8μmの共焦点顕微鏡の光学系を用いて、1分子当たり0、1又は2箇所のビオチン化部位を有する核酸を標的粒子とし、ストレプトアビジン粒子を標識用粒子として用い、試料溶液中の標的粒子を反転型走査分子計数法により検出した。
まず、以下に示す核酸をそれぞれ含有する水溶液(核酸試料1〜4)を調製した。なお、各塩基配列を表1に示す。
核酸試料1は、10ng/μLのHSRRB(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)により提供されたゲノム試料:No.194(以下、「ゲノムNo.194」)である。
核酸試料2は、10ng/μLのゲノムNo.194と、一方の核酸鎖が配列番号1で表される塩基配列からなるPCR産物(以下、「PCR産物」)である。
核酸試料3は、10ng/μLのゲノムNo.194と、配列番号2で表される塩基配列からなり、5’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸(以下、「ビオチン−ssDNA」)である。
核酸試料4:10ng/μLのゲノムNo.194と、配列番号3で表される塩基配列からなり、5’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸及び配列番号4で表される塩基配列からなり、5’末端がビオチンで標識された一本鎖核酸が会合したニ本鎖核酸(以下、「ビオチン−dsDNA」)である。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
Claims (12)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光しない粒子を検出する方法であって、
(a)標的粒子と、平均外径が前記光学系の光検出領域の直径の15%未満である標識用粒子とを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子1分子当たり、2分子以上の前記標識用粒子を結合させ、外径が前記光検出領域の直径の15%以上である発光しない複合体を形成する工程と、
(b)前記工程(a)において調製された試料溶液中の前記複合体の分子数を、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する工程と、
前記時系列光強度データにおいて、前記複合体が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記複合体の各々の存在を表す信号として個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の存在を表す信号の数を計数して、前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記複合体の数を計数する工程と、
により算出する工程と、
を有する標的粒子の検出方法。 - 前記複合体の外径が、前記光検出領域の直径の35%以上である請求項1に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記標的粒子と前記標識用粒子が特異的に結合する請求項1又は2に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記標的粒子が核酸である請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光である請求項1〜4のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記背景光が照明光である請求項1〜4のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項1〜6のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内における前記光検出領域の位置を移動する請求項1〜7のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに1つの複合体が前記光検出領域に入ったと判定する請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記複合体の存在を表す信号を個別に検出する工程において、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データにおいて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記複合体の存在を表す信号として検出する請求項1〜9のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- さらに、前記工程(b)において検出された計数された前記複合体の数に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の数密度又は濃度を決定する工程を有する請求項1〜10のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
- 前記工程(b)において、前記複合体の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記複合体の存在を表す信号の検出とを繰り返し、
前記複合体の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を決定する請求項1〜10のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
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WO2015108023A1 (ja) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | 株式会社ニコン | 微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法 |
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WO2017100660A1 (en) * | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Indevr, Inc. | Automated agglutination analyzer with contour comparison |
TWI619937B (zh) * | 2016-01-15 | 2018-04-01 | 奇美視像科技股份有限公司 | 以多光子激發技術檢查物體之方法以及量測物體之裝置 |
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US10578542B2 (en) | 2017-10-16 | 2020-03-03 | Becton, Dickinson And Company | Multi-photon counting for high sensitivity flow cytometer systems and methods for using the same |
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CN110429934B (zh) * | 2019-08-02 | 2023-01-31 | 西安星舟天启智能装备有限责任公司 | 一种抗干扰的自适应计数方法 |
JP7383249B2 (ja) * | 2019-11-20 | 2023-11-20 | オリンパス株式会社 | β-1,3-1,6-グルカンの測定方法 |
Family Cites Families (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4251733A (en) | 1978-06-29 | 1981-02-17 | Hirleman Jr Edwin D | Technique for simultaneous particle size and velocity measurement |
CA2035703A1 (en) | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Pedro Lilienfeld | System and method for determining and printing airborne particle concentration |
JPH04337446A (ja) | 1991-05-15 | 1992-11-25 | Hitachi Ltd | 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 |
US5866336A (en) | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
EP0836090A1 (en) | 1996-10-12 | 1998-04-15 | Evotec BioSystems GmbH | Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles |
US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
US6710871B1 (en) | 1997-06-09 | 2004-03-23 | Guava Technologies, Inc. | Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples |
GB2326229A (en) | 1997-06-13 | 1998-12-16 | Robert Jeffrey Geddes Carr | Detecting and analysing submicron particles |
SE9800360D0 (sv) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Goeteborg University Science I | Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules |
IL138496A0 (en) | 1998-03-16 | 2001-10-31 | Praelux Inc | Confocal microscopy imaging system |
US6388788B1 (en) | 1998-03-16 | 2002-05-14 | Praelux, Inc. | Method and apparatus for screening chemical compounds |
US20030036855A1 (en) | 1998-03-16 | 2003-02-20 | Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey | Method and apparatus for screening chemical compounds |
US6376843B1 (en) | 1999-06-23 | 2002-04-23 | Evotec Oai Ag | Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions |
EP1175602B1 (en) | 1999-04-29 | 2003-03-19 | Evotec OAI AG | A method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions |
WO2000071991A1 (en) | 1999-05-25 | 2000-11-30 | Biometric Imaging, Inc. | Apparatus and method for optical detection in a limited depth of field |
US8264680B2 (en) | 1999-05-28 | 2012-09-11 | Yokogawa Electric Corporation | Biochip reader and electrophoresis system |
US6965113B2 (en) | 2000-02-10 | 2005-11-15 | Evotec Ag | Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness |
US20010035954A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-11-01 | Rahn John Richard | Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering |
DE10035190C5 (de) | 2000-07-20 | 2009-07-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung |
DE10038528A1 (de) | 2000-08-08 | 2002-02-21 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung |
US6947133B2 (en) | 2000-08-08 | 2005-09-20 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors |
HU226937B1 (en) | 2000-11-17 | 2010-03-29 | Mta Szegedi Biolog Koezpont | Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope |
EP1351048A4 (en) | 2000-12-14 | 2007-02-28 | Olympus Corp | FLUOROMETRIC ANALYZER AND FLUOROMETRIC ANALYSIS |
US6633368B2 (en) * | 2001-01-02 | 2003-10-14 | Becton, Dickinson And Company | Method for determining the volume of single red blood cells |
US6782297B2 (en) | 2001-05-24 | 2004-08-24 | Eric Paul Tabor | Methods and apparatus for data smoothing |
US6750963B2 (en) | 2002-05-21 | 2004-06-15 | Agilent Technologies, Inc. | Imaging systems for signals on a surface |
DE60320828D1 (de) | 2002-11-07 | 2008-06-19 | Univ Erasmus | Fret proben und verfahren zur erkennung aufeinander einwirkeneden moleküle |
US6929945B2 (en) | 2002-12-09 | 2005-08-16 | Advanced Fluidix Laboratories Llc | Male fertility assay method and device |
JP4315794B2 (ja) | 2002-12-27 | 2009-08-19 | オリンパス株式会社 | 共焦点顕微鏡 |
US7038848B2 (en) | 2002-12-27 | 2006-05-02 | Olympus Corporation | Confocal microscope |
JP2005098876A (ja) | 2003-09-25 | 2005-04-14 | Institute Of Physical & Chemical Research | 2成分相互作用分析方法 |
EP1805500A4 (en) | 2004-09-28 | 2008-05-07 | Singulex Inc | SYSTEM AND METHOD FOR THE SPECTROSCOPIC ANALYSIS OF INDIVIDUAL PARTICLES |
GB0427050D0 (en) * | 2004-12-10 | 2005-01-12 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Method of,and apparatus and computer software for,imaging biological objects |
AU2006210424A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media |
JP4757103B2 (ja) | 2005-06-13 | 2011-08-24 | 学校法人関西文理総合学園 | 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム |
WO2007010803A1 (ja) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Olympus Corporation | 光測定装置 |
WO2007118209A2 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-18 | Kim Laboratories | Apparatus and method for rapid detection of analytes |
WO2007147159A2 (en) | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins |
WO2008007580A1 (fr) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Olympus Corporation | Procédé d'analyse de particules fines |
US20080052009A1 (en) | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Washington, University Of | Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements |
GB0618057D0 (en) | 2006-09-14 | 2006-10-25 | Perkinelmer Ltd | Improvements in and relating to scanning confocal microscopy |
US7413666B2 (en) | 2006-09-18 | 2008-08-19 | Bryant Robert L | Method for selectively sampling particulates in boiler/steam cycle corrosion transport |
JP5473202B2 (ja) | 2006-10-13 | 2014-04-16 | 滋賀県 | 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム |
WO2008080417A1 (en) | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Flult Biosystems Gmbh | A method of determining characteristic properties of a sample containing particles |
US7804594B2 (en) | 2006-12-29 | 2010-09-28 | Abbott Laboratories, Inc. | Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream |
EP2124085A4 (en) | 2007-02-14 | 2010-04-28 | Nikon Corp | CONFOCAL SLOTTED SCANNING MICROSCOPE |
JP2008292371A (ja) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Institute Of Physical & Chemical Research | 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法 |
JP2009145242A (ja) | 2007-12-14 | 2009-07-02 | Olympus Corp | 光測定装置 |
CN103543094B (zh) | 2007-12-19 | 2017-06-09 | 神谷来克斯公司 | 单分子检测用扫描分析器和使用方法 |
DE102008013715B4 (de) | 2008-02-29 | 2011-12-08 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Verfahren zur DNA-Analyse |
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US20100177190A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-07-15 | Ann-Shyn Chiang | Microscopy system with revolvable stage |
WO2010080642A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-15 | Biovigilant Systems, Inc. | Compact detector for simultaneous particle size and fluorescence detection |
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