CN101285095B

CN101285095B - 一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法

Info

Publication number: CN101285095B
Application number: CN2008100249076A
Authority: CN
Inventors: 罗光华; 郑璐
Original assignee: First Peoples Hospital of Changzhou
Current assignee: First Peoples Hospital of Changzhou
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2008-05-19
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2028-05-19
Also published as: CN101285095A

Abstract

本发明涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。该方法确定待测DNA片段的一条单链上的包含变异位点的靶序列，制备对应于靶序列的碱基淬灭探针，探针的一端仅一端结合有荧光基团，制备与待测DNA片段相对应的一对引物，然后进行聚合酶链式反应，再将探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有变异位点的靶序列上，再测定融解温度，即可对待测DNA片段的变异位点的单核苷酸是否具有单核苷酸多态性进行判断。本发明具有成本较低、操作方便、检测时间较短的特点。

Description

一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明涉及一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。

背景技术

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。基因调控区和编码区的SNPs比其它区位上的SNPs更可能造成功能上的变化。分型这些双等位基因标志给鉴定致病基因、建立药物靶向治疗以及个体化给药提供了很大的可能。因此，无论是学术界还是商业界对建立一种快速、敏感而经济的检测SNP的方法都有浓厚的兴趣。

许多经典的方法，如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析和凝胶迁移率变动分析法等，因受繁琐的操作程序、突变位点以及靶序列构象的限制而限制了应用范围。这些方法所需的检测时间长，并且需要有经验的技术员来分析最终结果。近来，出现了许多新的快速分型SNP的技术。如：基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）原理的单管快速SNP检测法、基于等位基因特异性引物延伸并且利用绿色和红色荧光标记的单核苷酸基因分型法、利用淬灭基团延伸（Quencher extension，QEXT）实时闭管检测SNP法、双联蝎型引物分析SNP技术、固相支持SNP分型法、使用核酸外切酶III/核酸酶S1/PNA体系直接正向检测SNP法、孪生探针法、多态核酸探针偶联聚合物检测法以及利用全程TaqMan实时定量数据自动基因分型法等。然而，以上所提及的技术需要昂贵的试剂，并且在中国，除了TaqMan探针及分子信标探针之外，极少有公司修饰其它类型的探针（包括FRET探针）。上述方法中，如酶切法等时间较长、标记范围也较小。

还有采用分子信标探针进行SNP检测的方法：采用人工合成的荧光标记寡核苷酸探针（寡核苷酸是一类只有30个以下碱基的短链核苷酸的总称，在寡核苷酸的端部连接荧光报告基团或/和荧光淬灭基团则构成探针），该探针的两端由5～7个与靶序无关的互补碱基组成，一端标记荧光报告基团，另一端标记淬灭基团。这样在游离状态下，荧光探针两端互补折叠成茎环结构，寡核苷酸探针的荧光报告基团与淬灭基团在空间非常接近，此时荧光报告基团经激发后发射出的荧光能量被淬灭基团吸收，不产生荧光信号，表现为荧光淬灭。而当探针与靶DNA杂交后，探针的茎环结构被破坏，淬灭基团离开荧光报告基团，经激发后荧光报告基团所产生的荧光信号向外发出。因而可以根据所发射荧光的情况，判断是否有碱基突变。但是，这种方法在进行探针的设计时，其标记的范围较小。

中国专利申请200310119928.3公开了一种用荧光共振能量转移而进行SNP检测的方法，该方法选择两种探针，一种探针结合有荧光团供体，另一种探针结合有荧光团受体，在激发光的照射下，荧光团供体受激向荧光团受体提供荧光，荧光团受体发出荧光，从而可以根据荧光团受体发出荧光的变化量来确定解链峰值所对应的温度值，该温度值低于解链温度时则确定目的核酸中存在一单核苷酸多态性。这种方法中随着探针的脱落，荧光强度由大变小。这种方法中对可与探针的寡核苷酸链结合的荧光团供体或荧光团受体的选取有一定的要求，因而成本较高。

中国专利文献CN1952178A公开了一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸性质的方法。该方法具有如下步骤：①确定待测DNA片段的一条单链上的第一序列和第二序列、且第一序列可能具有变异位点，第二序列是指与第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制备分别对应于第一序列的敏感探针和对应于第二序列锚定探针，敏感探针的一端仅一端结合有荧光报告基团（也可称为荧光基团）和淬灭基团中的一种，锚定探针的一端仅一端结合有荧光基团和淬灭基团中的另一种；③制备与待测DNA片段相对应的一对引物；④由过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入碱基淬灭探针，然后在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；⑤加热至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使敏感探针和锚定探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有第一序列和第二序列的单链上；由于荧光报告基团与淬灭基团相互临近且数量相当，所以若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则其所被激发出的荧光被结合于同一条链上的另一个探针的荧光淬灭基团淬灭，对外不显示荧光；⑥加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链上的第一序列上的敏感探针会先脱落下来，若此时对探针上的荧光报告基团进行激发，则因为敏感探针的脱落而对外显示出荧光，随着温度的继续升高，敏感探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。该方法虽然具有成本较低、操作方便、检测时间较短的特点，但需要准备两种探针和两种荧光标记，从而在进行探针的设计（包括确定核苷酸序列以及将荧光基团或淬灭基团连接在（或称标记）核苷酸序列的一端的核苷酸上）时，可供选择的寡核苷酸的范围还有待增加、相应的成功率也有待于增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本更低、操作更方便、检测时间更短的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，且该方法所采用的探针在设计时可供选择的寡核苷酸的范围更大、相应的成功率则更高。

本发明的总的技术构思是：本发明的方法包括确定待测DNA片段的一条单链上的包含变异位点的靶序列，制备对应于靶序列的碱基淬灭探针，探针的一端仅一端结合有荧光基团，制备与待测DNA片段相对应的一对引物，然后进行聚合酶链式反应，再将探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有变异位点的靶序列上，再测定融解温度，即可对待测DNA片段的变异位点的单核苷酸是否具有单核苷酸多态性进行判断。

实现本发明目的的提供一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法的技术方案是：具有以下步骤：

①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片段，而该待测DNA片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异；这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列可称为靶序列；而其中的可能发生变异的特定核苷酸所处的位置可称为变异位点；

②制备一种由寡核苷酸和荧光基团组成的碱基淬灭探针；碱基淬灭探针的寡核苷酸互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，碱基淬灭探针的寡核苷酸的一端仅一端结合有荧光基团，荧光基团可以标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸的5’或3’端，当荧光标记在5’端时，探针的寡核苷酸的3’端必须采用磷酸基团进行封闭；

③制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的一条单链的一端的一段序列互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的另一条单链的另一端的一段序列互补；

④由过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入碱基淬灭探针，在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；

⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使碱基淬灭探针的寡核苷酸杂交于扩增后的待测DNA片段的单链的靶序列上，此时的碱基淬灭探针的寡核苷酸处于与靶序列互补的状态；若在碱基淬灭探针的寡核苷酸处于单链状态时对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用较弱，若在碱基淬灭探针的寡核苷酸与靶序列杂交生成双链后的互补状态下对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用加强；

⑥在对探针的荧光基团进行激发的同时，加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链的靶序列上的碱基淬灭探针会脱落下来，碱基淬灭探针的脱落使其恢复到单链状态而对外显示出的荧光增强，随着温度的继续升高，碱基淬灭探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。

上述步骤④的体系中的待测脱氧核糖核酸优选为1.6～3.2ng/μl。

上述步骤④中所加入探针在体系中的浓度优选为4×10³～8×10⁴pM。

上述步骤②中的碱基淬灭探针的融解温度的值低于步骤③中寡核苷酸引物的融解温度的值。

上述步骤④中进行聚合酶链式反应的方法是，在90℃～95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即90℃～95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至55℃～61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至70℃～75℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至90℃～95℃，如此便完成了一个循环；一共运行25～40个循环。

上述步骤⑤中加热体系使待测DNA片段的双链解开的温度优选为90℃～95℃，降温而使碱基淬灭探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有靶序列的单链上的温度优选为20℃～65℃；

上述步骤⑥中升温速度优选为每秒0.1～0.3℃，最高温度为95℃。

上述步骤②中结合于探针的寡核苷酸的荧光基团优选为6-羧基荧光素。

上述步骤①中的待测DNA片段为载脂蛋白M基因的片段。

上述步骤⑥中，当待测DNA片段的单链上的碱基淬灭探针脱落下来的融解温度与野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之差的绝对值为5℃～10℃时，则判断所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的方法操作更简单、时间更短、可在单管中快速检测SNP，从而成本更低。本发明的方法仅仅需要两种引物和一种探针，荧光标记也只要一种，是目前为止最简单、最经济的SNP分型方法之一。在中国，很多生物技术公司都进行荧光修饰，因此，研究人员或试剂开发公司很容易得到此项服务。本法使用了一条探针，合成和修饰的总费用仅仅为300 RMB/5 OD左右。这比合成和修饰一条 TaqMan探针还要便宜（1600 RMB/5 OD ）。一般来说，PCR产物通常饱和在～10¹¹个分子/μl，因此，检测SNP时每个反应使用2 pmol探针就足够了。5 OD的探针约可检测10000份标本。从这个意义上来说，本法是非常经济实惠的。（2）在PCR产物融解过程中，基因序列的差异可通过探针融解温度的变化来检测。当温度慢慢升高时，碱基淬灭探针从靶序列上脱落，探针恢复单链状态，探针的寡核苷酸的与荧光基团毗连的碱基对荧光基团的淬灭作用减弱，从而导致荧光突然大量增加。荧光增量变化最大时的温度称为融解温度。突变型基因的融解温度与野生型基因的融解温度具有明显的差异。典型的野生型纯合子标本会呈现单一的融解谷，对于杂合子而言，则可见两个融解谷。突变型纯合子则会出现一个与野生型纯合子不同温度的融解谷。由一个碱基错配而造成的温度漂移通常在 5℃～10℃之间，并且很容易识别。（3）碱基淬灭探针的T_M值必须低于引物的T_M值，以避免Taq DNA聚合酶的切割。（4）本发明在制备探针时，探针可以在寡核苷酸的5’或3’端进行荧光基团的标记，因此针对于目标基因的可供选择的用于探针的寡核苷酸的范围更大，从而使成功率更高。（5）本检测方法已通过DNA测序的验证，适用于大批量基因分型的研究。

附图说明

图1为本发明的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法的原理图；其中的图1（a）为表示聚合酶链反应结束后，碱基淬灭探针与待测DNA片段在较低温度条件下进行杂交后的示意图。此时的碱基淬灭探针已由单链状态变为双链状态（或称互补状态），若对探针的荧光基团(FAM)进行激发，则与荧光基团毗连的寡核苷酸的碱基对荧光基团所发出的荧光的淬灭作用较强；图中箭头所指位置为突变位点（也就是SNP位点）。图1（b）为表示当温度缓慢升高时，碱基淬灭探针从靶序列上脱落，探针恢复单链状态，与荧光基团毗连的碱基对探针的荧光基团所发出的荧光的淬灭作用减弱，从而导致荧光突然大量增加的示意图。

图2为本发明的方法中所采用的探针以及一对引物的设计方案图。

图3A为本发明的方法中以载脂蛋白M基因为待测DNA片段，在将碱基淬灭探针（A淬灭探针）杂交于扩增后的待测DNA片段的含有靶序列的单链上后，随着温度的升高而体系中的三种基因型（A/A、A/G、G/G）的荧光信号强度随之变化的曲线图；

图3B为图3A中的三种基因型的融解曲线图。

图4为本发明的方法中的待测DNA片段是载脂蛋白M基因的部分测序结果图；其中图4（A）为突变型基因部分测序结果图，图4（B）为野生型基因部分测序结果图，图中箭头所指为突变位点。

图5A为图2中的4种不同碱基（A、T、C、G）淬灭探针用于测定载脂蛋白M基因的单核苷酸多态性时，其中的A/A纯合子的融解曲线图；

图5B为图2中的4种不同碱基淬灭探针用于测定载脂蛋白M基因的单核苷酸多态性时，其中的A/G杂合子的融解曲线图；

图5C为图2中的4种不同碱基淬灭探针用于测定载脂蛋白M基因的单核苷酸多态性时，其中的G/G纯合子的融解曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。

（实施例1）

本实施例的方法具有以下步骤：

①确定待测DNA片段。待测DNA片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异，这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列可称为靶序列；而其中的可能发生变异的特定核苷酸所处的位置可称为变异位点。本实施例的待测DNA片段为人类基因组中的载脂蛋白M（apolipoprotein M, apoM）基因的片段。apoM是新近发现的载脂蛋白，其基因定位在6p21.31。在apoM近启动子区有一T-778C (rs805296) SNP。在此SNP标志产生3种基因型，分别为T/T纯合子、C/C纯合子和T/C杂合子，其中的T/T纯合子属于野生型基因。这一SNP与胆固醇及空腹血糖相关，并且也增加汉族人群中2型糖尿病的易感性。apoM基因扩增产物的片段（即待测DNA片段）的长度为410bp，其中的第180位碱基则是可能发生变异的位点（图4（B）中的箭头所指位点）。

②制备碱基淬灭探针。碱基淬灭探针由寡核苷酸和荧光基团组成。碱基淬灭探针的寡核苷酸互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列。碱基淬灭探针的寡核苷酸的5’或3’端中的一端仅一端结合有荧光基团，也就是说荧光基团只有一个，而该荧光基团标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸的两个位于端头的核苷酸中的一个上；当荧光标记在寡核苷酸的5’端时，探针的寡核苷酸的3’端必须连接磷酸基团而封闭。我们设计了由图2所示序列的4种碱基淬灭探针，这4种探针的寡核苷酸均为apoM T-778C寡核苷酸，并且这4种碱基淬灭探针的寡核苷酸的标记有荧光基团的核苷酸具有相应的碱基。各碱基淬灭探针互补于与步骤①中的靶序列相对应的突变型的相应的DNA片段的相应序列，结合于探针的寡核苷酸的荧光基团是6-羧基荧光素。apoM T-778C寡核苷酸以及相应的碱基淬灭探针均在上海英骏公司合成和修饰。由于上述4种碱基淬灭探针的寡核苷酸参照编码链设计和合成（是该编码链序列的一部分），因此，若按照模板链进行分型，在进行检测时若检测到的是A/A纯合子或G/G纯合子，则其分型为T/T纯合子或C/C纯合子，而若检测到的是A/G杂合子，则其分型为T/C杂合子。本实施例所采用的碱基淬灭探针为A淬灭探针，其它实施例中，也可以采用图2所示的T淬灭探针、C淬灭探针或G淬灭探针。

③制备合适的两个寡核苷酸引物，它们是正义引物和反义引物。本实施例的正义引物是与上述待测DNA片段的一条单链的包括3′端在内的一段序列互补的寡核苷酸，反义引物是与上述待测DNA片段的另一条单链的包括3′端在内的一段序列互补的寡核苷酸。本实施例的正义引物的寡核苷酸有30位，其序列为5’-ACTGACACATTCACTCAACATTTATTACTA-3’；本实施例的反义引物的寡核苷酸有21位，其序列为5’-AGGGGTTGGTGGTGTTTTGTT-3’。这两种引物在上海生工合成和修饰。两个寡核苷酸引物的融解温度的值高于步骤②中的碱基淬灭探针的融解温度的值。

④进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）。将40～80ng的DNA模板、2.5μl的10×PCR缓冲液、2.5mM的MgCl₂、过量的底物0.5μl的4×dNTPs、购自上海申能***公司的1.25U的Taq DNA聚合酶、步骤③得到的正义引物10 pmol和反义引物10 pmol组成反应体系，还加入步骤②得到的A淬灭探针2 pmol。上述整个体系的体积为25μl，DNA模板在体系中的浓度为1.6～3.2ng/μl，探针在体系中的浓度为8×10⁴pM。DNA模板也即含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸，该DNA模板为用上海生工制造的UIIQ-10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒从200名人类冠脉疾病患者的血液中分别提取，然后从中任意选择得到。。在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；进行聚合酶链式反应的方法是，在90℃～95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即90℃～95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至55℃～61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至70℃～75℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至90℃～95℃，如此便完成了一个循环；一共运行25～40个循环，从而得到PCR产物。

⑤将A淬灭探针与PCR产物进行分子杂交。仍在罗氏公司LightCycler 基因扩增检测仪上进行，加热上述进行聚合酶链式反应后的体系（其中主要是PCR产物）至95℃、保持30秒，使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温至30℃、保持4分钟，从而使碱基淬灭探针的寡核苷酸杂交于扩增后的待测DNA片段的单链的靶序列上（图1a），此时的碱基淬灭探针的寡核苷酸处于与靶序列互补的状态。若此时对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，因为与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用较强，故荧光基团所发荧光因被该碱基淬灭，因此对外显示的荧光强度大大减弱。

⑥测定待测DNA片段的融解温度。仍在罗氏公司LightCycler 基因扩增检测仪上进行，打开检测仪上的荧光通道1（F1）进行检测，对探针的荧光基团进行激发。加热杂交后的体系，以每秒0.1℃的速度使体系从30℃升温至80℃，在升温过程中，碱基探针从待测DNA片段的单链上脱落下来（图1b），由于探针的寡核苷酸的与荧光基团相毗连的碱基（连接有荧光基团的核苷酸的碱基）在单链状态下对荧光基团所发出荧光的淬灭作用减弱，因而体系中的荧光强度增加，随着温度的继续升高，碱基淬灭探针脱落增加，荧光强度也随着增强（图3A），将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度（Melting temperature，T_M）。融解温度T_M与以下三种情况之一相对应（图3B）：第一种情况是由于G/G纯合子与碱基淬灭探针完全匹配，在G/G纯合子的融解曲线中产生一个较高的融解温度，大约在48.6℃左右；第二种情况是A/A纯合子与碱基淬灭探针有一个碱基不配，在A/A纯合子的融解曲线中T_M值则漂移到41.3℃左右；第三种情况是杂合子A/G基因型的融解曲线中出现了两个融解谷，T_M值分别为48.6℃和41.3℃。两个融解谷之间的温度差（△T）为7.3℃左右。在测出DNA片段的融解温度后，就可以对该DNA片段是否具有单核苷酸多态性进行判断了。因为第二种情况表示的是野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解曲线，其融解温度为41.3℃左右。

如果所测DNA片段的融解温度只有一个且处于48.6℃左右则属于第一种情况，说明有突变。如果所测DNA片段的融解温度只有一个且处于41.3℃左右则属于第二种情况，说明未发生突变。如果所测DNA片段的融解温度有两个且一个处于48.6℃左右、而另一个处于41.3℃左右则属于第三种情况，说明有突变。

不同实验之间的T_M值可能在±0.8℃ 之间波动，不同融解谷之间的△T可能在±0.6℃ 之间波动。本法之所以用融解谷，而不是用融解峰来表示，是因为LightCycler 3.5版本中没有 dF/dT的作图分析功能。我们希望这项功能在新的版本中添加，以便使用者根据各自需求选择相应功能。

此项检测方法的准确性通过DNA测序验证。DNA测序工作由上海英骏公司完成，图4显示了测序结果。

另外，我们还将不同碱基对荧光淬灭的效果进行了比较。为了比较四种碱基对荧光淬灭的影响，我们所设计的图2所示的4种碱基淬灭探针的各相应的寡核苷酸上分别标记了不同的碱基，图5显示了四种碱基(A，T，C和G)淬灭探针在三种基因型分型的过程中对荧光的淬灭效果。比较结果显示，四种碱基淬灭探针都能准确有效地用于A/A（图5A）、A/G（图5B）、 G/G（图5C）的基因分型，并且A淬灭探针、T淬灭探针、C淬灭探针在融解时荧光增加的最大速率要明显高于G淬灭探针。

Claims

1.一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，具有以下步骤：

①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片段，而该待测DNA片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异；这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列称为靶序列；而其中的可能发生变异的特定核苷酸所处的位置称为变异位点；

②制备一种由寡核苷酸和荧光基团组成的碱基淬灭探针；碱基淬灭探针的寡核苷酸互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，碱基淬灭探针的寡核苷酸只有一端结合有荧光基团，荧光基团标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸的5’或3’端，当荧光标记在5’端时，探针的寡核苷酸的3’端必须采用磷酸基团进行封闭；

⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使碱基淬灭探针的寡核苷酸杂交于扩增后的待测DNA片段的单链的靶序列上，此时的碱基淬灭探针的寡核苷酸处于与靶序列互补的状态；若在碱基淬灭探针的寡核苷酸与靶序列杂交生成双链后的互补状态下对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则荧光基团所发荧光被与荧光基团毗连的碱基淬灭，若在碱基淬灭探针的寡核苷酸处于单链状态时对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则荧光基团所发荧光强度增加；

⑥在对探针的荧光基团进行激发的同时，加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链的靶序列上的碱基淬灭探针会脱落下来，碱基淬灭探针的脱落使其恢复到单链状态而对外显示出的荧光增强，随着温度的继续升高，碱基淬灭探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之差的绝对值为5℃～10℃时，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。

2.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤④的体系中的待测脱氧核糖核酸为1.6～3.2ng/μl。

3.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤④中所加入探针在体系中的浓度为4×10³～8×10⁴pM。

4.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤②中的碱基淬灭探针的融解温度的值低于步骤③中寡核苷酸引物的融解温度的值。

5.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤④中进行聚合酶链式反应的方法是，在90℃～95℃下预变性1分钟，接着开始循环，也即90℃～95℃的温度下保持0秒，以温度转换率为每秒20℃的速度降温至55℃～61℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至70℃～75℃、保持10秒，再以温度转换率为每秒20℃的速度升温至90℃～95℃，如此便完成了一个循环；一共运行25～40个循环。

6.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤⑤中加热体系使待测DNA片段的双链解开的温度为90℃～95℃，降温而使碱基淬灭探针杂交于扩增后的待测DNA片段的含有靶序列的单链上的温度为20℃～65℃；

7.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤⑥中升温速度为每秒0.1～0.3℃，最高温度为95℃。

8.根据权利要求1所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤②中结合于探针的寡核苷酸的荧光基团是6-羧基荧光素。

9.根据权利要求1至8之一所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤①中的待测DNA片段为载脂蛋白M基因的片段。

10.根据权利要求9所述的检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：步骤⑥中，当载脂蛋白M基因的待测DNA片段的单链上的碱基淬灭探针脱落下来的融解温度与野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之差的绝对值为7.3±0.6℃时，则判断所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。