WO2011043220A1 - 融合遺伝子の測定方法 - Google Patents

融合遺伝子の測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011043220A1
WO2011043220A1 PCT/JP2010/066768 JP2010066768W WO2011043220A1 WO 2011043220 A1 WO2011043220 A1 WO 2011043220A1 JP 2010066768 W JP2010066768 W JP 2010066768W WO 2011043220 A1 WO2011043220 A1 WO 2011043220A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
region
gene
fusion
seq
alk
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/066768
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和也 小見
Original Assignee
富士レビオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士レビオ株式会社 filed Critical 富士レビオ株式会社
Priority to US13/500,497 priority Critical patent/US20120202214A1/en
Priority to EP10821891A priority patent/EP2487250A4/en
Priority to JP2011535352A priority patent/JPWO2011043220A1/ja
Publication of WO2011043220A1 publication Critical patent/WO2011043220A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a fusion gene that may exist in a living body.
  • the fusion gene is known to cause cancer.
  • an undifferentiated lymphoma kinase (Anaplastic Lymphoma Kinase; ⁇ ⁇ ⁇ ALK) gene, which is one of receptor tyrosine kinases, exhibits carcinogenicity by fusing with various genes (Non-patent Document 5). .
  • the EML4-ALK fusion gene is a gene in which a part of the 5 'side of the Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 4 (EML4) gene and the 3' region of the ALK gene are fused. It is known to cause some non-small cell lung cancer (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). As a method for detecting an EML4-ALK fusion gene, a method of amplifying EML4-ALK fusion gene mRNA by RT-PCR method has been reported (Non-patent Document 2).
  • an object of the present invention is to provide a simple fusion gene detection system that can cover even unknown fusion genes.
  • the inventor of the present application pays attention to the fact that the essence of the EML4-ALK fusion gene is “X (arbitrary gene) + ALK gene 3 ′ region (including kinase domain)”, and the fusion point is the boundary.
  • X arbitrary gene
  • ALK gene 3 ′ region including kinase domain
  • the present invention is a method performed on a sample separated from a living body, and for one gene constituting a fusion gene that may exist in the living body, a 5 ′ region upstream of the fusion point of the gene and Provided is a method for measuring a fusion gene, comprising measuring the expression of a downstream 3 ′ region and comparing the expression of a 5 ′ region with the expression of a 3 ′ region.
  • the present invention also provides a 5 ′ region detection primer set consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 of the sequence listing, and a 3 ′ region detection primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • the present invention provides a 5 ′ region detection primer set consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 of the sequence listing, and a 3 ′ region detection primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively. And a detection reagent for a fusion gene fused with an ALK gene.
  • the present invention provides a novel method capable of comprehensively detecting fusion genes that can exist in a living body regardless of the type of fusion partner. According to the method of the present invention, it was possible to detect fusion genes with any fusion partner by measuring the expression level of only two gene regions, and it was necessary to detect various types of fusion genes. Time and cost can be greatly reduced.
  • a fusion gene of the 3 ′ region containing the kinase domain of the ALK gene and the EML4 gene or the like is known as a fusion gene of the ALK gene.
  • PCR can be performed in a single tube including the internal standard, which is extremely advantageous as a simple and rapid ALK fusion gene detection system.
  • Fusion genes such as the EML4-ALK fusion gene, have been found in some cancer patients, and prescribe an inhibitor that inhibits the activity of the fusion gene product for such fusion gene-expressing patients This may be useful in the treatment of cancer.
  • Example 1 H2228 cells (EML4-ALK fusion gene positive, ALK gene negative), A549 cells (EML4-ALK fusion gene negative, ALK gene negative), SK-N-DZ cells (EML4-ALK fusion gene negative, ALK) It is the result of having measured the expression of 5 'area
  • Example 2 with respect to RNA samples extracted from H2228 cells, A549 cells, and SK-N-DZ cellularity, the 5 ′ region and 3 ′ region of the ALK gene and the internal standard gene TBP gene were simultaneously amplified and electrophoresed. is there.
  • Example 3 for RNA samples extracted from H2228 cells, A549 cells, and SK-N-DZ cellularity, the 5 ′ region and 3 ′ region of the ALK gene and the internal standard gene TBP gene were simultaneously amplified, and the amplified product was fluorescent. It is the result measured by the probe.
  • the fusion gene to be measured in the present invention means that a translocation (including inversion) occurs on the same chromosome or between different chromosomes, and a part of a certain gene is fused with a part of another gene. It exists as a gene. Normally, genes that should not be expressed in a certain tissue are expressed by fusing with the promoter region of other genes that can be expressed in that tissue as a result of chromosomal translocation, often resulting in various diseases such as cancer. Is known to produce Many of the known fusion genes have been identified as abnormal genes in connection with various diseases.
  • One of the genes constituting the fusion gene to be measured in the present invention is usually a gene that normally does not express the full length in a normal tissue, but a partial region thereof can be expressed in the tissue by fusion, The expression of the 5 'region and 3' region of this gene is measured. However, even if the gene is expressed in full length in normal tissues, as described later, the presence or absence and expression level of the fusion gene can be examined by the ratio of the expression levels of the 5 ′ region and the 3 ′ region.
  • the conditions for the fusion gene are not limited to the above.
  • fusion genes include fusion genes of genes such as ALK gene, ABL gene, retinoic acid receptor gene, SSX gene, AML1 gene and other genes.
  • ALK gene is a gene encoding a receptor tyrosine kinase, but various fusion genes in which the 3 ′ region containing the kinase domain is fused with the 5 ′ region of another gene are known, These are known to exhibit carcinogenicity (see Non-Patent Document 5, etc.).
  • the scope of the present invention is not limited to these specific examples, and includes various natural fusion genes not related to diseases, in addition to fusion genes related to various diseases such as cancer.
  • the ALK gene (SEQ ID NO: 1, GenBank NM_004304) is a gene consisting of 29 exons on human chromosome 2, and the kinase domain is 4256nt to 5083nt (meaning 4256th base to 5083th base) It is.
  • Each exon region of the ALK gene shown in SEQ ID NO: 1 is shown in Table 1 below.
  • fusion genes with various fusion partners are known as fusion genes of the ALK gene and other arbitrary genes (hereinafter sometimes simply referred to as “ALK fusion genes”). It has been. Examples of known ALK fusion genes are shown in SEQ ID NOs: 9 to 18 in the sequence listing.
  • SEQ ID NOs: 9 to 17 are the base sequences of the EML4-ALK fusion gene
  • SEQ ID NO: 18 is the base sequence of the KIF5B-ALK fusion gene.
  • the exon 20-29 region including the kinase domain of the ALK gene is fused with the 5 ′ region including the promoter region of other genes, and in some non-small cell lung cancer patients, It is expressed.
  • the method of the present invention attention is paid to only one gene constituting the fusion gene, and the expression at two locations, the 5 ′ region upstream and the 3 ′ region downstream from the fusion point of the gene, is measured.
  • one gene constituting a fusion gene for which the 5 ′ region and the 3 ′ region are to be measured may be referred to as a “target gene” for convenience.
  • “Measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
  • the “fusion point” refers to the boundary between the region lost by fusion and the region contained in the fusion gene, and in the fusion gene is the boundary where two different genes are fused. You can also.
  • the 5 ′ end of exon 20 in the ALK gene that is, 4080 nt in SEQ ID NO: 1 is the fusion point.
  • the 5 ′ region and 3 ′ region to be measured may be selected from regions upstream and downstream from the fusion point, respectively.
  • the fusion point is not necessarily limited to only one point in the gene, and several tens of bases or more between variants of the same fusion gene consisting of the same gene combination. Its position can be different. Therefore, it is desirable to select the 5 ′ region to be measured from the region upstream of the fusion point that is the 5 ′ most of the known fusion points, and similarly for the 3 ′ region, Of these, it is desirable to select from the region downstream of the fusion point located on the most 3 ′ side. From the viewpoint of covering unknown variants that have not been specifically identified, a region sufficiently separated from the most upstream or downstream fusion point, for example, about 200 bases, preferably from a region separated by 500 bases or more. It is preferable to select.
  • the known ALK fusion genes are fused to the fusion partner in exon 20 of the ALK gene and its downstream region. May be selected from exon 19 of the ALK gene and the upstream region thereof, and the 3 ′ region may be selected from exon 20 of the ALK gene and the downstream region thereof.
  • the known ALK fusion genes there are those in which up to 49 bp of the 5 ′ end of exon 20 is lost (SEQ ID NO: 13). Therefore, 4129 nt (SEQ ID NO: 13) which is the fusion point of this variant The position is based on 1. It is desirable to select the 3 ′ region from the region downstream from the expression of the fusion point position.
  • the 3 ′ region is a region sufficiently separated from the fusion point of 4129 nt, which is the most 3 ′ side of the known fusion points, for example, a region separated by about 200 bp or more, preferably about 500 bp or more. preferable.
  • the 3 ′ region from the kinase domain of the ALK gene.
  • the expression of the 2486nt to 2629nt region of SEQ ID NO: 1 as the 5 'region and the expression of the 4801nt to 4865nt or 4775nt to 4939nt region of SEQ ID NO: 1 as the 3' region are measured.
  • the present invention is not limited to such specific examples.
  • the sample used in the present invention is a protein sample or nucleic acid sample separated from a living body, preferably a nucleic acid sample.
  • an RNA sample such as a total RNA sample extracted from a sample of cells, tissues, blood or the like collected from a living body is preferable.
  • the RNA sample can be used after reverse transcription to cDNA.
  • RNA extraction and cDNA synthesis are conventional methods known per se and can be easily performed using commercially available kits. It is desirable to use a random hexamer as a primer for the reverse transcription reaction.
  • the measurement of the expression of the 5 ′ region and the 3 ′ region can be performed, for example, by immunoassaying a protein sample using an antibody that specifically recognizes the 5 ′ region and the 3 ′ region, respectively. Then, it is preferable to carry out by measuring the 5 ′ region and 3 ′ region of mRNA transcribed from the target gene or cDNA synthesized from this mRNA for the RNA sample.
  • mRNA or cDNA measurement methods include a nucleic acid amplification method using primers and a hybridization method using probes.
  • the nucleic acid amplification method include RT-PCR, real-time PCR, and NASBA method.
  • hybridization methods include Northern blotting, in situ hybridization, array analysis methods using a solid phase probe, and the like. These methods are well-known ordinary methods, and any method may be used in the present invention.
  • the immunoassay itself and a method for producing an antibody that specifically recognizes a desired region are also well-known conventional methods.
  • a polynucleotide that specifically hybridizes to each of the 5 ′ region and 3 ′ region of interest is used.
  • “specifically hybridizes” means that it hybridizes only with the target mRNA or cDNA under normal hybridization conditions and does not substantially hybridize with other nucleic acids.
  • Normal hybridization conditions refer to conditions used for normal PCR annealing and probe detection. For example, in the case of PCR using Taq polymerase, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ( The reaction is performed at a suitable annealing temperature of about 54 ° C. to 60 ° C. using a general buffer solution such as pH 8.3 to 9.0) and 1.5 mM MgCl 2.
  • the reaction is performed at a suitable hybridization temperature of about 42 ° C. to 65 ° C. using a general hybridization solution such as 5 ⁇ SSPE, 50% formamide, 5 ⁇ Denhardt's solution, and 0.1 to 0.5% SDS.
  • a general hybridization solution such as 5 ⁇ SSPE, 50% formamide, 5 ⁇ Denhardt's solution, and 0.1 to 0.5% SDS.
  • the appropriate annealing temperature or hybridization temperature is not limited to the above examples, and is determined based on the Tm value of the polynucleotide used as the primer or probe and the rule of thumb of the experimenter, and can be easily determined by those skilled in the art. Can do.
  • substantially does not hybridize means that it does not hybridize at all, or even if it is significantly less than the amount hybridized to the target region, and hybridizes only in a relatively negligible amount. is there.
  • a polynucleotide can be appropriately designed and prepared by those skilled in the art with reference to known sequence information. Sequence information can be easily obtained from databases such as GenBank. For example, in the case of the base sequence of the ALK gene, it is registered in GenBank with accession number NM_004304, and is also described as SEQ ID NO: 1 in the present sequence listing.
  • RT-PCR and real-time PCR include the methods described in the following examples.
  • primers that specifically amplify the 5 'region and 3' region of the target gene such as ALK gene using the cDNA as a template
  • the expression of each region of the target gene can be measured.
  • real-time PCR a detection method using a fluorescently labeled probe is also known, and it is possible to perform simpler and quicker detection by omitting the amplification product migration step.
  • a fluorescently labeled probe that specifically hybridizes to the amplified fragment of each region can be prepared and used.
  • amplification fragments can be distinguished and measured according to the fluorescence wavelength.
  • a fluorescently labeled probe can be easily prepared by those skilled in the art, and specific examples thereof are described in the following examples.
  • “specifically amplify” means to amplify only the target region or a non-target region, but it is very small compared to the amount of amplification in the target region and can be relatively ignored. It means that it only amplifies.
  • the set of primers that specifically hybridize within the 5 ′ region is a primer set that specifically amplifies the 5 ′ region. A person skilled in the art can appropriately select the size to be amplified.
  • the primer set when the target gene is the ALK gene, specific examples of the primer set include the primer set shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 and the 3 ′ region specifically amplified as the primer set that specifically amplifies the 5 ′ region. Examples of the primer set include, but are not limited to, the primer sets shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, or the primer sets shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.
  • an ALK5 ′ region-specific probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 that can be used in combination with the primer set of SEQ ID NOs: 3 and 4, and a primer set of SEQ ID NOs: 20 and 21 are used.
  • an ALK3 ′ region-specific probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 that can be used, but is not limited thereto.
  • one or more types of internal standard genes may be measured.
  • the internal standard gene GAPDH gene, ACTB gene, HPRT1 gene, HMBS gene, TBP gene and the like are well known, and these can also be used in the present invention.
  • a fluorescently labeled probe can also be prepared and used for the internal standard gene.
  • the TBP gene is used as an internal standard, and the base sequence of the primer set therefor is shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 or SEQ ID NOs: 23 and 24, but is not limited thereto.
  • Specific examples of the TBP gene-specific probe include, but are not limited to, a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 that can be used in combination with the primer set of SEQ ID NOs: 23 and 24.
  • the expression of each region is compared.
  • the expression level of each region of the target gene normalized by the expression level of the internal standard gene may be compared.
  • the amplification product is confirmed by electrophoresis, the presence or absence of a band or the signal intensity may be compared.
  • the full length of the target gene is expressed in the biological tissue or cell from which the sample is derived, the expression of both the 5 ′ region and the 3 ′ region is confirmed.
  • the expression of the 5 ′ region is not confirmed, and only the expression of the 3 ′ region is confirmed.
  • the expression of the fusion gene can be confirmed in more detail.
  • a control sample can be easily prepared by a person skilled in the art based on known information.
  • cell lines such as SK-N-DZ cells are known as cell lines that express only the full length of the ALK gene and do not express the ALK fusion gene.
  • the expression of the fusion gene can be measured based on the presence or absence of the expression of the 5 ′ region and 3 ′ region of the target gene or the ratio of the expression level.
  • the full length of the ALK gene is not expressed in human lung, it is known that the ALK fusion gene is expressed in lung cancer cells in some non-small cell lung cancer patients. Therefore, when the method of the present invention is performed using an RNA sample extracted from a lung biopsy sample collected from a lung cancer patient, the expression of the fusion gene can be detected based on the presence or absence of the expression of the 5 ′ region. That is, in this case, it can be determined that the ALK fusion gene is present and expressed in a patient in which only the 3 ′ region is expressed and the 5 ′ region is not expressed.
  • the ALK fusion gene can be detected based on the presence or absence of the 5 ′ region and 3 ′ region or the ratio thereof.
  • the formulation of an ALK inhibitor is useful for the treatment of cancer, and by using the method of the present invention, it is possible to select a patient to be prescribed for an ALK inhibitor.
  • the method of the present invention is not limited to lung cancer, and the ALK fusion gene is known to be associated with various cancers, and prescriptions of ALK inhibitors are useful for various cancers other than lung cancer. Is equally useful.
  • ALK fusion genes there are genes that are known to be associated with cancer, and similarly, it is known that inhibitor prescriptions are useful for cancer treatment. It is equally useful for cancers associated with these fusion genes.
  • the primer set is particularly useful as a detection reagent for ALK fusion genes.
  • the reagent may be composed of only a primer, or may contain various additives useful for stabilizing the primer.
  • the reagent may further include an internal standard primer set.
  • the reagent may further contain a fluorescently labeled probe for real-time PCR. The conditions for the primer set and the fluorescently labeled probe are as described above.
  • RNA samples 1 Cell density of 20000 cells / cm 2 for H2228 cells (human lung cancer-derived cell line, ATCC), A549 cells (human lung cancer-derived cell line, ATCC), and SK-N-DZ cells (human neuroblastoma-derived cell line, ECACC) Inoculated into a culture container of a 6-well culture plate so that the sample was cultured for 2 days.
  • RNA extraction from the sample was performed according to the manual using a commercially available RNA extraction kit (Rneasy mini kit, Qiagen) to obtain an RNA sample.
  • the extracted RNA sample was reverse transcribed to DNA with RT primer (random hexamer, Invitrogen) and Super Script II reverse transcriptase (Invitrogen) to obtain a cDNA sample.
  • RT primer random hexamer, Invitrogen
  • Super Script II reverse transcriptase Invitrogen
  • the TBP gene was measured by real-time PCR using SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as the 5 ′ region and 3 ′ region of the ALK gene contained in this cDNA sample and the internal standard gene.
  • the following primers were used.
  • the reaction conditions were 96 ° C. for 120 seconds and then 96 ° C. for 10 seconds—annealing 60 ° C. for 30 seconds—extension 72 ° C. for 30 seconds.
  • the number of cycles was determined appropriately by monitoring real-time PCR.
  • the following primers were used.
  • the composition of the reaction solution was such that each primer was used at a concentration of 0.8 ⁇ M, and the buffer attached to the kit was used according to the attached instructions.
  • ALK5 'area Forward (cccgcttctgaaagtgctac, SEQ ID NO: 3), reverse (cccggttttgttctccacta, SEQ ID NO: 4)
  • ALK3 'area Forward (agaggccttcatggaaggaa, SEQ ID NO: 5), reverse (atagcagcactccaaaggac, SEQ ID NO: 6)
  • TBP gene Forward (ccaaggaattgaggaagttgc, SEQ ID NO: 7), reverse (gtgccataaggcatcattgg, SEQ ID NO: 8)
  • Example 2 RNA sample preparation and analysis 2 Similar to Example 1, cDNA samples derived from each cell were obtained. Amplified and electrophoresed by the multiplex PCR method using TITANIUM Taq DNA polymerase (manufactured by TAKARA BIO INC.) As the 5 'region and 3' region of the ALK gene contained in this cDNA sample and the TBP gene as an internal standard gene did. The same primer as in Example 1 was used. The PCR reaction conditions were heat denaturation at 96 ° C. for 120 seconds, followed by 35 cycles of 96 ° C. for 15 seconds to 68 ° C. for 60 seconds. The composition of the reaction solution was such that each primer was used at a concentration of 0.8 ⁇ M, and a buffer attached to the polymerase was used according to the attached instructions.
  • Example 3 In the same manner as in Example 1, RNA samples derived from each cell were obtained. In the one-step real-time PCR method using TITANIUM One-Step RT-PCR Kit (manufactured by TAKARA BIO INC.) With the TBP gene as the 5 'region and 3' region of the ALK gene contained in this RNA sample and the internal standard gene It was measured. The following were used as the primers and probes for specifically detecting each amplification product. Each probe is labeled with a fluorescent substance having three different wavelengths at the 3 ′ end, and the abundance of the amplification product can be measured by a known fluorescence quenching reaction with a guanine base.
  • the reaction conditions were 50 ° C for 1 hour, heat denaturation at 96 ° C for 120 seconds, 96 ° C for 10 seconds-annealing at 60 ° C for 30 seconds-extension at 72 ° C for 30 seconds, and the number of cycles was determined appropriately by monitoring real-time PCR. .
  • the composition of the reaction solution was such that each primer was used at a concentration of 0.8 ⁇ M and each probe was used at a concentration of 0.1 ⁇ M, and a buffer attached to the kit was used according to the attached instructions.
  • ALK5 'area Forward (cccgcttctgaaagtgctac, SEQ ID NO: 3), reverse (cccggttttgttctccacta, SEQ ID NO: 4), probe (tctccatgtgagctccgaatgtcc, TAMRA modification at the 3 ′ end cytosine base, SEQ ID NO: 19)
  • TBP gene Forward (cttggcgtgtgaagataacc, SEQ ID NO: 23), reverse (tgctgcctttg

Abstract

要約　未知の融合遺伝子をも網羅してあらゆる融合遺伝子の存在を簡易迅速に検出できる手段が開示されている。本発明の融合遺伝子の測定方法は、生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む。測定対象となる融合遺伝子は、例えば、ＡＬＫ遺伝子と他の遺伝子の融合遺伝子である。

Description

融合遺伝子の測定方法
　本発明は、生体内に存在し得る融合遺伝子の測定方法に関する。
　癌患者の一部では、融合遺伝子が癌の原因となることが知られている。例えば、受容体型チロシンキナーゼの一つである未分化リンパ腫キナーゼ(Anaplastic Lymphoma Kinase; ALK)遺伝子は、様々な遺伝子と融合することで発がん性を発揮することが知られている（非特許文献５）。
　EML4-ALK融合遺伝子は、棘皮動物微小管付随タンパク質様タンパク質4(Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 4; EML4)遺伝子の5'側の一部とALK遺伝子の3'側領域が融合した遺伝子であり、一部の非小細胞性肺癌の原因となることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。EML4-ALK融合遺伝子を検出する方法としては、EML4-ALK融合遺伝子mRNAをRT-PCR法により増幅する方法が報告されている（非特許文献２）。
　EML4-ALK融合遺伝子においては、遺伝子の融合部位の違いにより、少なくとも9種類の異型遺伝子の存在が知られている(非特許文献３)。そのため、全ての融合遺伝子の発現を効率よく簡易に検出するためには、公知の方法では多数のプライマーおよびプローブを用いた複雑なマルチプレックス化が必要となり、多大なコスト、手間がかかってしまうという問題がある。また、ALK遺伝子の融合パートナーとしてはEML4遺伝子以外にも複数の遺伝子が報告されており(非特許文献４、非特許文献５)、今後も新たな融合遺伝子が見出される可能性が高い。各融合遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブを設定する公知の方法では、具体的に配列が同定されていない未知の融合遺伝子の検出は不可能である。
特開２００８－２９５４４４号
Nature 2007; 448:561-566 Clin. Can. Res. 2008; 14:6618-6624 J. Clin. Oncol. 2009; 27:1-4 Clin. Can. Res. 2009; 15:3143-3149 Biochem. J. 2009; 420:345-361
　従って、本発明の目的は、未知の融合遺伝子をも網羅できる簡易な融合遺伝子検出系を提供することにある。
　本願発明者は、鋭意研究の結果、EML4-ALK融合遺伝子の本質が「X（任意の遺伝子）＋ALK遺伝子の3'領域（キナーゼドメインを含む）」であることに着目し、融合点を境にしてALK遺伝子の5'側の領域及び3'側の領域の発現量を測定することで、融合パートナーの種類を問わず、あらゆる融合遺伝子の存在を簡易迅速に検出できることを見出し、さらに、５０種以上のプライマーセットを検討して、内部標準も含めて同時増幅が可能で且つ非特異増幅の少ないプライマーの組み合わせも見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む、融合遺伝子の測定方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号２０及び２１にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬を提供する。
　本発明により、生体内に存在し得る融合遺伝子を融合パートナーの種類にかかわらず網羅的に検出できる新規な方法が提供された。本発明の方法によれば、わずか2箇所の遺伝子領域の発現量を測定することで、あらゆる融合パートナーとの融合遺伝子を検出することが可能となり、様々な種類の融合遺伝子の検出にかかっていた手間とコストを大幅に軽減できる。例えば、ALK遺伝子の融合遺伝子には、ALK遺伝子のキナーゼドメインを含む3'側領域とEML4遺伝子等との融合遺伝子が知られているが、本発明の方法によれば、ALK遺伝子のうちの上流側の領域が失われている融合遺伝子であればいかなるものでも検出できるため、未だ具体的に存在が同定されていない新規な融合遺伝子についても検出可能であり、この点も大きな利点である。とりわけ、本願発明者が完成した特定のプライマーセットによれば、内部標準も含めてシングルチューブでPCRを実施でき、簡易迅速なALK融合遺伝子検出系として極めて有利である。EML4-ALK融合遺伝子等の融合遺伝子は、各種がん患者の一部において存在が認められており、このような融合遺伝子発現患者に対しては融合遺伝子産物の活性を阻害する阻害剤を処方することががんの治療上有用であり得る。本発明の方法により、がん患者由来の細胞、組織又は体液中での融合遺伝子の発現の有無を確認することで、阻害剤処方対象患者を選択することができるため、本発明の方法はとりわけがん治療の分野で有用である。
実施例１において、H2228細胞（EML4-ALK融合遺伝子陽性、ALK遺伝子陰性）、A549細胞（EML4-ALK融合遺伝子陰性、ALK遺伝子陰性）、SK-N-DZ細胞（EML4-ALK融合遺伝子陰性、ALK遺伝子陽性）から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域の発現を測定した結果である。 実施例２において、H2228細胞、A549細胞、SK-N-DZ細胞性から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域および内部標準遺伝子TBP遺伝子を同時に増幅、電気泳動した結果である。 実施例３において、H2228細胞、A549細胞、SK-N-DZ細胞性から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域および内部標準遺伝子TBP遺伝子を同時に増幅し、増幅産物を蛍光プローブにより測定した結果である。
　本発明で測定対象となる融合遺伝子とは、同一染色体上又は異なる染色体間で転座（逆位も包含する）が生じ、ある遺伝子の一部が他の遺伝子の一部と融合して一つの遺伝子として存在するものである。通常であればある組織中では発現しないはずの遺伝子が、染色体の転座の結果、その組織中で発現できる他の遺伝子のプロモーター領域と融合して発現してしまい、しばしばがん等の各種疾患を生じることが知られている。公知の融合遺伝子の多くは、そのように、各種疾患との関連で異常遺伝子として同定されたものである。本発明で測定対象となる融合遺伝子も、それを構成する遺伝子の一方は、通常、正常組織では本来全長が発現しないが、融合によって該組織でその一部領域が発現可能になる遺伝子であり、この遺伝子の5'領域と3'領域の発現を測定する。もっとも、該遺伝子が正常組織で全長を発現していたとしても、後述する通り、5'領域と3'領域の発現量の比率により、融合遺伝子の発現の有無や発現量を調べることができるので、融合遺伝子の条件は上記に限定されない。
　融合遺伝子の好ましい具体例としては、ALK遺伝子、ABL遺伝子、レチノイン酸受容体遺伝子、SSX遺伝子、AML1遺伝子等の遺伝子と他の遺伝子との融合遺伝子を挙げることができる。例えば、ALK遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子であるが、そのキナーゼドメインを含む3'側の領域が他の遺伝子の5'側の領域と融合した各種の融合遺伝子が公知であり、これらが発がん性を発揮することが知られている（非特許文献５等参照）。もっとも、本発明の範囲は、これらの具体例にのみ限定されず、がん等の各種疾患と関連性のある融合遺伝子の他、疾患との関連性のない各種の天然の融合遺伝子も包含される。
　ALK遺伝子（配列番号１、GenBank NM_004304）は、ヒト第2番染色体上に存在する、29のエクソンから成る遺伝子であり、キナーゼドメインは4256nt～5083nt（第4256番塩基～第5083番塩基の意）である。配列番号１に示すALK遺伝子の各エクソン領域を下記表1に示す。ALK遺伝子と他の任意の遺伝子との融合遺伝子（以下、単に「ALK融合遺伝子」ということがある）としては、非特許文献５に記載されるように、各種の融合パートナーとの融合遺伝子が知られている。公知のALK融合遺伝子の一例を配列表の配列番号９～１８に示す。配列番号９～１７がEML4-ALK融合遺伝子の塩基配列であり、配列番号１８がKIF5B-ALK融合遺伝子の塩基配列である。これらのALK融合遺伝子は、ALK遺伝子のキナーゼドメインを含むエクソン２０～２９の領域が、他の遺伝子のプロモーター領域を含む5'側領域と融合しており、非小細胞性肺癌患者の一部において発現している。エクソン２０の5'末端部が他の遺伝子と融合しているもののほか（配列番号９～１２、１４、１８）、隣接するイントロン領域が数十bp程度付加された状態で融合しているもの（配列番号１５、１６）、エクソン２０の5'末端領域が数十bp～百数十bp程度欠失した状態で融合しているもの（配列番号１３、１７）も知られている。上記に好ましい具体例として挙げたALK遺伝子以外の各遺伝子も、GenBank等のデータベースに登録され配列が公知であり、融合遺伝子の例も公知であるため、当業者であればALK融合遺伝子と同様に本発明の方法を適用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の方法では、融合遺伝子を構成する一方の遺伝子にのみ着目し、該遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の２箇所の発現を測定する。本明細書において、5'領域及び3'領域を測定すべき、融合遺伝子を構成する一方の遺伝子を、便宜的に「対象遺伝子」と呼ぶことがある。なお、「測定」には、検出、定量、半定量が包含される。
　ここで、「融合点」とは、融合により失われる領域と融合遺伝子中に含まれる領域との境界部分をいい、融合遺伝子中にあっては異なる2つの遺伝子が融合している境界部分ということもできる。例えば、配列番号９～１２、１４、１８に示すALK融合遺伝子の場合、ALK遺伝子中のエクソン２０の5'末端（すなわち配列番号１における4080nt）が融合点である。
　測定する5'領域と3'領域は、それぞれ融合点よりも上流及び下流の領域から選択すればよい。ただし、公知のALK融合遺伝子が例示するように、融合点は必ずしも遺伝子中のただ１点にのみ限定されず、同じ遺伝子の組み合わせから成る同一の融合遺伝子のバリアント間でも数十塩基程度又はそれ以上その位置が相違し得る。従って、測定すべき5'領域は、公知の融合点のうちで最も5'側にある融合点よりも上流の領域から選択することが望ましく、3'領域についても同様に、公知の融合点のうちで最も3'側にある融合点よりも下流の領域から選択することが望ましい。そして、具体的に同定されていない未知のバリアントをも網羅する観点からは、これらの最も上流又は下流の融合点から十分に離れた領域、例えば200塩基程度、好ましくは500塩基以上離れた領域から選択することが好ましい。
　例えば、融合遺伝子としてALK融合遺伝子を測定する場合、上記したように、公知のALK融合遺伝子の多くは、ALK遺伝子のエクソン20及びその下流の領域が融合パートナーと融合しているので、5'領域はALK遺伝子のエクソン19及びその上流側の領域内から選択し、3'領域はALK遺伝子のエクソン20及びその下流側の領域内から選択すればよい。そして、公知のALK融合遺伝子の中には、エクソン20のうちの5'末端側49bpまでが失われているものが存在するため（配列番号１３）、このバリアントの融合点である4129nt（配列番号１を基準とした位置。融合点の位置の表現については以下同様。）よりも下流側の領域から3'領域を選択することが望ましい。具体的には、5'領域として、ALK遺伝子（配列番号１）のうちの1nt～4079nt内の領域、3'領域として4129nt～6222nt内の領域を選択することが望ましい。また、未知のALK融合遺伝子の中には、エクソン20の5'末端側がより多く欠失しているものが存在する可能性も考えられるため、ALK融合遺伝子を網羅的に検出する観点からは、3'領域は、公知の融合点のうちで最も3'側にある融合点である4129ntの融合点から十分に離れた領域、例えば200bp程度以上、好ましくは500bp程度以上離れた領域であることが好ましい。また、3'領域は、ALK遺伝子のキナーゼドメインから選択することも好ましい。例えば、下記実施例では、5'領域として配列番号１の2486nt～2629ntの領域、3'領域として配列番号１の4801nt～4865ntもしくは4775nt～4939ntの領域の発現をそれぞれ測定している。もっとも、本発明はこのような具体例に限定されない。
　本発明で用いられる試料は、生体から分離されたタンパク質試料又は核酸試料であり、好ましくは核酸試料である。中でも、生体から採取された細胞、組織、血液等の試料から抽出された全RNA試料等のRNA試料であることが好ましい。RNA試料は、cDNAに逆転写して用いることができる。RNAの抽出やcDNAの合成はそれ自体周知の常法であり、市販のキットを用いて容易に行なうことができる。逆転写反応のプライマーにはランダムヘキサマーを用いることが望ましい。
　5'領域及び3'領域の発現の測定は、例えば、タンパク質試料について、5'領域と3'領域をそれぞれ特異的に認識する抗体を用いて免疫測定することによっても実施し得るが、本発明では、RNA試料について、対象遺伝子から転写されるmRNA又はこのmRNAから合成されたcDNAの5'領域及び3'領域を測定することにより行なうことが好ましい。このようなmRNA又はcDNAの測定法としては、プライマーを用いた核酸増幅法、及びプローブを用いたハイブリダイゼーション法を挙げることができる。核酸増幅法としては、RT-PCR、リアルタイムPCRやNASBA法等を挙げることができる。ハイブリダイゼーション法としては、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションの他、固相化プローブを用いたアレイ解析法等を挙げることができる。これらの手法自体は周知の常法であり、本発明ではいずれの手法を用いてもよい。なお、免疫測定それ自体や、所望の領域を特異的に認識する抗体の作製方法も、周知の常法である。
　プライマー及びプローブとしては、対象とする5'領域及び3'領域のそれぞれに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とするmRNA又はcDNAとのみハイブリダイズし、その他の核酸とは実質的にハイブリダイズしないという意味である。通常のハイブリダイズの条件下とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3～9.0)、1.5mM MgCl2といった一般的な緩衝液を用いて、54℃～60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいい、また、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、5 x SSPE、50％ホルムアミド、5 x Denhardt's solution、0.1～0.5％SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、42℃～65℃程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度又はハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブとして用いるポリヌクレオチドのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。また、「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても対象領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。そのようなポリヌクレオチドは、当業者であれば、公知の配列情報を参照して適宜設計し調製することができる。配列情報は、GenBank等のデータベースから容易に入手可能である。例えば、ALK遺伝子の塩基配列であれば、GenBankにアクセッション番号NM_004304で登録されており、本願配列表にも配列番号１として記載されている。
　RT-PCR法およびリアルタイムＰＣＲによる測定法の具体的な例としては、下記実施例に記載される方法が挙げられる。すなわち、各種細胞から抽出したＲＮＡ試料からランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡを調製した後、該cDNAを鋳型とし、ALK遺伝子等の対象遺伝子の5'領域および3'領域をそれぞれ特異的に増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、対象遺伝子の各領域の発現を測定することができる。リアルタイムPCRでは、蛍光標識プローブを用いた検出法も公知であり、増幅産物の泳動工程を省略してより簡便迅速な検出が可能になる。本発明でも、各領域の増幅断片に特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブを調製して用いることができる。5'領域と3'領域とで波長が異なる蛍光標識を用いれば、蛍光波長によって増幅断片を区別して測定できる。そのような蛍光標識プローブの調製も、当業者であれば容易に行なうことができ、その具体例が下記実施例に記載されている。ここで、「特異的に増幅する」とは、対象領域のみを増幅するか、あるいは対象外の領域も増幅するが、対象領域の増幅量と比較してごく微量であり、相対的に無視できる程度にしか増幅しないことを意味する。5'領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーのセットは、5'領域を特異的に増幅するプライマーセットである。増幅するサイズは当業者が適宜選択することができるが、増幅時間の短縮化や泳動による分離等の観点から、通常は1000bp以下であり、好ましくは30bp～500bp程度である。例えば、対象遺伝子がALK遺伝子の場合、プライマーセットの具体例を挙げると、5'領域を特異的に増幅するプライマーセットとしては配列番号３及び４に示すプライマーセット、3'領域を特異的に増幅するプライマーセットとしては配列番号５及び６に示すプライマーセットもしくは配列番号２０及び配列番号２１に示すプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。また、蛍光標識プローブの具体例として、配列番号３及び４のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号１９に示す塩基配列から成るALK5'領域特異的プローブ、配列番号２０及び２１のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号２２に示す塩基配列から成るALK3'領域特異的プローブが挙げられるが、これらに限定されない。
　核酸増幅法においては、１種類もしくは複数種類の内部標準遺伝子を測定してもよい。内部標準遺伝子としては、GAPDH遺伝子、ACTB遺伝子、HPRT1遺伝子、HMBS遺伝子、TBP遺伝子などが周知であり、本発明でもこれらを用いることができる。内部標準遺伝子についても蛍光標識プローブを調製して用いることができる。下記実施例ではTBP遺伝子を内部標準として用いており、そのためのプライマーセットの塩基配列は配列番号７及び８もしくは配列番号２３及び２４に示されているが、これらに限定されるものではない。また、TBP遺伝子特異的プローブの具体例として、配列番号２３及び２４のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号２５に示す塩基配列から成るプローブが挙げられるが、これに限定されない。
　5'領域と3'領域の発現を測定した後、各領域の発現を対比する。リアルタイムPCRにより測定した場合には、内部標準遺伝子の発現量で標準化した対象遺伝子の各領域の発現量を対比すればよい。増幅産物を泳動して確認する場合には、バンドの有無又はシグナル強度を対比すればよい。試料が由来する生体組織又は細胞中で、対象遺伝子全長が発現している場合には、5'領域と3'領域の両者の発現が確認される。融合遺伝子のみが発現している場合には、5'領域の発現が確認されず、3'領域の発現のみが確認される。対象遺伝子全長が発現せず、且つ融合遺伝子も発現していない場合には、5'領域及び3'領域いずれも発現が確認されない。対象遺伝子全長及び融合遺伝子の両者が発現している場合には、5'領域と3'領域の両者の発現が確認されることになるが、対象遺伝子全長のみが発現している場合と比較して3'領域の発現量が多くなる。このような場合には、例えば、対象遺伝子全長を発現し、融合遺伝子を発現していない組織や細胞から得た試料をコントロールとして同時に測定し、該コントロール試料での5'領域発現量と3'領域発現量の比率を求め、この比率と試料における発現量の比率とを対比すると、融合遺伝子の発現をより詳細に確認できる。そのようなコントロール試料は、当業者であれば公知の情報に基づいて容易に準備することができる。例えば、ALK遺伝子の場合、ALK遺伝子全長のみを発現し、ALK融合遺伝子を発現しない細胞株として、SK-N-DZ細胞などの細胞株が知られている。以上のように、対象遺伝子の5'領域及び3'領域の発現の有無又は発現量の比率に基づき、融合遺伝子の発現を測定することができる。
　例えば、ヒトの肺ではALK遺伝子全長は発現していないが、一部の非小細胞性肺癌患者において、肺癌細胞中でALK融合遺伝子が発現していることが知られている。従って、肺癌患者から採取した肺生検試料から抽出したRNA試料を用いて本発明の方法を実施した場合には、5'領域の発現の有無で融合遺伝子の発現を検出可能である。すなわち、この場合、3'領域の発現のみが認められ、5'領域の発現が認められない患者では、ALK融合遺伝子が存在し発現していると判断できる。血液試料（全血、血清又は血漿）から抽出したRNA試料を用いた場合でも、5'領域及び3'領域の発現の有無又はその比率に基づいて、ALK融合遺伝子を検出することができる。ALK融合遺伝子を発現する肺癌患者では、ALK阻害剤の処方が癌の治療上有用であり、本発明の方法を用いれば、ALK阻害剤の処方対象となる患者を選択することができる。肺癌に限らず、ALK融合遺伝子は各種がんとの関連が知られており、肺癌以外の各種がんでもALK阻害剤の処方が有用であるため、本発明の方法は肺癌以外のがんについても同様に有用である。また、ALK融合遺伝子以外にもがんとの関連が知られている遺伝子が存在し、同様にがん治療のために阻害剤処方が有用であることが知られているので、ALK融合遺伝子以外の融合遺伝子が関連するがんについても同様に有用である。
　下記実施例で用いられているALK遺伝子5'領域増幅用プライマーセット（配列番号３、４）及び3'領域増幅用プライマーセット（配列番号５、６もしくは配列番号２０、２１）からなる2組のプライマーセットは、ALK融合遺伝子の検出試薬として特に有用である。該試薬は、プライマーのみから成るものであってもよいし、プライマーの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬はまた、内部標準用プライマーセットをさらに含んでいてもよい。さらにまた、該試薬は、リアルタイムPCR用の蛍光標識プローブをさらに含んでいてもよい。プライマーセット及び蛍光標識プローブについての条件は上記した通りである。とりわけ、上記した2組のプライマーセットと、配列番号７、８もしくは配列番号２３、２４に示す内部標準用プライマーセットとの３組の組み合わせは、本願発明者が50種以上のプライマーセットについて実験を行ない、同時増幅が可能で且つ非特異増幅の少ないものとして選択された好ましい組み合わせであり、この3組の組み合わせによるととりわけ簡便にALK融合遺伝子の存在を検出可能である（下記実施例参照）。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＲＮＡサンプルの調製および解析１
　H2228細胞（ヒト肺癌由来細胞株、ATCC）、A549細胞（ヒト肺癌由来細胞株、ATCC）、SK-N-DZ細胞（ヒト神経芽腫由来細胞株、ECACC）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように６穴培養プレートの培養容器に播種し、2日間培養してサンプルとした。サンプルからのRNA抽出は、市販のRNA抽出キット（Rneasy mini kit、キアゲン社）を用いてマニュアルに従い実施し、RNAサンプルを得た。抽出したRNAサンプルをＲＴプライマー（ランダムヘキサマー、インビトロジェン社）およびSuper Script II逆転写酵素（インビトロジェン社製）にてＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡサンプルを得た。
　このｃＤＮＡサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をSYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- （東洋紡社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて測定した。プライマーは以下のものを使用した。反応条件は、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１０秒－アニーリング６０℃３０秒－伸長７２℃３０秒のサイクルとし、サイクル数はリアルタイムPCRをモニターして適宜決定した。プライマーは以下のものを使用した。反応液の組成は、各プライマーを０．８μMの濃度で使用した他は、キットに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。
ALK5'領域：
フォワード（cccgcttctgaaagtgctac、配列番号３）、リバース（cccggttttgttctccacta、配列番号４）
ALK3'領域：
フォワード（agaggccttcatggaaggaa、配列番号５）、リバース（atagcagcactccaaaggac、配列番号６）
TBP遺伝子：
フォワード（ccaaggaattgaggaagttgc、配列番号７）、リバース（gtgccataaggcatcattgg、配列番号８）
　結果を図１に示す。TBP遺伝子発現量で標準化したALK遺伝子の発現量について、SK-N-DZ細胞における発現量を100%としたときの相対値を示した。SK-N-DZ細胞由来のcDNAサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の存在が確認された。即ち、正常な融合していないALK遺伝子のみが存在することを意味する。H2228細胞由来ではALK3'領域のみ存在が確認された。即ち、ALK5'領域は発現しておらず、融合したALK3'領域のみが発現していることを意味する。この結果は、ALK遺伝子の5'領域および3'領域の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在が簡易に検出可能であることを示している。
実施例２：ＲＮＡサンプルの調製および解析２
　実施例１と同様に各細胞由来のcDNAサンプルを得た。このｃＤＮＡサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をTITANIUM Taq DNA polymerase（タカラバイオ社製）を使用したマルチプレックスＰＣＲ法にて増幅、電気泳動を実施した。プライマーは実施例１と同様のものを使用した。ＰＣＲの反応条件は、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１５秒－６８℃６０秒を３５サイクルとした。反応液の組成は、各プライマーを０．８μMの濃度で使用した他は、ポリメラーゼに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。
　結果を図２に示す。SK-N-DZ細胞由来のcDNAサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の増幅が確認されたが、H2228細胞ではALK3'領域のみ増幅が確認された。また、すべてのcDNAサンプルで内部標準TBP遺伝子の増幅が確認された。この結果は、ALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在を簡易に検出可能であることを示している。
実施例３：
　実施例１と同様に各細胞由来のＲＮＡサンプルを得た。このRNAサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をTITANIUM One-Step RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を使用したOne-Step リアルタイムＰＣＲ法にて測定した。プライマーおよび各増幅産物を特異的に検出するプローブは以下のものを使用した。各プローブは、それぞれ３'末端に異なる３波長を有した蛍光物質が標識されており、公知であるグアニン塩基による蛍光消光反応により、増幅産物の存在量を測定可能である。反応条件は、５０℃　１時間、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１０秒－アニーリング６０℃３０秒－伸長７２℃３０秒のサイクルとし、サイクル数はリアルタイムPCRをモニターして適宜決定した。反応液の組成は、各プライマーを０．８μM、各プローブを０．１μMの濃度で使用した他は、キットに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。
ALK5'領域：
フォワード（cccgcttctgaaagtgctac、配列番号３）、リバース（cccggttttgttctccacta、配列番号４）、プローブ（tctccatgtgagctccgaatgtcc、3'末端のシトシン塩基にTAMRA修飾、配列番号１９）
ALK3'領域：
フォワード（atgctgccagttaagtggatg、配列番号２０）、リバース（actggtgacaaactccagaac、配列番号２１）、プローブ（tatgccataccccagcaaaagcaac、3'末端のシトシン塩基にBODIPY FL修飾、配列番号２２）
TBP遺伝子：
フォワード（cttggcgtgtgaagataacc、配列番号２３）、リバース（tgctgcctttgttgctcttc、配列番号２４）、プローブ（ccttacgctcagggcttggcctcc、3'末端のシトシン塩基に5-CR6G修飾、配列番号２５）
　結果を図３に示す。TBP遺伝子の発現量およびALK5'領域およびALK3'領域の発現量について、SK-N-DZ細胞における発現量を100%としたときの相対値を示した。SK-N-DZ細胞由来のＲＮＡサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の増幅が確認されたが、H2228細胞ではALK3'領域のみ増幅が確認された。また、すべてのＲＮＡサンプルで内部標準TBP遺伝子の増幅が確認された。この結果は、ALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在をＲＮＡサンプルから直接に検出可能であることを示している。

Claims (14)

  1. 　生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む、融合遺伝子の測定方法。
  2. 　融合遺伝子を構成する前記一方の遺伝子がＡＬＫ遺伝子である請求項１記載の方法。
  3. 　前記5'領域がＡＬＫ遺伝子のエクソン1～19内のいずれかの領域であり、前記3'領域がエクソン20～29内のいずれかの領域である請求項２記載の方法。
  4. 　前記5'領域は、配列番号１に示すＡＬＫ遺伝子配列の1nt～4079ntの領域内のいずれかの領域であり、前記3'領域はＡＬＫ遺伝子配列の4129nt～6222ntの領域内のいずれかの領域である請求項３記載の方法。
  5. 　前記試料がＲＮＡ試料であり、前記発現の測定は、ＡＬＫ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はこれから合成されたｃＤＮＡの5'領域及び3'領域を測定することにより行なわれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　5'領域を特異的に増幅するプライマーセットと、3'領域を特異的に増幅するプライマーセットとを用いたＲＴ－ＰＣＲにより行なわれる請求項５記載の方法。
  7. 　配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを用いる請求項６記載の方法。
  8. 　配列番号７及び８にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに用いる請求項７記載の方法。
  9. 　前記生体ががん患者である請求項２ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記生体が肺癌患者である請求項９記載の方法。
  11. 　配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬。
  12. 　配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号２０及び２１にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬。
  13. 　配列番号７及び８にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに含む請求項１１記載の試薬。
  14. 　配列番号２３及び２４にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに含む請求項１２記載の試薬。
PCT/JP2010/066768 2009-10-06 2010-09-28 融合遺伝子の測定方法 WO2011043220A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/500,497 US20120202214A1 (en) 2009-10-06 2010-09-28 Method for detecting fusion gene
EP10821891A EP2487250A4 (en) 2009-10-06 2010-09-28 METHOD FOR DETECTION OF A FUSION GENE
JP2011535352A JPWO2011043220A1 (ja) 2009-10-06 2010-09-28 融合遺伝子の測定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-232473 2009-10-06
JP2009232473 2009-10-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011043220A1 true WO2011043220A1 (ja) 2011-04-14

Family

ID=43856678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/066768 WO2011043220A1 (ja) 2009-10-06 2010-09-28 融合遺伝子の測定方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120202214A1 (ja)
EP (1) EP2487250A4 (ja)
JP (1) JPWO2011043220A1 (ja)
WO (1) WO2011043220A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065646A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 アークレイ株式会社 遺伝子存在量の測定方法
US8962245B2 (en) 2010-09-02 2015-02-24 Kurume University Method for producing circular DNA formed from single-molecule DNA
WO2015064620A1 (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
WO2015064621A1 (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
US9121051B2 (en) 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest
US9416358B2 (en) 2011-08-31 2016-08-16 Kurume University Method for exclusive selection of circularized DNA from monomolecular DNA in circularizing DNA molecules
US10294515B2 (en) 2011-07-01 2019-05-21 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting gene fusions

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3133168B1 (en) 2009-05-26 2019-01-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting gene dysregulations
CN106462669A (zh) * 2014-03-25 2017-02-22 奎斯特诊断投资股份有限公司 通过使用平均循环阈值的基因内差异表达(ide)检测基因融合
JP6856544B2 (ja) * 2015-04-17 2021-04-07 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 遺伝子融合体を検出するための多重ｐｃｒ

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10215897A (ja) * 1997-02-05 1998-08-18 Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk 染色体相互転座による変異細胞検出方法、その検出用プローブキット、およびその検出装置
WO2002093130A2 (en) * 2001-05-14 2002-11-21 Cancer Genetics, Inc. Methods of analyzing chromosomal translocations using fluorescence in situ hybridization (fish)
JP2004089089A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Srl Inc ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用核酸及びそれを用いたＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法
JP2007535966A (ja) * 2004-05-04 2007-12-13 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ 染色体異常を検出するための方法
JP2008295444A (ja) 2006-10-11 2008-12-11 Astellas Pharma Inc Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5529925A (en) * 1993-12-03 1996-06-25 St. Jude Children's Research Hospital Nucleic acid sequences and fusion proteins present in human t(2;5) lymphoma
SI2450437T1 (sl) * 2006-04-14 2017-12-29 Cell Signaling Technology Inc. Okvarjenost genov in mutantna ALK kinaza v človeških solidnih tumorjih
EP1914240B1 (en) * 2006-10-11 2009-12-02 Astellas Pharma Inc. EML4-ALK fusion gene
EP3133168B1 (en) * 2009-05-26 2019-01-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting gene dysregulations

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10215897A (ja) * 1997-02-05 1998-08-18 Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk 染色体相互転座による変異細胞検出方法、その検出用プローブキット、およびその検出装置
WO2002093130A2 (en) * 2001-05-14 2002-11-21 Cancer Genetics, Inc. Methods of analyzing chromosomal translocations using fluorescence in situ hybridization (fish)
JP2004089089A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Srl Inc ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用核酸及びそれを用いたＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法
JP2007535966A (ja) * 2004-05-04 2007-12-13 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ 染色体異常を検出するための方法
JP2008295444A (ja) 2006-10-11 2008-12-11 Astellas Pharma Inc Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM. J., vol. 420, 2009, pages 345 - 361
CLIN. CAN. RES., vol. 14, 2008, pages 6618 - 6624
CLIN. CAN. RES., vol. 15, 2009, pages 3143 - 3149
HIROYUKI MANO: "Haigan no Atarashii Gan Idenshi -EML4-ALK Yugo Idenshi", THE LUNG PERSPECTIVES, vol. 16, no. 4, 2008, pages 76 - 78, XP008161091 *
J. CLIN. ONCOL., vol. 27, 2009, pages 1 - 4
NATURE, vol. 448, 2007, pages 561 - 566

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8962245B2 (en) 2010-09-02 2015-02-24 Kurume University Method for producing circular DNA formed from single-molecule DNA
US9434941B2 (en) 2010-09-02 2016-09-06 Kurume University Method for producing circular DNA formed from single-molecule DNA
US11268133B2 (en) 2011-07-01 2022-03-08 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting gene fusions
US10294515B2 (en) 2011-07-01 2019-05-21 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting gene fusions
US9416358B2 (en) 2011-08-31 2016-08-16 Kurume University Method for exclusive selection of circularized DNA from monomolecular DNA in circularizing DNA molecules
US9121051B2 (en) 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest
WO2013065646A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 アークレイ株式会社 遺伝子存在量の測定方法
KR101483576B1 (ko) 2011-10-31 2015-01-21 아크레이 가부시키가이샤 유전자 존재량의 측정 방법
JP5570657B2 (ja) * 2011-10-31 2014-08-13 アークレイ株式会社 遺伝子存在量の測定方法
WO2015064621A1 (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
WO2015064620A1 (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
JPWO2015064621A1 (ja) * 2013-10-29 2017-03-09 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
JPWO2015064620A1 (ja) * 2013-10-29 2017-03-09 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2487250A1 (en) 2012-08-15
EP2487250A4 (en) 2013-03-20
JPWO2011043220A1 (ja) 2013-03-04
US20120202214A1 (en) 2012-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011043220A1 (ja) 融合遺伝子の測定方法
JP6100685B2 (ja) 血中ｄｎａの定量的検出による悪性新生物の病勢の進行を評価する方法
Gunduz et al. Frequent deletion and down-regulation of ING4, a candidate tumor suppressor gene at 12p13, in head and neck squamous cell carcinomas
US9216172B2 (en) Method for determining effectiveness of cancer treatment by assessing the presence of a KIF5B-RET chimeric gene
JP5769952B2 (ja) Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子の高感度検出方法
JP2017538404A (ja) 癌を診断及び／又は観察するための循環無細胞ｒｎａの使用
AU2013281355B2 (en) Targeted RNA-seq methods and materials for the diagnosis of prostate cancer
JP7392048B2 (ja) 分析方法及びキット
CN110863053A (zh) 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法
Robesova et al. TaqMan based real time PCR assay targeting EML4-ALK fusion transcripts in NSCLC
Araki et al. Usefulness of peptide nucleic acid (PNA)-clamp smart amplification process version 2 (SmartAmp2) for clinical diagnosis of KRAS codon12 mutations in lung adenocarcinoma: Comparison of PNA-clamp SmartAmp2 and PCR-related methods
JP2017169580A (ja) 上皮増殖因子受容体キナーゼ・ドメイン内の新規な複合突然変異
Wong et al. The role of microsatellite instability in cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma of the cervix
Feng et al. Reduced telomere length in colorectal carcinomas
US9029089B2 (en) Methods for predicting survival in cancer patients
KR20100034557A (ko) 폐선암 수술 후 초기 재발 예측용 바이오마커
JP7297902B2 (ja) 分析方法及びキット
JP6806440B2 (ja) 新規融合体及びその検出法
JP7346533B2 (ja) 分析方法及びキット
WO2013075110A2 (en) A novel eml4-alk variant: primers, probes, methods, and kits for the detection thereof
Baum et al. Non-small cell lung carcinoma: molecular genetics with consideration of cytologic samples
Vlastos et al. Mapping EGFR1 mutations in patients with lung adenocarcinoma
CA2641410A1 (en) Genes for prognosis of cancer
US20140093872A1 (en) Method of Mutation Detection in Blood Cell-Free DNA Using Primer Extension (PE) and PCR
EP3146073B1 (en) A diagnostic marker for paget disease

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10821891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011535352

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13500497

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010821891

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010821891

Country of ref document: EP