JP5570657B2 - 遺伝子存在量の測定方法 - Google Patents
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Description
特に、特開2010−538614号公報に開示されている技術では、対象ゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定する方法であって、対象ゲノムDNAを含む試料において、標的遺伝子配列及び参照遺伝子配列を核酸増幅し、デジタルPCRによって増幅された各遺伝子の配列をアッセイし、標的遺伝子配列を含む増幅ポリヌクレオチド分子の数と、参照遺伝子配列を含む増幅ポリヌクレオチド分子の数との比から、コピー数の変動を決定している。
[1] 一の反応液に、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量が相違し得る少なくとも2つの遺伝子をコードする核酸を、単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーとを含み、前記第二のプライマーの存在量が、前記第一のプライマーセットを構成する第一プライマーのうち存在量の最も多い第一プライマーの存在量に比べて4倍量〜20倍量(モル比)である前記反応液を用いて、核酸増幅を行い、前記単一の付加塩基配列を含み且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の増幅産物を得ること(核酸増幅工程)、前記少なくとも2種の増幅産物の存在量に基づくそれぞれのシグナルを検出し、該シグナルから前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を測定すること(存在量測定工程)、を含む遺伝子の存在量の測定方法:
前記核酸における遺伝子の存在量は、ゲノムDNAにおける遺伝子のコピー数であり、
前記核酸増幅工程における前記反応液は、前記少なくとも2種の増幅産物をそれぞれ認識する、同一の蛍光色素で標識された少なくとも2種の検出用プローブを更に含み、
前記存在量測定工程における前記シグナルは、前記少なくとも2種の増幅産物と、それぞれに対応する前記少なくとも2種の検出用プローブとが解離する際の、少なくとも2つの蛍光強度の変動であり、
前記存在量測定工程は、前記少なくとも2つの蛍光強度の変動を同一の波長で測定し、Tm解析を行い、更に面積解析して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を決定する。
[2] 前記第一のプライマーが、前記単一の付加塩基配列と、それぞれの前記遺伝子をコードする核酸の増幅対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列と、を有する[1]に記載の測定方法。
[3] 前記第二のプライマーが、前記単一の付加塩基配列又はその相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する[1]又は[2]に記載の測定方法。
[4] 前記単一の付加塩基配列が、前記少なくとも2つの遺伝子の各増幅対象領域中の塩基配列とは非相同的な塩基配列からなる[1]〜[3]のいずれか1つに記載の測定方法。
[5] 前記第一のプライマーセットが、前記第一のプライマーと、該第一のプライマーがハイブリダイズする塩基配列の相補鎖側の塩基配列を増幅するために用いられ且つ前記単一の付加塩基配列を含まない第三のプライマーとを含む[1]〜[4]のいずれか1つに記載の測定方法。
[6] 前記反応液における前記第三のプライマーの存在量が、前記反応液における前記第一のプライマーの存在量に比べて、物質量基準で0.25倍量〜4倍量である[5]に記載の測定方法。
[7] 前記第一のプライマーが、増幅対象領域の塩基配列に対してミスマッチ塩基及び縮重塩基からなる群より選択された少なくとも一方を含む[1]〜[6]のいずれか1つに記載の測定方法。
[8] 前記第二のプライマーのTm値が、前記第一のプライマーの各Tm値よりも高い[1]〜[7]のいずれか1つに記載の測定方法。
[9] 前記第二のプライマーが、前記単一の付加塩基配列及びその相補的な塩基配列とは異なる付加配列を更に含む[1]〜[8]のいずれか1つに記載の測定方法。
[10] 前記少なくとも2つの遺伝子の少なくとも1つは、対象サンプル中の核酸における存在量が予め判明している参照遺伝子であり、少なくとも1つは対象サンプル中の核酸における存在量の測定対象となる標的遺伝子である[1]〜[9]のいずれか1つに記載の測定方法。
[11] 前記参照遺伝子由来の増幅産物の検出シグナルと、前記標的遺伝子由来の増幅産物の検出シグナルとを比較して、前記標的遺伝子の対象サンプル中の核酸における存在量を決定することを含む[10]に記載の測定方法。
[12] 前記少なくとも2つの遺伝子の少なくとも1つは、融合遺伝子の融合点よりも上流の5’側の遺伝子領域であり、少なくとも1つは、融合遺伝子の融合点よりも下流の3’側の遺伝子領域である[1]〜[9]のいずれか1つに記載の測定方法。
[13] 前記5’側の遺伝子領域由来の増幅産物の検出シグナルと、前記3’側の遺伝子領域由来の増幅産物の検出シグナルとを比較して、サンプル中における前記融合遺伝子の存在を検出することを含む[12]に記載の測定方法。
[14] 単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーと、前記少なくとも2つの遺伝子の核酸増幅領域にそれぞれハイブリダイズ可能な塩基配列を有し且つ同一の蛍光色素の標識を備えた少なくとも2つの検出用プローブと、を含む[1]〜[4]及び[7]〜[13]のいずれか1つに記載の測定方法のための遺伝子測定キット。
[15] 単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーと、前記第一のプライマーがハイブリダイズする塩基配列の相補鎖側の塩基配列を増幅するために用いられ且つ前記単一の付加塩基配列を含まない第三のプライマーと、前記少なくとも2つの遺伝子の核酸増幅領域にそれぞれハイブリダイズ可能な塩基配列を有し且つ同一の蛍光色素の標識を備えた少なくとも2つの検出用プローブと、を含む[5]〜[13]のいずれか1つに記載の遺伝子測定キット。
[16] 前記第一のプライマーにより導入された単一の付加塩基配列を含み且つ第二のプライマーによって核酸増幅された前記少なくとも2つの遺伝子に対応する増幅産物の存在量に基づく少なくとも2つのシグナルを検出する検出装置と、前記検出装置により検出された前記少なくとも2つの検出シグナルを対比して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を演算する演算装置と、を含む[1]〜[13]のいずれか1つに記載の遺伝子の存在量の測定方法を実施する遺伝子測定システム。
なお、本明細書において「遺伝子」には、遺伝子の一部の領域を示す「遺伝子領域」も包含される。また、「遺伝子」は塩基配列によりコードされているものであればよく、特定の機能を発現するものだけではなく、特定の機能を発現しないものも包含される。
本発明において「鋳型核酸」又は「鋳型」とは、核酸増幅を行う際にプライマーが鋳型としてアニーリングする塩基配列を意味する。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明の概要について説明する。
本発明にかかる遺伝子の存在量の測定方法は、一の反応液において、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量が相違し得る少なくとも2つの遺伝子をコードする核酸を、単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための特定量の第二のプライマーとを用いて、核酸増幅を行い、前記単一の付加塩基配列を含み且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の増幅産物を得ること、(以下、「核酸増幅工程」という)、前記少なくとも2種の増幅産物の存在量に基づくシグナルを検出し、該シグナルから前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を測定すること(以下、「存在量測定工程」という)、を含む。
前記測定対象遺伝子は、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量が互いに相違し得るものであり、一般に、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量が異なっているものを含むが、同一のものが含まれていてもよい。反応液中の前記測定対象遺伝子をコードする塩基配列は、後述する核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸に相当する。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムDNAを単離して測定対象遺伝子の核酸を調製することができる。全血からのゲノムDNAの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムDNA単離キット(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等が使用できる。
ここで、「対象サンプル中の核酸における存在量」とは、所定のサイズの遺伝子のコピー数、対象サンプル中の核酸に占める1コピーの遺伝子全体の大きさ、疾患に関わる遺伝子の増加や減少、タンパク質に翻訳された時に機能ドメインに相当する遺伝子内の特定の領域、タンデムリピートやマイクロサテライト等を意味する。本発明にかかる測定方法においては、遺伝子のコピー数を、測定対象となる存在量とすることが、例えば、前記測定方法の感度及び簡便性等の関連から好ましい。
前記標的遺伝子として使用可能な遺伝子は、測定された存在量の利用目的によって異なる。例えば、多型を示す遺伝子、疾患に起因して存在量が増加若しくは減少する遺伝子、疾患に起因して塩基配列中の塩基が欠失する遺伝子、並びに、検体により発現量が変化する遺伝子等が挙げられる。
以下、ALK融合遺伝子を例に挙げて、具体的に説明する。
ALK融合遺伝子としては、例えばJ. Clon. Oncol. 2009 Sep 10;27(26): 4232−5に記載のEML4−ALK融合遺伝子や、KIF5B、KLC1、TFG等各種の遺伝子との融合遺伝子が知られている。
ここで、本発明における測定方法においては、融合遺伝子を構成するいずれか一方の遺伝子にのみ着目し、該遺伝子の融合点よりも上流の5’側の遺伝子領域の存在量及び下流の3’側の遺伝子領域の存在量を測定し、比較すればよい。
融合点とは、異なる2つの遺伝子が融合している境界部分を意味する。例えば、ALK遺伝子中4125番目の塩基(配列番号23中、1760番目の塩基に相当)が融合点となる。
なお、遺伝子の存在量を測定する5’側の遺伝子領域及び3’側の遺伝子領域とは、融合点よりも、上流及び下流の領域であれば特に制限はされない。遺伝子の存在量を測定する5’側の遺伝子領域及び3’側の遺伝子領域は、融合点から1塩基以上離れていれば遺伝子の存在量の測定は可能であるが、十分に離れた領域であることが好ましく、例えば10塩基程度以上離れていることがより好ましく、50塩基程度以上離れていることが更に好ましい。
また、融合遺伝子変異に伴って生じる融合点は、核酸上に複数存在する可能性がある。そのため、融合点から5’側の遺伝子領域及び3’側の遺伝子領域の距離を、測定対象となる融合遺伝子変異の種類に応じて適宜設定することで、検出可能な融合遺伝子変異の種類を自由に変更することができ、より多くの変異体(Variant)を検出することが可能になる。
尚、融合点からの遺伝子領域までの距離(塩基数)は、測定対象遺伝子となる5’側の遺伝子領域又は3’側の遺伝子領域に、ハイブリダイズするプライマーのうち、融合点に近い距離にハイブリダイズしたプライマーの5’末端をもとに計算する。
なお、本明細書において、融合遺伝子は、ALK融合遺伝子に限定されない。例えば、GenBank等のデータベースに塩基配列が登録されているものであれば、いずれの遺伝子であっても、ALK融合遺伝子と同様に、本発明にかかる方法を適用することができる。
単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能とするためには、前記第一のプライマーは、単一の付加塩基配列と、前記測定対象遺伝子をコードする核酸の塩基配列の一部を鋳型として核酸増幅可能な塩基配列と、を含むことができ、これらの間にリンカー配列を含んでいてもよい。前記測定対象遺伝子をコードする核酸の塩基配列の一部を鋳型として核酸増幅可能な塩基配列としては、例えば、前記増幅対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列とすることができる。第一のプライマーは、例えば、操作の簡便性、測定方法の測定感度等の観点から、前記単一の付加塩基配列と前記測定対象遺伝子の増幅対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列との組み合わせであることが好ましい。
このような単一の付加塩基配列の構造(塩基配列及び長さ)としては、特に制限はなく、任意の配列を選択することができる。増幅産物の全てにおいて共通して導入される塩基配列であることから、少なくとも2つの遺伝子の各増幅対象領域中の塩基配列とは非相同的な塩基配列からなる配列であることが好ましく、前記増幅対象領域及び該増幅対象領域に隣接する領域(例えば、1000塩基長以内の範囲)を含めた領域の塩基配列とは非相同的な塩基配列からなる配列であることがより好ましく、反応液中に存在する遺伝子の塩基配列には存在しない塩基配列からなる配列であることが更に好ましい。これにより、後述する第二のプライマーによる核酸増幅の精度を高めることができる等の利点が得られる。ここで、「非相同的」とは、例えば、増幅対象領域50%以下、好ましくは25%以下の相同性を有することを意味する。
前記第一のプライマーに関する「ハイブリダイズ可能な塩基配列」には、鋳型核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列が含まれ、また、後述する核酸増幅条件下において、完全に相補的な塩基配列に対して、一本鎖核酸に対する親和性が大きく損なわれない程度に、更に1個又は数個の塩基が、欠失、置換、又は付加した塩基配列も含んでもよい。塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては1塩基又は2塩基以上が挙げられ、第一のプライマー全体の長さによって異なるが、例えば1塩基〜10塩基、好ましくは1塩基〜5塩基が挙げられる。
また他の調整用付加塩基としては、ウラシル塩基、APサイト、及びRNA塩基からなる群より選択された分解誘導塩基を導入してもよい。これらの分解誘導塩基を導入した場合には、第一のプライマーによる増幅産物を得た後、これら分解誘導塩基を分解することにより、増幅産物に対する第一のプライマーのTm値を下げることができ、また、第二のプライマーによる核酸増幅を優先して進行させることができるなどの利点が得られる。
また、前記第一のプライマーにおける前記単一の付加塩基配列と前記遺伝子の増幅対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列とは、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。
また、前記第一のプライマーにおける前記単一の付加塩基配列の位置は、いずれの位置であってもよい。好ましくは、前記単一の付加塩基配列は、前記第一のプライマーの5’末端に配置される。前記遺伝子の増幅対象領域にハイブリダイズする塩基配列の5’末端側に前記単一の付加塩基配列を配置することにより、例えば、第一プライマーが測定対象遺伝子を最初に増幅する際に反応を妨げない。
前記第二のプライマーは、前記単一の付加塩基配列又はその相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列を有することができる。第一プライマーの前記単一の付加塩基配列と第二プライマーのハイブリダイズを防止する等の点で、好ましくは、前記第一のプライマーの一部に含まれる前記単一の付加塩基配列の相補的な塩基配列に対してハイブリダイズ可能な塩基配列、即ち、前記第一のプライマーの一部に含まれる前記単一の付加塩基配列に相同な塩基配列を有する。これにより、効率よく且つ効果的に前記単一の付加塩基配列を含む増幅産物を反応液中に蓄積させることができる。
このため、第二のプライマーは、前記単一の付加塩基配列及びその相補的な塩基配列とは異なる付加配列であって、第一のプライマーのTm値よりも高いTm値となるように調整可能な付加配列(以下、調整用付加塩基配列という)を含むことができる。この結果、前記増幅産物に対して、第二のプライマーのTm値を高くすることができる。この目的のための付加配列としては、特に制限されないがGC含量の高い塩基配列等を挙げることができる。
また、前記第二のプライマーには、人工核酸を導入してもよい。このような人工核酸としては、LNA、BNA、PNA等を挙げることができる。
また、前記第二のプライマーのTm値を前記第一のプライマーのTm値よりも高くするためにRNAプライマーを導入してもよい。さらに融解温度を向上させるTmエンハンサーであるMGB(マイナーグルーブバインダー)を付加させてもよい。
また、前記第二のプライマーのTm値を前記第一のプライマーのTm値よりも高く設定する場合には、前記第二のプライマーのTm値が50℃〜85℃であり、前記第一のプライマーのTm値が40℃〜75℃であることが好ましい。また、前記第二のプライマーのTm値が55℃〜80℃であり、前記第一のプライマーのTm値が50℃〜75℃であることがより好ましい。
前記第三のプライマーに関する「ハイブリダイズ可能な塩基配列」には、前記第一のプライマーに関して記述した記載をそのまま適用することができる。
前記単一の付加塩基配列及び前記測定対象遺伝子の増幅対象領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する第一のプライマーと、調整用付加塩基配列を含まない第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
第二のプライマーよりも低いTm値となる第一のプライマーと、第一のプライマーよりも高いTm値となる第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
第二のプライマーよりも高いTm値となる第一のプライマーと、第一のプライマーよりも低いTm値となる第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
第二のプライマーよりも低いTm値となる調整用付加配列を含む第一のプライマーと、ミスマッチ又は縮重塩基を含まない第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
第二のプライマーよりも低いTm値となるミスマッチ又は縮重塩基等の調整用付加塩基配列を含む第一のプライマーと、ミスマッチ又は縮重塩基等の調整用付加塩基配列を含まない第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
第二のプライマーよりも低いTm値となる調整用付加配列及びミスマッチ又は縮重塩基を含む第一のプライマーと、ミスマッチ又は縮重塩基等の調整用付加塩基配列を含まない第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
前記単一の付加塩基配列及び測定対象遺伝子の増幅対象領域の塩基配列の双方に対して置換等を含まない第一のプライマーと、第一のプライマーよりも高いTm値となる調整用付加塩基配列を含む第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;
ミスマッチ又は縮重塩基等の調整用付加塩基配列を含む第一のプライマーと、第一のプライマーよりも高いTm値となるミスマッチ又は縮重塩基等の調整用付加塩基配列を含む第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ;並びに、
ミスマッチ又は縮重塩基を含む第一のプライマーと、第一のプライマーよりも高いTm値となるミスマッチ又は縮重塩基及び調整用付加塩基配列を含む第二のプライマーと、第三のプライマーとの組み合わせ。
例えば、第二のプライマーによる反応に移行させ易くする等の点で、好ましくは、第三のプライマーの量を、第一のプライマーの存在量に対して物質量基準で1倍〜4倍程度にすることができ、より好ましくは1倍〜2倍とすることができる。
さらに、前記第三のプライマーの量を前記第一のプライマーの量よりも少なくした場合には、例えば、第三のプライマーが反応液中に少ないため、前記第一のプライマーと第二のプライマーとが第三のプライマーを奪い合うように反応が起こる。このことから、参照遺伝子と標的遺伝子の反応プラトーに達し易い試薬を用意できる等の利点を得ることができる。この場合、第三のプライマーの量を、第一のプライマーの存在量よりも物質量基準で0.25倍〜1倍程度の量とすることができ、より好ましくは0.5倍〜1倍とすることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Taqポリメラーゼを用いる場合、好ましくは、反応液量50μlに対して0.01U〜100Uの濃度とすることができる。
温度条件は、核酸増幅の反応過程において複数の条件を設定してもよい。例えば、PCR反応を50サイクル実施する核酸増幅反応において、前半の10サイクルを55℃で実施し、後半の40サイクルを65℃で実施するといった反応条件を調整しても良い。
前記検出用プローブとしては、目的とする増幅産物を検出することができれば特に制限はない。また検出用プローブの長さとしては、特に制限はないが、5mer〜50merであることが好ましく、10mer〜30merであることがより好ましい。プローブの長さがこの範囲内であれば、例えば検出感度を高めることができる。
また、前記検出用プローブを核酸増幅工程でプライマーと共に存在させて使用する場合には、DNAポリメラーゼの反応対象となってプローブ自体の伸長を予防するために、3’末端側に後述する蛍光標識が付加されているか、プローブの3’末端に更にリン酸基が付加されていることが好ましい。
標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素及び蛍光団が挙げられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少(例えば、消光)するプローブが好ましい。
このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のCが、前記検出目的配列におけるGに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる(蛍光強度が減少する)という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。また、前記標識物質は、例えば、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。
前記核酸に対する前記検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
少なくとも2種の増幅産物の存在量は、少なくとも2種の遺伝子の存在量を反映しているため、核酸増幅工程で得られた増幅産物の存在量に基づくシグナルを測定することにより、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量を測定できる。
シグナルの検出は、反応液中に蓄積した増幅産物の存在量を測定する方法であればよく、シグナルの種類については特に制限はない。
前記シグナル検出工程としては、好ましくは、目的とする増幅産物を検出可能な検出用プローブを用いた検出方法を用いることができる。
前記シグナル対比工程では、前記シグナル検出工程で得られた各遺伝子に対応する各検出シグナルを対比することによって、各遺伝子の存在量を測定することを含む。前記検出シグナルの対比及び、対比結果からの各遺伝子の存在量の測定の方法については、特に限定されない。
この場合には、反応液中の複数の測定対象遺伝子の増幅産物量を、PCRサイクル数の経過と共に逐次測定し、得られた測定結果から、測定対象遺伝子の存在量を測定することができる。PCRサイクル数に伴う増幅産物の量は、一般に、指数関数的に増幅するが、一般的な検出方法では検出不能な初期サイクル期、指数関数的に増加して検出可能な増幅期、反応速度が低下するプラトー期に分けられる。前記核酸増幅工程では、前記検出対象遺伝子の種類に応じた複数の増幅産物は、いずれも第二のプライマーによって増幅産物されているため、プラトー期に到達しても、前記測定対象遺伝子の存在量に応じた量比で反応液中に蓄積する。このため、前記増幅産物の種類を識別する種類識別手段を適用することにより、反応液中に蓄積した前記測定対象遺伝子に由来する増幅産物を識別し、それぞれの量比を測定することによって、それぞれの測定対象遺伝子の存在量を測定することができる。
また、前記測定対象遺伝子が参照遺伝子と標的遺伝子とを含む場合には、参照遺伝子の存在量に対する比率から、標的遺伝子の存在量を測定してもよい。前記測定対象遺伝子が融合遺伝子における5’側の遺伝子領域と3’側の遺伝子領域とである場合には、5’側の遺伝子領域の存在量に対する比率から、3’側の遺伝子領域の存在量を測定してもよいし、3’側の遺伝子領域の存在量に対する比率から、5’側の遺伝子領域の存在量を測定してもよい。
(I)前記検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸(増幅産物)を接触させて、ハイブリッド形成体を得ること(ハイブリダイゼーション工程)。
(II)前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく検出シグナルの変動を測定すること(測定工程)。
(III)前記検出シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるTm値を検出すること(Tm値検出工程)。
(IV)前記Tm値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、目的とする増幅産物の存在又は存在比を検出すること(存在比検出工程)。
前記増幅産物の解離(解離工程)における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、85℃〜95℃である。加熱時間も特に制限されない。通常、1秒〜10分であり、好ましくは1秒〜5分である。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜85℃であり、好ましくは25℃〜70℃であり、終了温度は、例えば、40℃〜105℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、0.1℃/秒〜20℃/秒であり、好ましくは0.3℃/秒〜5℃/秒である。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい(または消光)が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
前記シグナル検出工程において得られた前記増幅産物の検出シグナルには、測定対象となる複数の遺伝子に由来する複数の増幅産物のシグナルが混在している。これらのシグナルは、それぞれ増幅産物の存在量を反映しているので、それぞれの検出シグナルを比較対比することによって、測定対象遺伝子の存在量、即ち、対象サンプル中の核酸における存在量を測定することができる。特に、測定対象となる遺伝子が、予め遺伝子の存在量が判明している前記参照遺伝子と前記標的遺伝子と含む場合、参照遺伝子の検出シグナルを基準とすることにより、簡便に、前記標的遺伝子の存在量を測定することができる。
また、測定対象となる遺伝子が、融合遺伝子における5’側の遺伝子領域と3’側の遺伝子領域とである場合、5’側の遺伝子領域の検出シグナルと、3’側の遺伝子領域の検出シグナルとを比較することにより、簡便に、サンプル中における融合遺伝子の存在を検出することができる。
検出シグナルに基づいて遺伝子の存在量を測定する方法としては、特に制限はなく、この目的のために使用可能な解析方法であれば、いずれも適用することができる。
このようなTm解析方法としては、WO2009/081965、及びWO2010/001969等に記載されたものを好ましく挙げることができる。
Tm解析方法の好ましい一例として、測定対象遺伝子を参照遺伝子及び標的遺伝子とし、Tm解析の結果を面積解析して、それぞれの遺伝子の対象サンプル中の核酸における存在量を決定する方法を以下に述べる。
なお、温度範囲ΔTR及び温度範囲ΔTTは、同一の幅(例えば、10℃)または異なる幅(例えば、温度範囲ΔTRが10℃、温度範囲ΔTTが7℃)となるように設定してもよい。また、温度範囲ΔTR及び温度範囲ΔTTは、それぞれの融解温度TmからプラスX℃、マイナスX℃の幅(X℃は例えば15℃以内、望ましくは10℃以内)というように設定してもよい。
+・・・+{f(Te−1)−B(Te−1)} ・・・(1)
ただし、Tsは各温度範囲における下限値、Teは上限値である。また、各温度Tにおけるベース値B(T)は、下記(2)式により求まる値であり、検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を検出信号の微分値から減算することにより、検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
ただし、a={f(Te)−f(Ts)}/(Te−Ts) である。
ここで参照遺伝子の存在量は予め判明しているので、参照遺伝子の面積と標的遺伝子の面積との対比を行うことにより、標的遺伝子の存在量を決定することができる。
本発明にかかる遺伝子測定キットは、前述した遺伝子測定方法のためのキットであって、前述した第一のプライマーを含む前記第一のプライマーセットと、前記第二のプライマーを含む。
本測定キットによれば、存在量の異なる測定対象遺伝子の存在量を簡便に測定することができる。
また、前記測定キットには、前記第一のプライマー及び第二のプライマーに加えて、前述した第三のプライマーを含んでもよい。
本遺伝子測定キットにおける前記第一のプライマー、前記第二のプライマー及び前記第三のプライマーについては、前述した事項がそのまま適用される。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
本発明にかかる遺伝子測定装置は、前述した遺伝子の存在量の測定方法を適用可能な装置であって、前記第一のプライマーにより導入された前記単一の付加塩基配列を含み且つ第二のプライマーによって核酸増幅された前記少なくとも2つの遺伝子に対応する増幅産物の存在量に基づく少なくとも2つのシグナルを検出する検出部と、前記検出部により検出された前記少なくとも2つの検出シグナルを対比して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を演算する演算部と、を含む遺伝子測定装置である。
本遺伝子測定装置であれば、前述した本発明にかかる遺伝子の存在量の測定方法を、より簡便に実施できる。
前記演算部は、検出部によって得られた各検出シグナルに基づいて、反応液中の測定対象遺伝子の存在量を演算する。
演算には、例えば、融解曲線の検出信号を温度に関して微分して、温度と検出信号の微分値との関係を表す微分融解曲線を演算すること、微分融解曲線に対して、予め検量線を作成したときに設定した温度範囲を設定すること、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積であって、測定対象遺伝子に対応する面積をそれぞれ求めること、得られた面積の比を演算すること、予め作成された検量線に基づいて、面積比に対応する測定対象遺伝子の存在比を演算すること、が含まれる。
本発明にかかる遺伝子測定システムは、前述した遺伝子の存在量の測定方法を適用可能な装置であって、前記第一のプライマーにより導入された前記単一の付加塩基配列を含み且つ第二のプライマーによって核酸増幅された前記少なくとも2つの遺伝子に対応する増幅産物の存在量に基づく少なくとも2つのシグナルを検出する検出装置と、前記検出装置により検出された前記少なくとも2つの検出シグナルを対比して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を演算する演算装置と、を含む遺伝子測定システムである。
本遺伝子測定装置であれば、前述した本発明にかかる遺伝子の存在量の測定方法を、より簡便に実施できる。
また、前記測定装置と同様に、前記測定装置及び演算装置については、例えば、WO2009/081965、及びWO2010/001969等に記載された装置をそのまま適用してもよい。
本発明に遺伝子診断方法は、上述した遺伝子測定方法を用いて行う診断方法である。
本方法によれば、対象サンプル中の核酸における存在量が異なる少なくとも2つの遺伝子の存在量に基づいて、このような存在量に関連する疾患、薬剤代謝能、薬剤感受性などの診断を行うことができる。
好ましくは、測定対象遺伝子の存在量がコピー数であり、対象サンプル中の核酸におけるコピー数が増減することを指標の一つとするコピー数多型の診断に本発明を適用する。コピー数多型を指標の一つとする疾患としては、染色体1q21.1のコピー数多型による神経芽細胞腫等が挙げられる。本発明によれば、これらの疾患、薬剤代謝能、薬剤感受性に関わる遺伝子の存在量の検出を精度よく診断することができる。
CYP2D6遺伝子を標的遺伝子として、ヒトCYP2D6遺伝子の特定領域配列(配列番号1)の存在量の測定を行った。参照遺伝子としてヒトsod2遺伝子の特定領域配列(配列番号2)を用いた。なお、CYP2D6遺伝子のゲノム塩基配列は、GenBank NG008376として、sod2遺伝子のゲノム塩基配列はGenBank NG008729として、それぞれ入手可能である。
配列番号1又は配列番号2の核酸配列をpUC57に挿入した人工核酸(プラスミド)を調製し、CYP2D6のコピー数を変化させるために、表1に従って各種のプラスミド溶液による試料a〜dを準備した。これらのプラスミド溶液を用いて、所定のコピー数で標的遺伝子及び参照遺伝子を含む各種試料(各種の鋳型)を調製した。
PCRは、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び63℃で15秒を1サイクルとして、60サイクル繰り返した。
またTm解析は、PCRの後、95℃で1秒、40℃で60秒処理し、続けて温度の上昇速度1℃/3秒で、40℃から80℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。励起波長を520nm〜555nmとし、測定波長を585〜700nmとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。標的遺伝子(CYP2D6)の場合には58℃付近、参照遺伝子(sod2)の場合には、70℃付近にそれぞれピークが認められることがわかっている。
CYP2D6の核酸を、単一の付加塩基配列とCYP2D6に特徴的な塩基配列に相補的な塩基配列とで構成された第一のプライマー(配列番号3、Tm値70.4℃)と、CYP2D6に特徴的な塩基配列に相補的な塩基配列で構成された第三のプライマー(配列番号4、Tm値55.7℃)を用いて増幅した。sod2の核酸を、前記単一の付加塩基配列と、sod2に特徴的な塩基配列に相補的な塩基配列とで構成されていた第一のプライマー(配列番号6、Tm値69.7℃)と、sod2に特徴的な塩基配列に相補的な塩基配列で構成された第三のプライマー(配列番号5、Tm値57.3℃)を用いて増幅した。それぞれの増幅産物を、前記単一の付加塩基配列のみで構成された第二のプライマー(配列番号7、Tm値59.6℃)と、それぞれの第三のプライマーを用いて増幅した。CYP2D6の検出用プローブ(配列番号8)及びsod2の検出用プローブ(配列番号9)は、表2に記載のとおりである。各プライマーのTm値は、Meltcalcを用いて算出した値である。
なお、表2中、小文字で表記した塩基配列は、前記単一の付加塩基配列を示す。
比較例1では、下記表4に示すようにCYP2D6及びsod2の双方において前記単一の付加塩基配列を含まないプライマー(2D6−Int6r−F1:配列番号10、sod2−R1:配列番号11)を含むプライマーセットを使用し、且つ第二のプライマーを使用しなかった表5の処方とした以外は、実施例1と同様にPCR及びTm解析を行った。
比較例2では、下記表4に示すようにCYP2D6及びsod2の双方において前記単一の付加塩基配列を含まないプライマー(2D6−Int6r−F1:配列番号10、sod2−R1:配列番号11)を含むプライマーセットを使用した表6の処方とした以外は、実施例1と同様にPCR及びTm解析を行った。
比較例3では、第二のプライマー(PEN3 F4:配列番号7、表2参照)を使用しない表7の処方とした以外は、実施例1と同様にPCR及びTm解析を行った。
比較例1〜3で使用した各プライマーの配列及びTm解析の結果を表8及び図2B〜図2Dに示す。
実施例1及び比較例1をそれぞれ3回ずつ繰り返しても、同様の傾向が認められた(データ示さず)。
実施例2では、第二のプライマーを、前記調整用付加塩基配列を有するPEN3 F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg:配列番号12、41mer、Tm値69.4℃)に変更して表9に示される処方に従った各試薬を使用し、PCRを、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び60℃で15秒を1サイクルとして、50サイクル繰り返した以外は、実施例1と同様にしてTm解析を行った。結果を表11及び図3に示す。
実施例3では、CYP2D6用の第一のプライマーを、5’末端側の前記単一の付加塩基配列を4塩基削除すると共にCYP2D6の増幅対象領域に相当する塩基配列に縮重を含む2D6−P3F4−Int6r−F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA、B=c,g,又はt:配列番号13、41mer、Tm値67.6〜69.2℃)に変更し、sod2用の第一のプライマーを、5’末端側の前記単一の付加塩基配列を4塩基削除すると共にsod2の増幅対象領域に相当する塩基配列に縮重を含むP3F4−sod2−R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC、D=a、g又はt:配列番号14、44mer、Tm値66〜67.3℃)に変更し、表10に示される処方に従った各試薬を使用し、PCRを、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び57℃で15秒を1サイクルとして5サイクル繰り返した後、95℃で1秒及び63℃で45秒を1サイクルとして45サイクル繰り返した以外は、実施例1と同様にしてPCR及びTm解析を行った。各プライマーのTm値は、Meltcalcを用いて算出した値である。結果を表11及び図4に示す。
実施例4では、第一のプライマーを、調整用付加配列及び縮重塩基を含む2D6−P3F4−Int6−F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA:配列番号13、41mer、Tm値67.6℃〜69.2℃)と、P3F4−sod2−R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC:配列番号14、44mer、Tm値66℃〜67.3℃)にそれぞれ変更し、第二のプライマーを、調整用付加塩基配列を含むPEN3 F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg:配列番号12、41mer、Tm値69.4℃)に変更して、表12に示される処方に従った各試薬を使用し、PCRを、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び57℃で15秒を1サイクルとして5サイクル繰り返し、その後、95℃で1秒及び63℃で45秒を1サイクルとして45サイクル繰り返した以外は、実施例1と同様にしてPCR及びTm解析を行った。
実施例5では、各プライマーの量を表13に示されるように変更した以外は、実施例4と同様にして、PCR及びTm解析を行った。
結果をそれぞれ表14、図5及び図6に示す。
実施例4は、第一のプライマーよりもTm値の高い第二のプライマーを使用すると共に、第三のプライマーよりも少ない量の第一のプライマーを使用したものである。実施例5は、実施例4と同一の組み合わせのプライマーを使用し、第三のプライマーよりも多い量の第一のプライマーを使用したものである。いずれの場合でも、表14、図5及び図6に示されるように、標的遺伝子のコピー数の増加を適切に反映した結果を得ることができる。
比較例6、実施例7〜8では、CYP2D6のプローブを3T−2D6−Int6−R2(gtacccttcctccc−(TAMRA):配列番号15)に変更し、表15に示されるように第二のプライマー(PEN3 F4)の量をそれぞれ100nM(比較例6)、400nM(実施例7)又は1200nM(実施例8)に変更した処方に従った各試薬を使用した以外は、実施例1と同様にしてPCR及びTm解析を行った。
結果をそれぞれ表16及び図7に示す。なお、図7では、比較例6、実施例7〜8それぞれの各試料における面積比を、標的遺伝子(CYP2D6)の量が250コピー/μLのときの面積比を100%としたときの割合で示す。
また、第二のプライマーの量を、反応液中の他のプライマーの量よりも多くすると面積比の増加率が大きくなり、少なくすると面積比の増加率が小さくなることが分かった。
いずれの場合でも、表16及び図7に示されるように、標的遺伝子のコピー数の増加を適切に反映した結果を得ることができる。
ALK遺伝子の5’側の遺伝子領域として、NCBIのアクセッションNo.NM_004304.4の2460〜2801番目の塩基配列(配列番号24)と、3’側の遺伝子領域として、4690〜5031番目の塩基配列(配列番号25)とを、pcDNA3.1(+)に挿入した人工核酸(プラスミド)よりRNAを合成し、表17に記載のコピー数を含む鋳型を調製した。
55℃で15分処理し、逆転写反応を行った。
PCRは、逆転写反応後の試料を、95℃で60秒処理した後、95℃で1秒及び58℃で15秒を1サイクルとして、50サイクル繰り返した。
またTm解析は、PCRの後、95℃で1秒、40℃で60秒処理し、続けて温度の上昇速度1℃/3秒で、40℃から75℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
励起波長を520nm〜555nmとし、測定波長を585〜700nmとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
5’側の遺伝子領域由来の増幅産物は51℃付近、3’側の遺伝子領域由来の増幅産物は58℃付近にそれぞれピークが認められることがわかっている。
5’側の遺伝子領域は、5’側の遺伝子領域に対する第一のプライマー;P3R2−ALK5’−R5(配列番号19、Tm値70.5℃)と、第三のプライマー;ALK5’−F2(配列番号18、Tm値59.9℃)を用いて増幅した。3’側の遺伝子領域は、3’側の遺伝子領域に対する第一のプライマー;P3R2−ALK3’−R3(配列番号21、Tm値70.1℃)と、第三のプライマー;ALK3’−F3(配列番号20、Tm値60.8℃)を用いて増幅した。それぞれの増幅産物を、前記単一の付加塩基配列のみで構成された共通プライマーである第二のプライマー;PEN3 R2(配列番号22、Tm値58.6℃)と、それぞれの第三のプライマーを用いて増幅した。
5’側の遺伝子領域に対する検出用プローブ(配列番号16)及び3’側の遺伝子領域に対する検出用プローブ(配列番号17)は、表18に記載のとおりである。
各プライマーのTm値は、Meltcalcを用いて算出した値である。
なお、表18中、小文字で表記した塩基配列は、単一の付加塩基配列を示す。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (16)
- 一の反応液に、対象サンプル中の核酸における遺伝子の存在量が相違し得る少なくとも2つの遺伝子をコードする核酸を、単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーとを含み、前記第二のプライマーの存在量が、前記第一のプライマーセットを構成する第一プライマーのうち存在量の最も多い第一プライマーの存在量に比べて4倍量〜20倍量(モル比)である前記反応液を用いて、核酸増幅を行い、前記単一の付加塩基配列を含み且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の増幅産物を得ること(核酸増幅工程)、
前記少なくとも2種の増幅産物の存在量に基づくそれぞれのシグナルを検出し、該シグナルから前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を測定すること(存在量測定工程)、
を含む遺伝子の存在量の測定方法:
前記核酸における遺伝子の存在量は、ゲノムDNAにおける遺伝子のコピー数であり、
前記核酸増幅工程における前記反応液は、前記少なくとも2種の増幅産物をそれぞれ認識する、同一の蛍光色素で標識された少なくとも2種の検出用プローブを更に含み、
前記存在量測定工程における前記シグナルは、前記少なくとも2種の増幅産物と、それぞれに対応する前記少なくとも2種の検出用プローブとが解離する際の、少なくとも2つの蛍光強度の変動であり、
前記存在量測定工程は、前記少なくとも2つの蛍光強度の変動を同一の波長で測定し、Tm解析を行い、更に面積解析して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を決定する。 - 前記第一のプライマーが、前記単一の付加塩基配列と、それぞれの前記遺伝子をコードする核酸の増幅対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列と、を有する請求項1に記載の測定方法。
- 前記第二のプライマーが、前記単一の付加塩基配列又はその相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する請求項1又は請求項2に記載の測定方法。
- 前記単一の付加塩基配列が、前記少なくとも2つの遺伝子をコードする核酸の各増幅対象領域中の塩基配列とは非相同的な塩基配列からなる請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記第一のプライマーセットが、前記第一のプライマーと、該第一のプライマーがハイブリダイズする塩基配列の相補鎖側の塩基配列を増幅するために用いられ且つ前記単一の付加塩基配列を含まない第三のプライマーとを含む請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記反応液における前記第三のプライマーの存在量が、前記反応液における前記第一のプライマーの存在量に比べて、物質量基準で0.25倍量〜4倍量である請求項5に記載の測定方法。
- 前記第一のプライマーが、増幅対象領域の塩基配列に対してミスマッチ塩基及び縮重塩基からなる群より選択された少なくとも一方を含む請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記第二のプライマーのTm値が、前記第一のプライマーの各Tm値よりも高い請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記第二のプライマーが、前記単一の付加塩基配列及びその相補的な塩基配列とは異なる付加配列を更に含む請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記少なくとも2つの遺伝子の少なくとも1つは、対象サンプル中の核酸における存在量が予め判明している参照遺伝子であり、少なくとも1つは対象サンプル中の核酸における存在量の測定対象となる標的遺伝子である請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記参照遺伝子由来の増幅産物の検出シグナルと、前記標的遺伝子由来の増幅産物の検出シグナルとを比較して、前記標的遺伝子の対象サンプル中の核酸における存在量を決定することを含む請求項10に記載の測定方法。
- 前記少なくとも2つの遺伝子の少なくとも1つは、融合遺伝子の融合点よりも上流の5’側の遺伝子領域であり、少なくとも1つは、融合遺伝子の融合点よりも下流の3’側の遺伝子領域である請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記5’側の遺伝子領域由来の増幅産物の検出シグナルと、前記3’側の遺伝子領域由来の増幅産物の検出シグナルとを比較して、サンプル中における前記融合遺伝子の存在を検出することを含む請求項12に記載の測定方法。
- 単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、
前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーと、
前記少なくとも2つの遺伝子の核酸増幅領域にそれぞれハイブリダイズ可能な塩基配列を有し且つ同一の蛍光色素の標識を備えた少なくとも2つの検出用プローブと、
を含む請求項1〜請求項4及び請求項7〜請求項13のいずれか1項に記載の測定方法のための遺伝子測定キット。 - 単一の付加塩基配列を増幅産物に導入可能であり且つ前記少なくとも2つの遺伝子のそれぞれに対応した少なくとも2種の第一のプライマーを含む第一のプライマーセットと、
前記単一の付加塩基配列を含む核酸を増幅するための第二のプライマーと、
前記第一のプライマーがハイブリダイズする塩基配列の相補鎖側の塩基配列を増幅するために用いられ且つ前記単一の付加塩基配列を含まない第三のプライマーと、
前記少なくとも2つの遺伝子の核酸増幅領域にそれぞれハイブリダイズ可能な塩基配列を有し且つ同一の蛍光色素の標識を備えた少なくとも2つの検出用プローブと、
を含む請求項5〜請求項13のいずれか1項に記載の測定方法のための遺伝子測定キット。 - 前記第一のプライマーにより導入された前記単一の付加塩基配列を含み且つ第二のプライマーによって核酸増幅された前記少なくとも2つの遺伝子に対応する増幅産物の存在量に基づく少なくとも2つのシグナルを検出する検出装置と、
前記検出装置により検出された前記少なくとも2つの検出シグナルを対比して、前記少なくとも2つの遺伝子の存在量を演算する演算装置と、
を含む請求項1〜請求項13のいずれか1項に記載の遺伝子の存在量の測定方法を実施する遺伝子測定システム。
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