KR101483576B1 - 유전자 존재량의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

하나의 반응액에 있어서, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 사용해서, 핵산 증폭을 행하여, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 것, 상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 것을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.

Description

유전자 존재량의 측정 방법{METHOD FOR MEASURING ABUNDANCE OF GENES}

본 발명은, 유전자 존재량의 측정 방법에 관한 것이다.

유전자 중에는, 1게놈 중에 복수 존재하는 것이 있다. 이러한 유전자의 게놈에 있어서의 존재량이, 유전자 진단에 이용되는 것이나 약제의 효과에 영향을 미치는 것이 있으며, 대상 샘플 중의 핵산(예를 들면, 게놈 등)에 있어서의 유전자의 존재량을 파악 또는 측정하는 것이 요구되는 경우가 있다. 이러한 검출의 일례로서는, 유전자의 카피수의 측정이나 유전자량의 증감의 측정, 또한 카피수 다형(多型)(CNV)의 진단 등을 들 수 있다.

유전자의 존재량을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, FISH법(예를 들면, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 5321-5325, June 1992 참조)이나, 경합적인 DNA의 결합을 이용한 CGH법(예를 들면, 일본국 특표평7-505053호 공보 참조) 등의 형광 표지법을 이용한 방법이 있다. 이들 방법에서는, 염색체에 대하여 직접 형광 표지 화합물을 반응시킨 후, 화상 처리나 형광 현미경에 의한 관찰에 의하여, 유전자의 존재량을 확인할 수 있다. 그러나, 동일한 유전자가, 염색체상의 비교적 근접한 위치에 2개소 이상 존재하는 경우 등에 정확히 식별할 수 없는 것이나, 많은 시약의 사용이나 조작이 번잡하다는 결점을 갖고 있다.

이러한 관점에서, 유전자의 존재량을 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 기술을 이용하여 측정하는 리얼타임 PCR(예를 들면, Clinical Chemistry pp. 1546-1554(2009), 국제공개 제2011/043220호 팸플릿 등)이나 디지털 PCR(예를 들면, 일본국 특개2010-538614호 공보 참조) 등을 사용하여, 유전자의 존재량을 효율 좋게 또한 정도(精度) 좋게 측정하는 기술이 개발되어 있다.

특히, 일본국 특개2010-538614호 공보에 개시되어 있는 기술에서는, 대상 게놈에 있어서의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대적 카피수를 결정하는 방법으로서, 대상 게놈 DNA를 포함하는 시료에 있어서, 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 핵산 증폭하고, 디지털 PCR에 의해서 증폭된 각 유전자의 서열을 어세이하여, 표적 유전자 서열을 포함하는 증폭 폴리뉴클레오티드 분자의 수와, 참조 유전자 서열을 포함하는 증폭 폴리뉴클레오티드 분자의 수와의 비(比)로부터, 카피수의 변동을 결정하고 있다.

한편, 1시료 중에 다른 유전자가 복수 존재할 경우에, 목적으로 하는 일부의 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 일본국 특표 2011-516069호 공보에는, 2단계의 핵산 증폭 공정과, 그 사이에서, 목적으로 되는 핵산 앰플리콘을 레스큐(rescue)하는 공정을 포함하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 최초의 핵산 증폭 공정에 있어서, 표적 특이적 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭하고, 그에 따라, 적어도 1개의 공통 프라이머 결합 부위를 포함하는 적어도 1개의 핵산 앰플리콘을 생성하고, 얻어진 핵산 앰플리콘을, 사용한 표적 특이적 프라이머로부터 분리(레스큐)하고나서, 공통 프라이머를 사용하여 증폭하고 있다.

또한 일반적으로 PCR 기술에서는, 서로 방향이 다른 한 쌍의 프라이머쌍을 사용하여, 2본쇄 핵산을 각각 핵산 증폭해서, 대상 유전자 서열의 증폭 산물(앰플리콘(amplicon)이라 하는 경우가 있음)을 생성하고 있다. 이 때문에, 2본쇄의 앰플리콘은, 프라이머쌍을 사용한 핵산 증폭의 과정에서 지수함수적으로 1반응계에 축적하고, 그 후, 생성된 상보적 앰플리콘쇄의 축적량의 증가에 따라, 증폭 반응의 속도가 저하하여, 결국 정지하는(플래토우(plateau)기) 것이 알려져 있다. 이 플래토우기에 도달하면 이미 핵산 증폭은 생기지 않기 때문에, 앰플리콘량이 증가하지 않는다. 이러한 플래토우기에 도달하지 않고 앰플리콘의 축적량을 계속적으로 증가시키기 위하여, 사용량에 일정한 차(差)를 마련한 한 쌍의 프라이머를 이용한 「지수(指數) 후의 선형(線形) PCR(LATE-PCR)」이 알려져 있다(예를 들면, 일본국 특표 2005-512577호 공보 참조).

또한, 융합 유전자를 검출하는 경우에 있어서는, 각 변이체에 대하여 특이적인 프라이머를 설정하는 멀티플렉스 PCR을 사용하는 경우가 많다(예를 들면, 일본국 특개2012-100628호 공보 참조). 멀티플렉스 PCR에 있어서는, 프라이머를 많이 준비하여 각각의 프라이머가 2량체를 제작할 가능성에 입각하여 최적화를 행할 필요가 있다. 이 최적화의 프로세스를 거쳐서 프라이머를 재제작하고, 실험을 통하여 측정 가능한지의 여부를 검토해 갈 필요가 있다. 또한, 프라이머수가 늘어남에 따라, 이 최적화의 프로세스의 난이도가 향상하여, 이 최적인 프라이머 세트를 발견해내기까지 다대한 시간과 노력과 코스트를 요한다.

그러나, 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열을 사용하여 핵산 증폭을 행하고, 증폭 산물의 양비(量比)로부터 카피수를 결정하는 경우에도, 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열을 각각 증폭하기 위하여, 다른 프라이머가 사용된다. 이렇게 다른 프라이머를 사용한 경우에는, 증폭 효율이 다른 경우가 많다. 또한, PCR 기술에 의하여 핵산 증폭을 행한 경우에는, 상술한 바와 같이 플래토우기가 존재하기 때문에, PCR 사이클수가 많아지면, 본래의 존재량과는 무관계로 증폭 산물량이 일정량으로 된다. 이 때문에, PCR 기술을 사용하여 게놈 중의 유전자의 존재량을 측정하려고 해도, 본래의 유전자 존재량을 정확히 반영하지 못하는 경우가 있다. 또한, 멀티플렉스 PCR을 사용하는 경우, 프라이머를 많이 준비할 필요가 있기 때문에, 최적화의 프로세스에 있어서, 비용면, 노력면 및/또는 시간면 등에서의 과제가 생긴다.

따라서, 본 발명은, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량을 종래의 기술보다도 정확히 또한 간편히 측정하는 유전자 존재량의 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 하나의 반응액에 있어서, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 사용해서, 핵산 증폭을 행하여, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 것, 상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 각각의 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 것을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.

[2] 상기 제1 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열과, 각각의 상기 유전자를 코딩하는 핵산의 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 [1]에 기재된 측정 방법.

[3] 상기 제2 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열 또는 그 상보적인 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 [1] 또는 [2]에 기재된 측정 방법.

[4] 상기 단일의 부가 염기 서열이, 상기 적어도 2개의 유전자의 각 증폭 대상 영역 중의 염기 서열과는 비상동적(非相同的)인 염기 서열로 이루어지는 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[5] 상기 제1 프라이머 세트가, 상기 제1 프라이머와, 당해 제1 프라이머가 하이브리다이즈하는 염기 서열의 상보쇄측의 염기 서열을 증폭하기 위하여 사용되며 또한 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제3 프라이머를 포함하는 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[6] 상기 반응액에 있어서의 상기 제3 프라이머의 존재량이, 상기 반응액에 있어서의 상기 제1 프라이머의 존재량에 비하여, 0.25배량∼4배량(몰비)인 [5]에 기재된 측정 방법.

[7] 상기 반응액에 있어서의 상기 제2 프라이머의 존재량이, 상기 제1 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머 각각의 상기 반응액에 있어서의 존재량에 비하여, 물질량 기준으로 1배량∼400배량인 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[8] 상기 반응액이, 상기 적어도 2종의 증폭 산물을 각각 인식하는 적어도 2종의 검출용 프로브를 더 포함하는 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[9] 상기 제1 프라이머가, 증폭 대상 영역의 염기 서열에 대하여 미스매치 염기 및 축중(縮重) 염기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한쪽을 포함하는 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[10] 상기 제2 프라이머의 Tm값이, 상기 제1 프라이머의 각 Tm값보다도 높은 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[11] 상기 제2 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열 및 그 상보적인 염기 서열과는 다른 부가 서열을 더 포함하는 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[12] 상기 적어도 2개의 유전자의 적어도 1개는, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량이 미리 판명되어 있는 참조 유전자이며, 적어도 1개는 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량의 측정 대상으로 되는 표적 유전자인 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[13] 상기 참조 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 상기 표적 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 상기 표적 유전자의 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량을 결정하는 것을 포함하는 [12]에 기재된 측정 방법.

[14] 상기 적어도 2개의 유전자의 적어도 1개는, 융합 유전자의 융합점보다도 상류의 5'측의 유전자 영역이며, 적어도 1개는, 융합 유전자의 융합점보다도 하류의 3'측의 유전자 영역인 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[15] 상기 5'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 상기 3'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 샘플 중에 있어서의 상기 융합 유전자의 존재를 검출하는 것을 포함하는 [14]에 기재된 측정 방법.

[16] 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량이, 당해 유전자의 각각에 대응하는 적어도 2개의 검출 시그널의 Tm 해석에 의해 측정되는 [1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[17] 상기 적어도 2종의 유전자의 존재량을 측정하기 위하여 사용되는 상기 시그널을, 동일한 파장으로부터 취득되는 흡광도 또는 형광값에 의해 얻는 [1]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[18] Tm 해석의 결과를 면적 해석하여 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량을 결정하는 [16] 또는 [17]에 기재된 측정 방법.

[19] 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 포함하는 [1]∼[4] 및 [7]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법을 위한 유전자 측정 키트.

[20] 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머와, 상기 제1 프라이머가 하이브리다이즈하는 염기 서열의 상보쇄측의 염기 서열을 증폭하기 위하여 사용되며 또한 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제3 프라이머를 포함하는 [5]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 유전자 측정 키트.

[21] 상기 적어도 2개의 유전자의 핵산 증폭 영역에 각각 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 가지며 또한 표지를 구비한 적어도 2개의 검출용 프로브를 더 포함하는 [19] 또는 [20]에 기재된 유전자 측정 키트.

[22] 상기 표지가 형광 표지인 [21]에 기재된 유전자 측정 키트.

[23] 상기 제1 프라이머에 의해 도입된 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 제2 프라이머에 의하여 핵산 증폭된 상기 적어도 2개의 유전자에 대응하는 증폭 산물의 존재량에 의거한 적어도 2개의 시그널을 검출하는 검출부와, 상기 검출부에 의해 검출된 상기 적어도 2개의 검출 시그널을 대비(對比)하여, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 연산하는 연산부를 포함하고, [1]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 유전자의 존재량의 측정 방법을 적용 가능한 유전자 측정 장치.

[24] 상기 제1 프라이머에 의해 도입된 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 제2 프라이머에 의하여 핵산 증폭된 상기 적어도 2개의 유전자에 대응하는 증폭 산물의 존재량에 의거한 적어도 2개의 시그널을 검출하는 검출 장치와, 상기 검출부에 의해 검출된 상기 적어도 2개의 검출 시그널을 대비하여, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 연산하는 연산 장치를 포함하는 [1]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 유전자의 존재량의 측정 방법을 실시하는 유전자 측정 시스템.

[25] [1]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법을 사용하여 행하는 유전자 진단 방법.

본 발명에 따르면, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량을 종래의 기술보다도 정확히 또한 간편히 측정하는 유전자 존재량의 측정 방법을 제공할 수 있다.

도 1의 (A)는, 핵산 혼합물의 융해 곡선의 일례이며, (B)는 미분 융해 곡선의 일례.
도 2a는 본 발명의 실시예 1에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 2b는 본 발명의 비교예 1에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 2c는 본 발명의 비교예 2에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 2d는 본 발명의 비교예 3에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명의 실시예 4에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 6은 본 발명의 실시예 5에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 본 발명의 실시예 6∼실시예 8에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 8은 본 발명의 실시예 9에 따른 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.

본 발명의 유전자의 존재량의 측정 방법은, 하나의 반응액에 있어서, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 사용하여, 핵산 증폭을 행하고, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 것, 상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 각각의 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 것을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법이다.

또, 본 명세서에 있어서 「유전자」에는, 유전자의 일부의 영역을 나타내는 「유전자 영역」도 포함된다. 또한, 「유전자」는 염기 서열에 의해 코딩되어 있는 것이면 되며, 특정의 기능을 발현하는 것뿐만 아니라, 특정의 기능을 발현하지 않는 것도 포함된다.

본 측정 방법에서는, 소정의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 제2 프라이머를 하나의 반응액 중에 존재시켜서 상기 적어도 2개의 유전자(이하, 「측정 대상 유전자」라 함)의 각각의 핵산에 대한 핵산 증폭을 행하므로, 소정의 제1 프라이머를 사용한 핵산 증폭에 의하여, 개개의 측정 대상 유전자에 대응한 복수종의 증폭 산물에는, 단일의 부가 염기 서열이 도입된다. 이 때문에, 반응액 중에 측정 대상 유전자가 복수종 존재해 있어도, 대응하는 증폭 산물에는 단일의, 즉 공통한 부가 염기 서열이 도입된다. 이 단일의 부가 염기 서열이 도입되며 또한 측정 대상 유전자에 대응한 복수종의 핵산(또는 증폭 산물)은 모두, 하나의 공통한 부가 염기 서열을 포함하고 있기 때문에, 1종류의 제2 프라이머에 의해 일률적으로 핵산 증폭 가능해진다. 이에 따라, 반응액 중에 존재하는 복수의 유전자의 존재량이 달랐다고 해도, 동일한 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭에 의하여 얻어진 개개의 유전자에 유래하는 증폭 산물의 존재량은, 다른 프라이머를 사용한 핵산 증폭과는 달리, 각 유전자의 존재량을 반영한 것으로 된다. 이 결과, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 적어도 2종의 유전자의 존재량을, 종래의 기술보다도 정확히 또한 간편히 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 측정 대상으로 되는 시료 중의 시료 핵산, 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특히 언급이 없는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대하여 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대하여 상보적인 당해 서열에 대하여 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열에 대하여, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로서, 명세서 전체를 대체 적용하는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)로서, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전상승분의 50%에 도달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양 쇄 사이의 수소 결합이 가열에 의하여 풀려서, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내며, 이에 따라 융해가 완료한 것으로 판단할 수 있다. Tm값은, 이 현상에 의거하여 설정된다. 본 발명에 있어서의 Tm값은, 특히 언급이 없는 한, 50%의 염기가 2본쇄를 형성하고, 남은 50%가 1본쇄로 융해하는 온도를 말한다.

본 발명에 있어서 「주형(鑄型) 핵산」 또는 「주형」이란, 핵산 증폭을 행할 때에 프라이머가 주형으로서 어닐링하는 염기 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서 「공정」이라는 단어는, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확히 구별할 수 없는 경우이어도 본 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

또한, 본 발명에 있어서 「∼」를 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「∼」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소치 및 최대치로서 포함하는 범위를 나타낸다.

또한, 본 명세서에 있어서 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재할 경우, 특히 언급이 없는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

이하, 본 발명의 개요에 대하여 설명한다.

<유전자의 존재량의 측정 방법>

본 발명에 따른 유전자의 존재량의 측정 방법은, 하나의 반응액에 있어서, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 사용하여, 핵산 증폭을 행하고, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 것(이하, 「핵산 증폭 공정」이라 함), 상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 것(이하, 「존재량 측정 공정」이라 함)을 포함한다.

핵산 증폭 공정은, 하나의 반응액에 있어서, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 사용하여, 핵산 증폭을 행하고, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 것을 포함한다.

상기 반응액에는, 적어도 2종의 유전자, 즉 측정 대상 유전자가 포함된다.

상기 측정 대상 유전자는, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 서로 상이할 수 있는 것이며, 일반적으로, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량이 다른 것을 포함하지만, 동일한 것이 포함되어 있어도 된다. 반응액 중의 상기 측정 대상 유전자를 코딩하는 염기 서열은, 후술하는 핵산 증폭을 행할 때의 주형으로 되는 핵산에 상당한다.

상기 반응액 중의 핵산의 공급원으로 될 수 있는 시료로서는, 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위 세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 주형으로 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위하여 전처리한 후에 사용할 수 있다.

예를 들면, 전혈을 시료로 할 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA를 단리하여 측정 대상 유전자의 핵산을 조제할 수 있다. 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의하여 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.

반응액 중의 핵산은, 1본쇄이어도 되고, 2본쇄이어도 된다. 반응액 중의 핵산 서열로서는, 예를 들면, DNA이어도 되며, 토탈 RNA, mRNA 등의 RNA 등이어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서는, 반응액 중에 후술하는 복수종의 프라이머를 존재시켜서 핵산 증폭을 행하기 때문에, 핵산 증폭 공정 후의 반응액 중에는, 핵산 증폭에 의하여 생성된 증폭 산물도 존재한다. 따라서, 본 발명에 있어서의 반응액 중의 핵산으로서는, 이들의 증폭 산물도 포함된다.

반응액 중의 상기 측정 대상 유전자는, 적어도 2종의 유전자이면, 본 발명에 있어서 존재량의 측정 대상으로 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 측정 대상 유전자의 적어도 1개는, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량이 미리 판명되어 있는 참조 유전자이며, 적어도 1개는 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량의 측정 대상으로 되는 표적 유전자이다. 이렇게, 측정 대상 유전자의 적어도 1개를, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량이 판명되어 있는 참조 유전자로 함에 의하여, 참조 유전자의 존재량을 참조(지표)로서 사용하여, 표적 유전자의 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량을 용이하게 측정할 수 있다.

여기에서, 「대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량」이란, 소정의 사이즈의 유전자의 카피수, 대상 샘플 중의 핵산에 차지하는 1카피의 유전자 전체의 크기, 질환에 관한 유전자의 증가나 감소, 단백질로 번역되었을 때에 기능 도메인에 상당하는 유전자 내의 특정의 영역, 탠덤 리피트나 마이크로 새틀라이트 등을 의미한다. 본 발명에 따른 측정 방법에 있어서는, 유전자의 카피수를, 측정 대상으로 되는 존재량으로 하는 것이, 예를 들면, 상기 측정 방법의 감도 및 간편성 등의 관련에서 바람직하다.

상기 참조 유전자로서 사용 가능한 유전자로서는, 개인간에서 동등한 존재량인 것이 미리 판명되어 있는 유전자, 또는 경시적으로 존재량이 변화하지 않아 비교적 안정한 존재량인 유전자이면 특히 제한은 없으며, RNaseP, sod2, COL8A1, gamma-actin 등을 들 수 있다. 또한, 상기 참조 유전자와 상기 표적 유전자와의 조합으로서는, 특히 제한은 없으며, 게놈 지도상에서 동일한 염색체상이어도 되고, 다른 염색체상의 게놈 지도상에서 떨어진 장소에 있어도 되고, 적의(適宜) 선택되며, 상기 표적 유전자와 상기 참조 유전자의 선택은 특히 한정되지 않는다.

상기 표적 유전자로서 사용 가능한 유전자는, 측정된 존재량의 이용 목적에 따라서 다르다. 예를 들면, 다형을 나타내는 유전자, 질환에 기인하여 존재량이 증가 혹은 감소하는 유전자, 질환에 기인하여 염기 서열 중의 염기가 결실하는 유전자, 및, 검체에 따라 발현량이 변화하는 유전자 등을 들 수 있다.

또한, 상기 참조 유전자와 표적 유전자와의 조합은, 표적 유전자의 성질에 따라서 적의 선택 가능하다. 예를 들면, 개인간의 카피수 다형을 검출할 경우에는, 개인간에서 동등한 존재량인 것이 미리 판명되어 있는 유전자를 참조 유전자로 하고, 다형을 나타내는 유전자를 표적 유전자로 들 수 있으며, 질환의 치료약의 표적이 되는 유전자의 존재량을 검출할 경우에는, 경시적으로 존재량이 변화하지 않아 비교적 안정한 존재량의 유전자를 참조 유전자로 하고, 질환에 기인하여 존재량이 증가 혹은 감소 또는 염기가 결실하는 유전자를 표적 유전자로 들 수 있으며, RNA의 발현량을 검출할 경우에는, 예를 들면 하우스키핑 유전자를 참조 유전자로 하고, 검체에 따라 발현량이 변화하는 유전자를 표적 유전자로 들 수 있다.

또한, 다른 태양으로서, 상기 측정 대상 유전자의 적어도 1개는, 융합 유전자의 융합점보다도 상류의 5'측의 유전자 영역(이하, 「5'측의 유전자 영역」이라고도 함)이며, 적어도 1개는, 융합 유전자의 융합점보다도 하류의 3'측의 유전자 영역(이하, 「3'측의 유전자 영역」이라고도 함)인 것도 바람직하다. 이렇게, 5'측의 유전자 영역의 존재량과, 3'측의 유전자 영역의 존재량을 비교함에 의해, 융합 유전자 변이의 유무 등을 용이하게 검출할 수 있다.

상기 융합 유전자는, 어느 유전자의 일부가 다른 유전자의 일부와 융합하여 하나의 유전자로서 존재하는 것이면 되며, 특히 제한되는 것이 아니다. 구체적으로는, ALK 융합 유전자, BCR-ABL 융합 유전자, AML1-MTG8 융합 유전자, RET 융합 유전자, ROS1 융합 유전자 등을 들 수 있다.

이하, ALK 융합 유전자를 예로 들어서, 구체적으로 설명한다.

ALK 유전자(NCBI의 액세션 No.㎚_004304.4)는, ALK(anaplastic lymphoma kinase) 수용체형 티로신키나아제를 코딩한다.

ALK 융합 유전자로서는, 예를 들면 J. Clon. Oncol. 2009 Sep 10; 27(26) : 4232-5에 기재된 EML4-ALK 융합 유전자나, KIF5B, KLC1, TFG 등 각종 유전자와의 융합 유전자가 알려져 있다.

여기에서, 본 발명에 있어서의 측정 방법에 있어서는, 융합 유전자를 구성하는 어느 한쪽의 유전자에만 주목하고, 당해 유전자의 융합점보다도 상류의 5'측의 유전자 영역의 존재량 및 하류의 3'측의 유전자 영역의 존재량을 측정하여, 비교하면 된다.

융합점이란, 다른 2개의 유전자가 융합해 있는 경계 부분을 의미한다. 예를 들면, ALK 유전자 중 4125번째의 염기(서열 번호 23 중, 1760번째의 염기에 상당)가 융합점으로 된다.

또, 유전자의 존재량을 측정하는 5'측의 유전자 영역 및 3'측의 유전자 영역이란, 융합점보다도, 상류 및 하류의 영역이면 특히 제한되지 않는다. 유전자의 존재량을 측정하는 5'측의 유전자 영역 및 3'측의 유전자 영역은, 융합점으로부터 1염기 이상 떨어져 있으면 유전자의 존재량의 측정은 가능하지만, 충분히 떨어진 영역인 것이 바람직하며, 예를 들면 10염기 정도 이상 떨어져 있는 것이 보다 바람직하며, 50염기 정도 이상 떨어져 있는 것이 더 바람직하다.

또한, 융합 유전자 변이에 따라 생기는 융합점은, 핵산 상에 복수 존재할 가능성이 있다. 그 때문에, 융합점으로부터 5'측의 유전자 영역 및 3'측의 유전자 영역의 거리를, 측정 대상으로 되는 융합 유전자 변이의 종류에 따라서 적의 설정함으로써, 검출 가능한 융합 유전자 변이의 종류를 자유롭게 변경할 수 있으며, 보다 많은 변이체(Variant)를 검출하는 것이 가능해진다.

또, 융합점으로부터의 유전자 영역까지의 거리(염기수)는, 측정 대상 유전자로 되는 5'측의 유전자 영역 또는 3'측의 유전자 영역에, 하이브리다이즈하는 프라이머 중, 융합점에 가까운 거리에 하이브리다이즈한 프라이머의 5'말단을 기초로 계산한다.

또, 본 명세서에 있어서, 융합 유전자는, ALK 융합 유전자로 한정되지 않는다. 예를 들면, GenBank 등의 데이터베이스에 염기 서열이 등록되어 있는 것이면, 어떠한 유전자이어도, ALK 융합 유전자와 마찬가지로, 본 발명에 따른 방법을 적용할 수 있다.

상기 제1 프라이머 세트는, 제1 프라이머를 포함하며, 측정 대상 유전자에 있어서의 증폭 대상 영역의 2본쇄 핵산을 각각 증폭하는 프라이머 세트이다. 상기 제1 프라이머는, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 것이다.

여기에서, 상기 증폭 대상 영역은, 측정 대상 유전자를 코딩하는 염기 서열의 일부에 상당하는 영역이며, 바람직하게는, 40염기길이∼5000염기길이, 보다 바람직하게는 50염기길이∼1000염기길이, 더 바람직하게는 60염기길이∼200염기길이로 한다. 상기 증폭 대상 영역을 이 범위의 길이로 함에 의해, 예를 들면, 상기 핵산 증폭 공정에 있어서의 반응 시간의 단축, 증폭 저해 영향의 완화, 복수의 핵산 증폭을 확실히 진행시켜, 측정 정도(精度)를 높일 수 있는 등의 이점이 얻어진다.

여기에서, 「상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응함」이란, 측정 대상 유전자에 특징적인 염기 서열을 증폭 대상 영역으로 하여 증폭 가능한 것을 의미한다. 이 때문에, 상기 핵산 증폭 공정에서는, 측정 대상 유전자의 종류에 따른 수의 제1 프라이머가 사용된다.

상기 제1 프라이머는, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능한 것을 요한다. 여기에서 「단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능」이란, 소정의 염기 서열로 구성된 상기 단일의 부가 염기 서열 그 자체를 포함하는 증폭 산물이 생성되는 것뿐만 아니라, 당해 소정의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 증폭 산물이 생성되는 것의 쌍방을 의미한다.

단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하게 하기 위해서는, 상기 제1 프라이머는, 단일의 부가 염기 서열과, 상기 측정 대상 유전자를 코딩하는 핵산의 염기 서열의 일부를 주형으로 하여 핵산 증폭 가능한 염기 서열을 포함할 수 있으며, 이들의 사이에 링커 서열을 포함하고 있어도 된다. 상기 측정 대상 유전자를 코딩하는 핵산의 염기 서열의 일부를 주형으로 하여 핵산 증폭 가능한 염기 서열로서는, 예를 들면, 상기 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열로 할 수 있다. 제1 프라이머는, 예를 들면, 조작의 간편성, 측정 방법의 측정 감도 등의 관점에서, 상기 단일의 부가 염기 서열과 상기 측정 대상 유전자의 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열과의 조합인 것이 바람직하다.

여기에서, 「단일의 부가 염기 서열」은, 하나의 측정에 사용되는 하나의 반응계 중에 존재할 수 있는 증폭 산물의 전부에 대하여 공통해서 도입될 수 있는 1종류의(단일의) 부가 염기 서열을 의미하며, 그 상보적인 서열도 포함한다. 제1 프라이머가 갖는 「단일의 부가 염기 서열」이란, 상기 단일의 부가 염기 서열 및 그 상보적인 염기 서열의 어느 것이어도 된다. 상기 증폭 산물에 도입되는 「단일의 부가 염기 서열」 및 제1 프라이머가 갖는 「단일의 부가 염기 서열」을, 이하, 특히 언급이 없을 경우, 단지 「단일의 부가 염기 서열」이라 총칭한다.

이러한 단일의 부가 염기 서열의 구조(염기 서열 및 길이)로서는, 특히 제한은 없으며, 임의의 서열을 선택할 수 있다. 증폭 산물의 전부에 있어서 공통하여 도입되는 염기 서열이므로, 적어도 2개의 유전자의 각 증폭 대상 영역 중의 염기 서열과는 비상동적인 염기 서열로 이루어지는 서열인 것이 바람직하며, 상기 증폭 대상 영역 및 당해 증폭 대상 영역에 인접하는 영역(예를 들면, 1000염기길이 이내의 범위)을 포함한 영역의 염기 서열과는 비상동적인 염기 서열로 이루어지는 서열인 것이 보다 바람직하고, 반응액 중에 존재하는 유전자의 염기 서열에는 존재하지 않는 염기 서열로 이루어지는 서열인 것이 더 바람직하다. 이에 따라, 후술하는 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭의 정도를 높일 수 있는 등의 이점이 얻어진다. 여기에서, 「비상동적」이란, 예를 들면, 증폭 대상 영역 50% 이하, 바람직하게는 25% 이하의 상동성을 갖는 것을 의미한다.

여기에서, 「상기 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열」이란, 통상의 핵산 증폭 조건에 있어서, 증폭 대상으로 되는 염기 서열을 포함하는 1본쇄 핵산(주형 핵산)에 대하여 어닐링하여, 주형 핵산과의 사이에서 2본쇄 핵산을 형성 가능한 서열을 갖고 있는 것을 의미한다.

상기 제1 프라이머에 있어서의 상기 증폭 대상 영역의 핵산 서열에 대하여 하이브리다이즈 가능한 염기 서열은, 증폭 대상 영역 중의 주형 핵산의 염기 서열을 증폭할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 대상으로 되는 유전자의 염기 서열에 의거하여 당업자이면 적의 설계할 수 있다.

상기 제1 프라이머에 관한 「하이브리다이즈 가능한 염기 서열」에는, 주형 핵산의 염기 서열에 대하여 완전히 상보적인 염기 서열이 포함되며, 또한, 후술하는 핵산 증폭 조건 하에 있어서, 완전히 상보적인 염기 서열에 대하여, 1본쇄 핵산에 대한 친화성이 크게 손상되지 않을 정도로, 1개 또는 몇 개의 염기가, 결실, 치환, 또는 부가한 염기 서열도 더 포함해도 된다. 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있으며, 제1 프라이머 전체의 길이에 따라서 다르지만, 예를 들면 1염기∼10염기, 바람직하게는 1염기∼5염기를 들 수 있다.

또한, 상기 제1 프라이머에는, 후술하는 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭을 우선시키기 위하여, 상술한 단일의 부가 염기 서열과는 다른 다양한 부가 염기 또는 소정의 길이의 부가 염기 서열(이하, 총칭해서 「조정용 부가 염기 서열」이라 함)을 포함해도 된다. 이들 조정용 부가 염기 서열은, 후술하는 것을 단독으로, 또는 후술하는 것으로부터 적의 선택된 2개 이상을 조합시킨 것으로 할 수 있다.

이러한 조정용 부가 염기 서열로서는, 상기 증폭 대상 영역의 염기 서열에 대하여 미스매치 염기 및 축중(縮重) 염기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한쪽을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 미스매치 염기 및 축중 염기의 종류 및 염기수에 대해서는, 특히 제한은 없지만, 예상되는 Tm값의 조정, 증폭 효율에의 영향, 동일한 프라이머 분자수의 조정으로부터 설정하면 된다.

또한 다른 조정용 부가 염기로서는, 우라실 염기, AP 사이트, 및 RNA 염기로 이루어지는 군에서 선택된 분해 유도 염기를 도입해도 된다. 이들 분해 유도염기를 도입했을 경우에는, 제1 프라이머에 의한 증폭 산물을 얻은 후, 이들 분해 유도 염기를 분해함에 의해, 증폭 산물에 대한 제1 프라이머의 Tm값을 낮출 수 있으며, 또한, 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭을 우선해서 진행시킬 수 있는 등의 이점이 얻어진다.

상기 제1 프라이머의 길이 및 Tm값은, 통상적으로는, 12mer∼60mer 및 40℃∼85℃, 바람직하게는 16mer∼50mer 및 50℃∼80℃이지만, 이것으로 한정되지 않는다.

또한, 상기 제1 프라이머에 있어서의 상기 단일의 부가 염기 서열과 상기 유전자의 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열은, 같은 길이이어도, 다른 길이이어도 된다.

또한, 상기 제1 프라이머에 있어서의 상기 단일의 부가 염기 서열의 위치는, 어떠한 위치이어도 된다. 바람직하게는, 상기 단일의 부가 염기 서열은, 상기 제1 프라이머의 5'말단에 배치된다. 상기 유전자의 증폭 대상 영역에 하이브리다이즈하는 염기 서열의 5'말단측에 상기 단일의 부가 염기 서열을 배치함에 의해, 예를 들면, 제1 프라이머가 측정 대상 유전자를 최초로 증폭할 때에 반응을 방해하지 않는다.

제2 프라이머는, 상기 제1 프라이머 세트에 의하여 증폭된 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위해서 사용된다. 이에 따라, 상기 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트를 사용하여 얻어진 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 증폭 산물을, 더 핵산 증폭해서, 반응액 중에 축적할 수 있다.

상기 제2 프라이머는, 상기 단일의 부가 염기 서열 또는 그 상보적인 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 가질 수 있다. 제1 프라이머의 상기 단일의 부가 염기 서열과 제2 프라이머의 하이브리다이즈를 방지하는 등의 점에서, 바람직하게는, 상기 제1 프라이머의 일부에 포함되는 상기 단일의 부가 염기 서열의 상보적인 염기 서열에 대하여 하이브리다이즈 가능한 염기 서열, 즉, 상기 제1 프라이머의 일부에 포함되는 상기 단일의 부가 염기 서열에 상동한 염기 서열을 갖는다. 이에 따라, 효율 좋게 또한 효과적으로 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 증폭 산물을 반응액 중에 축적시킬 수 있다.

상기 제2 프라이머는, 핵산 증폭 조건 하에 있어서 상기 단일의 부가 염기 서열 또는 그 상보적인 염기 서열과의 사이에서 2본쇄 핵산을 형성 가능하면, 1개 또는 몇 개의 염기가, 더 결실, 치환, 또는 부가한 것이어도 된다. 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있으며, 제2 프라이머 전체의 길이에 따라서 다르지만, 예를 들면 1염기∼10염기, 바람직하게는 1염기∼5염기를 들 수 있다.

바람직하게는, 상기 제2 프라이머는, 상기 제1 프라이머의 일부에 포함되는 상기 단일의 부가 염기 서열에 대하여 상동한 서열을 포함한다. 이에 따라, 예를 들면, 측정의 정도를 높일 수 있다. 여기에서, 상기 제2 프라이머에 있어서, 상기 단일의 부가 염기 서열에 대하여 「상동」이란, 상기 단일의 부가 염기 서열에 대하여 80% 이상의 상동성을 갖는 것을 의미한다. 상기 제2 프라이머에 있어서의 상기 단일의 부가 염기 서열에 대하여 상동한 서열은, 바람직하게는, 상기 단일의 부가 염기 서열에 대하여 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는다.

상기 제2 프라이머에는, 상기 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭이 상기 제1 프라이머에 의한 핵산 증폭보다도 우선해서 진행하도록, 제2 프라이머의 Tm값(상기 증폭 산물에 대한 Tm값을 의미함)을 제1 프라이머의 Tm값(상기 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산의 각 증폭 대상 영역 또는 상기 증폭 산물에 대한 Tm값을 의미함)보다도 높게 하는 것이 바람직하다.

이 때문에, 제2 프라이머는, 상기 단일의 부가 염기 서열 및 그 상보적인 염기 서열과는 다른 부가 서열로서, 제1 프라이머의 Tm값보다도 높은 Tm값으로 되도록 조정 가능한 부가 서열(이하, 조정용 부가 염기 서열이라 함)을 포함할 수 있다. 이 결과, 상기 증폭 산물에 대하여, 제2 프라이머의 Tm값을 높게 할 수 있다. 이 목적을 위한 부가 서열로서는, 특히 제한되지 않지만 GC 함량이 높은 염기 서열 등을 들 수 있다.

또한, 상기 제2 프라이머에는, 인공 핵산을 도입해도 된다. 이러한 인공 핵산으로서는, LNA, BNA, PNA 등을 들 수 있다.

또한, 상기 제2 프라이머의 Tm값을 상기 제1 프라이머의 Tm값보다도 높게 하기 위하여 RNA 프라이머를 도입해도 된다. 융해 온도를 향상시키는 Tm 인핸서인 MGB(마이너 그루브 바인더)를 더 부가시켜도 된다.

상기 제2 프라이머의 길이 및 Tm값은, 통상적으로는, 12mer∼60mer 및 40℃∼85℃, 바람직하게는 16mer∼50mer 및 50℃∼80℃이지만, 이것으로 한정되지 않는다.

또, 상기 제2 프라이머의 Tm값을 상기 제1 프라이머의 Tm값보다도 높게 설정할 경우에는, 상기 제2 프라이머의 Tm값이 상기 제1 프라이머의 Tm값에 비하여, 적어도 0.1℃, 1℃, 3℃, 5℃보다 높은 것이 바람직하다. 또한, 상기 제2 프라이머의 Tm값과 상기 제1 프라이머의 Tm값의 차가, 30℃, 25℃, 20℃보다 낮은 것이 바람직하다. 이것에 입각하여, 상기 제2 프라이머의 Tm값과 상기 제1 프라이머의 Tm값의 차가, 0.1℃∼30℃ 높은 것이 바람직하며, 1℃∼30℃, 3℃∼30℃, 5℃∼25℃ 높은 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기 제2 프라이머의 Tm값을 상기 제1 프라이머의 Tm값보다도 높게 설정할 경우에는, 상기 제2 프라이머의 Tm값이 50℃∼85℃이고, 상기 제1 프라이머의 Tm값이 40℃∼75℃인 것이 바람직하다. 또한, 상기 제2 프라이머의 Tm값이 55℃∼80℃이고, 상기 제1 프라이머의 Tm값이 50℃∼75℃인 것이 보다 바람직하다.

상기 제1 프라이머 세트는, 상기 제1 프라이머에 더하여, 측정 대상으로 되는 유전자의 2본쇄 핵산의 다른 쪽의 1본쇄 핵산을 증폭시키기 위한 다른 프라이머를 포함한다. 당해 다른 쪽의 프라이머로서는, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하도록 마찬가지로 설계된 같은 제1 프라이머로 할 수 있으며(한 쌍의 제1 프라이머에 의하여 구성된 세트), 또한, 상기 제1 프라이머가 하이브리다이즈하는 1본쇄의 상보쇄측을 핵산 증폭하기 위하여 사용되며 또한 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제3 프라이머로 할 수 있다. 제3 프라이머는, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않으며, 상기 제1 프라이머가 인식하는 상기 측정 대상 유전자의 1본쇄의 상보쇄의 핵산 서열에 대하여 하이브리다이즈 가능한 핵산 서열을 갖는 것이면 된다.

상기 제3 프라이머에 관한 「하이브리다이즈 가능한 염기 서열」에는, 상기 제1 프라이머에 관하여 기술한 기재를 그대로 적용할 수 있다.

또한, 상기 제2 프라이머는, 상기 단일의 부가 염기 서열을 갖는 2본쇄 핵산의 다른 쪽의 핵산을 증폭시키기 위한 다른 쪽의 프라이머와 제2 프라이머 세트를 형성할 수 있다. 상기 제2 프라이머 세트에 포함되는 다른 쪽의 프라이머로서는, 한 쌍의 상기 제2 프라이머로 구성된 세트로 할 수 있으며, 또한, 상기 제1 프라이머 세트에 포함되는 상기 제3 프라이머와 함께 상기 제2 프라이머 세트를 구성할 수도 있다. 즉, 상기 제1 프라이머 세트가 상기 제3 프라이머를 포함할 경우, 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머의 각각과 한 쌍(상기 제1 프라이머 또는 상기 제2 프라이머와 상기 제3 프라이머와의 세트)을 형성해서, 상기 측정 대상 유전자의 2본쇄 핵산의 양쪽의 염기 서열을 핵산 증폭할 수 있다.

핵산 증폭 공정에 있어서 사용되는 프라이머 세트로서는, 예를 들면, 한 쌍의 제1 프라이머의 세트 및 한 쌍의 제2 프라이머의 세트의 조합, 제1 프라이머 및 제2 프라이머와 제3 프라이머의 조합으로 할 수 있다. 또한, 이 경우에, 제1 프라이머 및 제2 프라이머에는, 상기 조정용 부가 염기 서열이 포함되어 있어도 된다.

조합의 예시로서는, 예를 들면, 이들로 한정되지 않지만, 이하의 것을 들 수 있다 :

상기 단일의 부가 염기 서열 및 상기 측정 대상 유전자의 증폭 대상 영역의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 제1 프라이머와, 조정용 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

제2 프라이머보다도 낮은 Tm값으로 되는 제1 프라이머와, 제1 프라이머보다도 높은 Tm값으로 되는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

제2 프라이머보다도 높은 Tm값으로 되는 제1 프라이머와, 제1 프라이머보다도 낮은 Tm값으로 되는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

제2 프라이머보다도 낮은 Tm값으로 되는 조정용 부가 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 미스매치 또는 축중 염기를 포함하지 않는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

제2 프라이머보다도 낮은 Tm값으로 되는 미스매치 또는 축중 염기 등의 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 미스매치 또는 축중 염기 등의 조정용 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

제2 프라이머보다도 낮은 Tm값으로 되는 조정용 부가 서열 및 미스매치 또는 축중 염기를 포함하는 제1 프라이머와, 미스매치 또는 축중 염기 등의 조정용 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

상기 단일의 부가 염기 서열 및 측정 대상 유전자의 증폭 대상 영역의 염기 서열의 쌍방에 대하여 치환 등을 포함하지 않는 제1 프라이머와, 제1 프라이머보다도 높은 Tm값으로 되는 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합;

미스매치 또는 축중 염기 등의 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 제1 프라이머와, 제1 프라이머보다도 높은 Tm값으로 되는 미스매치 또는 축중 염기 등의 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합; 및,

미스매치 또는 축중 염기를 포함하는 제1 프라이머와, 제1 프라이머보다도 높은 Tm값으로 되는 미스매치 또는 축중 염기 및 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머와, 제3 프라이머와의 조합.

또, 이 경우, 반응액 중의 측정 대상 유전자에 대응하는 제1 프라이머의 구성은, 동종의 것(예를 들면, 함께 미스매치 또는 축중 염기를 포함하지 않는 제1 프라이머로 구성되어 있음)이어도 되며, 이종의 것(예를 들면, 한쪽은 미스매치 또는 축중 염기를 포함하지 않는 제1 프라이머를 적용하고, 다른 쪽은 미스매치 또는 축중 염기를 포함하는 제1 프라이머를 적용함)이어도 되지만, 복수의 측정 대상 유전자에 대하여 동일한 증폭 효율로 핵산 증폭을 진행시키는 관점 등에서, 동종인 것이 바람직하다.

제3 프라이머를 사용한 경우에는, 상기 반응액은, 상기 제3 프라이머를, 당해 제3 프라이머와 쌍을 이루는 상기 제1 프라이머의 양에 대하여 물질량 기준으로 0.25배량∼4배량으로 포함할 수 있다. 0.25배량 이상이면, 예를 들면, 제1 프라이머와 제3 프라이머의 증폭 밸런스를 크게 손상시키지 않고 증폭할 수 있는 경향이 있고, 4배량 이하이면, 예를 들면, 제3 프라이머의 증폭 산물에 제2 프라이머가 반응하기 쉬운 등의 이점을 얻을 수 있다.

제3 프라이머량은 제1 프라이머의 양과 등량으로 할 수 있다. 또한, 실제로 사용하는 프라이머 서열이나 시약 처방, 얻어지는 검출 결과의 수치를 조절하기 위하여, 제3 프라이머의 양을 많게 하거나 적게 하거나를 미조정해서 최적화할 수 있다. 이에 따라, 예를 들면, 참조 유전자 혹은 표적 유전자, 또는 5'측의 유전자 영역 혹은 3'측의 유전자 영역의 검출 시그널의 강도를 조절 가능하게 할 수 있다는 이점과, 이 이점에 더하여, 참조 유전자 및 표적 유전자의 증폭 효율을 조절할 수 있다는 이점을 얻을 수 있다.

예를 들면, 제2 프라이머에 의한 반응으로 이행시키기 쉽게 하는 등의 점에서, 바람직하게는, 제3 프라이머의 양을, 제1 프라이머의 존재량에 대하여 물질량 기준으로 1배∼4배 정도로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1배∼2배로 할 수 있다.

또한, 상기 제3 프라이머의 양을 상기 제1 프라이머의 양보다도 적게 했을 경우에는, 예를 들면, 제3 프라이머가 반응액 중에 적기 때문에, 상기 제1 프라이머와 제2 프라이머가 제3 프라이머를 서로 빼앗도록 반응이 일어난다. 이것으로부터, 참조 유전자와 표적 유전자의 반응 플래토우에 도달하기 쉬운 시약을 준비할 수 있는 등의 이점을 얻을 수 있다. 이 경우, 제3 프라이머의 양을, 제1 프라이머의 존재량보다도 물질량 기준으로 0.25배∼1배 정도의 양으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.5배∼1배로 할 수 있다.

또한, 상기 반응액은, 상기 제2 프라이머를, 상기 제1 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머와 물질량 기준으로 등량 또는 많은 양으로 포함할 수 있다. 이에 따라, 예를 들면, 제1 프라이머 세트에 의하여 핵산 증폭된 증폭 산물을 확실히 증폭시킬 수 있는 등의 이점을 갖는다. 또한, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭에 비하여 제2 프라이머 세트의 핵산 증폭으로 이행하기 쉽고, 제2 프라이머에 의한 핵산 증폭 산물이 다량으로 얻어지고, 및, 제2 프라이머의 고갈이 원인으로 핵산 증폭 산물이 플래토우에 도달하는 것을 방지하는 등의 이점의 하나 이상도 얻을 수 있다.

바람직하게는, 상기 제2 프라이머는, 상기 반응액 중에서, 제1 프라이머 세트를 구성하는 각 프라이머 중 많은 쪽의 양의 1배량∼400배량(몰비), 바람직하게는 1배량∼40배량(몰비)의 많은 양으로 할 수 있으며, 더 바람직하게는 1배∼20배(몰비)로 할 수 있다. 제2 프라이머의 반응액 중의 농도를 상기 제1 프라이머 세트를 구성하는 각 프라이머 중 많은 쪽의 농도보다도 1배량 이상으로 함에 의해, 증폭 효율을 손상시키지 않고 증폭 산물을 확실히 반응액 중에 축적할 수 있는 등의 경향이 있고, 400배량 이하으로 함에 의해, 비특이적인 증폭의 방지나, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응을 방해하지 않는 등의 경향이 있다.

또한 상기 반응액은, 상기 제1 프라이머와의 양비, 및 상기 제2 프라이머와 양비를 함께 만족시키도록, 상기 제3 프라이머를 포함할 수 있다. 이에 따라, 상술한 이점을 함께 가질 수 있다.

또, 상기 핵산 증폭 공정에 있어서, 각 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머의 길이는 동일해도 달라도 된다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 폴리머라제를 사용하는 방법이 바람직하며, 그 예로서는, PCR법, ICAN법, LAMP법, NASBA법 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우에는, 후술하는 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 프로브 및 폴리머라제에 따라서, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다.

또한 PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용되는 DNA 폴리머라제를 특히 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(닛폰진사제), PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용할 경우, 바람직하게는, 반응액량 50㎕에 대하여 0.01U∼100U의 농도로 할 수 있다.

상기 PCR 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물이 해리할 수 있는 온도이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃∼95℃이다. 가열 시간도 특히 제한되지 않는다. 통상, 1초∼10분이며, 바람직하게는 1초∼5분이다.

또한, 해리한 1본쇄 핵산과 상기 프라이머 각각과의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정의 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴에 의하여 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 50℃∼80℃이다.

온도 조건은, 핵산 증폭의 반응 과정에 있어서 복수의 조건을 설정해도 된다. 예를 들면, PCR 반응을 50사이클 실시하는 핵산 증폭 반응에 있어서, 전반의 10사이클을 55℃에서 실시하고, 후반의 40사이클을 65℃에서 실시하는 반응 조건을 조정해도 된다.

하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는, 특히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 프라이머의 농도는, 예를 들면, 제1 프라이머와 제3 프라이머는 0.001μM∼1μM이며, 바람직하게는 0.01μM∼0.5μM, 제2 프라이머의 농도는, 예를 들면, 0.01μM∼10μM이며, 바람직하게는 0.05μM∼5μM이다.

상기 반응액은, 후술하는 시그널 검출 공정에 있어서 효과적으로 시그널을 검출하기 위하여, 상기 적어도 2종의 증폭 산물을 각각 인식하는 적어도 2종의 검출용 프로브를 포함해도 된다.

상기 검출용 프로브로서는, 목적으로 하는 증폭 산물을 검출할 수 있으면 특히 제한은 없다. 또한 검출용 프로브의 길이로서는, 특히 제한은 없지만, 5mer∼50mer인 것이 바람직하며, 10mer∼30mer인 것이 보다 바람직하다. 프로브의 길이가 이 범위 내이면, 예를 들면 검출 감도를 높일 수 있다.

상기 검출용 프로브는, 상기 측정 대상 유전자 각각의 핵산 서열에 대하여, 70%∼100% 같은 서열인 것이 바람직하며, 80% 이상 동일한 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 검출용 프로브를 핵산 증폭 공정에서 프라이머와 함께 존재시켜서 사용할 경우에는, DNA 폴리머라제의 반응 대상으로 되어 프로브 자체의 신장을 예방하기 위하여, 3'말단측에 후술하는 형광 표지가 붙어 있거나, 프로브의 3'말단에 인산기가 더 부가되어 있는 것이 바람직하다.

검출용 프로브는, 표지가 붙어 있는 표지화 프로브인 것이 검출의 효율성의 관점에서 바람직하다.

표지화 프로브에 있어서의 표지 물질의 구체예로서는, 예를 들면, 형광 색소 및 형광단(螢光團)을 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로서는, 예를 들면, 형광 색소로 표지되어, 단독으로 형광을 나타내며 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면, 소광)하는 프로브가 바람직하다.

이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라 불린다. 그 중에서도, 상기 프로브로서는, 올리고뉴클레오티드의 3'영역(예를 들면, 3'말단) 혹은 5'영역(예를 들면, 5'말단)의 염기가 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하며, 표지화되는 상기 염기는, 시토신(C)인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리다이즈하는 검출 목적 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C와 쌍을 이루는 염기 혹은 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3염기 떨어진 염기가 구아닌(G)으로 되도록, 상기 표지화 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라 불리며, 소위 Q Probe로서 알려져 있다.

이러한 구아닌 소광 프로브가 검출 목적 서열에 하이브리다이즈하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가, 상기 검출 목적 서열에 있어서의 G에 접근함에 의하여, 상기 형광 색소의 발광이 약해지는(형광 강도가 감소함) 현상을 나타낸다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 상기 표지 물질은, 예를 들면, 통상, 뉴클레오티드의 인산기에 결합할 수 있다.

또, Q Probe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법 또는 RFLP법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있으며, 시판의 형광 색소로서는, 예를 들면, BODIPY FL, FluorePrime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다. 측정 대상으로 되는 유전자가 시료액 중에 복수 존재하기 때문에, 본 발명에 있어서는, 복수의 검출용 프로브가 적용된다. 이 경우에 바람직하게 사용되는 복수의 프로브에 사용 가능한 형광 색소의 조합은, 예를 들면, 다른 조건에서 검출할 수 있으면 되며, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, Pacific Blue(검출 파장 445㎚∼480㎚), TAMRA(검출 파장 585㎚∼700㎚) 및 BODIPY FL(검출 파장 520㎚∼555㎚)의 조합 등을 들 수 있다. 동일한 형광 색소를 사용할 경우에는, 상기 검출 대상에 대한 Tm값이 상이한 검출용 프로브를 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 검출용 프로브가, 형광 색소 등의 표지화 물질로 표지화된 표지화 프로브인 경우, 예를 들면, 검출하는 형광 강도 등의 시그널 강도를 조절하기 위하여, 상기 표지화 프로브와 같은 서열인 미표지 프로브를 병용해도 된다. 이 미표지 프로브는, 예를 들면, 그 3'말단에 인산이 부가되어도 된다.

상기 반응액 중의 핵산에 대한 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 특히 제한되지 않는다. 시료 중의 핵산에 대하여 1배 이하가 바람직하며, 0.1배이하가 보다 바람직하다. 이에 따라, 예를 들면 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있다.

상기 핵산에 대한 상기 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비이어도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비이어도 된다.

상기 존재량 측정 공정에서는, 상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 것을 포함한다.

적어도 2종의 증폭 산물의 존재량은, 적어도 2종의 유전자의 존재량을 반영하고 있기 때문에, 핵산 증폭 공정에서 얻어진 증폭 산물의 존재량에 의거한 시그널을 측정함에 의해, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량을 측정할 수 있다.

유전자의 존재량의 측정은, 증폭 산물의 검출 시그널을 얻는 것(이하, 시그널 검출 공정이라 함), 및 얻어진 검출 시그널을 대비해서 존재량을 측정하는 것(이하, 시그널 대비 공정이라 함)에 의해 행할 수 있다.

시그널의 검출은, 반응액 중에 축적한 증폭 산물의 존재량을 측정하는 방법이면 되며, 시그널의 종류에 대해서는 특히 제한은 없다.

상기 시그널 검출 공정으로서는, 바람직하게는, 목적으로 하는 증폭 산물을 검출 가능한 검출용 프로브를 사용한 검출 방법을 사용할 수 있다.

상기 시그널 대비 공정에서는, 상기 시그널 검출 공정에서 얻어진 각 유전자에 대응하는 각 검출 시그널을 대비함에 의하여, 각 유전자의 존재량을 측정하는 것을 포함한다. 상기 검출 시그널의 대비 및, 대비 결과로부터의 각 유전자의 존재량의 측정의 방법에 대해서는, 특히 한정되지 않는다.

예를 들면, PCR의 사이클수와 증폭 산물의 축적량과의 관계로부터, 상기 유전자에 대응한 검출 시그널을 대비해서 각 유전자의 존재량을 산출해도 된다.

이 경우에는, 반응액 중의 복수의 측정 대상 유전자의 증폭 산물량을, PCR 사이클수의 경과와 함께 축차 측정하고, 얻어진 측정 결과로부터, 측정 대상 유전자의 존재량을 측정할 수 있다. PCR 사이클수에 따른 증폭 산물의 양은, 일반적으로, 지수함수적으로 증폭하지만, 일반적인 검출 방법으로는 검출 불능한 초기 사이클기, 지수함수적으로 증가하여 검출 가능한 증폭기, 반응 속도가 저하하는 플래토우기로 나뉜다. 상기 핵산 증폭 공정에서는, 상기 검출 대상 유전자의 종류에 따른 복수의 증폭 산물은, 모두 제2 프라이머에 의하여 증폭 산물로 되어 있기 때문에, 플래토우기에 도달해도, 상기 측정 대상 유전자의 존재량에 따른 양비로 반응액 중에 축적한다. 이 때문에, 상기 증폭 산물의 종류를 식별하는 종류 식별 수단을 적용함에 의해, 반응액 중에 축적한 상기 측정 대상 유전자에 유래하는 증폭 산물을 식별하고, 각각의 양비를 측정함에 의하여, 각각의 측정 대상 유전자의 존재량을 측정할 수 있다.

상기 종류 식별 수단으로서는, 상기 검출용 프로브의 Tm값, 표지종, 프로브를 고정한 DNA 마이크로 어레이 등을 들 수 있다.

또한, 상기 측정 대상 유전자가 참조 유전자와 표적 유전자를 포함할 경우에는, 참조 유전자의 존재량에 대한 비율로부터, 표적 유전자의 존재량을 측정해도 된다. 상기 측정 대상 유전자가 융합 유전자에 있어서의 5'측의 유전자 영역과 3'측의 유전자 영역인 경우에는, 5'측의 유전자 영역의 존재량에 대한 비율로부터, 3'측의 유전자 영역의 존재량을 측정해도 되고, 3'측의 유전자 영역의 존재량에 대한 비율로부터, 5'측의 유전자 영역의 존재량을 측정해도 된다.

또한, 상기 존재량 측정 공정은, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량이, 당해 유전자의 각각에 대응하는 적어도 2개의 검출 시그널의 Tm 해석에 의해 측정되는 것이어도 된다. 이 경우, 상기 시그널 검출 공정 및 상기 시그널 대비 공정으로서는, 하기 공정(Ⅰ)∼(Ⅳ)을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 또, 하기 공정(Ⅰ)은, 상술한 핵산 증폭 공정과 동시에 진행하는 것이어도 된다.

(Ⅰ) 상기 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산(증폭 산물)을 접촉시켜서, 하이브리드 형성체를 얻는 것(하이브리다이제이션 공정).

(Ⅱ) 상기 하이브리드 형성체를 함유하는 시료의 온도를 변화시킴에 의해, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 검출 시그널의 변동을 측정하는 것(측정 공정).

(Ⅲ) 상기 검출 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm값을 검출하는 것(Tm값 검출 공정).

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 목적으로 하는 증폭 산물의 존재 또는 존재비를 검출하는 것(존재비 검출 공정).

하이브리다이제이션 공정에서는, 상기 검출용 프로브와 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 양자를 하이브리다이즈시킨다. 시료 중의 1본쇄 핵산은, 예를 들면, 상기와 같이 해서 얻어진 증폭 산물을 해리함으로써 조제할 수 있다.

상기 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물이 해리할 수 있는 온도이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃∼95℃이다. 가열 시간도 특히 제한되지 않는다. 통상, 1초∼10분이며, 바람직하게는 1초∼5분이다.

해리한 1본쇄 핵산과 상기 검출용 프로브와의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정의 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴에 의하여 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 25℃∼50℃이다. 하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는, 특히 제한 없이, 통상 적용되는 조건을 적용할 수 있다.

측정 공정에서는, 얻어진 상기 1본쇄 핵산과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 따른 형광 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, Q Probe를 사용한 경우, 1본쇄 핵산과 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비하여 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)해 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 따른 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온∼85℃이며, 바람직하게는 25℃∼70℃이고, 종료 온도는, 예를 들면, 40℃∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초∼20℃/초이며, 바람직하게는 0.3℃/초∼5℃/초이다.

측정 공정에서는, 상기 적어도 2종의 유전자의 존재량을 측정하기 위하여 사용되는 상기 시그널을, 동일한 파장으로부터 취득되는 흡광도 또는 형광값에 의해 얻는 것이 바람직하다. 이에 따라, 간략화된 측정 및 검출에 의하여, 상기 측정 대상 유전자의 존재량을 측정할 수 있다. 동일 파장에 의해 흡광도 또는 형광값을 취득하기 위해서는, 예를 들면, 검출용 프로브의 표지를 동일한 것으로 하면 된다. 이때, 사용되는 각 프라이머의 Tm값이 다른 것이, 검출 감도의 관점에서, 보다 바람직하다.

Tm값 검출 공정에서는, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d 형광 강도/dt)을 산출하여, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아닌, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

또한, 하이브리드 형성체를 가열하여, 온도 상승에 따른 형광 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하는 것 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드 형성체를 형성할 때의 상기 온도 강하에 따른 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 상보 서열에 하이브리다이즈해 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 상보 서열에 하이브리다이즈해 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 프로브(예를 들면, QProbe)를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드 형성체를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따른 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.

한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따른 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

존재비 검출 공정에서는, 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 목적으로 하는 증폭 산물의 존재량을 검출하여, 당해 존재량으로부터 측정 대상으로 되는 유전자의 존재량을 검출한다.

상기 시그널 검출 공정에 있어서 얻어진 상기 증폭 산물의 검출 시그널에는, 측정 대상으로 되는 복수의 유전자에 유래하는 복수의 증폭 산물의 시그널이 혼재해 있다. 이들 시그널은, 각각 증폭 산물의 존재량을 반영하고 있으므로, 각각의 검출 시그널을 비교 대비함에 의하여, 측정 대상 유전자의 존재량, 즉, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량을 측정할 수 있다. 특히, 측정 대상으로 되는 유전자가, 미리 유전자의 존재량이 판명되어 있는 상기 참조 유전자와 상기 표적 유전자를 포함할 경우, 참조 유전자의 검출 시그널을 기준으로 함에 의해, 간편히, 상기 표적 유전자의 존재량을 측정할 수 있다.

또한, 측정 대상으로 되는 유전자가, 융합 유전자에 있어서의 5'측의 유전자 영역과 3'측의 유전자 영역인 경우, 5'측의 유전자 영역의 검출 시그널과, 3'측의 유전자 영역의 검출 시그널을 비교함에 의해, 간편히, 샘플 중에 있어서의 융합 유전자의 존재를 검출할 수 있다.

검출 시그널에 의거하여 유전자의 존재량을 측정하는 방법으로서는, 특히 제한은 없으며, 이 목적을 위하여 사용 가능한 해석 방법이면, 어느 것도 적용할 수 있다.

예를 들면, 상술한 시그널의 Tm 해석에 의해 얻어진 융해 곡선을 대비함에 의하여 유전자의 존재량을 측정하는 것이, 정도 좋게 또한 간편히 목적으로 하는 유전자의 존재량을 측정할 수 있는 등의 이점을 가져, 바람직하다.

이러한 Tm 해석 방법으로서는, WO2009/081965, 및 WO2010/001969 등에 기재된 것을 바람직하게 들 수 있다.

Tm 해석 방법의 바람직한 일례로서, 측정 대상 유전자를 참조 유전자 및 표적 유전자로 하여, Tm 해석의 결과를 면적 해석해서, 각각의 유전자의 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량을 결정하는 방법을 이하에 기술한다.

도 1의 (A)에, 어느 임의의 표적 유전자와 참조 유전자의 핵산 혼합물의 온도와 흡광도 또는 형광 강도 등의 검출 신호와의 관계로 표시된 융해 곡선, 및 동 도면의 (B)에 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계로 표시된 융해 곡선(미분 융해 곡선이라고도 함)을 나타낸다. 이 미분 융해 곡선으로부터 피크를 검출함에 의해, 참조 유전자의 핵산 R의 융해 온도 Tm_R 및 표적 유전자의 핵산 T의 융해 온도 Tm_T을 검출하여, Tm_R 및 Tm_T을 포함하는 온도 범위의 각각을 설정한다.

Tm_R을 포함하는 온도 범위 ΔT_R로서는, 예를 들면, Tm_R과 Tm_T과의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소로 되는 온도를 하한, 검출 신호의 피크의 아래 부분에 대응하는 온도를 상한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한, Tm_T를 포함하는 온도 범위 ΔT_T로서는, 예를 들면, Tm_R과 Tm_T과의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소로 되는 온도를 상한, 검출 신호의 피크의 아래 부분에 대응하는 온도를 하한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다.

또, 온도 범위 ΔT_R 및 온도 범위 ΔT_T는, 동일한 폭(예를 들면, 10℃) 또는 다른 폭(예를 들면, 온도 범위 ΔT_R가 10℃, 온도 범위 ΔT_T가 7℃)으로 되도록 설정해도 된다. 또한, 온도 범위 ΔT_R 및 온도 범위 ΔT_T는, 각각의 융해 온도 Tm로부터 플러스 X℃, 마이너스 X℃의 폭(X℃는 예를 들면 15℃ 이내, 바람직하게는 10℃ 이내)과 같이 설정해도 된다.

다음으로, 온도 범위 ΔT_R 및 온도 범위 ΔT_T의 각각에 대하여, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 통과하는 직선과 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적을 구한다. 면적의 계산 방법의 일례로서, 구체적으로 이하와 같이 구할 수 있다. 온도 T에 있어서의 검출 신호의 미분값을 f(T)로 하고, 온도 T에 있어서의 베이스값을 B(T)로 하여, 하기 (1)식에 의해 구한다.

면적 S={f(T_{s +1})-B(T_{s +1})}+{f(T_{s +2})-B(T_{s +2})}

+…+{f(T_{e -1})-B(T_{e -1})}…(1)

단, Ts는 각 온도 범위에 있어서의 하한값, Te는 상한값이다. 또한, 각 온도 T에 있어서의 베이스값 B(T)는, 하기 (2)식에 의해 구하는 값이며, 검출 신호에 포함되는 백그라운드 레벨을 나타내는 것이다. 이 베이스값을 검출 신호의 미분값으로부터 감산함에 의해, 검출 신호에 포함되는 백그라운드의 영향을 제거한다.

B(T)=a×(T-T_s)+f(T_s)…(2)

단, a={f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)이다.

상기 (1)식 및 (2)식에 따라서, 각 핵산에 대하여, 온도 범위 ΔT_R에 있어서의 면적 S_R 및 온도 범위 ΔT_T에 있어서의 면적 S_T를 구하고, 면적비와 각 핵산의 존재비와의 관계를 산출한다. 예를 들면, 횡축으로 존재비(핵산의 총량에 대한 표적 유전자 T의 비율)를 취하고, 종축으로 면적비(S_T/S_R)를 취해도 된다. 또, 면적비는 S_R/S_T로 정해도 된다.

여기에서 참조 유전자의 존재량은 미리 판명되어 있으므로, 참조 유전자의 면적과 표적 유전자의 면적과의 대비를 행함에 의해, 표적 유전자의 존재량을 결정할 수 있다.

또, 상기와 같이 해서 미리 구체적인 존재량을 알고 있는 측정 대상 유전자에 대해서 검량선을 작성하여, 표적 유전자의 정량을 행해도 된다.

상기와 같이 해서 작성된 검량선을 사용하여, 측정 대상으로 되는 복수의 유전자의 존재량을 측정한다. 존재량의 측정은, 측정 대상으로 되는 유전자 중, 하나의 유전자의 존재량과의 대비로 그 외의 유전자의 상대적인 존재량을 얻어도 되고, 하나의 유전자의 구체적인 존재량에 의거하여 그 외의 유전자의 구체적인 존재량을 얻어도 된다. 하나의 유전자를 참조 유전자로 했을 경우에는, 표적 유전자의 존재량을 참조 유전자의 존재량에 의거한 상대량으로서 얻을 수 있으며, 또한, 구체적인 양으로서 얻어도 된다. 존재량으로서 카피수를 구할 경우에는, 상기 참조 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 상기 표적 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 상기 표적 유전자의 카피수를 결정할 수 있다.

또, 측정 대상 유전자가, 5'측의 유전자 영역 및 3'측의 유전자 영역인 경우에 대해서도, 상술한 방법과 마찬가지의 방법으로, 5'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 3'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 샘플 중에 있어서의 융합 유전자의 존재를 검출할 수 있다.

<유전자의 측정 키트>

본 발명에 따른 유전자 측정 키트는, 상술한 유전자 측정 방법을 위한 키트로서, 상술한 제1 프라이머를 포함하는 상기 제1 프라이머 세트와, 상기 제2 프라이머를 포함한다.

본 측정 키트에 의하면, 존재량이 다른 측정 대상 유전자의 존재량을 간편히 측정할 수 있다.

또한, 상기 측정 키트에는, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머에 더하여, 상술한 제3 프라이머를 포함해도 된다.

본 유전자 측정 키트에 있어서의 상기 제1 프라이머, 상기 제2 프라이머 및 상기 제3 프라이머에 대해서는, 상술한 사항이 그대로 적용된다.

또한, 상기 측정 키트에는, 상기 적어도 2개의 유전자의 핵산 증폭 영역에 각각 하이브리다이즈 가능한 핵산 서열을 가지며 또한 표지를 구비한 적어도 2개의 검출용 프로브를 포함해도 된다. 이에 따라, 검출 프로브를 사용하여, 존재량이 다른 측정 대상 유전자를, 한층 더 간편히 측정할 수 있다. 상기 측정 키트에 포함되는 상기 검출용 프로브로서는, 상기 표지가 형광 표지인 것이 바람직하다. 상기 표지 및 형광 표지에 대해서는, 상술한 사항이 그대로 적용된다.

또한 상기 측정 키트는, 프로브 외에, 본 발명에 따른 측정 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데 필요한 시약류를 더 포함하고 있어도 된다. 또한, 상기 각 프로브, 상기 각 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

또, 「별개로 수용」이란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되며, 반드시 독립해서 취급 가능한 개별의 용기에 수용될 필요는 없다.

또한 본 발명의 측정 키트는, 상기 제1 프라이머를 포함하는 상기 제1 프라이머 세트와 제2 프라이머를 사용하여, 측정 대상 유전자를 포함하는 시료에 대해서 미분 융해 곡선을 작성하고, 그 Tm값 해석을 행하여, 측정 대상 유전자의 존재량을 측정하는 것이 기재된 취급설명서, 또는 측정 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종 시약에 대해서 기재된 사용설명서를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 측정 키트는, 융합 유전자 변이를 검출하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, ALK 융합 유전자 측정 키트로서는, ALK 유전자에 있어서의 특정 유전자 영역을 증폭시키는 것이 가능한 제1 프라이머를 포함하는 상기 제1 프라이머 세트(예를 들면, 서열 번호 19 및 21)와 제2 프라이머(예를 들면, 서열 번호 22)를 포함하는 측정 키트를 들 수 있다. 또한, ALK 융합 유전자 측정 키트는, ALK 유전자에 있어서의 특정 유전자 영역을 증폭시키는 것이 가능한 제1 프라이머를 포함하는 상기 제1 프라이머 세트(예를 들면, 서열 번호 19 및 21)와, 제2 프라이머(예를 들면, 서열 번호 22)와, 제3 프라이머(예를 들면 서열 번호 18 및 20)를 포함하는 측정 키트이어도 된다.

<유전자 측정 장치>

본 발명에 따른 유전자 측정 장치는, 상술한 유전자의 존재량의 측정 방법을 적용 가능한 장치로서, 상기 제1 프라이머에 의해 도입된 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 제2 프라이머에 의하여 핵산 증폭된 상기 적어도 2개의 유전자에 대응하는 증폭 산물의 존재량에 의거한 적어도 2개의 시그널을 검출하는 검출부와, 상기 검출부에 의해 검출된 상기 적어도 2개의 검출 시그널을 대비하여, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 연산하는 연산부를 포함하는 유전자 측정 장치이다.

본 유전자 측정 장치이면, 상술한 본 발명에 따른 유전자의 존재량의 측정 방법을, 보다 간편히 실시할 수 있다.

상기 검출부는, 검출 시그널을 검출 가능한 것이면 특히 제한은 없으며, 예를 들면, 사용되는 검출용 프로브의 종류에 따라서, 적의 선택 가능하다. 예를 들면, 검출용 프로브가 형광 표지 프로브이면, 형광 검출기를 포함할 수 있다.

상기 연산부는, 검출부에 의해서 얻어진 각 검출 시그널에 의거하여, 반응액 중의 측정 대상 유전자의 존재량을 연산한다.

연산에는, 예를 들면, 융해 곡선의 검출 신호를 온도에 관하여 미분해서, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 미분 융해 곡선을 연산하는 것, 미분 융해 곡선에 대하여, 미리 검량선을 작성했을 때에 설정한 온도 범위를 설정하는 것, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 통과하는 직선과 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적으로서, 측정 대상 유전자에 대응하는 면적을 각각 구하는 것, 얻어진 면적의 비를 연산하는 것, 미리 작성된 검량선에 의거하여, 면적비에 대응하는 측정 대상 유전자의 존재비를 연산하는 것이 포함된다.

상기 검출부 및 연산부를 구비한 장치로서는, 공지의 어느 것을 사용해도 된다. 예를 들면, WO2009/081965, 및 WO2010/001969 등에 기재된 장치를 그대로 적용해도 된다.

<유전자 측정 시스템>

본 발명에 따른 유전자 측정 시스템은, 상술한 유전자의 존재량의 측정 방법을 적용 가능한 장치로서, 상기 제1 프라이머에 의해 도입된 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 제2 프라이머에 의하여 핵산 증폭된 상기 적어도 2개의 유전자에 대응하는 증폭 산물의 존재량에 의거한 적어도 2개의 시그널을 검출하는 검출 장치와, 상기 검출부에 의해 검출된 상기 적어도 2개의 검출 시그널을 대비하여, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 연산하는 연산 장치를 포함하는 유전자 측정 시스템이다.

본 유전자 측정 장치이면, 상술한 본 발명에 따른 유전자의 존재량의 측정 방법을, 보다 간편히 실시할 수 있다.

본 시스템에 사용되는 검출 장치 및 연산 장치는, 상기 유전자 측정 장치에 있어서 검출부 및 연산부로서 기술한 것을 그대로 적용할 수 있다.

또한, 상기 측정 장치와 마찬가지로, 상기 측정 장치 및 연산 장치에 대해서는, 예를 들면, WO2009/081965, 및 WO2010/001969 등에 기재된 장치를 그대로 적용해도 된다.

<유전자 진단 방법>

본 발명의 유전자 진단 방법은, 상술한 유전자 측정 방법을 사용하여 행하는 진단 방법이다.

본 방법에 따르면, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 존재량이 다른 적어도 2개의 유전자의 존재량에 의거하여, 이러한 존재량에 관련하는 질환, 약제대사능, 약제감수성 등의 진단을 행할 수 있다.

바람직하게는, 측정 대상 유전자의 존재량이 카피수이며, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 카피수가 증감하는 것을 지표의 하나로 하는 카피수 다형의 진단에 본 발명을 적용한다. 카피수 다형을 지표의 하나로 하는 질환으로서는, 염색체 1q21.1의 카피수 다형에 의한 신경아세포종 등을 들 수 있다. 본 발명에 따르면, 이들의 질환, 약제대사능, 약제감수성에 관한 유전자의 존재량의 검출을 정도 좋게 진단할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예로 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 그들로 하등 한정되는 것이 아니다. 또, 특히 언급이 없는 한, 「%」는 질량 기준이다.

[실시예 1]

CYP2D6 유전자를 표적 유전자로 하여, 인간CYP2D6 유전자의 특정 영역 서열(서열 번호 1)의 존재량의 측정을 행했다. 참조 유전자로서 인간sod2 유전자의 특정 영역 서열(서열 번호 2)을 사용했다. 또, CYP2D6 유전자의 게놈 염기 서열은, GenBank NG008376으로서, sod2 유전자의 게놈 염기 서열은 GenBank NG008729로서, 각각 입수 가능하다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 핵산 서열을 pUC57에 삽입한 인공 핵산(플라스미드)을 조제하고, CYP2D6의 카피수를 변화시키기 위하여, 표 1에 따라서 각종 플라스미드 용액에 따른 시료 a∼d를 준비했다. 이들 플라스미드 용액을 사용하여, 소정의 카피수로 표적 유전자 및 참조 유전자를 포함하는 각종 시료(각종 주형)를 조제했다.

[표 1]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 2에 나타내는 프로브 및 각종 프라이머를 사용하여, 표 3에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 사용한 폴리머라제는, Taq 폴리머라제이다.

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 63℃에서 15초를 1사이클로 하여, 60사이클 반복했다.

또한 Tm 해석은, PCR 후, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃에서부터 80℃까지 온도를 상승시켜, 그 동안의 경시적(經時的)인 형광 강도의 변화를 측정했다. 여기(勵起) 파장을 520㎚∼555㎚로 하고, 측정 파장을 585∼700㎚로 하여, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다. 표적 유전자(CYP2D6)의 경우에는 58℃부근, 참조 유전자(sod2)의 경우에는, 70℃부근에 각각 피크가 확인되는 것을 알 수 있다.

Tm값에 의거한 해석은, 면적 해석에 의거하여 행했다. 구체적으로는, 시료 a∼d에 대하여, Tm 해석의 결과로부터 미분 융해 곡선을 작성해서, 표적 유전자 및 참조 유전자의 각각의 Tm값과 각각의 면적을 얻어서, 참조 유전자의 면적에 대한 표적 유전자의 면적의 비를 구했다. 결과를 표 8 및 도 2a에 나타낸다.

사용한 프라이머 및 프로브의 서열은 표 2에 기재된 바와 같다.

CYP2D6의 핵산을, 단일의 부가 염기 서열과 CYP2D6에 특징적인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 구성된 제1 프라이머(서열 번호 3, Tm값 70.4℃)와, CYP2D6에 특징적인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 구성된 제3 프라이머(서열 번호 4, Tm값 55.7℃)를 사용하여 증폭했다. sod2의 핵산을, 상기 단일의 부가 염기 서열과, sod2에 특징적인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 구성되어 있던 제1 프라이머(서열 번호 6, Tm값 69.7℃)와, sod2에 특징적인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 구성된 제3 프라이머(서열 번호 5, Tm값 57.3℃)를 사용하여 증폭했다. 각각의 증폭 산물을, 상기 단일의 부가 염기 서열만으로 구성된 제2 프라이머(서열 번호 7, Tm값 59.6℃)와, 각각의 제3 프라이머를 사용하여 증폭했다. CYP2D6의 검출용 프로브(서열 번호 8) 및 sod2의 검출용 프로브(서열 번호 9)는, 표 2에 기재된 바와 같다. 각 프라이머의 Tm값은, Meltcalc를 사용하여 산출한 값이다.

또, 표 2 중, 소문자로 표기한 염기 서열은, 상기 단일의 부가 염기 서열을 나타낸다.

[표 2]

[표 3]

[비교예 1∼3]

비교예 1에서는, 하기 표 4에 나타내는 바와 같이 CYP2D6 및 sod2의 쌍방에 있어서 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 프라이머(2D6-Int6r-F1 : 서열 번호 10, sod2-R1 : 서열 번호 11)를 포함하는 프라이머 세트를 사용하며, 또한 제2 프라이머를 사용하지 않았던 표 5의 처방으로 한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 PCR 및 Tm 해석을 행했다.

비교예 2에서는, 하기 표 4에 나타내는 바와 같이 CYP2D6 및 sod2의 쌍방에 있어서 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 프라이머(2D6-Int6r-F1 : 서열 번호 10, sod2-R1 : 서열 번호 11)를 포함하는 프라이머 세트를 사용한 표 6의 처방으로 한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 PCR 및 Tm 해석을 행했다.

비교예 3에서는, 제2 프라이머(PEN3 F4 : 서열 번호 7, 표 2 참조)를 사용하지 않은 표 7의 처방으로 한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 PCR 및 Tm 해석을 행했다.

비교예 1∼3에서 사용한 각 프라이머의 서열 및 Tm 해석의 결과를 표 8 및 도 2b∼도 2d에 나타낸다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

[표 8]

표 8 및 도 2a∼d에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서는, 시료 a∼b 중의 표적 유전자의 카피수에 따라서 면적비가 커져, 카피수의 증가에 반영한 결과가 얻어졌다. 이에 대하여, 비교예 1∼비교예 3에서는 모두, 시료 중의 카피수의 증가에 따른 면적비의 증가로 되어 있지 않아, 카피수의 증가에 반영한 결과가 얻어지지 않았다.

실시예 1 및 비교예 1을 각각 3회씩 반복해도, 마찬가지의 경향이 확인되었다(데이터 나타내지 않음).

[실시예 2∼실시예 3]

실시예 2에서는, 제2 프라이머를, 상기 조정용 부가 염기 서열을 갖는 PEN3 F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg : 서열 번호 12, 41mer, Tm값 69.4℃)로 변경하여 표 9에 나타난 처방에 따른 각 시약을 사용해서, PCR을, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 60℃에서 15초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 해서 Tm 해석을 행했다. 결과를 표 11 및 도 3에 나타낸다.

실시예 3에서는, CYP2D6용의 제1 프라이머를, 5'말단측의 상기 단일의 부가 염기 서열을 4염기 삭제함과 함께 CYP2D6의 증폭 대상 영역에 상당하는 염기 서열에 축중을 포함하는 2D6-P3F4-Int6r-F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA, B=c, g, 또는 t : 서열 번호 13, 41mer, Tm값 67.6∼69.2℃)로 변경하고, sod2용의 제1 프라이머를, 5'말단측의 상기 단일의 부가 염기 서열을 4염기 삭제함과 함께 sod2의 증폭 대상 영역에 상당하는 염기 서열에 축중을 포함하는 P3F4-sod2-R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC, D=a, g 또는 t : 서열 번호 14, 44mer, Tm값 66∼67.3℃)로 변경하고, 표 10에 나타나는 처방에 따른 각 시약을 사용하여, PCR을, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 57℃에서 15초를 1사이클로 하여 5사이클 반복한 후, 95℃에서 1초 및 63℃에서 45초를 1사이클로 하여 45사이클 반복한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 해서 PCR 및 Tm 해석을 행했다. 각 프라이머의 Tm값은, Meltcalc를 사용하여 산출한 값이다. 결과를 표 11 및 도 4에 나타낸다.

[표 9]

[표 10]

[표 11]

표 11, 도 3 및 도 4에 나타나는 바와 같이, 실시예 2 및 실시예 3에서는, 시료 a∼b 중의 표적 유전자의 카피수에 따라서 면적비가 커져, 카피수의 증가를 반영한 결과가 얻어졌다. 또한, 프라이머의 조건 및 반응 온도 조건을 변경함에 의해, 검출 그래프의 파형이 변화하여, 각각 다른 면적비의 결과가 얻어지기 때문에, 이들 조건을 적의 변경함에 의하여, 시약 처방의 최적화를 행할 수 있다.

[실시예 4∼실시예 5]

실시예 4에서는, 제1 프라이머를, 조정용 부가 서열 및 축중 염기를 포함하는 2D6-P3F4-Int6-F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA : 서열 번호 13, 41mer, Tm값 67.6℃∼69.2℃)와, P3F4-sod2-R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC : 서열 번호 14, 44mer, Tm값 66℃∼67.3℃)로 각각 변경하고, 제2 프라이머를, 조정용 부가 염기 서열을 포함하는 PEN3 F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg : 서열 번호 12, 41mer, Tm값 69.4℃)로 변경해서, 표 12에 나타나는 처방에 따른 각 시약을 사용하여, PCR을, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 57℃에서 15초를 1사이클로 하여 5사이클 반복하고, 그 후, 95℃에서 1초 및 63℃에서 45초를 1사이클로 하여 45사이클 반복한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 해서 PCR 및 Tm 해석을 행했다.

실시예 5에서는, 각 프라이머의 양을 표 13에 나타나는 바와 같이 변경한 이외에는, 실시예 4와 마찬가지로 해서, PCR 및 Tm 해석을 행했다.

결과를 각각 표 14, 도 5 및 도 6에 나타낸다.

[표 12]

[표 13]

[표 14]

표 14, 도 5 및 도 6에 나타나는 바와 같이, 실시예 4 및 실시예 5에서는, 시료 a∼d 중의 표적 유전자의 카피수에 따라서 면적비가 커져, 카피수의 증가를 반영한 결과가 얻어졌다.

실시예 4는, 제1 프라이머보다도 Tm값이 높은 제2 프라이머를 사용함과 함께, 제3 프라이머보다도 적은 양의 제1 프라이머를 사용한 것이다. 실시예 5는, 실시예 4와 동일한 조합의 프라이머를 사용하고, 제3 프라이머보다도 많은 양의 제1 프라이머를 사용한 것이다. 어떠한 경우에도, 표 14, 도 5 및 도 6에 나타나는 바와 같이, 표적 유전자의 카피수의 증가를 적절히 반영한 결과를 얻을 수 있다.

[실시예 6∼8]

실시예 6∼8에서는, CYP2D6의 프로브를 3T-2D6-Int6-R2(gtacccttcctccc-(TAMRA) : 서열 번호 15)로 변경하고, 표 15에 나타나는 바와 같이 제2 프라이머(PEN3 F4)의 양을 각각 100nM(실시예 6), 400nM(실시예 7) 또는 1200nM(실시예 8)로 변경한 처방에 따른 각 시약을 사용한 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 해서 PCR 및 Tm 해석을 행했다.

결과를 각각 표 16 및 도 7에 나타낸다. 또, 도 7에서는, 실시예 6∼8 각각의 각 시료에 있어서의 면적비를, 표적 유전자(CYP2D6)의 양이 250카피/㎕일 때의 면적비를 100%로 했을 때의 비율로 나타낸다.

[표 15]

[표 16]

표 16 및 도 7에 나타나는 바와 같이, 실시예 6∼실시예 8에서는 제2 프라이머의 반응액 중의 존재량을 변경해도, 시료 a∼d 중의 표적 유전자의 카피수에 따라서 면적비가 커져, 카피수의 증가를 반영한 결과가 얻어졌다.

또한, 제2 프라이머의 양을, 반응액 중의 다른 프라이머의 양보다도 많게 하면 면적비의 증가율이 커지고, 적게 하면 면적비의 증가율이 작아지는 것을 알 수 있었다.

어떠한 경우에도, 표 16 및 도 7에 나타나는 바와 같이, 표적 유전자의 카피수의 증가를 적절히 반영한 결과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르면, 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의 유전자의 존재량을 종래의 기술보다도 정확히 또한 간편히 측정할 수 있다.

[실시예 9]

ALK 유전자의 5'측의 유전자 영역으로서, NCBI의 액세션 No. NM_004304.4의 2460∼2801번째의 염기 서열(서열 번호 24)과, 3'측의 유전자 영역으로서, 4690∼5031번째의 염기 서열(서열 번호 25)을, pcDNA3.1(+)에 삽입한 인공 핵산(플라스미드)으로부터 RNA를 합성하여, 표 17에 기재된 카피수를 포함하는 주형을 조제했다.

[표 17]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 18에 나타내는 프로브 및 각종 프라이머를 사용하고, 표 19에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, RT-PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 사용한 폴리머라제는, Taq 폴리머라제이다. 또한, PEN3 R2(공통 프라이머)는, 0, 2μM 또는 4μM 첨가했다.

55℃에서 15분 처리하여, 역전사 반응을 행했다.

PCR은, 역전사 반응 후의 시료를, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 58℃에서 15초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

또한 Tm 해석은, PCR 후, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃에서부터 75℃까지 온도를 상승시켜, 그 동안의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다.

여기 파장을 520㎚∼555㎚로 하고, 측정 파장을 585∼700㎚로 하여, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

5'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물은 51℃부근, 3'측의 유전자 영역 유래의 증폭 산물은 58℃부근에 각각 피크가 확인되는 것을 알 수 있다.

Tm값에 의거한 해석은, 면적 해석에 의거하여 행했다. 구체적으로는, 주형 a∼c에 대하여, Tm 해석의 결과로부터 미분 융해 곡선을 작성하여, 5'측의 유전자 영역 및 3'측의 유전자 영역의 각각의 Tm값과 각각의 면적을 얻어서, 5'측의 유전자 영역의 면적에 대한 3'측의 유전자 영역의 면적의 비를 구했다. 결과를 표 20 및 도 8에 나타낸다.

사용한 프라이머 및 프로브의 서열은 표 18에 기재된 바와 같다.

5'측의 유전자 영역은, 5'측의 유전자 영역에 대한 제1 프라이머; P3R2-ALK5'-R5(서열 번호 19, Tm값 70.5℃)와, 제3 프라이머; ALK5'-F2(서열 번호 18, Tm값 59.9℃)를 사용하여 증폭했다. 3'측의 유전자 영역은, 3'측의 유전자 영역에 대한 제1 프라이머; P3R2-ALK3'-R3(서열 번호 21, Tm값 70.1℃)과, 제3 프라이머; ALK3'-F3(서열 번호 20, Tm값 60.8℃)을 사용하여 증폭했다. 각각의 증폭 산물을, 상기 단일의 부가 염기 서열만으로 구성된 공통 프라이머인 제2 프라이머; PEN3 R2(서열 번호 22, Tm값 58.6℃)와, 각각의 제3 프라이머를 사용하여 증폭했다.

5'측의 유전자 영역에 대한 검출용 프로브(서열 번호 16) 및 3'측의 유전자 영역에 대한 검출용 프로브(서열 번호 17)는, 표 18에 기재된 바와 같다.

각 프라이머의 Tm값은, Meltcalc를 사용하여 산출한 값이다.

또, 표 18 중, 소문자로 표기한 염기 서열은, 단일의 부가 염기 서열을 나타낸다.

[표 18]

[표 19]

[표 20]

이상의 결과로부터, 본 발명에 따르면, 융합 유전자 변이의 존재의 유무를 간편히, 저가로 또한 정확히 측정할 수 있다.

2011년　10월　31일에 출원된 일본국 출원번호 제2011-238953호의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허출원, 및 기술 규격이 참조에 의해 도입되는 것이 구체적이며 또한 개개로 기재된 경우와 같은 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> METHOD FOR MEASURING ABUNDANCE OF GENES <130> G1446 <150> JP2011-238953 <151> 2011-10-31 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgagaacctg tgcatagtgg tggctgacct gttctctgcc gggatggtga ccacctcgac 60 cacgctggcc tggggcctcc tgctcatgat cctacatccg gatgtgcagc gtgagcccat 120 ctgggaaaca gtgcaggggc cgagggagga agggtacagg cgggggccca tgaactttgc 180 tgggacaccc ggggctccaa gcacaggctt gaccaggatc ctgtaagcct gacctcctcc 240 aacataggag gcaagaagga gtgtcagggc cggaccccct gggtgctgac ccattgtggg 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cctatgacaa aaatatttta atacatgtaa tataacattt tactgtaatt attgaaatct 60 gttcatttgt gggtggtttt ggattttttt tttaataggg gagttgctgg aagccatcaa 120 acgtgacttt ggttcctttg acaagtttaa ggagaagctg acggctgcat ctgttggtgt 180 ccaaggctca ggttggggtt ggcttggttt caataaggaa cggggacact tacaaattgc 240 tgcttgtcca aatcaggatc cactgcaagg aacaacaggt tagatttaaa aattgtgatt 300 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2D6-P3F4-Int6r-F1; primer <400> 3 cgctgtagtc gaagacgatg tttacgtgag cccatctggg aaaca 45 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2D6-Int6f-R1; primer <400> 4 ggtgtcccag caaagttcat g 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sod2-F1; primer <400> 5 ggagaagctg acggctgc 18 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P3F4-sod2-R3; primer <400> 6 cgctgtagtc gaagacgatg tttacgcctt attgaaacca agccaacc 48 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PEN3 F4; primer <400> 7 cgctgtagtc gaagacgatg tttacg 26 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3T-2D6-Int6-R1; probe <400> 8 ctgtaccctt cctccc 16 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5T-sod2-F1-25; probe <400> 9 catctgttgg tgtccaaggc tcagg 25 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2D6-Int6r-F1; primer <400> 10 tgagcccatc tgggaaaca 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sod2-R1; primer <400> 11 ccttattgaa accaagccaa cc 22 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PEN3 F4+CTACG; primer <400> 12 ctacgctacg ctacgcgctg tagtcgaaga cgatgtttac g 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2D6-P3F4-Int6r-F2; primer <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> c, g or t <400> 13 gtagtcgaag acgatgttta cgtgagccca tctgggbaac a 41 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P3F4-sod2-R4; primer <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> a, g or t <400> 14 gtagtcgaag acgatgttta cgccttattg aaaccaagcd aacc 44 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3T-2D6-Int6-R2; probe <400> 15 gtacccttcc tccc 14 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5T-ALK5'-F2; probe <400> 16 ctcattcgtg gagtct 16 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3T-ALK3'-F2; probe <400> 17 ggaaggaata ttcac 15 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ALK5'-F2; primer <400> 18 tctccatgtg agctccgaat gtcc 24 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P3R2-ALK5'-R5; primer <400> 19 cgatcctgtt tcttagctta gtcaagatcc ccttgctcct tcccggtttt gttc 54 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ALK3'-F3; primer <400> 20 ggatgccccc agaggccttc 20 <210> 21 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P3R2-ALK3'-R3; primer <400> 21 cgatcctgtt tcttagctta gtcaagatcc tagcagcact ccaaaggacc atgtg 55 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PEN3 R2 ; primer <400> 22 cgatcctgtt tcttagctta gtcaagatcc 30 <210> 23 <211> 3926 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggcggcgcgg cgcggcgctc gcggctgctg cctgggaggg aggccgggca ggcggctgag 60 cggcgcggct ctcaacgtga cggggaagtg gttcgggcgg ccgcggctta ctaccccagg 120 gcgaacggac ggacgacgga ggcgggagcc ggtagccgag ccgggcgacc tagagaacga 180 gcgggtcagg ctcagcgtcg gccactctgt cggtccgctg aatgaagtgc ccgcccctct 240 gagcccggag cccggcgctt tccccgcaag atggacggtt tcgccggcag tctcgatgat 300 agtatttctg ctgcaagtac ttctgatgtt caagatcgcc tgtcagctct tgagtcacga 360 gttcagcaac aagaagatga aatcactgtg ctaaaggcgg ctttggctga tgttttgagg 420 cgtcttgcaa tctctgaaga tcatgtggcc tcagtgaaaa aatcagtctc aagtaaaggc 480 caaccaagcc ctcgagcagt tattcccatg tcctgtataa ccaatggaag tggtgcaaac 540 agaaaaccaa gtcataccag tgctgtctca attgcaggaa aagaaactct ttcatctgct 600 gctaaaagtg gtacagaaaa aaagaaagaa aaaccacaag gacagagaga aaaaaaagag 660 gaatctcatt ctaatgatca aagtccacaa attcgagcat caccttctcc ccagccctct 720 tcacaacctc tccaaataca cagacaaact ccagaaagca agaatgctac tcccaccaaa 780 agcataaaac gaccatcacc agctgaaaag tcacataatt cttgggaaaa ttcagatgat 840 agccgtaata aattgtcgaa aataccttca acacccaaat taataccaaa agttaccaaa 900 actgcagaca agcataaaga tgtcatcatc aaccaagaag gagaatatat taaaatgttt 960 atgcgcggtc ggccaattac catgttcatt ccttccgatg ttgacaacta tgatgacatc 1020 agaacggaac tgcctcctga gaagctcaaa ctggagtggg catatggtta tcgaggaaag 1080 gactgtagag ctaatgttta ccttcttccg accggggaaa tagtttattt cattgcatca 1140 gtagtagtac tatttaatta tgaggagaga actcagcgac actacctggg ccatacagac 1200 tgtgtgaaat gccttgctat acatcctgac aaaattagga ttgcaactgg acagatagct 1260 ggcgtggata aagatggaag gcctctacaa ccccacgtca gagtgtggga ttctgttact 1320 ctatccacac tgcagattat tggacttggc acttttgagc gtggagtagg atgcctggat 1380 ttttcaaaag cagattcagg tgttcattta tgtgttattg atgactccaa tgagcatatg 1440 cttactgtat gggactggca gaagaaagca aaaggagcag aaataaagac aacaaatgaa 1500 gttgttttgg ctgtggagtt tcacccaaca gatgcaaata ccataattac atgcggtaaa 1560 tctcatattt tcttctggac ctggagcggc aattcactaa caagaaaaca gggaattttt 1620 gggaaatatg aaaagccaaa atttgtgcag tgtttagcat tcttggggaa tggagatgtt 1680 cttactggag actcaggtgg agtcatgctt atatggagca aaactactgt agagcccaca 1740 cctgggaaag gacctaaagt gtaccgccgg aagcaccagg agctgcaagc catgcagatg 1800 gagctgcaga gccctgagta caagctgagc aagctccgca cctcgaccat catgaccgac 1860 tacaacccca actactgctt tgctggcaag acctcctcca tcagtgacct gaaggaggtg 1920 ccgcggaaaa acatcaccct cattcggggt ctgggccatg gagcctttgg ggaggtgtat 1980 gaaggccagg tgtccggaat gcccaacgac ccaagccccc tgcaagtggc tgtgaagacg 2040 ctgcctgaag tgtgctctga acaggacgaa ctggatttcc tcatggaagc cctgatcatc 2100 agcaaattca accaccagaa cattgttcgc tgcattgggg tgagcctgca atccctgccc 2160 cggttcatcc tgctggagct catggcgggg ggagacctca agtccttcct ccgagagacc 2220 cgccctcgcc cgagccagcc ctcctccctg gccatgctgg accttctgca cgtggctcgg 2280 gacattgcct gtggctgtca gtatttggag gaaaaccact tcatccaccg agacattgct 2340 gccagaaact gcctcttgac ctgtccaggc cctggaagag tggccaagat tggagacttc 2400 gggatggccc gagacatcta cagggcgagc tactatagaa agggaggctg tgccatgctg 2460 ccagttaagt ggatgccccc agaggccttc atggaaggaa tattcacttc taaaacagac 2520 acatggtcct ttggagtgct gctatgggaa atcttttctc ttggatatat gccatacccc 2580 agcaaaagca accaggaagt tctggagttt gtcaccagtg gaggccggat ggacccaccc 2640 aagaactgcc ctgggcctgt ataccggata atgactcagt gctggcaaca tcagcctgaa 2700 gacaggccca actttgccat cattttggag aggattgaat actgcaccca ggacccggat 2760 gtaatcaaca ccgctttgcc gatagaatat ggtccacttg tggaagagga agagaaagtg 2820 cctgtgaggc ccaaggaccc tgagggggtt cctcctctcc tggtctctca acaggcaaaa 2880 cgggaggagg agcgcagccc agctgcccca ccacctctgc ctaccacctc ctctggcaag 2940 gctgcaaaga aacccacagc tgcagaggtc tctgttcgag tccctagagg gccggccgtg 3000 gaagggggac acgtgaatat ggcattctct cagtccaacc ctccttcgga gttgcacagg 3060 gtccacggat ccagaaacaa gcccaccagc ttgtggaacc caacgtacgg ctcctggttt 3120 acagagaaac ccaccaaaaa gaataatcct atagcaaaga aggagccaca cgagaggggt 3180 aacctggggc tggagggaag ctgtactgtc ccacctaacg ttgcaactgg gagacttccg 3240 ggggcctcac tgctcctaga gccctcttcg ctgactgcca atatgaagga ggtacctctg 3300 ttcaggctac gtcacttccc ttgtgggaat gtcaattacg gctaccagca acagggcttg 3360 cccttagaag ccgctactgc ccctggagct ggtcattacg aggataccat tctgaaaagc 3420 aagaatagca tgaaccagcc tgggccctga gctcggtcac acactcactt ctcttccttg 3480 ggatccctaa gaccgtggag gagagagagg caatcaatgg ctccttcaca aaccagagac 3540 caaatgtcac gttttgtttt gtgccaacct attttgaagt accaccaaaa aagctgtatt 3600 ttgaaaatgc tttagaaagg ttttgagcat gggttcatcc tattctttcg aaagaagaaa 3660 atatcataaa aatgagtgat aaatacaagg cccagatgtg gttgcataag gtttttatgc 3720 atgtttgttg tatacttcct tatgcttctt ttaaattgtg tgtgctctgc ttcaatgtag 3780 tcagaattag ctgcttctat gtttcatagt tggggtcata gatgtttcct tgccttgttg 3840 atgtggacat gagccatttg aggggagagg gaacggaaat aaaggagtta tttgtaatga 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3926 <210> 24 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'-end sequence of alk <400> 24 tcaggaccct aaaggatgcc cggttccagg accaccaaga ccatgctcta ttgctcagta 60 ccactgatgt ccccgcttct gaaagtgcta cagtgaccag tgctacgttt cctgcaccga 120 tcaagagctc tccatgtgag ctccgaatgt cctggctcat tcgtggagtc ttgaggggaa 180 acgtgtcctt ggtgctagtg gagaacaaaa ccgggaagga gcaaggcagg atggtctggc 240 atgtcgccgc ctatgaaggc ttgagcctgt ggcagtggat ggtgttgcct ctcctcgatg 300 tgtctgacag gttctggctg cagatggtcg catggtgggg ac 342 <210> 25 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3'-end sequence of alk <400> 25 ccaccgagac attgctgcca gaaactgcct cttgacctgt ccaggccctg gaagagtggc 60 caagattgga gacttcggga tggcccgaga catctacagg gcgagctact atagaaaggg 120 aggctgtgcc atgctgccag ttaagtggat gcccccagag gccttcatgg aaggaatatt 180 cacttctaaa acagacacat ggtcctttgg agtgctgcta tgggaaatct tttctcttgg 240 atatatgcca taccccagca aaagcaacca ggaagttctg gagtttgtca ccagtggagg 300 ccggatggac ccacccaaga actgccctgg gcctgtatac cg 342

Claims (24)

1. 하나의 반응액에서, 대상 샘플 중의 핵산에서의 유전자의 존재량이 상이할 수 있는 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산을, 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머를 포함하고, 상기 제2 프라이머의 존재량이, 상기 제1 프라이머 세트를 구성하는 제1 프라이머 중 존재량이 가장 많은 제1 프라이머의 존재량에 비해 4배량∼20배량(몰비)인 상기 반응액을 사용해서, 핵산 증폭을 행하여, 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 증폭 산물을 얻는 공정,
   상기 적어도 2종의 증폭 산물의 존재량에 의거한 각각의 시그널을 검출하여, 당해 시그널로부터 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 측정하는 공정,
   을 이 순서로 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법 :
   상기 핵산에서의 유전자의 존재량은, 게놈 DNA에 있어서의 유전자의 카피수이며,
   상기 증폭 산물을 얻는 공정에 있어서의 상기 반응액은, 상기 적어도 2종의 증폭 산물을 각각 인식하는, 동일한 형광 색소로 표지된 적어도 2종의 검출용 프로브를 더 포함하고,
   상기 존재량을 측정하는 공정에 있어서의 상기 시그널은, 상기 적어도 2종의 증폭 산물과, 각각에 대응하는 상기 적어도 2종의 검출용 프로브가 해리할 때의, 적어도 2개의 형광 강도의 변동이며,
   상기 존재량을 측정하는 공정은,
   상기 적어도 2종의 검출용 프로브 및 상기 적어도 2종의 증폭 산물을 접촉시켜서, 하이브리드 형성체를 얻는 하이브리다이제이션 공정과,
   상기 하이브리드 형성체를 함유하는 상기 반응액의 온도를 변화시킴에 의해, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거하여 상기 적어도 2개의 형광 강도의 변동을 동일 파장에서 측정하는 측정 공정과,
   상기 적어도 2개의 형광 강도의 변동에 의거하여 상기 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm값을 검출하는 Tm값 검출 공정과,
   상기 Tm값에 의거하여, 면적 해석해서, 상기 대상 샘플 중의 핵산에 있어서의, 목적으로 하는 증폭산물의 존재 또는 존재비를 검출하는 존재비 검출 공정
   을 이 순서로 포함한다.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열과, 각각의 상기 유전자를 코딩하는 핵산의 증폭 대상 영역의 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 유전자의 존재량의 측정 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제2 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열 또는 그 상보적인 염기 서열에 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 유전자의 존재량의 측정 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 단일의 부가 염기 서열이, 상기 적어도 2개의 유전자를 코딩하는 핵산의 각 증폭 대상 영역 중의 염기 서열과는 비상동적(非相同的)인 염기 서열로 이루어지는 유전자의 존재량의 측정 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제1 프라이머 세트가, 상기 제1 프라이머와, 당해 제1 프라이머가 하이브리다이즈하는 염기 서열의 상보쇄측의 염기 서열을 증폭하기 위하여 사용되며 또한 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제3 프라이머를 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 반응액에서의 상기 제3 프라이머의 존재량이, 상기 반응액에서의 상기 제1 프라이머의 존재량에 비하여, 0.25배량∼4배량(몰비)인 유전자의 존재량의 측정 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 제1 프라이머가, 증폭 대상 영역의 염기 서열에 대하여 미스매치 염기 및 축중(縮重) 염기로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한쪽을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 제2 프라이머의 Tm값이, 상기 제1 프라이머의 각 Tm값보다도 높은 유전자의 존재량의 측정 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 제2 프라이머가, 상기 단일의 부가 염기 서열 및 그 상보적인 염기 서열과는 다른 부가 서열을 더 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 유전자의 적어도 1개는, 대상 샘플 중의 핵산에서의 존재량이 미리 판명되어 있는 참조 유전자이며, 적어도 1개는 대상 샘플 중의 핵산에서의 존재량의 측정 대상으로 되는 표적 유전자인 유전자의 존재량의 측정 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 참조 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 상기 표적 유전자 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 상기 표적 유전자의 대상 샘플 중의 핵산에서의 존재량을 결정하는 것을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.
12. 제1항에 있어서,
    상기 대상 샘플 중의 핵산이, 융합 유전자를 구성하는 적어도 1개의 유전자를 포함하고, 상기 적어도 2개의 유전자의 적어도 1개는, 상기 융합 유전자의 융합점보다도 상류의 5'측의 염기 서열에 상당하는 서열이며, 적어도 1개는, 상기 융합 유전자의 융합점보다도 하류의 3'측의 염기 서열에 상당하는 서열인 유전자의 존재량의 측정 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 5'측의 염기 서열에 상당하는 서열 유래의 증폭 산물의 검출 시그널과, 상기 3'측의 염기 서열에 상당하는 서열 유래의 증폭 산물의 검출 시그널을 비교하여, 샘플 중에서의 상기 융합 유전자의 존재를 검출하는 것을 포함하는 유전자의 존재량의 측정 방법.
14. 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와,
    상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머와,
    상기 적어도 2개의 유전자의 핵산 증폭 영역에 각각 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 가지며 또한 동일한 형광 색소의 표지를 구비한 적어도 2개의 검출용 프로브
    를 포함하는 제1항에 기재된 유전자의 존재량의 측정 방법을 위한 유전자 측정 키트.
15. 단일의 부가 염기 서열을 증폭 산물에 도입 가능하며 또한 상기 적어도 2개의 유전자의 각각에 대응한 적어도 2종의 제1 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트와,
    상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 제2 프라이머와,
    상기 제1 프라이머가 하이브리다이즈하는 염기 서열의 상보쇄측의 염기 서열을 증폭하기 위하여 사용되며 또한 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하지 않는 제3 프라이머와,
    상기 적어도 2개의 유전자의 핵산 증폭 영역에 각각 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 가지며 또한 동일한 형광 색소의 표지를 구비한 적어도 2개의 검출용 프로브
    를 포함하는 제5항에 기재된 유전자의 존재량의 측정 방법을 위한 유전자 측정 키트.
16. 상기 제1 프라이머에 의해 도입된 상기 단일의 부가 염기 서열을 포함하며 또한 제2 프라이머에 의하여 핵산 증폭된 상기 적어도 2개의 유전자에 대응하는 증폭 산물의 존재량에 의거한 적어도 2개의 시그널을 검출하는 검출 장치와,
    상기 검출 장치에 의해 검출된 상기 적어도 2개의 검출 시그널을 대비하여, 상기 적어도 2개의 유전자의 존재량을 연산하는 연산 장치
    를 포함하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 유전자의 존재량의 측정 방법을 실시하는 유전자 측정 시스템.
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