WO2011036883A1 - 抗インフルエンザウイルス剤 - Google Patents

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extract
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karin
viral
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清水　一史
玲子 黒田
貴仁 ▲高▼瀬
紗奈恵 菊池
桜井　孝治
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株式会社ロッテ
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    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Definitions

  • the present invention relates to an anti-influenza virus agent, an influenza virus adsorption inhibitor, a virus mRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, and a virus vRNA in influenza virus-infected cells, which contains a plant-derived extract having an influenza virus infection-suppressing action as an active ingredient.
  • the present invention relates to a synthesis inhibitor, a viral cRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, a hemolysis inhibitor in a viral membrane fusion activity test, and an influenza virus envelope disruptor.
  • the influenza virus that causes the influenza epidemic is an RNA virus having an envelope membrane with a diameter of about 1 / 10,000 mm. Although it is classified into three types, A, B, and C, due to the difference in antigenicity, it is A type and B type that show a trendy spread. Two types of glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), protrude in the form of spikes on the surface of these virus particles, and gene RNA segmented into 8 segments exists inside. HA and NA on the surface of the virus frequently mutate within the same subtype, and new antigenic variants appear every year.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • Influenza virus released by cough droplets enters from the human nose and mouth, adsorbs to the mucosal epithelial cells of the upper respiratory tract by the spike-like glycoprotein HA on the surface of the virus, and begins to proliferate after entering the cells.
  • Recent research has revealed the mechanism of viral infection.
  • the virus binds to a receptor consisting of a sugar chain on the surface layer of human target cells, is taken into the endosome, enters the cell by fusion of the viral membrane and endosomal membrane, undergoes shelling and translocation, and the expression of the viral gene Replication occurs, and finally progeny virus particles are formed and propagated by budding from the host cell membrane.
  • influenza virus causes symptoms such as sudden fever, headache, joint pain, general malaise in a few days, followed by respiratory symptoms such as cough, sore throat, runny nose and stuffy nose. Unlike the so-called cold, it is highly infectious and causes an explosive epidemic in a short period of time.
  • the structure of the HA protein of influenza virus repeats mutations every year, and the fact that antibodies made by past infections are not very useful is also a factor that spreads infection.
  • antiviral drugs such as amantadine, rimantadine, and zanamivir have been developed, but side effects such as hypersensitivity, neuropsychiatric symptoms, digestive system symptoms, and autonomic nervous system symptoms have been reported. Caution must be taken.
  • influenza viruses are thought to be difficult to suppress by vaccination because influenza viruses infect and proliferate in the airway mucosal epithelium and the epidemic type of the year cannot be accurately predicted. Frequent gargling, avoiding throat dryness, and adequate nutrition and rest are currently considered the most effective preventive measures. Development of an anti-influenza virus agent that is highly effective in suppressing infection and has no safety problems and can be used on a daily basis is desired.
  • Non-patent Documents 1 and 2 polyphenol components of tea and black tea have been reported as anti-influenza materials derived from natural products (Non-patent Documents 1 and 2), and it has become clear that gargle of black tea suppresses actual viral infections through tests using humans. (Non-Patent Document 3). In addition, it has been reported that ougon-derived flavonoid components exhibit an influenza infection suppression effect due to viral sialidase inhibitory activity (Non-patent Document 4).
  • Patent Document 1 Kameda Futoshi Koshiketsu
  • Patent Document 2 Kuroburi Currant Extract
  • Patent Document 3 Potato Anthocyanin Pigment
  • Patent Document 4 Guava Leaf Extract
  • an anti-influenza agent containing an extract of the flower bud or petal as an active ingredient is disclosed (Patent Document 6), an extract of Karin (Patent Document 8), and a column fraction of Karin.
  • the anti-influenza virus effect of is reported.
  • influenza virus adsorption inhibitory effect of the column fraction of Karin shown in the patent of the present invention, the viral mRNA synthesis inhibitory effect in influenza virus-infected cells, the virus vRNA synthesis inhibitory effect in influenza virus-infected cells, and the virus cRNA in influenza virus-infected cells
  • the synthesis inhibitory effect the hemolysis inhibitory effect in the virus membrane fusion activity test, and the envelope destruction effect of influenza virus, which have been revealed for the first time by the present invention.
  • An object of the present invention is to use a highly safe plant extract that can be used with peace of mind on a daily basis, an influenza virus adsorption inhibitor, a virus mRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, and a virus vRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells. It is intended to provide an agent, a virus replication inhibitor in influenza virus-infected cells, a hemolysis inhibitor in a virus membrane fusion activity test, and an influenza virus envelope disruptor.
  • the present inventors focused on highly safe kalin without side effects, and used RT-PCR analysis of mRNA, vRNA and cRNA in MDCK cells added with influenza virus, and chicken erythrocytes. The effect of the extract of karin on hemolysis and observation of virus particles with an electron microscope was found, and the product of the present invention was completed.
  • the present invention relates to an influenza virus adsorption inhibitor characterized by comprising an extract of karin (Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis), a viral mRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, and a virus in influenza virus-infected cells.
  • karin Choenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis
  • a viral mRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells and a virus in influenza virus-infected cells.
  • They are a vRNA synthesis inhibitor, a viral cRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, a hemolysis inhibitor in a viral membrane fusion activity test, and an influenza virus envelope disruptor.
  • this invention is the food-drinks which have an anti-influenza virus effect
  • the present invention comprises a highly safe extract of karin as an active ingredient, an influenza virus adsorption inhibitor strong against influenza virus, a virus mRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells, a virus vRNA synthesis inhibitor in influenza virus-infected cells,
  • the present invention provides a virus replication inhibitor in influenza virus-infected cells, a hemolysis inhibitor in a virus membrane fusion activity test, and an envelope disruptor for influenza virus.
  • the extract of Karin which is an active ingredient of the present invention, has high safety, it can be adsorbed, impregnated and added to a mask, an air conditioner filter, clothing, wet tissue, a spray solution, etc. Can be widely used in daily life.
  • the product of the present invention is effective in preventing influenza virus infection and treating diseases caused by influenza virus.
  • the destruction activity to the viral envelope membrane of a karin extract is shown.
  • the adsorption inhibitory activity, vRNA synthesis inhibitory activity, mRNA synthesis inhibitory activity, and cRNA synthesis inhibitory activity of the karin extract are shown.
  • the hemolysis inhibitory activity of a karin extract is shown.
  • ⁇ It is desirable to use the fruits of karin as the raw material for the product of the present invention.
  • the method for obtaining the extract of the present invention from the pulverized plant is not particularly limited, but water, methanol, ethanol, n-propanol, and lower alcohols such as n-butanol, ether, ethyl acetate, acetone, glycerin, propylene glycol.
  • One or two or more mixed solvents of organic solvents such as these are added, and extraction is performed by a conventional extraction method.
  • the extraction condition is not particularly limited, but it is preferably about 1 to 5 hours at 50 to 90 ° C.
  • the extract can be filtered and the extraction solvent can be distilled off, followed by concentration or lyophilization under reduced pressure. Further, those obtained by fractionating and purifying these extracts by organic solvent fractionation, column chromatography or the like can also be used.
  • the form of use of the product of the present invention is not particularly limited, and powders, tablets, troches can be obtained by adding a solvent, a dispersant, a pharmaceutical carrier, an emulsifier, a diluent, a stabilizer, etc. to the plant extract exemplified as an active ingredient.
  • a solvent e.g., ethanol
  • emulsifier e.g., a sulfate
  • a diluent e.g., diluent
  • a diluent emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent emulsifier
  • a diluent e.g., diluent
  • a stabilizer e.g., a stabilizer, etc.
  • the plant extract exemplified as an active ingredient.
  • an infection control product that can contribute to influenza prevention can be provided.
  • the amount of adsorbed and added plant extract in these applications varies depending on the form of the infection control product, and cannot be specified in general, but is added so that the proportion is 0.001 to 5% by weight. Is preferred.
  • the present invention is highly safe, for example, it is blended into confectionery such as chewing gum, candy, tablet confectionery, gummy jelly, chocolate and biscuits, ice cream, sorbet and other frozen confectionery, beverages, soups, jams and other food and drink, Can be used.
  • confectionery such as chewing gum, candy, tablet confectionery, gummy jelly, chocolate and biscuits, ice cream, sorbet and other frozen confectionery, beverages, soups, jams and other food and drink, Can be used.
  • the amount to be added varies depending on the form of use and the taste of the extract, but it is added in an amount of 0.001 to 5% by weight, preferably about 0.01 to 1% by weight based on the food or drink. Is preferred.
  • a reflux condenser is attached to a flask to which 300 g of dried Karin fruit and 3000 ml of 50% ethanol are added, and extraction is performed while refluxing for 1 hour. The obtained extract was filtered, the solvent was removed, and freeze-dried to obtain 69 g of extract.
  • the Karin 50% ethanol extract was applied to a Diaion HP20 (Mitsubishi Kasei) column. Elution was carried out in the order of water, 20% ethanol, 40% ethanol, and 60% ethanol. The component (CSD3) eluted with this ethanol concentration 40% aqueous solution was collected. The yield of this fraction was about 8.6 g as dry weight.
  • the phenol content of this product by the vanillin-hydrochloric acid method was 54% [based on ( ⁇ )-epicatechin], and it was confirmed that it mainly contained phenolic substances.
  • Viral adsorption inhibitory effect, vRNA synthesis inhibitory effect, mRNA synthesis inhibitory effect, and cRNA synthesis inhibitory effect by CSD3 were extracted from viral RNA and analyzed by RT-PCR.
  • a sample stock solution was prepared by dissolving CSD3 in 50% ethanol to 50 mg / ml.
  • Sample stock solutions are appropriately diluted with Tris-Glucose-Saline (TGS) (from 10 2 to 10 6- fold dilution), and 50 ⁇ l of these sample dilutions and virus solution (4 ⁇ 10 4 to 4 ⁇ 10 6 PFU (place forming unit) ) / Ml) 50 ⁇ l was mixed and allowed to react at room temperature for 10 minutes.
  • TGS Tris-Glucose-Saline
  • 0.1 ml of this was inoculated into a single-layer culture (6-well plate) of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells to which 0.4 ml of TGS was added, and the virus was adsorbed at room temperature for 30 minutes. After removing 0.5 ml of the culture solution and culturing at 37 ° C. for 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 hours, the viral genomic RNA in the infected cells was dissolved in guanidine thiocyanate 25% It was recovered by ethanol precipitation. Details of the cDNA synthesis method and the PCR amplification method from RNA in each test method are shown below.
  • RNA a reverse transcriptase reaction was carried out using Super Script III (Invitrogen) reverse transcriptase and T7 cRNA (1-12) primer according to the attached instructions to synthesize vRNA cDNA.
  • PCR amplification was performed with a set of oligonucleotide primers specific to the virus (Udorn) NP gene. PCR was performed for 45 cycles (5 seconds, 95 ° C., 34 seconds, 64 ° C.) using SYBR Premix taq polymerase II (Invitrogen).
  • the number of vRNA copies per hole obtained is shown in FIG.
  • the adsorption copy number of CSD3 untreated virus at 0 hour was 6.7 ⁇ 10 8 / hole, but it was 2.2 ⁇ 10 8 / hole by 1 ⁇ g / ml CSD3 treatment, and adsorption was suppressed to about 1/3.
  • the amount of vRNA synthesized by the CSD3 untreated virus was 2.2 ⁇ 10 10 / well (after 12 hours of culture), whereas that of CSD3 treated at 1 ⁇ g / ml was 3.2 ⁇ 10 8 / well, and the amount of vRNA synthesized was about Reduced to 1/70.
  • RNA synthesis inhibition test In the virus primary / secondary transcription inhibition test by CSD3, reverse transcription was performed using reverse transcriptase and T7T (18) VN primer to synthesize mRNA cDNA. PCR was amplified with a set of oligonucleotide primers specific to the NP gene using the synthesized cDNA as a template. PCR was performed for 45 cycles (5 seconds, 95 ° C., 34 seconds, 64 ° C.) using SYBR Premix taq polymerase II (Invitrogen).
  • the number of mRNA copies per hole obtained is shown in FIG.
  • the copy number of mRNA of CSD3 untreated virus was 2.6 ⁇ 10 10 / well (after 12 hours of culture), whereas that of CSD3 treatment at 1 ⁇ g / ml was 4.3 ⁇ 10 7 / well, and the amount of mRNA synthesis was about Reduced to 1/600.
  • CRNA synthesis inhibition test In the viral replication stage suppression test using CSD3, reverse transcription was performed using reverse transcriptase and T7 vRNA (1-13) primer to synthesize cRNA cDNA. PCR was amplified with a set of oligonucleotide primers specific to the NP gene using the synthesized cDNA as a template. PCR was performed for 45 cycles (5 seconds, 95 ° C., 34 seconds, 64 ° C.) using SYBR Premix taq polymerase II (Invitrogen). The number of copies of cRNA obtained for each well is shown in FIG.
  • CSD3 untreated virus cRNA copy number was 9.7 ⁇ 10 6 / well (after 8 hours of culture), whereas 1 ⁇ g / ml CSD3 treatment was 2.5 ⁇ 10 4 / well, and the amount of cRNA synthesis was about Reduced to 1/400.
  • CSD3 was added to the virus (16000HA) and kept at room temperature for 1 hour. Observation of the virus particles with an electron microscope was performed by a negative staining method with 2% uranium acetate.
  • FIG. 1 is an electron microscopic image showing the disrupting activity of a karin extract (CSD3) on the virus envelope membrane, (a) shows the case of adding the karin extract, and (b) shows no addition of the karin extract. Show the case.
  • Prescription ethanol of spray liquid 25.0% by weight Citric acid 1.5% by weight Trisodium citrate 1.0 wt% CSD3 0.5 wt% Water remaining 100.0% by weight
  • Prescription sugar for tablet candy 76.1% by weight Glucose 19.0% by weight Sucrose fatty acid ester 0.2% by weight Fragrance 0.2 wt% CSD3 0.5 wt% Water remaining 100.0% by weight

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Abstract

　日常的に安心して使用できる安全性の高い植物抽出物を用いる、インフルエンザウイルス吸着抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｃＲＮＡ合成抑制剤、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤の提供。カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。

Description

抗インフルエンザウイルス剤
　本発明はインフルエンザウイルスの感染抑制作用を有する植物由来の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤、インフルエンザウイルス吸着抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｃＲＮＡ合成抑制剤、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤に関するものである。
　毎年のようにインフルエンザの流行を引き起こすインフルエンザウイルスは直径１万分の１ミリメートル程度のエンベロープ膜を有するＲＮＡウイルスである。その抗原性の違いからＡ、Ｂ、Ｃの３つの型に分類されるが、流行的な広がりをみせるのはＡ型、Ｂ型である。これらのウイルスの粒子表面には、赤血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）という２種類の糖蛋白がスパイク状に突き出しており、内部には８本に分節した遺伝子ＲＮＡが存在する。ウイルスの表面にあるＨＡとＮＡは同一の亜型内で変異を頻繁に起こし、毎年のように新しい抗原変異株が出現する。
　咳による飛沫によって放出されたインフルエンザウイルスはヒトの鼻や口から侵入し、ウイルス表層のスパイク状糖蛋白質ＨＡにより上気道の粘膜上皮細胞に吸着し、細胞へ侵入後増殖を開始する。近年の研究により、ウイルスの感染メカニズムが明らかにされている。ウイルスはヒトの標的細胞の表層に存在する糖鎖よりなるレセプターに結合し、エンドゾームへ取り込まれ、ウイルス膜とエンドゾーム膜の融合により細胞内に侵入し、脱殻・移行を経て、ウイルス遺伝子の発現と複製がおこり、最後に宿主細胞膜からの出芽により子孫ウイルス粒子を形成し増殖する。
　インフルエンザウイルスの感染により数日で突然の発熱、頭痛、関節の痛み、全身倦怠感等の症状が現れ、それと前後して咳や喉の痛み、鼻水、鼻づまりなどの呼吸器症状が出現する。いわゆる風邪とは異なり、感染力が強く短期間で爆発的な流行を引き起こすのが特徴である。またインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質の構造は年ごとに変異を繰り返し、過去の感染によりできた抗体があまり役に立たないことも感染を広げてしまう要因になっている。
　インフルエンザウイルスの感染を抑制するためには、上皮細胞への吸着の阻害、細胞への侵入の阻害、遺伝子の転写・複製の抑制、蛋白質の合成阻害、細胞からの放出の抑制などが考えられ、それぞれが抗ウイルス薬のターゲットになっている。現在までに、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル等の抗ウイルス薬が開発されているが、過敏症、精神神経症状、消化器系症状、自律神経系症状等の副作用が報告されており、その応用に関しては注意が必要である。
　またインフルエンザウイルスは気道粘膜上皮で感染、増殖することや、その年の流行型が正確には予想できないことから、ワクチンの接種によって感染を抑えることも困難であると考えられている。頻繁なうがいと、喉の乾燥を避けること、栄養と休息を十分にとることなどが、現在最も有効な予防策と考えられている。感染抑制効果が高く、さらに安全性に問題がなく、日常的に利用できる抗インフルエンザウイルス剤の開発が望まれている。
　近年、天然物由来の抗インフルエンザ素材としてお茶や紅茶のポリフェノール成分が報告されており（非特許文献１及び２）、人を用いた試験により紅茶のうがいが実際のウイルス感染を抑えることが明らかになっている（非特許文献３）。またオウゴン由来のフラボノイド成分が、ウイルスのシアリダーゼ阻害活性によりインフルエンザ感染抑制効果を示すことが報告されている（非特許文献４）。さらに漢方製剤である桂枝二越婢一湯（特許文献１）、黒房すぐり抽出物（特許文献２）、馬鈴薯アントシアニン色素（特許文献３）、グァバ葉抽出物（特許文献４）、羅布麻抽出物（特許文献５）等の抗ウイルス効果が報告されている。
　また、バラ科植物においては、その花蕾または花弁の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザ剤が開示されており（特許文献６）、カリンの抽出物（特許文献８）、カリンのカラム分画物（非特許文献５）の抗インフルエンザウイルス効果が報告されている。しかしながら、本願発明特許に示したカリンのカラム分画物のインフルエンザウイルス吸着抑制効果、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制効果、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制効果、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｃＲＮＡ合成抑制効果、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制効果及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊効果に関する報告はみられず、本願発明により初めて明らかにされたものである。
特開平６－１９９６８０号公報 特開２０００－２１２０９２公報 特開２００１－３１６３９９公報 特開２０００－２７３０４８公報 特開平１１－７１２９６号公報 特開２００２－1４５７９０公報 特表２００２－０２０３０５公報 特開２００５－３４３８３６号公報
感染症学雑誌，６８（７）８２４－８２９（１９９４） 感染症学雑誌，７０（１１）１１９０－１１９２（１９９６） 感染症学雑誌，７１（６）４８７－４９４（１９９７） Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８（５）１３２９－１３３２（１９９０） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，　１１８，１０８－１１２（２００８）
　本発明の目的は、日常的に安心して使用できる安全性の高い植物抽出物を用いて、インフルエンザウイルス吸着抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルス複製抑制剤、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤を提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明者らは副作用がなく安全性の高いカリンに着目し、インフルエンザウイルスを添加したＭＤＣＫ細胞におけるｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ法解析、ニワトリ赤血球を用いた溶血反応、ウイルス粒子の電子顕微鏡観察に対する、カリンの抽出物の効果を見出し、本発明品を完成させた。
　すなわち、本発明は、カリン（Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis）の抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス吸着抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｃＲＮＡ合成抑制剤、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤である。さらに、本発明は、カリン抽出物を含有する抗インフルエンザウイルス作用を有する飲食品である。
　本発明は安全性の高いカリンの抽出物を有効成分とし、インフルエンザウイルスに対して強いインフルエンザウイルス吸着抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤、インフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルス複製抑制剤、ウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤及びインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤を提供するものである。また、本発明の有効成分であるカリンの抽出物は安全性が高いことから、マスク、エアコンフィルター、衣類、ウェットティッシュ、スプレー液等に吸着、含浸、添加することにより、インフルエンザウイルス感染抑制用品として日常生活において広く利用することができる。さらに、チューインガム、キャンディ、錠菓、飲料等の飲食物に添加し、抗インフルエンザウイルス作用を有する飲食物として日常的に利用、摂取することも可能である。本発明品はインフルエンザウイルスの感染予防や、インフルエンザウイルスに起因する疾病の治療に有効である。
カリン抽出物のウイルスエンベロープ膜への破壊活性を示す。 カリン抽出物の吸着抑制活性及びｖＲＮＡ合成抑制活性、ｍＲＮＡ合成抑制活性、ｃＲＮＡ合成抑制活性を示す。 カリン抽出物の溶血抑制活性を示す。
　本発明品の原料となるカリンにおいてはその実を使用することが望ましい。
　上記植物の粉砕物から本発明の抽出物を得る方法については特に限定しないが、水、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール並びにｎ－ブタノール等の低級アルコール、エーテル、酢酸エチル、アセトン、グリセリン、プロピレングリコール等の有機溶剤の１種または２種以上の混合溶媒を加えて、従来行なわれている抽出方法によって抽出する。しかし、本発明の抗インフルエンザウイルス剤を経口で摂取することを考慮すると、安全性の面から水、エタノールもしくはその混合液を用いて抽出することが望ましい。
　抽出条件としては特に制限はないが、５０～９０℃で１～５時間程度が望ましい。抽出液を濾過し、抽出溶剤を留去したあと、減圧下において濃縮または凍結乾燥したものを使用することができる。また、これらの抽出物を有機溶剤分画、カラムクロマトグラフィー等により分画精製したものも使用することができる。
　本発明品の利用形態については特に制限はなく、有効成分として例示した植物抽出物に溶剤、分散剤、製剤用担体、乳化剤、希釈剤、安定剤等を添加することにより、散剤、錠剤、トローチ剤、吸入剤、うがい薬、含漱剤、座剤、注射剤等任意の製剤として調製することが可能であり、投与経路として経口投与、気道投与、静脈内投与、直腸投与、皮下投与、皮内投与等を例示することができる。この場合成人への投与量は各抽出物で１０～２０００ｍｇ／日が好ましいが、この値に制限されるものではない。各種製剤への抽出物の添加量としては、その製剤の形態によって異なるが、０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上の割合になるように添加するのが好適である。
　また、本発明を、マスク、エアコンフィルター、衣類、ウェットティッシュ、スプレー液等に吸着、含浸、添加することにより、インフルエンザ予防に寄与しうる感染抑制用品を提供することができる。これらの用途における植物抽出物の吸着、添加量は、その感染抑制用品の形態に応じて異なり、一概に規定することは出来ないが、０．００１～５重量％の割合になるように添加するのが好適である。
　また本発明は安全性が高いことから、例えばチューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット等の菓子、アイスクリーム、シャーベット等の冷菓、飲料、スープ、ジャム等の飲食物に配合し、日常的に利用することが可能である。添加量としては、その利用形態および抽出物の呈味性によって異なるが、飲食品に対して０．００１～５重量％、好ましくは約０．０１～１重量％の割合になるように添加するのが好適である。
　以下実施例、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
 (カリン抽出物の調製)
  カリンの乾燥粉砕物を５０％ＥｔＯＨ抽出した後ダイヤイオンＨＰ－２０ を用いて分画し、５つの分画物（ＣＳＤ１～５）を得た。これらの分画物のうち，最も活性の高かったＣＳＤ３（４０％ＥｔＯＨ溶出画分）を試料とした。
　すなわち、カリン果実乾燥物３００ｇと５０％エタノール３０００ｍｌとを加えたフラスコに、還流冷却器を取り付け、１時間還流しながら抽出する。得られた抽出液を濾別し、溶媒を除去した後、凍結乾燥することにより抽出物を６９ｇ得た。
　上記カリン５０％エタノール抽出物をＤｉａｉｏｎＨＰ２０（三菱化成製）カラムに供した。水、２０％エタノール、４０％エタノール、６０％エタノールの順で溶出させた。このエタノール濃度４０％水溶液で溶出した成分（ＣＳＤ３）を採取した。本分画物の収量は乾燥重量として約８．６ｇであった。本品のバニリン－塩酸法によるフェノール含量は５４％［（－）－エピカテキンを標準として］であり、フェノール性の物質を主に含有していることが認められた。
　ＣＳＤ３によるウイルスの吸着抑制効果、ｖＲＮＡ合成抑制効果、ｍＲＮＡ合成抑制効果、ｃＲＮＡ合成抑制効果はウイルスＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。ＣＳＤ３を５０ｍｇ／ｍｌになるよう５０％エタノールで溶解したものを試料原液とした。試料原液をＴｒｉｓ－Ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｓａｌｉｎｅ（ＴＧＳ）で適宜希釈し（１０2から１０６倍希釈まで）、これらの試料希釈液５０μlとウイルス液（４×１０4から４×１０6ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｍｌ）５０μlを混合して室温で１０分間反応させた。この０．1ｍｌをＴＧＳが０．４ｍｌ添加されているＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ　ｃａｎｉｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞の単層培養（６穴プレート）に接種し、ウイルスを室温で３０分間吸着させ、反応後上清を除去して、０．５ｍｌの培養液を添加し、３７℃で０、１、２、３、４、６、８、１２時間培養後、感染細胞中のウイルスゲノムＲＮＡをチオシアン酸グアニジン溶解２５％エタノール沈殿法により回収した。以下に各試験法におけるＲＮＡからのｃＤＮＡ合成法およびＰＣＲ増幅法について詳細を示す。
（インフルエンザウイルスの吸着抑制試験およびｖＲＮＡ合成抑制試験）
　吸着抑制試験およびｖＲＮＡ合成抑制試験では、回収した０．５～５
μｇのＲＮＡから、添付説明書に従って、Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ III（インビトロジェン社）逆転写酵素およびＴ７　ｃＲＮＡ（１－１２）プライマーを用いて逆転写反応を行い、ｖＲＮＡのｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ウイルス（Ｕｄｏｒｎ）ＮＰ遺伝子特異的な１組のオリゴヌクレオチドプライマーによりＰＣＲの増幅を行った。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ（インビトロジェン社）を用いて４５サイクル（５秒、９５℃、３４秒、６４℃）実施した。
　得られた各穴あたりのｖＲＮＡのコピー数を図２に示す。ＣＳＤ３未処理ウイルスの0時間時の吸着コピー数は6.7×108/穴だったのに対し、1μg/mlのＣＳＤ３処理により2.2×108/穴であり約1/3に吸着は抑制された。また、ＣＳＤ３未処理ウイルスのｖＲＮＡ合成量は2.2×1010/穴（培養12時間後）だったのに対し、1μg/mlのＣＳＤ３処理では3.2×108/穴であり、ｖＲＮＡ合成量は約1/７0に減少した。
（ｍＲＮＡ合成抑制試験）
　ＣＳＤ３によるウイルスの一次／二次転写抑制試験では、逆転写酵素およびＴ７Ｔ（１８）ＶＮプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｍＲＮＡのｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＮＰ遺伝子特異的な１組のオリゴヌクレオチドプライマーによりＰＣＲの増幅を行った。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ（インビトロジェン社）を用いて４５サイクル（５秒、９５℃、３４秒、６４℃）実施した。
　得られた各穴あたりのｍＲＮＡのコピー数を図２に示す。ＣＳＤ3未処理ウイルスのｍＲＮＡのコピー数は2.6×1010/穴（培養12時間後）であったのに対し、1μg/mlのＣＳＤ３処理では4.3×107/穴であり、ｍＲＮＡ合成量は約1/600に減少した。
（ｃＲＮＡ合成抑制試験）
　ＣＳＤ３によるウイルスの複製段階抑制試験では、逆転写酵素およびＴ７　ｖＲＮＡ（１－１３）プライマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＲＮＡのｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＮＰ遺伝子特異的な１組のオリゴヌクレオチドプライマーによりＰＣＲの増幅を行った。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ（インビトロジェン社）を用いて４５サイクル（５秒、９５℃、３４秒、６４℃）実施した。得られた各穴あたりのｃＲＮＡのコピー数を図２に示す。ＣＳＤ3未処理ウイルスのｃＲＮＡのコピー数は9.7×106/穴（培養８時間後）であったのに対し、1μg/mlのＣＳＤ３処理では2.5×104/穴であり、ｃＲＮＡ合成量は約1/400に減少した。
（溶血抑制試験）
　ＣＳＤ３を５％エタノールに溶解（５ ｍｇ／ｍｌ）したものを試料原液とした。インフルエンザウイルス（１０ＨＡから３２０ＨＡ）とＣＳＤ３（試料原液をＴＧＳで１０2から１０６倍希釈）を、10分間室温下でインキュベートした。反応後、ＣＳＤ３で処理したインフルエンザウイルスと１０％ニワトリ赤血球１００μｌを混合し、３０分間室温で保持した。赤血球を遠心分離して集め、沈殿をｐＨ５．３の緩衝液（１３６ｍＭ　ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ）に懸濁させた。懸濁液を３７℃で３０分間インキュベート後、遠心分離した。上清の４０９ｎｍの吸光度を測定し、カリン未処理ウイルスの吸光度を１としカリン添加による溶血活性を評価した。
　得られた結果を図３に示す。
　ウイルス（１６０００ＨＡ）にＣＳＤ３を添加し、室温下、１時間保持した。ウイルス粒子の電子顕微鏡観察は２％酢酸ウラニュウムによる陰染色法により行った。
　これらの結果を、図１に示す。
　図１は、カリン抽出物（ＣＳＤ３）のウイルスエンベロープ膜への破壊活性を示す電子顕微鏡像であり、（ａ）はカリン抽出物添加の場合を示し、（ｂ）はカリン抽出物の未添加の場合を示す。
　ＣＳＤ３で処理ウイルスの電子顕微鏡像では粒子表面のＨＡ・ＮＡスパイクの外側に約２ｎｍ　幅のＣＳＤ３と見られる付着層が観察され、また、エンベロープに損傷箇所があり、粒子内部に染色剤が浸透し、内部構造が可視化されていた（図１の（ａ））。
（結論）
　カリン抽出物（ＣＳＤ３）処理ウイルスでは一次転写より前段階でウイルス増殖が停止することが示された。ウイルスの吸着・膜融合段階での失活も示されたが、それ以上にRNAの合成が抑制されており、膜融合から一次転写までの過程に関わる何らかの欠陥があることが示唆された。電子顕微鏡で示されたエンベロープの損傷がこの欠陥の原因となっている可能性がある。
　実施例１で調製したカリン抽出物を用いて、うがい薬、吸入剤、トローチ剤、スプレー液、チューインガム、キャンディ、錠菓、飲料、粉末剤、錠剤、含漱剤、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、アイス、シャーベット、スープ、ジャム、ウェットティッシュ、マスクを調製した。以下に実施例としてその処方を示した。
うがい薬の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
サッカリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
塩酸クロルヘキシジン　　　　　　　　　　　　　　　０．０１　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
吸入剤の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
トローチ剤の処方
ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７２．３　　重量％
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９．０　　重量％
アラビアゴム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
モノフルオロリン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　０．７　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
スプレー液の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．０　　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５　　重量％
クエン酸三ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
チューインガムの処方
ガムベース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０　　重量％
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５４．７　　重量％
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０　　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．３　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
キャンディの処方
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０．０　　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３４．０　　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
錠菓の処方
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７６．１　　重量％
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９．０　　重量％
ショ糖脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
飲料の処方
オレンジ果汁　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０．００　重量％
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．２４　重量％
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
粉末剤の処方
トウモロコシ澱粉　　　　　　　　　　　　　　　　５５．０　　重量％
カルボキシセルロース　　　　　　　　　　　　　　４０．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
錠剤の処方
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０．０　　重量％
結晶性セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０　　重量％
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　５．０　　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０　　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０　　重量％
含漱剤の処方
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．００　重量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．００　重量％
サッカリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
塩酸クロルヘキシジン　　　　　　　　　　　　　　　０．０１　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５０　重量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
グミゼリーの処方
ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０．００　重量％
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３．００　重量％
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．５０　重量％
植物油脂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５０　重量％
マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．９５　重量％
レモン果汁　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．００　重量％
ＣＳＤ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５　重量％
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．００　重量％
　この出願は２００９年９月２４日に出願された日本国特許出願第２００９－２１８６４３号および２００９年１２月８日に出願された日本国特許出願第２００９－２７８４６２号からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。

 

Claims (9)

  1.   カリン（Chaenomeles　sinensis,　Pseudocydonia　sinensis）の抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
  2.   カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
  3.   カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス吸着抑制剤。
  4. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｍＲＮＡ合成抑制剤。
  5. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｖＲＮＡ合成抑制剤。
  6. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルス感染細胞におけるウイルスｃＲＮＡ合成抑制剤。
  7. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするウイルス膜融合活性試験における溶血抑制剤。
  8. 　カリンを５０％エタノール水を用いて、抽出し、その抽出液をカラム分画して精製することにより得た抽出物を有効成分とすることを特徴とするインフルエンザウイルスのエンベロープ破壊剤。
  9.   カリン抽出物を含有する抗インフルエンザウイルス作用を有する飲食品。
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