WO2011010673A1 - インスリン測定方法 - Google Patents

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monoclonal antibody
monoclonal
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近藤　純一
知 清水
光章 山本
中村　靖
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積水メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method and reagent for measuring insulin using an immune reaction. More specifically, the present invention relates to an insulin measuring method and a measuring reagent using an antibody that does not react with insulin to which an anti-insulin antibody is not bound but has a property to react with insulin to which an anti-insulin antibody is bound.
  • Insulin is a peptide hormone having a molecular weight of about 5800, which is produced through proinsulin as a precursor in the islets of Langerhans in the pancreas. It is involved in glucose metabolism, amino acid metabolism and lipid metabolism, and a typical physiological action is hypoglycemia. Diabetes mellitus is caused by insufficient insulin secretion based on a decrease in ⁇ -cells or decreased function and insufficient insulin action in peripheral tissues. Therefore, measurement of blood insulin concentration that reflects the insulin secretion function of ⁇ cells is a useful index for diagnosis of diabetes, understanding of pathological conditions, and differentiation of causes of impaired glucose tolerance.
  • Patent Document 1 discloses insulin by an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as ELISA method) using a monoclonal antibody bound to an insoluble carrier and a monoclonal antibody that does not compete with the antibody for epitope and is labeled with an enzyme. Quantitative methods are disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a method for quantifying insulin by a particle aggregation immunoassay method using two types of monoclonal antibodies having different recognition sites bound to an insoluble carrier.
  • An object of the present invention is to provide an insulin-specific measurement method and measurement reagent that can accurately measure only insulin without being affected by proinsulin and insulin-like compounds.
  • the present inventors have surprisingly found that the first monoclonal antibody that reacts with insulin does not react with insulin to which the first monoclonal antibody is not bound. However, it was found that by combining a second monoclonal antibody that reacts with insulin bound to the first monoclonal antibody, only insulin can be accurately measured without being affected by proinsulin and insulin-like compounds. . As a result of further investigations, various forms of insulin using the above-described antibodies that react with insulin conjugated with an anti-insulin antibody (insulin-anti-insulin antibody complex: hereinafter sometimes referred to as “insulin-antibody complex”) are used. The inventors have found that a measurement method can be constructed, and have completed the present invention. That is, the present invention has the following configuration.
  • a method for measuring insulin characterized by using an antibody that does not react with insulin to which an anti-insulin antibody is not bound but has a property of reacting with insulin to which an anti-insulin antibody is bound.
  • An insulin measuring method using two kinds of antibodies 1) The first antibody has the property of reacting with insulin, 2) The second antibody does not react with insulin to which the first antibody is not bound, but has a property of reacting with insulin to which the first antibody is bound.
  • the second monoclonal antibody is an antibody that does not react with either proinsulin or an insulin-like compound.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are immobilized on latex, respectively, and insulin is measured by latex immunoagglutination method [3], [5], [6], [7] The insulin measurement method according to any one of the above.
  • the first monoclonal antibody is immobilized on a solid phase, and the second monoclonal antibody is labeled with a labeling substance. Insulin is measured by ELISA [3], [5], [6] [7] The insulin measurement method according to any one of [7].
  • the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance, and the second monoclonal antibody is immobilized on a solid phase.
  • Insulin is measured by ELISA or immunochromatography [3], [5] , [6], The method for measuring insulin according to any one of [7].
  • An insulin measurement reagent comprising an antibody that does not react with insulin to which an anti-insulin antibody is not bound, but has a property of reacting with insulin to which the anti-insulin antibody is bound.
  • An insulin measurement reagent comprising two types of antibodies, 1) The first antibody has the property of reacting with insulin, 2) The second antibody does not react with insulin to which the first antibody is not bound, but has a property of reacting with insulin to which the first antibody is bound.
  • the insulin measurement reagent according to [11].
  • the insulin measurement reagent according to [12], wherein both the first antibody and the second antibody are monoclonal antibodies.
  • the insulin measurement reagent according to [13], wherein the first monoclonal antibody is two or more monoclonal antibodies having different recognition sites.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are immobilized on latex, respectively, and insulin is measured by latex immunoagglutination method [13], [15], [16], [17] The insulin measurement reagent according to any one of the above.
  • the first monoclonal antibody is immobilized on a solid phase, and the second monoclonal antibody is labeled with a labeling substance. Insulin is measured by ELISA [13], [15], [16] [17] The insulin measurement reagent according to any one of [17].
  • the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance, and the second monoclonal antibody is immobilized on a solid phase. Insulin is measured by ELISA or immunochromatography [13], [15] , [16], Insulin measuring reagent according to any one of [17].
  • a monoclonal antibody having the following properties. 1) An antibody that binds to insulin does not react with unbound insulin 2) An antibody that binds to insulin reacts with insulin bound [22] Furthermore, it does not react with either proinsulin or insulin-like compounds [21] The monoclonal antibody according to [21]. [23] A monoclonal antibody screening method comprising the following steps. 1) Step of selecting an antibody that reacts with insulin 2) Step of selecting a monoclonal antibody that does not react with insulin to which the antibody selected in 1) is not bound but reacts with insulin bound with the antibody
  • highly sensitive and accurate insulin measurement can be performed without being affected by proinsulin and insulin-like compounds.
  • insulin secretion from ⁇ cells can be accurately grasped, it can be used for grasping the pathological condition of diabetes and is very useful.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram which shows the amino acid sequence of insulin.
  • the parts (a) to (e) show the difference in amino acid sequence from various insulin analog preparations examined for the reactivity with the antibody of the present invention.
  • the alphabet in circles in the figure is a single letter code for amino acids.
  • Insulin lispro the (a) and (b) moieties have “KP” instead of “PK”.
  • Insulin aspart (a) portion has “D” instead of "P”.
  • Insulin glargine (d) part has “G” instead of “N”, and (c) “RR” is added to part “T”.
  • Insulin detemir The (c) portion does not have “T”, and the myristate (C 14 H 28 O 2 ) is added to the (b) portion “K”.
  • Insulin gluridine the (b) part has “E” instead of “K” and the (e) part has “K” instead of “N”.
  • Biacore trademark
  • T100 the test result using Biacore (trademark) T100 about the reactivity of an insulin and 66221 antibody.
  • Biacore (trademark) T100 about the reactivity of an insulin and 66226 antibody.
  • Biacore (trademark) T100 about the reactivity of proinsulin and various insulin analog preparations, and 66221 antibody.
  • A proinsulin, (b) insulin lispro, (c) insulin aspart Same as above.
  • D Insulin glargine,
  • e Insulin detemir It is a figure which shows the test result using Biacore (trademark) T100 about the reactivity of proinsulin and various insulin analog preparations, and the 66226 antibody.
  • A proinsulin, (b) insulin lispro, (c) insulin aspart Same as above.
  • (D) Insulin glargine, (e) Insulin detemir The figure which shows the result of the ELISA method test which investigated the reactivity of insulin, proinsulin, and various insulin analog preparations by solidifying a primary antibody on a plate using 66221 antibody as a primary antibody and 66226 antibody as a secondary antibody. is there.
  • the figure which shows the result of the ELISA method test which examined the reactivity of insulin, proinsulin, and various insulin analog preparations by solidifying a primary antibody on a plate using 66226 antibody as a primary antibody and 66221 antibody as a secondary antibody. is there.
  • FIG. 1 shows the test result using Biacore (trademark) T100 about the reactivity of insulin analog preparation and insulin gluridine with 66221 antibody (a) and 66226 antibody (b).
  • the result of the ELISA method test in which the primary antibody was immobilized on a plate using the 66221 antibody as the primary antibody and the 66226 antibody as the secondary antibody, and the reactivity of insulin, proinsulin, insulin analog preparation / insulin gluridine was examined.
  • FIG. The result of the ELISA method test in which the primary antibody was immobilized on a plate using the 66226 antibody as the primary antibody and the 66221 antibody as the secondary antibody, and the reactivity of insulin, proinsulin, insulin analog preparation / insulin gluridine was examined.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes a first monoclonal antibody and a second monoclonal antibody, and these are used in combination when measuring insulin.
  • the first monoclonal antibody may be any monoclonal antibody that reacts with insulin, and is a functional fragment of an antibody that can react with insulin, such as the Fab ′ portion of an antibody, in addition to the whole antibody molecule. There may be.
  • the second monoclonal antibody may be any monoclonal antibody as long as it has the following properties 1) and 2).
  • the reaction site (recognition site) of the second monoclonal antibody is preferably one that recognizes a change in the structure of insulin caused by binding of the first monoclonal antibody and reacts with the insulin having the changed structure.
  • the “change in the structure of insulin” means a change in the structure that occurs independently of the insulin molecule itself due to the formation of the insulin-antibody complex, or the antibody and insulin molecule cooperate in the antibody-bound insulin.
  • the structure etc. which comprise.
  • the measurement method of the present invention is not affected by proinsulin and insulin-like compounds, it is desirable that at least one monoclonal antibody does not react with proinsulin and insulin-like compounds.
  • the insulin analog compound include insulin analog preparations such as insulin lispro, insulin aspart, insulin glargine, insulin detemir, and insulin gluridine.
  • One aspect of the second monoclonal antibody of the present invention is an antibody that does not cross-react with any of these compounds. When this antibody is used for measurement of insulin, the compound may be present in the sample. Insulin can be measured specifically. As long as one monoclonal antibody has the property of not reacting with these proinsulin and insulin analogs, the other monoclonal antibody may be either reactive with these analogs or non-reactive.
  • an antibody of the present invention and a compound means that the antibody of the present invention does not substantially react with a compound.
  • “Substantially does not react” refers to, for example, the above SPR method.
  • Biacore registered trademark
  • T100 When Biacore (registered trademark) T100 is used and measurement is performed with the antibody of the present invention immobilized, the reactivity of the antibody of the present invention is not enhanced. Specifically, it means that the reactivity between the antibody and the compound is not significantly different from the reactivity of the control (no compound added). It goes without saying that “substantially no reaction” can be confirmed by methods and means well known to those skilled in the art other than the SPR method.
  • the insulin recognized as an antigen by the antibody of the present invention may be the whole of the insulin molecule or a part thereof.
  • first monoclonal antibody examples include a monoclonal antibody (66221 antibody) produced by a hybridoma (FERM BP-11233), and examples of the “second monoclonal antibody” include a hybridoma (FERM BP-11234). ) Produced by the antibody (66226 antibody).
  • the antibody of the present invention can be easily produced by dissolving insulin as an antigen (immunogen) in a solvent such as phosphate buffered saline and administering this solution to an animal for immunization. If necessary, an appropriate adjuvant may be added to the solution, and then immunization may be performed using an emulsion.
  • Adjuvants include water-in-oil emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, oil-in-water emulsions, liposomes, aluminum hydroxide gels, and other commonly used adjuvants, as well as protein and peptide substances derived from biological components. Also good.
  • Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be preferably used.
  • route of administration, dosage, and timing of adjuvant it is desirable to select appropriately so that the desired immune response can be enhanced in animals immunized with the antigen.
  • the type of animal used for immunization is not particularly limited, but mammals are preferable, and for example, mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, and the like can be used, and mice can be more preferably used.
  • the animal may be immunized according to a general method.
  • the animal can be immunized by injecting a solution of an antigen, preferably a mixture with an adjuvant, into the animal subcutaneously, intradermally, intravenously, or intraperitoneally. . Since the immune response generally varies depending on the type and strain of the animal to be immunized, it is desirable to set the immunization schedule as appropriate according to the animal used.
  • the antigen administration is preferably repeated several times after the first immunization.
  • the present invention is not limited to these operations.
  • the manufacturing method of the monoclonal antibody itself is described in, for example, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, (1988).
  • spleen cells or lymph node cells which are antibody-producing cells
  • hybridomas can be produced by cell fusion with myeloma cells having high proliferation ability.
  • cells having high antibody production ability quality / quantity
  • myeloma cells are preferably compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
  • Cell fusion can be performed according to a method known in the art. For example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using an electric current, or the like can be employed.
  • the obtained hybridoma can be grown according to a known method, and a desired hybridoma can be selected while confirming the properties of the antibody produced.
  • the hybridoma can be cloned by a known method such as a limiting dilution method or a soft agar method.
  • Hybridoma selection can be efficiently performed at the selection stage in consideration of the conditions under which the produced antibody is used for actual measurement. For example, it can be obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody that reacts with insulin by ELISA, RIA, or the like. Specifically, the monoclonal antibody in the culture supernatant is first reacted with the immobilized insulin, and then the antigen-immobilized ELISA method in which the labeled anti-IgG antibody is reacted with the monoclonal antibody having high reactivity to insulin. A hybridoma producing the antibody is selected.
  • Monoclonal antibodies having desired characteristics can be produced by mass-culturing the hybridomas thus selected.
  • the mass culture method is not particularly limited.
  • the hybridoma is cultured in an appropriate medium and a monoclonal antibody is produced in the medium.
  • Examples thereof include a method for producing an antibody.
  • Purification of the monoclonal antibody can be performed by appropriately combining, for example, anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method and the like.
  • the selection of the hybridoma producing the second monoclonal antibody is performed by replacing the solid-phased insulin in the case of selecting the hybridoma producing the first monoclonal antibody with the insulin bound to the first monoclonal antibody.
  • Method method of binding insulin to the immobilized first monoclonal antibody and confirming the formation of a sandwich with the second monoclonal antibody candidate) or the second monoclonal antibody candidate by immobilizing the first monoclonal antibody in advance
  • a method of selecting the reaction between insulin and an antibody complex antibody formed by incubating insulin with an insulin, or a method of selecting one that does not show reactivity with insulin using Biacore (registered trademark) T100 Can be obtained by confirming
  • the antibody of the present invention in addition to the whole antibody molecule, it is also possible to use a functional fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity, in addition to those obtained through the immunization process for animals as described above, Those obtained using genetic recombination techniques and chimeric antibodies can also be used.
  • the functional fragment of an antibody include F (ab ′) 2 and Fab ′. These functional fragments can be obtained by converting the antibody obtained as described above into a proteolytic enzyme (for example, pepsin or papain). It can manufacture by processing with.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used as an immobilized (solid phase) antibody in which either the first monoclonal antibody or the second monoclonal antibody or both are immobilized on an insoluble carrier, or is well known to those skilled in the art described later. It can be used as a labeled antibody labeled with the labeling substance. Any of such immobilized antibodies and labeled antibodies are included in the scope of the present invention.
  • an immobilized antibody can be produced by physically adsorbing a monoclonal antibody to an insoluble carrier or chemically binding it (may be via an appropriate spacer).
  • an insoluble carrier comprising a polymer substrate such as polystyrene resin, an inorganic substrate such as glass, or a polysaccharide substrate such as cellulose or agarose
  • a shape for example, a microplate or a membrane
  • beads or fine particles for example, latex particles, gold colloidal particles
  • a tubular shape for example, a test tube
  • Insulin in a sample can be measured by using a labeled antibody, labeled protein A, labeled protein G, or the like that can bind to the second monoclonal antibody of the present invention.
  • the labeling substance for producing the labeled antibody include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, or radioactive isotopes, colloidal gold particles, and colored latex.
  • methods for binding the labeling substance and the antibody methods such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method, or periodic acid method available to those skilled in the art can be used. The types and methods for producing them are not limited to the above examples.
  • an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP O-phenylenediamine
  • ALP p-nitrophenyl phosphate, etc.
  • biotin is used as a labeling substance.
  • at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted.
  • insoluble carrier is “solid phase”, antigen or antibody is physically or chemically supported on an insoluble carrier, or the state in which it is supported is “fixed”, “immobilized”, “solid phased” ”,“ Sensitization ”, and“ adsorption ”.
  • detection or “measurement” should be interpreted in the broadest sense including proof and / or quantification of the presence of insulin, and should not be interpreted in a limited way in any sense.
  • body fluids mainly derived from living organisms can be mentioned. Specific examples include blood (whole blood), serum, plasma, urine, saliva, sputum, pancreatic extract, tears, otorrhea or prostate fluid, but are not limited thereto.
  • the aspect of the measuring reagent (kit) provided by the present invention is not particularly limited as long as it is a reagent capable of measuring insulin.
  • the ELISA method and immunochromatography method which are representative labeling immunoassay methods, and the latex immunoagglutination method (hereinafter referred to as LTIA method), which is a typical particle aggregation immunoassay method, will be described as examples.
  • ELISA method As an embodiment of a measuring reagent (kit) for detecting insulin present in a sample, the following elements: (A) a solid phase (such as a plate) on which the first monoclonal antibody is immobilized; and (b) a second monoclonal antibody labeled with a labeling substance, Can give.
  • the solid phase (plate or the like) on which the first monoclonal antibody is immobilized captures insulin in the sample and forms an insulin-antibody complex.
  • the second monoclonal antibody labeled with the labeling substance reacts with the insulin-antibody complex to form a sandwich, and the amount of the labeling substance is measured by a method according to the labeling substance, whereby the insulin in the sample is determined. Can be measured.
  • Specific methods for constructing the measurement reagent (kit) such as a method for immobilizing the first monoclonal antibody on a solid phase and a method for labeling the second monoclonal antibody with a labeling substance, are described in this specification. In addition to the methods described in 1), methods well known to those skilled in the art can be used without limitation. In the case of this configuration, it can be configured as a homogeneous measurement system, but is preferably configured as a heterogeneous measurement system.
  • the invention [19] (the first monoclonal antibody is immobilized on a solid phase and the second monoclonal antibody is labeled with a labeling substance, the invention for measuring insulin by ELISA [13] ], [15], [16], [17] insulin measuring reagents).
  • the invention [15] (the first monoclonal antibody is an insulin measurement reagent according to the invention [13], wherein the first monoclonal antibodies are two or more monoclonal antibodies having different recognition sites) for the purpose of improving sensitivity, etc.
  • the first monoclonal antibody is an insulin measurement reagent according to the invention [13], wherein the first monoclonal antibodies are two or more monoclonal antibodies having different recognition sites
  • the invention [20] (the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance and the second monoclonal antibody is immobilized on a solid phase, the invention measuring insulin by the ELISA method [13] ], [15], [16], [17] insulin measuring reagents).
  • ⁇ Labeled immunoassay method immunochromatographic method>
  • a sheet-like solid support such as a membrane
  • a labeled reagent site containing the labeling reagent the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance such as colloidal gold particles
  • a first labeled with a labeling substance The test sample solution is continuously moved by a capillary phenomenon in a “capture reagent site on which a second monoclonal antibody for capturing a complex of the monoclonal antibody and insulin is immobilized”.
  • the sample enters the labeling reagent site in the process of expanding and moving the solid support, and insulin is labeled with the labeling reagent (first reagent). 1), and an insulin-labeling reagent complex is formed.
  • the insulin-labeling reagent complex is developed and moved on the membrane as it is and enters the capture reagent site containing the second monoclonal antibody on the membrane, it is captured by the capture reagent immobilized on the solid support, and the capture reagent.
  • a complex of (second monoclonal antibody) -insulin-labeling reagent (first monoclonal antibody) is formed at the capture reagent position.
  • the presence of the analyte can be determined by detecting the labeling reagent by any method (in the case of visible colloidal gold particles, the aggregated image, and in the case of enzymes, a color reaction by adding a substrate). Can do.
  • Test sample supply site and “2.
  • Labeling reagent containing the first monoclonal antibody (the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance such as gold colloid particles). )
  • Labeled reagent sites that can be developed on the membrane are described independently in the order of movement of the test sample, but the structures stacked in the order of“ 1 ”and“ 2 ”from the top, etc.
  • the test sample is “2.
  • the labeling reagent containing the first monoclonal antibody (the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance such as gold colloid particles) can be developed on the membrane. Since the insulin-antibody complex is formed when it passes through the “retained labeling reagent site”, the invention [15] (first monoclonal antibodies are mutually connected with the intention of improving the sensitivity as in the ELISA method).
  • a first monoclonal antibody labeled with a labeling substance as in the insulin measurement reagent according to the invention [13] which is two or more monoclonal antibodies having different recognition sites, two or more monoclonal antibodies having different recognition sites are used. It is preferably possible to use it.
  • the invention [20] (the immunochromatography method in which the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance and the second monoclonal antibody is immobilized on a solid phase) (Insulin measuring reagent according to any one of inventions [13], [15], [16], [17]).
  • ⁇ Particle aggregation immunoassay method LTIA method>
  • a to D of a reagent for measurement (kit) for detecting insulin present in a sample each of at least the following elements: A. (A) latex particles on which the first monoclonal antibody is immobilized; and (b) latex particles on which the second monoclonal antibody is immobilized. (A) latex particles on which the first monoclonal antibody is immobilized; (b) second monoclonal antibody C.I. Latex particles on which (a) a first monoclonal antibody and (b) a second monoclonal antibody are immobilized. (A) Latex particles on which both the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are immobilized can be mentioned.
  • Latex particles used for A to D can be appropriately selected in particle size and type in order to obtain desired performance such as sensitivity improvement.
  • Latex particles may be any particles suitable for carrying antigens or antibodies.
  • polystyrene, styrene-sulfonic acid (salt) copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, vinyl acetate-acrylic acid ester copolymer A polymer etc. are mentioned.
  • the shape of the latex particles is not particularly limited, but the average particle size is large enough to allow an aggregate formed as a result of the aggregation reaction between the antibody or antigen on the latex particle surface and the measurement target to be detected visually or optically. It is preferable to have.
  • the average particle size is preferably 0.02 to 1.6 ⁇ m, particularly preferably 0.03 to 0.5 ⁇ m. Further, particles made of a material such as metal colloid, gelatin, liposome, microcapsule, silica, alumina, carbon black, metal compound, metal, ceramics or magnetic material can be used instead of latex particles.
  • the reagent of the LTIA method used in clinical examination is usually provided in the form of a first reagent and a second reagent, and is used by sequentially mixing with a test sample.
  • both or one of (a) and (b) can be contained in the first reagent solution or the second reagent solution.
  • These inclusions can be appropriately selected in consideration of the specifications of measuring instruments in clinical examinations and the design (performance and ease of use) of measuring reagents.
  • it is preferable that both (a) and (b) of the embodiment of A are contained in the second reagent, but (a) of the embodiment of A is contained in the first reagent and (b) is contained in the second reagent. It can also be used suitably.
  • the invention [18] (Invention [13], [15] wherein the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are respectively immobilized on latex, and insulin is measured by latex immunoagglutination. Insulin measuring reagent according to any one of [16] and [17].
  • the mode for carrying out the present invention has been described by taking the invention [3] which is a representative embodiment of the present invention as an example.
  • the limitation of using an antibody against the “insulin-antibody complex” Use of a polyclonal antibody as the first antibody as in the invention [4], use of two or more monoclonal antibodies having different recognition sites as the first antibody, as in the invention [5], etc.
  • the present invention can take various forms.
  • the antigen for immunization described above was injected subcutaneously into the back of female BALB / c mice (20-50 ⁇ g per mouse). This operation (immunization) was repeated twice a week. Three weeks after the start of immunization, the spleen was removed from a mouse whose high antibody titer was confirmed by test blood sampling, and cell fusion was performed by a conventional method using 50% -PEG1450 (manufactured by Sigma). As myeloma cells, SP2 / O was used.
  • the obtained fused cells are RPMI1640 medium containing HAT, 15% fetal bovine serum, and 10% BM-Condensed H1 Hybridoma Cloning Supplement (Roche) at 2.5 ⁇ 10 6 cells / mL as spleen cells. And dispensed 0.2 mL each into a 96-well culture plate. This was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • PBST PBS solution
  • Tween registered trademark
  • procrine 300 supplied by SUPELCO 400 ⁇ L / well
  • PBST containing 1% BSA BSA-PBST
  • Antigen-immobilized ELISA method Each mouse antiserum diluted serially with BSA-PBST or culture supernatant of fused cells was dispensed at 50 ⁇ L / well onto an ELISA-immobilized ELISA plate. Let stand for hours. (Ii) After washing 3 times with PBST, a solution obtained by diluting HRP-Gt F (ab ′) 2 -Anti-Mouse Ig's (AMI4404 manufactured by BIOSOURCE) 5000 times with BSA-PBST was dispensed by 50 ⁇ L / well. And left at room temperature for 1 hour.
  • hybridomas were cultured at 0.5 ⁇ 10 6 cells in 12-week-old female BALB / c mice that had been injected intraperitoneally with 0.5 mL of pristane two weeks ago. Six doses were administered intraperitoneally. After 14 days, ascites was collected and centrifuged to obtain a supernatant. The supernatant was mixed with an equal amount of an adsorption buffer (3 mol / L NaCl, 1.5 mol / L Glycine-NaOH buffer, pH 8.5) and then filtered.
  • an adsorption buffer 3 mol / L NaCl, 1.5 mol / L Glycine-NaOH buffer, pH 8.5
  • the filtrate is passed through a protein A sepharose column equilibrated with an adsorption buffer, and the antibody in the filtrate is adsorbed on the column and then eluted with 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.0). It was.
  • the eluate was neutralized with 1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 8.0) and dialyzed with PBS to collect antibodies. Hereafter, it was used for the test as 66221 antibody and 66226 antibody, respectively.
  • the hybridoma producing the 66221 antibody and 66226 antibody was applied by the applicant to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (address: 1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, April 6th, 2009) Deposit procedures (FERM P-21800, FERM P-21801) were given on the day, and then transferred to the deposit under the Budapest Treaty based on the original deposit on February 17, 2010, and the deposit number (FERM BP -11233, FERM BP-11234).
  • Insulin analog preparation (1) Insulin lispro 100 units / mL: manufactured by Eli Lilly Japan, (2) Insulin Aspart 100 units / mL: Novo Nordisk Pharma Co., Ltd. (3) Insulin glargine 100 units / mL: Sanofi Aventis Co., Ltd. (4) Insulin Detemil 100 Units / mL: Novo Nordisk Pharma Co. 1- 3.
  • Biacore registered trademark
  • Biacore registered trademark
  • T100 JJ-1037-02 manufactured by Biacore
  • Iii Series S Sensor Chip CM5: BR-1005-30 manufactured by Biacore
  • IIii Amine Coupling Kit: BR-1000-50 manufactured by Biacore
  • IIv Acetate 5.0: BR-1003-51 manufactured by Biacore (V) ⁇ -Mouse Immunoglobulins: manufactured by Biacore, BR-1005-14
  • Test Method Each of the reactivity was evaluated by capturing 66221 antibody or 66226 antibody on ⁇ -Mouse Immunoglobulins immobilized on Sensor Chip, and adding insulin, proinsulin, and various insulin analog preparations as analytes.
  • the specific operation procedure is as follows.
  • ⁇ -Mouse Immunoglobulins were immobilized on Sensor Chip CM5 (according to the attached instruction manual).
  • the 66221 antibody or 66226 antibody was diluted to 5 ⁇ g / mL with HBS-EP + (pH 8.5), and added at a flow rate of 30 ⁇ L / min for 300 seconds.
  • Result 3-1 Results of reaction with insulin
  • the reactivity of insulin with 66221 antibody and 66226 antibody was confirmed using Biacore (registered trademark) T100. The results are shown in FIGS. At an insulin concentration of 10 ng / mL, a reactivity of 8.5 RU was observed with 66221 antibody (FIG. 2). On the other hand, no reactivity was observed with the 66226 antibody (FIG. 3).
  • the vertical axis “RU” represents a unique unit in the Biacore (registered trademark) measurement system, and represents a mass change due to a reaction on the sensor surface.
  • Example 1 Measurement of insulin by the combination of monoclonal antibodies of the present invention 1 ⁇ LTIA method> 1.
  • Preparation of latex particles In a glass reaction vessel (capacity 2 L) equipped with a stirrer, reflux condenser, temperature detector, nitrogen inlet tube and jacket, 1100 g of distilled water, 200 g of styrene, 0.2 g of sodium styrenesulfonate, and An aqueous solution in which 1.5 g of potassium persulfate was dissolved in 50 g of distilled water was charged, and the inside of the container was replaced with nitrogen gas. After completion of the polymerization, the solution was filtered with a filter paper, and latex particles were taken out.
  • the latex particles obtained were photographed with a transmission electron microscope apparatus (manufactured by JEOL Ltd., “JEM-1010 type”) at a magnification of 10,000 times, and image analysis of at least 100 or more particles was performed. The average particle size was measured. The average particle size obtained was 0.3 ⁇ m.
  • a 66221 antibody-sensitized latex particle solution was prepared.
  • 2-2. Preparation of 66226 antibody-sensitized latex particle solution A 66226 antibody-sensitized latex particle solution was prepared in the same manner as described above using latex having an average particle size of 0.3 ⁇ m.
  • reagents 3-1 Preparation of first reagent 5 mM Tris-HCl (pH 8.5) containing 500 mM sodium chloride and 0.2% BSA was prepared and used as the first reagent.
  • Second Reagent The 66221 antibody-sensitized latex particle solution and 66226 antibody-sensitized latex particle solution are mixed in equal amounts and diluted with 5 mM Tris-HCl (pH 8.5) so that the absorbance at a wavelength of 600 nm is 5.0 Abs. Thus, a second reagent was obtained.
  • the first reagent and the second reagent were combined, and the formation of particle aggregates dependent on insulin concentration was confirmed using a Hitachi 7170 automatic analyzer. Specifically, 150 ⁇ L of the first reagent is added to 10 ⁇ L of an insulin solution having a concentration of 0 ⁇ U / mL, 5 ⁇ U / mL, 25 ⁇ U / mL, 50 ⁇ U / mL, 100 ⁇ U / mL, 200 ⁇ U / mL, and heated at 37 ° C. for 5 minutes. Then, 50 ⁇ L of the second reagent was added and stirred. Thereafter, the change in absorbance associated with the aggregation formation for 5 minutes was measured at a main wavelength of 570 nm and a sub wavelength of 800 nm.
  • Example 2 Measurement of insulin by a combination of monoclonal antibodies of the present invention 2 ⁇ ELISA method>
  • the 66221 antibody and 66226 antibody were respectively solid-phased, and different antibodies were combined as secondary antibodies, and the reactivity of insulin, proinsulin and insulin-like compounds was tested using the ELISA method.
  • Antibodies and antigen types used (1) Monoclonal antibody 66221 antibody: 2.30 mg / mL 66226 antibody: 3.99 mg / mL (2) Antigen species insulin, proinsulin, insulin analog preparations (insulin lispro, insulin aspart, insulin glargine, insulin detemir) were the same as those in Test Example 2.
  • ELISA measurement method (i) A solution obtained by diluting 66221 antibody or 66226 antibody to 2 ⁇ g / mL in PBS was solid-phased in a 96-well plate by 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 2 hours. (Ii) After washing 3 times with PBST 400 ⁇ L / well, 100 ⁇ L / well of BSA-PBST was dispensed and left standing at room temperature for 1 hour for blocking to prepare an ELISA plate.
  • 66221 antibody is the primary antibody and 66226 antibody is the secondary antibody, it does not show cross-reactivity with proinsulin and insulin analog preparations, so only insulin is quantified without being affected by them. I understand that I can do it.
  • the 66226 antibody was the primary antibody and the 66221 antibody was the secondary antibody, insulin could not be measured. Therefore, the 66226 antibody did not show reactivity with insulin, and the 66221 antibody bound to insulin. It turns out that it reacts.
  • the reaction mechanism of this measurement system is that the 66221 antibody first binds to insulin, causing some structural change in insulin, and the 66226 antibody specifically recognizes the structural change site. It is thought that a sandwich is formed.
  • Test method The test was performed in the same manner as described in Test Example 2, except that insulin gllysine, which is an insulin analog preparation, was used as the analyte.
  • Example 3 Measurement of insulin by combination of monoclonal antibodies of the present invention 3 ⁇ ELISA method>
  • the 66221 antibody and 66226 antibody were respectively solid-phased, and different antibodies were combined as secondary antibodies, and the reactivity of insulin, proinsulin and insulin-like compounds was tested using the ELISA method.
  • Antibodies and antigen types used (1) Monoclonal antibody 66221 antibody: 2.30 mg / mL 66226 antibody: 3.99 mg / mL (2) Antigen species insulin, proinsulin, insulin analog preparation (insulin gluridine).
  • the monoclonal antibody of the present invention enables highly sensitive and accurate insulin measurement without being affected by proinsulin and insulin-like compounds. Further, according to the present invention, since insulin secretion from ⁇ cells can be accurately grasped, it can be used for grasping the pathological condition of diabetes and is very useful.
  • Hybridoma 66221 producing 66221 antibody The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566) Date of deposit of biological materials at the depository in Loi April 8, 2009 (April 8, 2009) (original deposit date) February 17, 2010 (February 17, 2010) (Date of transfer to deposit under the Budapest Treaty by original deposit) Deposit number FERM BP-11233 assigned by the depository in Thailand for deposit (2) Hybridoma 66226 producing 66226 antibody The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566) Date of deposit of biological materials at the depository in Loi April 8, 2009 (April 8, 2009) (original deposit date) February 17, 2010 (February 17, 17,

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Abstract

　本発明は、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けず、インスリンのみを高感度に正確に測定することのできる、インスリン特異的な測定方法及び測定試薬の提供を課題とする。　抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いることによりインスリンを特異的に測定できる測定方法及び試薬を提供する。

Description

インスリン測定方法
　本発明は、免疫反応を利用したインスリンの測定方法及び測定試薬に関する。さらに詳しくは、抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いるインスリン測定方法及び測定試薬に関する。
　インスリンは、膵臓中のランゲルハンス島β細胞において、前駆体であるプロインスリンを経て生成される分子量約５８００のペプチドホルモンである。糖代謝ならびにアミノ酸代謝や脂質代謝に関与し、代表的な生理作用は血糖降下である。糖尿病は、β細胞の減少や機能低下に基づくインスリン分泌不足や末梢組織でのインスリン作用不足によりもたらされる。それゆえ、β細胞のインスリン分泌機能を反映する血中インスリン濃度の測定は、糖尿病の診断や病態把握及び耐糖能異常の原因鑑別に有用な指標となっている。
　モノクローナル抗体を用いたインスリンの測定方法としては、次のような技術が知られている。
　特許文献１には、不溶性担体に結合させたモノクローナル抗体と、該抗体とエピトープを競合せず、かつ酵素で標識されたモノクローナル抗体とを用いた酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法という）によるインスリンの定量方法が開示されている。
　特許文献２には、不溶性担体に結合させた認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体を用いた粒子凝集イムノアッセイ法によるインスリンの定量方法が開示されている。
　上記文献は、いずれもインスリンに対する認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を用いてインスリンを測定する方法であるが、プロインスリン、インスリンアナログ製剤などのインスリン類似化合物との交差反応性については何ら開示されていないことから、インスリンのみを正確に、かつ、高感度で測定できるかどうかは不明である。
特開平１－１４８９６２号公報 特開平３－１１８４７２号公報
　本発明は、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けず、インスリンのみを高感度に正確に測定することのできる、インスリン特異的な測定方法及び測定試薬の提供を課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、驚くべきことに、インスリンに反応する第１のモノクローナル抗体と、当該第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、当該第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する第２モノクローナル抗体を組み合わせることで、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けず、インスリンのみを高感度に正確に測定できることを見出した。さらに検討した結果、上記、抗インスリン抗体が結合したインスリン（インスリン－抗インスリン抗体複合体：以下「インスリン－抗体複合体」ということがある）に反応する抗体を使用して、さまざまな態様のインスリン測定方法を構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いることを特徴とする、インスリン測定方法。
〔２〕２種の抗体を用いるインスリン測定方法であって、
１）第１の抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
〔１〕に記載のインスリン測定方法。
〔３〕第１の抗体及び第２の抗体が、ともにモノクローナル抗体である〔２〕に記載のインスリン測定方法。
〔４〕第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、〔２〕に記載のインスリン測定方法。
〔５〕第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、〔３〕に記載のインスリン測定方法。
〔６〕少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔３〕～〔５〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔７〕第２のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔３〕～〔６〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔８〕第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔９〕第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔１０〕第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔１１〕抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、該抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を含むことを特徴とするインスリン測定試薬。
〔１２〕２種の抗体を含むインスリン測定試薬であって、
１）第１の抗体はインスリンと反応する性質を有し、
２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
〔１１〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１３〕第１の抗体及び第２の抗体がともにモノクローナル抗体である〔１２〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１４〕第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、〔１２〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１５〕第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、〔１３〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１６〕少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔１３〕～〔１５〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１７〕第２のモノクローナル抗体は、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔１３〕～〔１６〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１８〕第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１９〕第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔２０〕第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔２１〕以下の性質を有ることを特徴する、モノクローナル抗体。
１）インスリンに結合する抗体が結合していないインスリンとは反応しない
２）インスリンに結合する抗体が結合したインスリンとは反応する
〔２２〕さらに、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しないという性質を有する〔２１〕に記載のモノクローナル抗体。
〔２３〕下記工程を含むモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
１）インスリンと反応する抗体を選択する工程
２）１）で選択した抗体が結合していないインスリンとは反応せず、当該抗体が結合したインスリンと反応するモノクローナル抗体を選択する工程
　本発明によれば、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けずに、感度の高い、正確なインスリン測定が可能となった。また、本発明によれば、β細胞からのインスリン分泌を正確に把握できることから、糖尿病の病態把握に用いることもでき、非常に有用である。
インスリンのアミノ酸配列を示す概念図である。図中（ａ）～（ｅ）部分は本発明の抗体との反応性を検討した各種インスリンアナログ製剤とのアミノ酸配列の違いを示す部分である。図中の○の中のアルファベットはアミノ酸の1文字表記である。 インスリンリスプロ：（ａ）（ｂ）部分は「Ｐ－Ｋ」ではなく「Ｋ－Ｐ」を有する。インスリンアスパルト：（ａ）部分は「Ｐ」ではなく「Ｄ」を有する。 インスリングラルギン：（ｄ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｇ」を有し、更に（ｃ）部分「Ｔ」に「ＲＲ」が付加されている。 インスリンデテミル：（ｃ）部分は「Ｔ」を有さず、更に（ｂ）部分「Ｋ」にミリスチン酸（C14H28O2）が付加されている。インスリングルリジン：（ｂ）部分は「Ｋ」ではなく「Ｅ」を有し、更に（ｅ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｋ」を有する。 インスリンと６６２２１抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 インスリンと６６２２６抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 プロインスリン及び各種インスリンアナログ製剤と６６２２１抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。（ａ）プロインスリン、（ｂ）インスリンリスプロ、（ｃ）インスリンアスパルト 同上。（ｄ）インスリングラルギン、（ｅ）インスリンデテミル プロインスリン及び各種インスリンアナログ製剤と６６２２６抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。（ａ）プロインスリン、（ｂ）インスリンリスプロ、（ｃ）インスリンアスパルト 同上。（ｄ）インスリングラルギン、（ｅ）インスリンデテミル １次抗体として６６２２１抗体、２次抗体として６６２２６抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤の反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 １次抗体として６６２２６抗体、２次抗体として６６２２１抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤の反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンと６６２２１抗体（ａ）及び６６２２６抗体（ｂ）の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 １次抗体として６６２２１抗体、２次抗体として６６２２６抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンの反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 １次抗体として６６２２６抗体、２次抗体として６６２２１抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンの反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。
　以下、本発明の代表的な態様である下記発明〔３〕を例として、発明を実施するための形態について説明する。発明〔３〕を詳説すると以下である。
『２種のモノクローナル抗体を用いるインスリン測定方法であって、
１）第１のモノクローナル抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
２）第２のモノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、インスリン測定方法。』
　本発明のモノクローナル抗体には、第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体があり、インスリンの測定に際してはこれらを組み合わせて用いる。第１のモノクローナル抗体は、インスリンと反応するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよく、抗体分子全体のほかに、抗体のＦａｂ’部分などインスリンと反応することができる、抗体の機能性断片であってもよい。
　第２のモノクローナル抗体は、以下の１）と２）の性質を有するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよい。
１）第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しない
２）第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する
　上記「第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する」場合の第２のモノクローナル抗体の反応部位（認識部位）は、第１のモノクローナル抗体が結合したことによって起きるインスリンの構造の変化を認識して、当該構造が変化したインスリンに反応するものが望ましい。ここで、「インスリンの構造の変化」とは、インスリン－抗体複合体の形成により、インスリン分子自体に独立して生じた構造の変化や、抗体が結合したインスリンにおいて抗体とインスリン分子が協働して構成する構造等をいう。
　また、本発明の測定方法はプロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けないことが望ましいため、少なくとも１種のモノクローナル抗体は、プロインスリン及びインスリン類似化合物と反応しないことが望ましい。インスリン類似化合物としては、具体的には、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンなどのインスリンアナログ製剤などが挙げられる。
　本発明の第２のモノクローナル抗体の一態様として、これらの化合物のいずれとも交差反応しない抗体が挙げられ、本抗体をインスリンの測定に用いた場合には、当該化合物が試料中に存在しても、インスリンを特異的に測定することができる。一方のモノクローナル抗体がこれらプロインスリン及びインスリン類似化合物と反応しない性質を有していれば、他方のモノクローナル抗体はこれらの類似化合物と反応するものでも、反応しないものでもいずれでもよい。
　本明細書中、インスリンと「反応する」、インスリンを「認識する」、インスリンと「結合する」、インスリンと「交差反応性を示す」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体がインスリンなどの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
　本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいい、「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を使用し、本発明の抗体を固定化して測定を行った場合に、本発明の抗体の反応性の増強が認められないことをいう。詳細には、抗体と化合物との反応性が、コントロール（化合物非添加）の反応性と比べて有意な差がないことをいう。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できるのはいうまでもない。
　本発明の抗体によって抗原として認識されるインスリンは、インスリン分子の全体であってもよく、その一部であってもよい。
　「第１のモノクローナル抗体」としては、具体的にはハイブリドーマ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３３）が産生するモノクローナル抗体（６６２２１抗体）が挙げられ、「第２のモノクローナル抗体」としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３４）が産生するモノクローナル抗体（６６２２６抗体）が挙げられる。
　本発明の抗体は、抗原（免疫原）としてインスリンをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することによりに容易に製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
　免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウスを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体を得る場合、引き続き以下の操作が行われるが、それらの操作に限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）に記載の方法に準じて行うことができる。
　最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有するミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、またミエローマ細胞は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
　第１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択について説明する。
　ハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により、インスリンに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、まず、培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化したインスリンと反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、インスリンに対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
　このようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
　また、第２のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、上記第１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択の場合における固相化したインスリンを、第１のモノクローナル抗体と結合したインスリンに置き換えた選択方法（固相化した第１のモノクローナル抗体にインスリンを結合させ、第２のモノクローナル抗体候補とのサンドイッチ形成を確認する方法）や第２のモノクローナル抗体候補を固相化し、予め第１のモノクローナル抗体とインスリンをインキュベートして形成させたインスリン－抗体複合体抗体との反応を確認する選択方法、あるいはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンとの反応性を示さないものを選択する方法を適宜組み合わせて確認することにより得ることができる。
　本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものや、キメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、第１または第２のモノクローナル抗体のいずれか、あるいは両方を不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体として使用したり、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
　本発明の第２のモノクローナル抗体と結合可能な標識抗体、標識プロテインＡ又は，標識プロテインＧ等を用いることにより、試料中のインスリンを測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができるが、固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を標識物質として用いる場合にはその酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）の場合には、例えばＯ－フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤという）あるいは３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ－ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
　本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。また、「検出」又は「測定」という用語は、インスリンの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
　本発明の抗体を用いる測定方法における検出対象の「試料」としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。具体的には、血液（全血）、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、膵臓抽出液、涙液、耳漏又は前立腺液などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明により提供される測定用試薬（キット）の態様としては、インスリンの測定ができる試薬であれば、特に限定されるものではない。以下、代表的な標識イムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフ法と、代表的な粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）を例にそれぞれを説明する。
＜標識イムノアッセイ法：ＥＬＩＳＡ法＞
　試料中に存在するインスリンを検出するための測定用試薬（キット）の態様として、以下の要素：
（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、及び
（ｂ）標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体、
をあげることができる。
　第１のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）は、試料中のインスリンを捕捉してインスリン－抗体複合体を形成する。標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体は、当該インスリン－抗体複合体に反応してサンドイッチを形成し、標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のインスリンを測定することができる。第１のモノクローナル抗体の固相への固定化の方法、第２のモノクローナル抗体の標識物質での標識の方法など、測定試薬（キット）を構成する上での具体的な方法は本明細書中に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定系として構成することもできるが、ヘテロジーニアスな測定系として構成することが好ましい。
　特に好適な態様として、発明〔１９〕（第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。
　また、測定用試薬の感度や特異性を考慮して、
（ａ）標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体、及び
（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、
という上記とは逆の構成を採用することもできる。
　この構成の場合、被検試料と標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体含有溶液を混合し、予めインスリン－抗体複合体を溶液中で形成させておき、第２のモノクローナル抗体を固定化した固相に添加することが好ましい。この構成においては、感度の向上などを意図して、発明〔１５〕（第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、発明〔１３〕に記載のインスリン測定試薬）のように標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体として、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することが好適に可能である。
　特に好適な態様として、発明〔２０〕（第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。
＜標識イムノアッセイ法：イムノクロマトグラフ法＞
　一般的なイムノクロマトグラフ法では、メンブレンなどのシート状の固相支持体上、長さ方向に対して、端から順番に「１．被検試料供給部位」、「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」、「３．標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体とインスリンの複合体を捕捉するための第２のモノクローナル抗体を固定化した捕捉試薬部位」を被検試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するよう構成されている。
　具体的には、まず、インスリンを含む被検試料を被検試料供給部位に所定量添加すると、試料が固相支持体を展開移動する過程で標識試薬部位に侵入し、インスリンが標識試薬（第１のモノクローナル抗体を含む）と結合しインスリン－標識試薬の複合体が形成される。インスリン－標識試薬複合体はそのままメンブレン上を展開移動し、メンブレン上の第２のモノクローナル抗体を含む捕捉試薬部位に侵入すると、固相支持体上に固定化された捕捉試薬に捕捉され、捕捉試薬（第２のモノクローナル抗体）－インスリン－標識試薬（第１のモノクローナル抗体）の複合体が捕捉試薬位置に形成される。そして、標識試薬を任意の方法（可視可能な金コロイド粒子の場合はその凝集像、酵素の場合は基質を添加することによる発色反応）で検出することで、被分析物質の存在を判定することができる。
　なお、理解を容易にするため、「１．被検試料供給部位」と「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」を、独立して被検試料の移動方向順に記載したが、上から「１」、「２」の順で積み上げられた構造など、当業者に周知の態様・構成が採用されうることを当業者は当然に理解することができる。
　イムノクロマトグラフ法においては、被検試料が「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」を通過する時点で、インスリン－抗体複合体が形成させるので、前記ＥＬＩＳＡ法と同様に感度の向上などを意図して、発明〔１５〕（第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、発明〔１３〕に記載のインスリン測定試薬）のように標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体として、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することが好適に可能である。
　イムノクロマトグラフ法の測定試薬の特に好適な態様として、発明〔２０〕（第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、イムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。
＜粒子凝集イムノアッセイ法：ＬＴＩＡ法＞
　試料中に存在するインスリンを検出するための測定用試薬（キット）のＡ～Ｄの４態様として、それぞれ少なくとも以下の要素：
Ａ．（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子
Ｂ．（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体
Ｃ．（ａ）第１のモノクローナル抗体及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子
Ｄ．（ａ）第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体の両抗体を固定化したラテックス粒子
をあげることができる。
　これらの測定用試薬（キット）はＬＴＩＡ法に好適に使用できる。Ａ～Ｄに使用されるラテックス粒子は、感度向上などの所望の性能を得るため、粒子径や種類を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗原あるいは抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン－スルホン酸（塩）共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体又は抗原と測定対象物との凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２～１．６μｍであり、特に０．０３～０．５μｍが好ましい。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
　例えば、臨床検査で使用されるＬＴＩＡ法の試薬は、通常、第一試液、第二試液の形態で提供され、順次被検試料と混合して使用される。上記Ａ～Ｄの各態様における、（ａ）、（ｂ）は、その両方又は一方を、第一試液あるいは第二試液に含有させることができる。これらの含有のさせかたは、臨床検査における測定機器の仕様や測定試薬の設計（性能や使い易さなど）を考慮し、適宜選択しうる。一般にはＡの態様の（ａ），（ｂ）の両方を第二試液に含有させることが好適であるが、Ａの態様の（ａ）を第一試液、（ｂ）を第二試液に含有させることなども好適に使用しうる。
　特に好適な態様として、発明〔１８〕（第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。
以上、本発明の代表的な態様である発明〔３〕を例として、本発明を実施するための形態を説明したが、「インスリン－抗体複合体」に対する抗体を使用することを限度として、例えば発明〔４〕のように、第１の抗体にポリクローナル抗体を使用することや、発明〔５〕のように、第１の抗体に、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することなど、本発明が種々の態様をとりうることを当業者は当然に理解することができる。
　以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔試験例１〕本発明のモノクローナル抗体の製造方法
１．免疫用抗原の調製
ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０－ＡＩ５１）をコンプリートフロインドアジュバント（Ｗａｋｏ社製）と１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製し、免疫用抗原とした。
２．ハイブリドーマの作製
上記、免疫用抗原を雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注入した（１匹当たり２０～５０μｇ）。この操作（免疫）を１週間毎に２回繰り返した。免疫開始３週間後、試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％－ＰＥＧ１４５０（シグマ社製）を用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０6個／ｍＬになるようにＨＡＴ、１５％ウシ胎児血清及び１０％のＢＭ－Ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養した。
３．第１のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、インスリンに対し高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートにおいて継代した。継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述する競合ＥＬＩＳＡ法を行い、インスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。
３－１．抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）で１μｇ／ｍＬの濃度に調製したインスリンをスクリーニング用抗原として、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％プロクリン３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ-ＰＢＳＴという）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。該ＥＬＩＳＡ用プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各試薬を添加して実施例記載の各ＥＬＩＳＡ法試験に用いた。
３－２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
（i）抗原固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ＢＳＡ－ＰＢＳＴにより段階希釈した各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ－Ｇｔ　Ｆ（ａｂ’）2－Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ’ｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製　ＡＭＩ４４０４）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、０．０２％過酸化水素水を含む０．２Ｍクエン酸緩衝液（以下、基質溶解液という）にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（iv）１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．５Ｎ硫酸（以下、反応停止液という）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
３－３．競合ＥＬＩＳＡ法
（i）抗原固相化したＥＬＩＳＡ用プレートにヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０－ＡＩ５１）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで各０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
（ii）次いで、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで各５倍、２５倍に希釈した融合細胞の培養上清あるいはその原液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）以降の操作は、前記３－２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の工程（ii）～（iv）と同様に行った。
４．第２のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
　細胞融合７日後に、培養上清を用いて後述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行い、後述のクローニング及びモノクローナル抗体採取にて、予め採取したＦ（ａｂ’）2処理化した第１のモノクローナル抗体と結合させたインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを選択した。
４－１．サンドイッチＥＬＩＳＡ法
（i）Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ（登録商標） Ｆ（ａｂ’）2 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製　Ｐｒｏｄ＃４４８８８）を使用して第１のモノクローナル抗体（ここでは６６２２１抗体）をＦ（ａｂ’）2処理化した。
（ii）ＰＢＳ溶液に２μｇ／ｍＬの濃度に調製したＦ（ａｂ’）2処理化済み第１のモノクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＢＳＡ-ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
（iii）ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０－ＡＩ５１）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iv）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで段階希釈した融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（v）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ－Ｇｔ－Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－Ｆｃ（ＢＥＴＨＹＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製　Ａ９０―１３１Ｐ）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで１００００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
(vi)ＰＢＳＴで３回洗浄後、基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（vii）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
５．クローニング及びモノクローナル抗体採取
　上記３．及び４．のスクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングし、それぞれハイブリドーマ６６２２１、６６２２６を得た。次いで各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取するため、２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５×１０6個の量で腹腔内に投与した。１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和後、ＰＢＳで透析を行い、抗体を採取した。
以下、６６２２１抗体、６６２２６抗体としてそれぞれ試験に用いた。
６６２２１抗体及び６６２２６抗体を産生するハイブリドーマは、出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に２００９年４月８日に寄託手続がされ、受託番号（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１８００、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１８０１）が付与され、その後２０１０年２月１７日に原寄託に基づくブタペスト条約に基づく寄託へ移管され、受託番号（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３３、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３４）が付与されている。
〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のプロインスリン及びインスリン類似化合物との交差反応性
６６２２１抗体及び６６２２６抗体のプロインスリン及びインスリン類似化合物との交差反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて試験を行った。インスリン類似化合物としては、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミルなどのインスリンアナログ製剤を用いた。
１．試薬及び器具
１－１．モノクローナル抗体
（i）６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
（ii）６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
１－２．アナライト
（i）リコンビナントヒトインスリン：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製　３０－ＡＩ５１
(ii)プロインスリン：ＩＲＲ社製　Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ，　Ｈｕｍａｎ，　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，　ＮＩＢＳＣ　ｃｏｄｅ：　８４／６１１
（iii）インスリンアナログ製剤
　　　（１）インスリンリスプロ１００単位／ｍＬ：日本イーライリリー社製、
　　　（２）インスリンアスパルト１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
　　　（３）インスリングラルギン１００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
　　　（４）インスリンデテミル１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
１－３．Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式（Ｂｉａｃｏｒｅ社製：現ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、次の（i）～（viii）はＢｉａｃｏｒｅ社製当時の製品及びカタログＮｏ．であるが、現在はＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手可能である。）
（i）Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）　Ｔ１００：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＪＪ－１０３７－０２
（ii）Ｓｅｒｉｅｓ　Ｓ　Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００５－３０
（iii）Ａｍｉｎｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｋｉｔ：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１０００－５０
（iv）Ａｃｅｔａｔｅ　５．０：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００３－５１
（v）α－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００５－１４
（vi）Ｇｌｙｃｉｎｅ　１．５：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００３－５４
（vii）Ｇｌｙｃｉｎｅ　２．０：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００３－５５
（viii）ＨＢＳ－ＥＰ＋　１０×（ランニングバッファー）：Ｂｉａｃｏｒｅ社製　ＢＲ－１００６－６９（使用時、ＮａＯＨでｐＨ８．５に調製後、精製水にて１０倍希釈して用いる。）
２．試験方法
Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐに固定化したα－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓに６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体をキャプチャーさせ、アナライトとしてインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤を添加することでそれぞれの反応性を評価した。具体的な操作手順は以下のとおりである。
（i）Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５にα－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓを固定化した（付属の取扱説明書に従った）。
（ii）ＨＢＳ－ＥＰ＋　（ｐＨ８．５）で６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体を５μｇ／ｍＬとなるよう希釈し、流速３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間添加した。
（iii）ＨＢＳ－ＥＰ＋　（ｐＨ８．５）で各種抗原を１０ｎｇ／ｍＬに希釈し、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの２濃度につき各１２０秒間添加した。またその際にフリーランニングによる解離時間を１２０秒間と設定した。
（iv）Ｇｌｙｃｉｎｅ　１．５とＧｌｙｃｉｎｅ　２．０を１：１で混合して再生溶液とし、再生処理を１８０秒間行った。
３．結果
３－１．インスリンとの反応結果
　６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンとの反応性を確認した。結果を図２及び図３に示す。インスリン濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて、６６２２１抗体では８．５ＲＵの反応性が認められた（図２）。一方、６６２２６抗体では全く反応性が認められなかった（図３）。なお、縦軸「ＲＵ」とはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定系における独自の単位を示しており、センサー表面上での反応による質量変化を表している。
３－２．プロインスリン及びインスリンアナログ製剤との反応結果
　６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてプロインスリンあるいは各種インスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）との反応性を確認した。結果を図４－１、図４－２、図５－１及び図５－２に示す。抗原濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて、６６２２１抗体ではいずれも５．５～１３ＲＵのレスポンスが認められた。一方、６６２２６抗体では全く反応性が認められなかった。
〔実施例１〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定１＜ＬＴＩＡ法＞
１．ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器　（容量２Ｌ）　に、蒸留水１１００ｇ、スチレン２００ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．２ｇ、及び、蒸留水５０ｇに過硫酸カリウム１．５ｇを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で攪拌しながら４８時間重合した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置　（日本電子社製、「ＪＥＭ－１０１０型」）　を用いて１００００倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低１００個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は０．３μｍであった。
２．抗インスリン抗体感作ラテックス粒子の調製
２－１．６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
　平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ　トリス緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌという）（ｐＨ８．５）に、等量の５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で０．６０ｍｇ／ｍＬに希釈した６６２２１抗体溶液を添加して４℃２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡ含有５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して４℃１時間攪拌した。次に、これを遠心して上清を除去後、沈殿を５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で再懸濁し、６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
２－２．６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
　平均粒子径０．３μｍのラテックスを用いて上記と同じ方法により６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
３．試薬の調製
３－１．第一試薬の調製
　５００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含む５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を調製し第一試薬とした。
３－２．第二試薬の調製
　６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液及び６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で波長６００ｎｍでの吸光度が５．０Ａｂｓとなるように希釈して第二試薬とした。
４．測定方法
　第一試薬と第二試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いてインスリン濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度０μＵ／ｍＬ、５μＵ／ｍＬ、２５μＵ／ｍＬ、５０μＵ／ｍＬ、１００μＵ／ｍＬ、２００μＵ／ｍＬのインスリン溶液１０μＬに、第一試薬１５０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第二試薬５０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
５．測定結果
　表１よりインスリン濃度依存的に感度が上昇し定量が可能であることが確認された。
〔実施例２〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定２＜ＥＬＩＳＡ法＞
６６２２１抗体及び６６２２６抗体をそれぞれ固相化し、２次抗体としてそれぞれ別の抗体を組み合わせてインスリン、プロインスリン及びインスリン類似化合物の反応性についてＥＬＩＳＡ法を用いて試験を行った。
１．使用した抗体及び抗原種
（１）モノクローナル抗体
６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
（２）抗原種
インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）は、試験例２と同じものを用いた。
２．ＥＬＩＳＡ測定方法
（i）ＰＢＳに６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体を２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を９６穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ固相化し、室温で２時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴ４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
（iii）ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトインスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤をＢＳＡ－ＰＢＳＴで各０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iv）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ビオチン標識化した６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体をＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（v）ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＰＩＥＲＣＥ社製　Ｐｒｏｄ＃２１１２６）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（vi）ＰＢＳＴで３回洗浄後、基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（vii）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
３．結果
３－１．６６２２１抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表２及び図６に示す。
６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、インスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められたものの、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）では濃度依存的な吸光度の上昇がまったく認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３－２．６６２２６抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表３及び図７に示す。
６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）のいずれに対しても濃度依存的な吸光度の上昇が全く認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４．考察
前記結果より、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤とは交差反応性を示さないことから、それらの影響を受けずにインスリンのみを定量できることがわかる。また、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合には、インスリンを測定できなかったことから、６６２２６抗体は、インスリンとは反応性を示さず、６６２２１抗体が結合したインスリンと反応することがわかる。一方、前記試験例２のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた本発明のモノクローナル抗体の交差反応性試験結果では、６６２２１抗体は、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤のいずれとも反応するものの、６６２２６抗体では、それらいずれとも反応しなかった。
これらのことから、本測定系の反応機序としては、６６２２１抗体が先にインスリンに結合することで、インスリンに何らかの構造変化が起こり、６６２２６抗体は当該構造変化部位を特異的に認識することでサンドイッチが成立するものと考えられる。
〔試験例３〕本発明のモノクローナル抗体のインスリン類似化合物との交差反応性
　６６２２１抗体及び６６２２６抗体のインスリン類似化合物との交差反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて試験を行った。インスリン類似化合物として、インスリンアナログ製剤であるインスリングルリジンを用いた。
１．試薬及び器具
１－１．モノクローナル抗体
（i）６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
（ii）６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
１－２．アナライト
インスリンアナログ製剤
（i）インスリングルリジン　１００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
１－３．Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式
　Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式は、試験例２と同じものを用いた。
２．試験方法
　アナライトとしてインスリンアナログ製剤であるインスリングルリジンを用いた以外は試験例２に記載の方法と同様に行った。
３．結果
３－１．インスリンアナログ製剤との反応結果
　６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンアナログ製剤・インスリングルリジンとの反応性を確認した。結果を図８に示す。６６２２１抗体及び６６２２６抗体のいずれも全く反応性が認められなかった。なお、縦軸「ＲＵ」とはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定系における独自の単位を示しており、センサー表面上での反応による質量変化を表している。
〔実施例３〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定３＜ＥＬＩＳＡ法＞
６６２２１抗体及び６６２２６抗体をそれぞれ固相化し、２次抗体としてそれぞれ別の抗体を組み合わせてインスリン、プロインスリン及びインスリン類似化合物の反応性についてＥＬＩＳＡ法を用いて試験を行った。
１．使用した抗体及び抗原種
（１）モノクローナル抗体
６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
（２）抗原種
インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）。
２．ＥＬＩＳＡ測定方法
インスリンアナログ製剤としてインスリングルリジンを用いた以外は、すべて実施例２と同様の方法で行った。
３．結果
３－１．６６２２１抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表４及び図９に示す。
実施例２と同様、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、インスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められたものの、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）では濃度依存的な吸光度の上昇がまったく認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
３－２．６６２２６抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表５及び図１０に示す。
実施例２と同様、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）のいずれに対しても濃度依存的な吸光度の上昇が全く認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
４．考察
前記結果より、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合のいずれも、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンとは交差反応性を示さないことがわかった。
本発明のモノクローナル抗体によれば、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けずに、感度の高い、正確なインスリン測定が可能となった。また、本発明によれば、β細胞からのインスリン分泌を正確に把握できることから、糖尿病の病態把握に用いることもでき、非常に有用である。
（１）ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３３
（２）ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３４
[寄託生物材料への言及]
（１）６６２２１抗体を産生するハイブリドーマ６６２２１
イ　当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ　イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ　イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３３
（２）６６２２６抗体を産生するハイブリドーマ６６２２６
イ　当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ　イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ　イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２３４

Claims (23)

  1. 抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いることを特徴とする、インスリン測定方法。
  2. ２種の抗体を用いるインスリン測定方法であって、
    １）第１の抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
    ２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
    請求項１に記載のインスリン測定方法。
  3. 第１の抗体及び第２の抗体が、ともにモノクローナル抗体である請求項２に記載のインスリン測定方法。
  4. 第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載のインスリン測定方法。
  5. 第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、請求項３に記載のインスリン測定方法。
  6. 少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項３～５のいずれかに記載のインスリン測定方法。
  7. 第２のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項３～６のいずれかに記載のインスリン測定方法。
  8. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する請求項３，５，６，７のいずれかに記載のインスリン測定方法。
  9. 第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する請求項３，５，６，７のいずれかに記載のインスリン測定方法。
  10. 第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識しており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する請求項３，５，６，７のいずれかに記載のインスリン測定方法。
  11. 抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、該抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を含むことを特徴とするインスリン測定試薬。
  12. ２種の抗体を含むインスリン測定試薬であって、
    １）第１の抗体はインスリンと反応する性質を有し、
    ２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
    請求項１１に記載のインスリン測定試薬。
  13. 第１の抗体及び第２の抗体がともにモノクローナル抗体である請求項１２に記載のインスリン測定試薬。
  14. 第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のインスリン測定試薬。
  15. 第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のインスリン測定試薬。
  16. 少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項１３～１５のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
  17. 第２のモノクローナル抗体は、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項１３～１６のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
  18. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する請求項１３，１５，１６，１７のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
  19. 第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する請求項１３，１５，１６，１７のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
  20. 第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識しており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する請求項１３，１５，１６，１７のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
  21. 以下の性質を有することを特徴とする、モノクローナル抗体。
    １）インスリンに結合する抗体が結合していないインスリンとは反応しない
    ２）インスリンに結合する抗体が結合したインスリンとは反応する
  22. さらに、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しないという性質を有する請求項２１に記載のモノクローナル抗体。
  23. 下記工程を含むモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
    １）インスリンと反応する抗体を選択する工程
    ２）１）で選択した抗体が結合していないインスリンとは反応せず、当該抗体が結合したインスリンと反応するモノクローナル抗体を選択する工程
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