JP6182027B2 - B型インフルエンザウイルスの測定方法 - Google Patents
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Description
1.B型インフルエンザウイルスM1抗原の調製
B/Florida/4/2006株ウイルスRNAから逆転写反応により構築したcDNAライブラリーを基にM1をコードするDNAをプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでM1を発現させた。M1は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、該精製品を精製M1抗原と呼ぶ。
精製M1抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、精製M1抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗B型インフルエンザウイルスM1抗体を得た。
1.抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体の作製
B型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスNP抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
1.抗B型インフルエンザウイルスM1抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例1で精製した抗B−M1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗M1抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
参考例1で作製した抗NP抗体を用いて前述の実施例2−1と同様の方法により、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗NP抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
実施例1で作製した抗B−M1抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊し、抗B型インフルエンザウイルスM1抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗M1抗体固定化粒子と呼ぶ。
参考例1で作製した抗B−NP抗体を用いて前述の実施例2−3と同様の方法により、抗B型インフルエンザウイルスNP抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗NP抗体固定化粒子と呼ぶ。
3および4で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。本明細書において、乾燥パッドと呼ぶ。
1および2で作製した抗体固定化メンブレンと5で作製した乾燥パッドを他部材(バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド)とを貼り合せて5mm幅に切断し、B型インフルエンザウイルス試験片とした。本明細書において、試験片と呼ぶ。なお、貼り合わせの際に、抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの少なくとも一方に抗B−M1抗体が含まれる組み合わせとなるように試験片を作製した。
6で作製した試験片のサンプルパッドに、B型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液(10mM ADA(pH6.0)、1%ポリオキシエチレンアルキルエーテル)を60μL滴加し、8分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に+と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。本試験において、全ての組み合わせの試験片、すなわち抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの一方または両方が抗B−M1抗体であるときに+となった。
1.B型インフルエンザウイルスリコンビナントM1の調製
実施例1−1で構築したcDNAライブラリーを基に、M1アミノ酸配列の1〜124番目をコードするDNAおよび125〜248番目をコードするDNAをそれぞれプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでリコンビナントM1を発現させた。リコンビナントM1は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、前者のアミノ酸配列から成るリコンビナントM1をM1−N、後者のアミノ酸配列から成るリコンビナントM1をM1−Cと呼ぶ。
精製M1抗原、M1−N、M1−Cを用いて実施例1で得られた抗体の反応性を確認した。SDS−PAGEは10%アクリルアミドゲルを用いて常法で行った。電気泳動後、PVDF膜に転写した。スキムミルクでブロッキングを行った後、PBS−Tweenで十分に洗浄した。PBS−Tweenで1μg/mLに調整した抗B−M1抗体を室温で1時間反応させた。PBS−Tweenで十分に洗浄した後、3000倍に希釈したHRP標識抗マウス抗体を室温で1時間反応させた。PBS−Tweenで十分に洗浄した後、化学発光検出試薬を用いてシグナルを検出した。試験した抗体は精製M1抗原と反応することが確認され、M1−Nに反応する抗体と、M1−Cに反応する抗体とに判別された。結果を図2に示す。本明細書において、前者の抗体を抗M1−N抗体、後者を抗M1−C抗体と呼ぶ。
1.抗M1−N抗体と抗M1−C抗体とを組み合わせた試験片の作製
実施例2−6と同様の方法で以下の試験片を作製した。抗体固定化メンブレンと乾燥パッドとを、抗M1−N抗体同士で組み合わせた試験片(NN試験片)、抗M1−C抗体同士で組み合わせた試験片(CC試験片)、抗体固定化メンブレンに抗M1−N抗体を用い乾燥パッドに抗M1−C抗体を用いた試験片(NC試験片)、抗体固定化メンブレンに抗M1−C抗体を用いた乾燥パッドに抗M1−N抗体を用いた試験片(CN試験片)。
対照として、実施例2−6と同様の方法で、抗NP固定化メンブレンと抗NP固定化粒子を用いた試験片を作製した(従来法試験片)。
1および2で作製した試験片のサンプルパッドに、B型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液(10mM ADA(pH6.0)、1%ポリオキシエチレンアルキルエーテル)を60μL滴加し、8分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に+と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。CC試験片は従来法試験片に比べて4倍高い検出感度を示した。結果を表1に示す。
ロ 標識体領域
ハ 検出領域
ニ サンプルパッド
ホ 吸収帯
ヘ バッキングシート
Claims (6)
- B型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質(M1)の125〜248番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する2種類のモノクローナル抗体であって、同時にM1の125〜248番目のアミノ酸領域に結合できる2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法によりB型インフルエンザウイルスを免疫測定することを含む、B型インフルエンザウイルスの測定方法。
- 前記サンドイッチ法がイムノクロマト法である請求項1記載の方法。
- 前記サンドイッチ法がELISA法である請求項1記載の方法。
- B型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質(M1)の125〜248番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する2種類のモノクローナル抗体であって、同時にM1の125〜248番目のアミノ酸領域に結合できる2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、B型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキット。
- 前記モノクローナル抗体の一方である第1抗体またはその抗原結合性断片が支持体上に固定化された検出領域と、前記もう一方のモノクローナル抗体である第2抗体またはその抗原結合性断片を検体と共に供給する標識体領域と、検体移動領域を備えたイムノクロマト免疫測定器具である、請求項4記載のB型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキット。
- 前記モノクローナル抗体の一方である第1抗体またはその抗原結合性断片が固定化された支持体と、前記もう一方のモノクローナル抗体である第2抗体またはその抗原結合性断片を含む請求項4記載のB型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキット。
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