JPWO2014157723A1 - インスリン測定方法 - Google Patents

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Abstract

血液試料測定の際の非特異反応が抑制されたヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定方法及び測定試薬を提供することを課題とする。ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行う。

Description

本発明は、血液試料測定の際の非特異反応が抑制されたヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定方法及び測定試薬に関する。
ヒトインスリンは分子量５８０７のペプチドで、糖尿病の診断・治療上、重要な分子マーカーの一つである。ヒト血液試料中のインスリンの免疫学的測定は、その濃度の問題から、長らく競合法ＲＩＡあるいは化学発光免疫測定法が主流であったが、近年のラテックス凝集免疫測定方法（ＬＴＩＡ）の高感度化に伴い、生化学自動分析装置に適用可能なＬＴＩＡ用試薬が報告され、一部は市販されるに至っている。
非特許文献１の方法は、抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を用いたサンドイッチＬＴＩＡ法であるが、サンドイッチＬＴＩＡによるペプチドの測定は実用化された例が少ないため、なお課題が存在する。
国際公開第２０１１／０１０６７３号パンフレット
関東化学株式会社 サイアス ＩＮＳＵＬＩＮ II 添付文書（２０１０年２月作成）
本発明者らは非特許文献１に記載された方法での測定値が、従来のヘテロジニアス化学発光酵素免疫測定方法（従来法）での測定値と乖離する検体を選抜し、その検体を用いてサンドイッチＬＴＩＡ法での非特異反応の抑制方法について検討したところ、特定のｐＨ緩衝剤を２種類以上緩衝液中に含有させた状態でＬＴＩＡ法での免疫反応を行うと、従来法の測定値との乖離度合を縮小できることを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下に関するものである。
［１］ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とするインスリンの測定方法。
［２］ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物がＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ及びＴｒｉｓからなる群より選ばれるものである、［１］に記載の測定方法。
［３］緩衝液のｐＨが７．３〜７．８である、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とする、インスリンの粒子凝集免疫測定方法における血液試料由来の非特異反応の抑制方法。
本発明の測定方法によれば血液試料測定の際の非特異反応を抑制してヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定を行うことができる。免疫測定方法に使用されるｐＨ緩衝剤は、抗原抗体反応時のｐＨの至適化を目的として処方されており、ｐＨ緩衝域を拡大するためや、主たるｐＨ緩衝剤と組み合わせてｐＨを調整するために２種類のｐＨ緩衝剤を使用することはこれまでも行われてきたが、特定の２種類以上のｐＨ緩衝剤を緩衝液中に含有させると、非特異反応が抑制されることは予想できず、全く意外なことである。
従来のＬＴＩＡ法の測定結果と本発明方法の測定結果の相関図である。上段：化学発光酵素免疫測定方法（ルミパルスプレスト（登録商標）インスリン、富士レビオ社）と従来のＬＴＩＡ法（サイアスＩＮＳＵＬＩＮII、関東化学社）、下段：化学発光酵素免疫測定方法（ルミパルスプレスト（登録商標）インスリン、富士レビオ社）と本発明方法。
本発明方法の測定対象となる血液試料は全血、血清、血漿である。
本発明方法におけるｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液は、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）及びＴｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）からなる群より選ぶことができる。該緩衝液（ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物２種類以上含有させた場合の該ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物２種類以上の合計濃度）の好適な濃度範囲は１００ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは２００ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは４００ｍＭ〜８００ｍＭであり、該緩衝液の好適なｐＨは７．３〜７．８である。
本発明方法に使用可能な抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子は、特許文献１ほか、当業者に公知の方法により得ることができる。
本発明を実施するための試薬の形態は、通常使用されるラテックス凝集免疫測定試薬の形態を取ることができる。例えば、本発明の緩衝液を第一試薬とし、抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有する溶液を第二試薬とする形態や、本発明の緩衝液に抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有させた一試薬形態を挙げることができる。
また、本発明を実施するための試薬には、ラテックス凝集免疫測定試薬に含有させることが公知の各成分、例えば、カルシウムやマグネシウムなどの金属イオン、イオン性、非イオン性、両性などの界面活性剤、ＥＤＴＡなどのキレーター、デキストラン硫酸などの多糖や高分子化合物、アルブミンなどのタンパク質、Ｈｅｔｅｒｏ Ｂｌｏｃｋ（Omega Biologicals, Inc.）、ブロックエース（ＤＳファルマ社）、ＢＰＦ（東洋紡社）などの市販のブロッキング剤、抗ＩｇＭ抗体などと含有させることができる。
本発明方法の具体的な手順として、日立７１７０型自動分析装置などの分析装置を使用し、血液試料を主にｐＨ緩衝液からなる第一試薬に添加しインキュベートした後、そこに抗インスリン抗体を担持したラテックス粒子を含有する第二試薬を添加し、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ等の適当な波長での吸光度を測定し、インスリン濃度を求めることにより行うことができる。
なお、前述の本発明方法におけるｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物の濃度は、第一試薬と第二試薬の容量混合比が３：１の場合で記載している。
次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例１］
１．測定操作
２１８例の患者血清を化学発光酵素免疫測定方法（ルミパルスプレスト（登録商標）インスリン、富士レビオ社）、従来のＬＴＩＡ法（サイアスＩＮＳＵＬＩＮII、関東化学社）、本発明方法で測定した。
本発明方法は、特許文献１に記載の抗インスリンモノクローナル抗体感作ラテックスを使用して以下の第一試薬、第二試薬を調製して行った。
第一試薬
６００ｍＭ ＭＥＳ
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
２００ｍＭ ＮａＣｌ
５０μｇ／ｍＬ Ｈｅｔｅｒｏ Ｂｌｏｃｋ（Omega Biologicals, Inc.）
２００μｇ／ｍＬ 抗ＩｇＭ抗体
ｐＨ７．５
第二試薬
７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ
６６２２１抗体感作ラテックス
６６２２６抗体感作ラテックス
ｐＨ８．０
日立７１７０型自動分析装置を用い、血清１０μＬを第一試薬１５０μＬに添加し５分、３７℃でインキュベートした後、そこに第二試薬５０μＬを添加し、測光ポイント１９−３４のタイミングで主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍでの吸光度を測定し、インスリン濃度を求めた。
２．測定結果
化学発光酵素免疫測定方法の測定値を１００とした場合、従来のＬＴＩＡ法では８１例の血清で±３０％を超える値を示した。一方、本発明方法では、±３０％を超える値を示す血清は認められなかった。化学発光酵素免疫測定方法の測定値をＸ、従来のＬＴＩＡ法の測定値又は本発明方法の測定値をＹとし、相関関係を確認した。結果を図１に示す。本発明方法では、従来のＬＴＩＡ法で認められた化学発光酵素免疫測定方法の測定との乖離が収束していることがわかる。
本発明によれば、ヒトインスリンのラテックス凝集免疫測定方法における血液試料測定の際の非特異反応を抑制することが可能となった。本発明では、通常ｐＨ緩衝剤として使用されるアミン化合物を選択して使用することにより該効果を得ることができるため、試薬処方の設計に不要な制限が付加されることがなく、工業的に非常に有用である。
（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４
[寄託生物材料への言及]
（１）６６２２１抗体を産生するハイブリドーマ６６２２１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３
（２）６６２２６抗体を産生するハイブリドーマ６６２２６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４

Claims (4)

  1. ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とするインスリンの測定方法。
  2. ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物がＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ及びＴｒｉｓからなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の測定方法。
  3. 緩衝液のｐＨが７．３〜７．８である、請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. ｐＨ緩衝作用を有するアミン化合物を２種類以上含有する緩衝液中で、抗インスリン抗体を担持した粒子による免疫反応を行うことを特徴とする、インスリンの粒子凝集免疫測定方法における血液試料由来の非特異反応の抑制方法。
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