CN113784983A - Cd93特异性治疗性抗原结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人CD93特异性抗原结合域多肽(ABD)，所述ABD可以形成抗体、嵌合抗原受体等。包含抗CD93CAR的T细胞可用于治疗癌症，例如恶性血液病。

Description

CD93特异性治疗性抗原结合蛋白及其使用方法

交叉引用

本专利申请案主张于2019年3月2日提交的编号为62/813,009的美国临时专利申请案的优先权，

上述专利中的内容以引用方式全文并入本文中。

背景技术

近年来，免疫肿瘤学方法已成为一种有效的癌症治疗方法，它可以利用个体免疫***的能力来消除癌细胞。在癌症进展过程中，癌细胞可能会发生一系列适应性反应来逃避宿主免疫应答，其中癌细胞可以通过改变其表型来逃避细胞毒性或促炎性免疫应答。这种适应性过程可以由特异性或非特异性免疫机制触发。例如，癌细胞可能会劫持通常限制炎性反应和免疫应答的机制，从而保护自己。免疫疗法可以在各个方面阻断这些癌症逃避机制，恢复针对癌细胞的免疫应答。因此，免疫疗法或有可能使免疫***再次发现癌细胞，从而触发主动或被动免疫介导的癌症控制。

在临床应用或临床试验中，现有多种疗法可用于增强宿主免疫***对癌症做出的应答，包括，例如：检查点阻断，使对肿瘤抗原不再产生应答的耗竭性T细胞恢复活力；阻断先天免疫细胞机制，防止吞噬细胞破坏癌细胞；施用细胞因子，例如IL-2，增强T细胞活性；施用与肿瘤细胞抗原选择性结合并通过抗体依赖性机制(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))增强杀灭力的抗体；体外扩增和活化宿主T细胞或宿主树突细胞；等等。

基于T细胞的疗法的有效性可能因施用或活化的T细胞的抗原选择性而异。抗原特异性可以通过基因修饰和重定向T细胞以靶向肿瘤中过表达的抗原来改变。一种修饰方法是改造患者T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，以便生成能够更有效地靶向肿瘤的T细胞。T细胞已通过以下方式用于此目的：首先利用病毒和非病毒转染方法修饰细胞，然后在培养物中扩增经修饰的细胞以重新引入患者体内。

CAR的细胞外结构域包含抗原结合域，其通常通过间隔区与跨膜结构域分隔开来。源自抗体的单链可变区经常用于此目的，但也使用了抗原结合域(例如Fab片段)和其他配体。这些抗原结合域的使用可使CAR绕过抗原识别的MHC限制。

CAR T细胞已成功应用于恶性血液病的治疗中，例如使用抗CD19 CAR T细胞治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。用于治疗恶性血液病的其他抗原包括CD20和CD30。

虽然CAR T细胞在淋巴细胞白血病中的应答率非常高，但在许多患者中仍观察到抗原逃逸现象。因此，需要探索新的靶向血液学标志物，开发靶向疗法，从而得到更安全、更有效的方法。

发明内容

本发明提供了与CD93抗原结合域(ABD)相关的组合物和方法。所述抗CD93 ABD由一种或更多种与人CD93特异性结合的可变区多肽组成。所述ABD可与多种效应子多肽(包括但不限于嵌合抗原受体)、抗体及其片段和衍生物连接(例如，缀合或融合)，所述多肽可以称之为抗CD93 ABD构建体。实施例包括编码所述ABD的多核苷酸；包含编码所述抗CD93 ABD的多核苷酸的载体；经改造以表达所述抗CD93 ABD的细胞；以及包含经改造以表达所述抗CD93 ABD的细胞的药物制剂。所述抗CD93 ABD特别适合作为试剂用于人CD93相关疾病的诊断和免疫治疗，尤其是癌症治疗。

在一实施例中，所述抗CD93 ABD与CAR的效应子多肽共价连接，例如缀合或融合。在一些实施例中，CAR的所述抗CD93 ABD是单链可变区。在一些实施例中，所述抗CD93 ABD包含人源化可变区序列。在一些实施例中，抗CD93 CAR由人T细胞表达。在一些实施例中，抗CD93 CAR是双特异性CAR，其中第二抗原特异性可以是指存在于血液恶性肿瘤细胞上的抗原，例如，CD123、FLT3、TIM3、CD99、CD96、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)等。在其他实施例中，工程化T细胞表达抗CD93 CAR以及对存在于血液恶性肿瘤细胞上的抗原具有特异性的第二CAR。

在一些实施例中，T细胞在转移到受试者中之前，在离体处理中经基因修饰以引入编码抗CD93 CAR的基因序列。在一些实施例中，所述经基因修饰的细胞在体外扩增。可以向有相应需求的患者施用有效剂量的经基因修饰的细胞。T细胞包括但不限于初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、辅助性T细胞(例如，TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH)、记忆性T细胞(例如，中枢记忆性T细胞、干细胞记忆性T细胞(TSCM)、效应记忆性T细胞)、NK T细胞等。在一些实施例中，工程化T细胞包含免疫细胞的复杂混合物，例如从需要治疗的个体中分离出的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。

在其他实施例中，所述抗CD93 ABD以下列形式提供：与免疫球蛋白效应子序列(例如scFv)连接(例如，缀合或融合)的多肽；全长嵌合或人源化抗体，例如具有任何同种型的人免疫球蛋白恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA等；或抗体片段，例如F(ab')₂片段和F(ab)片段等。抗CD93抗体可以用可检测标记进行标记、固定在固相上和/或与异源化合物缀合。所述抗体还可以作为与第二抗原(尤其包括其他癌症抗原)或免疫治疗试剂(例如抗CD3、抗PD-1/PD-L1、抗CTLA-4、抗CD40、抗CD47等)反应的双特异性或多特异性抗体提供。

实施例包括抗CD93 CAR、抗CD93抗体及其衍生物和片段，其包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结构域多肽中的一项或两项的抗CD93 ABD，其中VH多肽包含至少一个、至少两个、至多3个如本文所提供以及如序列号：3、4和5所示的VH CDR序列；VL多肽包含至少一个、至少两个、至多3个如本文所提供以及如序列号：8、9和10所示的VL CDR序列，其结合来自可变区的框架序列，例如人VH或VL框架序列。在一些实施例中，抗CD93 ABD包含至少一个VL序列(其包含位于可变区框架中的3个如本文所提供的轻链CDR序列，所述框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架)以及至少一个VH序列(其包含位于可变区框架中的3个如本文所提供的重链CDR序列，所述框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架)。

在一些实施例中，所述抗CD93 ABD包含所提供的VH和VL序列的CDR中的一个或更多个的氨基酸序列变体，所述变体包含CDR残基内或邻近CDR残基的一个或更多个氨基酸***和/或CDR残基内或邻近CDR残基的缺失和/或CDR残基的取代(取代是产生此类变体的优选氨基酸改变类型)。此类变体相对于人CD93的结合亲和力通常至少约为10^-8，而且此类变体将同与具有本文所述的氨基酸序列的抗CD93 ABD相同的表位结合。

在一些实施例中，提供了治疗方法，尤其涉及消除表达CD93的癌细胞，包括但不限于血液恶性肿瘤细胞。在一些实施例中，所述癌症是恶性血液病，其中所述癌细胞表达CD93。在一些实施例中，所述恶性血液病是白血病，包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)和混合谱系白血病(MLL)。在一些实施例中，所述恶性血液病是骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施例中，所述恶性血液病是骨髓增殖性肿瘤(MPN)，所述疾病包括但不限于骨髓纤维化、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症等。方法可以包含向有需求的接受者(例如患有癌症的个体)体内引入工程化细胞群，其中所述细胞群已通过以有效减少存在于所述接受者体内的癌细胞数量的剂量引入编码抗CD93 ABD(尤其是抗CD93 CAR)的序列进行了修饰。所述细胞群可以离体工程化，并且通常相对于所述接受者是自体同源的或同种异体的。

在一些实施例中，提供了工程化细胞，例如，工程化T细胞，其中所述细胞已通过引入抗CD93 ABD编码序列(例如，抗CD93 CAR、抗CD93 scFv、抗CD93抗体等)进行了修饰。所述工程化细胞可以单位剂量提供以用于治疗，且相对于预期接受者可以是同种异体的、自体同源的等。可以使用任何合适的载体(例如，病毒载体、整合载体等)在体内或体外引入编码序列。

在一些实施例中，提供了包含编码多肽(包含抗CD93 ABD)的多核苷酸序列的载体，其中所述编码序列与在所述所需细胞中具有活性的启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子可以是组成型的或诱导型的。有多种载体为本领域所熟知并且可以用于此目的，例如病毒载体、质粒载体、微循环载体，所述载体可以整合到所述靶细胞基因组中，或者可以维持附加体。所述载体可装在试剂盒中提供。

附图说明

结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：

图1.重链可变区(A)和轻链可变区(B)的氨基酸序列。CDR带有下划线。

图2.小鼠和人源化F11重链可变区(A)和轻链可变区(B)比较。CDR已按指示标记。

图3.人源化和嵌合F11单克隆抗体以相似的亲和力结合人CD93。将人CD93/Fc融合蛋白包被在96孔板中，添加不同浓度的所示抗体。将HRP缀合的抗人κ抗体用作二抗。CD93结合活性通过读取OD₄₉₀ nm处的信号来测定。

图4.CD93在正常人白细胞上的表达。对于B细胞、T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、血小板、红细胞和NK细胞，人外周血分别用PE缀合的抗CD93抗体和APC缀合的抗CD19、CD3、CD14、CD15、CD41a、CD235a或CD56共染色。数据表示三分之一供体的数据。

图5.CD93在人原代rMLL AML样本(A)和其他AML(B)细胞上的表达。人原代rMLLAML和其他AML细胞用PE缀合的抗CD93(蓝色)或同种型抗体(红色)染色，CD93表达情况通过流式细胞术测定。

图6.CD93在正常人造血干细胞以及来自各种骨髓增殖性肿瘤(包括慢性髓系白血病(CML)、骨髓纤维化(MF)和真性红细胞增多症(PV))的白血病干细胞上的表达。

图7.CD93 CAR T细胞构建体与在原代人T细胞中的表达。A.产生了四种CD93特异性CAR T细胞变体，其中scFv的V_L和V_H部分的顺序不同，然后是CD28或41-BB细胞内共刺激结构域(以及CD28或CD8跨膜结构域)，其后是CD3δ。将各构建体***MSGV1逆转录病毒载体中。B.对于用源自CD93 F11构建体的四种逆转录病毒中的每一种转导的原代人T细胞，先用CD93-Fc融合蛋白染色，然后用抗人IgG Fc染色。所有逆转录病毒构建体都具有高转导效率和相似的CAR表达水平。

图8.CD93特异性CAR T细胞用CD93阳性AML细胞系孵育时会产生细胞因子。A.AML细胞系先用Fc嵌段处理，然后用生物素化HuF11抗体染色，接着用链霉亲和素APC染色或仅用链霉亲和素APC作为对照。CD93在许多AML细胞系中高度表达，包括THP-1、Kasumi、MOLM-13、NOMO-1和OCI-AML3，但在HEL-2上不表达。B.1x10⁵ AML细胞用1x10⁵空白对照品、F11 28δLH、F11 28δH-L、F11BBδL-H或F11 BBδH-L CAR T细胞孵育24小时。在24小时时，收集上清液并对IFNγ和IL-2进行ELISA。结果表示至少三项独立实验的相应结果。

图9.CD93 CAR T细胞在体外有效杀灭AML细胞。将稳定表达GFP的5x10⁴THP-1AML细胞用空白对照品、F11 28δL-H、F11 28δH-L、F11 BBδL-H或F11 BBδH-L CAR T细胞以1:1(左)或1:8(右)的E:T比例孵育96小时。体外

杀灭测定法测定了GFP表达随时间的倍数变化，作为细胞生长的替代指标。结果表示至少三项独立实验的相应结果。

图10.CD93 CAR T细胞在患者来源异种移植模型中的有效性和持久性。(A)实验设计：将1x10⁶ SU555 AML细胞注入经辐照的NSG中，3个月后系列骨髓抽吸物(BMA)显示达到适当的移植水平。将小鼠随机分组并用5x10⁶转导的空白对照品(N＝4)或CD93 BBz(N＝5)CAR T细胞进行治疗，然后用系列BMA测定白血病细胞清除率和T细胞的持久性。(B)白血病移植(％CD45+CD33+)和(C)CAR T细胞持久性(％CD45+CD3+)在CAR T治疗当天以及7天和21天后利用BMA通过流式细胞术进行测定。(D)生成了生存曲线。基于Gehan-Breslow-Wilcoxson检验，生存差异具有统计学意义。

图11.CD93在原代AML样本、HSC和AML细胞系上的表达。(A)与同种型对照品相比，CD93在原代AML样本SU042和SU555上高度表达(通过用CD93抗体染色进行分析)。(B)CD93在原代患者AML样本、MLL重排(MLLr)和非MLLr白血病细胞上的表达与在HSC上的表达的倍数差异。(C)经人源化mCD93抗体(F11)染色的AML细胞系中大多数AML细胞呈CD93阳性，但各细胞系之间并且有时各细胞系内的染色时间不一致。(D)CD93在单核细胞和嗜中性粒细胞上以低水平表达，但在其他成熟造血细胞上并非如此。

图12.CAR设计、扩增和表达。(A)CD93 CAR构建体使用人源化mCD93抗体(F11)的scFv设计，并克隆到逆转录病毒质粒中。(B)原代T细胞逆转录病毒转导后CD93 CAR T细胞的扩增动力学。虽然CD93 BBz的扩增动力学比CD93 28z慢，但两种CAR T细胞产物均能稳健扩增。(C)CD93 CAR T细胞在活化后第10天的转导效率始终高于70％。(D)与CD93 BBz相比，CD93 28z中代表耗竭性T细胞的标志物水平升高。

图13.CD93 CAR T细胞针对AML细胞系的细胞因子产生与细胞毒性。(A)AML细胞系用人源化抗CD93抗体染色。(B)活化后10天收集的CD93 CAR T细胞在无肿瘤细胞或AML细胞的情况下进行孵育，并通过ELISA测定细胞因子。(C)活化后10天收集的CD93 CAR T细胞与THP-1、Kasumi-1或OCI-AML3细胞以1:1的E:T比例共孵育；通过Incucyte测定法测定细胞毒性。CD93 28z和CD93 BBz CAR T细胞都表现出特异性和强大的细胞毒性。

图14.CD93 CAR T细胞在THP-1AML异种移植模型中的有效性。(A)实验设计：随机分组6天后，将1x10⁶表达荧光素酶的THP-1AML细胞注入经辐照的NSG小鼠(N＝15)中，并注入5x10⁶转导的空白对照品(N＝5)、CD93 28z(N＝5)或CD93 BBz(N＝5)CAR T细胞。监测作为白血病负荷替代指标的发光情况。(B)展示在CAR T细胞治疗后4周内通过IVIS Spectrum测得的生物发光情况的照片。(C)生物发光平均值表明CD93 CAR T细胞对白血病的控制作用，尤其是CD93 28z CAR。(D)在CAR治疗后第14天测定T细胞扩增水平，以将肿瘤反应与T细胞扩增相关联。

图15.CD93 CAR T细胞在患者来源异种移植模型中的有效性和持久性。(A)实验设计：将1x10⁶ SU555 AML细胞注入经亚致死性辐照的NSG中，4个月后系列骨髓抽吸物(BMA)显示达到适当的移植水平。将小鼠随机分组并用2x10⁶转导的空白对照品(N＝6)、CD93 28z(N＝7)或CD93 BBz(N＝7)CAR T细胞进行治疗，然后用系列BMA测定白血病细胞清除率和T细胞的持久性。(B)用F11抗体测定SU555上的CD93表达情况。(C)白血病移植(％CD45+CD33+)和(D)CAR T细胞持久性(％CD45+CD3+)在治疗后至多13周利用BMA通过流式细胞术进行测定。(E)用T细胞空白对照品或CD93 CAR T细胞治疗后1周BMA的流式细胞术结果。在接受CAR处理的动物的BM中无可测量的活细胞。(F)在治疗后2周进行的CBC显示，空白对照品处理组中有动物出现血细胞减少症，而接受CD93 CAR处理的动物恢复正常的骨髓中的血细胞比容和血小板正常。(G)基于Gehan-Breslow-Wilcoxson检验，CD93 CAR T细胞存活率较高。

图16.CD93 CAR T细胞不会通过影响生存力或集落形成能力来靶向造血祖细胞(HPC)。(A)在第10天，将CAR T细胞空白对照品或CD93 CAR T细胞与从人脐带血中分离出来的CD34+细胞一同孵育。共培养24小时后，测定CD34+细胞群中各祖细胞群(造血干细胞，HSC；普通髓系祖细胞，CMP；粒细胞单核细胞系祖细胞，GMP)的发生率(N＝2个脐带血样本)(B)CD93 CAR T细胞与源自人脐带血的CD34+细胞共培养后，不会产生IFNγ。(C)集落形成测定表明，与CD93 CAR T细胞共培养后，CFU-G/M/GM或CFU-E未受损。

图17.CD93在非发育正常组织中低表达，但在内皮细胞中高度表达。(A)基于源自BioGPS数据库的数据通过RNA表达分析CD93。除部分造血组织和发育组织外，无表达或表达水平极低。(B)正常组织微阵列的IHC表明，CD93在胰腺、隔膜、骨骼肌和肺中的表达水平最低。(C)在多个组织中，内皮细胞通过IHC可见CD93表达。(D)使用永生化HUVEC作为模型***，将CD93表达与AML细胞系进行比较，结果相当。(E)CD93 CAR T细胞与iHUVEC共培养24小时时会产生IFNγ。

实施方式

为了更容易理解本公开内容，下面以及整个说明书中定义了某些术语和短语。本文提供的定义是非限制性的，并且应该考虑到本领域技术人员在发明时的所知。

定义

在进一步描述本方法和章节之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或章节，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在该所述范围内的任何其他所述或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本专利所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在方法和材料。本专利提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。

如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个细胞”的指代对象包括多个此类细胞，而“所述肽”指的是一种或更多种药剂及所属领域技术人员已知的等效物，例如多肽，等等。

本专利所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

CD93。CD93是一种C型凝集素跨膜受体，可在细胞间粘附和防御机制中发挥作用。它包含C型凝集素结构域、一系列表皮生长因子样结构域、高度糖基化黏蛋白样结构域、独特的跨膜结构域和短胞质尾区。据报道，它参与凋亡细胞的清除。CD93序列与血栓调节蛋白具有同源性。人CD93蛋白的参考序列可在Genbank NP_036204获得；基因序列可在NM_012072获得。

例如，如图4和5所示，CD93在一些免疫细胞(包括嗜中性粒细胞和单核细胞)亚群的表面表达。它在原代白血病细胞(包括AML和MLL细胞)表面表达。

癌症。本文中使用的术语“癌症”(或“癌性”)或“肿瘤”用于指具有自主生长能力的细胞(例如，以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症)。过度增殖和肿瘤疾病状态可以分类为病理性的(例如，表征或构成疾病状态)，或者它们可以分类为非病理性的(例如，偏离正常但与疾病状态无关)。这些术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。病理性过度增殖细胞发生在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态。非病理性过度增殖细胞的示例包括与伤口修复相关的细胞增殖。术语“癌症”或“肿瘤”也用于指各种器官***的恶性肿瘤，包括影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及通常被认为包括恶性肿瘤的腺癌，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、***癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。

示例性癌症类型包括但不限于AML、ALL、CML、肾上腺皮质癌、***癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑癌、中枢神经***(CNS)癌症、周围神经***(PNS)癌症、乳腺癌、***、儿童非霍奇金淋巴瘤、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因氏肿瘤家族(例如尤因氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病或肿瘤、鼻腔和鼻旁癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、垂体瘤、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(例如子宫肉瘤)、移行细胞癌、***癌、外阴癌、间皮瘤、鳞状细胞或表皮样癌、支气管腺瘤、绒毛膜癌、头颈癌、畸胎癌或Waldenstrom巨球蛋白血症。

术语“恶性血液病”、“血液学肿瘤”和“血液学癌症”可互换使用且在本文中使用其广义含义，是指由造血***细胞引起的所有阶段和所有形式的癌症和过度增殖性疾病。

可以采用标的方法治疗的恶性血液病的示例包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，包括但不限于急性双表型白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、双表型急性白血病(BAL)母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)(无白血病细胞时称为小淋巴细胞淋巴瘤(SLL))、急性单核细胞白血病(AMOL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特淋巴瘤(BL)、毛细胞白血病、移植后淋巴细胞增生性疾病(PTLD)、

巨球蛋白血症/淋巴浆细胞性淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤(包括塞扎里综合征))、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓增殖性肿瘤。在特定实施例中，标的方法可用于治疗白血病，例如急性双表型白血病、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性单核细胞白血病(AMOL)。

对于AML，有多种分子标志物可用于患者选择和给药，包括但不限于与有利结果相关的已知临床预后因素，包括细胞遗传学突变，例如t(15；17)PML/RARα、t(8；21)AML1/ETO、11q23和inv(16)CBFβ/MYH11，或与中等风险相关的FLT3分子突变(例如FLT3-ITD、FLT3-D835)、NPM1、EVI1或cEBPα；与中间结果相关的临床预后因素，包括但不限于正常核型和细胞遗传学突变+8、+21、+22、del(7q)和del(9q)；与不良结果相关的临床预后因素，包括但不限于细胞遗传学突变del(5q)、11q23、t(6；9)、t(9；22)、异常3q、复杂的细胞遗传学突变以及IL2Ra和/或MSI2的表达水平升高。MDS患者对治疗的反应可能与AML患者的反应相似。

骨髓增生异常肿瘤(MDS)是一组常见于老年患者的综合征(白血病前期、难治性贫血、Ph阴性慢性髓系白血病、慢性粒单核细胞白血病、髓样化生)。可能与暴露于致癌物有关。MDS的特征是造血细胞的克隆性增殖，包括红细胞、髓细胞和巨核细胞形式。骨髓正常或细胞过多，且无效造血引起可变的血细胞减少症，最常见的是贫血。细胞生成紊乱也与骨髓和血液中的细胞形态异常有关。可能发生髓外造血，这会导致肝肿大和脾肿大。骨髓纤维化偶尔在诊断时出现或可能在MDS病程中发生。MDS克隆不稳定且趋于进展为AML。

适合用本文所揭示的方法治疗的恶性血液病可能包含MLL基因突变。MLL基因(髓系/淋巴细胞白血病或混合谱系白血病)也称为“ALL-1”、“HRX”或“Htrx”，在体细胞获得性相互易位以及染色体带11q23的缺失和倒位中重排。这些重排发生在5-10％的急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性髓系白血病(AML)患者以及一些急性骨髓增生异常综合征(MDS)患者中。MLL与大多数发生在1岁以下儿童中的急性白血病和治疗相关AML有关。MLL重排的肿瘤在临床上具有侵袭性，对治疗反应不佳。

抗原结合域(ABD)。本文中使用的术语ABD是指缔合形成可变区结构域的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)多肽的组合。ABD是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，作为单个多肽或二聚体。在此构型中，每个可变结构域中的三个CDRS相互作用，以在所述结构域表面界定抗原结合位点。所述六个CDR共同赋予所述抗体抗原结合特异性。然而，尽管亲和力低于整个结合位点，但单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)仍具有识别和结合抗原的能力。

术语“可变的”是指在抗体之间可变结构域的某些部分在序列上有很大差异且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称之为互补决定区(CDR)或高变区的三个节段中。可变结构域中更加高度保守的部分称之为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个FR区，它们主要采用β折叠构型，由三个CDR连接，形成环连接且在一些情况下形成β折叠构型的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密连接在一起，并与来自另一条链的CDR共同形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，免疫目的蛋白序列，第五版，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

本文所揭示的VL和VH序列源自抗体，但可以重新形成片段、单链结合域、连接至嵌合抗原受体等。示例性VH和VL序列在本文中以序列号：1和序列号：6(小鼠)以及序列号：2和序列号：7(人源化)的形式提供；并且针对每项分别定义CDR序列，其中VH CDR是序列号：3、4、5，VL CDR是序列号：8、9、10。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、与抗原保持特异性结合的抗体片段(包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scAb)、单域抗体(dAb)、单域重链抗体、单域轻链抗体、双特异性抗体、多特异性抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以诸如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等进行可检测地标记。抗体可与其他部分进一步缀合，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。此术语还涵盖Fab'、Fv、F(ab')₂和/或其他与抗原保持特异性结合的抗体片段以及单克隆抗体。本文中使用的单克隆抗体是指由一组相同细胞产生的抗体，所有这些细胞都是通过细胞复制由单个细胞产生的。虽然可以使用杂交瘤生产技术生产单克隆抗体，但也可以使用本领域技术人员已知的其他生产方法(例如，源自抗体噬菌体展示文库的抗体)。抗体可以是单价抗体或二价抗体。抗体可以是Ig单体，它是“Y形”分子，由四条多肽链组成：两条重链和两条轻链，通过二硫键连接。

本文中使用的术语“人源化免疫球蛋白”是指包含不同来源的免疫球蛋白部分的免疫球蛋白，其中至少一个部分包含人源氨基酸序列。嵌合抗体可包含源自具有必要特异性的非人源(例如小鼠)免疫球蛋白和源自人源免疫球蛋白序列(例如嵌合免疫球蛋白)的部分，其通过常规技术(例如合成)以化学方式连接在一起或使用基因工程技术制备成连续多肽(例如，可以表达编码嵌合抗体蛋白部分的DNA以产生连续多肽链)。人源化免疫球蛋白是含有一条或更多条免疫球蛋白链的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白链包含源自非人源抗体的CDR以及源自人源轻链和/或重链的框架区(例如，有或无框架变化的CDR移植抗体)。术语人源化免疫球蛋白还涵盖嵌合或CDR移植单链抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata等人，蛋白质工程，8(10):1057-1062(1995))；结构域抗体(dAb；Holt等人(2003)，生物技术动向，21:484)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后会产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')₂片段，它有两个抗原结合位点且仍能与抗原交联。

“Fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH₁)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH₁结构域的羧基末端添加了少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。Fab'-SH是其恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')₂抗体片段最初作为成对的Fab'片段生成，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据其恒定结构域的氨基酸序列归为两种明显不同的类型中的其中一种，这两种类型称之为κ和λ。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别。免疫球蛋白主要有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。亚类可以进一步分为类型，例如IgG2a和IgG2b。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链(V_H-V_L)中的轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用长度过短而无法使同一条链上的两个结构域配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。有关双抗体的详细描述请见，例如，EP 404,097；WO93/11161；以及Hollinger等人(1993)，美国国家科学院院刊，90:6444-6448。

“单链Fv”(scFv)多肽包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施例中，所述Fv多肽进一步包含位于V_H和V_L结构域之间的多肽连接子，使sFv能够形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述，请参阅Pluckthun，单克隆抗体药理学，第113卷，Rosenburg和Moore编纂，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。

嵌合抗原受体(CAR)。CAR由一般结构组成，其中通常以scFv形式提供的抗原结合域(例如本文所揭示的抗CD93 ABD)与T细胞受体效应子功能相关联。此术语是指能够触发或抑制免疫细胞活化的人造多模块分子。示例性CAR示意性地示于图7A中。CAR通常包含本文所述的抗CD93 ABD、连接子、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。在一些情况下，CAR将包括一个或更多个共刺激结构域和/或一个或更多个共抑制结构域。

间隔区(连接子)将连接抗原结合域与跨膜结构域。它应当足够灵活，以使抗原结合域以不同方向定向，从而促进抗原识别。最简单的形式是来自免疫球蛋白的铰链区，例如来自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4中任一项的铰链，尤其是人蛋白序列。替代方案包括免疫球蛋白的CH2CH3区域和CD3部分。对于许多基于scFv的构建体，IgG铰链能够起作用。在一些实施例中，所述连接子包含氨基酸序列(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5等，并且在一些实施例中n是3。

CAR跨膜结构域(TM)通常源自I型膜蛋白，例如CD3δ、CD4、CD8、CD28等。

细胞质信号传导结构域(例如，源自T细胞受体δ-链的结构域)用作CAR的一部分，以便在嵌合受体与靶抗原结合后产生T淋巴细胞增殖和效应子功能的刺激信号。来自共刺激分子的内结构域可能包括在CAR的细胞质信号传导部分中。

术语“共刺激结构域”是指CAR的刺激结构域，通常是内结构域，其提供次级非特异性激活机制，通过该机制传播初级特异性刺激。共刺激的示例包括通过T细胞受体的抗原特异性信号传导后的抗原非特异性T细胞共刺激和通过B细胞受体的信号传导后的抗原非特异性B细胞共刺激。有关共刺激(例如T细胞共刺激)以及所涉及的因素请见以下出版物：Chen&Flies，自然免疫学评论(2013)，13(4):227-42，该出版物中的内容以引用方式全文并入本文。合适的共刺激多肽的非限制性示例包括但不限于4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM。

术语“共抑制结构域”是指抑制结构域，通常是内结构域，其源自受体，能够对初级抗原特异性活化机制进行二级抑制，防止共刺激。有关共抑制(例如T细胞共抑制)以及所涉及的因素请见以下出版物：Chen&Flies，自然免疫学评论(2013)，13(4):227-42；以及Thaventhiran等人，临床与细胞免疫学杂志(2012)，S12。在一些实施例中，共抑制结构域同型二聚体化。共抑制结构域可以是跨膜蛋白的细胞内部分。合适的共抑制多肽的非限制性示例包括但不限于CTLA-4和PD-1。

第一代CAR仅通过单个信号传导结构域传递抗原结合信号，例如源自IgE FcεRIγ或CD3δ链的高亲和力受体的信号传导结构域。所述结构域含有一个或三个用于抗原依赖性T细胞活化的基于免疫受体酪氨酸的活化基序[ITAM]。基于ITAM的活化信号赋予T细胞裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子以响应抗原结合的能力。

除CD3δ信号外，第二代CAR还包括共刺激信号。巧合传递递送共刺激信号，增强了由CART转导的T细胞诱导的细胞因子分泌和抗肿瘤活性。共刺激结构域相对于CD3δ结构域通常在近膜端。第三代CAR包括三方信号传导结构域，其包含例如CD28、CD3δ、OX40或4-1BB信号传导区域。在***中，或“装甲车”CAR T细胞被进一步基因修饰以表达或阻断分子和/或受体，从而增强免疫活性。

CAR变体包括***CAR，其中所述细胞外部分、ABD和细胞质信号传导结构域均存在于两个单独的分子上。CAR变体还包括开关CAR，其是条件性可活化的CAR，例如包含***CAR，其中所述***CAR的两部分的条件性异二聚化在药理学上受到控制。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)请见，例如，第US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083号PCT申请；Fedorov等人，科学转化医学(2013)，5(215):215ra172；Glienke等人，药理学前沿(2015)，6:21；Kakarla&Gottschalk 52，癌症杂志(2014)，20(2):151-5；Riddell等人，癌症杂志(2014)，20(2):141-4；Pegram等人，癌症杂志(2014)，20(2):127-33；Cheadle等人，免疫学评论(2014)，257(1):91-106；Barrett等人，医学年评(2014)，65:333-47；Sadelain等人，癌症探索(2013)，3(4):388-98；Cartellieri等人，生物医学与生物技术杂志(2010)956304；这些出版物的内容以引用形式全文并入本文。

CAR变体还包括双特异性或串联CAR，其包括可以扩增或抑制原代CAR活性的第二代CAR结合域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其可以，例如，用作双特异性CAR***的组分，其中第二代CAR结合域的结合可抑制原代CAR活化。串联CAR(TanCAR)通过两个嵌合受体的结合来介导T细胞的双特异性活化，这些受体旨在响应两种不同肿瘤相关抗原的独立结合而传递刺激或共刺激信号。iCAR使用双抗原靶向，通过配备抑制信号传导结构域的第二抑制性受体的结合来抑制活性CAR的活化。

两个CAR对不同表位的双重识别(旨在以不同方式通过δ链或共刺激信号(例如通过CD28)传递杀伤效应)可以通过限制串联CAR对同时表达两种抗原(而非一种抗原)的癌细胞的活性，更加选择性地活化重编程T细胞。工程化T细胞中传递信号的效力将保持在活化阈值以下，因此在未结合共刺激受体的情况下无效。组合抗原识别可增强选择性肿瘤根除，保护仅表达一种抗原的正常组织，以免发生有害反应。

抑制性CAR(iCAR)被设计为通过抑制性受体信号传导模块激活来调节CAR-T细胞活性。该方法结合了两种CAR的活性，其中一种产生显性负信号，限制由活化受体激活的CAR-T细胞的反应。当与仅由正常组织表达的特异性抗原结合时，iCAR可以关闭抵消激活剂CAR的反应。这样，iCARs-T细胞可以将癌细胞与健康细胞区分开，并以抗原选择性方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCAR中的CTLA-4或PD-1细胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制信号，导致较少的细胞因子产生、较低效的靶细胞裂解和淋巴细胞运动性改变。

抗CD93 ADP可以作为“嵌合双特异性结合成员”提供，即，对两种不同结合配偶体(例如，两种不同抗原)具有双重特异性的嵌合多肽。第二抗原可以是，例如，存在于白血病细胞上的肿瘤相关抗原，例如CD123、FLT3、TIM3、CD99、CD96、B7-H3、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)等。嵌合双特异性结合成员的非限制性示例包括双特异性抗体、双特异性缀合的单克隆抗体(mab)₂、双特异性抗体片段(例如，F(ab)₂、双特异性scFv、双特异性双抗体、单链双特异性双抗体等)、双特异性T细胞接合子(BiTE)、双特异性缀合的单域抗体、微体及其突变体等。嵌合双特异性结合成员的非限制性示例还包括以下出版物中描述的嵌合双特异性试剂：Kontermann，MAbs.(2012)4(2):182–197；Stamova等人，抗体2012，1(2)，172-198；Farhadfar等人，白血病研究(2016)49:13-21；Benjamin等人，血液学治疗进展(2016)7(3):142-56；Kiefer等人，免疫学评论(2016)270(1):178-92；Fan等人，血液学与肿瘤学杂志(2015)8:130；May等人，美国保健***药房杂志(2016)73(1):e6-e13；这些出版物中的内容以引用方式全文并入本文。

在一些情况下，嵌合双特异性结合成员可以是双特异性T细胞接合子(BiTE)。BiTE通常通过将结合抗原的特异性结合成员(例如scFv)与特异性结合T细胞分子(例如CD3)的第二结合域融合来制备。

在一些情况下，嵌合双特异性结合成员可以是CAR T细胞衔接子。本文中使用的“CAR T细胞衔接子”是指表达的双特异性多肽，其结合CAR的抗原识别结构域并将CAR重定向至第二抗原。通常，CAR T细胞衔接子将具有结合区，一个特异于其所针对的CAR上的表位，另一个表位针对结合配偶体，当结合时，其转导激活CAR的结合信号。有用的CAR T细胞衔接子包括但不限于例如以下出版物中所述的衔接子：Kim等人，美国化学学会杂志(2015)137(8):2832-5；Ma等人，美国国家科学院院报(2016)113(4):E450-8；以及Cao等人，应用化学国际版(英语)(2016)55(26):7520-4；这些出版物中的内容以引用方式全文并入本文。

效应抗CD93 CAR-T细胞包括对表达CD93的靶细胞(包括血液恶性肿瘤细胞)具有溶细胞活性的自体同源或同种异体免疫细胞。效应细胞具有无需通过T细胞抗原受体识别的溶细胞活性。在一些实施例中，T细胞经改造以表达抗CD93 CAR。术语“T细胞”是指可以通过表达CD3和/或T细胞抗原受体来表征的哺乳动物免疫效应细胞。

在一些实施例中，工程化细胞包含免疫细胞的复杂混合物，例如从需要治疗的个体中分离出来的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。参见，例如，Yang和Rosenberg(2016)，免疫学进展，130:279-94，“癌症的过继性T细胞疗法；Feldman等人(2015)，肿瘤学研讨会，42(4):626-39“过继性细胞疗法-肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体和嵌合抗原受体”；临床试验NCT01174121，“使用肿瘤浸润性淋巴细胞对转移癌患者进行免疫治疗”；Tran等人(2014)，科学，344(6184)641-645，“上皮癌患者中基于突变特异性CD4+T细胞的癌症免疫疗法”。

在一些实施例中，所述工程化T细胞相对于接受治疗的个体是同种异体的，例如，参见临床试验NCT03121625；NCT03016377；NCT02476734；NCT02746952；NCT02808442。参见综述，Graham等人(2018)，细胞，7(10)E155。在一些实施例中，同种异体工程化T细胞是完全HLA匹配的。然而，并非所有患者都具有完全匹配的供体，并且适合于所有独立于HLA类型的患者的细胞产物提供了替代方案。通用的“现成”CAR T细胞产物在收获和制造的均匀性方面具有优势。

可以对同种异体T细胞进行基因改造以减少移植物抗宿主病。例如，可以通过不同的基因编辑技术敲除TCRαβ受体。TCRαβ是异二聚体，α和β链都需要存在才能表达。单个基因编码α链(TRAC)，而有2个基因编码β链，因此TRAC基因位点KO已被删除用于此目的。已经使用许多不同的方法来实现这种删除，例如CRISPR/Cas9；大范围核酸酶；工程化I-CreI归巢核酸内切酶等。参见，例如，Eyquem等人(2017)，自然，543:113–117，其中所述TRAC编码序列被CAR编码序列取代；以及Georgiadis等人(2018)，分子治疗，26:1215–1227，它通过规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9将CAR表达与TRAC碎片联系起来，而无需将CAR直接整合到TRAC基因位点中。预防GVHD的替代策略修饰CAR-T细胞以表达TCRαβ信号传导的抑制剂，例如使用截短形式的CD3δ作为TCR抑制分子。

同种异体T细胞可以与淋巴细胞清除强化联合施用，使CAR-T细胞在宿主免疫功能恢复之前扩增和清除恶性肿瘤细胞，例如通过施用阿仑单抗(单克隆抗CD52)、嘌呤类似物等进行。可能会修饰所述同种异体T细胞以抵抗阿仑单抗，目前正在进行相关临床试验。另外，也通过基因编辑阻止CAR-T细胞上HLA I类分子的表达，例如通过删除β2-微球蛋白进行，参见NCT03166878。

除修饰T细胞外，诱导多能干(iPS)CAR-T细胞还可提供同种异体CAR-T细胞的来源。例如，用重编程因子转导供体T细胞可以恢复多能性，然后重新分化为效应T细胞。

如上所述从受试者或供体中收集的用于工程化的T细胞可以通过富集所需细胞的技术从细胞混合物中分离，或者可以在不分离的情况下工程化和培养。适当的溶液可用于分散或悬浮。所述溶液通常是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。适宜的缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液等。

亲和分离技术可包括磁性分离、使用抗体包被的磁珠、亲和层析、与单克隆抗体连接或与单克隆抗体(例如补体和细胞毒素)结合使用的细胞毒性剂以及附着于固体基质(例如培养板)的抗体“淘选”或其他适宜的技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等。可以通过使用与死细胞相关的染料(例如，碘化丙啶)来针对死细胞选择细胞。可以采用不会对所选细胞的活力造成不适当的损害的任何技术。亲和试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除抗体试剂外，还可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应子和受体分子等。

可以将分离的细胞收集在维持细胞活力的任何合适的培养基中，通常在收集管底部具有血清缓冲。可以购买各种培养基，并可根据细胞的性质使用，包括经常补充胎牛血清(FCS)的dMEM、HBSS、DPBS、RPMI、Iscove的培养基等。

收集的和任选富集的细胞群可以立即用于基因修饰，或者可以在液氮温度下冷冻并储存，解冻并能够重复使用。细胞通常储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。

工程化细胞可以通过任何适宜的给药途径(通常在血管内)利用任何生理学上可接受的培养基输注给受试者，尽管它们也可以通过其他途径引入，其中细胞可以找到合适的生长位点。通常，将施用至少1×10⁶个细胞/kg、至少1×10⁷个细胞/kg、至少1×10⁸个细胞/kg、至少1×10⁹个细胞/kg、至少1×10¹⁰个细胞/kg或更多，其通常受收集期间获得的T细胞数量限制。

表达构建体：抗CD93 ABD构建体(例如CAR、抗体、scFv等)编码序列可以通过表达载体引入待工程化的细胞中。例如，可以诸如使用CRISPR技术将CAR编码序列引入内源性T细胞受***点，例如，TRAC基因(参见，例如，Eyquem等人(2017)，自然，543:113-117；Ren等人(2017)，蛋白与细胞，1-10；Ren等人，(2017)，肿瘤靶标，8(10):17002-17011)。CRISPR/Cas9***可以通过用编码Cas9和sgRNA的质粒转染直接应用于人体细胞。使用慢病毒和逆转录病毒载体广泛证明了病毒传递CRISPR组分的事实。还报道了使用由非整合病毒(例如腺病毒和腺病毒相关病毒(AAV))编码的CRISPR进行基因编辑的情况。最近发现，更小的Cas蛋白能使所述技术与安全性和效率不断提升的载体(例如AAV载体)组合并增强所述组合。

将编码抗CD93 ABD构建体的核酸***用于表达和/或整合的载体中。有许多此类载体可供使用。载体组分通常包括但不限于以下各项中的一项或更多项：复制起点、一种或更多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体，质粒载体，整合载体等。

表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型，或(c)提供复杂培养基无法获得的关键营养素。

当与另一个核酸序列处于功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达为发送多肽分泌信号的前蛋白，则其可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与编码序列连接；以及如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。但是，增强子不一定连续的。

表达载体将含有被宿主生物体识别并可操作地连接至抗CD93 ABD构建体编码序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)，其控制与其可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度变化)从其控制下的DNA启动增加的转录水平的启动子。众所周知，多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。

来自哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以例如通过从病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒LTR(例如鼠干细胞病毒)、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的启动子、异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子)或热激启动子来控制，条件是这些启动子与宿主细胞***相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，其也含有SV40病毒复制起点。

高等真核生物的转录可以通过将增强子序列***载体而增加。增强子是DNA的顺式作用元件，长度通常约为10至300bp，其作用于启动子以增加其转录。增强子是相对方向和位置独立的，已经在转录单元的5’和3'，内含子内以及编码序列本身内发现。现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)已知许多增强子序列。然而，通常使用来自真核病毒的增强子。示例包括复制起点后期的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在编码序列的5’或3’位置剪接到表达载体中，但优选启动子的5’位点位置。

用于真核宿主细胞的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶尔3’非翻译区域获得。含有一种或更多种上述组分的合适载体的构建采用标准技术。

用于克隆或表达抗CD93 ABD构建体的合适宿主细胞是上述原核、酵母或其他真核细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是小鼠L细胞(L-M[TK-]，ATCC#CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于悬浮培养中的生长的293或293细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA、ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138、ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2、HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562、ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。

可以用上述表达载体转染宿主细胞，包括T细胞、干细胞等，用于抗CD93 ABD构建体表达。可以在适合于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养细胞。哺乳动物宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM),Sigma)、RPMI 1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM),Sigma)适用于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指由氨基酸残基构成的聚合物。该术语还适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。

本文中使用的有关多肽或DNA序列的术语“序列同一性”是指两个分子之间的亚单元序列同一性。当两个分子中的一个亚单元位置被相同的单体亚单元(例如，相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，所述分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数目的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序来计算同一性，例如GCS程序包(Devereux等人，核酸研究，12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，分子生物学杂志，215:403,1990)。

本文中的“蛋白质变体”或“变体蛋白质”或“变体多肽”是指通过至少一种氨基酸修饰而与野生型蛋白质不同的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，也可以是WT多肽的修饰形式。变体多肽可以指多肽本身、包含多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。与亲本多肽相比，变体多肽优选地具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，约1至约10个氨基酸修饰，并且优选约1至约5个氨基酸修饰。

本文中使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”是指未修饰的多肽，其随后被修饰以产生变体。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽，也可以是野生型多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身，包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、合成的氨基酸以及作用方式与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸以及后续经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构不同于氨基酸的常规化学结构但作用方式与天然存在的氨基酸类似的化合物。

本文所揭示的氨基酸修饰可以包括氨基酸取代、缺失和***，尤其是氨基酸取代。变体蛋白还可以包括在细胞因子和/或受体其他位置(例如，亲和力改造中涉及的位置以外的位置)的保守修饰和取代。此类保守取代包括以下出版物中所述的取代：Dayhoff，蛋白质序列和结构图谱，5(1978)；以及Argos，欧洲分子生物学学会学报，8:779-785(1989)。例如，属于以下组中的其中一组的氨基酸表示保守变化：第I组：Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；第II组：Cys、Ser、Tyr、Thr；第III组：Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；第IV组：Lys、Arg、His；第V组：Phe、Tyr、Trp、His；以及第VI组：Asp、Glu。此外，指定氨基酸的氨基酸取代可以用保守变化替代。

术语“分离的”是指基本上不受其自然环境影响的分子。例如，分离的蛋白基本上不含来自其所源自的细胞或组织来源的细胞物质或其他蛋白。该术语是指其中分离的蛋白纯度满足以下条件的制剂：足以作为治疗组合物施用；或者纯度至少为70％至80％(w/w)；更优选地，纯度至少为80％-90％(w/w)；甚至更优选地，纯度为90-95％；最优选地，纯度至少为95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)。“分离的”化合物是指从至少90％的获取该化合物的样本的至少一种组分中去除的化合物。本文所述的任何化合物均可以分离的或分隔的化合物形式提供。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指的是正在评估治疗和/或正在接受治疗的哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物指人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有疾病的个体。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。

关于患者的术语“样本”涵盖生物来源的血液和其他液体样本、固体组织样本(如活检标本)、组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该术语还涵盖在采购后以任何方式处理过的样本，例如通过试剂、清洗或富集某些细胞群(例如病变细胞)而处理过的样品。该定义还包括富含特定类型分子的样本，例如核酸、多肽等。术语“生物学样本”涵盖临床样本，还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样本、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物学样本”包括从患者病变细胞中获得的样本，例如，包含从患者病变细胞中获得的多核苷酸和/或多肽的样本(例如，细胞裂解物或包含多核苷酸和/或多肽的其他细胞提取物)；以及包含患者病变细胞的样本。包含患者病变细胞的生物学样本也可以包括非病变细胞。

本文中使用的术语“诊断”是指对受试者、个体或患者的分子或病理状态、疾病或病症的鉴定。

本文中使用的术语“预后”是指预测受试者、个体或患者死亡或疾病进展的可能性，所述进展包括复发、扩散和耐药性。本文中使用的术语“预测”是指基于观察、经验或科学推理预言或估计受试者、个体或患者发生特定事件或临床预后的可能性的行为。在一示例中，医师可能会尝试预测患者存活的可能性。

本文中使用的术语“疗法”、“治疗”等是指为了在受试者、个体或患者身上或中获得效果而施用药剂或施行手术。预防作用指的是对疾病或其症状的完全或部分预防，治疗作用指的是疾病和/或疾病导致的症状实现部分或完全治愈。本文中使用的“治疗”可以包括哺乳动物，特别是人类中癌症的治疗，且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；(b)缓解疾病或其症状，即，使疾病或其症状消退。

治疗指治疗或改善或预防疾病成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，例如症状的消除；缓解；减轻或使疾病状况对患者更耐受；减缓退化或衰退率；或减少退化晚期的衰弱。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医生的检查结果。因此，术语“治疗”包括施用工程化细胞以预防或延迟、缓解、阻止或抑制与疾病或其他疾病相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指疾病的减少、消除或预防疾病症状或疾病在受试者中的副作用。

本文中使用的“治疗有效量”是指足以治疗或管理疾病或病症的治疗剂(例如工程化T细胞和抗体构建体等输注)的量。治疗有效量可以指足以延迟或最大限度地减少疾病发作(例如，延迟或最大限度地降低癌细胞的生长和扩散)的治疗剂的量。治疗有效量也可以指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明治疗剂的治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在疾病的治疗或管理中提供治疗益处。

本文中使用的术语“给药方案”是指单独施用于受试者的一组单位剂量(通常多于一剂)，各剂量给药通常间隔一定时间段。在一些实施例中，给定治疗剂具有推荐的给药方案，其可以涉及一剂或更多剂。在一些实施例中，给药方案包含多个剂量，每个剂量给药彼此间隔相同时长的时间段；在一些实施例中，给药方案包括多个剂量和至少两个间隔单独剂量给药的不同时间段。在一些实施例中，给药方案中的所有剂次具有相同量的单位剂量。在一些实施例中，给药方案内的不同剂次具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包含第一剂的量中的第一剂，随后是与所述第一剂的量不同的第二剂的量中的一个或更多个额外剂次。在一些实施例中，给药方案包含第一剂的量中的第一剂，随后是与所述第一剂的量相同的第二剂的量中的一个或更多个额外剂次。在一些实施例中，当在相关人群中施用时，给药方案与期望或有益结果相关联(即，是治疗性给药方案)。

在某些实施例中，与……组合”、“联合疗法”和“组合产品”是指向患者同时施用本文所述的工程化蛋白和细胞与另外的疗法，例如外科手术、放疗、化疗等。当组合施用时，每种组分可以在不同时间点以任何顺序同时施用或按顺序施用。因此，每种组分可以分开施用，但施用时间须足够接近，以达到预期的治疗效果。

“合并给药”是指在所述组合将具有治疗效果的时间施用一种或更多种组分，例如工程化蛋白和细胞、已知的治疗剂等。这种合并给药可以涉及同时(即，同一时间)、先或后施用组分。本领域普通技术人员将能够轻易地确定适当给药时间、顺序和剂量。

术语“组合”的使用不限制患有病症的受试者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可以在(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)之前施用第一预防剂或治疗剂，伴随或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)向患有病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂。

可与抗CD93 ABD多肽或工程化细胞联合给药的化疗剂包括但不限于阿比曲沙、阿霉素、阿霉素、阿霉素、氨苄青霉素、天冬酰胺酶、蒽环类、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、BiCNU、硫酸博来霉素、白消安、博来霉素、喜树碱、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、盐酸佐柔比星、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、更生霉素、阿糖胞苷、赛德萨、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、多西紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、爱施巴、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉、吉西他滨、吉扎尔、美新、羟基脲、爱治、伊达霉素、伊达比星、异环磷酰胺、环磷酰胺、伊立替康、兰维斯、白细胞介素、亮抑素、甲基苄肼、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、光神霉素、密吐霉素、马勒兰、阿托胞苷、诺维本、喷司他丁、盐酸米托恩醌、长春碱、奥沙利铂、紫杉醇、伯尔定、脱氧助间型霉素、顺氯氨铂、普卡霉素、甲苄肼、乐疾宁、雷替曲塞、泰索帝、泰素、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、雷替曲塞、拓扑替康、戊柔比星、长春花碱、凡毕士、长春碱、长春地辛、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和足叶噻吩昔。

可与抗CD93 ABD多肽或工程化细胞联合给药的靶向治疗剂可能包括酪氨酸激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(Gleevec，也称为STI-571)、吉非替尼(Iressa，也称为Zd1839)、厄洛替尼(市售Tarceva)、索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、达沙替尼(Sprycel)、拉帕替尼(Tykerb)、尼洛替尼(Tasigna)和硼替佐米(Velcade)、Jakafi(鲁索替尼)；Janus激酶抑制剂，如托法替尼；ALK抑制剂，如克唑替尼；Bcl-2抑制剂，如甲磺酸盐、维奈妥拉和棉酚；FLT3抑制剂，如米哚妥林(Rydapt)；IDH抑制剂，如AG-221；PARP抑制剂，如Iniparib和奥拉帕尼；PI3K抑制剂，如哌立福新；VEGF受体2抑制剂，如阿帕替尼；与[D-Lys(6)]-LHRH连接的AN-152(AEZS-108)多柔比星；Braf抑制剂，如维罗非尼、达拉菲尼和LGX818；MEK抑制剂，如曲美替尼；CDK抑制剂，如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制剂，如盐霉素；和/或小分子药物缀合物，如长春瑞滨；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如替西罗莫司(Torisel)、依维莫司(Afinitor)、维罗非尼(Zelboraf)、曲美替尼(Mekinist)和达拉菲尼(Tafinlar)。

抗CD93 ABD多肽或工程化细胞可以与免疫调节剂联合给药，例如细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素(LT)、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促***(LH)、肝生长因子、***素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)(例如TGF-α或TGF-β)、***(IGF)、***、血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)(例如TNF-α或TNF-β)、米勒管抑制物质、小鼠***相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ)、S1因子、白介素(IL)(例如IL-1、IL-1cc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21或IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白、内皮抑制素和LT。

可以与抗CD93 ABD多肽或工程化细胞联合给药的肿瘤特异性单克隆抗体可以包括但不限于利妥昔单抗(以MabThera或Rituxan的名称市售)、阿仑单抗、帕尼单抗、伊匹单抗(Yervoy)等。

受关注的是用于与抗CD93 ABD多肽或工程化细胞联合给药的低甲基化(也称为表观遗传)药剂。低甲基化药剂是抑制DNA甲基化的药物。目前可用的低甲基化药剂会阻断DNA甲基转移酶的活性(DNA甲基转移酶抑制剂/DNMT抑制剂)。目前该类别下的两个成员——阿扎胞苷和地西他滨已获得FDA批准在美国使用。Guadecitabine同样受关注。由于其副作用相对轻微，阿扎胞苷和地西他滨特别适用于治疗老年患者以及有合并症的患者。这两种药物对具有不利细胞遗传学特征的AML母细胞具有显著活性。

恶性血液病(例如白血病)的治疗可与一个或更多个治疗实体相结合。在一些实施例中，所述额外治疗实体在免疫应答调节剂中。免疫检查点蛋白是免疫抑制分子，其作用是降低针对靶细胞的免疫反应性，尤其是在本发明的方法中针对肿瘤细胞的免疫反应性。T细胞对肿瘤的内源性反应可能因肿瘤细胞活化免疫检查点(免疫抑制蛋白)和抑制共刺激受体(免疫活化蛋白)而失调。本领域中称为“免疫检查点抑制剂”的所述治疗剂类别通过施用抑制信号拮抗剂来逆转对免疫反应的抑制。其他免疫疗法施用免疫共刺激分子激动剂来增强反应性。

在临床癌症免疫疗法背景下研究最活跃的免疫检查点受体、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)——都是抑制性受体。阻断这些受体中的任意一项的抗体的临床活性表明，可以在多个层面增强抗肿瘤免疫力，而且可以在机理考虑和临床前模型的指导下巧妙设计组合策略。

多肽和多核苷酸组合物

本发明提供了多肽构建体和组合物，其包含与效应子多肽连接的抗CD93 ABD，所述效应子多肽可以包括但不限于嵌合抗原受体；抗体；以及其片段和衍生物，所述多肽可以称之为抗CD93 ABD构建体。此类构建体包含具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结构域多肽中的一项或两项的抗CD93 ABD，其中VH多肽包含至少一个、至少两个、至多3个如本文所提供以及如序列号：3、4和5所示的VH CDR序列；VL多肽包含至少一个、至少两个、至多3个如本文所提供以及如序列号：8、9和10所示的VL CDR序列，其结合来自可变区的框架序列，例如人VH或VL框架序列。

在一些实施例中，抗CD93 ABD包含至少一个VL序列(其包含位于可变区框架中的3个如本文所提供的轻链CDR序列，所述框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架)以及至少一个VH序列(其包含位于可变区框架中的3个如本文所提供的重链CDR序列，所述框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架)。

在一些实施例中，所述抗CD93 ABD包含所提供的VH和VL序列的CDR中的一个或更多个的氨基酸序列变体，所述变体包含CDR残基内或邻近CDR残基的一个或更多个氨基酸***和/或CDR残基内或邻近CDR残基的缺失和/或CDR残基的取代(取代是产生此类变体的优选氨基酸改变类型)。此类变体相对于人CD93的结合亲和力通常至少约为10^-8，而且此类变体将同与具有本文所述的氨基酸序列的抗CD93 ABD相同的表位结合。

在一些实施例中，目的多肽具有由至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至多为序列号：1、2、6或7所示的可变区提供的全部氨基酸组成的连续序列。目的多肽还包括与序列号：1、2、6或7所示的氨基酸序列相比至多有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸存在差异的可变区序列。在其他实施例中，目的多肽与序列号：1、2、6或7所示的氨基酸序列的同一性至少约为80％、至少约为85％、至少约为90％、至少约为95％、至少约为99％。

在一实施例中，所述抗CD93 ABD与CAR的效应子多肽共价连接，例如作为在框架中融合的单一多肽。在一些实施例中，CAR的所述抗CD93 ABD是单链可变区。在一些实施例中，所述抗CD93 ABD包含人源化可变区序列。在一些实施例中，抗CD93 CAR由人T细胞表达。在一些实施例中，抗CD93 CAR是双特异性CAR，其中第二抗原特异性可以是指存在于血液恶性肿瘤细胞上的抗原，例如，CD123、FLT3、TIM3、CD99、CD96、B7-H3等。在其他实施例中，工程化T细胞表达抗CD93 CAR以及对存在于血液恶性肿瘤细胞上的抗原具有特异性的第二CAR。

在其他实施例中，所述抗CD93 ABD以下列形式提供：与免疫球蛋白效应子序列(例如scFv)连接的多肽；全长嵌合或人源化抗体，例如具有任何同种型的人免疫球蛋白恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA等；或抗体片段，例如F(ab')₂片段和F(ab)片段等。除Fab外，本发明还考虑了对CD93的至少一个表位具有结合特异性的更小的抗体片段和表位结合肽。例如，单链抗体可以根据第4,946,778号美国专利(Ladner等人)所述的方法构建，该专利全文以引用方式并入本文。单链抗体包含由灵活连接子部分连接的轻链和重链的可变区。更小的是被称为单域抗体的抗体片段，其包含一个分离的VH单结构域。获得单域抗体的技术是本领域已知的技术，所述单域抗体至少具有一些其所源自的完整抗体的结合特异性。例如，Ward等人在“大肠杆菌分泌的单一免疫球蛋白可变结构域库的结合活性”(自然，341:644-646)中公开了筛选以获得对其靶表位具有足够亲和力的抗体重链可变区(H单域抗体)的方法，以便以分离物形式与其结合。抗CD93抗体可以用可检测标记进行标记、固定在固相上和/或与异源化合物缀合。所述抗体还可以作为与第二抗原(尤其包括其他癌症抗原，例如CD123、FLT3、TIM3、CD99、CD96、B7-H3等)或免疫治疗试剂(例如抗PD-1/PD-L1、抗CTLA-4、抗CD40、抗CD47等)反应的双特异性或多特异性抗体提供。

本发明还提供了编码抗CD93 ABD的分离的核酸及其构建体、包含所述核酸的载体和宿主细胞以及用于生产所述多肽构建体的重组技术。目的核酸编码与所提供的多肽序列的同一性至少约为80％、至少约为85％、至少约为90％、至少约为95％、至少约为99％或完全相同的多肽。多核苷酸序列可以编码提供的任何或所有CDR序列，或者可以编码完整的可变区、scFv、完整的多肽构建体(例如CAR)和抗体等。如本领域所熟知，可变区序列可以与任何合适的恒定区序列融合。

在一些实施例中，提供了包含编码抗CD93 ABD或抗CD93 ABD构建体的编码序列的载体，其中所述编码序列与在所需细胞中具有活性的启动子可操作地连接；或在适合基因组***的载体中提供，例如通过CRISPR***。有多种载体为本领域所熟知并且可以用于此目的，例如病毒载体、质粒载体、微循环载体，所述载体可以整合到所述靶细胞基因组中，或者可以维持附加体。

多肽组合物可以制备为注射剂，其可以是液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前在液体载体中溶解或悬浮的固体形式。蛋白质可以以贮库注射或植入物制剂的形式施用，所述贮库注射或植入物制剂可以以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。药物组合物通常配制成无菌的、基本等渗的并且完全符合美国食品药品监督管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)规定。

优选的剂型取决于预期的给药方式和治疗应用。基于所需制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以免影响所述组合的生物活性。此类稀释剂的示例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。另外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵)；六甲铵氯化物；苯扎氯铵、氯化苄索铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在本发明的另一实施例中，提供了分离的多肽或多核苷酸中含有的制品。所述制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳多肽或多核苷酸组合物，其可以是治疗组合物，例如用于治疗癌症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述容器上或与所述容器相关的标签表明所述组合物用于处理所选条件。另外的容器可以随制品提供，所述制品可以容纳例如药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。所述制品可以进一步包括从商业和用户的角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及具有使用说明的包装插页。

细胞组合物

在一些实施例中，提供了工程化细胞，其中所述细胞通过引入抗CD93 CAR来修饰。一些实施例中，所述细胞是T细胞，包括但不限于初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞；在其他实施例中，所述工程化细胞是干细胞，例如，造血干细胞或iPSC。在一些实施例中，所述细胞在转移到受试者中之前，在离体处理中进行基因修饰。所述工程化细胞可以单位剂量提供以用于治疗，且相对于预期接受者可以是同种异体的、自体同源的等。

方法包括获得所需细胞的步骤，例如，T细胞、造血干细胞等，其可以从生物学样本中分离出来，或者可以通过祖细胞来源(例如iPSC)体外衍生获得。用包含编码所述受体的序列的载体转导或转染所述细胞，所述步骤可以在任何合适的培养基中进行。如上所述，所述载体可以将CAR编码序列整合至TCR链的基因组位点中，例如，TCRA位点，或者可以提供外源启动子的表达。

例如，可以从癌症患者中收集细胞，进行离体修饰以表达抗CD93 CAR，并重新引入所述受试者体内。从所述受试者中收集的所述细胞可以从任何适宜且适当的来源收集，包括例如，外周血(例如，所述受试者的外周血)、活组织切片(例如，来自所述受试者的肿瘤活组织切片)等。在一些情况下，收集的所述细胞可以是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，例如，从受试者的肿瘤中收集的TIL。

在不希望使用自体细胞的情况下，例如在患者无足够的T细胞进行修饰、无足够的时间来扩增自体细胞等的情况下，可以使用同种异体细胞，例如，来自健康供体的T细胞或干细胞。如本文所讨论，可以对此类同种异体细胞进行基因修饰，以减少GVHD、减少宿主抗移植物反应等。

在一些情况下，用于生成CAR-T细胞的细胞修饰将仅限于引入抗CD93 CAR。其他情况下，所述T细胞经修饰以表达第二CAR，例如，串联CAR、iCAR等。所述第二CAR可以通过降低CAR-T细胞对表达CD93的正常细胞的活性来提高对肿瘤细胞的特异性。

工程化细胞可以适合于治疗用途的药物组合物形式提供，例如，适于人类治疗的药物组合物。可以冷冻或制备包含这些细胞的治疗制剂，以与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿药学大全，第16版，Osol，A.Ed.(1980))联合给药，所述制剂为水溶液形式。细胞的配制、给药和施用方式应符合良好的医疗管理规范。在这种情况下需要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的病因、药剂的递送部位、给药方法、给药时间表以及医师已知的其他因素。

细胞可以通过任何合适的手段给药，通常是肠胃外给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内(推注或缓慢滴注)、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下给药。

治疗方法

本发明进一步提供了用于减少癌细胞(例如血液恶性肿瘤细胞)的生长的方法。所述方法可减少表达CD93的癌细胞的数量。通常，所述方法包含使癌细胞与剂量足以减少癌细胞生长并治疗所述癌症的抗CD93 CAR T细胞、抗CD93抗体或由其衍生的片段接触，其通常在致使所述表达CD93的癌细胞死亡的条件(例如，通过T细胞介导的细胞毒性、ADCC、增强吞噬作用等)下在体内接触。

在实施例中，所述癌症是恶性血液病。在实施例中，所述恶性血液病指白血病。在一些实施例中，所述恶性血液病是白血病前期，例如骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓增殖性肿瘤(MPN)。在另一实施例中，所述恶性血液病是白血病。在实施例中，所述恶性血液病是淋巴瘤。在实施例中，所述恶性血液病是骨髓瘤。

在实施例中，所述白血病选自急性髓系白血病(AML)、混合谱系白血病(MLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)。在实施例中，所述白血病是AML。在实施例中，所述白血病是MLL。

“减少癌细胞生长”包括但不限于减少癌细胞增殖，以及减少患者组织(例如，血液、骨髓、***等)中存活癌细胞的数量。可以采用多种已知癌症诊断测定法中的任何一种来评估物质或特定量的所述物质能否有效治疗癌症，所述测定法包括但不限于活检、造影剂放射照相研究、CAT扫描以及检测与所述个体血液或活检切片中的癌症相关的肿瘤标志物。

在一些实施例中，所述方法可以包括向有相应需求的受试者施用有效量的表达抗CD93 CAR的T细胞。在一实施例中，向患有恶性血液病的受试者施用有效量的表达抗CD93CAR的自体或同种异体T细胞，以治疗所述癌症。CAR-T细胞群可以离体工程化和扩增。除CD93以外，存在于所述T细胞中的所述CAR或第二CAR可以识别存在于所述癌细胞表面上的第二抗原，从而在第二抗原和CD93结合后，活化表达所述CAR的免疫细胞。所述细胞群中的个体免疫细胞可以表达所述CAR和第二CAR，例如iCAR或TAN-CAR。免疫应答可以表现为T细胞对所述接受者中存在的靶细胞的细胞溶解应答的增加，例如消除肿瘤细胞等。

在体内进行接触的情况下，向所述接受者输注有效剂量的工程化细胞。剂量和频率可能因药剂、给药方式、细胞因子的性质等而异。本领域技术人员将理解，这样的指导将根据个人情况进行调整。对于局部给药(例如鼻内、吸入等)或全身给药(例如肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)等)，剂量也可以变化。通常向所述接受者施用至少约10⁴个工程化细胞/kg、至少约10⁵个工程化细胞/kg、至少约10⁶个工程化细胞/kg、至少约10⁷个工程化细胞/kg或更多。

在治疗包含施用抗CD93抗体的情况下，所述抗体可以与减少癌细胞生长的化疗药物缀合。因此，在一些实施例中，本发明提供了将药物递送至癌细胞的方法，其包含向受试者施用药物-抗体复合物，其中所述抗体对CD93具有特异性，且所述药物是减少癌细胞生长的药物，其中多种是本领域已知的药物。靶向可以通过将药物与对癌症相关多肽具有特异性的抗体偶联(例如，直接或通过连接子分子共价或非共价连接，以形成药物-抗体复合物)来实现。将药物与抗体偶联的方法是本领域所熟知的方法。

疑似含有癌细胞的样本(包括组织切片、载玻片等)用CD93特异性试剂染色，例如抗CD93 ABD构建体。样本可以进行冷冻、包埋、存在于组织微阵列中等。试剂(例如抗体、多核苷酸探针等)可以可检测的方式标记，或者可以在染色过程中间接标记。由此获得的信息可用于预后和诊断，包括对疾病加重的易感性、病况和对环境变化的反应，例如时间的流逝、药物治疗或其他方式。在一些实施例中，进行此类染色，以确定个体是否患有对抗CD93CAR-T细胞治疗敏感的癌症。

抗CD93 ABD可用于体外和体内监测CD93疾病治疗过程。因此，例如，通过测定表达CD93的细胞，尤其是表达CD93的癌细胞数量的增加或减少情况，可以确定旨在改善疾病的特定治疗方案是否有效。

为了方便起见，本发明的抗体可装在试剂盒中提供，即，预定量的试剂与诊断测定说明书的包装组合。所述抗体用酶标记时，所述试剂盒将包括所述酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。所述多种试剂的相对量可以有很大变化，以提供试剂溶液浓度，而显著优化所述测定的灵敏度。尤其是，所述试剂可以干粉形式提供，通常为冻干粉末，其包括在溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

通过将具有所需纯度的抗体与可选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿药学大全，第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备包含本发明的一种或更多种抗体的治疗性制剂，所述制剂为冻干制剂或水溶液形式。抗体组合物配制、给药和施用方式应符合良好的医疗管理规范。在这种情况下需要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的病因、药剂的递送部位、给药方法、给药时间表以及医师已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将受这些考虑因素支配。

试剂盒

本发明还提供了用于所述方法中的试剂盒。标的试剂盒可以包括编码所述抗CD93ABD或抗CD93 ABD构建体的表达载体。在一些实施例中，所述组分以任何适宜包装(例如棒包装，剂量包装等)的液体或固体形式以一定剂型(例如治疗有效剂型)提供。本发明还可以提供用于选择或体外衍生细胞的试剂，例如生长因子、分化剂、组织培养试剂等。

除上述组分外，标的试剂盒可能进一步包括(在某些实施例中)用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的试剂盒中，其中一种或更多种可能存在于试剂盒中。些说明书可能存在的一种形式是印在合适的介质或基材(例如，其上印有信息的一张纸或几张纸)、试剂盒包装、包装说明书等之上的印刷信息。这些说明书存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些说明书可能存在的另一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。

本发明现在被充分描述，本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下进行各种改变和修改。

示例

示例1

人源化和嵌合抗人CD93单克隆抗体和变体经改造引入嵌合抗原受体T细胞中

产生针对人CD93的单克隆抗体。单克隆小鼠抗人CD93抗体是通过使用CD93-Fc融合蛋白对小鼠进行免疫处理而产生的。使用标准方案生成杂交瘤。选择杂交瘤，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术筛选来自所得克隆的上清液。鉴定小鼠杂交瘤克隆F11，以产生对人CD93具有特异性的单克隆抗体。使用通用抗体引物通过杂交瘤克隆F11的重链和轻链可变区。对每种V基因产物的多个克隆进行测序，以监测PCR诱导的错误。确定F11中VH和VL的核苷酸序列，推导出的氨基酸序列分别如图1A和B所示。

F11抗体的人源化。为了选择用作CDR移植模板的人抗体框架(FR)，将小鼠F11 VL和VH区与人种系序列的相应区进行比较。结果发现，IGKV2D-29亚组中小鼠F11 VL区FR的同源性最高，而人IGHV1-2亚组中VH区FR的同源性最高。因此，来自人IGKV2D-29和IGHV1-2的FR被用作设计人源化F11的依据。通过分子建模鉴定了F11与IGKV2D-29/IGHV1-2序列之间有所不同且可能影响抗原结合的FR区中的氨基酸位置。小鼠和人源化VH和VL的序列比对如图2所示。

嵌合和人源化F11抗体的抗原结合活性的表征。将小鼠和人源化F11可变区构建于人IgG1支架上，以分别制备嵌合F11-G1(ChF11-G1)和人源化F11-G1(HuF11-G1)。在293细胞中进行瞬时转染，所得抗体通过蛋白A亲和层析纯化。为了评估抗体的抗原结合活性，通过用作为诱饵的人CD93/Fc融合蛋白包被进行ELISA。如图3所示，与具有原代小鼠F11抗体可变区的ChF11-G1相比，HuF11-G1以剂量依赖性方式强烈结合CD93，表明HuF11-G1与其亲本抗体相比保留了相似的抗原结合活性。

为了增强抗体Fc依赖性效应子功能，构建了在Fc恒定区含有三重G236A/S239D/I332E突变的HuF11-G1突变体(HuF11-G1 TM)。恒定区中的G236A/S239D/I332E突变对抗体与抗原的结合无影响(图3)。

CD93在正常人外周血白细胞和人原代白血病细胞上的表达谱。使用对不同血液亚群具有特异性的抗体，通过流式细胞术检测CD93在正常人外周血细胞上的表达。在单核细胞和嗜中性粒细胞上检测到CD93表达，但在红细胞、血小板、淋巴细胞或NK细胞上未检出(图4)。在人原代白血病细胞上进一步研究CD93表达。在与混合谱系白血病1基因(rMLL)(n＝11)和急性髓系白血病(AML)细胞(n＝14)重排相关的急性白血病细胞中检测到CD93(图5)。

此外，在多个正常骨髓(NBM)造血干细胞(HSC)、原发性慢性髓系白血病(CML)干细胞(LSC)、骨髓纤维化(MF)LSC和真性红细胞增多症(PV)LSC的多个样本上检验了CD93表达。CD93在CML LSC以及MF和PV LSC的亚群上表达——但未在所有正常HSC上表达(图6)。这些结果表明CD93是MPN LSC的标志物，具有治疗潜力。

基于CD93抗体huF11的scFv序列生成嵌合抗原受体T细胞。为了使用具有CD28或41-BB共刺激结构域的CD93 scFv生成嵌合抗原受体(CAR)T细胞，创建了四种构建体并将其克隆至逆转录病毒载体MSGV1中。这些构建体转染后产生逆转录病毒，然后采用标准技术将其转导至原代人T细胞中，以产生CD93 CAR T细胞。如图7所示，构建体名称为F11 28δL-H、F11 28δH-L、F11 BBδL-H和F11 BBδH-L。通过流式细胞术检测CAR T细胞的表达，先使用CD93-Fc融合蛋白，然后使用抗人IgG Fc二抗，以量化转导效率。所有CAR变体在原代T细胞上均以相似水平一致表达，转导效率>90％(图7)。

CD93特异性CAR T细胞用CD93阳性AML细胞系孵育时会产生细胞因子。如图8A所示，CD93在许多永生化AML细胞系中高水平表达，所述细胞系包括THP-1、Kasumi-1、MOLM13、NOMO-1和OCI-AML3。HEL-2细胞在本底上无可测量的CD93表达，因此可在细胞因子测定中用作对照品。为了评估上述CD93 CAR T细胞的活性，将1x10⁶ CAR T细胞与来自指定细胞系的1x10⁶ AML细胞共孵育24小时，然后通过ELISA测定IFNγ和IL-2的产生情况。针对所有具有高CD93阳性的细胞系(包括THP-1、Kasumi-1、MOLM13、NOMO-1和OCI-AML3)，产生了高水平的IFNγ和IL-2。对于所有CAR(仅CAR)以及无CD93表达的阴性对照AML细胞系(HEL-2)，基线细胞因子产生水平非常低。四种CAR变体之间的细胞因子表达水平无可重复的显著差异(图8B)。

CD93特异性CAR T细胞在体外有效杀灭AML细胞。采用体外杀灭测定法来评价CD93CAR对AML细胞系THP-1的效力。在96孔板中，用GFP稳定转导的5x10⁴ THP-1AML细胞与空白对照品或四种CD93 CAR T细胞变体中的其中一种以1:1至1:8不等的E:T比例共孵育。在96小时内测定GFP荧光的倍数变化，以证明靶细胞的生长或杀灭。当THP-1细胞与CAR T细胞空白对照品共孵育时，它们按照预期稳健扩增。当与四种CD93 CAR变体中的任一种一同孵育时，THP-1细胞被迅速杀灭，截至48小时时几乎无GFP表达，即使E:T比例低至1:8(图9)。与细胞因子分泌数据类似，四种不同的CD93 CAR T细胞之间的杀灭效应无显著差异。结合图8所示的细胞因子结果，这些体外结果表明本文所述的CD93 CAR T细胞对靶标AML细胞具有显著的细胞毒性效应。

CD93特异性CAR T细胞可以在体内消除AML。CD93 28δL-H CAR T细胞在患者来源的异种移植小鼠模型中进行了测试，以评估相应体内效应。对九只NRG小鼠进行辐照并给予1x10⁶ SU555人白血病细胞，这是一种已知具有高水平CD93表达的原代AML样本(参见图5A)。进行连续骨髓穿刺，直到所有小鼠都具有可测量且可重复的人白血病细胞移植水平，这由骨髓隔室中CD33阳性人白细胞的百分比定义。移植水平范围为0.15％至35％，且小鼠被分为两组，平均移植水平约为9％。四只小鼠通过尾静脉注射了10x10⁶ CAR T细胞空白对照品，五只小鼠注射了10x10⁶ CD93 28δL-H CAR T细胞。CAR T细胞注射后，生成了40天的生存曲线。所有接受CD93 CAR T细胞的小鼠均未检测到人AML，而所有接受空白对照品的动物存活时间均不超过20天。(图10)。

序列。F11小鼠重链可变区蛋白包含氨基酸序列(序列号：1)EVQLQQSGPELVKPGASVKI PCKASGYTFT DYHMDWVKQS HGKSLEWIGD IDPYNGDTVF NQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSED TAVYYCTRGG DYWGQGTTLT VSS。VH的人源化形式包含序列(序列号：2)QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYHMDWVKQA PGQGLEWIGD IDPYNGDTVF NQKFKGKATMTRDTSISTAY MELSRLRSDDT AVYYCTRGGD YWGQGTLVTV SS。VH CDR序列鉴定方式如下。CDR1(序列号：3)DYHMD；CDR2(序列号：4)DIDPYNGDTVFNQKFKG；CDR3(序列号：5)GGDY。

F11小鼠轻链可变区蛋白包含氨基酸序列(序列号：6)DVVMTQTPLS LPVSLGDQASISCRSSQTLV HSNGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGVYFCSQSTHVP FTFGSGTKLE IK。VL的人源化形式包含序列(序列号：7)DIVMTQTPLSLSVTPGQPAS ISCRSSQTLV HSNGNTYLHW YLQKPGQPPQ LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGV YFCSQSTHVP FTFGQGTKLE IK。VL CDR序列鉴定方式如下：CDR1(序列号：8)RSSQTLVHSNGNTYLH；CDR2(序列号：9)KVSNRFS；CDR3(序列号：10)SQSTHVPFT。

示例2

儿童急性髓系白血病(AML)的五年总生存率接近70％，但对于具有高风险特征或疾病复发的患者而言，迫切需要新的疗法。抗原表达的显著患者间和患者内异质性要求开发靶向特定细胞表面抗原的CAR。CD93被鉴定为在白血病母细胞上突出且在白血病干细胞上表达的细胞表面标志物，其在HSC和其他造血祖细胞上的表达可忽略不计。

针对CD93的CAR T细胞可能介导有效的抗白血病活性，但不会影响正常的髓系祖细胞群。我们实验室基于来自人源化小鼠抗体的scFv开发了针对CD93的CAR T细胞。CD93CAR T细胞可以重复产生大量具有高CAR表面表达的细胞，且不会高水平表达与T细胞耗竭相关的抑制性受体。当与CD93阳性AML细胞系共孵育时，CD93 CAR T细胞会分泌细胞因子并表现出细胞毒性。这些都不影响HSC或造血祖细胞活力或集落形成能力。在AML的鼠异种移植模型中，CD93 CAR T细胞在多种模型中表现出抗白血病作用。内皮细胞也表达CD93，且由CD93 CAR T细胞靶向。因此，CD93 CAR T细胞或许有助于拓宽AML患者的免疫疗法选择范围，但需要组合工程化策略才能将其安全地转化为临床治疗方案。

图11-17中显示的数据表明，CD93在许多白血病细胞系和原代白血病样本中高水平表达。CD93在造血祖细胞上不表达，但在除内皮细胞外的非发育组织中低水平表达。基于F11抗体的人源化鼠scFv的CD93 CAR T细胞稳健扩增，不表达高水平的耗竭标志物。CD93CAR T细胞在体外与AML细胞系共孵育时会分泌细胞因子并表现出细胞毒性。CD93 CAR T细胞在多种AML体内异种移植模型中显示出活性且提供生存益处。在内皮细胞上表达CD93可能受益于组合CAR工程化策略，以便实现临床转化(例如与门或非门)。

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学托管委员会

拉温德拉·玛吉特

克里斯托·麦考尔

刘劼

罗比·马兹纳

丽贝卡·理查德

洪婉真

<120> CD93 特异性治疗性抗原结合蛋白及

其使用方法

<130> STAN-1524WO

<150> 美国 62/813,009

<151> 2019/3/2

<160> 10

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Val Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Val Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

Asp Tyr His Met Asp

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

Asp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Val Phe Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

Gly Gly Asp Tyr

1

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr

1 5

Claims (54)

1.一种包含人CD93特异性抗原结合域(ABD)的多肽，其包含：

在重链可变区(VH)框架中包含CDR1、CDR2和CDR3序列的VH结构域，其中CDR1、CDR2或CDR3中至少有一项包含如序列号：3、4或5所示的氨基酸序列；

以及轻链可变区(VL)结构域。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述VL结构域包含VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR1、CDR2或CDR3中至少有一项包含如序列号：8、9或10所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中VH框架中的所述VH结构域CDR1、CDR2和CDR3序列包含与序列号：3、4、5中任一项列出的CDR序列或CDR序列组相对的至多3个氨基酸取代。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中VL框架中的所述VL结构域CDR1、CDR2和CDR3序列包含与序列号：8、9、10中任一项列出的CDR序列或CDR序列组相对的至多3个氨基酸取代。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述VH结构域包含序列号：3、4和5中的每一项。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述VL结构域包含序列号：8、9和10中的每一项。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述VH结构域包含序列号：1或序列号：2所示的序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述VL结构域包含序列号：6或序列号：7所示的序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述VH和VL框架序列是人源框架序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述ABD是单链可变区多肽(scFv)。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述ABD与人Fc序列连接。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述多肽是嵌合抗原受体(CAR)。

13.根据权利要求12所述的多肽CAR，其中所述CAR包含通过连接子与跨膜结构域和细胞质信号传导结构域连接的ABD。

14.根据权利要求13所述的多肽CAR，其中所述细胞质信号传导结构域包含人TCRζ的内结构域。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的多肽CAR，其进一步包含免疫共刺激蛋白的内结构域。

16.根据权利要求15所述的多肽CAR，其中所述免疫共刺激蛋白是4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM中的一种或更多种。

17.根据权利要求16所述的多肽CAR，其中所述免疫共刺激蛋白是CD28。

18.根据权利要求16所述的多肽CAR，其中所述免疫共刺激蛋白是4-1BB。

19.根据权利要求12-18中任一项所述的多肽CAR，其进一步包含免疫共抑制蛋白的内结构域。

20.根据权利要求19所述的多肽CAR，其中所述免疫共抑制蛋白是CTLA-4和PD-1中的一种或更多种。

21.根据权利要求12-20中任一项所述的多肽CAR，其中所述CAR对除CD93以外的第二抗原具有双特异性。

22.根据权利要求1-20中任一项所述的多肽CAR，其与对第二抗原具有特异性的第二CAR组合，形成串联CAR。

23.根据权利要求21或22所述的多肽CAR，其中所述第二抗原是存在于血液恶性肿瘤细胞上的抗原。

24.根据权利要求23所述的多肽CAR，其中所述第二抗原选自CD123、FLT3、TIM3、CD99、CD96、CD33、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)和B7-H3。

25.根据权利要求12-20中任一项所述的多肽CAR，其与对第二抗原具有特异性的第二CAR组合，形成串联CAR。

26.根据权利要求12-20中任一项所述的多肽CAR，其中所述CAR是***CAR，其中所述CAR的所述ABD和所述细胞质信号传导结构域存在于两个单独的分子上。

27.一种编码根据权利要求1-21中任一项所述的多肽的核酸。

28.一种包含根据权利要求22所述的核酸的核酸载体。

29.根据权利要求23所述的核酸载体，其中所述载体是整合载体。

30.根据权利要求24所述的核酸载体，其中所述载体适用于通过CRISPR实现基因组***。

31.根据权利要求23所述的核酸载体，其中所述载体可以维持附加体。

32.一种经离体基因改造以包含根据权利要求23-26中任一项所述的载体的哺乳动物细胞，其中所述载体编码包含人CD93特异性抗原结合域(ABD)的多肽，并且所述细胞表达包含人CD93特异性抗原结合域(ABD)的多肽。

33.根据权利要求27所述的细胞，其中所述细胞是人体细胞。

34.根据权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。

35.根据权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

36.根据权利要求30所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。

37.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是从患有恶性血液病的个体中分离出来的。

38.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是从健康供体中分离出来的。

39.根据权利要求33所述的细胞，其中所述细胞包含减少移植物抗宿主病的基因修饰。

40.根据权利要求33或34所述的细胞，其中所述细胞包含减少移植物排斥的基因修饰。

41.根据权利要求27-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞存在于离体培养物中扩增的细胞群中。

42.一种包含根据权利要求27-36中任一项所述的细胞群的药物制剂。

43.根据权利要求37所述的药物制剂，其为单位剂量制剂。

44.一种治疗个体所患的癌症的方法，所述方法包含：

向有相应需求的个体施用有效剂量的根据权利要求27-35中任一项所述的细胞群。

45.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞群相对于所述个体是自体同源的。

46.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞群相对于所述个体是同种异体的。

47.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述癌症是恶性血液病。

48.根据权利要求42所述的方法，其中所述恶性血液病是骨髓瘤。

49.根据权利要求42所述的方法，其中所述恶性血液病是淋巴瘤。

50.根据权利要求42所述的方法，其中所述恶性血液病是白血病。

51.根据权利要求45所述的方法，其中所述白血病是急性髓系白血病。

52.根据权利要求45所述的方法，其中所述白血病是混合谱系白血病。

53.根据权利要求42所述的方法，其中所述恶性血液病是骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓增殖性肿瘤(MPN)。

54.一种用于根据权利要求39-48中任一项所述的方法中的试剂盒。

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