JP5752052B2 - Cd93またはその可溶性断片の用途 - Google Patents
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Description
以下、本発明を詳しく説明する。
1)生物学的試料及び対照群のタンパク質を固定体にコーティングさせる工程、
2)前記固定体に炎症性疾患診断用マーカーであるCD93またはその可溶性断片に特異的に結合する抗体を添加して抗原抗体結合反応を遂行する工程、
3)前記抗原抗体結合反応を通じて生成された抗原抗体結合反応物を2次抗体接合体の標識体及び発色基質溶液を用いて検出する工程、及び
4)生物学的試料と対照群に対する検出結果とを比較する工程。
[発明の実施のための形態]
<実施例1>sCD93タンパク質の準備
<1−1>pYW600の製作
<1−1−1>oriPの挿入
まず、oriPをクローニングするため、pMEP4(Invitrogen、米国)を鋳型に正方向プライマー(5’−gtagatctgcaggaaaaggacaagc−3’;配列番号27)及び逆方向プライマー(5’−cgagatctggttgacttccctaatgt−3’;配列番号28)を用いて95℃30秒、60℃30秒、72℃1分、30サイクルの条件でPCR反応を遂行した後、2187bpの大きさのPCR産物をPCR精製キット(Promega、米国)を用いて精製した。その後、前記PCR産物をBglII酵素(Invitrogen、米国)で切断した後、切断産物をまた精製した。前記精製された切断断片をpcDNA3.1(Invitrogen、米国)のCMVプロモーター上部に存在するBglII認識部位にBglII酵素(Invitrogen、米国)を用いて線形化したベクターに挿入した後、大腸菌に形質転換させて形質転換体を収得した(pcDNA3.1−oriP)。前記形質転換体からプラスミドを通常の方法で抽出した後、塩基配列分析を通じてoriPが正しく挿入されたかどうか確認した。
<1−1−2>ヒト抗体Fcをコードするポリヌクレオチドの挿入
前記製造したoriPが挿入されたpcDNA3.1ベクターにヒト抗体Fcをコードするポリヌクレオチドを挿入するため、pLCN−MoHベクター(韓国登録特許第450266号)を鋳型に、「Bam HI−SfiI−human immunoglobulin Fc N−terminal sequence」で構成された正方向プライマー(5’−cgg gat cc g gcc gtg ggg gcc gac aaa a ct cac aca tgc c−3’:配列番号29)と「XbaI−stop codon−human immunoglobulin Fc C−terminal sequence」で構成された逆方向プライマー(5’−cgagtc tca ttt acc cgg aga cag gga−3’:配列番号30)を用いてPCR反応を遂行した(94℃、4分処理後、95℃、30秒、60℃、30秒、72℃、1分過程を30回反復した後72℃、10分間延長)。
<1−1−3>sCD93_Fcの発現精製
sCD93_Fcを動物細胞であるHEK293E細胞で発現/精製するためにsCD93_Fcを発現させることができる発現ベクターを製作した。
<実施例2>sCD93タンパク質のTHP−1細胞の大食細胞への分化誘導効果実験
ヒト由来の急性単球性白血病細胞であるTHP−1細胞は、PMAなどの化学物質によって付着、広がり(spreading)、成熟過程を経て大食細胞に分化する。本実験では、sCD93がTHP−1細胞の大食細胞への分化誘導効果を実験した。
このようなTHP−1細胞の分化が分子的にどのように起きるのかを調べるため、MAPK(mitogen−activated protein kinases)信号経路を中心に調べた。
<実施例4>sCD93タンパク質の基質金属タンパク質分解酵素(MMP)の発現誘導効果実験
その次に、sCD93_Fc処理によるTHP−1細胞の基質金属蛋白質分解酵素(matrix metalloproteinase,MMP)発現に対する影響を調べた。THP−1細胞に陰性対照群としてhIgG 5μg/mlを処理して、陽性対照群はPMA0.1μg/mlを処理した。実験群ではsCD93_Fcを5、1、0.2μg/mlの濃度で処理した。処理後24時間が経過した後、ゼラチンザイモグラフィ分析法を用いて培養上澄み液に含まれたMMP−9(92kDa)とMMP−2(72kDa)の発現変化を観察した。ゼラチン(Sigma)最終濃度が2mg/mlになるように8%SDS−PAGEゲルを作った後、24時間の間培養した上澄み液をかけてクマシーブルーで染色した後、脱染色溶液で弱く色抜きした後、ゲルを写真撮影した。
<実施例5>sCD93タンパク質の食作用誘導効果実験
このようなTHP−1細胞の大食細胞類似(macrophage−like)細胞への分化による食作用(phagocytosis)効果調べるため、mRFPを発現しているバクテリア(E.coli)を用いて食作用を測定した。THP−1細胞にsCD93_Fc 5μg/mlを処理して3日間培養した後、あらかじめ育てておいたRFP(赤色蛍光タンパク質)発現ベクターで形質転換されたE.coliを分化したTHP−1細胞に入れた。再び、12時間が経過した後、蛍光顕微鏡でバクテリアが分化したTHP−1細胞によって食作用されたことを確認し(図14)、この細胞を細胞分離緩衝溶液(cell dissociation buffer)(EDTA緩衝溶液)で分離してFACS(Coolter)分析を実施した(図15)。
<実施例6>CD93タンパク質抗体のTNF−a生成阻害効果実験
このようなsCD93_Fcの炎症効果と大食細胞分化効果に対して、それに対する抗体の抗炎症剤としての開発可能性を調べるため、CD93に対する抗体処理によってこのような効果が抑制されるのかどうか調べた(図16)。THP−1細胞に陰性対照群としてPBS(−)、hIgG 5μg/mlを処理して、陽性対照群はPMA0.1μg/mlを処理し、また実験群ではsCD93_Fc 5μg/mlと抗CD93ポリクローナル抗体(R&D system)10μg/mlを処理した。24時間が経過した後、LPS 1μg/mlによる感受性を調べるためにLPSを処理した。LPS処理後、さらに24時間が経過した後、Quantikine TNF−a分析キット(R&D system)を用いて培養上澄み液に含まれたTNF−a量を測定した。
<実施例7>siRNAを用いた多様な炎症促進性サイトカイン発現変化実験
THP−1細胞でCD93に対するsiRNA阻害技法を用いてCD93をノックダウンさせた時のさまざまなサイトカインの変化量をリアルタイムPCRを用いて実験した。
<実施例8>ヒト単核球細胞であるTHP−1細胞でのCD93発現及びCD93可溶性断片量の測定実験(in vitro)
様々な炎症誘導物質によるまたは炎症性環境でのCD93発現とその断片化様相を調べるために、ヒト単核球細胞であるTHP−1細胞でのCD93発現と培養上澄み液内でのCD93可溶性断片の量を測定した。
<8−1>ヒト単核球細胞であるTHP−1細胞でのCD93発現様相:FACS実験
THP−1細胞は、10%牛胎児血清、ペニシリンG(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、L−グルタミン(2mM)、HEPES(10mM)、ピルビン酸ナトリウム(1.0mM)を含むRPMI1640培地で37℃の細胞培養器で培養した。培養されたTHP−1細胞をPBS、LPS(1.0μg/ml)、TNF−a(0.5μg/ml)またはPMA(0.1μg/ml)で24時間の間処理して、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。PBSで1回洗浄して3%NGS(normal goat serum)を用いて30分間遮断した後、再び3回洗浄した。そこにヤギ抗ヒトCD93抗体(R&D systems)を1時間の間冷たく冷却して反応させた。PBSでまた3回洗浄した後、抗ヤギIgG−FITC抗体で1時間の間冷たく冷却して蛍光染色した。対照群には、それぞれの実験群に対して抗CD14−FITC抗体で別に蛍光染色した。それぞれ染色した細胞を流細胞分析機(EPICS Elite(Coulter))を用いて分析した。
<8−2>ウエスタンブロット実験
THP−1細胞は、10%牛胎児血清、ペニシリンG(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100/)、L−グルタミン(2mM)、HEPES(10mM)、ピルビン酸ナトリウム(1.0mM)を含むRPMI1640培地で37℃の細胞培養器で培養した。培養されたTHP−1細胞をPBS、LPS(1.0μg/ml)、TNF−a(0.5μg/ml)またはPMA(0.1μg/ml)で24時間の間処理した後、溶解物(lysate)と培養上澄み液を得た。5分間試料を沸かした後、冷凍保管した。試料を8%SDS−PAGEゲルにローディングした後、電気泳動した。ゲルを再びニトロセルロース膜に移した後、4%脱脂牛乳で遮断した。以後、ヤギ抗CD93抗体(R&D systems)を0.5μg/mlに希釈して常温で1時間の間反応させた。また、PBSTで3回洗浄した後、抗ヤギIgG−HRP抗体(Santa cruz)を0.5μg/mlにして常温で1時間の間反応させた。内部対照群に抗βアクチン(Santa cruz)と抗ヤギIgG−HRP(Santa cruz)を用いた。以後、ECLキット(ECL Plus,Amersham,米国)を製造社の方法にしたがって処理した。
<8−3>RT−PCR実験
THP−1細胞を6ウェルプレートに培養した後、それぞれPBS、LPS(1.0μg/ml、InvivoGen)、PMA(0.1μg/ml、Sigma)を処理した。処理24時間後にRNA同定キット(Qiagen)を用いて、RNAを同定した。逆転写のために逆転写酵素(Bio−Rad)とdNTPを混合して42℃で1時間の間反応させてそれぞれのcDNAを得た。リアルタイムPCR分析のためにCFX96 system(Bio−Rad)を用いた。95℃で3分間初期変性して、続いて95℃で15秒間アニーリング、60℃で1分間の伸長化を40〜45周期にしてPCRを遂行した。蛍光測定は、各アニーリング工程で記録されて、データは工程ごとに自動保存された。具体的には、2μlのcDNA鋳型とCD93プライマーを23のiQ SYBR Supermix(Bio−Rad)と混合して反応させた。すべての反応は、2回反復した。相対的mRNA発現を測定するために、平均Ct(average threshold cycle)値を基準値にした。すべてのCt値の基準は、GAPDHを用いて標準化した。プライマーセットは、次のとおりである[CD93:正方向プライマーCTC TGG GGC TAC TGG TCT ATC(配列番号:34)、逆方向プライマーTGT CGG ACT GTA CTG GTT CTC(配列番号:35);GAPDH:正方向プライマーCAT GTT CGT CAT GGG TGT GAA(配列番号:36)、逆方向プライマーGGA CTG TGG TCA TGA GTC CTT(配列番号:37)]。
<実施例9>マウス末梢血液単核細胞と腹膜細胞でのCD93発現様相及び血清と腹膜液でのCD93可溶性断片量の測定実験(in vivo)
前記試験管内(in vitro)実験でのCD93発現様相に対して、生体内(in vivo)実験でも同じ発現様相と断片化現象が起きるのかどうかを確認するために、下記のような実験を遂行した。すなわち、マウスに腹膜炎を起こすか炎症誘発物質(チオグリコレートまたはLPS)を注射した後、マウス末梢血単核細胞(PBMC)と腹膜細胞でのCD93発現様相、及び血清と腹膜液(PLF)でのCD93可溶性断片量を測定した。
<9−1>マウス末梢血液単核細胞と腹膜細胞でのCD93発現様相:FACS実験
6週齢のbalb/Cマウスに、1mlのPBS、4%チオグリコレートまたは0.1mg/mlのLPSを注射した後、3日間維持した。3日後、マウスから後眼窩静脈(retro−orbital vein)を通じてヘパリンコーティングされたガラス毛細管チューブを用いて血液を採血して、遠心分離して血清とPBMC細胞を得た。直ちにマウスを犠牲にして、腹腔内から腹膜液(PLF)と腹膜細胞(大部分腹腔内大食細胞)を得た。それぞれの細胞に含まれた赤血球を除去するために、10mlの赤血球溶解バッファー(Sigma)を37℃で10分間二度反応させて完全に赤血球を除去した。その次に、前記実施例<8−1>前述したのと同一な方法で蛍光染色した。但し、抗体の場合、羊抗マウスCD93抗体(R&D systems)と抗羊IgG−FITC(Santa Cruz)を用いた。また、大食細胞の分化程度を調べるために、分化マーカーであるCD11b抗体(BD sciences)を用いて、二重染色をした。
<9−2>ウエスタンブロット実験
前記<9−1>で使用して残った半分の細胞を溶解させた後、ウエスタンブロットを遂行した。マウスCD93を検出するために羊抗マウスCD93抗体(R&D systems)と抗羊IgG−HRP(Santa Cruz)を用いたことを除き、前記実施例<8−2>の方法と同一にしてウエスタンブロット実験を遂行した。また、大食細胞の分化程度を調べるために、分化マーカーであるCD11b抗体(BD sciences)を用いて二重染色を行なった。内部対照群として抗βアクチン(Santa cruz)と抗ヤギIgG−HRP(Santa cruz)を用いた。以後、ECLキット(ECL Plus,Amersham,米国)を製造社の方法にしたがって処理した。
<9−3>CD93可溶性断片の量測定:サンドイッチELISA実験
FACSとウエスタンブロット実験によってCD93分子自体の量が増加したことを観察した後、CD93可溶性断片がどのように変化するかを確認するために、サンドイッチELISA方法を用いて血清と腹膜液(PLF)でのCD93可溶性断片の量を測定した。
<実施例10>滑膜組織内でのCD93発現及び滑膜液内でのCD93可溶性断片量の測定
<10−1>滑膜組織内でのCD93発現:免疫組織化学方法
3人のリウマチ性関節炎(RA)患者と2人の退行性関節炎(osteo−arthritis,OA)患者から得た滑膜組織を4%パラホルムアルデヒドで一晩中固定した。以後、アルコールで脱水してパラフィンでエンベディング(embedding)して切断を実施した。以後、内在したペルオキシダーゼ活性を無くすためにメタノリックH2O2で反応させた。また、非特異的反応を無くすために3%NGS(normal goat serum)で2時間遮断した。以後、組織をヤギ抗ヒトCD93抗体(R&D)とビオチニル化された抗ヤギIgG、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体(Vector、Peterboredgh,UK)を順に各1時間ずつ反応させた。染色された組織は、再びヘマトキシリンで対比染色して、オリンパス顕微鏡(Tokyo,日本)で観察した。
<10−2>滑膜液内でのCD93可溶性断片量の測定:サンドイッチELISA方法
8人のリウマチ性関節炎患者と8人の退行性関節炎患者から得た滑膜液内でのCD93可溶性断片量をサンドイッチELISA方法を用いて測定した。
配列番号6:CD14新逆方向プライマー
配列番号7:CD64新正方向プライマー
配列番号8:CD64新逆方向プライマー
配列番号9:CD1a新正方向プライマー
配列番号10:CD1a新逆方向プライマー
配列番号11:IL-6正方向プライマー
配列番号12:IL-6逆方向プライマー
配列番号13:IL-12正方向プライマー
配列番号14:IL-12逆方向プライマー
配列番号15:iNOS正方向プライマー
配列番号16:iNOS逆方向プライマー
配列番号17:CXCL11正方向プライマー
配列番号18:CXCL11逆方向プライマー
配列番号19:CLEC4A正方向プライマー
配列番号20:CLEC4A逆方向プライマー
配列番号21:SPHK-1正方向プライマー
配列番号22:SPHK-1逆方向プライマー
配列番号23:IL-1β正方向プライマー
配列番号24:IL-1β逆方向プライマー
配列番号25:TNF-α正方向プライマー
配列番号26:TNF-α逆方向プライマー
配列番号27:pMEP4正方向プライマー
配列番号28:pMEP4逆方向プライマー
配列番号29:Bam HI Sfil ヒト免疫グロブリンFc N末端配列正方向プライマー
配列番号30:Xbal Stop Codon ヒト免疫グロブリンFc C末端配列逆方向プライマー
配列番号31:CD93プラスミド正方向プライマー
配列番号32:CD93プラスミド逆方向プライマー
配列番号34:CD93正方向プライマー
配列番号35:CD93逆方向プライマー
配列番号36:GAPDH正方向プライマー
配列番号37:GAPDH逆方向プライマー
Claims (6)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるCD93水溶性断片に特異的な抗体を有効成分として含む抗炎症用薬学的組成物。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の断片、組換え抗体及び化学的に修飾された抗体からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の抗炎症用薬学的組成物。
- 前記抗体の断片は、Fab、F(ab’)2、scFv、Fv、Fab/c、抗体をタンパク質切断酵素で切断して得られた抗体または遺伝子組換え技術によって得られた抗体であることを特徴とする、請求項2に記載の抗炎症用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル抗体が、
1)ヒトを除く哺乳動物に、CD93水溶性断片及び全長のCD93タンパク質からなる群から選択された免疫源を免疫させて抗体産生細胞を採取する工程と、
2)前記抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを製造する工程、及び
3)前記ハイブリドーマから前記モノクローナル抗体を得る工程とを含む方法によって製造されることを特徴とする、請求項2に記載の抗炎症用薬学的組成物。 - 前記ポリクローナル抗体が、
1)ヒトを除く哺乳動物に、CD93水溶性断片及び全長のCD93タンパク質からなる群から選択された免疫源を免疫させる工程、及び
2)前記免疫された哺乳動物から採取した血液からCD93水溶性断片に特異的な抗体を分離する工程とを含む方法によって製造されることを特徴とする、請求項2に記載の抗炎症用薬学的組成物。 - 前記CD93水溶性断片が、CD93タンパク質が細胞培養後放出された細胞外部分(ectodomain)で95kDaであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の抗炎症用薬学的組成物。
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