WO2020005003A1 - Lag-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

Lag-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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신지영
윤선하
최윤선
박재은
이지수
송영자
백기선
유석호
김응철
이동중
조영규
박범찬
임정채
박영우
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    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies that specifically bind to LAG-3 and their use.
  • Immune homeostasis is regulated by the balance of immune active signaling systems and immunosuppressive signaling systems.
  • Immune suppression signal transduction is activated by a protein called an immune barrier to maintain normal self-tolerance to self antigens or to impair the function of activated T cells after an immune response, thereby preventing normal tissue from autoimmune and excessive inflammatory responses. It is one of the important immune systems to protect. However, chronic virus-infected cells and cancer cells use these immunosuppressive signaling systems to escape the T-cell immunity and create favorable microenvironments that allow them to live well.
  • cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 CTL-4
  • programmed cell death protein 1 PD-1
  • T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 TIM-3
  • LAG-3 lymphocyte activation gene
  • Many immune gateway proteins are known, including T cell immunoreceptors with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domains (VIGIT) and v-domain Ig-containing suppressor of T cell activation (VISTA).
  • VIPIT immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domains
  • VISTA v-domain Ig-containing suppressor of T cell activation
  • Lymphocyte activation gene 3 is a type I transmembrane protein composed of 498 amino acids, one of several immune barrier proteins such as CTLA-4, PD-1, and PD-L1.
  • the LAG-3 gene is present on the twelfth human chromosome and is located close to the cluster of differentiation 4 (CD4) gene, which is structurally similar to CD4 and both proteins can bind to major histocompatibility complex (MHC) class II, but both proteins
  • MHC major histocompatibility complex
  • LAG-3 is composed of an extracellular domain consisting of four immunoglobulin-like domains, a transmembrane domain and an intracellular domain.
  • the first domain (Ig-like V-type domain) is important for MHC class II binding.
  • LAG-3 has few amino acids important for binding MHC class II. It is known that the binding between LAG-3s is important for binding to MHC class II.
  • the intracellular region is relatively short and does not contain an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) or an immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) region, and human and rat LAG-3 phosphorylation sites of well-conserved serine residues It has three distinct structures: the KIEELE site, and the glutamine-proline repeat sequence. Among these, the KIEELE motif is known to play an important role in inhibiting T cell activity.
  • LAG-3 mice lacking the LAG-3 gene show uncontrolled proliferation and splenomegaly when treated with staphylococcal enterotoxin B (SEB) or egg white albumin (ovalbumin).
  • SEB staphylococcal enterotoxin B
  • ovalbumin egg white albumin
  • LAG-3 liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin
  • Galectin-3 tumor-infiltrating (tumor-) infiltrating) CD8 + T cells are known to inhibit T cell activity by binding to LAG-3 present in T cells.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention to provide a composition for treating cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention is a heavy chain CDR1 described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 27; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3, and a light chain CDR1 set forth in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 53, or SEQ ID NO: 57; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 9; And a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3), comprising a light chain variable region comprising a light chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 60 to provide.
  • LAG-3 Lymphocyte-activation gene 3
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides an expression vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the expression vector.
  • the present invention also provides a method of producing the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof by culturing the transformant.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition for treating cancer to a subject.
  • the present invention also provides a cancer diagnostic composition comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof and a kit for diagnosing cancer comprising the cancer diagnostic composition.
  • the present invention also provides a drug conjugate in which a drug is bound to the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention i) the antibody; ii) a transmembrane domain; And iii) a chimeric antigen receptor (CAR) protein comprising an intracellular signaling domain characterized by producing T cell activation when the antibody of i) binds to an antigen.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides a multi-specific antibody comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LAG-3.
  • novel antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to LAG-3 of the present invention can bind to LAG-3 and inhibit its activity, it may be useful for the development of immunotherapeutic agents for various diseases associated with LAG-3. It is expected to be.
  • Fig. 1 shows the results of confirming the schematic diagram (A) of the antigenic protein used for the production of the antibody binding to LAG-3 protein, and the purity (B) and activity (C) of the purified antigenic protein.
  • Figure 2 shows the binding force of the grip pool (pool) to LAG-3 according to the number of panning.
  • FIG. 3 shows the binding capacity of a single scFv phage clone to LAG-3 protein.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the purity of the antibody by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions of the purified LAG-3 antibody 1E09.
  • Figure 5 shows the results of confirming the binding specificity for the antigen of 1E09 using HEK293E cell line with different expression of LAG-3 protein.
  • Figure 6 shows the results of confirming the cross-reactivity and binding specificity of the 1E09 antibody using cells overexpressing human LAG-3 (A), monkey LAG-3 (B) and mouse LAG-3 (C).
  • Figure 7 shows the results of measuring the binding affinity and kinetic constant of the 1E09 antibody and human, monkey and mouse LAG-3 proteins using octets.
  • FIG. 8 shows LAG-3 cleaving ( ⁇ Ig-V) Ig-like V-type (Ig-V) domains in the extracellular domain of LAG-3, or replacing specific or unspecific amino acids in the Ig-V domain with other amino acids.
  • the binding specificity of the LAG-3-1E09 antibody using -mFc or -His fusion proteins (A and B) was confirmed by ELISA (C).
  • FIG. 11 shows avidity of single scFv clone phage of 1E09 antibody variants against LAG-3.
  • FIG. 12 shows the results of purity and yield analysis by SDS-PAGE in reducing or non-reducing conditions of selected antibody variants after optimizing 1E09.
  • Figure 13 shows cross-reactivity and binding specificity using cells overexpressing human LAG-3 (A), monkey LAG-3 (B) and mouse LAG-3 (C) of the mutant antibodies 1E09-AM_2H01 and 1E09-FR_1E05. The result is confirmed.
  • FIG. 14 shows that variant antibodies increase the activity of T cells by inhibiting the formation of LAG-3 / MHC class II complex.
  • Figure 15 shows the results of measuring the binding affinity and kinetic constants of variant antibodies and human, monkey and mouse LAG-3 proteins using octets.
  • FIG. 16 shows LAG-3-mFc or -His fusion proteins in which the Ig-V domain is cleaved ( ⁇ Ig-V) in the extracellular region of LAG-3, or a specific or unspecific amino acid in the Ig-V domain is replaced with another amino acid.
  • the binding specificity of 1E09-AM_2H01 and 1E09-FR_1E05 variant antibodies of LAG-3-1E09 using was confirmed by ELISA.
  • the present invention provides a heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 27; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3, and a light chain CDR1 set forth in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 53, or SEQ ID NO: 57; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 9; And a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3), comprising a light chain variable region comprising a light chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 60 to provide.
  • LAG-3 Lymphocyte-activation gene 3
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is characterized in that it specifically binds to the extracellular domain of LAG-3 protein of human, monkey or mouse, and the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is major histocompatibility. May inhibit the binding of LAG-3 to a major histocompatibility complex (MHC) class II molecule, or stimulate an immune response, or inhibit the binding of LAG-3 to an MHC class II molecule and stimulate an immune response have.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to LAG-3 preferably, i) a heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3, and a light chain CDR1 set forth in SEQ ID NO: 8; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 9; And a light chain variable region comprising the light chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 10, ii) a heavy chain CDR1 set forth in SEQ ID NO: 27; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3, and a light chain CDR1 set forth in SEQ ID NO: 53; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 9; And a light chain variable region comprising the light chain
  • the term "monoclonal antibody” refers to a protein molecule that is directed to a single antigenic site (single epitope) and binds specifically thereto.
  • the monoclonal antibodies can be prepared through various methods known in the art.
  • an antibody means a whole antibody form, and the whole antibody has a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is connected by a heavy chain and a disulfide bond.
  • the full length antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma. 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be selected from the group consisting of a fully human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a mouse antibody and a recombinant antibody, preferably May be a human antibody, but is not limited thereto.
  • the human antibody has an advantage that the immune response does not occur when administered to humans, since all structures are derived from humans, compared to conventional humanized antibodies or mouse antibodies are less likely to occur. Therefore, it can be very usefully used as a therapeutic antibody.
  • the term “antigen binding fragment” refers to a fragment having an antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • Fab in the antibody fragment has a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and the first constant region (CH1) of the heavy chain has one antigen binding site.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced when the cysteine residues of the hinge region of Fab' form disulfide bonds.
  • Double-chain Fv is a disulfide bond is connected to the heavy chain variable region and light chain variable region
  • short-chain Fv is generally covalently linked to the variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab, cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragments), Preferably it can be produced through genetic recombination techniques.
  • proteolytic enzymes e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab, cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragments
  • it can be produced through genetic recombination techniques.
  • variable region refers to a site showing many variations in sequence while performing a function of specifically binding to an antigen, and in the variable region, CDR1, CDR2, and CDR3, which are complementarity determining regions, exist. .
  • a framework region (FR) portion exists between the complementarity determining regions to support the complementarity determining region rings.
  • CDR complementarity determining region
  • the present inventors bio-pan a natural human single chain Fv library by phage display method to produce a human antibody that specifically binds to LAG-3.
  • biopanning refers to a peptide having a property of binding to a target molecule (antibody, enzyme, cell surface receptor, etc.) from a phage library that displays the peptide on the outer coat of the phage. It refers to the process of selecting only phage expressing on the surface.
  • Monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention are not particularly limited, but may be glycosylated and / or PEGylated to enhance residence time in the administered body.
  • glycosylation of the present invention means a processing method for translating glycosyl groups to proteins.
  • the glycosylation is carried out by glycosyl transferase binding of glycosyl groups to the serine, threonine, asparagine or hydroxylsilic acid residues of the target protein, the glycosylated protein can be used as a constituent of biological tissue, as well as cells It also plays an important role in cell recognition on the surface. Therefore, in the present invention, the effect of the antibody can be improved by changing the glycosylation of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof or the pattern of the glycosylation.
  • PEGlation refers to a processing method for improving the residence time of the antibody by introducing polyethylene glycol into the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Specifically, by PEGylating the polymer nanoparticles with polyethylene glycol, the hydrophilicity of the surface of the nanoparticles is increased and immune functions, including macrophage in the human body to prey and digest pathogens, waste and foreign influx, etc. Rapid degradation in the body through the so-called stealth effect, which prevents recognition from the body, can be prevented. Therefore, the retention time of the antibody can be improved by the PEGylation.
  • the PEGylation used in the present invention may be formed by a method of forming an amide group by combining a carboxyl group of hyaluronic acid with an amine group of polyethylene glycol, but is not limited thereto and may be performed by various methods.
  • the polyethylene glycol to be used is not particularly limited to this, but preferably has a molecular weight of between 100 and 1,000, it is preferable to use a linear or branched structure.
  • glycosylation and / or PEGylation may be modified various glycosylation and / or PEGylation pattern by methods known in the art as long as it retains the function of the antibody of the invention, the antibody of the invention is a variety of glycosylation and / or The PEGylation pattern includes all of the modified monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof may bind to human LAG-3 protein with a K D of 1.5 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less, and 7.0 ⁇ 10 ⁇ to monkey LAG-3 protein. It may be to bind with a K D of 10 M or less, and may bind to a mouse LAG-3 protein with a K D of 6.0 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides polynucleotides encoding the heavy and light chain variable regions of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • Polynucleotides encoding the light and heavy chains of the monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention are preferred codons due to degeneracy of the codons or in organisms which wish to express the light and heavy chains or fragments thereof of the human antibody.
  • various modifications can be made to the coding region within the range of not changing the amino acid sequences of the light chain and the heavy chain of the antibody expressed from the coding region, and within the range that does not affect the expression of the gene even in the portion except the coding region.
  • Various modifications or modifications can be made in the above, and those skilled in the art will understand that such modified genes are also included in the scope of the present invention.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, which are also included in the scope of the present invention.
  • sequence of such polynucleotides may be single or double chained and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding the heavy and light chain variable regions of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • expression vector means a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Viral vectors such as cosmid vectors, Adenovirus vectors, Retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, and the like, which are essential for operably linked gene expression. Genetic constructs comprising regulatory elements.
  • operably linked refers to a functional link between a nucleic acid expression control sequence and a polynucleotide encoding a protein of interest to perform a general function. Operational linkage with expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can be facilitated using enzymes commonly known in the art. have.
  • Suitable expression vectors of the invention may include signal sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers. Initiation and termination codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be functional in the subject and be in frame with the coding sequence when the gene construct is administered. Generic promoters can be either constitutive or inducible. Prokaryotic cells include, but are not limited to, lac, tac, T3 and T7 promoters.
  • Eukaryotic cells include monkey virus 40 (SV40) promoter, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter, human immunodeficiency virus (HIV) promoter, HIV long terminal repeat (LTR) promoter, moronivirus promoter, cytomegalovirus (CMV) ) Promoters derived from ⁇ -actin promoter, human hemoglobin, human muscle creatine, human metallothionein, as well as promoters, Epstein-Barr virus (EBV) promoter, Loose sacoma virus (RSV) promoter. Do not.
  • the expression vector may comprise a selectable marker for selecting a host cell containing the vector.
  • the selection marker is for selecting cells transformed with the vector, and markers conferring a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins can be used. Since only cells expressing a selection marker survive in an environment treated with a selective agent, transformed cells can be selected.
  • the vector when the vector is a replicable expression vector, the vector may include a replication origin, which is a specific polynucleotide from which replication is initiated.
  • Vectors that can be inserted into the genome of a host cell such as viruses (eg baculovirus) or phage vectors, and retroviral vectors, are also available.
  • the vector expressing the whole antibody or antibody fragment can be either a vector system in which the light and heavy chains are simultaneously expressed in one vector or a system in which the light and heavy chains are expressed in separate vectors. In the latter case, the two vectors are introduced into the host cell through cotransfomation and targeted transformation, and the cells transformed with the vector containing the light (or heavy) chain are selected and express the light chain. The selected cells are transformed back into a vector comprising a heavy (or light) chain to finally select cells expressing both the light and heavy chains.
  • variable region (VL) and the constant region (CL) of the human light chain, the variable region (VH) of the human heavy chain and the first constant region domain (CH1) were inserted. Use a vector.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the expression vector of the present invention.
  • Suitable host cells of the vector are Escherichia coli , Bacillus subtilis , Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis ) Or prokaryotic cells such as Staphylococcus sp. Also, fungi such as Aspergillus sp., Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces sp. And Neurospores. Yeast, such as Neurospora crassa , other eukaryotic cells, and cells of higher eukaryotes, such as cells from insects, and plant cells. It may also be derived from a mammal.
  • COS-7 Preferably, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO / -DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK derived from mammalian cells , BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2 / 0, NS-0, U20S or HT1080
  • the present invention is not limited thereto.
  • transformation into host cells includes any method of introducing a nucleic acid into an organism, cell, tissue, or organ, and may be performed by selecting a suitable standard technique according to the host cell as known in the art. . These methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, agrobacterial mediated transformation, PEG, dextran sulfate, Lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation methods, and the like.
  • the present invention also provides
  • step (b) monoclonal antibody or antigen thereof that specifically binds to Lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3), comprising the step of purifying the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention from the culture medium of step (a) Provided are methods for making the binding fragments.
  • LAG-3 Lymphocyte-activation gene 3
  • Cultivation of the transformant in the production method may be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be used by those skilled in the art can be easily adjusted according to the strain or animal cells selected.
  • Antibodies obtained by culturing the transformant can be used without purification and further remove impurities by various conventional methods, such as centrifugation or ultrafiltration, and the resultant is subjected to dialysis, salt precipitation, chromatography. Etc. can be used and these can be used individually or in combination. Among them, affinity chromatography is most used, and ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
  • Antibodies produced by this method are antibodies with increased affinity for the antigen.
  • affinity refers to the ability to specifically recognize and bind a specific site of an antigen, wherein a high affinity along with the specificity of the antibody for the antigen is an important factor in the immune response.
  • a humanized heavy chain library cell was prepared by randomly mutating the heavy chain variable region, and a colony lift assay was performed on the library cells to first select a variant clone having high antigen-binding ability, and then perform a competitive ELISA on the selected clones. The affinity of each clone was examined.
  • various methods for measuring affinity for the antigen can be used, and surface plasmon resonance technology is an example thereof.
  • K D refers to the dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction and was used as a measure of the affinity of the antibody for antigen. Lower K D values mean higher affinity of the antibody for antigen.
  • the present invention also provides a composition for stimulating an immune response, comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • Antibodies specific for LAG-3 of the present invention inhibit the binding of LAG-3 to MHC class II molecules, or stimulate an immune response, or inhibit the binding of LAG-3 to MHC class II molecules and cause an immune response. Since it can be stimulated, the composition comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof specific for LAG-3 of the present invention as an active ingredient is capable of stimulating an immune response.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention binds to LAG-3, which blocks the interaction of MHC and T cell receptors and decreases the activity of T lymphocytes, it has a high affinity, thereby inhibiting the activity of LAG-3 to enhance the activity of T lymphocytes and immunity. Can stimulate the response.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is as described above.
  • cancer includes any type of cancer that can be treated by the human antibody of the present invention, but is not limited to, for example, liver cancer, breast cancer, kidney cancer, brain tumor, biliary tract cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer. , Rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, colon cancer, cervical cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's disease, lymphoma and multiple myeloma hematologic cancer, but are not limited thereto.
  • compositions provided by the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Pharmaceutically acceptable carriers for compositions formulated in liquid solutions include sterile and physiologically compatible carriers, including saline, sterile water, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solutions, maltodextrin solutions, glycerol and these components.
  • One or more components can be mixed and used, and other conventional additives, such as an antioxidant, a buffer solution, and bacteriostatic agents, can be added as needed.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • composition for treatment of cancer comprising the antibody of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier is applicable to any formulation containing it as an active ingredient, it can be prepared in oral or parenteral formulations.
  • Pharmaceutical formulations of the invention may be oral, rectal, nasal, topical (including the cheek and sublingual), subcutaneous, vaginal or parenteral (intramuscular, subcutaneous). And forms suitable for administration by inhalation or insufflation.
  • Oral dosage forms containing the composition of the present invention as an active ingredient include, for example, tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, preparation powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. can do.
  • lactose For formulation into tablets and capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, stearic acid masne It may include a lubricating oil such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and in the case of a capsule, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • a lubricating oil such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax
  • a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • Formulations for parenteral administration comprising the composition of the present invention as an active ingredient, for injection, such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, a suppository injection method or aerosol for spraying by inhalation through the respiratory system It can be formulated as.
  • the compositions of the present invention may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • solutions or suspensions which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a rectal composition such as suppositories or enemas, including conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed dispersion or wet powder.
  • composition of the present invention allows administration of the antibody of the present invention to a subject to inhibit tumor growth in the subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an immunostimulatory antibody, the immunostimulatory antibody is preferably from the group consisting of anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody It may be one or more selected, more preferably may be an anti-PD-L1 antibody, but is not limited thereto.
  • an immunostimulatory antibody is preferably from the group consisting of anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody It may be one or more selected, more preferably may be an anti-PD-L1 antibody, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising administering to a subject a composition for treating cancer comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the term "administration" means introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner.
  • the route of administration of the composition of the present invention may be administered via various routes orally or parenterally as long as it can reach the target tissue, and specifically, oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, It may be administered in a conventional manner via transdermal, nasal, inhaled, intraocular or intradermal routes.
  • the treatment method of the present invention includes administering a composition for treating cancer of the present invention in a pharmaceutically effective amount.
  • a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition for preventing or treating cancer suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above-mentioned matters.
  • the subject refers to any animal in which diseases such as tumor development and angiogenesis may occur due to excessive activity of LAG-3, which means not only humans and primates but also cattle, pigs, sheep, and horses. And domestic animals such as dogs and cats.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing cancer comprising a LAG-3 antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention, and a kit for diagnosing cancer comprising the composition.
  • a diagnostic composition comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof specific for LAG-3 of the present invention can be used to diagnose a disease, such as cancer, related to the expression and degree of expression of LAG-3.
  • the method for diagnosing cancer can be detected by reacting the monoclonal antibody specific for LAG-3 of the present invention with an isolated biological sample of a suspected cancer and analyzing the antigen-antibody complex formation, thereby diagnosing cancer. It can provide information for
  • biological sample includes tissues, cells, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spinal cord, etc.), cell culture supernatants, ruptured eukaryotic cells, and bacterial expression systems. However, it is not limited thereto. These biological samples can be reacted with or without the engineered antibodies to confirm the presence of LAG-3 or cancer.
  • antigen-antibody complex means a combination of a LAG-3 protein antigen in a sample and a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention which recognizes the same, and the formation of such antigen-antibody complex is conventional.
  • Phosphorus can be measured according to the immunoassay method, radioimmunoassay using the antibody against LAG-3, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition Or it may be measured through hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification, but is not limited thereto.
  • cancer By analyzing the final signal intensity by the immunoassay process, cancer can be diagnosed. In other words, if the LAG-3 protein of the present invention is overexpressed in a biological sample isolated from a suspected individual and the signal is stronger than the biological sample isolated from a normal individual, the cancer is diagnosed as cancer.
  • the kit according to the present invention contains the antibody against LAG-3 of the present invention, and can diagnose cancer by analyzing a signal indicated by the reaction between the sample and the antibody.
  • the signal may include, but is not limited to, an enzyme bound to the antibody, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase or cytochrome P450.
  • the substrate for the enzyme is bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1- Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin when chromogenic reaction substrates such as phosphate (ASph-B-phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used , Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorphin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenedi) amine-HCl and pyrocatechol, TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azin
  • kits according to the invention may comprise a label which generates a detectable signal, said label comprising a chemical (eg biotin), an enzyme (eg alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, hose) Radish peroxidase and cytochrome P450), radioactive materials (eg 14 C, 125 I, 32 P and 35 S), fluorescent materials (eg fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and FRET ( fluorescence resonance energy transfer), but is not limited thereto.
  • a chemical eg biotin
  • an enzyme eg alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, hose
  • Radish peroxidase and cytochrome P450 eg 14 C, 125 I, 32 P and 35 S
  • fluorescent materials eg fluorescein
  • luminescent materials eg chemiluminescent and FRET ( fluorescence resonance energy transfer)
  • Measurement of the activity or signal of an enzyme used for cancer diagnosis can be carried out according to various methods known in the art. This allows for the qualitative or quantitative analysis of LAG-3 expression.
  • the present invention also provides an antibody-drug conjugate wherein a drug is bound to the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the term "drug” may be bound to the antibody or antigen-binding fragment thereof specific for LAG-3 of the present invention, and may be separated from the antibody or antigen-binding fragment thereof by acidic conditions, It means a compound that shows a therapeutic effect on.
  • Drugs that can be used in the antibody-drug conjugates according to the present invention include any compound, moiety or group that has a cytotoxic or cytostatic effect, and (i) a microtubulin inhibitor, mitosis inhibitor, topoisomerase inhibitor Or a chemotherapeutic agent capable of functioning as a DNA intercalator; (ii) protein toxins that can function enzymatically; And (iii) radioisotopes (radionuclides) and the like, one or more of which may be used in the compound.
  • Non-limiting examples of such drugs include maytansinoids, auristatins, dolastatins, tricortesenes, CC1065, calicheamicins and other enedin antibiotics, taxanes, anthracyclines, methotrexate, adriamycin, binddesin, vinca Alkaloids (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin, daunomycin, etoposide, teniposide, carminomycin, aminopterin , Dactinomycin, mitomycin, bleomycin, esperamycin, 5-fluorouracil, melphalan, other nitrogen mustards and stereoisomers, isomers, homologues or derivatives thereof, cis-platinum and cis-platinum homologues , Enzymes and other fragments thereof, such as nucleolytic enzymes
  • radioisotopes include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, and the like.
  • the present invention is not limited thereto, and micro RNAs (miRNAs), siRNAs, shRNAs, and the like, which can suppress the expression of certain oncogenes, may also be used.
  • the invention also relates to i) an antibody of the invention; ii) a transmembrane domain; And iii) a chimeric antigen receptor (CAR) protein comprising an intracellular signaling domain characterized by producing T cell activation when the antibody of i) binds to an antigen.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the CAR protein can be specified by consisting of a monoclonal antibody of the present invention, a known transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the extracellular domain comprises an antigen recognition region, in which the antigen binding site is an antibody specific for LAG-3.
  • Antibodies specific for LAG-3 are as described above, and the antibodies used in the CAR are preferably in the form of antibody fragments, more preferably in the form of Fab or scFv, but are not limited thereto.
  • the transmembrane domain of the CAR is in a form linked with an extracellular domain, and may be derived from a natural or synthetic one. If derived from naturally occurring ones, it may be derived from membrane-bound or transmembrane proteins, and may be alpha, beta or zeta chains of T cell receptors, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, It may be a portion derived from the membrane permeable region of various proteins such as CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 or CD8. Sequences of such transmembrane domains can be obtained from, but are not limited to, documents known in the art, which are known in the art of transmembrane regions of transmembrane proteins.
  • the membrane-permeable domain when synthesized, it may mainly include hydrophobic amino acid residues such as leucine and valine, and for example, phenylalanine, tryptophan, and triplet of valine may be present in the synthesized transmembrane domain. This is not restrictive.
  • the intracellular domain is a part of the domain of the CAR present in the cell, and is in a form linked with the membrane permeable domain.
  • the intracellular domain of the present invention may comprise an intracellular signaling domain, which is characterized by T cell activation, preferably T cell proliferation, when antigen binds to the antigen binding site of the CAR.
  • the intracellular signaling domain is not particularly limited as long as the antibody is bound to an antigen-binding site existing outside the cell, and is a part that transmits a signal capable of causing T cell activation, and various kinds of intracellular signaling domains Can be used, for example, an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM), which can be a CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta , CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d or may include those derived from Fc ⁇ RI ⁇ , but is not limited thereto.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • the intracellular domain of the CAR of the present invention preferably further includes a costimultatory domain (costimultatory domain) together with the intracellular signaling domain, but is not limited thereto.
  • the co-stimulatory domain which is included in the CAR of the present invention, in addition to the signal by the intracellular signaling domain, plays a role in transmitting a signal to the T cells, CAR comprising a intracellular domain of the co-stimulatory molecule Means the intracellular part of the.
  • the costimulatory molecule is a cell surface molecule, and means a molecule necessary to bring about a sufficient response of lymphocytes to an antigen, for example, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA- 1 (lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, or B7-H3, but is not limited thereto.
  • the costimulatory domain can be an intracellular portion of a molecule selected from the group consisting of such costimulatory molecules and combinations thereof.
  • a short oligopeptide or polypeptide linker may link the intracellular and transmembrane domains of the CAR, which is included in the CAR of the invention, even when the antigen binds to an antibody located outside the cell.
  • Any linker capable of inducing T cell activation through the domain is not particularly limited in length.
  • the present invention also provides a multispecific antibody comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LAG-3.
  • the multispecific antibody may be preferably a bispecific antibody, but is not limited thereto.
  • the multispecific antibody according to the present invention is preferably in the form in which the anti-LAG-3 antibody according to the present invention is bound to an antibody or fragment thereof which has an ability to bind to an immunopotent cell-specific target molecule.
  • Immunoefficacy cell-specific target molecules are PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, TIGIT, BTLA, KIR, A2aR, VISTA, B7-H3, TCR / CD3, CD16 (Fc ⁇ RIIIa) CD44, Cd56 , CD69, CD64 (Fc ⁇ RI), CD89 and CD11b / CD18 (CR3) is preferably, but not limited to.
  • Multispecific antibodies are antibodies that recognize different (multiple or more) epitopes at the same time against the same antigen or two or more different antigens.
  • Antibodies belonging to multispecific antibodies are scFv based antibodies, Fab based antibodies and IgG based antibodies. And the like.
  • Multispecific, e.g., bispecific antibodies can be more effective than inhibiting / amplifying a single signal because two signals can be simultaneously suppressed or amplified, and each signal is inhibited by a separate signal inhibitor. Compared to treatment, low dose dosing is possible and two signals can be suppressed / amplified in the same time and space.
  • bispecific antibodies are well known. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs under conditions in which the two heavy chains have different specificities.
  • hybrid scFv can be prepared in heterodimeric form by combining VL and VH of different scFv's with each other (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444, 1993), tendem ScFv can be prepared by linking different scFvs to each other, and heterodimeric miniantibodies can be prepared by expressing CH1 and CL of the Fab at the ends of each scFv.
  • individual Fabs for a particular antigen can be prepared in the form of heterodimeric Fabs in combination with each other using disulfide bonds or mediators, with different antigens at the ends of the heavy or light chains of the particular Fab
  • scFv to the two antigen binding (valency), or by placing a hinge region between the Fab and scFv (hedge region) can be prepared to have four antigen-binding value in homodimeric form.
  • a double-target bibody having three antigens to the antigen, and different scFvs at the light and heavy chain ends of the Fab are fused to the antigen.
  • Triple target bibodies having a valence of three for three, a simple form of the triple target antibody F (ab ') 3 obtained by chemically conjugating three different Fabs is known in the art.
  • hybrid hybridomas also known as quadromas
  • quadromas were produced by hybridizing mice and let hybridomas again by Trion Pharma. Methods of producing antibodies are known.
  • a method of preparing a bispecific antibody of the so-called 'Holes and Knob' type, wherein the light chain portion is shared, and the amino acid of the CH3 homodimeric domain of Fc is modified in a heterodimeric form for different heavy chains (Merchant et al., Nat.
  • DDD dimerization and docking domain
  • PKA protein kinase A
  • DNL 'dock and lock
  • LAG-3 protein was performed using the LAG-3 gene cDNA clone plasmid (# HG16498-G, Sino Biological Inc, China) to obtain only the extracellular domain (29-450 th amino acid sequence) at the 5 'end and 3' end. It was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primers for LAG-3 containing restriction enzyme Sfi I site (Table 1). The amplified PCR product was prepared by fusing mouse Fc (mFc) at the carboxy-terminus using an expression vector (FIG. 1A).
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAG-3 plasmid was transfected with HEK293F cells (Invitrogen, USA) using PEI (Polyethylenimine: # 23966, Polysciences, USA), and then serum-free medium, FreeStyle 293 expression medium (FreeStyle 293 Expression). Medium: # AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA) for 7 days.
  • Cell culture medium containing LAG-3 protein was collected, centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes, and remaining cells and suspended solids were removed through a 0.22 ⁇ m TOP-filter (Millipore, USA).
  • Purification of LAG-3 protein was performed by affinity chromatography using protein A agarose resin. The first purified protein was purified by Superdex 200 (1.5 cm x 100 cm) gel filtration chromatography. Secondary purification was performed using gel filtration chromatography.
  • Purified protein was purified using SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) under reduced or non-reduced conditions. As a result, as shown in Figure 1B, it was confirmed that the purity of the purified LAG-3-mFc protein has a purity of 95% or more.
  • the cells were then washed three times with PBS (phosphate buffered saline: # LB001-02, Welgene, Korea) containing 2% fetal bovine serum (FBS) (# 26140-079, Thermo Fisher Scientific).
  • PBS phosphate buffered saline: # LB001-02, Welgene, Korea
  • FBS fetal bovine serum
  • anti-human LAG-3 antibody # 565616, BD Biosciences, USA
  • PE phytoerythrin
  • the purified LAG-3-mFc protein bound well to Daudi cells, and the binding was reduced when blocking the antibody treated with MHC class II (Fig. 1C). This result indicates that the purified LAG-3-mFc protein is capable of binding to MHC class II expressed on the cell surface and is structurally active.
  • LAG-3-mFc prepared in Example 1 and 50 ⁇ g of LAG-3-his (# 16498-H08H) protein antigen purchased from Sino Biological Inc. were coated on an immunosorbent tube, and blocking was performed. .
  • Polyphage ELISA enzyme linked immunoassay
  • 96-well immuno-plates (# 439454, NUNC, USA) contain two human LAG-3 antigens, LAG-3-mFc and LAG-3-his proteins, each of which has a carboxy-terminus fused with a different tag. 100 ng per well was coated with a coating buffer (coating buffer) at 4 ° C. for about 16 hours, and then each well was blocked using 4% skim milk dissolved in PBS.
  • each well was washed with 0.2 ml of PBS-T, and 100 ⁇ l of the first to third panning poly scFv-phage was added to each well and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • the HRP (horseradish peroxidase) conjugated mouse anti-M13 antibody (# 11973-MM05, Sino Biological Inc.) was diluted 1: 2,000 and 1 at room temperature. Reacted for hours.
  • OPD tablet # 8787-TAB, Sigma
  • PC buffer solution 0.1 M Na 2 HPO 4 , 0.005 M Na-Citrate, pH 5.0. The color was developed for minutes, and then measured with a spectrophotometer (Molecular Devices, USA) at 490 nm of absorbance.
  • M1 helper phage with a multiplicity of infection (MOI) of 1:20, proceeding in the same manner as in Example 2-2 to perform phage-ELISA for a single scFv phage.
  • MOI multiplicity of infection
  • DNA-prep was performed using a DNA purification kit (Qiagen, Germany) for monoclonal 1E09 that specifically binds to selected LAG-3 and commissioned for sequence analysis (Solgent, Korea). Based on the results of the sequencing analysis, the regions of complementarity determining regions (CDRs) of the variable region of heavy chain (VH) and variable region of light chain (VL) of the selected antibodies were identified. Similarities were investigated using the Ig BLAST program at NCBI's web page http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. The properties of monoclonal 1E09 that specifically binds to LAG-3 are summarized in Table 3.
  • the antibodies comprising the heavy and light chain CDRs, the FR (framework region) sequences of the selected antibodies and the heavy and light chain variable regions comprising the same are shown in Tables 4 and 5.
  • the monoclonal phage antibody 1E09 complete (fully) position sequences each Sfi I / Nhe I and Sfi I / Bgl II restriction enzymes for the DNA base sequence of the heavy and light chains in order to switch to the IgG form of the selected LAG-3 PCR (iCycler iQ, Bio-Rad, USA) was performed using the primer having.
  • the heavy and light chain PCR products were digested with respective expression vectors with corresponding restriction enzyme sites and eluted with DNA-gel extraction kit (Qiagen).
  • Ligation is performed by mixing 1 ⁇ l of vector (10 ng), 15 ⁇ l of heavy or light chain (100-200 ng), 2 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 1 ⁇ l of ligase (1 U / ⁇ l), and distilled water. After standing for 2 hours, put into transformed cells (competent cells, XL1-blue) and placed on ice for 5 minutes, gave a heat shock (heat shock) at 42 °C for 90 seconds.
  • the expression vector containing the prepared heavy and light chains was co-transfected into HEK-293F cells at a ratio of 6: 4, and the supernatant was collected on day 7, followed by centrifugation and 0.22 ⁇ m top-filter. After removing the material, the supernatant was collected and subjected to Protein A affinity chromatography to purify IgG antibodies. After purification, the antibody was eluted with glycine buffer and exchanged with the final PBS buffer. Purified antibodies were quantified at 280 nm absorbance using a spectrophotometer (SpectraMX M5, Molecular Devices, USA) using the molar extinction coefficient of the antibody and stored at -70 ° C until use. . Purified antibodies were loaded by 5 ⁇ g of each in reducing and non-reducing conditions and analyzed by SDS-PAGE to confirm the purity and mobility of the purified protein.
  • LAG-3 human single antibody 1E09 was detected at a size of 150 kDa or more under non-reducing conditions, and the yield was 130 mg / L (FIG. 4).
  • the transgenic cell pool overexpressing human LAG-3 was transfected with HEK293E pcDNA3.1 plasmid containing human LAG-3 (NCBI accession number NM_002286.5) and then 100 ⁇ g / ml Zeocin (# R25001, Thermo). Screening was performed on selective culture medium containing Fisher Scientific). After the screening process, the cell pool was isolated by confirming the expression state by FACS (fluorescence activated cell sorting) analysis using anti-human LAG-3 antibody (# 565616, BD, USA) bound to the phycoerythrin (PE) phosphor. It was used for the characterization evaluation of the antibody against the antigen.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • LAG-3-1E09 antibody Antigen specificity of LAG-3-1E09 antibody was reduced by LAG-3 expression by treating LAG-3 siRNA (small interfering RNA) (Bioneer, Korea) in the human LAG-3 overexpressed HEK293E cell pool. The extent was checked by FACS analysis as compared to before reduction.
  • LAG-3 siRNA small interfering RNA
  • LAG-3-1E09 human single antibody binds well to human LAG-3 overexpressing cells, but the binding was decreased in cells in which LAG-3 expression was decreased by LAG-3 siRNA treatment (FIG. 5B). This result indicated that LAG-3-1E09 human single antibody specifically binds to human LAG-3 antigen.
  • Rhesus monkey LAG-3 (NCBI accession number XM_001108923.2) or mouse LAG-3 (NCBI accession number NM_008479) was included in the same manner as the human LAG-3 overexpressed transformed cell pool of Example 4-1.
  • the plasmid pcDNA3.1 was transformed into HEK293E cells, respectively, to make cell pools, and used for the characterization evaluation of 1E09 antibody against antigen.
  • transfected HEK293E cells overexpressing human, monkey, and mouse LAG-3, respectively were prepared at 0.2 ⁇ 10 6 cells per sample, and the antibody was used at 6 ⁇ g / ml (40 nM).
  • the antibody was used at 6 ⁇ g / ml (40 nM).
  • ) was continuously diluted to a multiple of 1/3 dilution and reacted with the prepared cells at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed three times with PBS containing 2% FBS, and reacted for 30 minutes at 4 ° C. using an anti-human IgG antibody (# FI-3000, Vectorlabs) bound to the FITC fluorescent substance. After the suspension was suspended in PBS containing 0.2 ml of 2% FBS, and analyzed using a flow cytometer FACSCanto II flow cytometer.
  • LAG-3 human single antibody 1E09 specifically binds to LAG-3 protein of human, monkey and mouse overexpressed on the cell surface, and showed that binding increased depending on antibody concentration (FIG. 6). .
  • the cell binding capacity of the antibody was calculated as the amount required to reach 50% of the maximum binding (EC 50 )
  • mean fluorescence intensity (MFI) values indicating the degree of cell binding were analyzed using GraphPad Prism software.
  • the EC 50 value showing the cell binding capacity of the LAG-3-1E09 antibody was 0.0757 ⁇ g / ml for human LAG-3, 0.2462 ⁇ g / ml for monkey LAG-3, and 1.5003 ⁇ g / ml for mouse LAG-3.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • the binding affinity for the antigen of LAG-3 human single antibody 1E09 is human recombinant LAG-3 (hLAG-3-mFc), monkey LAG-3 (MrhLAG-), which are recombinant fusion proteins fused at the carboxy-terminus of mouse Fc (mFc). 3-mFc), mouse LAG-3 (mLAG-Fc) antigen, was measured using Octet ® QK e (Fortebio Inc. USA) analytical instrument.
  • anti-human Fc capture # 18-5060, Fortebio Inc.
  • AMC anti-mouse Fc capture: # 18-5088, Fortebio Inc.
  • biosensors were buffered (# 18). After 10 minutes of stabilization in -1042, Fortebio Inc., the antigen or antibody was immobilized and stabilized in buffer (# 18-1042, Fortebio Inc.) for 10 minutes, and then the immobilized antigen or antibody was washed with buffer for 5 minutes, An antibody or antigen to be bound to a 96-well plate (# 655209, Greiner Bio-One, USA) was prepared by concentration (0.94-60 nM), followed by an association reaction for 10 minutes, followed by 10 minutes or 30 minutes.
  • the antigen binding capacity (K D ) of LAG-3 human single antibody 1E09 showed the highest affinity with 0.0918 nM (Fig. 7A) for human LAG-3 antigen.
  • the affinity of 0.328 nM (FIG. 7B) and LAG-3 antigen in mice showed 0.596 nM (FIG. 7C).
  • LAG-3 human single antibody 1E09 To determine the binding site for the antigen of LAG-3 human single antibody 1E09, cleavage of Ig-V domain (29-167 amino acid sequence) in the extracellular region of LAG-3 as shown in FIG. 8A ( ⁇ Ig-V) Or recombinant LAG-3 proteins prepared by fusion of a variant (M1-M7) and a wild-type (WT) with a specific or unspecific amino acid in the Ig-V domain with another amino acid with an mFc or His tag. Produced and purified together (FIGS. 8A and 8B).
  • LAG-3-His (WT) is a trademark of Sino Biological Inc.
  • LAG-3-His proteins purchased from (# 16498-H08H) were used and purified by affinity chromatography using Ni Sepharose 6 Fast Flow resin (# 17531803, GE Healthcare). Purified or purchased recombinant LAG-3 proteins were confirmed for purity via SDS-PAGE (FIG. 8B) and then used for ELISA analysis to confirm binding specificity of LAG-3 human single antibody 1E09 (FIG. 8C).
  • LAG-3-1E09 antibody did not bind to LAG-3- ⁇ Ig-V variant as compared to wild-type LAG-3 antigen, and LAG-3 Ig-V domain variant.
  • M7>M6 ⁇ M4> M1 the binding decreased in the order (FIG. 8C).
  • LAG-3-1E09 human single antibody had a binding site in the Ig-V domain (29-167 amino acid sequence) in the extracellular domain of LAG-3, specifically LAG-3 Ig.
  • LAG-3-1E09 antibody can inhibit the formation of LAG-3 / MHC class II complex
  • a Raji cell line expressing MHC class II on the cell surface human leukemia cells derived from Burkitt's lymphoma
  • 0.2 x 10 6 , 200 nM (14.4 ⁇ g / ml) LAG-3-mFc protein antibodies were serially diluted from 400 nM in half dilution to pre-incubation for 30 minutes at 4 °C Thereafter, the antigen-antibody mixture was reacted with the prepared cells at 4 ° C. for 30 minutes.
  • LAG-3-1E09 antibody The inhibitory ability of LAG-3-1E09 antibody to prevent the formation of LAG-3 / MHC class II complex is shown by the decrease of the ability of LAG-3-mFc to bind to MHC class II expressing cells.
  • LAG-3 human single antibody 1E09 including Patent Publication No. 2015-0023909
  • the degree of inhibition can be expressed as the amount of sample required to reach 50% of the maximum inhibition by the antibody (IC 50 ) and analyzed using MFI values and GraphPad Prism software to confirm the degree of binding of LAG-3-mFc.
  • the IC 50 values of the reference antibody and the 1E09 antibody were similarly identified as 26.6084 nM and 25.0922 nM, respectively.
  • Inhibit recovery of an antibody level may be indicated by the light emission intensity is luciferase (luciferase) out to decompose the substrate, was measured by a spectrophotometer (GloMax ® Discover System, Model # GM3000, Promega).
  • LAG-3-1E09 antibody including a reference antibody, showed a concentration gradient-dependent recovery of signals from Jurkat T cells, a functioning cell line that was reduced by the formation of LAG-3 / MHC II complex (FIG. 10).
  • the degree of recovery can be expressed by the amount of sample required to reach 50% of the maximum effect by the antibody (EC 50 ), and analyzed using GraphPad Prism software.
  • the 50 value was 0.05784 ⁇ g / ml and the reference antibody was 0.16811 ⁇ g / ml.
  • the 1E09 antibody of the present invention showed about 2.9-fold superiority to the control antibody.
  • Antibody optimization is to construct a new LC shuffling library by fixing the heavy chain and adding 10 5 -10 6 light chain (LC) pools retained by YBIOLOGICS, 1) LC shuffling 2) conserved residues by comparison with residues of structurally important sites such as hydrophobic cores of the heavy chain, exposed residues, charge clusters, salt bridges, etc. core packing followed by LC shuffling followed by mutation to conserved residues. 3) DNA of antibody variable regions is frequently encountered during in vivo affinity maturation. Mutational hot spots (mutational hot spots) that can be mutated randomly followed by LC shuffling proceeded by three methods of CDR hotspot + LC shuffling.
  • the LC gene of the 1E09 antibody was cleaved with BstX I and used as a vector, and the library pool retained by WBIOLOGICS was cut with BstX I and used as an insert. After ligation with ligase, transformation was performed using the cells for electroporation transformation.
  • the antibody libraries were prepared by collecting the transformed cells in a square plate, and various libraries of about 1.5 x 10 7 were obtained. As a result of sequencing analysis, the heavy chain (HC) sequences were identical and the LC sequence was identical. Confirmed different things.
  • the FR portion of the 1E09 antibody was replaced with a conserved amanoic acid sequence, followed by cleavage of the LC gene with BstX I, which was then used as a vector and retained by WY Biologics.
  • Library pools were cut with BstX I and used as inserts.
  • transformation was performed using the cells for electroporation transformation.
  • the antibody libraries were prepared by collecting the transformed cells in a square dish, and various libraries of about 8.4 x 10 6 were obtained.
  • the FR sites of HC were replaced with conserved amanoic acid sequences and LC sequences were different. It was.
  • CDR hotspot + LC shuffling library To construct a CDR hotspot + LC shuffling library, the FR portion of the 1E09 antibody was replaced with a conserved amanoic acid sequence, and then the hotspot libraries of CDR1 and CDR2 were cut with Sfi I and used as inserts. The library pool retained at was cut into Sfi I and used as a vector. After ligation with ligase, transformation was performed using the cells for electroporation transformation. The antibody libraries were prepared by collecting the transformed cells in a square plate, and various libraries of about 5.6 x 10 6 were obtained. As a result of sequencing, the amino acid of CDR1 and CDR2 hotspot sequences was substituted with the amino acid sequence conserved in the FR region of HC. This random variation was confirmed that the LC sequence is different.
  • Biopanning for variant selection of 1E09 antibody was carried out in the same manner as in Example 2-1 after infecting the human antibody libraries prepared for antibody optimization in Example 6-1 with bacteria, and specific for LAG-3 antigen. ScFv-phages that bind to each other were eluted. A pool of positive phages was obtained through a panning process in which the eluted phages were again infected with E. coli and amplified, and panning to obtain antibody variants was performed only the first round. As a result, as shown in Table 6, the phage influent and the number of antigen binding were confirmed in panning using optimized human antibody libraries.
  • Colony obtained from panning using optimized human antibody libraries prepared for screening single scFv phage clones specific for LAG-3 antigen was carried out in the same manner as in Example 2-3 to perform phage-ELISA on single scFv phage It was.
  • the antibodies comprising the heavy and light chain CDRs, FR sequences, and heavy and variable chain and light chain variable regions of the selected antibodies are shown in Tables 8 to 13.
  • Example 3-1 The same method as in Example 3-1 was performed to convert the monoclonal phage antibodies against selected 22 LAG-3s from phage to fully human IgG form, and each plasmid DNA containing heavy and light chain DNA sequences. To obtain a sequencing analysis (Solgent, Korea).
  • Binding of 22 antibodies, variants of LAG-3 human single antibody to human LAG-3 antigen, and cross-reactivity between different species were determined by the methods described in Examples 4-1 and 4-2.
  • the overexpressed HEK293E cells were identified by measuring MFI values indicative of antibody binding using CytoFLEX, a flow cytometer.
  • the binding of the mutant antibodies, including LAG-3-1E09 parent, to the human LAG-3 antigen and cross-reactivity between monkey and mouse species were determined using the values measured at antibody concentrations of 2 ⁇ g / ml, respectively. Table 14 shows.
  • the cell binding capacity is the same as the EC 50 value shown in FIG. 13.
  • the activity evaluation experiment of 22 antibodies which are LAG-3 human single antibody 1E09 variant was performed using LAG-3 / MHC class II blocking bioassay kit by the method similar to Example 5-2. After incubating the APC cell line with MHC II overexpression in a 96-well plate for 16 hours or more, the antibody concentration was continuously diluted in 1 / 2.5 dilution multiples from 25 ⁇ g / ml (FIG. 14A) or 10 ⁇ g / ml (FIG. 14B). Antibodies were treated and the working cell line overexpressing human LAG-3 was incubated together for 6 hours.
  • the extent of recovery of inhibition of the antibody was determined by measuring the luminescence intensity of luciferase by dissolving the substrate with a spectrophotometer (GloMax ® Discover System, Model # GM3000, Promega).
  • concentrations of signals from working cell lines Jurkat T cells
  • concentrations of signals from working cell lines for example 15 antibodies
  • Gradient-dependent recovery activity was shown (FIG. 14).
  • EC 50 value representing the inhibitory recovery ability of each antibody is shown in Table 15.
  • the affinity of the selected LAG-3 human single antibody variants for antigen was determined by recombinant fusion proteins human LAG-3 (hLAG-3-mFc), monkey LAG-3 (MrhLAG-3-mFc) as in Example 4-3.
  • human LAG-3 hLAG-3-mFc
  • monkey LAG-3 MrhLAG-3-mFc
  • K D the equilibrium dissociation constant
  • the antigen binding capacity (K D ) is determined by human LAG- 3 antigens were found to be 0.136 nM and 0.0906 nM, respectively, and monkey LAG-3 antigens were 0.629 nM and 0.456 nM, respectively. It was confirmed to be invisible.
  • the Ig-V domain in the LAG-3 extracellular domain portion similarly to the parental antibody 1E09 ( Figure 8C)

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Abstract

본 발명은 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 LAG-3에 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로 LAG-3과 연관된 다양한 질환의 면역 치료제의 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도
본 발명은 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
면역 항상성을 유지하는 것은 생명체가 살아가는데 가장 중요하다. 면역 항상성은 면역 활성 신호 전달 체계와 면역 억제 신호 전달 체계의 밸런스에 의해 조절된다. 면역 억제 신호 전달은 면역관문이라고 불리는 단백질에 의해 활성화 되어 자기 항원에 대한 자기 관용(self-tolerance)을 유지하거나 면역반응 이후 활성화된 T 세포의 기능을 약화시킴으로써 자가 면역 반응과 과도한 염증반응으로부터 정상 조직을 보호하는데 중요한 면역 시스템 중에 하나이다. 하지만 만성적인 바이러스에 감염된 세포나 암세포는 이러한 면역억제 신호 전달 시스템을 이용하여 T 세포의 면역작용으로부터 벗어나 자신들이 잘 살아 갈 수 있는 유리한 미세 주변환경(microenvironment)을 만든다.
현재까지 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1(programmed cell death protein 1), TIM-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3), LAG-3(lymphocyte activation gene 3), TIGIT(T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domains), VISTA(v-domain Ig-containing suppressor of T cell activation)를 포함하여 많은 면역관문 단백질들이 알려져 있다. 암세포의 면역회피(immune evasion) 기전은 T 세포 표면에 위치한 면역관문 단백질과 결합하여 살상기능을 갖는 T 세포(cytotoxic T cells)를 무력화시킴으로써 이루어진다. 이러한 사실은 면역관문 단백질을 타겟하여 활성이 약화된 T 세포의 기능을 다시 되살림으로써 바이러스에 감염된 세포나 암세포를 사멸시킬 수 있다는 면역관문 억제제의 이론적 배경을 제공했다. 또한 여러 면역관문 단백질의 신호전달 경로는 서로 독특하고 중복되지 않는 것으로 알려져 있어, 면역관문 억제제를 함께 사용함으로써 T 세포의 면역기능을 강화하여 암 치료를 극대화하기 위한 연구가 활발히 진행되는 이유이기도 하다.
LAG-3(lymphocyte activation gene 3)는 CTLA-4, PD-1, PD-L1과 같은 여러 면역관문 단백질 중 하나로 498개의 아미노산으로 구성된 타입 1 세포막 단백질 (type I transmembrane protein)이다. LAG-3 유전자는 12번째 인간 염색체에 존재하며 CD4(cluster of differentiation 4) 유전자에 가깝게 위치해 있고, CD4와 구조적으로 유사하여 두 단백질 모두 MHC(major histocompatibility complex) class Ⅱ에 결합할 수 있지만, 두 단백질 사이의 아미노산 서열에 대한 유사성은 20% 미만이며, MHC class Ⅱ에 대한 결합력은 LAG-3가 CD4보다 훨씬 높다. LAG-3는 4개의 면역글로불린 유사 도메인으로 구성된 세포외 영역(extracellular domain)과 막횡단 영역(transmembrane domain) 그리고 세포내 영역(intracellular domain)으로 구성되어 있다. 세포외 영역 중, 첫번째 도메인(Ig-like V-type domain)은 MHC class Ⅱ 결합에 중요하며, 광범위한 결합부위를 갖는 CD4와 달리 LAG-3는 소수의 몇몇 아미노산이 MHC class Ⅱ의 결합에 중요하며, MHC class Ⅱ에 결합하기 위해 LAG-3들간의 결합이 중요하다고 알려져 있다. 세포내 영역은 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)과 ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif) 부위를 포함하지 않고 상대적으로 짧은 편이며, 사람과 쥐의 LAG-3는 잘 보존된 세린 잔기의 인산화 부위, KIEELE 부위, 글루타민-프롤린 반복서열의 세 가지의 특징적 구조를 가지고 있다. 이 중에서 특히 KIEELE 모티프는 T 세포의 활성을 억제하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
LAG-3 유전자를 없앤 마우스에 포도상구균에서 분비하는 장내독소, staphylococcal enterotoxin B(SEB) 혹은 난백 알부민(ovalbumin)을 처리했을 때, 조절되지 않는 T 세포의 증식과 비장 비대증을 보인다. LAG-3의 발현은 T 세포가 활성화 된 후, CD4 +, CD8 + T 세포와 몇몇 자연살해(natural killer) 세포에서 증가되며, 자연 조절 T 세포(natural Treg cells)와 유도된 CD4 +FoxP3 + 조절 T 세포(iTreg cells)에 더 많은 양의 LAG-3가 발현된다고 보고되었다. MHC class Ⅱ이외에, LAG-3의 결합단백질(ligand)로는 LSECtin(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin)과 Galectin-3가 알려져 있으며 LSECtin은 암세포에, Galectin-3는 종양 침투(tumor-infiltrating) CD8 + T 세포에 각각 발현되어 T 세포에 존재하는 LAG-3와 결합함으로써 T 세포의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 인간 LAG-3 단백질의 세포외 도메인을 항원으로 사용하여, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 스크리닝 하였고, 스크리닝된 항체 클론의 중쇄와 경쇄의 가변부위를 바탕으로 제조된 단클론항체가 인간, 원숭이 및 마우스 LAG-3 단백질에 높은 친화도로 결합할 수 있으며, LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체의 형성을 저해하여 T 세포의 활성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LAG-3에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 8, 서열번호 53 또는 서열번호 57로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10, 서열번호 33 또는 서열번호 60으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 약물 결합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 항체; ii) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 상기 i)의 항체가 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multi-specific antibody)를 제공한다.
본 발명의 LAG-3에 결합하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3에 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로 LAG-3과 연관된 다양한 질환의 면역 치료제의 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도　１은　LAG-3 단백질에 결합하는 항체의 제조를 위해 사용된 항원 단백질의 모식도(A) 및 정제된 항원 단백질의 순도(B)와 활성(C)을 확인한 결과이다.
도 2는 패닝 횟수에 따른 LAG-3에 대한 파지 풀(pool)의 결합력을 나타낸 것이다.
도 3은 LAG-3 단백질에 대한 단일 scFv 파지 클론의 결합력을 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 LAG-3 항체인 1E09의 환원적 혹은 비환원적 조건에서 SDS-PAGE에 의한 항체의 순도를 분석한 결과이다.
도 5는 LAG-3 단백질의 발현이 서로 다른 HEK293E 세포주를 이용하여 1E09의 항원에 대한 결합특이성을 확인한 결과이다.
도 6은 인간 LAG-3(A), 원숭이 LAG-3(B) 및 마우스 LAG-3(C)가 과발현된 세포를 이용하여 1E09 항체의 교차반응성과 결합특이성을 확인한 결과이다.
도 7은 옥텟을 이용하여 1E09 항체와 인간, 원숭이 및 마우스 LAG-3 단백질들과의 결합 친화성과 키네틱 상수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 LAG-3의 세포외 영역에서 Ig-like V-type (Ig-V) 도메인을 절단 (△Ig-V)하거나 Ig-V 도메인 내 특정 또는 불특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 LAG-3-mFc 또는 -His 융합 단백질들(A 및 B)을 이용하여 LAG-3-1E09 항체의 결합 특이성을 ELISA를 통해 확인한 결과(C)이다.
도 9는 재조합 인간 LAG-3 단백질 (hLAG-3-mFc)와 MHC class Ⅱ를 발현하는 Raji 세포를 이용하여 1E09가 농도 의존적으로 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성을 저해하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 1E09가 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성을 저해함으로써 T 세포의 활성을 증가시키는 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 LAG-3에 대한 1E09 항체 변이체의 단일 scFv 클론 파지의 결합력을 나타낸 것이다.
도 12는 1E09를 최적화 한 후 선별된 변이체 항체들의 환원적 혹은 비환원적 조건에서 SDS-PAGE에 의해 분석한 순도와 생산량을 나타낸 결과이다.
도 13은 변이체 항체인 1E09-AM_2H01과 1E09-FR_1E05의 인간 LAG-3(A), 원숭이 LAG-3(B) 및 마우스 LAG-3(C)가 과발현된 세포를 이용하여 교차반응성과 결합특이성을 확인한 결과이다.
도 14는 변이체 항체들이 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성을 저해함으로써 T 세포의 활성을 증가시키는 것을 보여주는 결과이다.
도 15는 옥텟을 이용하여 변이체 항체들과 인간, 원숭이 및 마우스 LAG-3 단백질들과의 결합 친화성과 키네틱 상수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 LAG-3의 세포외 영역에서 Ig-V 도메인을 절단 (△Ig-V)하거나 Ig-V 도메인 내 특정 또는 불특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 LAG-3-mFc 또는 -His 융합 단백질들(도 8A 및 8B 참고)을 이용하여 LAG-3-1E09의 변이체 항체인 1E09-AM_2H01과 1E09-FR_1E05의 결합 특이성을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 8, 서열번호 53 또는 서열번호 57로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10, 서열번호 33 또는 서열번호 60으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간, 원숭이 또는 마우스의 LAG-3 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 것이 특징으로, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 주요조직적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하거나, 또는 면역 반응을 자극하거나, 또는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하고 면역 반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 바람직하게는, i) 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역으로 이루어진 것일 수 있고, ii) 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 53로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 33으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역으로 이루어진 것일 수 있으며, iii) 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 57로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 60으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역으로 이루어진 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 i) 서열번호 114의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 115의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있고, ii) 서열번호 116의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 117의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으며, iii) 서열번호 118의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 119의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "단클론항체"란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 상기 단클론항체는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 항체(antibody)는 전체(whole) 항체 형태를 의미하며, 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지며, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명의 단클론 항체는 인간항체(fully human antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 키메릭 항체(chimeric antibody), 마우스 항체(mouse antibody) 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 인간항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인간항체는 모든 구조가 인간으로부터 유래되었기 때문에, 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있다. 따라서 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원 결합 단편"이란, 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어 "가변영역(variable region)"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 부위를 의미하고, 가변영역에는 상보성결정영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 상보성결정영역 사이에는 프레임워크 영역(FR, framework region) 부분이 존재하여 상보성결정영역 고리를 지지해주는 역할을 한다.
본 발명에서 용어 "상보성결정영역(CDR, complementarity determining region)"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 파지 디스플레이 방법으로 천연 인간 단쇄 Fv 라이브러리(naive human single chain Fv library)를 바이오 패닝하여 LAG-3에 특이적으로 결합하는 인간항체를 제조하였다.
본 발명에서 용어 "바이오 패닝(biopanning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)과 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 특별히 이에 제한되지 않으나, 투여된 생체 내에서의 체류시간을 증진시키기 위하여, 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)될 수 있다.
본 발명의 용어 "당화(glycosylation)"는 글리코실기를 단백질에 전위시키는 가공방법을 의미한다. 상기 당화는 글리코실 전달효소에 의해 글리코실기가 표적 단백질의 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 히드록실리신 잔기에 결합되어 수행되는데, 상기 당화된 단백질은 생체조직의 구성물질로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포표면에서 세포인식에도 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명에서는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 당화 또는 상기 당화의 패턴을 변화시켜서 항체의 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "페길화(PEGlation)"는 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써, 항체의 혈중 체류시간을 향상시키는 가공방법을 의미한다. 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜로 고분자 나노 입자를 페길화하는 것에 의해, 나노 입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 대식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서, 상기 페길화에 의하여 항체의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 페길화는 히알루론산의 카르복실 그룹과 폴리에틸렌글리콜의 아민 그룹의 결합에 의해 아미드 그룹을 형성하는 방법으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 다양한 방법으로 페길화를 수행할 수 있다. 이때, 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 100 내지 1,000 사이의 분자량을 갖고, 선형 또는 가지형의 구조를 가지는 것을 사용함이 바람직하다.
상기 당화 및/또는 페길화는 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 한 당업계의 공지된 방법에 의해 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형될 수 있고, 본 발명의 항체는 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 변이 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 모두 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 단백질에 1.5 × 10 -10M 이하의 K D로 결합하는 것일 수 있고, 원숭이 LAG-3 단백질에 7.0 × 10 -10M 이하의 K D로 결합하는 것일 수 있으며, 마우스 LAG-3 단백질에 6.0 × 10 -10M 이하의 K D로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"란 숙주세포에서 목적유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코스미드(cosmid) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.
발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다.
또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 폴리뉴클레오티드인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용 가능하다. 전체 항체 또는 항체 단편을 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(cotransfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입하고, 경쇄(또는 중쇄)를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별한다.
Fab 형태의 항체를 제작하기 위해서, 인간 경쇄의 가변영역(VL)과 불변영역(CL) 및 인간 중쇄의 가변영역(VH)과 첫 번째 불변 영역 도메인(CH1)의 아미노산을 코딩하는 유전자를 삽입한 벡터를 이용한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 벡터의 적합한 숙주세포는 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.), 슈도모나스 속( Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스( Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속( Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스퍼질러스 속( Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스( Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아( Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속( Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa) 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 식물 세포일 수 있다. 또한 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 포유동물세포로부터 유래된 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "숙주세포로의 형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO 4) 침전, 염화 칼슘(CaCl 2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민(lipofectamine) 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주 또는 동물세포에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
형질전환체를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 이들을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 친화 크로마토그래피가 가장 많이 사용되며, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 있다.
상기 방법으로 제작된 항체는 항원에 대한 친화도(affinity)가 증가된 항체이다. 용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 본 발명에서는 중쇄 가변영역을 무작위로 돌연변이시켜 인간화 중쇄 라이브러리 세포를 제작하고 이 라이브러리 세포를 대상으로 콜로니 리프트 어세이를 실시하여 항원 결합능이 높은 변이체 클론을 먼저 선별하였고 선별된 클론들을 대상으로 경쟁적 ELISA를 실시하여 각 클론의 친화도를 조사하였다. 그 외에도 항원에 대한 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 표면 플라즈몬 공명 기술(surface plasmon resonance technology)이 그의 예이다.
본 발명에 사용되는 용어 "K D"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수(dissociation constant)를 의미하며, 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하는 척도로 사용되었다. K D 값이 낮으면 낮을수록 항체의 항원에 대한 친화력이 높음을 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 면역 반응을 자극하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 LAG-3에 특이적인 항체는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하거나, 또는 면역 반응을 자극하거나, 또는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하고 면역 반응을 자극할 수 있으므로, 본 발명의 LAG-3에 특이적인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역 반응을 자극할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체는, MHC와 T 세포 수용체의 상호작용을 차단하여 T 림프구의 활성을 감소시키는 LAG-3에 고친화도로 결합하므로, LAG-3의 활성을 억제하여 T 림프구의 활성을 증진시켜 면역반응을 자극할 수 있다. 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 인간항체에 의해 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 간암, 유방암, 신장암, 뇌종양, 담도암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁경부암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 상기 각 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상체에 본 발명의 항체를 투여하면 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 면역자극성 항체를 추가로 포함할 수 있고, 상기 면역자극성 항체는 바람직하게는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-CTLA-4 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 항-PD-L1 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 개체는 LAG-3의 과도한 활성으로 인하여 종양 발달과 신생혈관생성 등의 질병이 발생할 수 있는 임의의 동물을 의미하는 것으로, 상기 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 그리고 암에 대해서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 LAG-3에 특이적인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 LAG-3의 발현 여부와 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암을 진단할 수 있다.
상기 암을 진단하는 방법은 본 발명의 LAG-3에 특이적인 단클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 분석함으로써 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 LAG-3의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 LAG-3 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 LAG-3에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 의심되는 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 본 발명의 LAG-3 단백질이 과발현되어 시그널이 정상 개체로부터 분리한 생물학적 시료보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 LAG-3에 대한 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 예를 들어 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질 (예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이를 통해 LAG-3 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다.
본 발명에서 용어 "약물"이란, 본 발명의 LAG-3에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료효과를 나타내는 화합물을 의미한다.
본 발명에 따른 항체-약물 결합체에 사용될 수 있는 약물은 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 부분 또는 기를 포함하며, (i) 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제; (ii) 효소적으로 기능할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 방사선동위원소(방사선 핵종) 등이 포함되며, 상기 화합물에서 1종 이상이 사용될 수 있다.
이러한 약물의 비제한적인 예로는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 기타 질소 머스타드 및 그의 입체 이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀 등의 각종 항종양 또는 항암제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사선 동위원소(방사선 핵종)에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이에 제한되지 않으며, 특정 암유전자(oncogene)의 발현을 억제시킬 수 있는 마이크로 RNA (miRNA), siRNA 및 shRNA 등도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, i) 본 발명의 항체; ii) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및 iii) 상기 i)의 항체가 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공한다.
본 발명에서, 상기 CAR 단백질은 본 발명의 단클론항체와, 공지의 막통과 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인으로 구성됨으로써 특정될 수 있다.
본 발명에서 용어, "CAR(chimeric antigen receptor)"은, 면역 효과기 세포에 특정 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 자연적으로 존재하지 않는 수용체를 의미한다. 보통, 상기 CAR은 T 세포에 단클론항체의 특이성을 이식하기 위하여 사용되는 수용체를 말한다. CAR은 대개 세포 외 도메인, 막투과성 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 도메인으로 구성된다.
상기 세포 외 도메인은 항원 결합 부위(antigen recognition region)를 포함하며, 본 발명에서 상기 항원 결합 부위는 LAG-3에 특이적인 항체이다. LAG-3에 특이적인 항체는 전술한 것과 같으며, CAR에 사용되는 항체는 항체 단편의 형태인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Fab 또는 scFv 형태이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, CAR의 막투과성 도메인은 세포 외 도메인과 연결된 형태로서, 자연적 또는 합성된 것에서 유래한 것일 수 있다. 자연적으로 존재하는 것에서 유래한 경우, 막 결합 또는 막투과성 단백질에서 유래한 것일 수 있으며, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 CD8 등 다양한 단백질의 막투과성 영역에서 유래한 부분일 수 있다. 이러한 막투과성 도메인의 서열은 막투과성 단백질의 막투과성 영역 부분을 공지하고 있는 당업계에 공지된 문헌 등으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 막투과성 도메인이 합성된 것일 경우, 이는 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기를 주로 포함할 수 있으며, 그 예로 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)이 합성된 막통과 도메인에 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 CAR에서 상기 세포 내 도메인은 세포 내에 존재하는 CAR의 도메인 일부로서, 막투과성 도메인과 연결된 형태이다. 본 발명의 상기 세포 내 도메인은 CAR의 항원 결합 부위에 항원이 결합하면 T 세포 활성화, 바람직하게는 T 세포 증식을 가져오는 것이 특징인, 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 세포 내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포 내 신호전달 도메인이 사용될 수 으며, 그 예로 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3 제타(ξ, zeta), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 CAR의 세포 내 도메인은 세포 내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인(costimultatory domain)을 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은, 본 발명의 CAR에 포함되어 세포 내 신호전달 도메인에 의한 신호에 더하여, T 세포에 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, CAR의 세포 내 부분을 의미한다.
상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 림프구의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 그 예로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
또한, 선택적으로, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 CAR의 세포 내 도메인 및 막투과성 도메인을 연결할 수 있으며, 상기 링커는 본 발명의 CAR에 포함되어도, 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 링커라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 바람직하게는 이중특이적 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-LAG-3 항체가 면역효능세포-특이적 표적분자에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태가 바람직하다. 면역효능세포-특이적 표적분자는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, TIGIT, BTLA, KIR, A2aR, VISTA, B7-H3, TCR/CD3, CD16(FcγRIIIa) CD44, Cd56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 동일한 항원 또는 두 개 이상의 다른 항원에 대하여 동시에 서로 다른 다중(이중 이상)의 에피토프를 인식하는 항체로, 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444, 1993), 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고(Muller et al., FEBS lett., 432:45, 1998), 그리고 Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998).
Fab을 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 얻어진 간단한 형태의 삼중표적항체 F(ab') 3의 제조방법이 당업계에 알려져 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태의 이중특이적 항체의 제조방법(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998), heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조한 방법이 알려져 있다. 또한, 임클론(ImClone)사는 인간 VEGFR-2에 대한 키메릭 단클론항체인 IMC-1C11을 기반으로하여, 이 항체의 경쇄 아미노 말단에 마우스 혈소판유도성장인자수용체-알파(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)에 대한 single variable domain만을 융합시켜 이중특이적 항체를 제작하여 보고하였다. 또한, Rossi 등은 단백질 카이네이즈 A(protein kinase A, PKA) R 서브유닛의 dimerization and docking domain(DDD)과 PKA의 anchoring domain을 이용한 이른 바 'dock and lock(DNL)' 방법을 통해서 CD20에 대한 다수의 항원결합가를 지니는 항체를 선보인 바 있다(Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841, 2006).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. LAG-3 항원 제작과 정제 및 활성 확인
1-1. LAG-3 항원 단백질 발현 벡터 제작
LAG-3 단백질의 클로닝은 LAG-3 gene cDNA clone 플라스미드(#HG16498-G, Sino Biological Inc, China)를 이용하여 세포외 도메인(29-450번째 아미노산 서열)만을 얻기 위해 5' 말단과 3' 말단에 제한효소 SfiⅠ 자리가 포함된 LAG-3에 대한 프라이머(표 1)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물은 발현 벡터를 이용하여 카복시-말단에 마우스 Fc(mFc)를 융합시켜 제작하였다(도 1A).
LAG-3 클로닝을 위한 PCR 프라이머
프라이머 명칭 서열번호 (5'→3')
LAG-3-F gtcccggtggtgtgggcccaggag (서열번호 112)
LAG-3-R gaggtggcctgctgggagggcacc (서열번호 113)
1-2. LAG-3 항원 단백질의 발현 및 정제
제작한 LAG-3 플라스미드는 HEK293F 세포(Invitrogen, USA)에 PEI (Polyethylenimine: #23966, Polysciences, USA)를 사용하여 형질감염(transfection) 시킨 후, 무혈청 배지인 프리스타일 293 발현 배지(FreeStyle 293 Expression Medium: #AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA)에서 7일 동안 배양하였다. LAG-3 단백질을 포함하는 세포 배양액을 회수하여 10분간 5,000 rpm에서 원심분리하고 0.22 μm TOP-필터(Millipore, USA)를 통해 남아있는 세포와 부유물질을 제거하였다. LAG-3 단백질의 정제는 단백질 A 아가로스 레진(protein A agarose resin)을 이용한 친화성 크로마토크래피(affinity chromatography)를 이용하였으며 1차 정제된 단백질은 Superdex 200 (1.5 cm x 100 cm) 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 이용하여 2차 정제를 진행하였다.
정제된 단백질은 환원 혹은 비환원 조건에서 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 순도를 확인하였다. 그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이, 정제된 LAG-3-mFc 단백질의 순도는 95% 이상의 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
1-3. LAG-3 항원 단백질의 활성 확인
정제한 LAG-3-mFc 단백질 활성은 LAG-3 리셉터인 MHC class Ⅱ를 발현하고 있는 Daudi(human B cell line) 세포에 결합할 수 있는지를 통해 확인하였다. 5 x 10 5의 Daudi 세포(# 10213, Korean Cell Line Bank, Korea)는 10 ㎍/㎖의 LAG-3-mFc 또는 MHC class Ⅱ 항체(blocking antibody)인 200 ㎍/㎖의 항-인간 HLA-DR, DP, DQ (#555556, BD, USA) 항체와 함께 4℃에서 45분간 반응시켰다. 그 후, 세포들은 2% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (#26140-079, Thermo Fisher Scientific)이 포함된 PBS(phosphate buffered saline: #LB001-02, Welgene, Korea)로 3차례 수세하고, 세포 표면에 결합한 LAG-3 확인을 위해 PE(phycoerythrin) 형광물질이 결합된 항-인간 LAG-3 항체(#565616, BD Biosciences, USA)를 4℃에서 30분간 처리한 후, 동일한 수세과정을 거치고 이후 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁 시킨 후, 유세포 분석기(flow cytometry)인 FACSCanto Ⅱ (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 정제한 LAG-3-mFc 단백질은 Daudi 세포에 잘 결합하였으며, MHC class Ⅱ에 대한 항체를 처리하여 블로킹(blocking) 하였을 때는 그 결합이 감소하는 것을 확인하였다(도 1C). 이 결과는 정제한 LAG-3-mFc 단백질이 세포 표면에 발현하고 있는 MHC class Ⅱ와 결합할 수 있으며 구조적으로 활성을 가지고 있음을 나타낸다.
실시예 2. LAG-3 인간항체의 선별
2-1. 바이오패닝
실시예 1에서 제작한 LAG-3-mFc 및 Sino Biological Inc.에서 구입한 LAG-3-his(#16498-H08H) 단백질 항원 50 ㎍을 면역 흡착(immunosorb) 튜브에 코팅한 후, 블로킹을 수행하였다.
인간항체 라이브러리 파지는 2.7 x 10 10의 다양성을 가진 인간 scFv(single-chain variable fragment) 라이브러리를 박테리아에 감염 시킨 후, 박테리아를 30℃에 16시간 동안 배양하였다. 배양 후, 원심 분리하여 상층액을 PEG(polyethylene glycol, Sigma)로 농축한 다음, 이를 PBS 완충용액에 녹여 인간항체 라이브러리를 준비하였다. 면역튜브에 라이브러리 파지를 넣은 후, 실온에서 2시간 반응한 다음, 1 x PBS-Tween20(PBS-T)와 1 x PBS로 수세한 후 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만 용출하였다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝 과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻고, 비슷한 방법으로 2~3차 라운드 패닝을 수행하였고, 각 패닝 라운드에서의 파지 유입수와 결합수는 표 2에 나타낸 바와 같다.
패닝횟수에 따른 항체의 역가 비교
패닝횟수 파지의 유입수 파지의 결합수
1회 8 x 10 12 8 x 10 6
2회 3 x 10 12 5 x 10 5
3회 4 x 10 12 1 x 10 5
2-2. 폴리(poly) 파지 ELISA
실시예 2-1의 각 라운드의 패닝 과정을 통해 수득한 양성 폴리 scFv-파지 항체 풀에 대한 항원과의 특이성을 알아보기 위해 폴리 파지 ELISA(enzyme linked immunoassay)를 수행하였다.
각 1차부터 3차까지 패닝하여 얼려두었던 세포 스톡(stock)을 5 ㎖의 2 x YTCM (Yeast extract 10 g, Tryptone 17 g, NaCl 5 g, chloramphenicol 34 ㎍/㎖), 2% 글루코오스, 5 mM MgCl 2 배지에 OD 600에서 0.1 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD 600=0.5~0.7) 배양한 후 M1 헬퍼 파지를 감염하여 2 x YTCMK (2 x YTCM, Kanamycin 35 ㎍/㎖), 5 mM MgCl 2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4,500 rpm, 15 분, 4℃) 후, 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 96-웰 면역-플레이트(#439454, NUNC, USA)에는 카복시-말단이 다른 표지(tag)로 융합된 두 종류의 인간 LAG-3 항원, LAG-3-mFc와 LAG-3-his 단백질을 각각 웰 당 100 ng씩 4℃에서 16시간 정도 코팅완충용액(coating buffer)으로 코팅한 후 PBS에 녹인 4% 스킴 밀크(skim milk)를 사용하여 각 웰을 블로킹(blocking)하였다. 그 후, 각 웰 마다 PBS-T 0.2 ㎖ 사용하여 수세하고, 1차~3차 패닝 폴리 scFv-파지를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰 마다 PBS-T 0.2 ㎖를 사용하여 4번 수세 후 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 마우스 항-M13 항체(#11973-MM05, Sino Biological Inc.)를 1:2,000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-T로 수세 후에 OPD tablet(#8787-TAB, Sigma)을 PC 완충용액(0.1 M Na 2HPO 4, 0.005 M Na-Citrate, pH 5.0)에 녹인 기질용액을 만들어 100 ㎕/well씩 넣어 10분 동안 발색 시킨 다음, 흡광도(absorbance) 490 nm에서 분광광도계(spectrophotometer: Molecular Devices, USA)로 측정하였다.
그 결과 도 2에 따르면, 카복시-말단의 표지(tag)가 다른 2가지 인간 LAG-3 항원인 LAG-3-mFc와 LAG-3-his 단백질들에 대한 결합능이 3차 폴리 scFv-파지에서 증강(enrichment) 됨을 ELISA 분석법으로 확인하였다.
2-3. 단일클론 선별
항원에 대해 특이적인 단일 scFv 파지 클론을 선별하기 위해 결합능이 큰 3차 패닝 다클론 파지 항체군에서 얻은 콜로니를 선택하여 2 x YTCM, 2% 글루코스, 5 mM MgCl 2 배지 1 ㎖이 포함된 96-딥 웰 플레이트(#90030, Bioneer, Korea)에서 37℃ 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1 ㎖의 2 x YTCM, 2% 글루코스, 5 mM MgCl 2 배지에 OD 600에서 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD 600=0.5~0.7) 배양하고, M1 헬퍼 파지를 MOI(multiplicity of infection) 값이 1:20이 되로록 감염시킨 이후, 상기 실시예 2-2와 같이 동일한 방법으로 진행하여 단일 scFv 파지에 대해 파지-ELISA를 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 재조합 인간 LAG-3-his 항원에 대해 결합능이 강한 28개의 단일 파지 클론을 선별하여 얻었다. 선별된 파지 클론들은 아래 실시예 2-4 염기서열 분석과 실시예 3 내지 실시예 5와 같은 항체 특성 분석 과정을 통해 추가 선별 되었으며, 그 중에서 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단일클론 1E09 클론에 대해 실시예를 기술하였다.
2-4. 단일클론의 염기서열 분석
선별된 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단일클론 1E09에 대해 DNA 정제 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA-prep을 수행하고 서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea). 서열 분석 결과를 보고 선별된 항체의 VH(variable region of heavy chain)와 VL(variable region of light chain)의 CDR(complementarity determining region) 부위를 확인하였고, 이들 항체와 생식계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 웹페이지 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/의 Ig BLAST 프로그램을 이용하여 조사하였다. LAG-3에 특이적으로 결합하는 단일클론 1E09의 특성을 표 3에 정리하여 제시하였다.
LAG-3 단일클론 1E09의 특성
클론명 VH 유사성 VL 유사성 그룹
1E09 VH3-11 88.8% O12 89.5% 1
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR, FR(framework region) 서열 및 이를 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체는 다음 표 4 및 표 5와 같다.
LAG-3 단일클론 1E09의 중쇄 가변영역
클론명 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
1E09 QVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCAAS (서열번호 4) GFSFSDHY (서열번호 1) MNWIRQAPGKGLEWVAY (서열번호 5) IDTSATYI (서열번호 2) YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열번호 6) ARDNWGSLDY (서열번호 3) WGQGALVTVSS (서열번호 7)
LAG-3 단일클론 1E09의 경쇄 가변영역
클론명 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
1E09 DIQMTQSPSSLSPSVGDRVTITCQAS (서열번호 11) QEISIY (서열번호 8) LNWYQQKPGKAPKLLIY (서열번호 12) DAS (서열번호 9) NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호 13) QQTYITPYT (서열번호 10) FGQGTKLDIK (서열번호 14)
실시예 3. LAG-3 인간 단일 항체의 생산
3-1. scFv 형태를 IgG 형태로 전환(conversion)
선별된 LAG-3에 대한 단일 클론 파지 항체 1E09를 완전(fully) IgG 형태로 전환하기 위해 중쇄와 경쇄의 DNA 염기서열에 대해 각각 SfiI/ NheI과 SfiI/ BglⅡ 제한효소 자리 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR(iCycler iQ, Bio-Rad, USA)을 수행하였다. 중쇄와 경쇄 PCR 산물들은 각각 일치하는 제한효소 자리를 갖는 각각의 발현벡터들과 함께 절단하여 DNA-gel extraction 키트(Qiagen)로 DNA를 용출하였다. 라이게이션(ligation)은 벡터 1 ㎕(10 ng), 중쇄 또는 경쇄 15 ㎕(100~200 ng), 10 x 버퍼 2 ㎕, ligase(1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치 후, 형질전환 세포(competent cell, XL1-blue)에 넣어 얼음에 5분간 놓고, 42℃에서 90초간 열 충격(heat shock)을 주었다.
열 충격 후 배지 1 ㎖을 넣은 뒤 1시간 동안 37℃에서 키운 후, LB Amp 플레이트에 스프레딩(spreading)하여 37℃에 16시간 동안 배양하였다. 이렇게 얻은 콜로니를 취해 LB Amp 배지 5 ㎖을 접종하여 37℃에 16시간 동안 배양 후, DNA-prep 키트(Nuclogen)를 이용하여 DNA-prep을 수행하였다. 얻은 DNA는 서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea).
그 결과, 완전 IgG로 전환한 1E09의 중쇄와 경쇄 클론의 DNA 염기서열이 표 3의 클론의 파지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다. 이후 1E09의 항체 생산을 위해 각각의 중쇄와 경쇄 클론을 LB Amp 100 ㎖ 배지에 키워 midi-prep 키트(QIAgen)를 이용하여 각각 다량의 플라스미드를 얻었다.
3-2. 인간 단일 항체의 생산
준비된 중쇄와 경쇄를 포함하는 발현벡터는 6:4의 비율로 HEK-293F 세포에 동시 형질감염(co-transfection)하여 7일차 상층액을 수거하여 원심분리와 0.22 μm Top-필터를 통해 세포와 부유물질을 제거한 후, 상층액을 모아 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)를 수행하여 IgG 항체를 정제하였다. 정제 후, 글리신 완충용액(glycine buffer)으로 항체를 용출하고, 최종 PBS 완충용액으로 교환하였다. 정제된 항체는 항체의 몰흡광계수(molar extinction coefficient)를 이용하여 분광광도계(SpectraMX M5, Molecular Devices, USA)를 사용하여 흡광도(absorbance) 280 nm에서 정량되었고, 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. 정제된 항체는 환원, 비환원 조건에서 각 5 ㎍씩 로딩하여 SDS-PAGE 분석하여 정제 단백질의 순도 및 이동도(mobility) 상태를 확인하였다.
그 결과, LAG-3 인간 단일 항체 1E09는 비환원 조건에서 150 kDa 이상 크기에서 검출되었고, 생산량은 130 mg/L였다(도 4).
실시예 4. LAG-3 인간 단일 항체의 특성
4-1. LAG-3 항원에 대한 항체 특이성
인간 LAG-3을 과발현하는 형질전환 세포 풀은 인간 LAG-3(NCBI accession number NM_002286.5)을 포함하고 있는 pcDNA3.1 플라스미드를 HEK293E에 형질감염 시킨 후, 100 ㎍/㎖ Zeocin(#R25001, Thermo Fisher Scientific)이 들어있는 선택적 배양 배지에서 선별과정을 수행하였다. 선별과정 후 세포 풀은 PE(phycoerythrin) 형광물질이 결합된 항-인간 LAG-3 항체(#565616, BD, USA)를 이용한 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석을 통해 발현 상태를 확인하여 분리하였고, 항원에 대한 항체의 특성분석 평가를 위해 사용되었다.
LAG-3-1E09 항체의 항원 특이성은 제조한 인간 LAG-3 과발현 HEK293E 세포 풀에 LAG-3 siRNA(small interfering RNA) (Bioneer, Korea)을 처리하여 LAG-3 발현을 감소시킨 후, 항체의 결합 정도를 FACS 분석을 통해 감소전과 비교하여 확인하였다.
인간 LAG-3 과발현 세포에 20 nM의 대조 siRNA (siCon) 또는 LAG-3 siRNA (siLAG-3)를 처리하고 48시간 후에 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 확인한 결과, LAG-3 siRNA를 처리한 세포에서 LAG-3의 발현양이 90% 이상 감소하는 것을 확인하였다(도 5A). 이때 LAG-3 항체의 세포 결합을 확인하기 위해 시료당 0.5 x 10 6의 각 세포를 준비하여 2 ㎍/㎖의 항체와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포들은 2% FBS가 포함된 PBS로 3차례 수세하고, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs)를 사용하여 4℃에서 30분간 반응 후, 동일한 수세과정을 거치고 이후 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁 시킨 후, 유세포 분석기인 FACSCanto Ⅱ flow cytometer를 사용하여 분석하였다. 그 결과 LAG-3-1E09 인간 단일 항체는 인간 LAG-3 과발현 세포에는 잘 결합하였으나, LAG-3 siRNA 처리에 의해 LAG-3 발현이 감소한 세포에서는 결합이 감소되는 것을 보여주었다(도 5B). 이 결과는 LAG-3-1E09 인간 단일 항체가 인간 LAG-3 항원에 특이적으로 결합한다는 것을 의미하였다.
4-2. 다른 종의 LAG-3 단백질에 대한 교차반응성(cross-reactivity) 분석
실시예 4-1의 인간 LAG-3 과발현 형질전환 세포 풀 제작과 동일한 방법으로 원숭이(Rhesus monkey) LAG-3(NCBI accession number XM_001108923.2) 또는 마우스 LAG-3(NCBI accession number NM_008479)를 포함하고 있는 pcDNA3.1 플라스미드를 HEK293E 세포에 각각 형질전환하여 세포 풀을 만들고, 항원에 대한 1E09 항체의 특성분석 평가를 위해 사용하였다.
LAG-3-1E09 인간 단일 항체의 교차반응성 확인을 위해 인간, 원숭이, 마우스 LAG-3을 각각 과발현하는 형질전환 HEK293E 세포를 시료당 0.2 x 10 6 개로 준비하고, 항체를 6 ㎍/㎖ (40 nM)부터 1/3 희석 배수로 연속적으로 희석하여 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포는 2% FBS가 포함된 PBS로 3차례 수세하고, FITC 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs)를 사용하여 4℃에서 30분간 반응 후, 동일한 수세과정을 거치고 이후 0.2 ㎖의 2% FBS 가 든 PBS로 현탁 시킨 후, 유세포 분석기인 FACSCanto Ⅱ flow cytometer를 사용하여 분석하였다.
그 결과, LAG-3 인간 단일 항체 1E09는 세포 표면에 과발현된 인간, 원숭이 및 마우스의 LAG-3 단백질에 대해 모두 특이적으로 결합하였고, 항체 농도에 의존적으로 결합이 증가함을 보였다(도 6). 이때 항체의 세포 결합능(cell binding capacity)을 최대 결합의 50%에 이르는데 필요한 양(EC 50)으로 계산했을 때, 세포 결합 정도를 나타내는 MFI(mean fluorescence intensity) 값들을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석한 결과, LAG-3-1E09 항체의 세포 결합능을 나타내는 EC 50값은 인간 LAG-3에 대해서는 0.0757 ㎍/㎖, 원숭이 LAG-3에 대해서는 0.2462 ㎍/㎖, 마우스 LAG-3에 대해서는 1.5003 ㎍/㎖로 계산되었다.
4-3. LAG-3 인간 단일 항체의 항원에 대한 친화도(affinity) 확인
LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 항원에 대한 결합 친화도는 카복시-말단에 마우스 Fc(mFc)가 융합된 재조합 융합 단백질들인 인간 LAG-3(hLAG-3-mFc), 원숭이 LAG-3(MrhLAG-3-mFc), 마우스 LAG-3(mLAG-Fc) 항원을 이용하여 Octet ® QK e(Fortebio Inc. USA) 분석 장비를 통해 측정하였다.
항원 항체간 친화도 측정을 위해 AHC(anti-human Fc capture: #18-5060, Fortebio Inc.) 또는 AMC(anti-mouse Fc capture: #18-5088, Fortebio Inc.) 바이오센서를 완충액(#18-1042, Fortebio Inc.)에 10분간 안정화시킨 후에 항원 또는 항체를 고정하고 완충액(#18-1042, Fortebio Inc.)에 10분간 안정화시킨 후에 고정되지 않은 항원 또는 항체는 완충액으로 5분간 세척하고, 96-웰 플레이트(#655209, Greiner Bio-One, USA)에 결합을 원하는 항체 또는 항원을 농도별(0.94-60 nM)로 준비하여 10분간 결합(association) 반응을 수행하고, 이어서 10분 또는 30분간 해리(dissociation) 반응을 수행하였다. 모든 실험은 30℃, 1,000 rpm 조건에서 수행하였고, 시간에 따른 결합과 해리 과정 중의 센서그램(sensorgram) 데이터를 수집하여 Octet 데이터 분석 소프트웨어 9.0에 따라 1:1 글로벌 바인딩 피팅 모델(global binding fitting model)을 적용하여 평형 해리상수(equilibrium dissociation constant, K D)를 구하였다.
그 결과, 도 7과 같이, LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 항원 결합력(K D)은 인간 LAG-3 항원에 대해 0.0918 nM(도 7A)로 가장 높은 친화도를 보였고, 원숭이 LAG-3 항원에는 0.328 nM(도 7B), 마우스의 LAG-3 항원에는 0.596 nM(도 7C)의 친화도를 보였다.
4-4. ELISA 분석법을 통한 LAG-3 항원에 대한 결합부위(epitope) 결정
LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 항원에 대한 결합부위를 알아보기 위해 도 8A에서와 같이 LAG-3의 세포외 영역에서 Ig-V 도메인(29-167번째 아미노산 서열)을 절단(△Ig-V)하거나 Ig-V 도메인 내 특정 또는 불특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 변이체(M1-M7)와 wild-type(WT)을 mFc 또는 His 태그와 융합하여 제작한 재조합 LAG-3 단백질들을 상기 실시예 1과 같이 생산, 정제하였다(도 8A 및 8B). 다만, LAG-3-His (WT)은 Sino Biological Inc. (#16498-H08H)에서 구입하여 사용하였고, 생산한 재조합 LAG-3-His 단백질들은 Ni Sepharose 6 Fast Flow resin (#17531803, GE Healthcare)을 이용한 친화성 크로마그래피(affinity chromatography)를 통해 정제하였다. 정제 또는 구매한 재조합 LAG-3 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 순도를 확인한 후(도 8B), LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 결합 특이성 확인을 위해 ELISA 분석에 사용하였다(도 8C).
LAG-3 항원 변이체를 이용한 ELISA 분석결과, LAG-3-1E09 항체는 wild-type LAG-3 항원과 비교하여 LAG-3-△Ig-V 변이체에 결합하지 않았고, LAG-3 Ig-V 도메인 변이체에서는 M7>M6≥M4>M1의 순서로 결합이 감소하는 것을 알 수 있었다(도 8C). 이 결과로 LAG-3-1E09 인간 단일 항체는 LAG-3의 세포외 영역 부분 중, Ig-V 도메인(29-167번째 아미노산 서열)에 결합부위를 갖는 것으로 확인되었고, 세부적으로는 LAG-3 Ig-V 도메인의 M1, M4, M6, M7 변이체의 변이 아미노산 위치에 결합 부위를 가지며, 상기 아미노산 위치는 wild-type LAG-3에서 각각 52DL 53, 107GGLRSGRLPLQ 117, 137R, 150AVHLRDRALSCR 161인 것으로 확인되어, 본 발명의 LAG-3-1E09 항체는 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 갖는 것을 확인하였다.
실시예 5. LAG-3 인간 단일 항체의 활성평가
5-1. LAG-3 항체에 의한 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성 억제 확인
LAG-3-1E09 항체가 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 세포 표면에 MHC class Ⅱ를 발현하고 있는 Raji 세포주(Burkitt 림프종유래의 인간 백혈병세포)를 각각 시료당 0.2 x 10 6 개로 준비하고, 200 nM (14.4 ㎍/㎖)의 LAG-3-mFc 단백질에 항체들을 400 nM에서부터 1/2 희석 배수로 연속적으로 희석하여 4℃에서 30분간 반응(pre-incubation) 시킨 후, 항원-항체 혼합물을 준비한 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포는 2% FBS가 포함된 PBS로 3차례 수세하고, LAG-3-mFc를 검출할 수 있는 FITC 형광물질이 결합된 항-마우스 IgG 항체(#FI-2000, Vectorlabs)를 사용하여 4℃에서 30분간 반응 후, 동일한 수세과정을 거치고 이후 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFLEX (Beckman coulter, USA)을 사용하여 분석하였다.
LAG-3-1E09 항체의 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성을 막는 저해 능력은 MHC class Ⅱ 발현세포에 결합하는 LAG-3-mFc의 결합력 감소로 알 수 있고, 실험 결과에서 대조항체(한국공개특허공보 제2015-0023909호)를 포함하여 LAG-3 인간 단일 항체 1E09는 농도 의존적으로 LAG-3와 MHC class Ⅱ 복합체의 형성을 저해함을 확인하였다(도 9). 그 저해 정도는 항체에 의한 최대 억제의 50%에 이르는데 필요한 시료의 양(IC 50)으로 나타낼 수 있고, LAG-3-mFc의 결합 정도를 확인하는 MFI 값들과 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 분석한 결과, 대조항체(reference)와 1E09 항체의 IC 50 값은 각각 26.6084 nM과 25.0922 nM로 유사하게 확인되었다.
5-2. LAG-3-1E09 항체의 T 세포에 대한 활성 평가
LAG-3에 결합하는 인간 단일 항체 1E09의 활성 평가 실험은 LAG-3/MHC class Ⅱ 차단 바이오어세이 키트(blockade bioassay kit: #CS194822, Promega)를 사용하여 진행하였다. MHC class Ⅱ가 과발현되어 있는 APC 세포주를 96-웰 플레이트에 16시간 이상 배양 후, 10 ㎍/㎖의 항체 농도로부터 1/2.5 희석 배수로 연속 희석한 각 항체들을 처리하고, 인간 LAG-3가 과발현되는 작용 세포주(Jurakat T 세포주)를 6시간 동안 함께 배양하였다. 항체의 저해 회복 정도는 루시퍼라제(luciferase)가 기질을 분해하여 나오는 발광세기로 알 수 있고, 분광광도계(GloMax ® Discover System, Model # GM3000, Promega)로 측정하였다. 대조항체(reference)를 포함하여 LAG-3-1E09 항체는 LAG-3/MHC Ⅱ 복합체 형성으로 감소되어 있던 작용 세포주인 Jurkat T 세포의 시그널을 농도 구배 의존적으로 회복시키는 활성을 보였다(도 10). 그 회복 정도는 항체에 의한 최대 효과의 50%에 이르는데 필요한 시료의 양(EC 50)으로 나타낼 수 있고, GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 분석한 결과, LAG-3-1E09 항체의 저해 회복 능력인 EC 50 값은 0.05784 ㎍/㎖, 대조항체(reference)는 0.16811 ㎍/㎖로 확인되어, 본 발명의 1E09 항체는 대조항체 대비 약 2.9배 우월한 활성도를 보였다.
실시예 6. LAG-3 인간 단일 항체의 최적화
6-1. 1E09 항체의 최적화를 위한 라이브러리 제작
항체 최적화는 중쇄는 고정하고 와이바이오로직스에서 보유하고 있는 10 5-10 6 경쇄(light chain, LC) 풀(pool)을 넣어 새로운 LC 셔플링 라이브러리(LC shuffling library)를 제작하고, 1) LC 셔플링, 2) 중쇄의 소수성 코어(hydrophobic core), 노출 잔기(exposed residue), 전하 클러스터(charge cluster), 염 브릿지(salt bridge) 등과 같이 구조적으로 중요한 부위의 잔기들과 비교분석을 하여 보존된 잔기(conserved residue)로 변이시킨 뒤 LC 셔플링을 진행하는 코어 패킹(core packing) + LC 셔플링, 3) 항체 가변 영역(variable region)의 DNA는 in vivo 친화도 성숙(affinity maturation) 과정에서 빈번하게 변이 될 수 있는 변이 핫스팟(mutational hot spot)을 랜덤하게 변이시킨 뒤 LC 셔플링을 진행하는 CDR 핫스팟 + LC 셔플링의 3가지 방법으로 진행을 하였다.
LC 셔플링 라이브러리를 제작하기 위해 1E09 항체의 LC 유전자를 BstX I으로 절단한 다음 벡터로 사용하고, 와이바이오로직스에서 보유하고 있는 라이브러리 풀을 BstX I으로 절단하여 인서트(insert)로 사용하였다. 리가제로 라이게이션 후, 전기천공 형질전환용 세포를 이용하여 형질전환을 수행하였다. 사각 접시(square plate)에 형질전환된 세포를 모아 항체 라이브러리를 제조한 결과 약 1.5 x 10 7의 다양한 라이브러리를 얻었고 염기 서열 분석 결과 중쇄(heavy chain, HC)의 서열은 모두 같으며 LC의 서열이 서로 다른 것을 확인하였다.
Core 패킹 + LC 셔플링 라이브러리를 제작하기 위해 1E09 항체의 FR 부분을 보존(conserved)된 아마노산 서열로 치환한 뒤 LC 유전자를 BstX I으로 절단한 다음 벡터로 사용하고, 와이바이오로직스에서 보유하고 있는 라이브러리 풀을 BstX I으로 절단하여 인서트로 사용하였다. 리가제로 라이게이션 후, 전기천공 형질전환용 세포를 이용하여 형질전환을 수행하였다. 사각 접시에 형질전환된 세포를 모아 항체 라이브러리를 제조한 결과 약 8.4 x 10 6의 다양한 라이브러리를 얻었고 염기 서열 분석 결과 HC의 FR 부위가 보존된 아마노산 서열로 치환되었고 LC의 서열이 서로 다른 것을 확인하였다.
CDR 핫스팟 + LC 셔플링 라이브러리를 제작하기 위해 1E09 항체의 FR 부분을 보존(conserved)된 아마노산 서열로 치환한 뒤 CDR1, CDR2의 핫스팟 라이브러리를 SfiI으로 절단한 다음 인서트로 사용하고, 와이바이오로직스에서 보유하고 있는 라이브러리 풀을 SfiI으로 절단하여 벡터로 사용하였다. 리가제로 라이게이션 후, 전기천공 형질전환용 세포를 이용하여 형질 전환을 수행 하였다. 사각 접시에 형질 전환 된 세포를 모아 항체 라이브러리를 제조한 결과 약 5.6 x 10 6의 다양한 라이브러리를 얻었고 염기 서열 분석 결과 HC의 FR 부위가 보존된 아마노산 서열로 치환되었고 CDR1, CDR2의 핫스팟 서열의 아미노산이 랜덤하게 변이되었고 LC의 서열이 서로 다른 것을 확인하였다.
실시예 7. LAG-3 인간 단일 항체 변이체의 선별
7-1. 바이오패닝
1E09 항체의 변이체 선별을 위한 바이오패닝은 실시예 6-1에서 항체 최적화를 위해 제작한 인간항체 라이브러리들을 박테리아에 감염시킨 후, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 진행하였고, LAG-3 항원에 특이적으로 결합하는 scFv-파지들을 용출하였다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝 과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻었고, 항체 변이체를 얻기 위한 패닝은 첫 번째 라운드만 진행하였다. 그 결과, 표 6과 같이 최적화 인간항체 라이브러리들을 이용한 패닝에서의 파지 유입수와 항원에 대한 결합수를 확인하였다.
최적화 패닝에 따른 항체의 역가 비교
시료 파지의 유입수 파지의 결합수
1E09 (LC shuffling, LS) 8.0 x 10 12 3.2 x 10 8
1E09 (Core packing+LS) 1.2 x 10 13 1.1 x 10 8
1E09 (CDR hotspot+LS) 2.0 x 10 12 3.4 x 10 8
1E09 (Core packing+CDR hotspot+LS) 4.0 x 10 12 8.0 x 10 7
7-2. LAG-3 항체 변이체의 단일 클론 선별
LAG-3 항원에 대해 특이적인 단일 scFv 파지 클론을 선별하기 위해 제작한 최적화 인간항체 라이브러리들을 이용한 패닝에서 얻은 콜로니를 실시예 2-3과 동일한 방법으로 진행하여 단일 scFv 파지에 대해 파지-ELISA를 수행하였다.
그 결과, 1E09 최적화 인간항체 라이브러리들을 이용한 패닝 결과들 중에서, 예를 들어 Core 패킹+ LC 셔플링(도 11A)와 Core 패킹+CDR 핫스팟+LC 셔플링(도 11B) 방법을 통해 얻은 132개의 클론들 중에서 모항체(1E09)와 유사하게 항원에 대한 결합능을 갖는 클론을 포함하여 78개의 단일 파지 클론을 확인할 수 있었다.
7-3. LAG-3 항체 변이체의 염기서열 분석
선별된 단일 클론에 대한 염기서열 분석은 실시예 2-4와 같이 동일한 방법으로 수행 및 조사 하였다. 그 결과, 모항체 1E09와 유사성에 차이가 있는 22종의 새로운 파지 항체를 확인하였고, 표 7에 정리하였다.
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000001
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR, FR 서열 및 이를 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체는 다음 표 8 내지 표 13과 같다.
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000002
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000003
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000004
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000005
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000006
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000007
실시예 8. 선별된 LAG-3 인간 단일 항체 변이체의 생산
8-1. scFv 형태를 IgG 형태로 전환(conversion)
선별된 22종의 LAG-3에 대한 단일 클론 파지 항체들을 파지에서 완전 인간 IgG 형태로 전환하기 위해 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하였고, 중쇄와 경쇄 DNA 염기서열을 포함하는 각각의 플라스미드 DNA를 얻어 서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea).
그 결과, 완전 IgG로 전환한 LAG-3에 대한 22개 항체 클론의 중쇄와 경쇄 서열은 각각 파지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다. 이 후, 각각의 서열이 확인된 중쇄와 경쇄 플라스미드 DNA는 항체 생산을 위해 사용되었다.
8-2. LAG-3 항체 변이체의 생산
선별된 1E09 항체 변이체인 22종의 항체들 생산은 실시예 3-2에 기술한 동일한 과정으로 수행되었다. 클로닝된 중쇄와 경쇄를 포함하는 각각의 벡터는 동물 임시발현 세포 HEK-293F에 동시 형질감염하여 발현 시킨 후, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하여 생산량을 확인하고, 환원, 비-환원 조건에서 SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 순도 및 이동도 상태를 확인하였다.
그 결과, 도 12와 같이 LAG-3-1E09 인간 단일 항체 변이체들은 비환원 조건에서는 모두 150 kDa 이상의 크기에서 검출되었고, 생산량은 최저 22 mg/L에서 최대 186 mg/L 사이로 다양하게 확인되었다.
실시예 9. 선별된 LAG-3 인간 항체 변이체의 특성
9-1. 선별된 LAG-3 인간 항체 변이체의 교차반응성(cross-reactivity)
LAG-3 인간 단일 항체의 변이체인 22종 항체들의 인간 LAG-3 항원에 대한 결합 및 다른 종간 교차반응성은 실시예 4-1, 4-2에 기술한 방법으로 인간, 원숭이 또는 마우스 LAG-3가 과발현된 HEK293E 세포에서 유세포 분석기인 CytoFLEX를 사용하여 항체 결합을 나타내는 MFI 값을 측정하여 확인하였다. LAG-3-1E09 모항체(parent)를 포함하여 그 변이 항체들의 인간 LAG-3 항원에 대한 결합과 원숭이, 마우스 종간 교차반응성 여부는 각각 2 ㎍/㎖의 항체 농도에서 측정한 값을 사용하여 하기 표 14에 나타내었다.
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000008
또한, 22종의 항체들에서, 예로 1E09_AM_2H01, 1E09_FR_1E05 항체들의 경우, 세포 결합능(cell binding capcity)은 도 13에 나타낸 EC 50 값과 같다.
9-2. 선별된 LAG-3 인간 단일 항체 변이체 항체의 활성 평가
LAG-3 인간 단일 항체 1E09 변이체인 22종 항체들의 활성 평가 실험은 실시예 5-2와 같은 방법으로 LAG-3/MHC class Ⅱ 차단 바이오어세이 키트를 사용하여 진행하였다. MHC Ⅱ가 과발현되어 있는 APC 세포주를 96-웰 플레이트에 16시간 이상 배양 후, 항체 농도는 25 ㎍/㎖(도 14A) 또는 10 ㎍/㎖(도 14B)로부터 1/2.5 희석 배수로 연속 희석된 각 항체들을 처리하고, 인간 LAG-3 가 과발현되는 작용 세포주를 6시간 동안 함께 배양하였다. 항체의 저해 회복 정도는 루시퍼라제가 기질을 분해하여 나오는 발광세기를 분광광도계(GloMax ® Discover System, Model # GM3000, Promega)로 측정하여 확인하였다. LAG-3-1E09 모항체(parent)을 포함하여 22종의 항체들 중에서, 예로 15종 항체들의 경우 LAG-3/MHC class Ⅱ 복합체 형성으로 감소되어 있던 작용 세포주(Jurkat T 세포)의 시그널을 농도 구배 의존적으로 회복시키는 활성을 보였다(도 14). 대조항체(reference)와 비교하였을 때, 본 발명의 12종의 항체가 우월한 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었고, 각 항체들의 저해 회복 능력을 나타내는 EC 50 값은 표 15에 나타내었다.
Figure PCTKR2019007877-appb-img-000009
9-3. 선별된 LAG-3 인간 단일 항체 변이체들의 항원에 대한 친화도 확인
선별된 LAG-3 인간 단일 항체 변이체들의 항원에 대한 친화도는 실시예 4-3과 같이 재조합 융합 단백질들인 인간 LAG-3(hLAG-3-mFc), 원숭이 LAG-3(MrhLAG-3-mFc), 마우스 LAG-3(mLAG-Fc) 항원을 이용하여 Octet ® QK e (Fortebio Inc. USA) 분석 장비를 통해 동일한 방법으로 평형 해리상수(K D)를 구하여 확인하였다.
그 결과, LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 변이체 항체들 중에서 예를 들어 1E09-AM_2H01(도 15, A-C)과 1E09-FR_1E05(도 15D, E)의 경우, 항원 결합력(K D)은 인간 LAG-3 항원에 대해 각각 0.136 nM, 0.0906 nM로 확인되었고, 원숭이 LAG-3 항원에는 각각 0.629 nM, 0.456 nM로 확인되었으며, 마우스 LAG-3 항원에는 1E09-AM_2H01은 2.62 nM, 1E09-FR_1E05는 결합 반응을 보이지 않는 것으로 확인되었다.
9-4. 선별된 LAG-3 인간 단일 항체 변이체들의 항원에 대한 결합부위(epitope) 결정
LAG-3 인간 단일 항체 1E09 변이체들의 항원에 대한 결합부위 확인은 실시예 4-4와 같이 LAG-3의 세포외 영역에서 Ig-V 도메인이 절단(△Ig-V)되거나 특정 또는 불특정 아미노산 서열을 다른 아미노산으로 치환(M1-M7)한 재조합 LAG-3 돌연변이체들과 WT을 이용하여 ELISA 분석으로 확인하였다(도 16).
그 결과, LAG-3 인간 단일 항체 1E09의 변이체 항체들 중에서 예를 들어 1E09-AM_2H01과 1E09-FR_1E05의 경우, 모항체인 1E09(도 8C)와 유사하게 LAG-3 세포외 영역 부분에서 Ig-V 도메인에 결합하고, 세부적으로는 LAG-3 Ig-V 도메인의 M1, M4, M6, M7 부위에 결합하는 것으로 나타나, WT LAG-3의 52DL 53, 107GGLRSGRLPLQ 117, 137R, 및 150AVHLRDRALSCR 161에 결합하는 입체형태적 에피토프(conformational epitope)를 갖는다는 것을 확인하였다(도 16).

Claims (24)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 8, 서열번호 53 또는 서열번호 57로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10, 서열번호 33 또는 서열번호 60으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 27로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 53로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 33으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 57로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 9로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 60으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 114의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 115의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제3항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 116의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 117의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 118의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 119의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론항체는 인간항체, 인간화 항체, 키메릭 항체 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 LAG-3과 결합하는 scFv(single chain variable fragment), dsFv, Fab, F(ab') 및 F(ab') 2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  13. (a) 제12항의 형질전환체를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 면역 반응을 자극하기 위한 조성물.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 면역자극성 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역자극성 항체는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-CTLA-4 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 암은 간암, 유방암, 신장암, 뇌종양, 담도암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁경부암, 갑상선암, 방광암, 골암, 흑색종, 중피종, 췌장암, 난소암, 전립선암, 육종, 피부암, 고환암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  19. 제15항의 암 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  21. 제20항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 약물 결합체.
  23. i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체;
    ii) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및
    iii) 상기 i)의 항체가 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multi-specific antibody).
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