WO2013027895A1 - 페록시다신 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 - Google Patents

페록시다신 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis inhibitor composition
  • an angiogenesis inhibitor composition comprising a peroxidasin inhibitor (Peroxidasin Inhibitor) as an active ingredient, containing a peroxidasin inhibitor that can effectively inhibit cell migration, cell proliferation and tube formation of endothelial cells
  • a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis and a method for screening angiogenesis inhibitors is provided.
  • Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing blood vessels and plays an important role in normal human defense and physiological phenomena and early development, such as wound healing and inflammatory reactions.
  • angiogenesis is a disease that can be treated by blocking the angiogenesis, diseases such as cancer, diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis and the disease that induces angiogenesis due to the lack of angiogenesis. It includes myocardial infarction and ischemic limbs, so it is of high importance not only in basic medical aspects but also in clinical applications. Thus, molecular and cytological mechanisms of angiogenesis are the basis for various clinical applications.
  • angiogenesis is due to the breakdown of the basal membrane by proteolytic enzymes, the movement of vascular endothelial cells forming the vascular wall, the proliferation, and the formation of tubes (tubes) by vascular endothelial cell differentiation. This occurs through a series of sequential steps, including the steps that are generated.
  • angiogenesis is tightly regulated by a variety of negative and positive regulators (Folkman and Cotran., Int. Rev. Exp. Patho ., 16, 207-248 , 1976). Failure to do so can lead to a number of conditions, including cancer, rheumatoid arthritis, and diabetic retinopathy.
  • abnormal angiogenesis is known to play a very important role in tumor growth and metastasis, firstly to provide nutrition and oxygen for tumor growth and proliferation, and secondly to neonatal capillary Blood vessels provide an opportunity for metastatic cancer cells to enter the blood circulation, allowing cancer cells to spread and spread throughout the body.
  • angiogenesis inhibitors have the potential to be commonly used in all solid tumors. Because of its rapid growth characteristics, it has a toxic effect on bone marrow cells and gastrointestinal cells that have a relatively rapid cell cycle, whereas angiogenesis inhibitors have relatively low side effects even after long-term administration.
  • Angiogenesis inhibitors act in direct contact with vascular endothelial cells As is because it has the advantage that the drug delivery can be facilitated.
  • angiogenesis inhibitors include a mechanism for reducing the activity of certain angiogenesis-promoting factors, a mechanism for inhibiting the growth or death of vascular endothelial cells, There are four broad categories of mechanisms that inhibit the action of angiogenesis and indirect factors that control endothelial cell survival factors and increase the activity of angiogenesis inhibitors present in the body.
  • Angiogenesis inhibitors such as angiostatin, endostatin, PK5, prothrombin kringle 2 are well known (O'Relly, MS et al. Cell ., 79, 315-328, 1994; Lee. TH, Biol. Che., 273, 28805-28812, 1998).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present inventors are researching a new therapeutic agent that can prevent and treat various diseases caused by angiogenesis, the present invention can inhibit angiogenesis by inhibiting the expression of peroxidasin or protein activity. It was first identified that peroxidasin could be used as a new target for the development of angiogenesis therapeutics.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, including a substance that inhibits the expression of peroxidasin or the activity of a protein.
  • It is another object of the present invention to provide a method for screening angiogenesis inhibitors comprising the step of analyzing the expression of peroxidasin (peroxidasin) or protein activity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis comprising an inhibitor of the expression of peroxidasin (peroxidasin) gene or an activity inhibitor of peroxidasin (peroxidasin) protein as an active ingredient to provide.
  • the peroxidasin (peroxidasin) gene is composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the peroxidasin protein may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the expression inhibitor or gene activity inhibitor of the gene may be an antisense oligonucleotide, siRNA, aptamer or antibody specific for peroxidasin (peroxidasin).
  • the siRNA may specifically inhibit the expression of peroxidasin (peroxidasin), it may be composed of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 to 9.
  • the inhibitor of the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or the inhibitor of peroxidasin (peroxidasin) protein may be one having endothelial cell migration, endothelial cell proliferation or angiogenesis inhibitory activity have.
  • the composition is diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal graft rejection, neovascular glaucoma, melanoma, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophiliac joints, atherosclerotic plaques , Keloid, wound granulation, vascular adhesion, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune disease, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesion, cat scratch disease, ulcer, liver cirrhosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, malignant neurosis Thrombotic microangiopathy, organ transplant rejection, renal glomerulopathy, diabetes, angiogenesis-dependent cancer, benign tumor, inflammatory disease and neurodegenerative disease Can be.
  • test substance After treating the test substance, analyzing the expression of the peroxidasin gene or the activity of the protein; And it provides a method for screening angiogenesis inhibitors comprising the step of comparing the expression of the peroxidasin gene (peroxidasin) gene or the activity of the test material untreated test substance.
  • test material when the test material is treated when the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or protein activity is inhibited compared with the test material is not treated as an angiogenesis inhibitor
  • the method may further include determining.
  • analyzing the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or protein activity is RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), Northern blot, Western blot, cDNA microarray hybridization reaction, In situ hybridization reaction, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, immunostaining chemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and peroxidase activity measurement method can be performed by any one method selected from the group consisting of.
  • the angiogenesis inhibitor is diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal graft rejection, neovascular glaucoma, melanoma, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophiliac joint, atherosclerotic plaque Vascular proliferation, keloids, wound granulation, vascular adhesion, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesion, cat scratch disease, ulcers, cirrhosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy,
  • angiogenesis-related diseases selected from the group consisting of malignant neurosis, thrombotic microangiopathy, organ transplant rejection, renal glomerulopathy, diabetes, angiogenesis-dependent cancer, benign tumors, inflammatory diseases and neurodegenerative diseases It may be.
  • Inhibitors that inhibit the expression of peroxidasin (peroxidasin) or the activity of proteins can effectively inhibit endothelial cell migration, cell proliferation and vasculature, resulting in various diseases caused by abnormal control of angiogenesis or It can be usefully used to effectively prevent or treat the condition of the disease, there is an effect that can be used as a new target peroxidasin (peroxidasin) to discover the pathogenesis and treatment of angiogenesis-related diseases.
  • Figure 1 shows the results of analyzing the expression of peroxidasin (peroxidasin) in a variety of cells
  • A shows the results of RT-PCR
  • B shows the results of performing Western blot.
  • C ⁇ D is a photograph observed by performing immunostaining chemistry It is shown.
  • Figure 3 is a graph showing the results of analyzing the inhibition of movement of endothelial cells according to the treatment of siRNA for peroxidasin (peroxidasin).
  • Figure 4 shows the results of analyzing the degree of inhibition of angiogenesis of endothelial cells according to the treatment of siRNA for peroxidasin (peroxidasin).
  • Figure 5 shows the results of a comparative analysis of the degree of inhibition of proliferation of endothelial cells according to the treatment of siRNA for peroxidasin (peroxidasin).
  • peroxidasin can be used as a target of a new therapeutic agent capable of preventing or treating angiogenesis-related diseases, and an expression inhibitor of peroxidasin gene or peroxidasin It is characterized by providing a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, which comprises an inhibitor of protein activity as an active ingredient.
  • the peroxidasin gene was first reported in 1994 as the Peroxidasin homolog gene in Drosophila (Nelson et al., 1994) and is a unique protein with both the peroxidase and extracellular domains as a member of the myeloperoxidase family.
  • Drosophila when hemocytes differentiate early from the head mesoderm, they express Peroxidasin and then phagocytosis of apoptotic cells. Hemocytes are important mobile cells, and joint function of intestinal cells such as leukocytes and fibroblast in vertebrates. (joint function)
  • hemocytes are known to synthesize collagen type IV (representative collagen mainly distributed in blood vessels), laminin, glutactin, tiggrin, proteoglycan papilin, and extracellular matrix and peroxidasin as they spread through embryos.
  • the peroxidasin of these Drosophila consists of 1512 amino acid residues and is known to form a trimer structure.
  • the human peroxidasin molecule consists of 1479 amino acids.
  • 6 leucine-rich regions and 4 Ig loops and vWF consists of a type c sequence.
  • the enzyme domain peroxidase domain shows homology with human myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase, and has been observed in vitro to mediate H 2 O 2 -driven radio iodination, oxidation and dityrosine formation by peroxidase activity. It is believed to function in consolidation, phagocytosis, and defence, but nothing is clear yet.
  • the present inventors assumed that the peroxidasin gene has an ECM domain and binds to the basement membrane and is involved in angiogenesis, and has investigated the role of peroxidasin in angiogenesis.
  • peroxidasin peroxidasin
  • peroxidasin expression patterns in tissues through fluorescence microscopy and immunostaining chemistry resulting in peroxidasin expression in both venous and arterial endothelial cells.
  • the present inventors can confirm that peroxidasin is strongly expressed in endothelial cells, thereby inhibiting the expression of peroxidasin to elucidate the role of peroxidasin in endothelial cells.
  • the siRNA was prepared and treated with the cells, the phenomenon occurring in the cells was observed.
  • the endothelial cell migration was analyzed according to the expression inhibition of the peroxidasin gene.
  • the siRNA for peroxidasin and the scrambled siRNA and the control group were treated as a control group.
  • all the groups treated with siRNA for peroxidasin was found to induce a low level of endothelial cell migration compared to the control group (see Example 3).
  • peroxidasin is involved in endothelial cell migration and plays an essential role in endothelial cell migration during angiogenesis.
  • HUVEC cells treated with siRNA for peroxidasin in order to investigate whether it can inhibit angiogenesis, HUVEC cells treated with siRNA for peroxidasin (peroxidasin) and Analysis of the scrambled siRNA and the non-treated group as a control group showed that angiogenesis was significantly reduced in the group treated with siRNA against peroxidasin compared to the control group (see Example 4).
  • the endothelial cell proliferation was also inhibited, that is, stimulated bFGF to induce endothelial cell proliferation, and then peroxidasin (peroxidasin) siRNA
  • the degree of endothelial cell proliferation was compared between the treated group and the scrambled siRNA-treated group. As a result, the endothelial cell proliferation was 43% and 59.5% in the siRNA-treated group. It was confirmed that the decrease (see Example 5).
  • angiogenesis refers to highly regulated processes that occur in response to various proangiogenesis such as hypoxia and low pH, as well as growth factors, cytokines and other physiological molecules ( Folkman and Shing, J. Biol. Chem ., 267, 10931, 1992).
  • Angiogenesis mechanisms for the development of new blood vessels require the cooperation of various molecules that regulate the degradation and reconstitution, migration, proliferation, differentiation and tube (tube) formation of the extracellular matrix (ECM), and after angiogenesis initiation, Angiogenesis-promoting factors, including VEGF, bFGF, and PDGF, activate endothelial cells through stimulation of cell surface receptors, and activated cells proliferate, increase expression of cell adhesion molecules, increase secretion of proteolytic enzymes, and cell migration. And an increase in intrusion.
  • Angiogenesis-promoting factors including VEGF, bFGF, and PDGF, activate endothelial cells through stimulation of cell surface receptors, and activated cells proliferate, increase expression of cell adhesion molecules, increase secretion of proteolytic enzymes, and cell migration. And an increase in intrusion.
  • the most essential cells in building new blood vessels are the vascular endothelial cells that make direct contact with blood by constituting the inner membrane of blood vessels and secrete various bioactive substances to expand blood vessels, inhibit blood clots, and selectively metabolize blood vessel walls. It regulates the permeation and migration of products, and expresses various cell membrane proteins on the cell surface, and plays an important role in regulating blood flow and adhesion of leukocytes and platelets.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • vascular endothelial progenitor cells are progenitor cells that can differentiate into vascular endothelial cells
  • vascular endothelial progenitor cells that circulate in blood vessels are known to promote angiogenesis by being seated as neovascular vessels.
  • the endothelial cell migration and proliferation is effectively inhibited and angiogenesis is significantly reduced by confirming that the perioxidation-related disease that can prevent or treat angiogenesis ( It is possible to provide a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, including an inhibitor of peroxidasin gene expression or an inhibitor of peroxidasin protein activity.
  • the peroxidasin (peroxidasin) gene may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the peroxidasin (peroxidasin) protein It may be composed of amino acids encoded from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, preferably may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the inhibitor of the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or the inhibitor of the activity of the peroxidasin (peroxidasin) is an antisense oligonucleotide, siRNA, aptamer, antibody, compound or specific to peroxidasin (peroxidasin) or It may be a natural extract.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or derivatives thereof that contain a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a particular mRNA and binds to the complementary sequence within the mRNA to inhibit translation of the mRNA into a protein. It works. Antisense oligonucleotide sequence means a DNA or RNA sequence that is complementary to peroxidasin mRNA and capable of binding to peroxidasin mRNA, and that translates to peroxidasin mRNA, translocation into the cytoplasm, maturation or other It may inhibit the essential activity of all global biological functions.
  • the antisense oligonucleotide has a length of 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense oligonucleotides can be modified at one or more base, sugar or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5 (3): 343-55 (1995). )). Oligonucleotide backbones can be modified with phosphorothioates, phosphoroesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic intersaccharide bonds, and the like. In addition, antisense oligonucleotides may include one or more substituted sugar moieties. Antisense oligonucleotides may comprise modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methyl pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine Etc.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention may be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense oligonucleotides.
  • oligonucleotides comprising fat-soluble moieties are already well known in the art (US Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255).
  • the modified oligonucleotides can increase stability to nucleases and increase the binding affinity of the antisense oligonucleotides with the target mRNA.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by conventional methods to be administered in vivo or to allow antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is in the opposite direction of the multicloning site (MCS).
  • MCS multicloning site
  • siRNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (see WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 and WO 00/44914) siRNAs are provided as an efficient gene knockdown method or as a gene therapy method because they can inhibit the expression of target genes siRNAs are the first in plants, worms, fruit flies and parasites. Recently, siRNA has been developed and used for mammalian cell research.
  • the sense strand (sequence corresponding to the peroxidasin mRNA sequence) and the antisense strand (sequence complementary to the peroxidasin mRNA sequence) have a double-stranded structure. Or it may have a single chain structure with self-complementary sense and antisense strands.
  • siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA pairs that pair with RNA, but include mismatches (corresponding bases are not complementary), expansion / bulge (bases corresponding to one chain). None) and the like may be included.
  • the siRNA may be preferably selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 9.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a given target molecule. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the given target molecule.
  • the aptamers of the invention can be RNA, DNA, modified nucleic acids or mixtures thereof.
  • the aptamers of the invention may also be in linear or cyclic form.
  • the length of the aptamer of the present invention is not particularly limited, and may be usually about 15 to about 200 nucleotides, but for example, about 100 nucleotides or less, preferably about 80 nucleotides or less, more preferably about 60 nucleotides or less, Most preferably about 45 nucleotides or less.
  • the length of the aptamers of the invention may also be, for example, at least about 18, 20 or 25 nucleotides. If the total number of nucleotides is small, chemical synthesis and mass production are easier, and the cost advantage is also large. In addition, it is easy to chemical formula, high in vivo stability, low toxicity.
  • the aptamer of the present invention can be produced by the SELEX method and its improvement method (Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510) known by Ellington,
  • the SELEX method is a method of selecting oligonucleotides that specifically bind to a target substance from a pool of oligonucleotides having about 10-14 different nucleotide sequences.
  • the oligonucleotide used has a structure in which a random sequence of about 40 residues is sandwiched between primer sequences.
  • This oligonucleotide pool is associated with a target substance to recover only the oligonucleotides bound to the target substance using a filter or the like.
  • the recovered oligonucleotide is amplified by RT-PCR and used as a template for the next round. By repeating this operation about 10 times, an aptamer specifically binding to a target substance can be obtained.
  • aptamers having a stronger binding strength to the target material can be concentrated and selected.
  • aptamers having different binding forces, aptamers having different binding forms, and aptamers having the same binding force or binding form but different base sequences can be obtained.
  • the SELEX method includes the amplification process by PCR, by providing a mutation by using manganese ions in the process, it becomes possible to perform SELEX richer in diversity.
  • aptamers can be obtained using the Cell-SELEX technique for complex targets, ie living cells and tissues, in addition to the conventional SELEX technique (Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9 (4): 668, 2008), the Cell-SELEX technique has the advantage of enabling the development of aptamers for diseased cells, even when surface marker targets are unknown.
  • the Cell-SELEX technique has advantages over the conventional SELEX procedure because the isolated protein may not exhibit its original properties, since the target protein in the physiological state allows for a more functional approach in the selection process. have.
  • the present invention can be used as an inhibitor of activity of peroxidasin (peroxidasin) protein may be used, but is not limited to antibodies, peptides, compounds or natural extracts.
  • Antibodies that specifically bind to and inhibit activity by a peroxidasin protein that can be used in the present invention are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.
  • Antibodies to peroxidasin proteins are commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods ( US Pat. No. 4,816,56) or phage antibody library method (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991) It can be prepared by). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a peroxidasin protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using known affinity techniques.
  • the antibody may include a single chain variable region fragment (scFv).
  • the single chain variable region fragment may be composed of "variable region (VL) -linker-heavy chain variable region (VH) of light chain".
  • the linker means an amino acid sequence of a certain length that serves to artificially link the variable regions of the heavy and light chains.
  • Peptides capable of specifically binding to peroxidasin to inhibit the activity of peroxidasin can be obtained by conventional methods known in the art, such as phage display (Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface” .Science 228 (4705): 13151317 (1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display”. Chem. Rev .. 97 (2): 391410 (1997).
  • compounds that can inhibit the activity of peroxidasin can be obtained by the following method, that is, it can be obtained through the angiogenesis inhibitor screening method provided in the present invention.
  • the present invention after treating the test substance, analyzing the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or protein activity; And it can provide a method for screening angiogenesis inhibitors comprising the step of comparing the expression of the peroxidasin gene (peroxidasin) gene or the activity of the test material untreated test substance.
  • the method of analyzing the expression of the peroxidasin (peroxidasin) gene or protein activity can be carried out through various methods known in the art, but is not limited thereto, but RT-PCR ( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, Northern blot, Western blot, cDNA microarray hybridization reaction, in situ hybridization reaction, radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunostaining chemistry and ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Can be used.
  • the test substance or peroxidasin protein may be labeled with a detectable label.
  • the detectable label may be a chemical label (eg biotin), an enzyme label (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase, ⁇ -galactosidase and ⁇ - Glucosidase), radiolabels (eg C14, I125, P32 and S35), fluorescent labels (eg coumarin, fluorescein, fluoresein Isothiocyanate (FITC), rhodamine 6G, rhodamine B, TAMRA (6 -carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl and FAM), luminescent labels, chemil
  • a peroxidasin protein or a test substance labeled with a detectable label whether or not binding between the peroxidasin protein and the test substance occurs can be analyzed by detecting a signal from the label.
  • alkaline phosphatase bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS-B1-phosphate) Signal is detected using a chromogenic reaction substrate such as) and enhanced chemifluorescence (ECF).
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-AS-B1-phosphate naphthol-AS-B1-phosphate
  • ECF enhanced chemifluorescence
  • hose radish peroxidase When hose radish peroxidase is used as a label, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, Amplex Red Reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di
  • Signals can be detected using substrates such as [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine.
  • substrates such as [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine.
  • the "test substance” refers to an unknown substance used in screening to test whether or not it affects the activity of peroxidasin protein.
  • the sample includes, but is not limited to, chemicals, peptides and natural extracts.
  • the sample analyzed by the screening method of the present invention is a single compound or a mixture of compounds (eg, a natural extract or a cell or tissue culture). Samples can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds. Methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are commercially available from Maybridge Chemical Co.
  • Samples can be obtained by a variety of combinatorial library methods known in the art, for example biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, deconvolution required By a synthetic library method, a “1-bead 1-compound” library method, and a synthetic library method using affinity chromatography screening. Methods of synthesizing molecular libraries are described in DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl.
  • the activity of the peroxidasin protein treated with the test substance or the expression level of the gene is measured, and the activity of the peroxidasin protein or the expression level of the gene is treated as a control, that is, the test substance.
  • the test substance may be determined as an angiogenesis inhibitor, and the substance may be caused by angiogenesis. It can be used as a treatment for.
  • composition for inhibiting angiogenesis according to the present invention alone or one or more pharmaceutically acceptable inhibitors of the expression of a pharmaceutically effective amount of a peroxidasin gene or an inhibitor of the activity of a peroxidasin protein Carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient for the physiologically active ingredient to be administered to an animal or human to exhibit the desired physiological or pharmacological activity. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment.
  • the above pharmaceutically acceptable means physiologically acceptable and when administered to a human, usually does not cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal, and can be formulated for various oral or parenteral administration. It may be formulated in a form.
  • parenteral formulations are injectable formulations, preferably aqueous isotonic solutions or suspensions.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • oral dosage forms include, for example, intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, and wafers, and these formulations may contain, in addition to the active ingredients, diluents (e.g., lactose, dextrose).
  • diluents e.g., lactose, dextrose
  • the tablets may comprise binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or its Disintegrants such as sodium salts, absorbents, colorants, flavors and / or sweeteners may be further included.
  • the formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • composition of the present invention may further include auxiliaries such as preservatives, hydrating agents, emulsifiers, salts or buffers for controlling osmotic pressure and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to conventional methods.
  • auxiliaries such as preservatives, hydrating agents, emulsifiers, salts or buffers for controlling osmotic pressure and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to conventional methods.
  • composition according to the invention can be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, the dosage of the active ingredient being determined by several factors such as the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient. It may be appropriately selected depending on.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with known compounds that can enhance the desired effect.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to humans and animals orally or parenterally, such as intravenous, subcutaneous, intranasal or intraperitoneal. Oral administration also includes sublingual application. Parenteral administration includes injection and drip methods such as subcutaneous injection, intramuscular injection and intravenous injection.
  • the total effective amount of the inhibitor of the expression of the peroxidasin gene or the activity inhibitor of the peroxidasin protein may be administered to the patient in a single dose, Multiple doses may be administered by a fractionated treatment protocol with long term administration.
  • the composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the degree of disease, but can be repeatedly administered several times a day at an effective dose of 100 ⁇ g to 3,000 mg once administered based on an adult.
  • the treatment or dosage concentration may be determined in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment of the drug. .
  • an appropriate effective dosage according to a specific use as an agent for treating or preventing the angiogenesis inhibitor or angiogenesis-related disease, and the composition according to the present invention
  • the formulation, route of administration, and method of administration are not particularly limited.
  • the present invention can provide a drug for inhibiting angiogenesis for preventing or treating a disease caused by angiogenesis, which contains the pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis of the present invention as an active ingredient.
  • a method for inhibiting angiogenesis may be provided comprising administering an inhibitor of the expression of a oxidase (peroxidasin) gene or an inhibitor of the activity of a peroxidasin protein to a mammal other than a person in whom angiogenesis is abnormally sustained. .
  • the disease caused by the angiogenesis or abnormal angiogenesis is not limited thereto, but diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal graft rejection, neovascular glaucoma, melanoma, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophilia sexual joints, capillary hyperplasia in atherosclerotic plaques, keloids, wound granulation, vascular adhesions, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesion, cat scratch disease, ulcers, Selected from the group consisting of cirrhosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, malignant neuropathy, thrombotic microangiopathy, organ transplant rejection, renal glomerulopathy, diabetes, angiogenesis-dependent cancer, benign tumors, inflammatory diseases and neurodegenerative diseases Can be.
  • HAVECs Human umbilical endothelial cells
  • Jaffe see Clin. Invest. 52, 2745, 1973
  • 20% fetal bovine serum 30 ug / ml endothelial cells.
  • the growth additive (BD Bioscience Co., USA), 90 ug / ml of heparin (Sigma) and 1% of the antibiotic was added to the M199 medium and cultured under the conditions of 37 ° C and 5% carbon dioxide supply.
  • Late EPC used cells obtained from previously reported experiments (Ha et al., FEBS Lett.
  • WJ-MSC was isolated from the cord matrix portion by a method known by Mitchell et al. (Stem Cells, 21, 50, 2003) and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum, Bovine capillary Endothelial cell (BCE) cells were obtained from Dr. Tae-Hee Lee's team at the Nuclear Medical Center (Kim et al., Biochem, Biophy.Res.Commun., 304, 740), and AT-MSC were obtained from Prof.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • BCE Bovine capillary Endothelial cell
  • BM-MSC was purchased from Cambrex Bioscience (Rockland, ME) and cultured using mesenchymal stem cell growth medium bullet-kit.
  • Other cell lines were obtained from the American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, USA), HL60 and Hep3B were cultured in RPMI-1640 medium with 10% fetal bovine serum, and the remaining cell lines were supplemented with 10% fetal bovine serum. Cultured in DMEM medium.
  • Trizol Invitrogen, USA
  • cDNA was synthesized using the reverse transcription system of Promega on the obtained RNA, and the amplification of the obtained cDNA was performed using the Super Taq PLUS version (Super Bio Co.LTD). It was. Then, Peroxidasin (hereinafter, referred to as 'PXDN') gene was amplified using the primers described below.
  • the PCR reaction was performed for 5 minutes at 95 ° C. for the first time, followed by denaturation at 95 ° C. for 1 minute, and annealing at 55 ° C. for 5 minutes, followed by extension reaction at 72 ° C. for 1 minute, and the reaction was repeated 30 times. In the last cycle, the reaction was extended for 10 minutes at 72 ° C.
  • the PCR product was then visualized with EtBr reagent after 1.0% agarose-gel electrophoresis to confirm the reaction product.
  • Peroxidasin forward primer SEQ ID NO: 2
  • Peroxidasin reverse primer (SEQ ID NO: 3):
  • peroxidasin peroxidasin
  • lysis buffer 50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF.
  • Cells were lysed with 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM PMSF, 1 ⁇ g / ml pepstatin, and a protein inhibitor mixture (Roche), and the cell lysates were centrifuged at 14000 rpm for 30 minutes.
  • Electrophoresis was performed on 8% agarose gel. The separated proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane at 100 V for 2 hours, after which the membrane was blocked with 5% scheme milk. The reaction was then carried out using a primary antibody against PXDN, followed by reaction with a secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The immunized bands were then visualized using a chemiluminscent substrate (ECL kit) (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
  • ECL kit chemiluminscent substrate
  • peroxidasin peroxidasin
  • the human umbilical cord was fixed with 4% paraformaldehyde for analysis using a fluorescence microscope, then a Paraffin block was made, sectioned to a size of 4 um, deparaffinized with xylene, and then rehydrated with alcohol.
  • the antibody was then unmasked according to the retrieval method (0.1 mM, pH 8.0 EDTA buffer heated in microwave oven for 3 cycles x 1 min), reacted with each slice for 5 hours in 5% normal goat serum buffer, and then each slice was sliced.
  • the reaction was overnight with a primary antibody against the Peroxidasin protein. Thereafter, the mixture was washed three times with PBS solution, and reacted with Alexa 488 or Cy 3 conjugated secondary antibody for 1 hour.
  • the concentration used with the primary antibody was Peroxidasin (1: 500), CD31 (clone JC70A, 1:25, DAKO, Glostrup, Denmark), and vWF (clone F8 / 86, 1:25). , DAKO, Glostrup, Denmark), and PBS solution was used as a control instead of the primary antibody, and after the antibody reaction, each section (slice) was finally made using 1 ⁇ g / ml DAPI (Sigma, St. Louis, Mo). Nuclei were fluorescently labeled.
  • immunostaining chemistry quenched the endogenous peroxidase with 3% hydrogen peroxide in slices of human umbilical cord tissue that had been rehydrated with xylene and alcohol prepared for fluorescence microscopy analysis, and then 5% normal for 1 hour. After blocking with goat serum buffer, each slice was reacted with a primary antibody overnight, washed three times with PBS solution three times, and then reacted with a secondary antibody. The primary antibody was used as peroxidasin antibody (1: 500) and visualized using chromagen 3, 3′-diaminobenzidine (DAB) (Sigma, St. Louis, Mo).
  • DAB chromagen 3, 3′-diaminobenzidine
  • peroxidasin red expression sites were consistent with those of CD31 (green) and vWF (green) expression sites.
  • Peroxidasin peroxidasin was found to be expressed, and also in the small capillaries of the matrix portion was found to be expressed (see Figure 3).
  • peroxidasin is expressed not only in endothelial cells but also in stromal cells in the cord matrix (Wharton's jelly) region.
  • the present inventors were able to confirm that peroxidasin is expressed in endothelial cells through the above experimental results, and based on these results, to determine whether peroxidasin is involved in endothelial cell migration. For this purpose, it was analyzed whether inhibition of peroxidasin expression in endothelial cells affects endothelial cell migration.
  • siRNAs that can inhibit the expression of peroxidasin was prepared. SiRNAs that can act at different positions of peroxidasin were prepared, and as a control from ST Pham (Seoul, Korea). The supplied scrambled siRNA was used.
  • the prepared siRNA was then treated with HUVEC cells dispensed in an amount of 5 ⁇ 10 5 cells / 100mm dish, wherein the cells were treated with 20% fetal bovine serum, 30 ⁇ g / ml of endothelial cell growth supplements and 90 ⁇ g / ml heparin. Cells cultured in the added M199 medium were used. Treatment of siRNA on HUVEC cells was treated with 10 nM (100 pmol) scrambled siRNA and 10 nM (100 pmol) peroxidasin siRNA using Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Post cells were incubated for 48 hours.
  • the endothelial cell migration was analyzed in the siRNA-treated cells.
  • the endothelial cell migration was analyzed by Kim et al., (Mol Cancer Ther, 2133-2141, 2008).
  • the treated cells were treated with VEGF (2 ng / ml) for 5 hours, and the migrated cells were fixed for 5 hours, fixed, stained with hematoxylene and eosin, and photographed for analysis. .
  • the inhibition of the expression of Peroxidasin by each siRNA treatment was confirmed by the same method as the Western blot performed in the above Example.
  • siRNA sequence Name Forward direction SEQ ID NO: Reverse SEQ ID NO: siRNA-1 GCA UGA CUU CGC UGC UCA UTT 4 AUG AGC AGC GAA GUC AUG CTT 5 siRNA-2 GCA UCA AUG CUG GCA UCU UTT 6 AAG AUG CCA GCA UUG AUG CTT 7 siRNA-3 GCG AAU CUC ACG CCA ACA ATT 8 UUG UUG GCG UGA GAU UCG CTT 9 ScrambledsiRNA GUU CAG GUC CGG CGA GTT 10 CUC GCC GGA CAC GCU GAA CTT 11
  • peroxidasin plays an important role in the endothelial cell migration, and furthermore, when the expression or activity of peroxidasin is inhibited, the endothelial cell migration can be reduced.
  • Example 3 when the inhibition of peroxidasin (peroxidasin) expression inhibits endothelial cell migration, the present inventors also inhibit angiogenesis when the expression of peroxidasin (peroxidasin) is inhibited.
  • cold Matrigel 150 ⁇ l, BD Bioscience
  • siRNA1, siRNA2, and siRNA3 were harvested and then further incubated for 20 hours.
  • the angiogenesis was photographed and observed, and the size (length) of the tube was measured using the Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) program.
  • peroxidasin plays an important role in angiogenesis, it can be seen that by controlling this can inhibit angiogenesis.
  • the correlation between peroxidasin and endothelial cell proliferation was examined by comparing the degree of cell proliferation in the siRNA treatment group, the scrambled siRNA treatment group, and the lipofectamine treatment group using the verified siRNA.
  • 4x10 3 cells (HUVECs) were each dispensed into 96-well plates, incubated for 24 hours, and then the cells were treated with siRNA1, siRNA3, scrambled siRNA, and lipofectamine alone for 4 hours and incubated for 48 hours. . After incubation, two hours after treatment with 20 ul of MTS reagent, the cells in each plate were analyzed for cell proliferation at 490 nm with an ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).
  • the proliferation of the cell group treated with siRNA1 and siRNA3 respectively was 43%, 59.5% reduction compared to the cell group treated with scrambled siRNA, respectively. Therefore, the present inventors have found that peroxidasin plays an important role in endothelial cell proliferation. Especially, when the expression or activity of peroxidasin is inhibited, proliferation of endothelial cells is prevented. It can be seen that it can be effectively suppressed.
  • peroxidasin plays an important role in endothelial cell migration, proliferation, and angiogenesis, or a substance that inhibits the expression of peroxidasin or In the case of substances that inhibit the activity of peroxidasin, it can be seen that it can be used as a therapeutic agent for the treatment of neovascular diseases, and peroxidasin for the development of therapeutic agents and studies on the mechanism of action of neovascular diseases. (peroxidasin) could be a new target.

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Abstract

본 발명은 페록시다신 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물 및 시험물질을 처리한 후, 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 시험물질을 처리한 경우와 비교하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명에 따른 페록시다신의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 억제제는 내피세포의 세포 이동, 세포 증식 및 맥관형성을 효과적으로 억제할 수 있어 혈관신생이 비정상적으로 조절되어 야기되는 다양한 질환 또는 질환들의 상태를 효과적으로 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

페록시다신 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물
본 발명은 페록시다신 억제제(Peroxidasin Inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물에 관한 것으로서, 내피세포의 세포 이동, 세포 증식 및 튜브 형성을 효과적으로 억제할 수 있는 페록시다신 억제제를 함유한 혈관신생억제용 약학적 조성물 및 혈관신생억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 상처치유와 염증반응과 같은 정상적인 인체 방어 및 생리적 현상과 초기 발생과정에 있어서 아주 중요한 역할을 한다.
또한, 혈관신생은 혈관신생을 차단하여 임상적 치료 효과를 나타내는 질환인 암, 당뇨병성 망막증, 건선, 류마티스 관절염과 같은 질환과 혈관신생이 부족하여 혈관신생을 유도함으로써 치료효과를 볼 수 있는 질환인 심근경색증 및 허혈사지증 등을 포함하고 있어 기초의학적인 측면뿐만 아니라 임상적 응용 측면에서 중요성이 높은 분야이다. 따라서 혈관신생 과정의 분자, 세포학적 기전 연구는 다양한 임상적 적용을 가능하게 하는 기초가 된다.
한편, 혈관신생의 과정은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브(관)의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.
혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데(Folkman and Cotran., Int. Rev. Exp. Patho., 16, 207~248, 1976), 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증 등 여러 가지 질환들이 야기된다. 특히, 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있는데, 첫째로는 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 역할을 하며, 둘째로는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포가 온 몸에 퍼져 전이가 되도록 하는 역할을 한다.
따라서 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암을 포함하는 여러 질환의 예방 및 치료에 있어서 중요한 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제의 개발에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 또한, 이러한 혈관신생 억제제는 항암 치료법에 있어서 특히 각광을 받고 있는데 이러한 이유로는 첫째, 혈관신생 억제제는 모든 고형성 종양에서 공통적으로 사용할 수 있는 가능성이 있고, 둘째, 기존의 항암 화학요법은 암 세포가 빠르게 성장하는 특징을 이용하여 치료하기 때문에 비교적 세포주기가 빠른 골수세포 및 위장관계 세포에 독성 작용을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 장기 투여하여도 비교적 부작용이 적다는 장점이 있고, 셋째, 하나의 혈관세포는 수백 개의 암세포에 영양분과 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포 억제를 통해 많은 암세포를 억제할 수 있으며, 넷째, 기존의 항암 요법의 경우에는 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 직접적으로 혈관 내피세포에 접촉하여 작용함으로써 약물 전달을 용이하게 할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문이다.
한편, 성인의 혈액 중에 순환하는 혈관 내피 전구 세포의 존재에 대한 가설은 100년 전에 보고된 바 있고, 1997년 Isner 박사 그룹에서 동정하여 처음으로 Science에 발표되었다(Asahara et al., 1997). 그 후 여러 연구 그룹에서 말초혈액, 골수 및 제대혈에서 이러한 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell, EPC)가 존재한다는 증거들이 제시되었다. 특히 말초 혈액의 EPC는 골수에서부터 유래하는 것으로 증명되었고(Asahara et al., 1999a, Takahashi et al, 1999), in vitro에서 배양된 EPC를 in vivo에 주입하였을 때, ischemia 실험동물 모델과, 이식 암 실험동물 모델에서 혈관신생이 일어나는 부위에 배양하여 넣어준 세포들이 혈관형성에 기여하는 것이 보고되었고(Kalka et al., 2000; Murohara et al., 2000), EPC 이동에 관여하는 각종 성장인자 및 사이토카인에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다 (Asahara et al., 1999b, Takahashi et al., 1991).
따라서 최근에는 성인에서의 혈관신생에 대한 패러다임이 변화되고 있어 기존의 혈관으로부터 싹트듯이 자라나오는 내피세포뿐만 아니라, 골수 유래 EPC도 관여하는 것으로 이해되어지고 있다.
그러나 이러한 EPC의 허혈조직에 대한 치료적 유용성이 인정되어 임상적 의의가 중요한데도 불구하고(Assmus et al., 2002; Kang et al, 2004), 현재까지도 EPC의 동정 및 특징에 대한 연구가 충분하지 못하며, 내피세포와 구분할 수 있는 마커가 부재하고, EPC 분화 조절에 대한 이해도 미미한 실정이다(Hristov et al., 2003).
한편, 현재까지 개발된 혈관신생 억제제로는 약 200 여종이 보고되어 있는데, 이러한 혈관신생 억제제로는 특정 혈관 형성촉진인자의 활성을 감소시키는 기전, 혈관내피세포의 성장억제 또는 고사를 유도하는 기전, 혈관형성 촉진인자나 내피세포 생존인자를 조절하는 간접인자들의 작용을 억제하는 기전 및 체내에 존재하는 혈관신생 억제제들의 활성을 증가시키는 기전에 역할을 하는 4가지로 크게 분류할 수 있고, 특히 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), PK5, 프로트롬빈 크링글 2(prothrombin kringle 2)과 같은 혈관형성 억제제들이 잘 알려져 있다(O'Relly, M.S. 등 Cell., 79, 315~328, 1994; Lee. T.H., Biol. Che., 273, 28805~28812, 1998).
또한, 종래에는 혈관신생 억제를 위해 VEGF(혈관내피 성장인자)의 신호전달을 억제하는 연구가 진행되고 있는데, 이 경우 기술개발의 초기 단계에서는 혈관신생이 억제되는 듯한 양상을 보였으나, 이후 혈관신생이 더욱 공격적으로 이루어지는 부작용이 발생하고 있으며, 상기 기술된 종래 개발된 혈관신생 억제제의 경우도 체내 유해한 각종 부작용이 발생하는 문제점이 있어 이러한 문제점을 해소하면서 동시에 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 혈관신생 억제제의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 혈관신생에 의해 유발되는 각종 질환을 예방 및 치료할 수 있는 새로운 치료제를 연구하던 중, 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 단백질의 활성을 억제할 경우, 혈관신생을 억제할 수 있다는 사실을 확인함으로써 페록시다신(peroxidasin)을 혈관신생 치료제 개발을 위한 새로운 타겟으로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 단백질의 활성 정도를 분석하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 페록시다신 단백질은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제는 페록시다신(peroxidasin)에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 앱타머 또는 항체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA는 페록시다신(peroxidasin)에 대해 특이적으로 발현을 저해할 수 있는 것으로서, 서열번호 4 내지 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제는 내피세포의 이동, 내피세포의 증식 또는 맥관형성 저해 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 혈관신생관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은,
시험물질을 처리한 후, 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 시험물질을 처리한 경우와 비교하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시험물질을 처리한 경우가 시험물질을 처리하지 않은 경우에 비해 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성이 억제되면 상기 시험물질을 혈관신생 억제제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 것은 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블럿, 웨스턴 블롯, cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 인 시투 혼성화 반응, 방사능면역분석, 면역침전법, 면역염색화학법, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 peroxidase 활성 측정법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관신생 억제제는 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 억제제는 내피세포의 세포 이동, 세포 증식 및 맥관 형성을 효과적으로 억제할 수 있어 혈관신생이 비정상적으로 조절되어 야기되는 다양한 질환 또는 질환들의 상태를 효과적으로 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 혈관신생 관련 질환의 발병기작 및 치료제 발굴을 위해 페록시다신(peroxidasin)을 새로운 타겟으로 사용할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 각종 세포들을 대상으로 페록시다신(peroxidasin)의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것으로서, A는 RT-PCR 결과를 나타낸 것이고, B는 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Human umbilical cord 조직 내에서 페록시다신(peroxidasin)의 발현 양상을 면역형광분석 방법(A 및 B)으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고, C~D는 면역염색화학법을 수행하여 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA의 처리에 따른 내피세포의 이동 저해 양상을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA의 처리에 따른 내피세포의 맥관형성 저해 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA의 처리에 따른 내피세포의 증식저해 정도 비교분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제의 타겟으로 페록시다신(peroxidasin)을 사용할 수 있음을 최로로 규명하였고, 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
페록시다신(peroxidasin) 유전자는 초파리의 Peroxidasin homolog 유전자로서 1994년 처음으로 보고되었으며(Nelson et al., 1994), myeloperoxidase family의 하나로서 peroxidase domain과 extracellular domain을 동시에 갖는 독특한 단백질이다. 특히 초파리 발달과정에서 hemocyte가 head mesoderm으로부터 초기에 분화하면 Peroxidasin을 발현하고, 이후 apoptotic cell을 phagocytosis하는 것으로 보고된 바 있으며, Hemocyte는 중요한 이동 세포로서 척추동물의 백혈구와 fibroblast와 같은 장관세포의 조인트 작용(joint function)을 수행한다.
또한, Hemocyte가 embryo에 퍼져나가면서 collagen type IV(혈관에 주로 분포하는 대표적 collagen), laminin, glutactin, tiggrin, proteoglycan papilin등과 extracellular matrix와 Peroxidasin을 합성하는 것으로 알려져 있다.
또한, 이들 초파리의 Peroxidasin은 1512 아미노산 잔기로 이루어져 있으며 트라이머의 구조를 이루는 것으로 알려져 있으며, 사람의 peroxidasin 분자는 1479 개의 아미노산으로 이루어져 있고 peroxidase domain 외에 6개의 leucine-rich region과 4개의 Ig loop 및 vWF type c 서열로 이루어져 있다. 특히 효소 도메인인 peroxidase 도메인은 human myeloperoxidase (MPO)와 eosinophil peroxidase와 상동성을 나타내며, in vitro에서 peroxidase 활성으로 H2O2-driven radio iodination, oxidation, dityrosine 형성을 매개하는 것으로 관찰되어, 세포외기질 consolidation, phagocytosis, defence에 기능하는 것으로 추정되고 있을 뿐, 아직 명확하게 밝혀진 내용은 없다.
한편 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin) 유전자가 ECM 도메인을 가지고 있고 basement 막에 결합되어 혈관 형성에 관여할 것으로 추정하였고, 혈관형성에서의 페록시다신(peroxidasin)의 역할을 규명하였다.
먼저, 본 발명의 일실시예에 따르면, 페록시다신(peroxidasin)의 발현 양상을 분석하기 위해 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 이용하여 각종 세포들을 대상으로 분석한 결과, 단핵구 세포에서는 발현이 거의 되지 않는 것으로 나타났고, early EPC에서는 약하게 발현되며, late EPC에서 강하게 발현되는 것으로 나타났으며, 성숙된 내피세포인 HUVEC과 HMVEC에서도 발현되는 것이 확인되었다(실시예 1 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 형광현미경과 면역염색화학법을 통해 조직 내에서의 페록시다신(peroxidasin) 발현 양상을 분석한 결과, 정맥과 동맥 유래 내피세포 모두에서 peroxidasin이 발현될 뿐만 아니라 matrix 부분의 작은 모세혈관에서도 이들이 발현하는 것을 알 수 있었다(실시예 2 참조).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포에서 발현이 강하게 일어나고 있다는 사실을 확인함으로써 내피세포에서의 페록시다신(peroxidasin) 역할을 규명하기 위해 페록시다신의 발현을 저해할 수 있는 siRNA를 제작하고 이를 세포에 처리하였을 경우 세포내에서 일어나는 현상을 관찰하였다.
먼저, 본 발명의 일실시예에서는 페록시다신 유전자의 발현저해에 따른 내피세포의 이동을 분석하였는데, 이를 위해 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA와 대조군으로서 scrambled siRNA 및 아무것도 처리하지 않은 군을 대상으로 분석한 결과, 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA을 처리한 모든 군은 대조군들에 비해 내피세포의 이동이 낮은 수준으로 유도된 것으로 나타났다(실시예 3 참조).
따라서 이러한 결과를 토대로 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포의 이동에 관여하며, 혈관신생 시 내피세포의 이동에서 필수적인 역할을 할 것으로 추정되었다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 저해할 경우, 맥관형성을 억제할 수 있는지를 조사하기 위해 HUVEC 세포에 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA을 처리한 군과 대조군으로서 scrambled siRNA 및 아무것도 처리하지 않은 군을 대상으로 분석한 결과, 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA을 처리한 군의 경우 대조군에 비해 맥관형성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(실시예 4 참조).
또한, 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 저해할 경우, 내피세포의 증식도 억제되는 것으로 조사되었는데, 즉, bFGF의 자극을 주어 내피세포의 증식을 유도한 다음, 페록시다신(peroxidasin)의 siRNA 처리군과 scrambled siRNA을 처리한 군의 내피세포 증식 정도를 비교하였는데, 그 결과, 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA을 처리한 군의 경우 대조군에 비해 43% 및 59.5%로 내피세포의 증식이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(실시예 5 참조).
한편, 앞서 배경기술에서도 기술한 바와 같이, 혈관신생은 성장인자, 사이토카인 및 기타 생리학적 분자뿐만 아니라 저산소증 및 낮은 pH와 같은 다양한 전혈관신생(proangiogenesis)에 반응하여 생기는 고도로 조절되는 과정을 말한다(Folkman and Shing, J. Biol. Chem., 267, 10931, 1992). 새로운 혈관이 발달하기 위한 혈관신생 메카니즘은 세포외 기질(ECM)의 분해 및 재구성, 이동, 증식, 분화 및 튜브(관) 형성을 조절하는 다양한 분자의 협동을 필요로 하며, 혈관신생 개시 이후에, VEGF, bFGF, PDGF 등을 비롯한 혈관신생 촉진 인자는 세포 표면 수용체의 자극을 통하여 내피세포를 활성화시키고, 활성화된 세포는 세포 증식과정, 세포 접착 분자의 발현 증가, 단백질 분해성 효소의 분비 증가, 세포 이동 및 침입의 증가를 거친다.
또한, 세포 부착을 위한 인테그린, 셀렉틴 및 면역글로불린 유전자 슈퍼 패밀리의 구성원뿐만 아니라 ECM을 분해하기 위한 매트릭스 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제와 같은 단백질 분해용 효소를 비롯한 다수의 분자가 증식 및 침입을 증진시키고(Brooks, Eur. J. Cancer, 32A, 2423, 1996), 나아가 ECM 성분 및 용해성 인자와 상호작용하는 세포 표면의 수용체로부터 유래한 신호 전달 메카니즘에 의해 관내강(Lumen) 형성 및 성숙 혈관으로의 분화가 유도됨으로써 혈관신생이 형성된다.
또한, 일반적으로 새로운 혈관을 구축하는데 있어서 가장 핵심적인 세포는 혈관의 내막을 구성하여 혈액과 직접 접하고 있는 혈관내피세포로서 다양한 생리활성 물질을 분비하여 혈관의 확장, 혈전의 저해, 혈관벽의 선택적인 대사산물들의 투과 및 이동을 조절하고, 세포표면에 다양한 세포막 단백질을 발현하여 혈액의 흐름 및 백혈구와 혈소판의 부착을 조절하는 중요한 역할을 한다.
그러나 최근에 혈관을 구축하는데 있어서 혈관내피세포 뿐만 아니라 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell, EPC)가 관여하는 것으로 알려진 바 있다. 혈관내피 전구세포는 혈관내피세포로 분화할 수 있는 전구세포로서 혈관을 순환하던 혈관내피 전구세포가 신생혈관으로 안착되어 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
그러므로 본 발명에서는 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현을 억제하였을 경우, 내피세포의 이동 및 증식이 효과적으로 억제되고 맥관형성도 현저히 감소됨을 확인함으로써 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 페록시다신(peroxidasin) 단백질은 상기 서열번호 1의 염기서열로부터 코딩되는 아미노산으로 구성된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제는 페록시다신(peroxidasin)에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 앱타머, 항체, 화합물 또는 천연추출물 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 페록시다신 mRNA에 상보적이고 페록시다신 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, 페록시다신 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-다이아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다.
본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(페록시다신 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(페록시다신 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 siRNA는 바람직하게 서열번호 4 내지 9의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 보다 바람직하게는 약 60 뉴클레오티드 이하이고, 가장 바람직하게는 약 45 뉴클레오티드 이하일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 또한, 예컨대 약 18, 20 또는 25 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다.
또한, 본 발명의 앱타머는 SELEX법 및 그 개량법은 Ellington에 의해 공지된 방법(Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510)에 의해 제작할 수 있는데, SELEX법이란, 10-14개 정도의 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 풀로부터, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선별해오는 방법이다. 사용되는 올리고뉴클레오티드는 40잔기 정도의 랜덤 서열을 프라이머 서열로 끼운 구조를 하고 있다. 이 올리고뉴클레오티드 풀을 표적 물질과 회합시켜, 필터 등을 이용하여 표적 물질에 결합한 올리고뉴클레오티드만 회수한다. 회수한 올리고뉴클레오티드는 RT-PCR로 증폭하고, 이것을 다음 라운드의 주형으로서 이용한다. 이 작업을 10회 정도 반복함으로써, 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 취득할 수 있다. SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머가 농축되고, 선별될 수 있다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있다. 또한, SELEX 법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.
또한, 앱타머는 종래 SELEX 기법 이외에, 복합 타겟, 즉 살아있는 세포 및 조직에 대해 Cell-SELEX 기법을 이용하여 얻을 수 있는데(Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008), Cell-SELEX 기법은 표면 마커 타겟이 알려져 있지 않을 때조차도, 질환 세포에 대한 앱타머를 개발할 수 있게 하는 장점이 있다. 게다가, 분리된 상태에서는 그 본래의 특성을 나타내지 않을 수도 있어, 생리적 상태에 있는 타겟 단백질은 선별과정에서 더 기능적인 접근을 가능하게 하기 때문에, Cell-SELEX 기법은 종래의 SELEX 과정에 비하여 장점을 가지고 있다.
또한 본 발명에서 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제로 사용할 수 있는 것으로는 항체, 펩타이드, 화합물 또는 천연추출물을 사용할 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 이용될 수 있는 페록시다신(peroxidasin) 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 페록시다신(peroxidasin) 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법, 예를 들어, 융합 방법(Kohler 및 Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. 및 Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , Current Protocols In immunology, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 페록시다신(peroxidasin) 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
페록시다신(peroxidasin)에 특이적으로 결합하여 페록시다신(peroxidasin)의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev.. 97(2):391410(1997)).
또한 페록시다신(peroxidasin)의 활성을 억제할 수 있는 화합물은 하기의 방법의 의해 얻을 수 있는데, 즉, 본 발명에서 제공하는 혈관신생 억제제 스크리닝 방법을 통해 수득할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 시험물질을 처리한 후, 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 시험물질을 처리한 경우와 비교하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 위해 상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행할 수 있는데, 이에 제한되지는 않으나, RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블럿, 웨스턴 블롯, cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 인 시투 혼성화 반응, 방사능면역분석, 면역침전법, 면역염색화학법 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질은 검출가능한 표지(detectable label)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출 가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.
검출가능한 표지가 표지된 페록시다신(peroxidasin) 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 페록시다신(peroxidasin) 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di
[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출할 수 있다.
본 발명의 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법에서 상기 “시험물질” 은 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시료는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
본 발명의 방법을 통해 시험물질이 처리된 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 또는 유전자의 발현정도를 측정하여 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 또는 유전자의 발현정도가 대조군, 즉 시험물질을 처리하지 않은 군에 비해 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 활성이 하향-조절(down-regulation)될 경우, 상기 시험물질은 혈관신생 억제제로 판정될 수 있으며, 그러한 물질은 혈관신생으로 인해 유발되는 질환의 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 혈관신생억제용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 약학적으로 유효한 양이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.
비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 처리 또는 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 혈관신생 억제제 또는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않는다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명의 혈관신생억제용 약학적 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관형성에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 혈관신생 억제용 약제를 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 혈관신생 형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 혈관형성에 의해 유발되는 질환 또는 혈관신생 형성이 비정상적인 질환은 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
세포배양
하기 본 발명의 실시예들에서 사용하는 세포들 및 상기 세포의 배양 조건은 다음과 같다. HUVEC(human umbilical endothelial cell)은 Jaffe에 의해 공지된 방법(Clin. Invest. 52, 2745, 1973 참조)에 따라 인간 탯줄(cord)로부터 분리하였으며, 20%의 소 태아 혈청, 30ug/ml의 내피세포 성장첨가제(BD Bioscience사, USA), 90ug/ml의 헤파린(시그마사) 및 1%의 항생제가 첨가된 M199 배지에서 37℃의 온도 및 5%의 이산화탄소가 공급되는 조건 하에 배양하였다. Late EPC는 전에 보고한 실험을 통해 확보한 세포를(Ha 등, FEBS Lett. 581, 2663, 2007) 사용하였고 MNC 및 early EPC도 전에 보고한 실험을 통해 확보한 세포를 사용하여(FASEB J. 25, 159, 2011 참조) 상기 배지에서 배양하였다. WJ-MSC는 Mitchell 등(Stem Cells, 21, 50, 2003)에 의해 공지된 방법으로 cord matrix 부분으로부터 분리하여 10%의 소태아 혈청이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에서 배양하였으며, Bovine capillary endothelial cell (BCE) cell은 원자력 의학원의 이태희 박사팀으로부터 확보하였고(Kim 등, Biochem, Biophy. Res. Commun., 304, 740), AT-MSC는 서울성모병원 성형외과 이종원 교수팀으로부터 확보하여 상기의 배지에서 배양하였다. BM-MSC는 Cambrex Bioscience (Rockland, ME)사로부터 구입하여 mesenchymal stem cell growth medium bullet-kit을 사용하여 배양하였다. 다른 세포주들은 American Tissue Culture Collection(Rockville, MD, USA)을 통해 확보하였고, HL60와 Hep3B는 10% 소태아 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였고, 나머지 세포주들은 10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
<실시예 1>
Peroxidasin의 발현 양상 분석
<1-1> RT-PCR에 의한 분석
상기 기술된 방법으로 배양된 각 세포들에서 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 발현 양상을 분석하기 위해, 상기 세포들로부터 총 RNA를 분리하고, RT-PCR을 수행하였다. 이를 위해 먼저 각 세포들을 대상으로 1ml의 Trizol(인비트로젠사, USA) 시약을 첨가하고 상온에서 3분간 방치하여 핵단백질 복합체들이 완전히 분리되도록 한 후, Trizol 시약 1ml당 0.2ml의 클로로포름을 첨가한 후, 이들 혼합액을 튜브로 옮기고 15초 동안 강하게 교반시킨 후, 3분 동안 방치시켰다. 이후, 4℃에서 15분 동안 12000rpm으로 원심분리한 다음, 상등액만을 새로운 튜브로 옮기고 상등액 부피의 1/2에 해당되는 부피의 이소프로필 알콜을 첨가한 후, 10분 동안 상온에서 방치하고, 이후 4℃에서 10분 동안 12000rpm으로 원심 분리하였다. 이후, 상등액을 제거하고 튜브 바닥에 남은 RNA 펠렛을 70%의 에탄올로 한번 세척한 후, RNA 펠렛을 건조시킨 다음, 50ul의 RNase가 없는 증류수에 녹였다.
이후 RT-PCR을 수행하기 위해, 상기 수득한 RNA을 대상으로 프로메가의 역전사 시스템을 사용하여 cDNA를 합성하였고, 수득한 cDNA의 증폭은 Super Taq PLUS 버전(Super Bio Co.LTD)을 사용하여 수행하였다. 이후, Peroxidasin(이하,‘PXDN'이라고 함) 유전자는 하기에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이때, 상기 PCR은 최초 열변성을 95℃에서 5분간 반응시킨 후, 95℃에서 1분간 변성, 55℃에서 5분간 어닐링시킨 다음, 72℃에서 1분간 연장반응 시켰고, 이러한 반응을 30회 반복수행하였으며, 마지막 사이클에서는 72℃에서 10분간 연장반응 시켰다. 이후 PCR 산물은 1.0%의 아가로스-겔 전기영동 후, EtBr 시약으로 가시화시켜 반응산물을 확인하였다.
프라이머 서열
Peroxidasin 정방향 프라이머(서열번호 2):
5‘- TCA ACC CAC TGC TTT ACC G-3’
Peroxidasin 역방향 프라이머(서열번호 3):
5‘-AGG TCG ATG TTG AGT GTC G-3’
그 결과, RT-PCR에 의한 페록시다신(peroxidasin) mRNA의 발현양은 도 1에 나타낸 바와 같이, 단핵구 세포에서는 거의 발현이 되지 않는 것으로 나타났고, early EPC는 약간의 발현을 나타내었고, Late EPC는 비교적 높은 수준으로 발현된 것으로 나타났다. 또한, HUVEC와 HMVEC에서도 비교적 발현 수준이 높은 것으로 나타났다. 한편, A549, K562, HL60, U87, Hep3B, HT29는 발현이 거의 되지 않는 것으로 확인되었다.
<1-2> 웨스턴 블럿에 의한 분석
<1-1>에서 수행한 각종 세포들을 대상으로 페록시다신(peroxidasin)의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 웨스턴 블럿의 수행을 위해 먼저 각종 배양한 세포들을 용해 버퍼(50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM PMSF, 1 μg/ml pepstatin, and protein inhibitor mixture (Roche))로 세포들을 용해시키고, 세포 용해액을 14000rpm에서 30분 동안 원심분리 한 후, 그 상등액을 8%아가로스 젤에 전기영동 하였다. 이후 분리된 단백질들을 니트로셀룰로스 멤브레인으로 100V의 전력으로 2시간 동안 이동시킨 후, 멤브레인을 5% 스킴 밀크로 블록킹 시켰다. 이후 PXDN에 대한 일차항체를 사용하여 반응시킨 다음, horseradish peroxidase 가 접합된 이차 항체를 사용하여 반응시켰다. 이후 면역 반응된 밴드들은 chemiluminscent substrate (ECL kit) (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 사용하여 가시화시켰다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블럿 결과는 상기 RT-PCR의 결과와 유사한 결과를 보였는데, 인간 유래 내피세포인 HUVEC과 late EPC에서 강하게 발현되는 것으로 나타났고, bovine 내피세포에서도 발현되는 것이 관찰되어 내피세포에서 발현이 잘 되는 것이 관찰되었다. 또한 신생아 제대 matrix 부분의 mesenchymal stromal cell 에서도 비교적 페록시다신(peroxidasin)의 발현이 높았고, 성인 골수 유래, 지방조직 유래 중간엽기질 세포는 발현이 비교적 적게 나타났다. mouse 유래 NIH3T3에서는 항체의 species specificity 로 인해서인지 발현이 매우 약하게 나타났다. 따라서 페록시다신(peroxidasin)은 내피세포에 주로 많이 발현하는 것으로 확인하였다.
<실시예 2>
Cord 조직에서 Peroxidasin의 발현 양상 분석
본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 조직 수준에서 관찰하기 위해, 정맥과 동맥이 뚜렸한 cord 조직을 대상으로 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 분석하였다. 이를 위해, Cord 조직을 형광현미경으로 분석하였고, 또한 면역염색화학법을 통해 분석하였다.
먼저, 형광현미경을 이용한 분석을 위해 Human umbilical cord를 4% paraformaldehyde로 고정시킨 후 Paraffin block을 만들고 4um의 크기로 section하여, 크실렌으로 탈파라핀화 시킨 다음, 알콜로 재수화시켰다. 이후 항체를 retrieval 방법(0.1 mM, pH 8.0 EDTA buffer heated in microwave oven for 3 cycles x 1 min)에 따라 unmask한 후, 5% normal goat serum 버퍼로 한 시간 동안 각 슬라이스에 반응시킨 후, 각 슬라이스를 Peroxidasin 단백질에 대한 일차 항체로 밤새동안 반응시켰다. 이후, PBS 용액으로 3번 세척하고, Alexa 488 또는 Cy 3이 접합된 이차 항체로 1시간 반응시켰다. 이때 상기 일차 항체와 사용한 농도(PBS 용액으로 희석한 비율)는 Peroxidasin (1:500), CD31(clone JC70A, 1:25, DAKO, Glostrup, Denmark), and vWF(clone F8/86, 1:25, DAKO, Glostrup, Denmark)이고, 대조군으로 상기 일차항체 대신 PBS 용액을 사용하였으며, 항체반응 후, 최종적으로 각 섹션(슬라이스)들은 1 μg/ml DAPI(Sigma, St. Louis, Mo)을 이용하여 핵을 형광표지 시켰다.
또한, 면역염색화학법은 상기 형광현미경 분석을 위해 준비한 크실렌 처리 및 알콜로 재수화 처리를 마친 Human umbilical cord 조직의 슬라이스들을 3%의 과산화수소로 내재적인 peroxidase를 quenching시키고, 이후 1시간 동안 5% normal goat serum 버퍼로 블록킹 시킨 다음, 각 슬라이스들을 일차 항체로 밤새 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 10분 씩 3회 세척한 후, 2차 항체를 사용하여 반응시켰다. 이때 일차 항체는 peroxidasin 항체(1:500)를 사용하였고, chromagen 3, 3’-diaminobenzidine (DAB) (Sigma, St. Louis, Mo)을 사용하여 가시화시켰다.
형광현미경과 면역염색화학법에 의한 분석 결과, 페록시다신(peroxidasin) (red) 발현 부위는 CD31 (green)과 vWF (green) 발현 부위와 일치하는 것을 관찰할 수 있어서 정맥과 동맥 유래 내피세포 모두에서 페록시다신(peroxidasin)이 발현되는 것을 알 수 있었고, 또한 matrix 부분의 작은 모세혈관에서도 이들이 발현하는 것을 볼 수 있었다(도 3 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)은 내피세포 뿐만 아니라 cord matrix (Wharton’s jelly) 부위에 있는 stromal cell에서도 발현되고 있다는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 3>
Peroxidasin knockdown에 의한 세포 이동 저해 분석
본 발명자들은 상기와 같은 실험 결과들을 통해 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포에서 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포의 이동에 관여하고 있는지를 확인하기 위해, 내피세포에서 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 억제할 경우 내피세포의 이동에 영향을 주는지를 분석하였다. 이를 위해 먼저 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 저해할 수 있는 siRNA를 제작하였는데 페록시다신(peroxidasin)의 각기 다른 위치에 작용할 수 있는 siRNA를 제작하였고, 대조군으로는 ST Pham(서울, 한국)으로부터 공급받은 scrambled siRNA를 사용하였다. 이후 제작한 siRNA는 5 × 105cells/100mm dish 의 양으로 분주된 HUVEC 세포에 처리하였는데, 이때 상기 세포는 20% fetal bovine serum, 30 μg/ml of endothelial cell growth supplements 및 90 μg/ml의 heparin이 첨가된 M199배지에서 배양한 세포를 사용하였다. HUVEC 세포에 대한 siRNA의 처리는 10 nM (100 pmol)의 scrambled siRNA 및 10 nM (100 pmol)의 peroxidasin siRNA을 리포펙타민 RNAiMAX Transfection Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA)을 사용하여 처리하였고, 처리 후 세포들은 48시간 동안 배양하였다.
siRNA가 처리된 세포들을 대상으로 내피세포의 이동정도를 분석하였는데, 내피세포의 이동분석은 Kim et al.,(Mol Cancer Ther, 2133-2141, 2008)에 의한 방법으로 수행하였는데, 즉, siRNA로 처리하여 48시간 배양한 세포들에 대해 VEGF (2 ng/ml)를 5시간 동안 각각 처리하고 이동된 세포들을 고정시킨 후, 헤마토크실렌 및 에오신을 이용하여 고정시키고 염색시킨 다음 사진 촬영하여 분석하였다. 또한, 각각의 siRNA 처리에 의한 Peroxidasin의 발현 저해 정도는 상기 실시예에서 수행한 웨스턴 블럿과 동일한 방법을 수행하여 확인하였다.
표 1 siRNA 서열
Name 정방향 서열번호 역방향 서열번호
siRNA-1 GCA UGA CUU CGC UGC UCA UTT 4 AUG AGC AGC GAA GUC AUG CTT 5
siRNA-2 GCA UCA AUG CUG GCA UCU UTT 6 AAG AUG CCA GCA UUG AUG CTT 7
siRNA-3 GCG AAU CUC ACG CCA ACA ATT 8 UUG UUG GCG UGA GAU UCG CTT 9
ScrambledsiRNA GUU CAG GUC CGG CGA GTT 10 CUC GCC GGA CAC GCU GAA CTT 11
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 페록시다신(peroxidasin) mRNA의 각기 다른 위치에 작용하는 siRNA 3 종을 제작하여 HUVEC에 처리한 후 48 시간 배양하였을 때 HUVEC에서의 페록시다신(peroxidasin) 발현이 감소하는 것으로 나타났으며, 또한 transfection 후 48 시간된 세포들을 수확하여 modified Boyden chamber에서 VEGF 2 ng/ml 존재 하에 세포 이동을 유도하였을 때, scrambled siRNA를 transfection 시킨 세포들은 아무것도 처리하지 않은 세포들과 유사한 수준으로 세포 이동이 유도되었으나, siRNA1, siRNA2, siRNA3를 각각 transfection시킨 세포들의 이동은 낮은 수준으로 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 peroxidasin 발현이 현저히 감소한 siRNA2를 처리한 세포들의 경우, 세포이동이 현저하게 감소된 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 peroxidasin이 내피세포의 이동에 중요한 역할을 하고 있다는 사실을 알 수 있었고 나아가 peroxidasin의 발현 또는 활성을 억제할 경우, 내피세포의 이동을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
Peroxidasin knockdown에 의한 맥관 형성 저해 분석
상기 실시예 3의 실험을 통해 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 저해할 경우 내피세포의 이동을 억제할 수 있음을 확인함에 따라 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)의 발현저해시 맥관형성도 억제할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 먼저 세포 배양 플레이트에 차가운 Matrigel(150 ㎕, BD Bioscience)을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 굳힌 후, 상기 실시예 3에서 siRNA1, siRNA2, siRNA3를 각각 transfection시킨 세포를 수확하여 상기 굳힌 세포배양 플레이트에 처리한 다음, 20시간 동안 더 배양하였다. 이후, 맥관형성을 사진 촬영하여 관찰하였고, Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)프로그램을 사용하여 튜브의 크기(길이)를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 페록시다신(peroxidasin)에 대한 siRNA를 처리한 세포들에서는 내피세포의 맥관형성이 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 결과로부터 페록시다신(peroxidasin)이 맥관형성에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었고, 이를 제어함에 따라 혈관신생을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
Peroxidasin knockdown에 의한 내피세포의 증식 저해 분석
상기 실험들을 통해 검증된 siRNA을 이용하여 siRNA 처리군과 scrambled siRNA 처리군, lipofectamine 처리군을 대상으로 세포증식 정도를 비교하여 peroxidasin과 내피세포 증식과의 상관관계를 조사하였다. 이를 위해 4x103cells(HUVECs)을 96웰 플레이트에 각각 분주한 후, 24시간 동안 배양한 다음, 상기 세포들에 siRNA1, siRNA3, scrambled siRNA 및 lipofectamine 단독을 각각 4시간 동안 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 20 ul의 MTS시약을 처리하고 2시간이 지난 후, 각각의 플레이트에서의 세포들을 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 490 nm에서 세포의 증식정도를 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, siRNA1 및 siRNA3를 각각 처리한 세포군의 증식은 scrambled siRNA를 처리한 세포군에 비해 각각 43%, 59.5% 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포 증식에 있어서도 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었고, 특히 페록시다신(peroxidasin)의 발현 또는 활성을 저해할 경우, 내피세포의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.
종합적으로 상기와 같은 실험들을 통해 본 발명자들은 페록시다신(peroxidasin)이 내피세포의 이동, 증식 및 맥관형성에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인함에 따라 페록시다신(peroxidasin)의 발현을 저해하는 물질 또는 페록시다신(peroxidasin)의 활성을 저해하는 물질의 경우 신생혈관에 의한 질환들을 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 신생혈관 관련 질환의 치료제 개발 및 작용 기전의 연구를 위해 페록시다신(peroxidasin)이 새로운 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 페록시다신(peroxidasin) 단백질은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제는 페록시다신(peroxidasin) 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 앱타머 또는 항체인 것을 특징으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 siRNA는 페록시다신(peroxidasin) 에 대해 특이적으로 발현을 저해할 수 있는 것으로서, 서열번호 4 내지 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 억제제 또는 페록시다신(peroxidasin) 단백질의 활성 억제제는 내피세포의 이동, 내피세포의 증식 또는 맥관형성 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 혈관신생관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물인 것을 특징으로 하는 혈관신생억제용 약학적 조성물.
  7. 시험물질을 처리한 후, 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 단계; 및
    시험물질을 처리하지 않은 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 시험물질을 처리한 경우와 비교하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 시험물질을 처리한 경우가 시험물질을 처리하지 않은 경우에 비해 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성이 억제되면 상기 시험물질을 혈관신생 억제제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 페록시다신(peroxidasin) 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 분석하는 것은 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블럿, 웨스턴 블롯, cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 인 시투 혼성화 반응, 방사능면역분석, 면역침전법, 면역염색화학법, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 peroxidase 활성 측정법으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 혈관신생 억제제는 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 억제제인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제를 스크리닝 하는 방법.
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