WO2008087992A1 - 焦点検出装置、顕微鏡 - Google Patents

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light source
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Ichiro Sase
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    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a focus detection device and a microscope. Background art
  • the wavelength of fluorescent dyes used for fluorescence observation has been increasing, and observation methods such as optical tweezers and two-photon excitation have also been used. Therefore, the wavelength of light used as observation light in biological microscopes is not limited to the visible light region, and it is possible to use light in a wavelength band greater than near infrared light only for focus detection and maintenance. There is a problem that it is impossible. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a focus detection apparatus that can be used, and a microscope including the same.
  • the first aspect of the present invention emits light of a specific wavelength band. Reflects defocus detection light in a specific wavelength band for detecting defocus between the light source, the objective lens of the microscope, and the observation object, and non-defocus shift in at least two different wavelength bands excluding the specific wavelength band.
  • a focus detection device including an optical member that transmits detection light.
  • the wavelength band for reflecting light from the light source in the optical member is a band sandwiched between two wavelength bands from the observation object to be transmitted.
  • the optical member reflects an outer edge light beam out of the light in the specific wavelength band, guides it to the observation object, and transmits the remaining light beam. It is desirable that
  • the light source is a light source that selectively emits a plurality of lights having different wavelength bands
  • the reflecting member is a plurality of lights having different wavelength bands emitted by the light sources. It is desirable that the dichroic mirror unit has a plurality of dichroic mirrors each corresponding to the optical path so that it can be removed from the optical path.
  • the light source is a light source that selectively emits a plurality of lights having different wavelength bands.
  • a light receiving means for receiving the reflected light of the light from the light source reflected by the observation object.
  • control unit detects a defocus between the objective lens of the microscope and the observation object based on a signal from the light receiving unit.
  • the light from the second light source is directed toward the observation object. It is desirable to have a second optical member that reflects in the direction and transmits light from the observation object.
  • the first light source emits light in an infrared wavelength band
  • the second light source emits light in a longer wavelength band than the infrared wavelength band. It is desirable that
  • a microscope characterized by including the focus detection device according to the first aspect of the present invention.
  • the optical system includes an objective lens and a camera mounting portion, and the optical member and the second optical member are optical paths between the objective lens and the camera mounting portion.
  • the ancient member is provided closer to the objective lens, and the second optical member is provided from a mounting portion of the camera.
  • the second light source is a light source for optical tweezers.
  • the second light source is a light source for two-photon excitation.
  • the first light source emits light in an infrared wavelength band
  • the second light source emits light in a longer wavelength band than the infrared wavelength band. It is desirable that
  • a focus detection device that limits the wavelength band of light used for focus detection, and that can use light in a wider wavelength band other than that for observation other than a microscope or focus detection, and the same Microscope can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including a focus detection apparatus according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows a dichroic mirror of the focus detection device 3 according to the first embodiment of the present invention. It is a figure which shows the reflection characteristic of 1 15.
  • FIG. 3 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including the focus detection apparatus according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A and 4B show the configuration of the focus detection device 30 according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A shows the configuration of the IR light source 31.
  • FIG. 4B shows the dichroic mirror unit.
  • 3 is a diagram illustrating a configuration of 2.
  • FIG. 5 is a diagram showing the reflection characteristics of the dichroic mirror 3 2 b in the dichroic mirror unit 32.
  • FIG. 6 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including a focus detection apparatus according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 7A and 7B show the configuration of the partial mirror 41 of the focus detection device 40 according to the third embodiment of the present invention, FIG. 7A is a top view, and FIG. 7B is a front view.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including a focus detection apparatus according to the first embodiment of the present invention.
  • the microscope 1 includes a microscope body 2, a focus detection device 3, and an optical tweezer optical system 4.
  • non-focus shift detection light light excluding light used for focus detection is referred to as non-focus shift detection light.
  • the non-focus shift detection light includes optical tweezer light, multiphoton excitation light, and fluorescence from an observation object in fluorescence observation, for example. Also optical tweezers light or multiphoton A light source that emits excitation light is referred to as a second light source.
  • the microscope body 2 includes a stage 7 on which a sample 6 sandwiched between a cover glass 5a and a slide glass 5b is placed, an objective lens 8, an imaging lens 9, and a camera 1 in that order from the stage 7 side. 0.
  • the illumination light for illuminating the sample 6, that is, a wavelength shorter than near-infrared light having a wavelength ⁇ ⁇ ⁇ 1 described later, wavelength A FL or A
  • An illumination light source (not shown) that emits illumination light including light of FL 2 and A FL 3 is provided.
  • the objective lens 8 can be moved up and down electrically by an objective lens driving unit (not shown).
  • the optical tweezer optical system 4 includes a laser light source 11, a lens 1 2, mirrors 1 3 a, 1 3 b, and half-mirror 1 14 in order from the laser light source 11 1 side.
  • the half mirror 14 is disposed in the optical path between the objective lens 8 and the imaging lens 9 in the microscope main body 2, and as a result, the laser light from the laser light source 11 is transmitted to the microscope main body 2.
  • the sample 6 can be guided to the inner optical path and irradiated.
  • the light from the sample 6 illuminated by the illumination light source (not shown) in the microscope main body 2 passes through the objective lens 8 and sequentially passes through the dichroic mirror 15 and the neutral mirror 14 described later.
  • the imaging lens 9 forms an image on the imaging surface of the camera 10.
  • the camera 10 can take an image of the sample 6 and the observer can observe the taken image of the sample 6 through a monitor (not shown) (hereinafter referred to as “normal observation”). )
  • the laser light emitted from the laser light source 1 1 passes through the lens 1 2 and is reflected by the mirrors 1 3 a and 1 3 b to the half mirror 14 in the microscope body 2. Led. The laser light is reflected by the half mirror 14, passes through a dichroic mirror 15 to be described later, and is irradiated onto the sample 6 through the objective lens 8. This allows the observer to use optical tweezers on sample 6. (Hereinafter referred to as “observation by optical tweezers”).
  • observation by optical tweezers the configuration of the focus detection device 3 that is the most characteristic in the present embodiment will be described in detail.
  • the focus detection device 3 includes an IR light source 16 that emits light of a predetermined wavelength band, a lens 17, a half mask 18, a half mirror 1 19, and a dichroic in order from the IR light source 16 side. And a mirror 15 and an imaging lens 20 and a light receiving element 21 on the reflection light path of the half mirror 19.
  • the dichroic mirror 15 is disposed in the optical path between the objective lens 8 and the half mirror 14 in the microscope main body 2, thereby allowing the light from the IR light source 16 to pass through the microscope main body 2. It can be guided to the optical path.
  • the dichroic mirror 15 in this embodiment reflects only light in a predetermined wavelength band, that is, near-infrared light having a wavelength ⁇ IR 1 emitted from the IR light source 16 as shown in FIG. have.
  • FIG. 2 is a diagram showing the reflection characteristics of the dichroic mirror 15 of the focus detection device 3 in the first embodiment of the present invention.
  • the light in the predetermined wavelength band emitted from the IR light source 16 passes through the lens 17, the half mask 18, and the half mirror 19 in order, and then is dichroic. Reflected by the mirror 15 to the sample 6 side. This light is reflected by the glass interface 6 a in the vicinity of the sample 6 after passing through the objective lens 8. The reflected light of the IR light source 16 from the glass interface 6a is reflected again by the dichroic mirror 15 in the direction of the IR light source 16 and further reflected by the half mirror 19 and then coupled. An image is formed on the light receiving surface of the light receiving element 21 via the image lens 20.
  • the control unit 22 provided in the focus detection device 3 detects the position in the optical axis direction of the lens interface 6a based on the signal obtained by the light receiving element 21, that is, the objective lens 8 and Detection of defocus with the lens interface 6a, By driving the objective lens 8 via the objective lens driving section shown, the lens interface 6 a is arranged at the focal position of the objective lens 8. Thereby, focusing of the sample 6 is achieved in the microscope body 2. Since the above focusing operation is always performed during observation of the sample 6, the focused state of the sample 6 is always maintained during observation. Therefore, this microscope 1 is very useful for observations involving administration, observations over a long period of time, and continuous observation of a plurality of portions of a sample.
  • the microscope 1 restricts the light used in the focus detection device 3 (hereinafter referred to as “focus detection light”) to a predetermined wavelength band as described above, thereby allowing light having a wavelength longer than that of the focus detection light. Can be used for observation. Therefore, the microscope 1 can perform observation by an optical tweezer method using light having a wavelength longer than that of the focus detection light in addition to normal observation using light having a wavelength shorter than that of the focus detection light.
  • the focusing operation in the present embodiment is achieved by arranging the lens interface 6a at the focal position of the objective lens 8 as described above.
  • the configuration of the present embodiment is not limited to this, and the focus detection apparatus 3 further includes an offset lens that can move in the optical axis direction in the optical path between the half mirror 19 and the dichroic mirror 15. It is desirable to have a configuration. By moving this offset lens, when the lens interface 6a is disposed at the focal position of the objective lens 8, the lens interface 6a is displaced from the focal position in the optical axis direction by an arbitrary offset amount. It becomes possible. This makes it possible to focus not only on the lens interface 6 a, that is, on a desired location in the depth direction of the sample 6 but also on the surface of the sample 6. In addition, such It is desirable that the facet lens is also provided in the focus detection devices of the following embodiments.
  • the focusing operation is performed by moving the objective lens 8 up and down by the objective lens driving unit (not shown) as described above, but the configuration of the present embodiment is not limited to this, and the stage driving is performed. It is also possible to provide a configuration in which a focusing operation is performed by moving the stage 7 up and down. This also applies to the microscopes of the following embodiments.
  • FIG. 3 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including the focus detection apparatus according to the second embodiment of the present invention.
  • the focus detection device 30 of the present embodiment includes an IR light source 31 that can selectively emit light of a plurality of wavelengths shown in FIG. 4A in place of the IR light source 16 in the focus detection device of the first embodiment.
  • a dichroic mirror unit 32 shown in FIG. 4B is provided in place of the dichroic mirror 15.
  • FIG. 4A is a diagram showing a configuration of the IR light source 31 of the focus detection device 30 according to the second embodiment of the present invention.
  • the dichroic mirror one unit 32 includes a dichroic mirror 32 a having a reflection characteristic only near-infrared light of wavelength lambda IR1, only infrared light having a wavelength lambda j R 2 as shown in FIG. 5 A dichroic mirror with reflection characteristics 32 b and wavelength ⁇ 1 And a dichroic mirror 32 c that has the property of reversing only the infrared light of R3 .
  • FIG. 4B is a diagram showing the configuration of the dichroic mirror unit 32 in the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the reflection characteristics of the dichroic mirror 32 b in the dichroic mirror unit 32.
  • the dichroic mirror unit 32 is provided with a slide mechanism (not shown).
  • the dichroic mirror unit 32 a, 32 b and 32 c By sliding the dichroic mirror unit 32 into the optical path through the slide mechanism, the dichroic mirror unit 32 a, 32 b and 32 c can be selectively placed in the optical path. As a result, a dichroic mirror corresponding to the wavelength of the LED selected in the IR light source 31 can be arranged in the optical path.
  • the focus detection apparatus 30 after passing through near-infrared light of wavelength lambda IR1 emitted from LED 31 a in the IR light source 31, lens 17, the half mask 18, the half mirror one 19 in order, dichroic Reflected to the sample 6 side by the Dick mouth of the Ikkumi unit 32.
  • This light is reflected by the glass interface 6 a in the vicinity of the sample 6 after passing through the objective lens 8.
  • the near-infrared reflected light of wavelength ⁇ IR1 from the glass interface 6a is reflected again by the dichroic mirror 32a of the dichroic mirror unit 32 and further reflected by the half mirror 19. Thereafter, an image is formed on the light receiving surface of the light receiving element 21 through the imaging lens 20.
  • the focusing operation performed by the control unit 22 provided in the focus detection device 30 and its maintenance are the same as in the first embodiment.
  • the present microscope can achieve the same effects as those of the first embodiment.
  • this microscope can be used together with normal observation by switching the LEDs 31a, 31b, 31c and the corresponding dichroic mirrors 32a, 32b, 32c in the focus detection device 30 as described above.
  • the wavelength band of focus detection light can be changed according to the observation method. Therefore, specifically, for example, if a dichroic mirror 32b is placed in the optical path to cause the LED 31b to emit light, that is, if infrared light having a wavelength ⁇ IR2 is used as focus detection light, as shown in FIG.
  • wavelengths A FL1 , A FL2 , A FL3 In addition to normal observation (wavelengths A FL1 , A FL2 , A FL3 ), it is possible to perform fluorescence observation using a long-wavelength fluorescent dye (wavelength A FL4 ) and observation using the optical tweezer method (wavelength ⁇ ⁇ 3 ) It becomes. Even when the wavelength band of the focus detection light is changed in this way, the focused state of the sample 6 can be maintained if the signal detection condition of the light receiving element is electrically switched. (Third embodiment)
  • FIG. 6 is a diagram showing an overall configuration of a microscope including a focus detection apparatus according to the third embodiment of the present invention.
  • the focus detection device 40 of the present embodiment includes a partial mirror 41 shown in FIG. 7, instead of the dichroic mirror 15 in the focus detection device 3 of the first embodiment.
  • FIGS. 7A and 7B show the configuration of the partial mirror 41 of the focus detection device 40 according to the third embodiment of the present invention, FIG. 7B shows a top view, and FIG. 7B shows a front view.
  • the partial mirror 41 includes a partial mirror portion 42 described later and two triangular prisms 43a and 43b that sandwich the partial mirror portion 42.
  • the partial mirror unit 42 includes an elliptical transmission surface 4 2 a whose major axis extends in the optical axis direction of the objective lens 8 in the microscope body 2 when viewed from the IR light source 16 side, and
  • the reflecting surface 42b includes reflecting surfaces 42b provided at both ends on the long axis side of the transmitting surface 42a.
  • the transmission surface 4 2 a of the partial mirror section 42 blocks the light from the sample 6 illuminated by the illumination light source (not shown) in the microscope main body 2 and the laser light from the optical tweezer optical system 4. Because it is not sized, the partial mirror does not interfere with normal observation and observation with the optical tweezer method. Furthermore, even when blocking, the amount of light blocking is small and acceptable.
  • the focus detection apparatus 40 light in a predetermined wavelength band (near-infrared light having a wavelength ⁇ IR 1 ) emitted from the IR light source 16 is converted into a lens 17, a half mask 18, After passing through the half mirrors 1 and 9 in order, they are reflected to the sample 6 side by the reflecting surfaces 4 2 a and 4 2 b of the partial mirror 4 1. This light is reflected by the glass interface 6 a in the vicinity of the sample 6 after passing through the objective lens 8. The reflected light from the glass interface 6 a is reflected again by the reflecting surfaces 4 2 a and 4 2 b of the partial mirror 41 and further reflected by the half mirror 19 and then passes through the imaging lens 20. Thus, an image is formed on the light receiving surface of the light receiving element 2 1.
  • a predetermined wavelength band near-infrared light having a wavelength IR 1
  • the focusing operation performed by the control unit 22 provided in the focus detection apparatus 40 and its maintenance are the same as those in the first embodiment.
  • the present microscope can achieve the same effects as those of the first embodiment.
  • the focus detection device 40 of the present embodiment may be configured to include the IR light source 31 in the second embodiment in place of the IR light source 16. Thereby, the same effects as those of the second embodiment can be obtained.
  • the partial mirror 4 1 can be used regardless of the wavelength band of the focus detection light, it does not require the work of sliding the dichroic mirror unit 3 2 into the optical path as in the second embodiment. Smoother focus detection light switching can be realized.
  • the wavelength band of light used for focus detection is limited. It is possible to realize a focus detection apparatus that can be used for observation of light in the outside wavelength band with a microscope, for example, normal observation and application technology used in combination with this, and a microscope equipped with the same.

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Abstract

　焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、それ以外のより広い波長帯域の光を顕微鏡による観察に使用可能とした焦点検出装置、及びこれを備えた顕微鏡を提供する。特定の波長帯域の光を発する光源１６と、光源１６からの光のみを反射して顕微鏡２の観察対象物６ａへ導き、観察対象物６ａから反射した光源１６からの光は反射し、光源１６からの光の反射光を除く、少なくとも２つの異なる波長帯域の観察対象物６ａからの光を透過する反射部材１５と、観察対象物６ａからの光源１６の光の反射光を受光する受光手段２１と、受光手段２１からの信号に基づいて顕微鏡２の対物レンズ８と観察対象物６ａとの焦点ずれを検出する制御手段２２と、を有し、前記特定の波長帯域以外の光を顕微鏡２の観察光として使用可能としたことを特徴とする。

Description

明 細 書 焦点検出装置、 顕微鏡 · 技術分野
本発明は、 焦点検出装置、 顕微鏡に関する。 背景技術
従来、 生物顕微鏡用の焦点検出装置が多数提案されており、 例えば近赤外光の 反射を利用して試料近傍のガラス界面を検出して焦点合わせを行いこれを維持 する技術 （例えば、 特開 2004- 70276号公報を参照。 ） は、 投薬を伴う観察や長時 間にわたる観察を行う際、 さらには試料の複数箇所を連続的に観察する際に非常 に有効である。
しかしながら近年の生物顕微鏡では、 蛍光観察に際して用いられる蛍光色素の 長波長化が進んでおり、 さらには光ピンセットや 2光子励起法等の観察方法も使 用されるようになってきている。 したがって、 生物顕微鏡において観察光として 使用される光の波長は可視光領域に留まらなくなってきており、 焦点検出及びそ の維持のためだけに近赤外光以上の波長帯域の光を使用することができなくな つているという問題がある。 発明の開示
そこで本発.明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、 焦点検出に利用する 光の波長帯域を限定し、 それ以外のより広い波長帯域の光を顕微鏡による観察や 焦点検出以外に使用可能とした焦点検出装置、 及びこれを備えた顕微鏡を提供す ることを目的とする。
上記課題を解決するために本発明の第 1態様は、 特定の波長帯域の光を発する 光源と、 顕微鏡の対物レンズと観察対象物との焦点ずれを検出するための特定波 長帯域の焦点ずれ検出光を反射すると共に、 前記特定波長帯域を除く少なくとも 2つの異なる波長帯域の非焦点ずれ検出光を透過する光学部材を備えることを 特徴とする焦点検出装置を提供する。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記光学部材における前記光源からの光を 反射する波長帯域は、 前記透過する観察対象物からの 2つの波長帯域に挟まれる 帯域であることが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記光学部材は、 前記特定の波長帯域の光 のうち、 外縁光束を反射して前記観察対象物へ導き、 かつ残りの光束を透過する パーシャルミラ一であることが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記光源は、 波長帯域の異なる複数の光を 選択的に発する光源であり、 前記反射部材は、 前記光源の発する波長帯域の異な る複数の光にそれぞれ対応した複数のダイクロイツクミラーを光路内へ揷脱可 能に備えたダイクロイックミラ一ュニットであることが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記光源は、 波長帯域の異なる複数の光を 選択的に発する光源であることが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 観察対象物に照射する焦点ずれ検出用の特 定波長帯域の光を発する光源を有することが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 観察対象物で反射した前記光源からの光の 反射光を受光する受光手段を有することが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記受光手段からの信号に基づいて前記顕 微鏡の対物レンズと前記観察対象物との焦点ずれを検出する制御手段を有する ことが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記非焦点ずれ検出光を照射する第 2の光 源を有することが望ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記第 2の光源からの光を観察対象物の方 向に反射させ、 観察対象からの光を透過させる第 2の光学部材を有することが望 ましい。
また、 本発明の第 1態様によれば、 前記第 1の光源は赤外波長帯域の光を発す るものであり、 前記第 2の光源は前記赤外波長帯域よりも長波長帯域の光を発す るものであることが望ましい。
本発明の第 2態様は、 本発明の第 1態様に係る焦点検出装置を備えることを特 徵とする顕微鏡を提供する。
また、 本発明の第 2態様によれば、 対物レンズと、 カメラの取付部とを有し、 前記光学部材と前記第 2の光学部材とは前記対物レンズと前記カメラの取付部 の間の光路に設けられ、 前記古学部材は、 前記対物レンズ寄りに設けられ、 前記 第 2の光学部材は前記カメラの取付部よりに設けられることが望ましい。
また、 本発明の第 2態様によれば、 前記第 2の光源は、 光ピンセット用の光源 であることが望ましい。
また、 本発明の第 2態様によれば、 前記第 2の光源は、 2光子励起用の光源で あることが望ましい。
また、 本発明の第 2態様によれば、 前記第 1の光源は赤外波長帯域の光を発す るものであり、 前記第 2の光源は、 前記赤外波長帯域よりも長波長帯域の光を発 するものであることが望ましい。
本発明によれば、 焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、 それ以外のより 広い波長帯域の光を顕微鏡による観察や焦点検出以外に使用可能とした焦点検 出装置、 及びこれを備えた顕微鏡を提供することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の第 1実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
図 2は、 本発明の第 1実施形態における焦点検出装置 3のダイクロイツクミラ 一 1 5の反射特性を示す図である。
図 3は、 本発明の第 2実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
図 4 A、 4 Bは、 本発明の第 2実施形態における焦点検出装置 3 0の構成を示 し、 図 4 Aは I R光源 3 1の構成を示し、 図 4 Bはダイクロイツクミラーュニッ ト 3 2の構成を示す図である。
図 5は、 ダイクロイツクミラ一ュニット 3 2におけるダイクロイツクミラー 3 2 bの反射特性を示す図である。
図 6は、 本発明の第 3実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
図 7 A、 7 Bは、 本発明の第 3実施形態における焦点検出装置 4 0のパ一シャ ルミラー 4 1の構成を示し、 図 7 Aは上面図、 図 7 Bは正面図である。 発明の実施の形態
以下、 本発明の各実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡を添付図面に基 づいて説明する。
(第 1実施形態）
はじめに、 本実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体的な構成を説 明する。
図 1は、 本発明の第 1実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
図 1に示すように本顕微鏡 1は、 顕微鏡本体 2と、 焦点検出装置 3と、 光ピン セット光学系 4とからなる。
本実施形態では、 焦点検出に用いる光を除く光を非焦点ずれ検出光と称する。 この非焦点ずれ検出光には、 光ピンセット光や多光子励起光、 更には例えば蛍光 観察における観察対象物からの蛍光が含まれる。 また、 光ピンセット光や多光子 励起光を発する光源を第 2の光源と称する。
顕微鏡本体 2は、 カバ一ガラス 5 aとスライドガラス 5 bで挟持された試料 6 を載置したステージ 7と、 該ステージ 7側から順に、 対物レンズ 8と、 結像レン ズ 9と、 カメラ 1 0とを備えている。 また、 対物レンズ 8側から見てステージ 7 の裏側には、 試料 6を照明するための照明光、 すなわち後述する波長 λ Ι Κ 1の近 赤外光よりも波長が短い、 波長 A F Lい A F L 2, A F L 3の光を含む照明光を発する 不図示の照明光源が備えられている。 なお、 対物レンズ 8は、 不図示の対物レン ズ駆動部によつて電動で上下動可能である。
また、 光ピンセット光学系 4は、 レーザ光源 1 1と、 該レーザ光源 1 1側から 順に、 レンズ 1 2と、 ミラ一 1 3 a、 1 3 bと、 ハ一フミラ一 1 4とを備えてい る。 なお、 ハーフミラー 1 4は、 顕微鏡本体 2における対物レンズ 8と結像レン ズ 9との間の光路中に配置されており、 これによりレーザ光源 1 1からのレ一ザ 光を、 顕微鏡本体 2内の光路へ導き試料 6へ照射することができる。 また、 本実 施形態においてレーザ光源 1 1は、 波長 λ I R 3 = 1 0 6 4 11 mの赤外レーザ光を 発するものである。
以上の構成の下、 顕微鏡本体 2において、 不図示の照明光源によって照明され た試料 6からの光は、 対物レンズ 8を経て、 後述するダイクロイツクミラー 1 5 及びノヽーフミラ一 1 4を順に透過し、 結像レンズ 9によってカメラ 1 0の撮像面 上に結像される。これにより、カメラ 1 0では試料 6の像を撮影することができ、 観察者は撮影された試料 6の像を不図示のモニタを介して観察することが可能 となる （以下、 「通常観察」 という） 。
また、 光ピンセット光学系 4において、 レーザ光源 1 1から発せられたレーザ 光は、 レンズ 1 2を経て、 ミラ一 1 3 a、 1 3 bによって反射され、 顕微鏡本体 2内のハーフミラー 1 4へ導かれる。 そしてこのレーザ光は、 該ハーフミラー 1 4によって反射され、 後述するダイクロイツクミラー 1 5を透過した後、 対物レ ンズ 8を介して試料 6に照射される。 これにより、 観察者は試料 6に光ピンセッ ト操作を行うことが可能となる（以下、 「光ピンセット法による観察」という）。 次に、 本実施形態において最も特徴的な焦点検出装置 3の構成について詳細に 説明する。
本焦点検出装置 3は、 所定の波長帯域の光を発する I R光源 1 6と、 該 I R光 源 1 6側から順に、 レンズ 1 7と、 ハーフマスク 1 8と、 ハーフミラ一 1 9と、 ダイクロイツクミラー 1 5とを備えており、 さらにハーフミラ一 1 9の反射光路 上には、 結像レンズ 2 0と、 受光素子 2 1とを備えている。 なお、 本実施形態に おいて I R光源 1 6の発する所定の波長帯域の光とは、 波長 λ I R 1 = 7 7 0 n m の近赤外光である。
また、 ダイクロイツクミラ一 1 5は、 顕微鏡本体 2における対物レンズ 8とハ ーフミラ一 1 4との間の光路中に配置されており、 これにより I R光源 1 6から の光を顕微鏡本体 2内の光路へ導くことができる。 そして本実施形態におけるダ ィクロイツクミラー 1 5は、 図 2に示すように I R光源 1 6から発せられた所定 の波長帯域の光、 すなわち波長 λ I R 1の近赤外光のみを反射する特性を有してい る。 なお、 図 2は、 本発明の第 1実施形態における焦点検出装置 3のダイクロイ ックミラー 1 5の反射特性を示す図である。
以上の構成の下、 本焦点検出装置 3において、 I R光源 1 6から発せられた所 定の波長帯域の光は、 レンズ 1 7、 ハーフマスク 1 8、 ハーフミラー 1 9を順に 経た後、 ダイクロイツクミラー 1 5によって試料 6側へ反射される。 この光は、 対物レンズ 8を経た後、 試料 6近傍のガラス界面 6 aによって反射される。 そし てこのガラス界面 6 aからの I R光源 1 6の光の反射光は、 再びダイクロイツク ミラー 1 5によって I R光源 1 6方向へ反射され、 さらにハ一フミラー 1 9で反 射された後、 結像レンズ 2 0を介して受光素子 2 1の受光面に結像される。
これに伴い、 本焦点検出装置 3に備えられた制御部 2 2は、 受光素子 2 1で得 られた信号に基づいてレンズ界面 6 aの光軸方向位置を検出し、 すなわち対物レ ンズ 8とレンズ界面 6 aとの焦点ずれを検出し、 顕微鏡本体 2に備えられた不図 示の対物レンズ駆動部を介して対物レンズ 8を駆動することで、 対物レンズ 8の 焦点位置にレンズ界面 6 aを配置する。 これにより、 顕微鏡本体 2において試料 6の合焦が達成される。 なお、 以上の合焦動作は、 試料 6の観察中常に実行され るため、 試料 6の合焦状態は観察中常に維持されることとなる。 したがって本顕 微鏡 1は、 投薬を伴う観察や長時間にわたる観察、 さらには試料の複数の箇所の 連続観察を行う場合に非常に有用である。
以上、本顕微鏡 1は、上述のように焦点検出装置 3において使用する光（以下、 「焦点検出光」 という。 ） を所定の波長帯域に限定することで、 焦点検出光より も波長の長い光を観察に使用可能としている。 したがって本顕微鏡 1は、 焦点検 出光よりも波長の短い光を使用する通常観察に加え、 焦点検出光よりも長い波長 の光を使用する光ピンセット法による観察も行うことができる。
なお、 本顕微鏡 1は、 上述のように光ピンセット光学系 4を備えているが、 本 発明はこれに限られるものでなく、 この光ピンセット光学系 4の代わりに、 例え ば波長 λ I R 2 = 8 5 0〜1 0 0 0 n mの赤外光を発する光源を備えた 2光子励起 観察を行うための光学系を備える構成とすることもできる。 この場合、 本顕微鏡 1は、 試料 6の通常観察に加え、 焦点検出光よりも波長の長い光を使用する 2光 子励起観察を行うことが可能となる。
また、 本実施形態における合焦動作は、 上述のように対物レンズ 8の焦点位置 にレンズ界面 6 aを配置することで達成される。 しかしながら本実施形態の構成 はこれに限られず、 本焦点検出装置 3はさらに、 ハーフミラー 1 9とダイクロイ ックミラ一 1 5との間の光路中に、 光軸方向へ移動可能なオフセットレンズを備 えた構成とすることが望ましい。 このオフセットレンズを移動させることで、 レ ンズ界面 6 aを対物レンズ 8の焦点位置へ配置する際に、 レンズ界面 6 aを該焦 点位置から任意のオフセット量だけ光軸方向へずらして配置することが可能と なる。 これにより、 レンズ界面 6 a、 すなわち試料 6の表面だけでなく、 試料 6 の深さ方向の所望の箇所に焦点合わせを行うことが可能となる。 なお、 斯かるォ フセットレンズは、 以下の各実施形態の焦点検出装置においても備えられている ことが望ましい。
また、 本実施形態では、 上述のように不図示の対物レンズ駆動部によって対物 レンズ 8を上下動させて合焦動作を行っているが、 本実施形態の構成はこれに限 られず、 ステージ駆動部を設け、 ステージ 7を上下動させて合焦動作を行う構成 とすることもできる。 なお、 これは以下の各実施形態の顕微鏡においても同様で ある。
(第 2実施形態）
図 3は、 本発明の第 2実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
以下、 本実施形態及び後述する第 3実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微 鏡について、 上記第 1実施形態と同様の構成である部分には同じ符号を付してそ の説明を省略し、 異なる構成の部分について詳細に説明する。
本実施形態の焦点検出装置 30は、 上記第 1実施形態の焦点検出装置における I R光源 16に代えて図 4 Aに示す複数の波長の光を選択的に発することが可 能な I R光源 31を備え、 さらにダイクロイツクミラ一 15に代えて図 4 Bに示 すダイクロイツクミラ一ュニット 32を備えている。
本実施形態において I R光源 31は、 波長 λ IR1= 770 nmの近赤外光を発 する LED 31 aと、波長 λ IR2= 870 nmの赤外光を発する L ED 31 bと、 波長 λ IR3= 1064 nmの赤外光を発する LED 31 cとを備えており、 観察 者はこれらの LEDを選択的に発光させることが可能である。 なお、 図 4Aは、 本発明の第 2実施形態における焦点検出装置 30の I R光源 3 1の構成を示す 図である。
また、 ダイクロイツクミラ一ユニット 32は、 波長 λ IR1の近赤外光のみを反 射する特性を有するダイクロイツクミラー 32 aと、図 5に示すように波長 λ j R 2の赤外光のみを反射する特性を有するダイクロイツクミラ一 32 bと、波長 λ 1 R3の赤外光のみを反財する特性を有するダイクロイツクミラー 32 cとを備え ている。 なお、 図 4Bは、 本発明の第 2実施形態におけるダイクロイツクミラ一 ユニット 32の構成を示す図である。 また、 図 5は、 ダイクロイツクミラ一ュ二 ット 32におけるダイクロイツクミラー 32 bの反射特性を示す図である。 また、 ダイクロイツクミラ一ュニット 32には不図示のスライド機構が設けら れており、 このスライド機構を介して該ダイクロイツクミラーュニット 32を光 路内ヘスライドさせることでダイクロイツクミラ一 32 a、 32 b、 32 cを選 択的に光路内へ配置することが可能である。 これにより、 I R光源 31において 選択した L E Dの波長に対応したダイクロイツクミラ一を光路内に配置するこ とができる。
以上の構成の下、 本焦点検出装置 30において、 I R光源 31における LED 31 aから発せられた波長 λ IR1の近赤外光は、レンズ 17、ハーフマスク 18、 ハーフミラ一 19を順に経た後、 ダイクロイツクミラ一ュニット 32のダイク口 イツクミラ一 32 aによつて試料 6側へ反射される。 この光は、 対物レンズ 8を 経た後、 試料 6近傍のガラス界面 6 aによって反射される。 そしてこのガラス界 面 6 aからの波長 λ IR1の近赤外光の反射光は、 再びダイクロイツクミラ一ュ二 ット 32のダイクロイツクミラー 32 aによって反射され、 さらにハーフミラー 19で反射された後、 結像レンズ 20を介して受光素子 21の受光面に結像され る。
なお、 これに伴い本焦点検出装置 30に備えられた制御部 22で行われる合焦 動作及びその維持は上記第 1実施形態と同様である。
また、 以上は LED 31 aから発せられた波長 λ IR1の近赤外光について説明 したが、 LED 31 bから発せられる波長 λ IR2の赤外光、 LED 31 cから発 せられる波長 λ IR3の赤外光についても、 それぞれに対応したダイクロイツクミ ラ一ユニット 32におけるダイクロイツクミラー 32 b、 ダイクロイツクミラー
32 cを光路内へ配置することで同様の合焦動作及びその維持を達成すること ができる。
以上より、 本顕微鏡は上記第 1実施形態と同様の効果を奏することができる。 また本顕微鏡は、 上述のように焦点検出装置 30において LED 31 a、 31 b、 31 cとこれに対応するダイクロイツクミラー 32 a、 32 b、 32 cとを 切り替えることで、 通常観察と併用したい観察方法に合わせて焦点検出光の波長 帯域を変更することができる。 したがって具体的には、 例えばダイクロイツクミ ラ一 32 bを光路内へ配置して LED 31 bを発光させる、 即ち波長 λ IR2の赤 外光を焦点検出光として使用すれば、 図 5に示すように通常観察 （波長 AFL1、 AFL2, AFL3) に加えて、 長波長の蛍光色素を使用する蛍光観察 （波長 AFL4) と光ピンセット法による観察 （波長 λΙΚ3) とを行うことが可能となる。 なお、 このように焦点検出光の波長帯域を変更した場合でも、 受光素子の信号検出条件 を電気的に切り替える構成とすれば、 試料 6の合焦状態を維持することができる。 (第 3実施形態）
図 6は、 本発明の第 3実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成 を示す図である。
本実施形態の焦点検出装置 40は、 上記第 1実施形態の焦点検出装置 3におけ るダイクロイツクミラー 15に代えて、 図 7に示すパーシャルミラ一 41を備え ている。
図 7 Α、 7 Βは、 本発明の第 3実施形態における焦点検出装置 40のパーシャ ルミラー 41の構成を示し、 図 7 Αは上面図を、 図 7 Bは正面図を示す。
図 7Bに示すように、 パーシャルミラー 41は、 後述するパーシャルミラー部 42と、 これを挟持する 2つの三角柱プリズム 43 a、 43 bとからなる。 そし てパーシャルミラー部 42は、 図 7 Bに示すように I R光源 16側から見て顕微 鏡本体 2における対物レンズ 8の光軸方向へ長軸が伸びた楕円形状の透過面 4 2 aと、 該透過面 42 aの長軸側の両端部に設けられた反射面 42 bとからなる。 斯かるパーシャルミラ一部 42の構成により、 I R光源 16からの近赤外光の うちの大部分を透過させて光路外へ廃棄し、 高 N A領域を進行する外縁光束のみ をガラス界面 6 a側へ反射し、 さらにガラス界面 6 aで反射された前記外縁光束 を再びハーフミラー 1 9側へ反射することができる。
なお、 パーシャルミラー部 4 2の透過面 4 2 aは、 顕微鏡本体 2において不図 示の照明光源によって照明された試料 6からの光、 及び光ピンセット光学系 4か らのレ一ザ光を遮らない大きさに形成されているため、 通常観察及び光ピンセッ ト法による観察にパーシャルミラ一 4 1が支障をきたすことはない。 さらに、 遮 る場合でも、 その遮光量は小さいため、 許容できるものである。
以上の構成の下、 本焦点検出装置 4 0において、 I R光源 1 6から発せられた 所定の波長帯域の光 （波長 λ I R 1の近赤外光） は、 レンズ 1 7、 ハーフマスク 1 8、 ハーフミラ一 1 9を順に経た後、 パーシャルミラー 4 1の反射面 4 2 a、 4 2 bによって試料 6側へ反射される。 この光は、 対物レンズ 8を経た後、 試料 6 近傍のガラス界面 6 aによって反射される。 そしてこのガラス界面 6 aからの反 射光は、 再びパーシャルミラ一 4 1の反射面 4 2 a、 4 2 bによって反射され、 さらにハーフミラ一 1 9で反射された後、 結像レンズ 2 0を介して受光素子 2 1 の受光面に結像される。
なお、 これに伴い本焦点検出装置 4 0に備えられた制御部 2 2で行われる合焦 動作及びその維持は上記第 1実施形態と同様である。
以上より、 本顕微鏡は上記第 1実施形態と同様の効果を奏することができる。 また、 本実施形態の焦点検出装置 4 0は、 I R光源 1 6に代えて上記第 2実施 形態における I R光源 3 1を備える構成とすることもできる。 これにより、 上記 第 2実施形態と同様の効果を奏することができる。 また、 パーシャルミラー 4 1 は焦点検出光の波長帯域に関わらず使用可能であるため、 第 2実施形態のように ダイクロイックミラ一ュニット 3 2を光路内ヘスライドさせるような作業を必 要としないため、 よりスムーズな焦点検出光の切り替えを実現することができる。 以上の各実施形態によれば、 焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、 それ以 外の波長帯域の光を顕微鏡による観察、 例えば通常観察及びこれに併用される応 用技術に使用可能とした焦点検出装置、 及びこれを備えた顕微鏡を実現すること ができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 特定の波長帯域の光を発する光源と、 顕微鏡の対物レンズと観察対象物と の焦点ずれを検出するための特定波長帯域の焦点ずれ検出光を反射すると共に、 前記特定波長帯域を除く少なくとも 2つの異なる波長帯域の非焦点ずれ検出光 を透過する光学部材を備えることを特徴とする焦点検出装置。
2 . 前記光学部材における前記光源からの光を反射する波長帯域は、 前記透過 する観察対象物からの 2つの波長帯域に挟まれる帯域であることを特徴とする 請求項 1に記載の焦点検出装置。
3 . 前記光学部材は、 前記特定の波長帯域の光のうち、 外縁光束を反射して前 記観察対象物へ導き、 かつ残りの光束を透過するパーシャルミラーであることを 特徴とする請求項 1に記載の焦点検出装置。
4. 前記光源は、 波長帯域の異なる複数の光を選択的に発する光源であり、 前記反射部材は、 前記光源の発する波長帯域の異なる複数の光にそれぞれ対応 した複数のダイクロイツクミラーを光路内へ揷脱可能に備えたダイクロイツク ミラ一ュニットであることを特徴とする請求項 1に記載の焦点検出装置。
5 . 前記光源は、 波長帯域の異なる複数の光を選択的に発する光源であること を特徴とする請求項 3に記載の焦点検出装置。
6 . 観察対象物に照射する焦点ずれ検出用の特定波長帯域の光を発する光源を 有することを特徴とする請求項 1記載の焦点検出装置。
7 . 観察対象物で反射した前記光源からの光の反射光を受光する受光手段を有 することを特徴とする請求項 6記載の焦点検出装置。
8 . 前記受光手段からの信号に基づいて前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対 象物との焦点ずれを検出する制御手段を有することを特徴とする請求項 7記載 の焦点検出装置。
9 . 前記非焦点ずれ検出光を照射する第 2の光源を有することを特徴とする請 求項 1記載の焦点検出装置。
1 0 . 前記第 2の光源からの光を観察対象物の方向に反射させ、 観察対象から の光を透過させる第 2の光学部材を有すること特徵とする請求項 9記載の焦点 検出装置。 ' 1 1 . 前記第 1の光源は赤外波長帯域の光を発するものであり、 前記第 2の光 源は前記赤外波長帯域よりも長波長帯域の光を発するものであることを特徴と する請求項 9記載の焦点検出装置。
1 2 . 請求項 1から 1 1の何れか 1項記載の焦点検出装置を備えることを特徴 とする顕微鏡。
1 3 . 対物レンズと、 カメラの取付部とを有し、 前記光学部材と前記第 2の光 学部材とは前記対物レンズと前記カメラの取付部の間の光路に設けられ、 前記古 学部材は、 前記対物レンズ寄りに設けられ、 前記第 2の光学部材は前記カメラの 取付部よりに設けられることを特徴とする請求項 1 2記載の顕微鏡。
1 4. 前記第 2の光源は、 光ピンセット用の光源であること特徴とする請求項 1 2記載の顕微鏡。
1 5 . 前記第 2の光源は、 2光子励起用の光源であること特徴とする請求項 1 2記載の顕微鏡。
1 6 . 前記第 1の光源は赤外波長帯域の光を発するものであり、 前記第 2の光 源は、 前記赤外波長帯域よりも長波長帯域の光を発するものであることを特徴と する請求項 1 2記載の顕微鏡。
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