JP4945025B2 - 軸方向高解像度を有する走査型顕微鏡方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好ましくは支持体の上に配置された基板上、または基板中の少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法に関する。更に本発明による方法、及びこの方法を実施するデバイスの応用分野が記述される。
【０００２】
【従来の技術】
共焦点配置、即ちその軸方向高局部解像度による多光子励起用に構成された配置は、焦点面の外側である背景信号の低減に適することが知られている。このため、特に大きな表面構造を検出する時、走査プロセスを行なう間に焦点面が調査される対象物の内部の希望する位置に常に置かれることを保証しなければならない、という問題がある。従って、たとえば調査される対象物がその上に配置される標本支持体の不整により、共焦点測定ボリュームは対象物内部の希望する平面にはなく、たとえば標本支持体の一部としてこの対象物に近接する構造体を検出する可能性がある。このことは、実行されるべき対象物の登録及び特性に逆の影響を与える。従って、焦点面をある位置の内部に維持するか、または追跡する手段を採るることが望ましい。
【０００３】
“日本特許要約”（１９９４年８月１５日発行、第０１８巻、No. ４３６（Ｐ−１７８６））は、画像生成デバイスの自動的な結像、または調査される対象物の表面の不均一性の測定に適した位置検出用デバイスを記述している。光ファイバが使用され、その端部はアクチュエータによって光軸に沿って移動される。そのように」て生成された干渉信号は、焦点位置の変位の検出とそれの再調節のために使用される。
【０００４】
“日本特許要約”（１９９８年３月３１日発行、第０９８巻、No. ００４）は、共焦点型顕微鏡光学系の原理を使用する焦点検出器を提案している。
【０００５】
ＵＳ−Ａ−５，０６２，７１５は、表面振動の測定用に設計されたマイケルソン干渉計の共焦点型自動焦点システムの使用を開示している。
【０００６】
ＵＳ−Ａ−５，０８４，６１２は、透過幾何学中に構成された走査型顕微鏡についての画像生成方法を記述している。ここで、検出用に使用される開口絞りの位置は、屈折効果のために、標本の近傍に（標本のセクションの中に? ）生じる透過光に起こり得る変位が補償される方法で追跡される。しかしながら、標本内部の測定焦点の位置を追跡することが、この方法の目的ではない。
【０００７】
ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１８８６（国際出願番号ＷＯ９５／２２０５８）は、共焦点開口絞りを含む自動焦点機構を有する共焦点型検出デバイスを記述している。自動焦点は、次の三つのステップで実現される。第一に、レーザが、標本をその上に置いた基板の後側に収束される。次のステップで、焦点は基板の上の平面に位置される。この基板の表面上の所望の位置を通過した後に表面の正確な位置が決定され、焦点が基板表面上に調節される、ということは第３ステップにおいてのみである。このプロセスは基板の四隅で実行されるが、これは非常に時間を要する過程である。標本の実際の測定の間に自動焦点システムを操作することは不可能であり、また焦点高さは補間法によって推定される。この結果、平面でない基板が価格面での理由によって研究室で通常使用されるため、特にそれらについて受け入れることの出来ない位置欠陥が生じるであろう。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、軸方向高解像度、特に共焦点型顕微鏡を備えた検出デバイス中に、シート支持体上に好ましく配置されたシート状または三次元構造の信頼性のある検出を行なわせる方法を提供することが、本発明の目的である。更にこの方法を実施するデバイスが提供される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は請求項１による特徴を有する方法により、及び請求項１６または１７による特徴を有するデバイスにより解決される。
【００１０】
本発明は、好ましくは支持体上に配置された基板の上及び／又はその中の少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法またはデバイスを提供し、それによって検体をそこに適用させた基板の代表的な部分が、共焦点または多光子励起用に構成された少なくとも一つのデバイスにより測定ボリュームで走査され、それによって光パラメータの測定値を受け取る。これらの測定値は次いで、少なくとも一つの検体の特徴付けのための信号処理によって処理される。測定値を記録する期間中は、少なくとも一つの検体は基板及び／又は支持体に対して実質的にその位置に留まる。基板は、基板に近接する少なくとも一つの構成部品の一つとは異なる屈折率を有する。たとえば、近接する構成部品は、基板をその上に有する支持体であってもよい。しかしながら、基板はまた浸漬液に対して、空気に対してまたはたとえばカバーガラスのような基板を覆う構成部品に対して、直接接触してもよい。
【００１１】
本発明によれば、補助焦点が走査プロセスの前及び／又はその間に発生され、補助焦点は基板とこれに近接する構成部品との間のインタフェイスまたは別の適当なインタフェイス上に少なくとも部分的に位置される。このインタフェイスは、検体に対して規定された空間関係を有する。このようにして、たとえば検体（たとえば調査されるべき蛋白質または核酸のような高分子）は、支持体（たとえば光学的ガラス製の標本支持体）上に置かれた基板（たとえばゲル）中に埋め込むことができるであろう。インタフェイスの位置を決定すること、及び特にインタフェイスと補助焦点を発生する光学系との間の距離を決定できることは、補助焦点の機能である。本発明によれば、補助焦点と測定ボリュームとはユーザによって調節可能な規定された相互の位置を有する。このようにして、補助焦点の位置を追跡することにより、インタフェイスに関する測定ボリュームの位置を追跡することがまた可能である。このようにして、インタフェイスからの測定ボリュームの距離がユーザによって選択できる。
【００１２】
共焦点に配置された検出器により、インタフェイスによって再帰反射された光の強度が検出される。この強度は、補助焦点がインタフェイスの光軸の方向に置かれた場合に最大値を有する。再帰反射の強度は、補助焦点が基板または基板に近接する構成部品に向かう方向に光軸上を移動させられる時に減少する。代わりに、複数の検出器を、像平面の前方及び／又は後方に補助焦点を発生する光学系の光軸に沿って置いてもよく、検出強度の比が決定できる。
【００１３】
従って本発明は、追跡が全測定処理の間オンラインで実行できることが好ましく、それによって測定ボリュームは常にインタフェイスからの選択された距離で決定された平面内で導かれる、ということが特徴付けられる。設定位置からの変位に対する合焦デバイスの感度は、下記のように共焦点型測定デバイスの対応する感度よりも高いことが望ましい。
【００１４】
好ましい実施の形態においては、補助焦点はまた測定ボリュームの発生用に役立つ光学系と同じ光学系によって発生される。補助及び測定焦点の発生用に、同じ放射源を使用することさえも可能である。このような放射源はたとえば適当な光学要素によって分離される、異なる波長または偏光の光を放射し、それぞれの光線径路に供給されることができる。
【００１５】
走査プロセスの前及び／又はその間に、補助焦点の所望する位置決め、及び上述のようにして間接的に測定ボリュームの所望する位置決めを可能とするために、インタフェイスからの補助焦点の位置が基板に向かう方向で変位するか、または基板に近接する構成部品に向かう方向で変位するか否かを見出すことが望ましい。本発明によれば、下記の解決法が提案される。
【００１６】
第１の実施の形態においては、インタフェイスに対する補助焦点の位置は実質的に光軸に沿って変化されると共に再帰反射の強度は移動に依存して位置合せされる（図１、図２、図３、図５及び６参照）。その結果、たとえば合焦光学系は光軸に沿って上方及び下方に移動できる。しかしながら、たとえば位置決めすることのできる支持体上に配置された基板をｚ方向に直接的にまたは間接的に移動することも可能である。更に、補助焦点の発生に役立つ光束の発散を変えることも可能である。移動は周期的に実行されることが好ましい。共焦点配置型検出器によって検出された強度は、反射されたインタフェイスと補助焦点との間の距離が低減される都度、高められるであろう。他方、この距離が移動によって増加される時、強度は低減されるであろう。このようにして、補助焦点の位置がインタフェイスの位置からどの方向に変位したかということ及び変位が修正できたことが、それぞれ、検出強度の上昇または低減に帰着する移動の方向によって検出可能である。
【００１７】
好ましくは、移動の大きさは測定ボリュームからの測定値の同時記録が妨害されないように選択されなければならない。それ故に、移動の振幅は通常測定ボリュームの軸方向の範囲に対応するであろうし、またはこの範囲よりも小さいであろう。後者の場合、補助焦点の共焦点検出されたボリュームの範囲−特に補助焦点と測定ボリュームの発生のために使用される対物レンズの光軸それぞれの方向の共焦点検出されたボリュームの範囲−は測定ボリュームの範囲よりも小さくあるべきである。このような小さな範囲は、測定ボリュームの発生のための光学系の開口数よりも大きい開口数を有する光学系によって補助焦点が発生されるような方法で、与えられることが好ましいであろう。変わりに、単にそれぞれの光学系の共通光学系の開口数の少ない部分が、補助焦点の発生用よりも測定ボリュームの発生用に利用できる。別の変形例においては、共焦点配置された絞りは補助焦点の検出に使用され、それによって絞りは測定ボリュームの検出に使用される共焦点配置された絞りよりも小さい開口部を備える。
【００１８】
第二の好ましい実施の形態では、インタフェイスに対する補助焦点の位置は補助焦点を発生する光学系の光軸に対して横方向及び軸方向の両方に移動される。再帰反射の分析は、上記の実施の形態のそれに対応した方法で実行できる。
【００１９】
第３の好ましい実施の形態においては、再帰反射の強度は光軸に沿って配置された少なくとも二つの検出器によって検出される。従って、インタフェイスから反射された補助焦点の光は、たとえば半反射鏡による検出器上で分割される。検出器は−反射インタフェイスに関する補助焦点の位置に依存して−反射強度の異なる位置が検出器によって検出されるように、特に焦点面の前方及び後方で合焦光学系からの異なる距離で配置されることが好ましい。このようにして、補助焦点の位置がインタフェイスの位置からどの方向に変位したかが、検出器によって検出された強度の分布から決定できる。このことが、図４に例示的に示されている。
【００２０】
たとえば、この平面の前方及び後方の焦点面から同じ距離に配置された二つの検出器は、それぞれ補助焦点がインタフェイス上に置かれるならば１：１の強度比を検出する。インタフェイスからの補助焦点の変位の方向に従って、検出器の一つによって検出された強度は増加する。
【００２１】
希望する位置からのそのように決定された補助焦点の変位は、もし必要ならば上記の移動に重畳される対応する追跡によって総ての実施の形態において修正可能である。補助焦点は、それがインタフェイス上に位置されるような方法で追跡されることが好ましい。
【００２２】
装置の作用力をできるだけ小さくするために、測定ボリュームの発生にも役立つ光学系と同じ光学系で補助焦点を発生することが望ましい。本発明のこのような実施の形態においては、たとえば半反射鏡は、それぞれ対物レンズの前面でそれぞれ測定ボリュームまたは補助焦点を発生する光線を集中するためと共に、それぞれ測定ボリュームまたは補助焦点から反射される検出された放射を分離するために利用できる。たとえばもし、測定ボリューム及び補助焦点を相互に実質的に光軸に沿って調節可能な距離に配置することが望まれるならば、それぞれ異なる発散または集束を行い、その後対物レンズからそれぞれ測定ボリューム及び補助焦点へ合焦される二つの光束を発生するために、標本とは反対側で対物レンズの前面に適当な光学的要素（たとえばレンズ、凸及び凹面鏡）を接続することが有用である。
【００２３】
他方、別々の光学系によって測定ボリューム及び補助焦点が発生される配置が選択できる。この場合、両光学系は好都合にも機械的に接続され、または補助焦点の追跡は測定ボリュームのそれぞれの追跡に影響するような方法で制御可能である。またこの実施の形態では、測定ボリューム及び補助焦点は完全にまたは部分的に重畳できるか、あるいはそれらは相互に空間的に分離して配置できる。補助焦点及び測定ボリュームの相互の位置取りは、この場合、この二つの対物レンズの位置を相互に調節することにより調節できる。
【００２４】
光学的に異なる波長の放射を発することのできる一個の単一放射源によって、測定ボリューム用及び補助焦点用の両方の励起光線径路を発生することが好ましいであろう。他方、特に測定ボリューム及び補助焦点を空間的に分離する場合、二つの別々の放射源を使用することが好ましいであろう。放射源はたとえばレーザ、発光ダイオード、フィラメントまたは電気放電ランプで良い。当該技術に習熟した人々に知られた適当な検出器は、たとえばアバランシェ型のフォトダイオードまたは他のフォトダイオード及び光電子増倍管である。単一光子検出用手段が、好ましい。
【００２５】
本発明による方法及び装置の別の実施の形態においては、測定ボリューム及び／又は補助焦点を発生するために、好ましくは０．９よりも大きい高開口数及び／又は短い動作距離を有する対物レンズを選択することが特に好都合である。より短い動作距離、特に１ミリメータよりも短いか等しい距離の選択は、測定ボリューム中の蛍光性の測定に特に好都合である。光線の射出追跡中に起こる蛍光性光の吸収は、分子当たりのカウント値、即ち分子によって検出された蛍光性強度を低減する。期待とは対照的に、この影響は信号／雑音比に明らかに直線的なまたは直線的以上の影響を与えるため、小さな動作距離が有利である。
【００２６】
走査プロセスは、次のように実行できる。好ましくは、励起光を発生する放射源、放射源の入射放射がそこから反射されるダイクロイックミラー、機械的開口を備えた対物レンズの配置を有する共焦点型顕微鏡が観察されるべきボリュームを光学的に検出するために使用され、それによってこの配置はダイクロイックミラーによって反射された放射を受け取り、この放射を観察されるべきボリュームの上に合焦し、更に観察光学系配置は観察されるべきボリュームから到来しかつダイクロイックミラーを通過する放射を受け取る。ダイクロイックミラーと対物レンズ配置との間に、好ましくは標準点位置の周囲に振動可能に配置された対物レンズ側に平面偏向鏡を有する反射鏡配置が位置される。対物レンズ側の鏡が振動する時、それぞれの反射された励起光の光軸は、対物レンズ配置の機械的開口の部分の実質的に共通の交差点で相互に交差する。対物レンズ側の鏡の振動軸は、対物レンズ側の偏向鏡がその標準点位置に置かれた時、反射放射の光軸の共通交差点を通して伸長し、かつ反射放射の光軸に垂直な平面で対物レンズ側の偏向鏡によって固定された平面の交差線に対応する。対応デバイスはＰＣＴ／ＥＰ９７／０３０２２（国際公開番号ＷＯ９７／４８００１）として知られており、その開示はここに参考文献として組み入れてある。しかしながらまた当該技術に習熟した人々に知られる他の方法も、放射源によって発生される光線を変位させるために使用できる。選択肢として、基板または使用された顕微鏡光学系の位置を直接的にまたは間接的に変更することも、可能である。
【００２７】
たとえば、拡散光強度、少なくとも一つの波長における蛍光性強度、偏光依存蛍光性強度、蛍光性耐久性及び／又は分子光度は光学的パラメータとして検出できる。それによって、ＷＯ−Ａ−９８／１６８１４に記述された方法によって分子光度を決定することが好ましいであろう。そこにおいて、測定ボリューム中に置かれた粒子からの射出放射の強度変動は検出器によって観察され、それによってこの方法は以下のステップ、即ち、時間間隔の規定長当たりの光子の数の反復測定、時間間隔当たりの光子の数のたとえば分布関数としての関数の決定、及び時間間隔当たりの光子の数の関数に基づいた特定の特別な視感度のたとえば分布関数としての関数の再度の決定、が記述されている。また参照は、光子の数の関数が如何にして処理できるか、またはたとえば器具のパラメータが如何にして十分な方法で考慮に入れられるかについてなされる。粒子の物理的特性、特に、特定の」感度もまたＰＣＴ／ＥＰ９８／０６１６５に開示されているように決定できる。ここに開示された方法は以下のステップを含む。即ち、検出された光子間の時間セグメントの間隔の反復測定、関数たとえばこの時間セグメントの間隔の分布関数の決定、及び時間セグメントの間隔のこの関数に基づいて調査されるべき粒子の特定の物理的特性の関数の決定。特に時間セグメントの間隔の実験的に決定され且つ理論的な関数に関する適合プロセスが提案され、それによって理論的関数に関して器具配置についての特性である空間視感度関数のパラメータが考慮に入れられる。たとえば蛍光性偏光、波長依存性蛍光性強度、蛍光性耐久性、エネルギー転移等を調査することが提案される。他の実施の形態では、検体の改良された特性を得るために複数の光学的パラメータを決定することが有利であろう。特にこのことはＰＣＴ／ＥＰ９８／０３５０５に記述された方法により実行できる。以下の方法が、ここで提案されている。即ち、少なくとも一つの検出器による測定ボリューム中に置かれた粒子からの射出放射の強度変動の決定、この強度変動に基づく少なくとも二次元統計的関数を含む中間統計的データの決定、中間統計的データに基づく情報の決定。最終ステップにおいて、たとえば一つの粒子における二つの特性の相互発生が調査できる。参照は特に調査粒子の調査された物理的特性、それらの決定及び中間統計的データの決定に関して上記公開特許出願の開示に対して為され、その開示はここに参考文献として組み入れられている。
【００２８】
本発明による方法及びこの方法を実行するために使用される装置はたとえば、分子、分子複合体、ポリマー、たとえばポリマーまたは無機材料の成長粒子の多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスのような検体の光学的パラメータの検出用に適している。それらはたとえば無機質または有機質基板上に配置できる。特に、この基板はポリマー性ゲル、ポリマー性または無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなることができる。
【００２９】
更に他の実施の形態では、分布及び／又は検体構造及び／又は演繹的な情報が信号処理に使用される。従って、たとえば基板としてバクテリアまたはポリマー性ボール（いわゆるビーズ）を、特にその同じ種類の検体がそれぞれ配置されるその表面または内部に使用することが可能である。信号処理において、特に画像処理において、信号処理によって性質としての測定値を一緒に識別できるこの基板のたとえば構造、空間範囲、配置等のような調査されるべき基板に関する演繹的な情報を考慮することが、しばしば役に立つ。更に、等価なものとして識別された検体に属する測定値について平均値を形成すること、またはより重要な検体の特性を形成するために異なる方法でこの測定値を統計的に評価することは有利であろう。たとえばＨｏｕｇｈ変換、テンプレートマッチング及び相関方法のような文献で知られた対象物識別方法は、信号処理方法として使用できる。この方法は文献に記述される（たとえばＥ．Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｖｉｓｉｏｎ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ−Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，２版、１９９７年）。
【００３０】
優れた検体及び／又は基板を、それらに更なる分析及び／又は処理を受けさせるためにある光学的パラメータにより他の検体及び／又は基板から分離することは、しばしば望ましい。この分離は、たとえばピペット、機械的グリッパ等のような適当なマニピュレータにより実行できる。特に、適当な方法が、たとえばその開示がここに参考文献として組み込まれているＷＯ−Ａ−９５／３５４９２に開示されている。たとえば、それぞれ圧力差パルスまたは光圧力パルスの電位または電界インパルスによる除去または分離が、そこに記述されている。また、それぞれ好ましい圧電制御ポンプまたは分配システムを使用することが可能である。一般に、分離プロセスの自動化用の走査プロセスの間、測定ボリュームの位置に依存して決定された測定値を検出することは有用である。
【００３１】
特に、この方法とそれに対応するデバイスは、添加物、組合せ化学、機能的ゲノム分析、進化生物工学、診断法、材料検査または蛋白分析についての探索に使用できる。
【００３２】
本発明による一つの実施の形態においては、たとえばビーズ構造が基板として使用され、このビーズ構造は同じ種類の複数の検体によって占められるか、またはこの検体を含む。たとえばこの検体は組合せ化学のプロセスの結果であり得るが、それによって通常検体の実際の構造は未知である。検体は、たとえば蛍光性色のような検出可能なマーカを含むことが好ましい。この変形例は、後で添加される反応添加剤が検出可能なマーカを含むということを必要としない、という利点を有する。基板は、たとえば複数の凹所またはシート状構造を備えたミクロフィルタプレートのような支持体上に配置されることが好ましい。この実施の形態においては、支持体の上部表面または下部表面は、補助焦点及び測定ボリュームを追跡するインタフェイスとして使用できる。反応添加剤が添加され、検体とのその相互作用が調査される。一つの実施の形態においては、これらの反応添加剤は検出可能なマーカを含むこともできる。その後、基板はたとえば検体間に反応添加剤の潜在的な結合剤を見出すために、及び／又は化学的反応を生成するために走査される。反応添加剤と検体との間の結合剤は、上述の詳細に記述された光学的パラメータにより特徴付けできる。反応添加剤と検体との間の所望の特性を有する複合剤は、それらが更なる分析及び／又は処理を受けるためにそれぞれ他の検体または基板から分離できる。所望の方法が、活性成分の探索に適用されることが好ましい。
【００３３】
他の変形例において、劈開性リンク構造が基板と検出可能なマーカをそれに適用させる検体との間に配置される。このようにしてたとえば化学的合成のプロセスにおいて、劈開性リンク構造はポリマー性ビーズとして基板上に配置でき、このリンク構造は調査されるべき検体が好ましくは組合せ論の方法でその後それに合成される蛍光性色で結合される。この変形例は、反応添加剤と検体との間の所望の特性を備えた複合剤を担うビーズの選択の後、着色マークされた検体の分離が生じるであろうから、この検体はその後いわゆる溶解検定で分析できる。この変形例はまた、活性成分の探索に特に適している。
【００３４】
別の実施の形態においては、既知の構造の検体を備えた基板が使用され、それにより総ての基板は同じ検体を含む。基板はまた、その中でマイクロタイタまたはナノタイタプレートの凹所上に分布されることが好ましい。その後、検体と相互作用することが知られている反応添加剤の溶液が、凹所に加えられる。更に、この活性成分が検体と反応添加剤との間の相互作用性に影響を与えるのに適するか否かを見出すために、異なる電位の活性成分の溶液が凹所に加えられる。
【００３５】
上記の実施の形態は、たとえばウィースル、ファージ、バクテリア、菌類または真核細胞のような生物学的基板で実行できる。このようにしてたとえば自然のまたはクローン化された検体が、ここで所望の識別表現型とその対応する遺伝子型との間の結合であるという利点を持ってこの生物学的基板の表面上で調査できることが好ましい。このような処理は、ファージ表示または細胞表示の適切な項目の下で知られる。
【００３６】
更に他の適用において、本発明による方法は、細胞報告検定でも役立つことができる。走査方法の精度、特に正確な局部解像度により、驚くべき高局部解像度と定量的精度を有する検体の露出の観察及び／又は細胞内移行が可能となる。
【００３７】
本発明の方法により、役立つ方法で信号導入の径路の調査が可能となる。特に、それは一次細胞と共に作用することが可能であり、このようにしてたとえば受容体のような調査されるべき検体の上方調整された表現を放棄できる、ということがまた特徴付けられる。
【００３８】
更にこの方法は、影響を受けた人の細胞が健康な人の細胞と比較できる、いわゆる差分表示に適用できる。更に、比較の可能性は、既処置／未処置細胞、野生型／突然変異体等を含む。
【００３９】
更に、本出願は、たとえば蛋白質−蛋白質−相互作用性及び蛋白質−核酸−相互作用性のような分子相互作用の調査に関係する。特に蛋白質と潜在的に生理学的に重要な配位子−その構造はしかしながらしばしばまだ明らかにされていないが−を伴う未知の性質または機能のペプチドとの間の相互作用を調査することも、可能である。ここで少なくとも一つの添加物が、特別の構造を備えて化学的にまたは吸着的に結合されることが好ましいであろう。
【００４０】
また本発明による方法と対応する装置をゲル電気泳動法の分野に適用することも、好ましいであろう。それぞれ、分離または単離のステップと組み合わせて基板として作用するゲル上のある種の検体は、別の分析または、また複製（ＰＣＲ等）に直接指向させることができる。
【００４１】
本発明による方法と装置はまた、たとえばこれが出生前診断法、腫瘍学または一般的に病理学における場合にあるように、稀にしか見出せない細胞タイプの検出または好ましくはその単離に適用できる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
本発明による好ましい実施の形態は以下に記述される。
【００４３】
まず最初に、図１は共焦点配置を示す。放射源１０からの放射は、光学系３３によって平行にされ、対物レンズ３２によって、調査される基板６０上に合焦される。放射源１０は、異なる波長の光を射出する。波長依存屈折力を有する置換可能な光学手段３５は、この光を異なる収束の束に分離し、この束は対物レンズ３２によって異なる位置に合焦され、それによって補助焦点７１と測定ボリューム７０とが発生される。このようにして補助焦点７１と測定ボリューム７０との間の所望の距離が、レンズ３５のユーザによる選択により調節可能である。図示された例示の配置において、補助焦点７１は基板６０と支持体６１との間のインタフェイス６２上に置かれ、測定ボリューム７０は基板６０中に置かれる。測定ボリューム７０から発する散乱または蛍光性放射は対物レンズ３２によって再度束ねられ、たとえば完全にまたは幾分かを反射する鏡のように構成されたビームスプリッタ４０によって完全にまたは幾分かが反射される。反射された放射は測定ボリューム７０と共に共焦点に配置された絞り５０上に光学系３０により合焦される。絞りを通過する放射は、測定信号を受け取るために役立つ検出器２０上に落ちる。絞り５０は、多光子励起を使用する時は必要ではない。
【００４４】
また共焦点に配置された別のビームスプリッタ４１、光学系３１及び絞り５１により、インタフェイス６２で反射された補助焦点７１からの放射の一部は、検出器２１に向けられる。本図による配置において、たとえば合焦光学系３２は、インタフェイス６２に対する補助焦点７１の現在位置を決定できるように、そしてもし必要ならば再調節するために、光軸に沿って上方及び下方へ移動される。このようにして測定ボリューム７０の間接的な追跡が保証される。
【００４５】
図２は共焦点配置の他の変形例を示している。ここで、測定ボリューム７０と補助焦点７１は相互に分離した光軸に沿って配置される。放射源１０、検出器２０及び対応する光学的要素よりなる従来の共焦点型放射及び検出ユニットは、既に図１に記述されている。この実施の形態においては、別の放射源１１が補助焦点７１の発生のために使用される。図示例において、ビームスプリッタ４２から反射されたこの放射源の光は光学系３１によって収束ビームに束ねられるため、対物レンズ３２によって発生された補助焦点７１は、対物レンズ３２による光線の平行束に合焦することに起因して、測定ボリューム７０よりも対物レンズ３２に接近して位置される。補助焦点７１は、再度基板６０と支持体６１との間のインタフェイス６２上に配置される。インタフェイス６２で反射された放射は対物レンズ３２及び光学系３１によって共焦点に配置された絞り５１上に収束され、検出器２１によって検出される。この実施の形態においては、光学系３１を適当に位置決めすることにより、補助焦点７１を測定ボリューム７０から選択された距離に配置できる。補助焦点７１はインタフェイス６２上に位置され、且つ測定ボリューム７０は基板６０内部の補助焦点７１から所望の距離に発生されることが好ましい。更に他の実施の形態では、補助焦点７１は対物レンズ３２の前面に発散する光束によって発生させることができるので、このようにして補助焦点７１は測定ボリューム７０よりも対物レンズ３２から遠い距離に配置される。好都合なことに、図１に記述された探索及び調節機構はこの実施の形態にもまた使用できる。
【００４６】
図３は本発明による更に他の実施の形態を示している。ここで、別の対物レンズ３４が補助焦点７１の発生用に適用される。測定ボリューム７０は再度対物レンズ３２によって発生されて作像される。対物レンズ３２の後方に配置された従来の共焦点配置の構成部品は、既に図１で議論された。対物レンズ３２及び３４の位置は、相互に制御可能にまたは機械的に接続されている。補助焦点７１の発生のために、別の放射源１１が使用され、その放射はレンズ３５によって平行にされ、対物レンズ３４によって基板６０と支持体６１との間のインタフェイス６２上に合焦される。補助焦点７１から反射された放射は再度対物レンズ３４によって束ねられ、光線分割器４２によって反射される。反射された放射は、光学系３１によって補助焦点７１と共焦点的な絞り５１上に合焦される。絞り５１を通過する放射は検出器２１に当たる。例示的に図示された配置において、補助焦点７１及び測定ボリューム７０は相互に軸方向及び横方向に分離して配置される。好都合なことに、図１に記述された探索及び調節機構はこの実施の形態にもまた使用できる。
【００４７】
図４は図２に示された本発明による実施の形態の変形例を示している。ここで、二つの検出器２１、２２が補助焦点７１によって反射された光に対して適用される。二つ以上の検出器の配置はまた、図１または図３による実施の形態それぞれについて使用できる。光線への露出及び測定ボリューム７０の観察についての従来の配置は、図１で議論されたように実施される。示された配置において、測定ボリューム７０及び補助焦点７１は一致するように調節される。しかしながら、レンズ３０乃至３５を異なる方法で位置決めすることにより、測定ボリューム７０と補助焦点７１との間を他の所望の距離に調節することが可能である。
【００４８】
補助焦点７１は、基板６０と支持体６１との間のインタフェイス６２上に再度位置される。インタフェイス６２で反射された放射は、対物レンズ３２及び放射分割器４１を通して検出器２１、２２の方向へ向けられる。この放射は、別の光線分割器４３によって検出器２１、２２上で分割される。両検出器は、合焦光学系３４、３５と共に絞り５１、５２の前面に配置される。これにより、絞り５１、５２は、補助焦点７１がインタフェイス６２上に置かれた時、それぞれ共焦点位置の前方または後方に配置される。もし補助焦点７１とインタフェイス６２との相互の相対位置が変更されると、検出器２１、２２は再帰反射の変化した強度分布を検出するであろう。基板６０または支持体６１の方向に置換可能な補助焦点７１の位置の変動の方向に依存して、補助焦点７１から発する放射のより高いまたはより低い強度の何れかが検出器２１または検出器２２上に当たるであろう。このため、図１に記述された探索移動は、必要とされない。
【００４９】
図５は、図２に図示された本発明による実施の形態の更に他の変形例を示す。測定ボリューム７０の放射及び観察用の従来の配置は既に議論された。図示例において、測定ボリューム７０及び補助焦点７１は一致するように調節される。しかしながら、それらの相互の相対位置は、レンズ３１の適当な位置決めによって変更できる。この場合、基板６０と近接空気６３との間の転移がインタフェイス６２として役立つ。測定ボリューム７０の発生用の対物レンズ３２は、その開口数に関して部分的に使用されるのみである。他方、補助焦点７１を発生するための光学系３２上に広い照明がある。同様に、共焦点に配置された絞り５０及びその対応する検出器２０上に測定ボリューム７０を作像する際に、光線の検出追跡の開口数は絞り５３によって制限される。この実施の形態は、測定ボリューム７０と比較してより小さなサイズの補助焦点７１に帰着する。このようにして、上述した補助焦点７１の探索移動の大きさは、測定ボリューム７０からの測定値の受け取りに関しては殆ど影響を受けずに残るように非常に小さく選択できるが、補助焦点７１のインタフェイス６２からのいかなる変位も検出できるし、修正もできる。
【００５０】
図６は、図２による発明方法を実行するための光学的配置の他の実施の形態を示す。測定ボリューム７０の放射及び観察についての従来の配置は、上記で既に議論された。その出力放射が光ファイバ８１に結合される半導体レーザが、補助焦点７１の発生のために使用されることが好ましい。光ファイバ結合４２は、図２の従来の光線分割器に対応する。この実施の形態においては、補助焦点７１の放射は図２に図示された開口絞り５１の機能を置き換える光ファイバ８０のコアに結合される。光ファイバ結合４２を通過した後、放射は光ファイバ８２によって検出器２１へ向けられる。光ファイバは、単一モードタイプでもまたは多モードタイプでも良い。
【００５１】
図７ａは、例２で述べられた抗体で混合されたテオフィリン・ビーズを示す。高解像度は、ビーズにおける蛍光性抗体の局部的に高められた濃度が溶液中にある蛍光性抗体の背景信号とは明らかに異なることを示す。図７ｂは、第２蛍光性にマークされた抗体がビーズにおいて安定せず、かつ目立って特徴的なリング構造に導かれるように、第１抗体が追加されないマイナス方向の制御を示す。
【００５２】
本発明は、以下に本発明による方法の特定の実施の形態を示す例１、及び具体的な生物学上の適用を示す例２により詳細に記述される。
【００５３】
（例１）
本例は、実質的に図６に示された配置に対応する。３ｍＷのパワーと７８０ｎｍの波長を有する半導体レーザ１１が、補助焦点７１を発生する放射源として使用される。レーザ１１の出力放射は、単一モードガラスファイバ８１によって光ファイバＹ結合４２に向けられる。結合４２の出口における他のの単一モードガラスファイバ８０は補助焦点７２用の放射を供給するためと、インタフェイス６２において反射された光の共焦点検出用に使用される。
【００５４】
４０ｍｍの焦点距離を有する色消しレンズ３１は、適用されたまたは検出された放射を束ねるためそれぞれに使用される。対物レンズ３２へ向けられた光束の収束、及びそれによる補助焦点７１の測定ボリューム７０に対する位置は、ファイバ８０の自由端と色消しレンズ３１との間の距離を変えることにより変更できる。記述された実施の形態においては、測定ボリューム７０と補助焦点７１との間の距離は色消しレンズ３１の５ｍｍの変位によって０乃至１００μｍまで調節可能である。
【００５５】
ここで使用される対物レンズ３２は、倍率４０倍及び開口数１．２を有する標準顕微鏡対物レンズである。それは光軸から１００μｍの距離に亘って、対物レンズを変位させ得る圧電転移器上に載置される。この転移器の駆動力及びここで使用される対物レンズの質量に依存してこの移動に関する制限周波数は、約４００Ｈｚである。
【００５６】
この例示の実施の形態においては、ガラス支持体６１（屈折率ｎ₁ ≒１．５２）から、この場合ポリマー性ボール（屈折率ｎ₂ ≒１．３３）の水性懸濁液からなる基板６０への転移は、表面６２と接触するように使用される。インタフェイス６２から反射された放射は、対物レンズ３２及び色消しレンズ３１を超えて再度ファイバ８０に向けられ、その光学的コアは図１乃至図５に示された開口絞り５１の機能を引き継ぎ、これにより共焦点検出を保証する。結合４２を超えて放射容量の５０％が、下流の相互インピーダンス増幅器（増幅度１０⁸ ｖ／ａ）を備えるシリアム（ｃｉｌｉｕｍ）フォトダイオードよりなる検出器２１に到達する。検出器２１の出力信号は、１４ビットアナログ−デジタル変換器によってデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）に供給される。このＤＳＰはまた、１４ビットアナログ−デジタル変換器及び下流の高電圧増幅器を通して対物レンズ３２の圧電転移器を制御する。追跡を制御するために、対物レンズは２００Ｈｚの一般的な周波数及び０．５μｍの振幅で正弦波的に上方及び下方に移動される。検出器２１によって受け取られた、この探索移動と同期する強度復調を通して、ＤＳＰはインタフェイス６２の位置と補助焦点７１の位置との間の可能な変位の方向を（正弦波移動についての時間的平均を取りながら）決定する。決定された変位は、対物レンズ３２の、正弦波移動と干渉する追跡によって補償される。
【００５７】
共焦点型測定装置において、活性消滅アバランシェ型フォトダイオードが検出器２０として使用される。ホール絞り５０は、５０μｍの直径を有する。光容量を１００μＷに低減された５４３ｎｍの波長を有するＨｅ−Ｎｅレーザが放射源１０として使用される。
【００５８】
（例２）
本例において、いわゆるｔｅｎｔａ−ｇｅｌ^TM、Ｓ ＰＨＧ−Ｇｌｙ（ＲＡＰＰポリマー）タイプのビーズが基板として使用される。それらは検体として、テオフィリン分子（Ａｌｄｒｉｃｈ）と接合される。ビーズの添加は９％であり、ビーズの５ｍｇが４４４μリットルのＰＢＳパッファ中に懸濁される。Ｌａｂ−ｔｅｋ装填カバーガラス、＃１硼珪酸塩、腐敗性、８−ウェル（Ｎｕｎｃ Ｎａｌｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ロット番号１４８１１６−０６０５）が、標本支持体として使用される。ポリクローナルラビット抗テオフィリン抗体（Ｅｕｒｏｐａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ロットNo. ８０１７１５）は、第１抗体として使用される。蛍光性にマークされた（ＴＲＩＴＣ、テトラメチルローダミン−５−（及び６）−イソチオシアン酸塩）抗ラビットＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ、ロットNo. ０７７（１０１））は、第２ロット抗体として役立つ。検定バッファ、以下ＴＮＴという、は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０よりなる。
【００５９】
検定は次のように行なわれる。即ち、８μリットルのビーズ懸濁液が第１抗体の１：２０００希釈液の１００μリットルで混合され、室温で３０分間振動された。その後、ＴＮＴバッファ（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で二回繰り返された洗浄ステップが行なわれた。第２抗体の１：５０００希釈液の１００μリットルが加えられ、室温で１時間振動された。その後２００μリットルのＴＮＴバッファが加えられた。
【００６０】
放射波長５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザが、測定ボリューム７０に関して励起光線の追跡の発生のために使用された。ＴＲＩＴＣの蛍光性スペクトルに適した帯域フィルタとして、５８０ｎｍの中間転移波長及び３０ｎｍの半値幅を有する検出側の帯域通過が使用された。
【００６１】
例２の結果が、図７ａ及び図７ｂに図示されている。得られた測定値は、先ず単一ビーズの識別及び位置決め用に役立つ画像処理ステップを受ける。このために、Ｈｏｕｇｈ変換が、記述された実施の形態に使用される。続いて、識別された各ビーズについてビーズ表面上に点をマークするそれらの測定値が決定される。このために、ビーズ表面を通る光学的な切り口がほぼ円構造に導かれるということは、この場合には期待値として、演繹的情報を好都合に使用することである。本件の場合、最大強度の測定値はそれぞれ識別されたビーズの中心から放射状に伸長する調査径路に沿って決定される。代わりに、エッジ強調及び／又は閾値分析として文献から知られる方法が、このステップにおいて使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 放射源と、一方は補助焦点からの信号を検出し、他方は測定ボリュームからの信号を検出する二つの検出器を有する共焦点型顕微鏡配置を図示する略式図である。
【図２】 本発明による他の共焦点型顕微鏡配置を図示する略式図であり、測定ボリューム及び補助焦点は相互に分離した光軸に沿って配置され、補助焦点を発生する追加の放射源を含む。
【図３】 変形例であり、分離した光学系が補助焦点及び測定ボリュームの発生のために使用され、例示的に示されるように、補助焦点と測定ボリュームは軸方向及び横方向の両方で相互に分離して位置取りすることが出来る。
【図４】 本発明の別の実施の形態を図示し、補助焦点及び測定ボリュームは同じ光学系によって新たに発生され、この変形例において、補助焦点の位置の変位の方向を検出するために、光軸に沿って相互に離間配置された二つの検出器が補助焦点によって反射された光について使用される。
【図５】 本発明の実施の形態を示し、基板から近接空気層への転移がインタフェイスとして役立ち、補助焦点及び測定ボリュームの異なる大きさは使用される対物レンズの開口数の異なるサイズによって得られる。
【図６】 ファイバ光結合を備える実施の形態を示す。
【図７】 （ａ）及び（ｂ）は、例２に図示された実績の結果を示す。

Claims (21)

1. 分子、分子複合体、ポリマー、ポリマー性粒子、無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなる少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法であって、
   少なくとも一つの検体が基板（６０）上及び／又は内に配置され、前記基板（６０）は支持体（６１）上に配置されると共に基板（６０）に近接する前記支持体（６１）を含む少なくとも一つの構成部品とは異なる屈折率を有し、
   少なくとも一つの検体は共焦点または多光子励起用に構成された少なくとも一つのデバイスを使用して測定ボリューム（７０）で走査され、前記デバイスは第１放射源（１０）と少なくとも一つの第１対物レンズ（３２）とからなり、それによって少なくとも一つの検体の特徴付けのための信号処理によって処理される光学的パラメータの測定値を受け取り、
   少なくとも一つの検体は測定値取得の間、実質的に基板（６０）または支持体（６１）またはその両方に対してその位置を維持し、
   走査プロセスの前及び／又はその間、補助焦点（７１）は少なくとも一つの第２放射源（１１）と第２対物レンズ（３４）とによって発生され、前記補助焦点（７１）は基板（６０）と近接する構成部品との間のインタフェイス（６２）上または前記検体への規定された空間関係を有する他のインタフェイス（６２）上に少なくとも部分的に配置され、
   第１放射源（１０）から発生された放射は第１光学系（３３）で平行にされ、第２放射源（１１）から発生された放射は第１光学系（３３）とは異なる第２光学系（３５）で平行にされ、
   補助焦点（７１）からの再帰反射は、共焦点配置された絞り（５１）を有する検出器（２１）、または像平面の前方及び／又は後方でしかも補助焦点（７１）を発生する第２対物レンズ（３４）の光軸に沿って配置された絞り（５１，５２）を有する複数の検出器（２１、２２）によって検出され、前記再帰反射はインタフェイス（６２）の位置の測定及びこのようにして測定ボリューム（７０）の間接的な位置決めに使用され、
   測定ボリューム（７０）に対する補助焦点（７１）の位置は規定された方法で調節されまたは調節可能であること
   を特徴とする少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法。
2. 分子、分子複合体、ポリマー、ポリマー性粒子、無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなる少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法であって、
   少なくとも一つの検体が基板（６０）上及び／又は内に配置され、前記基板（６０）は支持体（６１）上に配置されると共に基板（６０）に近接する前記支持体（６１）を含む少なくとも一つの構成部品とは異なる屈折率を有し、
   少なくとも一つの検体は共焦点または多光子励起用に構成された少なくとも一つの装置を使用して測定ボリューム（７０）で走査され、前記装置は第１放射源（１０）と少なくとも一つの対物レンズ（３２）とからなり、それによって少なくとも一つの検体の特徴つけのための信号処理によって処理される光学的パラメータの測定値を受け取り、
   少なくとも一つの検体は記録する間、実質的に基板（６０）または支持体（６１）またはその両方に対してその位置を維持し、
   走査プロセスの前及び／又はその間、補助焦点（７１）は少なくとも一つの第２放射源（１１）と対物レンズ（３２）とによって発生され、前記補助焦点（７１）は基板（６０）と近接する構成部品との間のインタフェイス（６２）上または前記検体への規定された空間関係を有する他のインタフェイス（６２）上に少なくとも部分的に配置され、
   第１放射源（１０）から発生された放射は第１光学系（３３）で平行にされ、第２放射源（１１）から発生された放射はそれとは異なる第２光学系（３１）で平行にされ、
   補助焦点（７１）からの再帰反射は、共焦点配置された絞り（５１）を有する検出器（２１）、または像平面の前方及び／又は後方でしかも補助焦点（７１）を発生する対物レンズ（３２）の光軸に沿って配置された絞り（５１，５２）を有する複数の検出器（２１、２２）によって検出され、前記再帰反射はインタフェイス（６２）の位置の測定及びこのようにして測定ボリューム（７０）の間接的な位置決めに使用され、
   測定ボリューム（７０）に対する補助焦点（７１）の位置は規定された方法で調節されまたは調節可能であること
   を特徴とする少なくとも一つの検体を光学的に検出する方法。
3. 補助焦点（７１）の共焦点検出されたボリュームの、特に対物レンズ（３２、３４）それぞれの光軸の方向での範囲は測定ボリューム（７０）の範囲よりも小さいことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 補助焦点（７１）の共焦点検出されたボリュームのより小さな範囲を取得するための補助焦点（７１）は測定ボリューム（７０）を発生するために使用される対物レンズ（３２）の開口数よりも大きい開口数を有する対物レンズ（３４）によって発生されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 補助焦点（７１）の共焦点検出されたボリュームの小さな範囲を取得するために、共通光学系またはそれぞれの対物レンズ（３２、３４）の開口数のより小さな部分が補助焦点（７１）を発生するよりも測定ボリューム（７０）を発生するために使用されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
6. 補助焦点（７１）の共焦点検出されたボリュームの小さな範囲を取得するために、共焦点配置された絞り（５１）が補助焦点（７１）の検出において使用され、前記絞り（５１）は測定ボリューム（７０）の検出において使用される共焦点配置された絞り（５０）よりも小さな開口部を有することを特徴とする請求項３に記載の方法。
7. 測定ボリューム（７０）を間接的に位置決めするために、インタフェイス（６２）に対する補助焦点（７１）の位置は補助焦点（７１）を発生する対物レンズ（３４）の光軸に実質的に沿って好ましくは周期的に移動され、検出器（２１）の移動に依存する再帰反射の強度が登録され、補助焦点（７１）の位置は再帰反射の強度がその最大値に達するような方法で再調節されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
8. 測定ボリューム（７０）を間接的に位置決めするために、インタフェイス（６２）に対する補助焦点（７１）の位置は補助焦点（７１）を発生する対物レンズ（３４）の光軸に対して横方向及び縦方向の両方に移動されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
9. 補助焦点（７１）の好ましい周期的な移動の振幅は測定ボリューム（７０）の軸範囲よりも小さいかまたは等しいことを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
10. 再帰反射の強さは少なくとも二つの検出器（２１、２２）によって検出され、インタフェイス（６２）の位置は検出器（２１、２２）によって検出された強度の分布によって決定されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
11. 散乱光強度及び／又は偏光依存散乱光強度及び／又は少なくとも一つの波長における蛍光性強度及び／又は偏光依存蛍光性強度及び／又は蛍光性耐久性及び／又は分子光度及び／又はラマン散乱及び／又はルミネッセンスは光学的パラメータとして検出されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
12. 無機または有機基板（６０）、特にポリマー性ゲル、無機材料からの成長ポリマー性粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスが使用されることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
13. 光学的パラメータによって選択された検体及び／又は基板（６０）は他の検体及び／又は基板（６０）からの走査プロセスの間またはその後に分離されることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
14. 活性成分の探索に、組合せ化学的または組合せ生物学的合成産物に、機能的ゲノム分析に、進化生物工学に、診断法に、蛋白分析または材料の調査に使用するための請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
15. 分子、分子複合体、ポリマー、ポリマー性粒子、無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなる少なくとも一つの検体を光学的に検出する請求項１に記載の方法を実行する装置であって、
    少なくとも一つの第１放射源（１０）と、
    第１対物レンズ（３２）、及び、測定ボリューム（７０）からの測定値を検出するための少なくとも一つの第１検出器（２０）を備え、共焦点にまたは多光子励起用に構成された少なくとも一つのデバイスと、
    少なくとも一つの第２放射源（１１）と、
    第２対物レンズ（３４）、及び、
    共焦点配置された絞り（５１）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための少なくとも一つの第２検出器（２１）、または、
    像平面の前方及び／又は後方にしかも補助焦点（７１）を発生する第２対物レンズ（３４）の光軸に沿って配置された絞り（５１、５２）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための複数の第２検出器（２１、２２）
    を備えた少なくとも一つのデバイスと、
    基板（６０）に対して測定ボリューム（７０）及び補助焦点（７１）を位置決めする少なくとも一つのデバイスと、
    測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を可変的に位置決めするデバイスと、
    第１放射源（１０）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）と、
    第２放射源（１１）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）とは異なる第２光学系（３５）と
    を備えたことを特徴とする請求項１に記載の方法を実行する装置。
16. 分子、分子複合体、ポリマー、ポリマー性粒子、無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなる少なくとも一つの検体を光学的に検出する請求項２に記載の方法を実行する装置であって、
    少なくとも一つの第１放射源（１０）と、
    対物レンズ（３２）、及び、測定ボリューム（７０）からの測定値を検出するための少なくとも一つの第１検出器（２０）を備え、共焦点にまたは多光子励起用に構成された少なくとも一つのデバイスと、
    少なくとも一つの第２放射源（１１）と、
    同じ対物レンズ（３２）、及び、
    共焦点配置された絞り（５１）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための少なくとも一つの第２検出器（２１）、または、
    像平面の前方及び／又は後方にしかも補助焦点（７１）を発生する対物レンズ（３２）の光軸に沿って配置された絞り（５１、５２）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための複数の第２検出器（２１、２２）
    を備えた少なくとも一つのデバイスと、
    基板（６０）に対して測定ボリューム（７０）及び補助焦点（７１）を位置決めする少なくとも一つのデバイスと、
    測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を相対的に位置決めするデバイスと、
    第１放射源（１０）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）と、
    第２放射源（１１）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）とは異なる第２光学系（３１）と
    を備えたことを特徴とする請求項２に記載の方法を実行する装置。
17. 分子、分子複合体、ポリマー、ポリマー性粒子、無機材料からの成長粒子、多孔質構造、細胞、バクテリア及びウイルスからなる少なくとも一つの検体を光学的に検出する請求項１に記載の方法を実行する装置であって、
    少なくとも一つの第１放射源（１０）と、
    第１対物レンズ（３２）、及び、測定ボリューム（７０）からの測定値を検出するための少なくとも一つの第１検出器（２０）を備え、共焦点にまたは多光子励起用に構成された少なくとも一つのデバイスと、
    第２対物レンズ（３４）、及び、
    共焦点配置された絞り（５１）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための少なくとも一つの第２検出器（２１）、または、
    像平面の前方及び／又は後方にしかも補助焦点（７１）を発生する第２対物レンズ（３４）の光軸に沿って配置された絞り（５１、５２）を有する補助焦点（７１）からの再帰反射を検出するための複数の第２検出器（２１、２２）
    を備えた少なくとも一つのデバイスと、
    基板（６０）に対して測定ボリューム（７０）及び補助焦点（７１）を位置決めする少なくとも一つのデバイスと、
    測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を相対的に位置決めするデバイスと
    を備え、
    補助焦点（７１）は規定された方法で測定ボリューム（７０）に対して調節され、更に、
    第１放射源（１０）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）と、
    第２放射源（１１）によって発生された放射を平行にする第１光学系（３３）とは異なる第２光学系（３１）と
    を備えたことを特徴とする請求項１に記載の方法を実行する装置。
18. 基板（６０）に対して測定ボリューム（７０）及び補助焦点（７１）を位置決めするデバイスは、測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を位置決めする手段を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
19. 測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を位置決めするデバイスは対物レンズ（３２、３４）の相対的位置を調節する手段を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
20. 測定ボリューム（７０）に対して補助焦点（７１）を位置決めするデバイスは、補助焦点（７１）及び測定ボリューム（７０）を発生するために、それぞれの対物レンズ（３２、３４）によって合焦されるそれらの光束の集束を変化させるための手段を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
21. 活性成分の探索、組合せ化学的または組合せ生物学的合成産物、機能的ゲノム分析、進化生物工学、診断法、蛋白分析の研究にまたは材料の調査における請求項１５に記載の装置の使用。

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