WO2008052489A1 - Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) - Google Patents

Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) Download PDF

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Definitions

  • the present invention is related to the field of biotechnology and the pharmaceutical industry, in particular with the development and application of recombinant polypeptide molecules related to antibodies, which specifically recognize Vascular Endothelium Growth Factor-A (in English “Vascular Endothelial Growth Factor-A", abbreviated VEGF-A) human (Ferrara, N. et al. 2003. Nature Medicine 9: 669-676) and interfere with its in vitro and pro-angiogenic stimulatory effects in vivo.
  • scFv single-chain Fv type antibody fragment
  • Fab antibody fragment a Fab antibody fragment
  • ScFv 2 -Fc full antibody bivalent recombinant molecules
  • angiogenesis The process of formation of new blood vessels from those preexisting is called angiogenesis, which is regulated by a balance of pro-angiogenic and anti-angiogenic factors.
  • diseases whose course has been related to the induction of pro-angiogenic factors and the formation of new blood vessels abnormally are: cancer (both primary tumors and their metastases), acute and chronic inflammatory processes such as asthma, respiratory distress, endometriosis, atherosclerosis, tissue edema, infectious diseases such as hepatitis and Kaposi's sarcoma, autoimmune diseases such as diabetes, psoriasis, rheumatoid arthritis, thyroiditis, and several other diseases and conditions such as Diabetic and newborn retinopathy, organ transplant rejection, age-related macular degeneration (wet variant), neovascular glaucoma, hemangiomas and angiofibromas (Carmeliet, P. and Jain, RK. 2000. Nature 407 : 249-257; Kuwano M,
  • Ranibizumab is a recombinant Fab antibody fragment, caused by manipulation of Bevacizumab by genetic engineering. Intravitreal injection of Ranibizumab neutralizes locally produced VEGF-A and affects neo-angiogenesis in the deep retina, which is the basis of this disease.
  • Vascular endothelial growth factors are a family of molecules that directly and specifically induce the formation of new vessels (Leung, D. et al. 1989. Science 246: 1306-1309).
  • This family includes the vascular permeability factor, also known as the vascular endothelial growth factor (in English “Vascular Permeability Factor”, abbreviated VPF) (now called VEGF-A), the placental growth factor (in English “Placental Growth Factor ", abbreviated PIGF), platelet-derived growth factors (abbreviated PDGF), PDGF-A and PDGF-B, and other molecules structurally and functionally related to VEGF-A, which they have been called VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, and VEGF-E (Olofsson, B.
  • VEGF-A is a homodimeric glycoprotein formed by two 23 kDa subunits (Ferrara, N. et al. 1989. Biochem Biophys Common Res 161: 851-858) of which there are 5 monomersical isoforms derived from the differential splicing of a same ribonucleic acid (RNA). These include two isoforms that remain attached to the cell membrane (VEGF 189 and VEGF 206) and three of a soluble nature (VEGF 121, VEGF 145, and VEGF 165).
  • VEGF 165 isoform is the most abundant in mammalian tissues, except in lung and heart, where VEGF 189 predominates (Neufeld G et al. 1995. Canc Met Rev 15: 153-158), and in placenta, where expression prevails of VEGF 121 (Shibuya, M. 1995. Adv Cancer Res 67: 281- 316).
  • VEGF-A is the most studied and characterized protein of this family, and its alteration has been described in a greater number of diseases. Its over expression is associated with tumors of different origin and location and their metastases (Grunstein, J. et al. 1999. Cancer Res 59: 1592-1598), chronic inflammatory processes such as ulcerative colitis and Chron disease (Kanazawa, S. et al. 2001. Am J Gastroenterol 96: 822-828), psoriasis (Detmar, M. et al. 1994. J Exp Med 180: 1141-1146), respiratory distress (Thickett, DR. et al. 2001.
  • VEGFR2 receptor (KDR / Flk1) mediates the biological effects of VEGF-A, and also binds to VEGF-C and VEGF-D ligands. This receptor is expressed differentially in the active endothelium and in some cell lines of tumor origin where it establishes autocrine bonds with the secreted VEGF.
  • KDR / Flk1 The VEGFR2 receptor (KDR / Flk1) mediates the biological effects of VEGF-A, and also binds to VEGF-C and VEGF-D ligands.
  • This receptor is expressed differentially in the active endothelium and in some cell lines of tumor origin where it establishes autocrine bonds with the secreted VEGF.
  • their over-expression in particular has been related to the progression: of endometrial cancer (Giatromanolaki, A. et al. 2001. Cancer 92: 2569-2577), of malignant mesotheliomas (Strizzi, L. e
  • KDR KDR-induced hypersensitivity reactions
  • VEGF-A and / or its receptors are blockade of VEGF-A and / or its receptors, highlighting among the approved products or in clinical trials the following: (1) monoclonal antibodies blocking VEGF-A or KDR receptor, (2) inhibitors of metalloproteinases, such as Neovastat and Prinomastat, (3) inhibitors of VEGF such as Thalidomide, Suramin, Troponin I 1 IFN- ⁇ and Neovastat, (4) VEGF receptor blockers such as SU5416, FTK787 and SU6668), (5) tumor endothelial apoptosis inducers such as Endostatin and CA4-P, and (6) ribozymes that decrease VEGF expression or of its receptors (Angiozyme).
  • the present invention describes recombinant polypeptide molecules related to antibodies comprising variable regions (RV) of human immunoglobulins encoded by the nucleotide sequences SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8, or homologous sequences; that recognize an epitope in human VEGF-A defined around, although not necessarily limited to, residues C102, C57, R56, T31 and L32; and interfere with its pro-angiogenic effect.
  • RV variable regions
  • Antigen binding sites these molecules are formed by one or more antigen binding sites, these sites consisting of amino acids encoded by DNA sequences of heavy and light chain variable regions of human immunoglobulins.
  • Recombinant antibodies Describes an immunoglobulin or parts thereof partially or totally synthetically produced (via recombinant dexosiribonucleic acid (DNA) or artificial gene synthesis) with specific recognition of an antigen through one or more domains that interact with it (formed by particular combinations of variable regions of heavy and light chains of immunoglobulins, and commonly referred to as the antigen binding site) (Gavilondo and Larrick. 2000. Biotechniques 29: 128-136,).
  • recombinant antibodies are the so-called chimeric and humanized antibodies, in which the variable regions (or parts thereof) obtained from one species are associated by genetic engineering, with constant regions of immunoglobulins from another species.
  • Recombinant antibodies also include genetically engineered antibody fragments that comprise one or more antigen binding sites.
  • Examples of recombinant antibody fragments are: (i) the Fab fragment that includes the VL, VH, CL and CH1 domains of an immunoglobulin; (ii) the Fd fragment, which consists of the VH and CH 1 domains; (iii) the Fv fragment, which consists of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) the scFv fragment, where the VH and VL domains of a single antibody bind in different sequence (VH-VL or VL-VH) with a peptide binding segment (linker) that allows the two domains to associate to form a antigen binding site (Bird et al. 1988. Science 242: 423-426;
  • fragments such as scFv and Fab
  • antibody libraries where a broad repertoire of genes (either synthetic or natural) from the variable regions of a species are randomly combined to produce particular associations of variable regions of antibodies, which are then exposed on the surface of filamentous phages.
  • Recombinant antibodies are also the "antibody-like" molecules produced by genetic engineering when antibody fragments are artificially assembled to constant regions of antibodies.
  • a bivalent "antibody-like" molecule by attaching a scFv to a region formed by the hinge domains, CH2, CH3 and sometimes CH4 of the Fc of an immunoglobulin, which depending on having all or part of the regions described and of its degree of glycosylation, it can exhibit effector functions associated with the Fc of immunoglobulins.
  • the first term describes the part of an antibody that interacts specifically with an antigen (or part thereof).
  • an antibody can bind only to a particular part of the antigen, whose part is called an epitope.
  • An antibody binding site is mainly formed by two antibody variable regions, the light chain variable region and the heavy chain variable region.
  • the antibody binding site is formed by the non-covalent interaction of the variable regions.
  • the binding site of an antibody can be artificially stabilized by binding the two variable regions with a binding peptide (linker) that does not interfere with its antigen-specific recognition properties. This is the case of a scFv type fragment.
  • the antibody binding sites are assembled by means of the non-covalent interaction of the variable regions, which is reinforced by the non-covalent interaction of the CH1 and CL domains (kappa or lambda) that follow in the structure of the native molecule to the heavy and light chain variable regions, respectively.
  • the complete native antibodies possess two identical antigen binding sites.
  • the epitope recognized by the binding site of an antibody in the case of the antigen being a protein, may be formed by a linear sequence of amino acids, or be conformational, it being understood that the amino acids recognized by the binding site of the antibody they are close in the tertiary structure of the protein, but they are not necessarily sequential in their primary structure. In the case of proteins, the epitope is by nature a discrete zone, defined by a particular group of amino acids that interact with those of the antibody through non-covalent linkages.
  • variable regions for example, one is derived from the other thanks to mutations that can be more or less extensive
  • they can have sequences of totally different variable regions.
  • the latter is due to the fact that the specific interactions between antibodies and antigens, especially in the case of proteins, are produced by surface interactions, that is, the formation of non-covalent bonds (hydrogen bonds, van der Waals and the like) between amino acid residues of the variable regions (although some residues structurally close to these may participate discreetly).
  • homologous antibody must therefore be able to specifically identify the particular epitope recognized by another antibody.
  • the term "homologue” is extensible to other forms of antibodies included in the definitions above for recombinant antibodies (antibody fragments, "antibody type” molecules, and others).
  • the antibody-related recombinant polypeptide molecules are: a human single chain Fv (scFv) antibody fragment (scFv 2H1), a Fab antibody fragment (Fab 2H1-32) and "full antibody” type bivalent molecules ScFv 2 -Fc (ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 - Fc 2H1 8.2).
  • scFv human single chain Fv
  • Fab 2H1-32 Fab antibody fragment
  • ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 - Fc 2H1 8.2 "full antibody” type bivalent molecules ScFv 2 -Fc
  • different RVs spontaneously assemble each other to form antigen binding sites.
  • artificial binding segments (linkers) or other antibody-related sequences can contribute, such as constant domains of the immunoglobulins.
  • the RVs are derived from those contained in an scFv that was isolated from a library of human scFv antibody fragments deployed on the surface of filamentous phages, constructed exclusively using an RV repertoire of human lambda chains. Thanks to the strategy employed, the recombinant polypeptide molecules related to antibodies described in this invention have VR of immunoglobulins with novel DNA sequences and different from those reported by other authors who have also obtained antibodies that neutralize the pro-angiogenic action of VEGF-A , such as those derived from hybridomas (Kim, KJ. et al. 1992. Growth Factors 7: 53-64; Muller, Y. et al. 1997.
  • anti-angiogenic effects that are obtained with the application of the recombinant polypeptide molecules described in this invention, and their variants equivalent, they occur because they interfere with the interaction of human VEGF-A with the receptors present in activated vascular endothelial cells, which influences their ability to proliferate and maintain their physiological stability.
  • "equivalent variants” are those polypeptide molecules derived from other associations and manipulations of the sequences contained in the RV 2H1 RVCP (SEQ ID No. 7) and 2H1 RVCL (SEQ ID No. 8) and other RV homologs contained in this invention (SEQ ID No.
  • polypeptide molecules that retain the ability to specifically recognize human VEGF-A and to interfere with its biological effect of stimulating the growth of endothelial and pro-angiogenic cells.
  • polypeptide molecules can take the form of other recombinant antibody fragments, such as an scFv where the VL domain is preceded to VH, or where other binding segments known in the state of the art are used, or as F fragments (ab ') 2, Fabc, Facb, dimeric, trimeric and tetrameric scFv (Winter G, Milstein C. 1991. Nature 349: 293-299; WO94 / 13804; de Haard, H et al. 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31 : 5-31).
  • multivalent molecules are produced (Bestagno M et al. 2001. Biochemistry 40: 10686-10692).
  • they may be in the form of bispecific antibody molecules, where a portion thereof retains its specificity for human VEGF-A and another has a different specificity, or in the form of complete antibodies, where these sequences are associated with constant regions of human immunoglobulins or other species. All these manipulations by genetic engineering are known to those skilled in the art.
  • Equivalent variants are also considered those molecules or variants produced by the so-called CDR transplant in which the sequences of the CDRs contained in the RV 2H1 RVCP (SEQ ID No. 7) and 2H1 RVCL (SEQ ID No. 8) and others Homologous RVs, such as those contained for example in SEQ ID No. 13, are artificially placed within the framework of sequences other than the original ones flanking them, as is revealed, for example, in EP-B-0239400, EP-A -184187, GB 2188638A or EP-A-239400, and that this manipulation does not affect its ability to specifically recognize human VEGF-A and interfere with the growth of endothelial cells and pro-angiogenesis.
  • the recombinant polypeptide molecule in the form of an scFv fragment specifically recognizes different isoforms of human VEGF-A.
  • the heavy and light chain RVs of human immunoglobulins are genetically linked in that order by a binding segment (linker) of 16 amino acids, to form the DNA sequence described in SEQ ID No 6.
  • the scFv 2H1 fragment It was obtained from a homologous scFv that we call scFv 2H1-F, selected from a scFv library deployed in filamentous phages, constructed using an RV repertoire of human lambda chains, by methods similar to those already described (Rojas G, et al 2005. Biochem Biophys Common Res 336: 1207-1213).
  • the intentional bias in the light chain RV repertoire of the library used was designed to increase the probability of finding antibodies different from those reported by other authors, and that neutralize VEGF-A by mechanisms other than those already identified.
  • a fusion protein was used containing Ia 121 of human VEGF-A, which has been mutated in three residues, R82, K84, H86 that were replaced by glutamic acid; so that it affects their interaction with the KDR receptor (Shen, B. et al. 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985), as demonstrated in the Example!
  • This recombinant fusion protein (called P64 47aa- VEGF, SEQ ID No. 3) was produced in bacteria, purified in a similar way to those molecular species that possess the in vitro biological activity corresponding to human VEGF-A.
  • the antigen used in the present invention is different from antigens or immunogens used by other authors who have sought monoclonal or recombinant antibodies that recognize human VEGF.
  • the P64K protein domain of Neisser ⁇ a meningitidis located at the N-terminal end of P64 47aa- VEGF, increases immunogenicity, allows high levels of expression in E. co // and that dimeric forms such as those that manifest the biological activity occur of human VEGF.
  • the mutated area comprises an epitope already recognized by other antibodies reported as neutralizing the biological functions of VEGF-A (Muller, Y. et al. 1997. Proc Nati Acad Sci USA 94: 7192-7197; Muller, AY. Et al. 1998.
  • the DNA sequence of the scFv 2H1-F fragment obtained from the library was cloned from the corresponding fagomide vector into an expression vector for periplasm.
  • the scFv 2H1 with apparent molecular weight somewhat above 29 kDa, is recovered from the culture medium and the periplasm of the transformed bacteria, and is easily purified by metal ion affinity chromatography (in English "Metal ion affinity chromatography, abbreviated IMAC) (Porath J. 1992. Prot. Expr. Purif.
  • the expression vector pACR.1 adds to the C-terminal end of the scFv 2H1 molecule a c-myc peptide domain that serves as "brand” for analytical purposes, followed by a domain of six histidines to facilitate purification by IMAC.
  • Fab 2H1-32 The recombinant polypeptide molecule in the form of a Fab fragment specifically recognizes different isoforms of human VEGF-A.
  • the DNA sequences encoding the RVF of scFv 2H1, designated 2H1 RVCP (SEQ ID No. 7) and 2H1 RVCL (SEQ ID No. 8) were cloned into the vector pFabHum-1, where they were genetically associated to the CH1 and C ⁇ constant regions of human IgG immunoglobulins, respectively, as described in SEQ ID No. 10 and SEQ ID No. 9.
  • Plasmid pFabHum-1 is a bicistronic vector constructed for the expression of Fab fragments with constant regions.
  • the polypeptide chains produced comprise the RV and its particular light or heavy constant region, which are assembled to form a Fab fragment in the bacterial periplasm, where they are exported from the cytoplasm thanks to signal peptides provided by the vector.
  • the periplasmic Fab assembly is based on non-covalent interactions between heavy and light chain RVs, and between the CH1 and C ⁇ domains, and is reinforced by a covalent disulfide bond between two cysteines located near the C-terminal of the CH1 regions and C ⁇ , also contributed by the vector.
  • Fab 2H1-32 has an apparent molecular weight of 50 kDa.
  • the "complete antibody" bivalent recombinant polypeptide molecules called ScFv 2 -Fc 2H1-8.2 and ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 comprise the RV sequences of scFv 2H1, associated with a sequence encoding 10 spacer amino acids, followed by Ia nucleotide sequence coding for the hinge, CH2 and CH3 regions of an IgGI-type human immunoglobulin (SEQ ID No. 14) and a sequence very similar to the previous one (SEQ ID No. 13), with only slight changes of bases in the RVs, respectively.
  • the pVSJG-HucFc vector is designed for the expression of "complete antibody" type molecules that comprise two identical scFvs associated with an IgG type human immunoglobulin Fc, in mammalian cells.
  • the polypeptide chain that gives rise to these bivalent molecules is transported to the endoplasmic reticulum of mammalian cells thanks to an immunoglobulin signal peptide present in the vector pVSJG-HucFc.
  • the peptide is removed in the endoplasmic reticulum and two identical polypeptide chains are covalently associated through the disulfide bonds in the hinge regions, which is reinforced by the non-covalent interactions of the CH2 and CH3 regions.
  • the molecules ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1-8.2 have a similar apparent molecular weight of between 100 and 120 kDa.
  • Secreted proteins have four additional amino acids (QVLK) contributed by the vector.
  • the recombinant antibodies of the invention can also be produced in other eukaryotic systems, such as transgenic plants (Pujol , M. et al. 2005. Vaccine 23: 1833-1837).
  • the recombinant polypeptide molecules described above specifically recognize isoforms 121 and 165 of human VEGF-A, and do not identify mouse VEGF. They can bind to soluble human VEGF-A, to human VEGF-A adsorbed on solid surfaces, or to human VEGF-A associated or close to human cells that produce it, among the latter those present in human tumors growing in nude (athymic) mice.
  • the polypeptide molecules of the present invention are capable of interacting with the active human VEGF-A, so that interfere with the growth of human endothelial cells in vitro, and in vivo neo-angiogenesis processes, the latter measured by plug models of subcutaneous Matrigel in mice, and of human tumor cell transplantation in congenital athymic mice ( nudes)
  • the recombinant polypeptide molecules described in the invention do not recognize mouse VEGF-A, and effectively interfere with the association between human VEGF-A and a soluble form of the KDR receptor.
  • scFv 2H1 and ScFv 2 -Fc 2H 1-4.1 polypeptide molecules prevents the appearance of choroidal neovascularization (NVC), or improves its evolution, in an experimental model of non-human primate where NVC is produced by laser photocoagulation.
  • Fab 2H1-32 ScFv 2 -Fc 2H1- 8.2 polypeptide molecules can also produce similar effects on NVC, taking into account that their specificity for human VEGF is similar to that of scFv 2H1 and ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 polypeptide molecules. , and have anti-angiogenic effect on the other models in vitro and in vivo.
  • the recombinant polypeptide molecules of the present invention can be conjugated or coupled to an enzyme or its fragments, to a modifier of the biological response, to a toxin or drug, or to radioactive isotopes, which add to the original molecule an additional functional characteristic to that of bind to the human VEGF-A antigen, this being the ability to identify and / or affect the viability of cells that are in an anatomical area of a multicellular organism where there is a high concentration of human VEGF-A, or in its immediate vicinity , or Ia to interact with forms of VEGF-A that are associated with the cell membrane.
  • the polypeptide molecules object of this invention while having the ability to recognize and interact with human VEGF-A and to interfere with its pro-angiogenic effect and stimulation of endothelial cell proliferation, may also affect other biological functions described.
  • human VEGF such as those in which this molecule acts in the negative regulation of the immune response (Chouaib S et al. 1997. Immunology Today 18: 493-497).
  • a set of elements make the polypeptide molecules object of the present invention novel with respect to other antibodies and antibody fragments that neutralize human VEGF-A. Among these elements are:
  • the base sequences encoding the RVs that make up the antigen binding sites of the polypeptide molecules described in this invention have not been reported before, and differ from those of other anti-VEGF-A antibodies.
  • the sequence of the CDRs, in particular the CDR3 of the heavy chain RV differs markedly from others previously reported that are rich in the aromatic amino acids tyrosine and / or tryptophan, which has been related to the recognition of a certain epitope ( Fellouse FA et al. 2004. PNAS 101: 12467-12472).
  • the CDR3 of the heavy chain RV does not have tyrosines.
  • polypeptide molecules described in this invention are very dependent for their recognition of human VEGF-A that it possesses a biologically active dimeric conformation, as evidenced by the loss of recognition after treatment of VEGF-A with reducing agents.
  • the polypeptide molecules described in this invention recognize a conformational epitope in human VEGF not described above, when compared to epitopes reported for other antibodies and antibody fragments that neutralize the biological functions of human VEGF-A (Muller Y et al. 1997. PNAS 94: 7192-7197; Muller AY. et al. 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaeppi J.-M. et al. 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Fuh G et al. 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; WO2005012359).
  • Example 9 the in silico analysis of the probable associations between the peptide sequence specifically selected by the scFv 2H1 antibody fragment, from a combinatorial library of 12 amino acid linear peptides, and the known data of the structures primary and tertiary of human VEGF-A; suggest that the scFv 2H1 antigen binding site is Interacting with a conformational epitope in the human VEGF-A molecule.
  • the zone recognized in the tertiary structure of VEGF-A does not coincide with the epitopes described for other antibodies and antibody fragments that neutralize human VEGF-A, and is therefore novel.
  • This epitopic definition also opens up new possibilities of knowledge about the complex interaction between human VEGF-A and its KDR receptor, which is not yet resolved.
  • the polypeptide molecules scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc 2H 1-8.2 described in the present invention, and their equivalent variants, are capable of interacting with the active human VEGF-A, and interfere with its effect of stimulation of neo-angiogenesis.
  • angiogenesis diseases that occur with an abnormal and excessive angiogenesis
  • cancer both primary tumors and their metastases
  • eye diseases such as age-related macular degeneration, wet variant, neovascular glaucoma, and diabetic and newborn retinopathy
  • acute and chronic inflammatory processes such as asthma, respiratory distress, endometriosis, atherosclerosis, and tissue edema
  • infectious diseases such as Hepatitis and Kaposi's sarcoma
  • autoimmune diseases such as diabetes, psoriasis, rheumatoid arthritis, thyroiditis
  • several other diseases and conditions such as organ transplant rejection, hemangiomas and angiofibromas.
  • Another aspect of the present invention is the use of the molecules described in the present invention to produce a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis and the treatment of pathological conditions associated therewith.
  • Said treatment comprises the administration of an effective amount of the molecules described in the present invention to a human being.
  • these recombinant polypeptide molecules that recognize human VEGF are useful for the treatment of malignant neoplastic processes and their metastases. In a preferred embodiment, they are effective in the treatment of carcinomas, sarcomas and vascularized tumors.
  • the application of molecules described in this invention had the effect of inhibiting the growth of a human carcinoma, transplanted to nude nude mice.
  • tumors that can be treated with this strategy include (but are not limited to): epidermoid tumors, squamous tumors such as head and neck tumors, colorectal tumors, prostate tumors, breast, lung (including small and non-small cell), pancreas, thyroid, ovary and liver.
  • Kaposi's sarcoma central nervous system neoplasms (neuroblastomas, capillary hemangioblastomas, meningiomas and brain metastases), melanomas, renal and gastrointestinal carcinomas, rhabdomyosarcoma, glioblastomas, and leiomyosarcomas.
  • the recombinant polypeptide molecules described in the present invention have an epitopic recognition of human VEGF-A that distinguishes them from Bevacizumab as presented in Example 5, and therefore they are different in terms of how to interfere in the union between human VEGF-A and its receptor, they can develop therapeutic effects in vivo different from other molecules that also act by inhibiting this interaction. It is well documented that it is possible to achieve different therapeutic effects in vivo, including the side effects of the treatment, by antibodies produced against the same antigen, but that recognize different epitopes, or that have different affinity (Alian DGP 2005. The Oncologist 10: 760- 761,).
  • antibodies and antibody fragments such as Ranibizumab and Bevacizumab
  • Ranibizumab and Bevacizumab have application in the treatment of other diseases that occur with excessive angiogenesis (Gaudreault, J. et al. 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733 ; Costa, RA et al. 2006. Investig Ophthalmol Visual Sci 47: 4569-4578).
  • the recombinant polypeptide molecules described are useful in the treatment of age-related macular degeneration, wet variant.
  • the scFv 2 -Fc 2H 1-4.1 molecule is smaller in molecular size than Bevacizumab, which gives it advantages.
  • the described recombinant polypeptide molecules, or their equivalent variants are used in in vivo diagnostic procedures for forms of human cancer that express VEGF, such as, for example, adenocarcinomas of the colon, lung or breast, and others.
  • the polypeptide molecules specific to human VEGF-A described in this invention can be radiolabeled, and injected in the form of agents that allow to obtain demonstrative images of the presence and location of tumors expressing VEGF-A in man.
  • a polypeptide molecule such as those described in this invention is associated with a radioactive isotope and the binding of these to the tumor is determined.
  • the method may comprise the administration of the radiolabeled polypeptide molecule to an individual.
  • the scFv 2H1 fragment radiolabelled with 125 I binds to human VEGF-A expressed by human tumor cells transplanted to nude nude mice and specifically accumulates in the tumor area. Reactivity with tissues that abnormally express high amounts of human VEGF-A can be detected by any appropriate means.
  • a radionuclide such as 125 I, 111 In or 99m Tc
  • these are preferably located in the tumor, and not in normal tissues, the presence of radioactive marking in the tumor tissue It can be detected and quantified using a ganma camera or a ganma counter.
  • the quality of the tumor image obtained correlates directly with the signal: background relationship (Goldenberg DM. 1992. Int. J. of Biol. Markers, 7; 183-188).
  • the experimental use of 125 I is exemplified in this invention, but does not limit the use of other different radionuclides.
  • the polypeptide molecules described in the present invention once radiolabeled, provide a beneficial therapeutic effect for the patient, by staying in the area of the tumor producing VEGF -A human and affect both tumor cells, and those that make up only the tumor blood vessels, as well as other cellular elements of the tumor stroma that produce VEGF-A.
  • the polypeptide molecules described in the present invention, or their equivalent variants, coupled to other agents may be the basis of treatment methods that comprise their administration as drugs or pharmaceutical compositions.
  • these molecules chemically coupled or by genetic engineering to therapeutic radionuclides, toxins, drugs or modifiers of the biological response, can direct the therapeutic effect of the elements coupled to anatomical areas with an abnormally high concentration of human VEGF-A, such as It can be a tumor and its immediate vicinity, and exert a therapeutic effect.
  • the amount to be administered, the frequency and intervals of administration depend on the nature and severity of the disease being treated, and these decisions are the responsibility of specialists and other doctors in medicine, which are based on what is already known in this field of The technique
  • compositions of the present invention can be administered in isolation or in combination with other treatments, either simultaneously or sequentially, which depends on the disease to be treated.
  • Pharmaceutical compositions comprise, in addition to the active ingredient, an accepted pharmaceutical excipient, buffer, stabilizer or carrier, or other materials well known to those skilled in the art. These materials are not toxic, do not interfere with the efficacy of the active ingredient, and their precise nature depends on the route of administration, be it oral, mucosal, or parenteral, for example, intravenous injection.
  • the molecules described in the present invention are produced by the expression of the nucleic acid that encodes them. Therefore, the nucleic acid sequences that code for any of the polypeptide molecules described above and the methods for
  • nucleic acid encodes, primarily (but not exclusively), for the base sequences exemplified for the scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and molecules.
  • appropriate vectors can be chosen or constructed containing the regulatory sequences appropriate to the case, including promoter, terminator, enhancer (enhanceia, polyadenylation, marker genes and other relevant sequences.
  • Vectors may be plasmidiums.
  • Figure 1 Scheme of plasmid pACR.1, used for the production of soluble scFv fragments in the periplasm and culture medium of E. coli.
  • the vector has a LacZ promoter, a ribosome binding site (abbreviated Ribosome Binding Site, abbreviated RBS) and the signal peptide (SP) pe / B.
  • Figure 2. DNA sequence (SEQ ID No.6) encoding the scFv 2H1 recombinant antibody fragment, produced in the E. coli pACR.1 vector.
  • the first 354 bases make up the human immunoglobulin heavy chain variable region (RV) (called 2H1 RVCP, SEQ ID No.7), followed by 48 bases that code for the linker segment, which continue with 333 bases that encode for human immunoglobulin light chain RV (called 2H1 RVCL, SEQ ID No. 8), to terminate with 69 bases that code for the amino acids provided by the cloning site, the c-myc peptide and six histidines contained in the vector.
  • the underlined bases represent the CDR annotations, according to Kabat et al.
  • FIG. 3 Results of the expression of scFv 2H1 in E. coli BL-21. From left to right the molecular weight pattern is observed (66, 45, 35, 29, 20 and 14.2 kDa; lane 1); a scFv control (scFv M3; lane 2), the culture supernatant of the bacteria transformed with the plasmid pACR.1-scFv 2H1 (lane 3), where a reinforced band is seen that migrates somewhat above 29 kDa, and in lane 4, the culture supernatant of the bacteria transformed with plasmid pACR.1 without the insert.
  • Figure 4 Results of the purification of scFv 2H1 by IMAC.
  • Figure 4A is an electrophoresis in polyacrylamide gels (in English "Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide GeI Electrophoresis", abbreviated SDS-PAGE) at 12% where they are seen, from left to right: A control scFv (scFv M3), of size molecular of about 29 kDa (lane 1), Starting material containing scFv 2H1 (lane 2), and scFv 2H1 eluted with high purity (lane 3).
  • scFv M3 A control scFv (scFv M3), of size molecular of about 29 kDa (lane 1), Starting material containing scFv 2H1 (lane 2), and scFv 2H1 eluted with high purity (lane 3).
  • B a Western blot is observed made from a replica of the previous electrophoresis.
  • the monoclonal antibody 9E10 was used for the detection, which identifies
  • Figure 6. Scheme of plasmid pFabHum-1, used for the production of soluble Fab fragments in the periplasm and culture medium of E. coli.
  • Figure 7. DNA sequence (SEQ ID No. 9 and SEQ ID No. 10) of the two chains that encode to form the mature molecule of the Fab 2H1-32 antibody fragment that is assembled in the bacterial periplasm.
  • Figure 7A and in the 5'-3 'sense the coding sequence for a variable region of immunoglobulin light chain appears, followed by the coding sequence of a C ⁇ domain of immunoglobulin.
  • the underlined bases represent the CDR annotations in the order: CDR1 of light chain RV (RVL), CDR2 of RVL and CDR3 of RVL.
  • FIG. 7B the coding sequences for a heavy chain variable region of immunoglobulins, a human immunoglobulin CHI domain, six histidines and a c-myc peptide appear.
  • the underlined bases represent the CDR annotations, in the order: CDR1 of heavy chain RV (RVP), CDR2 of RVP and CDR3 of RVP.
  • Figure 8 Plasmid map pVSJG-HucFc, used to obtain "complete antibody” divalent molecules, from the cloning of scFv fragments between the restriction sites AfI Il and Xba I ( Figure 8A). Schematic representation of the type of molecule that is produced by mammalian cells transfected with this plasmid, once a given scFv fragment has been cloned into it ( Figure 8B).
  • Figure 9 DNA sequence (SEQ ID No. 13) that codes for the mature antibody type molecule called ScFv 2 -Fc 2H1-4.1.
  • a heavy chain variable region of immunoglobulins appears, followed by a binding segment (linker) and a light chain variable region of immunoglobulins, to terminate in this order with a spacer that codes for 10 amino acids, and the CH2 and CH3 domains of an IgGL-type human immunoglobulin
  • the underlined bases represent the CDR annotations in the order (top to bottom): Heavy-chain RV CDR1 (RVP), RVP CDR2, RVP CDR3 , Light chain RV CDR1 (RVL), RVR CDR2 and RVL CDR3.
  • Figure 11 Specific recognition of the peptides on phages, in terms of the binding site of the scFv 2H1 fragment, in an ELISA type test where the binding to the adsorbed fragment to a solid surface was evaluated in the presence of an excess of VEGF (Peprotech).
  • the Figure shows 10 clones of peptide-carrying phages, representative of the behavior exhibited by the 35. In the experiment, phage samples were incubated or not with VEGF in solution.
  • Figure 12 Mapping of the residues that mainly define the epitope recognized in the VEGF-A molecule by scFv 2H1, in comparison with those described for other antibodies.
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor-A
  • the two identical molecules of the dimer appear as light gray and black.
  • the position of the residues defined as the main indicative of the epitope recognized by scFv 2H1 are marked only in the light gray chain, and appear in black, representing Van der Waals (VDW).
  • Residues recognized by other antibodies are marked as light gray VDW in Figures A to Ia D.
  • Figure 12E shows the position of contiguous amino acids (in light gray VDW) that are different when comparing the sequences of human and mouse VEGF-A, in relation to the position of the epitope defined by the main indicative residues for scFv 2H1 (in black VDW).
  • Figure 13 Capacity of scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1 8.2 molecules to interfere with the stimulatory effect of human VEGF-A on the growth of human endothelial cells of the umbilical cord (HuVEC).
  • Figure 14 Anti-tumor activity of the scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1 8.2 molecules at the doses of: 2.5 mg / kg of weight (Figure 14A) and 25 mg / kg of weight ( Figure 14B). The points in the curves refer to the average of the volumes estimated for the 5 animals / group. Negative control: unrelated monoclonal antibody CB-Hep.1 (anti-HBsAg) at the higher dose.
  • Figure 15 Percentage of the dose injected per gram of tissue, after 24 hours (first two bars in each tissue) and 48 hours (second two bars in each tissue) if the scFv 2H1 fragment (dark bars) or the fragment is inoculated scFv Hep.1 (clear bars) radioactive ( 125 I) to nude mice with tumors derived from human A431 tumor cells. Each bar represents the average of the counts recovered from the organs / tissues recovered from 5 mice.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the band corresponding to the product of the amplification was extracted from 2% agarose gel. After the digestion of the band with the Nhe I and BamH1 endonucleases, the DNA was purified and cloned into the vector pM238 (Yero, D. et al. 2006. Biotechnol. Appl. Biochem 44: 27-34). Through this vector, the proteins are expressed in bacteria as fusion proteins with an N-terminal domain of 47 amino acids of the P64K protein of Neisseria meningitidis. The resulting plasmid (P64 47a- VEGF) was automatically sequenced and it was determined that it contained only the mutations described above, as shown in SEQ ID No. 3, with respect to the amino acid sequences reported in the Biology Laboratory database. European Molecular (www.embl-heidelberg.de) for the zone of the cloned human VEGF isoform.
  • the cells were collected 8 h later, and after ultrasonic disruption the protein of interest remained in the precipitate of rupture
  • the solubilization was performed with sodium phosphate buffer plus 6M urea.
  • the supernatant was subjected to IMAC in Ni-NTA matrix (QIAGEN).
  • the eluted fractions were evaluated by SDS-PAGE, observing two bands comprising more than 98% of the protein in the preparation, with the sizes of about 26 kDa, 54 kDa and larger.
  • the first size corresponds to a monomer, while the second one to a dimeric molecule, and the larger ones to higher aggregations.
  • the elution fraction was dialyzed in PBS, subjected to chromatography on a Superosa F12 column (Pharmacia), to select exclusively the species with the highest apparent molecular weight (greater than or equal to 54 kDa), which were called P64 47aa- VEGF. This preparation was frozen at -2O 0 C for later use.
  • the fusion protein P64 47aa- VEGF, in which three critical mutations (residues R82, K84, and H86 were replaced by glutamic acid) were exprofessed was not identified by soluble KDR, a result that coincides with the predictions made by Shen et al. (Shen, B. et al. 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985), and that makes our antigen different from others reported in the literature and used for the development of antibodies and antibody fragments that neutralize human VEGF.
  • Table 1a Binding assay for KDR-Fc, using VEGF-A or the P64 47aa- VEGF fusion protein as ELISA coating.
  • the plate was washed and incubated with an anti-mouse peroxidase conjugate (Sigma).
  • the reaction was developed with the substrate solution composed of 0.5 mg / mL o / to-phenylenediamine and 0.015% hydrogen peroxide, in phosphate citrate buffer; pH 5.5.
  • the serum of animals immunized with the P64 47aa- VEGF protein specifically recognized commercial human VEGF with titers of up to 1: 32,000.
  • Example 3 Selection of antibody binding sites against human VEGF.
  • scFv human single chain Fv
  • RV variable regions
  • the ligation products were electroporated to TG1 cells to obtain the final library.
  • the presence and size of the inserts was determined in a sample of 30 colonies, with oligonucleotides that are associated with the flanking regions of the cloned scFv.
  • the recombinant protein P64 47aa- VEGF was used as an antigen.
  • the mixture of phages that make up the library was previously subjected to a depletion process with an excess (1 mg / mL) of the P64k antigen in solution, to eliminate the unwanted scFv specific for this protein.
  • the depleted mixture was confronted with the P64 47aa- VEGF protein immobilized in Maxisorp immunotubes (Nunc). For this, the immunotubes were coated with 10 ⁇ g / mL of the protein in PBS, at 4 ° C overnight, and then blocked with PBS-4% skim milk.
  • Phages that did not bind were removed by 20 washes with a 0.1% PBS-Tween solution, followed by 2 washes with PBS. Then, the bound phages were eluted with a solution of 100 mmol / L of triethylamine for 10 min, which was immediately neutralized with 0.5 mol / L of Tris (pH 7.5). The eluted phages were amplified in the E. coli TG 1 strain and used as a starting material in the next selection cycle. This procedure was repeated 3 times under the same conditions. Subsequently, individual colonies of TG1 infected with the eluted phages of the second and third selection cycle were randomly selected to produce phages at 96-well scale.
  • the absorbance was read at 492 nm in a microplate reader. Of the 96 phage clones evaluated by this ELISA, 87 of them were positive.
  • the DNA coding for the scFv-like antibody fragments that carry the phage clones that were positive for ELISA was amplified by PCR and subjected to a restriction analysis with the BstN-1 enzyme. The product of this digestion was observed on a 4% agarose gel. From this analysis, 7 different restriction patterns were identified and a representative clone of each pattern was selected.
  • TG-1 bacteria were infected, which were grown at 28 ° C for 16 hours.
  • the phages contained in the culture supernatant were precipitated with a solution of PEG 5000 in 2.5 M NaCl; and they were aliquoted for the immunochemical characterization described below.
  • Example 4 Immunochemical characterization of scFv in selected phages from the library. (a) Recognition of different isoforms of human and murine VEGF
  • isoforms 121 and 165 As well as isoform 165 of murine VEGF, the 7 phage clones carrying scFv fragments were subjected to an ELISA.
  • the immunoplates were coated with isoforms 121 and 165 of human VEGF (Peprotech) and isoform 120 of murine VEGF (R&D) at a concentration of 1 ⁇ g / ml in PBS. After blocking the plates, the purified phages were added as described above and diluted in PBS-4% skim milk, and incubated for 1 hour at 22 ° C. After several washes, the bound phages were detected by the addition of conjugated anti-M13 antibodies.
  • the reaction was developed and measured as described in Example 2.
  • the 7 phage clones selected for this characterization specifically recognize the sophormas 121 and 165 of human VEGF. Of these, clones 2H1-F and 3C1 do not recognize isoform 120 of murine VEGF.
  • the Table shows the ability to recognize clones, classifying as positive (+) those that gave optical densities in the ELISA above 5 times the negative control.
  • a 100 mM iodoacetamide solution in 4% PBS-milk was added to the wells where VEGF-A had been reduced with the dithiothreitol solution and incubated for 1 hour at 22 ° C. The rest of the wells were maintained with PBS-4% milk. After washing the plate again, the purified phages, diluted in PBS-4% milk, were added in both dithiothreitol and non-treated wells. treated and incubated for 1 hour at 22 ° C. After several washes, the bound phages were detected by the addition of anti-M13 antibodies conjugated to peroxidase.
  • a sample of the mixture of phages that make up the library before selecting was used as a negative control.
  • Table 3 shows that 3 patterns are observed: one in which recognition was not affected against reduced VEGF (exemplified by clone 3C1), a second pattern in which a partial affectation was observed (exemplified by clones 2B2 and 3E8 ) and a third party where there was a complete affectation of the recognition before the reduced form of VEGF (exemplified by clones 2D2, 2E1, 2H1-F and 2E3).
  • the recognition capacity of the clones for VEGF-A was taken, in terms of the average Optical Density (at 492 nm) of three wells obtained in the experiment, and as a reference that produced by the negative control.
  • the plates were blocked and subsequently the wells were incubated with a mixture of the corresponding phage clone, diluted in PBS-4% milk, and 2 ⁇ g / mL of soluble receptor (KDR-Fc, Sigma), or only with the vehicle ( PBS-4% milk). Bound phages were detected with an anti-M13 peroxidase conjugate (Amersham). As shown in Table 4, the clone that showed more evidence of blocking the binding of KDR-Fc to VEGF-A was 2H1-F.
  • the Table shows the recognition capacity of the clones for VEGF-A, in terms of the average Optical Density (at 492 nm) of three wells obtained in the experiment, taking as reference the one produced by the negative control
  • Example 5 Expression of the scFv 2H1 fragment in E. coli, purification and characterization of its recognition for human VEGF.
  • the pACR.1 vector is a plasmid designed for the expression of antibody fragments towards the periplasm of E. coli ( Figure 1). Its main elements are the LacZ promoter, a signal peptide, Ncol and Not I restriction sites for the insertion of the fragment gene, a c-myc peptide coding domain and a sequence coding for 6 histidines, the latter with a view to Ia purification of expression products by IMAC.
  • the DNA corresponding to the fagomide carrying the scFv called 2H1-F was used as a template for CPR.
  • Neo I and Not I were digested ( Promise) and repurified for your bond.
  • the pACR.1 vector was digested Neo I and Not I (Promega), and ligated with the predigested band using T4 DNA ligase (Promega).
  • the product of the binding reaction was used to transform competent E. coli (strain XL-1 Blue; Stratagene) by electroporation. Transformed cells were plated in selective solid medium and grown at 37 ° C. The methods used are widely known (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. 1989. Sambrook, Fritsch and Maniatis).
  • Plasmid DNA was purified from different colonies (QIAGEN MiniPrep kit), and checked by digestion with the restriction enzymes already described for the expected product of the ligation.
  • Several plasmids were chosen to obtain the consensus DNA sequence of scFv 2H1, using automatic sequencing and specific primers that hybridize externally to the cloning regions of the pACR.1 vector.
  • the consensus DNA sequence obtained for the complete fragment (VH-linker-VL- c myc-histidines) called scFv 2H1 (SEQ ID No. 6) appears in Figure 2.
  • the representative plasmid of this construction was called pACR.1- scFv 2H1.
  • 2H1 RVCP heavy chain RV
  • 2H1 RVCL light chain
  • 2H1 RVCP belongs to Subgroup I of variable regions of human immunoglobulins
  • 2H1 RVCL can be classified into several groups of variable regions of human immunoglobulins type lambda.
  • PACR.1-scFv 2H1 was used to transform competent E. coli BL21 cells. This strain allows the expression of the heterologous protein in the periplasm and / or the culture medium. The transformation was plated in selective solid medium and growth was allowed at 37 ° C. A representative colony of the construction was grown in liquid medium and upon reaching 1 of OD 530n In it was induced for 12 hours by adding 1 mM of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (in English "isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside", abbreviated IPTG ) to the culture medium.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
  • Recombinant bacteria transformed with the pACR.1-scFv 2H1 vector were centrifuged and the supernatant was dialyzed for 72 hours in the coupling buffer (5OmM NaH 2 PO4, 30OmM NaCI, pH 7-8). Preparations containing scFv were applied directly to an Agarose-NTA matrix (QIAGEN).
  • Figure 4A demonstrates that a protein with a high purity is obtained that continues to migrate somewhat above 29 kDa.
  • the fractions obtained were evaluated by Western Blot using as a primary antibody a specific monoclonal antibody (9E10) against the c-myc-derived peptide containing this protein and in the standard (scFv-M3), followed by rabbit anti-lgG antibodies of mouse conjugated with peroxidase (Sigma).
  • Figure 4B demonstrates that AcM 9E10 detected scFv 2H1 without major degradation.
  • the ability of purified scFv 2H1 to block the access of a soluble VEGF receptor to the antigen was evaluated by means of a competitive ELISA.
  • the assay is based on the inhibition of the binding of a soluble KDR-Fc receptor to human VEGF-A adsorbed to a solid surface, by adding increasing concentrations of scFv 2H1.
  • Maxisorp (Nunc) 96-well immunoplates were coated with human VEGF-A 121 isoform (Peprotech) at a concentration of 1 ⁇ gg / mL in PBS for 16 hours at 4 0 C.
  • the plates were blocked and subsequently the wells were incubated with increasing concentrations of purified 2H1 scFv, and 0.5 ⁇ g / mL of soluble receptor (KDR-Fc, SIGMA), or only with the vehicle (PBS-4% milk).
  • An anti-HBsAg scFv was used as a negative control.
  • the KDR-Fc bound to the human VEGF-A in the solid phase was detected with anti-human IgG antibodies conjugated with peroxidase (Sigma).
  • scFv 2H1 is capable of affecting the binding of the soluble receptor to human VEGF-A in the solid phase, with a clear dependence on the dose used.
  • the scFv 2H1 bacterial fragment was compared with Bevacizumab (Avastin®, Genentech) with respect to its ability to identify the fusion protein P64 47a a-VEGF, originally used for the phage antibody selection procedure described in Example 3 and which gave rise to scFv 2H1-F.
  • P64 47 aa-VEGF or human VEGF-A (Peprotech) were immobilized in 96-well Maxisorp (Nunc) immunoplates at a concentration of 1 ⁇ g / ml in PBS, for 16 h at 4 0 C. The plate was blocked at 22 0 C with PBS-4% milk for 1 h.
  • scFv 2H1 recognizes both P64 47aa -VEGF and human VEGF-A, while the Bevacizumab only recognizes Peprotech's human VEGF-A.
  • the unrelated scFv anti-HBsAg and TheraCIM humanized IgGI antibody against the EGF receptor; CIMAB SA, Habana
  • Example 6 Expression of scFv 2H1 in Pichia pastoris and demonstration of its recognition for human VEGF.
  • Plasmid pPS9 is an integrative vector that contains a fragment of 1, 15 Kb corresponding to the promoter of the enzyme alcohol oxidase (AOX.1) followed by the gene that codes for the secretion signal of the sucrose invertase (sucll) of Saccharomyces cerevisiae , a multiple cloning site, a 960 bp fragment of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapt) enzyme to guarantee termination of transcription, and the S.
  • AOX.1 alcohol oxidase
  • this vector contains a 2.1 kb fragment, corresponding to the 3 'sequence of the AOX.1 gene. All these elements are inserted into a vector pUC18 (EP0438200 A1). After the Ncol / Xbal digestion of the 2H1 gene, and purification from agarose gel, it was linked to the previously digested pcol vector Ncol / Spel, and the ligation products were used to transform the E. coli strain XL-1 Blue. .
  • Isolated colonies corresponding to the transformation of the strain with each recombinant vector were analyzed, using a PCR of colonies with a primer that hybridizes in the promoter, selecting those that were found to contain the insert. Sequencing of the cloned genes was performed according to the procedure described in other examples. The sequences obtained for the recombinant plasmids called pPS2H1-12 and pPS2H1-13 match, and contain the scFv 2H1, with sequence compatible with that cited in SEQ ID No. 6. Recombinant strains of P. pastoris were obtained with these two plasmids by means of Ia Electroporation of the wild strain MP36 his 3 (Yong V. et al. 1992. Biotechnol.
  • AcM 9E10 as primary antibody, and mouse anti-mouse IgG conjugated antibodies with peroxidase (Sigma). For both constructs, recombinant proteins were identified by AcM 9E10.
  • Example 7 Obtaining a bacterial Fab fragment from the variable regions of scFv 2H1 and characterizing its recognition for human VEGF
  • the plasmid pFabHum-1 is schematized, used for the production of soluble Fab-type fragments in the periplasm and culture medium of E. coli.
  • the vector has a LacZ promoter, an RBS, the sequence of a signal peptide (PS), cloning sites for the light chain variable region (Sal I and Avr II), and the coding sequence for a human immunoglobulin C ⁇ domain, followed by another RBS and PS sequence, cloning sites for the heavy chain variable region (Apa Ll and Bst EII) followed by the coding sequence of a human immunoglobulin CH1 domain, extended to include the first cysteine of the hinge region of a human IgGI.
  • the heavy RV-CH1 protein is expressed in association with a domain of six histidines for purification by IMAC and a c-myc peptide for analytical purposes, both at the C-terminal end and provided by the vector itself.
  • the DNA corresponding to the fagomide carrying the scFv called 2H1-F was first digested with the enzymes Sal I and Avr Il to obtain the light chain variable region. After verifying the size in 1.5% agarose gel, cloning was carried out in the pFabHum-1.
  • the plasmid (called pFab-Hum-1 RVL) was replicated, purified and then subjected to a new digestion with the enzymes Apa Ll and Bst EII. In the case of Bst IBD, the digestion was partial. Once the size of 1.5% agarose gel was verified, cloning was carried out in the pFab Hum-1 RVL. Once the cloning was verified by restriction enzymes, the plasmid (called pFab 2H1-32), was replicated, purified and sequenced automatically. The DNA sequence coding for the mature Fab 2H1-32 protein is described in Figure 7.
  • the one corresponding to the light chain and C ⁇ RV combination can be seen in 7A (SEQ ID No.9) and the one corresponding to the RV combination Heavy chain and CH1 can be seen in 7B (SEQ ID No. 10).
  • the sequences of the CDRs noted according to the classification of Kabat et al.
  • PFabHum-1 H1-32 was used to transform competent E. coli BL21 cells. The transformation was plated in selective solid medium and growth was allowed at 37 ° C for 16 hours. A representative colony of the construction was grown in liquid medium and upon reaching 1 of OD 5 30 nm it was induced for 12 hours by adding 1 mM of IPTG to the culture medium. The cells were centrifuged and the periplasmic content was isolated by osmotic shock and brief sonication, both the periplasmic fraction and the culture supernatant were evaluated in 12% SDS-PAGE. This assay revealed the expression of a protein of expected molecular weight (approx.
  • the purified Fab fragment was evaluated for its ability to recognize human VEGF by an ELISA assay.
  • Maxisorp (Nunc) 96-well immunoplates were coated with isoforms 121 and 165 of human VEGF-A (Peprotech) and isoform 120 of mouse VEGF-A (R&D) at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • Samples of the purified Fab were diluted and incubated one hour at 22 ° C. After several washes a specific monoclonal antibody (9E10) was added against the c-myc-derived peptide (1 ⁇ g / mL), followed by rabbit anti-mouse IgG antibodies conjugated to peroxidase (Sigma).
  • Example 8 Obtaining and characterizing recognition of dimeric molecules comprising two units of the scFv fragment genetically fused to the Fc fragment of a human IgGI.
  • PCR was performed using the plasmid pACR.1-scFv 2H1 as a template containing the gene sequence of scFv 2H1 and primers # 5 ( SEQ ID No. 10) and # 6 (SEQ ID No. 11) that appear in Table 8, to modify the DNA sequence that codes for this antibody fragment and make it compatible with the cloning that follows.
  • This procedure was performed with the PanoTaq enzyme (Panorama Inc.), and the procedure recommended by the manufacturer.
  • the amplified DNA was cloned into the pVSJG-HucFc vector.
  • This vector is represented in Figure 8A and was designed for the expression in mammalian cells of a polypeptide chain comprising, in this order: a leader sequence (signal peptide) of the heavy chain of a murine monoclonal antibody, followed by a fragment scFv, separated by 10 amino acids (which act as a spacer) of the consensus sequences that form the hinge domains, CH2 and CH3 of a human IgGI immunoglobulin.
  • this chain passes to the endoplasmic reticulum, where it is dimerized from the formation of the covalent disulfide bonds in the hinge domain and the complementary association of the CH2 and CH3 regions.
  • the hinge domains, CH2 and CH3 thus form a human immunoglobulin Fc, to which two identical scFvs associated with a "complete antibody” type bivalent molecule are associated by its N-terminal end ( Figure 8B).
  • Figure 8B Among the main features of this vector are the presence of a cytomegalovirus promoter.
  • the two plasmids were purified under endotoxin-free conditions using the Yield Plasmid Midiprep (Promega) Puree system, and were used to transfect P3 / x63 myeloma cells. Ag8,653 using the SuperFect reagent (QIAGEN). Transfectomas were selected in the presence of the G418 selection marker. Supernatants obtained from colonies of transfectomas resistant to this antibiotic were evaluated by an ELISA assay. For this, Maxisorp 96-well immunoplates (Nunc) were coated with isoform 121 of human VEGF (Peprotech).
  • the transfectome clones producing the ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc 2H 1-8.2 molecules were grown in 162 cm 2 bottles in the presence of 10% fetal bovine serum and the supernatant was collected from reached high cell density
  • the supernatants of the two clones were diluted 1: 1 in sodium phosphate buffer 0.1 M, pH 7.0 and purified independently by affinity chromatography, using Sepharose Fast Flow 4 Protein A (Amersham) matrices.
  • the scFv 2 -Fc 2H 1-4.1 and scFv 2 -Fc 2H 1-8.2 molecules were eluted with 0.2 M glycine buffer; pH 4.0 and subjected to rapid neutralization with 1M Tris; pH 10.0. After dialysis against PBS, the concentration was estimated by UV adsorbance at 280 nm and the purity by 12% SDS-PAGE. It was determined that the preparation had more than 85% purity. Samples of the purified molecules were applied to an ELISA system as described in the previous procedure, as compared to unpurified supernatant, determining that they possessed adequate human VEGF-A recognition activity by this method.
  • Eluted phages were amplified in TG1 bacteria and used as a starting material in the next selection cycle. This procedure was repeated 3 times under the same conditions. Subsequently, individual colonies of TG1 infected with the eluted phages of the second and third selection cycle were randomly selected to produce phages at 96-well scale.
  • phage ELISA a phage ELISA.
  • 96 plates were coated Maxisorp (Nunc) wells with scFv 2H1, and then blocked.
  • the phages diluted in PBS-4% skim milk were incubated for 1 hour at 22 ° C in the plates, followed by several washes with 0.1% PBS-Tween.
  • the bound phages were detected by the addition of an anti-M13 peroxidase conjugate (Amersham). Of the 40 phage clones evaluated by this ELISA, 35 of them were positive and were used for the procedure below.
  • an ELISA was performed where the competition of the phage peptides with VEGF-A was evaluated, by binding to the scFv fragment adsorbed to a solid surface
  • a 96-well plate (Nunc, Maxisorp) was coated with 10 ⁇ g of scFv 2H1, and blocked.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the bound phages were detected by the addition of an anti-M13 peroxidase conjugate (Amersham). As seen in Figure 11 for a sample of the clones tested, the presence of VEGF completely prevents the binding of phage associated peptides to the immobilized scFv 2H1.
  • the methods require the 3D structure of an element of the interaction partner (template protein; in our case the human VEGF-A, from the PDB Protein Data Bank (Code 1 BJ1) and the sequence amino acid of the second element in this interaction (binding protein; in our case the CCRTLMLLQYHR peptide; SEQ ID NO.
  • the FINDEPI program generates a database of potential mimotopes of each surface patch in the protein template, applying a set of stereochemical rules.This database is explored using profile alignment methods to detect mimotopes potentially similar to the peptides experimentally selected for their binding.After applying a clustering algorithm, the program reports a list of residues exposed on the surface of the template protein, with the possibility of being located at the interface of interaction between the two proteins. The method has been tested with protein-protein complexes for which its crystallographic structure is known, and for which there is experimental sequence data of the peptides that bind.
  • an interaction zone was defined in the human VEGF-A molecule that mainly comprises residues C102, C57, R56, T31 and L32 (recorded according to the PDB Protein Data Bank Code 1 BJ1). It is considered in this invention that these residues are major indicators of the epitope recognized by scFv 2H1. According to the predictions made, they may also appear associated with the main indicator residues of the epitope described above, although with a lower score, residues G59, C68, V69, P70 and H99.
  • the epitope defined primarily through residues C102, C57, R56, T31 and L32 does not match those reported for other antibodies and antibody fragments that neutralize human VEGF (Muller AY et al. 1997.
  • Figure 12 shows the mapping of the residues that mainly define the epitope recognized in the VEGF-A molecule by scFv 2H1, in comparison with those described for other antibodies.
  • a representative cartoon-like diagram of the tertiary structure of human VEGF-A is used in its dimeric conformation, with alpha helices, beta chains and loops.
  • the two identical molecules of the dimer appear as light gray and black.
  • the position of the residues defined as the main indicative of the epitope recognized by scFv 2H1 are marked only in the light gray chain, and appear in black, representing Van der Waals (VDW).
  • Residues recognized by other antibodies are marked as light gray VDW in Figures 12 A to Ia D.
  • Figures 12A and 12B show that the epitope defined by the main indicative residues for scFv 2H1 is contiguous but not overlapped with that defined for Fab G6 and B20-4 (Fuh G. et al. 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631).
  • Figure 12C shows that the epitope defined by the main indicative residues for scFv 2H1 is quite different and structurally distant from that defined for the humanized antibody Bevacizumab, commercially known as Avastin.
  • Figure 12D shows that the epitope defined by the main indicative residues for scFv 2H1 also does not structurally overlap with that defined for antibody 3.2E3.1.1 (Muller AY et al. 1997. PNAS 94: 7192-7197).
  • Figure 12E shows the position of contiguous amino acids (in light gray VDW) that are different when comparing the sequences of human and mouse VEGF-A, in relation to the position of the epitope defined by the main indicative residues C102, C57 , R56, T31 and L32 for scFv 2H1 (in black VDW). It is known in the state of the art that residues adjacent to a given epitope are critical for the projection of the tertiary structure thereof, and therefore, for its recognition by antibodies, as well as that the change of a single amino acid is sufficient to determine The specificity of an antibody for a molecule of one species or another (Fuh G. e ⁇ al. 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631). This could explain why scFv 2H1 does not recognize mouse VEGF-A.
  • the cells were stimulated with fresh medium supplemented with 10 ng / ml of human VEGF-A (Peprotech) and incubated with different concentrations of scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc molecules 2H1-8.2.
  • HuVEC cells were grown in the presence of 10 ng / mL of human VEGF-A, where they reach a proliferation that is arbitrarily defined as 100% (proliferation controls without interference, VEGF bar), or mixtures of scFv purified molecules were added 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1 8.2, at three different concentrations (striped bar: 2 ⁇ g / mL; full bar: 1 ⁇ g / mL and empty bar: 0.5 ⁇ g / mL) with 10 ng / mL of human VEGF-A (Peprotech).
  • the mixture with the soluble KDR-Fc receptor at 0.5 ⁇ g / mL was used as inhibition control.
  • an anti-HBsAg scFv was used in the mixture.
  • the cells were stained with 0.5% crystal violet in 20% methanol.
  • the plates were washed with water and allowed to air dry. Staining was eluted with a 1: 1 solution of ethanol in 0.1 M sodium citrate and absorbance was measured in a plate reader at 562 nm.
  • the absorbance value of the basal cell proliferation was subtracted from all plaque values and the data were represented as the percentage of inhibition with respect to the control of maximum proliferation.
  • Example 11 Evaluation of the in vivo antiangiogenic effect of different molecules that recognize human VEGF, in the subcutaneous Matrigel pellet model in the mouse.
  • the animals were divided into groups of 10 and injected subcutaneously in the abdominal midline with 500 ⁇ L of Matrigel containing 100 ng of human VEGF (Peprotech), and different concentrations of the molecules to be tested or an unrelated antibody (CB -Hep.1, Heber Biotec, Havana).
  • the animals were sacrificed and the Matrigel plug was removed, from which the hemoglobin content was determined by the Drabkin Method using the Drabkin's reagent kit (Sigma) system according to the manufacturer's instructions.
  • the scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1- 8.2 molecules significantly inhibit (p ⁇ 0.001) the human VEGF-induced vascularization in the Matrigel pellets, which is correlated with a decrease in hemoglobin levels.
  • Example 12 Evaluation of the in vivo antiangiogenic effect of different molecules that recognize human VEGF, in the model of nude mice xenotransplanted with human tumor cells of the A431 line.
  • an effective model for the assay. of anti-angiogenic substances is that of the inhibition of tumor growth in animals. Due Since scFv 2H1, and therefore the molecules derived from the RVs that compose it, identify only human VEGF, the tumor growth model in mice was established with human tumor cells inoculated to congenital nude mice (nude mice; nu / nu) . In the experiment performed, 9 groups of 5 nude nu / nu mice of BALB / c line (CENPALAB, Havana) were used, aged between 8 and 10 weeks.
  • the treatment groups were organized for each of the four molecules (scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1-8.2) taking into account two dose levels: 25 mg / kg and 2.5 mg / kg per mouse in PBS pH 7.2.
  • the ninth group (negative control) was treated only with the vehicle (PBS pH 7.2).
  • the mice were inoculated subcutaneously with 5x10 6 human tumor cells of the A431 line (ATCC, CRL 1555) in the right dorsal area. When the tumors reached 200 mm 3 volumes, the mice were randomized in the 9 groups of 5 animals and the treatment was started as indicated for each experimental group.
  • tumor penetration (supposedly better at less size) is not as important as bioavailability, which is favored for "IgG type" molecules such as ScFv 2 -Fc 2H1 4.1 and ScFv 2 -Fc 2H1 8.2, due to the presence of an Fc compatible with FcRn-mediated recycling (Vaccaro C. et al. 2005. Nature Biotechnol 23: 1283 -1288).
  • Fc compatible with FcRn-mediated recycling Vaccaro C. et al. 2005. Nature Biotechnol 23: 1283 -1288.
  • the scFv and the Fab are not so different, since both lack Fc.
  • the tumors of the treated mice showed a significant reduction in vascular density, a reduction in the diameter of the vessels, an increase in tumor apoptosis and a reduction in mitotic figures.
  • Example 13 Ability of the scFv 2H1 fragment labeled with 125 I to selectively lodge in the tumor area in nude mice inoculated with A431 cells.
  • radiolabeled products were analyzed in thin layer chromatography to determine the incorporation into protein, finding values of 93 and 95% of the radioactivity, respectively.
  • the ability of radiolabeled products to detect their corresponding antigens was tested in a system where polystyrene immunotubes were coated with recombinant human VEGF isoform 121 (5 ⁇ g / mL; Peprotech), or recombinant HBsAg (5 ⁇ g / mL; Heber Biotec, Havana), were blocked, and the sample of the radiolabeled fragment of corresponding specificity was added, adjusted to the amounts that could be trapped by that solid phase.
  • mice 20 nu / nu mice were used. The animals were inoculated subcutaneously with 5x10 6 human tumor cells of the A431 line in the right dorsal area. When the tumors reached volumes of around 300 mm 3 , four groups of 5 animals were randomized and treatment began. The mice were injected through the tail vein with the radiolabelled product in question (10 with scFv 2H1 and another 10 with scFv Hep.1), and were sacrificed in groups of 5 of each product at 24 and 48 hours, surgically removed the tumor and the following normal tissues: spleen, liver, kidney, intestine, muscle, bone marrow and blood. The accumulation of radioactivity was expressed as a percentage of the dose injected per gram of tissue.
  • scFv 2H1 can specifically locate anatomical areas where there is a high local concentration of human VEGF, such as an A431 tumor, and is therefore useful for transporting to this area of It specifically forms different therapeutic products, such as a radioactive isotope, or possibly a toxin or a drug.
  • the values correspond after 24 and 48 hours after injecting the animals with the different radiolabeled molecules with 125 I. Each ratio was calculated from the average values derived from the tissues recovered from 5 mice.
  • EXAMPLE 14 Prevention of experimental choroidal neovascularization (NVC) in non-human primates by means of the scFv 2H1 fragment and the bivalent molecule ScFv 2 -Fc 2H1-4.1.
  • Anesthesia before enucleation and for euthanasia was done with intravenous sodium pentobarbital.
  • the NVC membranes were induced in the macula by means of argon laser burns, ensuring that the procedure caused a blister and a small hemorrhage, with application points between 50 and 100 ⁇ m.
  • Photography and fluorescent angiography were used to detect and measure the extent and characteristics of the lesions.
  • the eyes of the animals were checked on different days, before and after the application of the fragment and the placebo, of the laser burn procedure, and at the end of the experiment, which ended with enucleation and death.
  • the animals were divided into two groups of 3, according to the molecule to be studied: the scFv 2H1 antibody fragment or the bivalent immunoglobulin type ScFv 2 -Fc 2H1-4.1 molecule.
  • the right eye of each animal received 500 ⁇ g of scFv 2H1 or ScFv 2 -Fc 2H1-4.1, depending on the group, in 50 ⁇ L of PBS by intravitreal injection, while the left only the vehicle.
  • the eyes received 2 injections before laser treatment (days 0 and 14). On day 21, all eyes received laser treatment for the induction of NVC. An injection in each eye was repeated on day 2 with the specific product or vehicle.
  • phase I of the treatment (before day 42) the studies demonstrated a reduction in the advent of grade 4 lesions in the eyes where scFv 2H1 or ScFv 2 -Fc 2H 1-4.1 was administered, compared to the respective eyes control, which suggests that the fragment helps in the prevention of NVC.
  • the treatment phase Il when all eyes received scFv 2H1 fragment or ScFv 2 -Fc
  • EXAMPLE 15 Expression of dimeric molecules comprising two units of the scFv fragment genetically fused to the Fc of a human IgGI in transgenic tobacco plants.
  • the CPR was used, under conditions such as those described in Example 8, to amplify the gene coding for ScFv 2 -Fc 2H1-4.1, and modify its ends for the addition of appropriate restriction sites (Ncol and Xbal) to clone in plant cell vectors.
  • the basic synthetic oligonucleotides used in CPR were designed based on the sequences reported in SEQ ID No. 13.
  • the amplified DNA fragment was detected as a majority band of approximately 1.4 Kb and purified from an agarose gel to the 1% (Sigma) using the QIAquick GeI Extraction Kit (QIAGEN, GmbH).
  • the DNA was subsequently digested with the aforementioned enzymes and cloned into the pHES74 vector (López A., et al. 1996. Applied Biotechnology 13: 265-270) as a scFv-hinge-CH2-CH3 construct preceded by the signal sequence of the sweet potato sporamine.
  • This vector has the promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S, an omega leading region of the tobacco mosaic virus that acts as a translational enhancer to increase the amount of protein produced, and the nopaline synthase terminator that also promotes expression high foreign genes in transgenic plants.
  • the scFv-Fc-terminator gene-promoter expression cassette was introduced into the binary vector pDE1001, to produce the final plasmid pDEscFv-Fc.70. Details for similar constructions and for the Work with this type of material has been previously reported (Ram ⁇ rez, N. et al. 2002. Transgenic Res. 11: 61-64).
  • the final plasmid pDEscFv-Fc.70 was used to transform cells of Nicotiana tabacum cv plants. Petit Havana SR1, through gene transfer mediated by Agrobacter ⁇ um tumefaciens.
  • the FO and F1 plants were obtained by conventional procedures described above and the expression of active scFv-Fc molecules was detected using an ELISA system similar to that described in Example 8.
  • the biologically active scFv-Fc molecule is prepared in the form of total soluble proteins (TSP) from plants, which were extracted by grinding 0.4 g of tobacco leaves from transformed plants, or controls, in liquid nitrogen until obtaining a fine powder, basically as described.
  • the powder was transferred to a reaction tube, mixed 1: 2 (weight / volume) with extraction buffer (61 mM Tris-HCI pH 6.9; 2% SDS; 12.5% glycerol), and incubated in ice for 5 minutes.
  • the insoluble material was removed by centrifuging at 13,000 rpm and the soluble part was tested in ELISA at different dilutions, using anti-human Fc antibodies conjugated to alkaline phosphatase (Sigma) to detect the expression. It was shown that the TSP of the transgenic plants contained molecules capable of recognizing the human VEGF of the solid phase, but not the TSP of the control plants.

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Abstract

Moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos, que reconocen específicamente el Factor de Crecimiento de Endotelio Vascular-A (VEGF-A) humano, e interfieren con sus efectos estimulatorios in vitro, y pro-angiogénicos in vivo. Dichas moléculas polipeptídicas recombinantes son capaces de afectar la proliferación de células endoteliales humanas in vitro, la angiogénesis subcutánea en ratones inducida por tapones de Matrigel que contienen VEGF-A, y el crecimiento de tumores humanos transplantados a ratones desnudos. Varias de estas moléculas previenen la neovascularización coroidea en un modelo experimental en primates no humanos. Estas moléculas pueden emplearse para la inmunoterapia pasiva de entidades patológicas cuyo curso se asocia al aumento de la vasculatura, tales como la degeneración macular asociada a la edad (variante húmeda), el cáncer y sus metástasis, los glaucomas neovasculares, la retinopatía diabética y del recién nacido, los procesos inflamatorios agudos y crónicos, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, el rechazo al transplante de órganos, los hemangiomas y los angiofibromas, entre otros

Description

ANTICUERPOS RECOMBINANTES CONTRA EL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR (VEGF).
Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con el campo de Ia biotecnología y Ia industria farmacéutica, en particular con el desarrollo y aplicación de moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos, que reconocen específicamente el Factor de Crecimiento de Endotelio Vascular-A (en inglés "Vascular Endothelial Growth Factor-A", abreviado VEGF-A) humano (Ferrara, N. et al. 2003. Nature Medicine 9: 669-676) e interfieren con sus efectos estimulatorios in vitro y pro-angiogénicos in vivo. Entre estas moléculas se encuentran un fragmento de anticuerpo tipo Fv de cadena simple (en inglés "single-chain variable fragment", abreviado scFv), un fragmento de anticuerpo tipo Fab, y moléculas recombinantes bivalentes tipo "anticuerpo completo" (ScFv2-Fc).
Estado de Ia técnica anterior
El proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de aquellos preexistentes se denomina angiogénesis, que está regulado por un equilibrio de factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos. Entre las enfermedades cuyo curso se ha relacionado con Ia inducción de factores pro-angiogénicos y Ia formación de nuevos vasos sanguíneos de forma anómala están: el cáncer (tanto los tumores primarios como sus metástasis), procesos inflamatorios agudos y crónicos como el asma, el distrés respiratorio, Ia endometriosis, Ia ateroesclerosis, los edemas tisulares, enfermedades de origen infeccioso como las hepatitis y el sarcoma de Kaposi, enfermedades autoinmunes como Ia diabetes, Ia psoriasis, Ia artritis reumatoide, Ia tiroiditis, y otras varias enfermedades y estados tales como Ia retinopatía diabética y del recién nacido, el rechazo al transplante de órganos, Ia degeneración macular asociada a Ia edad (variante húmeda), los glaucomas neovasculares, los hemangiomas y los angiofibromas (Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M, et al. 2001. Intern Med 40: 565-572).
Un procedimiento terapéutico atractivo para muchas de estas enfermedades puede basarse en Ia inhibición de Ia actividad de los factores pro-angiogénicos que estimulan Ia formación anómala de vasos, mediante Ia administración de moléculas que los neutralicen. En Ia práctica médica, el anticuerpo recombinante humanizado Bevacizumab, conocido comercialmente con el nombre de Avastin (Ferrara, N. et al. 2005. Biochem Biophys Res Común 333: 328-335), que reconoce y neutraliza eL efecto pro-angiogénico del VEGF-A humano, ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de procesos tumorales. Se ha demostrado que su efecto depende mayoritariamente de Ia inhibición de Ia neo-angiogénesis que induce el VEGF-A producido por las células tumorales y otras del estroma tumoral, tales como macrófagos y fibroblastos. Este anticuerpo fue originalmente obtenido como un anticuerpo monoclonal murino (Kim, KJ. et al. 1992. Growth Factors 7: 53-64) mediante Ia inmunización de ratones con Ia isoforma 165 del VEGF-A humano obtenida en mamíferos. El anticuerpo fue luego modificado por ingeniería genética para lograr su humanización, Io que Ie confiere una mejor tolerancia y eficacia terapéutica al ser aplicado en humanos.
Recientemente, se ha aprobado en varios países el uso del Ranibizumab (Gaudreault, J. et al. 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733), conocido comercialmente con el nombre de Lucentis, un fragmento de anticuerpo derivado del ya mencionado Avastin, para el tratamiento de Ia degeneración macular asociada a
Ia edad, variante húmeda. El Ranibizumab es un fragmento recombinante de anticuerpo tipo Fab, originado por manipulación del Bevacizumab por ingeniería genética. La inyección intravítrea del Ranibizumab neutraliza el VEGF-A producido localmente y afecta Ia neo-angiogénesis en Ia retina profunda, que es base de esta enfermedad.
Los factores de crecimiento del endotelio vascular son una familia de moléculas que inducen de manera directa y específica Ia formación de nuevos vasos (Leung, D. et al. 1989. Science 246:1306-1309). Esta familia comprende al factor de permeabilidad vascular, también conocido como factor de crecimiento del endotelio vascular (en inglés "Vascular Permeability Factor", abreviado VPF) (ahora denominado VEGF-A), el factor de crecimiento de placenta (en inglés "Placental Growth Factor", abreviado PIGF), los factores de crecimiento derivados de plaquetas (en inglés "Platelet-Derived Growth Factor", abreviado PDGF) PDGF-A y PDGF-B, y otras moléculas relacionadas estructural y funcionalmente con el VEGF-A, que se han denominado VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, y VEGF-E (Olofsson, B. et al. 1996. Proc Nati Acad Sci USA 93: 2576-2581 ; Joukov, V. et al. 1996. EMBO J 15:290-298; Yamada, Y. et al. 1997. Genomics 42:483-488; Ogawa, S. et al. 1998. J Biol Chem 273:31273-31282).
El VEGF-A es una glicoproteína homodimérica formada por dos subunidades de 23 kDa (Ferrara, N. et al. 1989. Biochem Biophys Res Común 161 : 851-858) de Ia cual existen 5 isoformas monoméπcas derivadas del corte y empalme diferencial de un mismo ácido ribonucleico (ARN). Estas incluyen dos isoformas que se mantienen unidas a Ia membrana celular (VEGF 189 y VEGF 206) y tres de naturaleza soluble (VEGF 121 , VEGF 145, y VEGF 165). La isoforma VEGF 165 es Ia más abundante en tejidos de mamíferos, excepto en pulmón y corazón, donde predomina el VEGF 189 (Neufeld G et al. 1995. Canc Met Rev 15:153-158), y en placenta, donde prevalece Ia expresión del VEGF 121 (Shibuya, M. 1995. Adv Cáncer Res 67: 281- 316).
El VEGF-A es Ia proteína más estudiada y caracerizada de esta familia, y su alteración se ha descrito en un número mayor de enfermedades. Su sobréexpresión se asocia con tumores de diferente origen y localización y sus metástasis (Grunstein, J. et al. 1999. Cáncer Res 59: 1592-1598), procesos inflamatorios crónicos como Ia colitis ulcerativa y enfermedad de Chron (Kanazawa, S. et al. 2001. Am J Gastroenterol 96: 822-828), psoriasis (Detmar, M. et al. 1994. J Exp Med 180: 1141-1146), distrés respiratorio (Thickett, DR. et al. 2001. Am J Respir Crit Care Med 164: 1601-1605), ateroesclerosis (Celletti, FL. et al. 2001. Nat Med 7: 425-429), endometriosis (McLaren, J. 2000. Hum Reprod Update 6: 45-55), asma (Hoshino, M. et al. 2001. J Allergy Clin Immunol 107: 295-301), artritis reumatoide y osteoartritis (Pufe, T. et al. 2001. J Rheumatol 28: 1482-1485), tiroiditis (Nagura, S. et al. 2001. Hum Pathol 32: 10-17), retinopatía diabética y del recién nacido (Murata, T. et al. 1996. Lab Invest 74: 819-825; Reynolds, JD. 2001. Paediatr Drugs 3: 263- 272), degeneración macular y glaucomas (Wells, JA. et al. 1996. Br J Ophthalmol 80: 363-366), edemas tisulares (Kaner, RJ. et al. 2000. Am J Respir CeII Mol Biol 22: 640-641), obesidad (Tonello, C. et al. 1999. FEBS Lett 442: 167-172), hemangiomas (Wizigmann, S. y Píate, KH. 1996. Histol Histopathol 11 : 1049-1061), en el líquido sinovial de pacientes con artropatías inflamatorias (Bottomley, MJ. et al. 2000. Clin Exp Immunol 119:182-188) y asociada al rechazo al transplante (Vasir, B. et al. 2001. Transplantation 71 : 924-935). En el caso particular de los tumores, las células que expresan las tres isoformas básicas de! VEGF-A (121 , 165 y 189), son las que crecen con mayor rapidez in vivo (Grunstein, J. 2000. Mol CeII Biol 20: 7282-7291).
Las alteraciones de Ia función de las células endoteliales inducidas por las moléculas de Ia familia del VEGF están mediadas por Ia unión de estas a receptores celulares tirosina quinasa clase III, que hasta ahora incluyen el VEGFR1 (FItI), el VEGFR2 (KDR/Flk1) y el VEGFR3 (Flt4) (Kaipainen, A. 1993. J Exp Med 178: 2077- 2088). Se ha identificado el dominio 2 del extremo N-terminal como el responsable de Ia unión a los ligandos, propiciándose Ia fosforilación del dominio citoplasmático y Ia transducción de Ia señal (Davis-Smyth, T. et al. 1996. EMBO 15: 4919-4927). El receptor VEGFR2 (KDR/Flk1 ) media los efectos biológicos del VEGF-A, y también se une a los ligandos VEGF-C y VEGF-D. Este receptor se expresa de manera diferencial en el endotelio activo y en algunas líneas celulares de origen tumoral donde establece lazos autocrinos con el VEGF secretado. Además de estar involucrado en las patologías ya descritas, que se relacionan con Ia sobre-expresión de sus ligandos, su sobre-expresión en particular se ha relacionado con el avance: del cáncer de endometrio (Giatromanolaki, A. et al. 2001. Cáncer 92: 2569-2577), de mesoteliomas malignos (Strizzi, L. eí al. 2001. J Pathol 193: 468-475), de neoplasmas astrocíticos (Carroll, RS. et al. 1999. Cáncer 86: 1335-1341), de cáncer primario de mama (Kranz, A. et al. 1999. lnt J Cáncer 84: 293-298), de cáncer gástrico tipo intestinal (Takahashi, Y. eí al. 1996. Clin Cáncer Res 2: 1679-1684), de glioblastoma multiforme, oligodendrogliomas anaplasticos, y ependimomas con necrosis (Chan, AS. et al. 1998. Am J Surg Pathol 22: 816-826). La sobre-expresión del KDR se ha asociado, además, a Ia enfermedad autonómica VHL y a hemangioblastomas (Wizigmann-Voos, S. et al. 1995. Cáncer Res 55:1358-1364), al avance de Ia retinopatía diabética (Ishibashi, T. 2000. Jpn J Ophthalmol 44:323-324) y, junto al FIt- 1 , a las reacciones de hipersensibilidad retardada (Brown, LF. et al. 1995. J Immunol 154:2801-2807)
La mayor parte de las nuevas estrategias terapéuticas basadas en Ia inhibición de Ia angiogénesis, especialmente para cáncer, se basan en el bloqueo del VEGF-A y/o sus receptores, resaltándose entre los productos aprobados o en ensayo clínico los siguientes: (1) anticuerpos monoclonales bloqueadores del VEGF-A o del receptor KDR, (2) inhibidores de las metaloproteinasas, como el Neovastat y el Prinomastat, (3) inhibidores del VEGF como Ia Talidomida, el Suramin, Ia Troponina I1 el IFN-α y el Neovastat, (4) bloqueadores de receptores del VEGF como los SU5416, FTK787 y SU6668), (5) inductores de apoptosis del endotelio tumoral como Ia Endostatina y el CA4-P, y (6) ribozimas que disminuyen Ia expresión del VEGF o de sus receptores (Angiozyme). De todos los anteriores, son los anticuerpos (y sus fragmentos) neutralizantes de los efectos pro-angiogénicos del VEGF-A los que más han avanzado en cuanto a su aplicación y aceptación como productos terapéuticos. Además de los ejemplos del Bevacizumab y el Ranibizumab que mencionamos más arriba, y que ya han sido registrados, existen reportes de otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que reconocen y neutralizan el VEGF humano (Muller, Y. et al. 1997. Proc Nati Acad Sci USA 94: 7192-7197; Asano, M. et al. 1998. Hybridoma 17:185-190; Vitaliti A. et al. 2000. Cáncer Res 60: 4311-4314; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Reléase 74:173-181 ; Jayson, G. et al. 2002. JNCI 94: 1484-1493; Brekken, RA. et al. 2000. Cáncer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. eí al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625- 6631 ; US 5730977).
Explicación de Ia invención
La presente invención describe moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos que comprenden regiones variables (RV) de inmunoglobulinas humanas codificadas por las secuencias nucleotídicas SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8, o secuencias homologas; que reconocen un epítope en el VEGF- A humano definido alrededor de, aunque no necesariamente limitado a, los residuos C102, C57, R56, T31 y L32; e interfieren con su efecto pro-angiogénico. Se demuestra Ia capacidad de dichas moléculas para neutralizar los efectos pro- angiogénicos del VEGF-A humano en modelos in vitro e in vivo relevantes a Ia neo- angiogénesis. Estas moléculas están formadas por uno o más sitios de unión al antígeno, constituidos estos sitios a partir de aminoácidos codificados por secuencias de ADN de regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas. A los efectos de esta invención se define Ia siguiente terminología: • Anticuerpos recombinantes Describe una inmunoglobulina o partes de esta producidas parcial o totalmente de forma sintética (por Ia vía del ácido dexosirribonucleico (ADN) recombinante o de síntesis artificial de genes) con reconocimiento específico de un antígeno mediante uno o más dominios que interactúan con este (formados por combinaciones particulares de regiones variables de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas, y que se denomina comúnmente sitio de unión al antígeno) (Gavilondo y Larrick. 2000. Biotechniques 29: 128-136,). Ejemplos de anticuerpos recombinantes son los llamados anticuerpos quiméricos y humanizados, en los cuales se asocian por ingeniería genética las regiones variables (o partes de estas) obtenidas de una especie, con regiones constantes de inmunoglobulinas de otra especie. Entre los anticuerpos recombinantes también están los fragmentos de anticuerpos producidos por ingeniería genética que comprenden uno o más sitios de unión al antígeno. Ejemplos de fragmentos recombinantes de anticuerpos son: (i) el fragmento Fab que incluye los dominios VL, VH, CL y CH1 de una inmunoglobulina; (ii) el fragmento Fd, que consiste en los dominios VH y CH 1 ; (iii) el fragmento Fv, que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento scFv, donde los dominios VH y VL de un único anticuerpo se unen en diferente secuencia (VH-VL o VL-VH) con un segmento de unión peptídico (linker) que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et al. 1988. Science 242: 423-426;
Huston et al. 1988. PNAS USA 85: 5879-5883); (v) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos de forma similar al scFv, pero donde el pequeño tamaño del linker no permite a los dominios VH y VL de una misma molécula scFv asociarse entre sí, y los sitios de unión al antígeno se forman mediante Ia asociación de dos o más scFv (WO94/13804; Holliger P et al. 1993. PNAS USA 90: 6444-6448); (vi) otros fragmentos como el dAb (Ward SE eí al. 1989. Nature 341 : 544-546), regiones determinantes de Ia complementaridad (en inglés "Complementaήty Determinant Región", abreviado CDR) aisladas, fragmentos F(ab')2 y dímeros biespecíficos de scFv (PCT/US92/09965; Holliger P y Winter G. 1993. Current Opinión Biotechnol. 4: 446-449; de Haard, H et al. 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31 :5-31). Algunos tipos de fragmentos, como los scFv y los Fab, se pueden obtener asimismo a partir de bibliotecas de anticuerpos, donde un repertorio amplio de genes (ya sea sintéticos o naturales) de las regiones variables de una especie se combinan al azar para producir asociaciones particulares de regiones variables de anticuerpos, que se exponen luego en Ia superficie de fagos filamentosos.
Son también anticuerpos recombinantes las moléculas "tipo anticuerpo" producidas por ingeniería genética cuando se ensamblan artificialmente fragmentos de anticuerpo a regiones constantes de anticuerpos. Por ejemplo, es posible construir una molécula "tipo anticuerpo" bivalente uniendo un scFv a una región formada por los dominios bisagra, CH2, CH3 y en ocasiones CH4 del Fc de una inmunoglobulina, que en dependencia de poseer todas o parte de las regiones descritas y de su grado de glicosilación, puede exhibir funciones efectoras asociadas al Fc de las inmunoglobulinas.
• Sitio de unión al antíqeno. Epítope
El primer término describe Ia parte de un anticuerpo que interactúa específicamente con un antígeno (o parte de él). Cuando el antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina epítope. Un sitio de unión de un anticuerpo está formado principalmente por dos regiones variables de anticuerpo, Ia región variable de cadena ligera y Ia región variable de cadena pesada. El sitio de unión de anticuerpo se forma por Ia interacción no covalente de las regiones variables. El sitio de unión de un anticuerpo puede ser estabilizado de forma artificial mediante Ia unión de las dos regiones variables con un péptido de unión (linker) que no interfiera con sus propiedades de reconocimiento específico del antígeno. Este es el caso de un fragmento tipo scFv. De forma natural, los sitios de unión de anticuerpo se ensamblan mediante Ia interacción no covalente de las regiones variables, que se refuerza mediante Ia interacción no covalente de los dominios CH1 y CL (kappa o lambda) que siguen en Ia estructura de Ia molécula nativa a las regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente. Los anticuerpos completos nativos poseen dos sitios de unión al antígeno idénticos. El epítope reconocido por el sitio de unión de un anticuerpo, en el caso de ser el antígeno una proteína, puede estar formado por una secuencia lineal de aminoácidos, o ser conformacional, entendiéndose por ello que los aminoácidos reconocidos por el sitio de unión del anticuerpo están cercanos en Ia estructura terciaria de Ia proteína, pero no son necesariamente secuenciales en su estructura primaria. En el caso de proteínas, el epítope es por naturaleza una zona discreta, definida por un grupo particular de aminoácidos que interactúan con los del anticuerpo mediante enlances no covalentes.
• Anticuerpo homólogo
Se trata de un anticuerpo natural o producido por ingeniería genética que reconoce de forma específica un epítope de un antígeno, que es también identificado de forma específica por otro anticuerpo diferente. Los dos anticuerpos en cuestión pueden estar relacionados en las secuencias de sus regiones variables (por ejemplo, uno se deriva de otro gracias a mutaciones que pueden ser más o menos extensas), o pueden tener secuencias de regiones variables totalmente diferentes. Esto último se debe a que las interacciones específicas entre anticuerpos y antígenos, especialmente en el caso de las proteínas, se produce mediante interaciones de superficie, es decir, Ia formación de enlaces no covalentes (enlaces de hidrógeno, de van der Waals y similares) entre residuos aminoacídicos de las regiones variables (aunque pueden participar de forma discreta algunos residuos cercanos estructuralmente a estas). Ello hace que dos anticuerpos diferentes cuyos sitios de unión sean diferentes en cuanto a secuencia, pueden aún así presentar una suficiente identidad de interacción con el epítope particular, que los haga específicos para este. Un anticuerpo homólogo debe ser capaz por tanto de identificar de forma específica el epítope particular reconocido por otro anticuerpo. El término homólogo es extensible a otras formas de anticuerpos comprendidas en las definiciones que aparecen arriba para anticuerpos recombinantes (fragmentos de anticuerpos, moléculas "tipo anticuerpo", y otras).
• Específico Se refiere a Ia situación en Ia cual un anticuerpo o fragmento de este no presenta una unión significativa a otras moléculas diferentes de su pareja de unión específica. Este término es también aplicable al caso donde un sitio de unión al antígeno es específico para un epítope particular que aparece en un número de antígenos relacionados o no, en cuyo caso el sitio de unión será capaz de unirse a varios antígenos que porten el mencionado epítope.
En una realización de Ia invención, las molécula polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos son: un fragmento de anticuerpo tipo Fv de cadena simple (scFv) humano (scFv 2H1), un fragmento de anticuerpo Fab (Fab 2H1-32) y moléculas bivalentes tipo "anticuerpo completo" ScFv2-Fc (ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2- Fc 2H1 8.2). En todas ellas las RV diferentes se ensamblan espontáneamente entre sí para formar sitios de unión al antígeno. En Ia estabilidad de este ensamblaje pueden contribuir segmentos de unión artificiales (linkers) u otras secuencias relacionadas con anticuerpos, como son dominios constantes de las ¡nmunoglobulinas. Las RV se derivan de las contenidas en un scFv que se aisló de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos scFv humanos desplegados en Ia superficie de fagos filamentosos, construida empleando exclusivamente un repertorio de RV de cadenas lambda humanas. Gracias a Ia estrategia empleada, las moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos descritas en esta invención tienen RV de inmunoglobulinas con secuencias de ADN novedosas y diferentes a las reportadas por otros autores que también han obtenido anticuerpos que neutralizan Ia acción pro-angiogénica del VEGF-A, como aquellos derivados de hibridomas (Kim, KJ. et al. 1992. Growth Factors 7:53-64; Muller, Y. et al. 1997. Proc Nati Acad Sci USA 94: 7192-7197; Asano, M. et al. 1998. Hybridoma 17:185-190; Schaeppi, JM. et al. 1999. J Cáncer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brekken, RA. et al. 2000. Cáncer Res 60: 5117-5124; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Reléase 74:173-181), a partir de Ia transformación de células humanas por virus (US 5730977), por medio de Ia modificación por ingeniería genética de anticuerpos pre-existentes (Jayson, G. et al. 2002. JNCI 94: 1484-1493; Ferrara, N. eí al. 2005. Biochem Biophys Res Común 333: 328-335), y los provenientes de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos humanos (Vitaliti, A. et al. 2000. Cáncer Res 60: 4311-4314; Fuh, G. et al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631). Las moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas con anticuerpos descritas en Ia presente invención también son novedosas en tanto reconocen un epítope conformacional en el VEGF-A humano que es diferente de los definidos por otros anticuerpos que neutralizan el VEGF-A humano (Muller, Y. et al. 1997. Proc Nati Acad Sci USA 94: 7192-7197; Muller, AY. eí al. 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaeppi, JM. et al. 1999. J Cáncer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brekken, RA. et al. 2000. Cáncer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. er a/. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631 ; WO2005012359).
Los efectos anti-angiogénicos que se obtienen con Ia aplicación de las moléculas polipeptídicas recombinantes descritas en esta invención, y sus variantes equivalentes, se producen debido a que interfieren con Ia interacción del VEGF-A humano con los receptores presentes en las células endoteliales vasculares activadas, Io que influye en Ia capacidad de estas para proliferar y mantener su estabilidad fisiológica. En el contexto de esta invención se consideran "variantes equivalentes" aquellas moléculas polipeptídicas derivadas de otras asociaciones y manipulaciones de las secuencias contenidas en las RV 2H1 RVCP (SEC ID No. 7) y 2H1 RVCL (SEC ID No. 8) y otras RV homologas contenidas en esta invención (SEC ID No. 13) que retienen Ia capacidad de reconocer específicamente al VEGF-A humano y de interferir con su efecto biológico de estimulación del crecimiento de las células endoteliales y pro-angiogénico. Estas moléculas polipeptídicas pueden tomar Ia forma de otros fragmentos de anticuerpos recombinantes, como un scFv donde el dominio VL esté antepuesto al VH, o donde se empleen otros segmentos de unión (linkers) conocidos en el estado del arte, o como fragmentos F(ab')2, Fabc, Facb, scFv diméricos, triméricos y tetraméricos (Winter G, Milstein C. 1991. Nature 349: 293-299; WO94/13804; de Haard, H et al. 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31 :5-31). También cuando mediante Ia adición de otras secuencias derivadas de inmunoglobulinas se logran producir moléculas multivalentes (Bestagno M et al. 2001. Biochemistry 40: 10686-10692). Además, pueden estar en Ia forma de moléculas de anticuerpo biespecíficas, donde una porción de las mismas conserven su especificidad para el VEGF-A humano y otra tenga una especificidad diferente, o en Ia forma de anticuerpos completos, donde estas secuencias se asocien a las regiones constantes de inmunoglobulinas humanas o de otra especie. Todas estas manipulaciones por ingeniería genética son conocidas para aquellos expertos en el arte.
Se consideran también "variantes equivalentes" aquellas moléculas o variantes producidas por el llamado transplante de CDR en que las secuencias de las CDR contenidas en las RV 2H1 RVCP (SEC ID No. 7) y 2H1 RVCL (SEC ID No. 8) y otras RV homologas, como las contenidas por ejemplo en Ia SEC ID No. 13, se coloquen artificialmente en el marco de secuencias que no sean las originales que las flanquean, como es revelado, por ejemplo, en EP-B-0239400, EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y que esta manipulación no afecte su capacidad de reconocer específicamente el VEGF-A humano y de interferir con el crecimiento de las células endoteliales y Ia pro-angiogénesis.
La molécula polipeptídica recombinante en forma de fragmento scFv (denominada scFv 2H1 ) reconoce específicamente diferentes isoformas de VEGF-A humano. En esta, las RV de cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas están unidas genéticamente en ese orden por un segmento de unión (linker) de 16 aminoácidos, para formar Ia secuencia de ADN que se describe en SEC ID No 6. El fragmento scFv 2H1 fue obtenido a partir de un scFv homólogo que denominamos scFv 2H1-F, seleccionado de una biblioteca de scFv desplegados en fagos filamentosos, construida empleando un repertorio de RV de cadenas lambda humanas, por métodos semejantes a los ya descritos (Rojas G, et al. 2005. Biochem Biophys Res Común 336:1207-1213). El sesgo intencional en el repertorio de RV de cadena ligera de Ia biblioteca empleada se diseñó para aumentar Ia probabilidad de encontrar anticuerpos diferentes a los reportados por otros autores, y que neutralizaran el VEGF-A por mecanismos distintos a los ya identificados.
En el proceso de selección a partir de Ia biblioteca se empleó una proteína de fusión que contiene Ia ¡soforma 121 del VEGF-A humano, Ia cual ha sido mutada en tres residuos, R82, K84, H86 que fueron sustituidos por ácido glutámico; de manera que afecta su interacción con el receptor KDR (Shen, B. et al. 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985), como se demuestra en el Ejemplo! Esta proteína de fusión recombinante (denominada P6447aa-VEGF, SEC ID No. 3) se produjo en bacterias, se purificó de forma similar a Ia que se recuperaran aquellas especies moleculares que poseen Ia actividad biológica in vitro correspondiente al VEGF-A humano. Por tanto, el antígeno empleado en Ia presente invención es diferente a antígenos o inmunógenos usados por otros autores que han buscado anticuerpos monoclonales o recombinantes que reconozcan el VEGF humano. El dominio de proteína P64K de Neissería meningitidis, localizado en el extremo N-terminal de P6447aa-VEGF, aumenta Ia inmunogenicidad, permite altos niveles de expresión en E. co// y que se produzcan formas diméricas como las que manifiestan Ia actividad biológica del VEGF humano. La zona mutada comprende un epítope ya reconocido por otros anticuerpos reportados como neutralizantes de las funciones biológicas del VEGF-A (Muller, Y. et al. 1997. Proc Nati Acad Sci USA 94: 7192-7197; Muller, AY. et al. 1998. Structure δ: 1153-1167). De acuerdo a esta invención, el uso de Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF para Ia selección de sitios de unión al VEGF humano, a partir de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos scFv que contiene un repertorio de RV de cadena lambda, fue un factor determinante para poder identificar un fragmento de anticuerpo (scFv 2H1-F) que reconoce un epítope conformacional de VEGF-A humano no descrito anteriormente.
Para producir Ia molécula polipeptídica scFv 2H1 , Ia secuencia de ADN del fragmento scFv 2H1-F obtenido de Ia biblioteca se clonó desde el vector fagomidio correspondiente hacia un vector de expresión para periplasma. El scFv 2H1 , con peso molecular aparente algo por encima de los 29 kDa, se recupera del medio de cultivo y del periplasma de las bacterias transformadas, y se purifica fácilmente mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos (en inglés "Metal ion affinity chromatography, abreviado IMAC) (Porath J. 1992. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281). El vector de expresión pACR.1 añade al extremo C-terminal de Ia molécula scFv 2H1 un dominio de péptido c-myc que sirve como "marca" para propósitos analíticos, seguido de un dominio de seis histidinas para facilitar Ia purificación por IMAC.
La molécula polipeptídica recombinante en forma de fragmento Fab (denominada Fab 2H1-32) reconoce específicamente diferentes isoformas de VEGF-A humano. En esta, las secuencias de ADN codificantes para las RV del scFv 2H1 , denominadas 2H1 RVCP (SEC ID No. 7) y 2H1 RVCL (SEC ID No. 8) se clonaron en el vector pFabHum-1 , donde las mismas se asociaron genéticamente a las regiones constantes CH1 y Cλ de inmunoglobulinas humanas tipo IgG, respectivamente, como se describe en SEC ID No. 10 y SEC ID No. 9. El plasmidio pFabHum-1 es un vector bicistrónico construido para Ia expresión de fragmentos Fab con regiones constantes Cλ y CH 1 humanas en el periplasma bacteriano. Las cadenas polipeptídicas producidas comprenden las RV y su región constante ligera o pesada particular, que se ensamblan para formar un fragmento Fab en el periplasma bacteriano, adonde son exportadas desde el citoplasma gracias a péptidos señales que aporta el vector. El ensamblaje del Fab periplasmático se basa en interacciones no covalentes entre las RV de cadena pesada y ligera, y entre los dominios CH1 y Cλ, y se refuerza mediante un enlace covalente tipo disulfuro entre dos cisteínas ubicadas cerca del C-terminal de las regiones CH1 y Cλ, aportado también por el vector. El Fab 2H1-32 tiene peso molecular aparente de 50 kDa. Las moléculas polipeptídicas recombinantes bivalentes tipo "anticuerpo completo" denominadas ScFv2-Fc 2H1-8.2 y ScFv2-Fc 2H1-4.1 comprenden las secuencias de las RV del scFv 2H1 , asociadas a una secuencia que codifica para 10 aminoácidos espaciadores, seguidos por Ia secuencia nucleotídica que codifica para las regiones bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana tipo IgGI (SEC ID No. 14) y una secuencia muy semejante a Ia anterior (SEC ID No 13), con sólo ligeros cambios de bases en las RV, respectivamente. Estas moléculas se obtuvieron luego del clonaje de los productos de Ia RCP del gen que codifica para el scFv 2H1 , excluyendo los dominios 3' de este, que codifican para el péptido c-myc y seis histidinas, en el vector pVSJG-HucFc. El vector pVSJG-HucFc está diseñado para Ia expresión de moléculas tipo "anticuerpo completo" que comprenden dos scFv idénticos asociados a un Fc de inmunoglobulina humana tipo IgG, en células de mamíferos. La cadena polipeptídica que da origen a estas moléculas bivalentes se transporta al retículo endoplásmico de las células -de mamífero gracias a un péptido señal de inmunoglobulinas presente en el vector pVSJG-HucFc. El péptido se remueve en el retículo endoplásmico y dos cadenas polipeptídicas idénticas se asocian covalentemente a través de los enlaces disulfuro en las regiones bisagra, unión que se refuerza por las interacciones no covalentes de las regiones CH2 y CH3. Las moléculas ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2 tienen peso molecular aparente semejante de entre 100 y 120 kDa. Las proteínas secretadas tienen su extremo aminoterminal cuatro aminoácidos adicionales (QVLK) aportados por el vector.
Los anticuerpos recombinantes de Ia invención, como el scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2, pueden producirse además en otros sistemas eucariotes, como es el caso de plantas transgénicas (Pujol, M. et al. 2005. Vaccine 23: 1833-1837).
En otro aspecto de Ia invención, las moléculas polipeptídicas recombinantes antes descritas reconocen de forma específica las isoformas 121 y 165 del VEGF-A humano, y no identifican el VEGF de ratón. Pueden unirse a VEGF-A humano soluble, a VEGF-A humano adsorbido en superficies sólidas, o a VEGF-A humano asociado o cercano a células humanas que Io producen, entre estas últimas aquellas presentes en tumores humanos creciendo en ratones desnudos (atímicos). Las moléculas polipeptídicas de Ia presente invención, entre ellas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2, son capaces de interactuar con el VEGF-A humano activo, de forma tal que interfieren con el crecimiento de células endoteliales humanas in vitro, y de procesos de neo-angiogénesis in vivo, medido esto último mediante los modelos de tapón (pellet) de Matrigel subcutáneo en ratones, y de trasplante de células tumorales humanas en ratones atímicos congénitos (desnudos). Las moléculas polipeptídicas recombinantes descritas en Ia invención no reconocen el VEGF-A de ratón, e interfieren efectivamente Ia asociación entre el VEGF-A humano y una forma soluble del receptor KDR. La aplicación de las moléculas polipeptídicas scFv 2H1 y ScFv2-Fc 2H 1-4.1 evita Ia aparición de neovascularización coroidea (NVC), o mejoran su evolución, en un modelo experimental de primate no humano donde Ia NVC se produce mediante fotocoagulación por láser. Las moléculas polipeptídicas Fab 2H1-32 ScFv2-Fc 2H1- 8.2 pueden también producir efectos semejantes sobre Ia NVC, teniendo en cuenta que su especificidad por el VEGF humano es similar a Ia de las moléculas polipeptídicas scFv 2H1 y ScFv2-Fc 2H1 4.1 , y tienen efecto anti-angiogénico en los otros modelos in vitro e in vivo.
Las moléculas polipeptídicas recombinantes de Ia presente invención pueden conjugarse o acoplarse a una enzima o sus fragmentos, a un modificador de Ia respuesta biológica, a una toxina o droga, o a isótopos radiactivos, que añaden a Ia molécula original una característica funcional adicional a Ia de unir al antígeno VEGF-A humano, pudiendo ser esta Ia capacidad de identificar y/o afectar Ia viabilidad de células que se encuentren en una zona anatómica de un organismo multicelular donde exista una alta concentración de VEGF-A humano, o en su vecindad inmediata, o Ia de interactuar con formas de VEGF-A que estén asociadas a Ia membrana celular.
Las moléculas polipeptídicas objeto de esta invención, en tanto que poseen Ia capacidad de reconocer e interactuar con el VEGF-A humano y de interferir con su efecto pro-angiogénico y de estimulación de Ia proliferación de células endoteliales, pueden también afectar otras funciones biológicas descritas para el VEGF humano, como aquellas en las cuales esta molécula actúa en Ia regulación negativa de Ia respuesta inmune (Chouaib S et al. 1997. Immunology Today 18:493-497). Un conjunto de elementos hacen que las moléculas polipeptídicas objeto de Ia presente invención sean novedosas respecto a otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan el VEGF-A humano. Entre estos elementos están:
(a) las secuencias de bases que codifican para las RV que componen los sitios de unión al antígeno de las moléculas polipeptídicas descritas en esta invención, no se han reportado antes, y difieren de las de otros anticuerpos anti-VEGF-A. La secuencia de las CDR, en particular Ia CDR3 de Ia RV de cadena pesada, se diferencia notablemente de otras anteriormente reportada que son ricas en los aminoácidos aromáticos tirosina y/o triptofano, Io que se ha relacionado con el reconocimiento de un determinado epítope (Fellouse F.A. et al. 2004. PNAS 101 :12467-12472). En el caso de las moléculas polipeptídicas descritas en esta invención, el CDR3 de Ia RV de cadena pesada no posee tirosinas.
(b) Ia especificidad inmunoquímica por el VEGF-A humano de las moléculas polipeptídicas descritas en esta invención difiere de Ia de fragmentos Fab humanos obtenidos de otras bibliotecas (Fuh G. et al. 2006. J. Biol Chem 281 : 6625-6631), que también reconocen VEGF-A de ratón.
(c) las moléculas polipeptídicas descritas en esta invención son muy dependientes para su reconocimiento del VEGF-A humano de que este posea una conformación dimérica biológicamente activa, como demuestra Ia pérdida del reconocimiento luego del tratamiento del VEGF-A con agentes reductores.
(d) las moléculas polipeptídicas descritas en esta invención reconocen un epítope conformacional en el VEGF humano no descrito antes, si se compara con los epítopes reportados para otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan las funciones biológicas del VEGF-A humano (Muller Y et al. 1997. PNAS 94: 7192-7197; Muller AY. et al. 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaeppi J.-M. et al. 1999. J Cáncer Res Clin Oncol 125: 336-342; Fuh G. et al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631 ; WO2005012359).
Como se muestra en el Ejemplo 9, el análisis in silico de las probables asociaciones entre Ia secuencia peptídica seleccionada específicamente por el fragmento de anticuerpo scFv 2H1 , a partir de una biblioteca combinatoria de péptidos lineales de 12 aminoácidos, y los datos conocidos de las estructuras primaria y terciaria del VEGF-A humano; sugieren que el sitio de unión al antígeno del scFv 2H1 está ¡nteractuando con un epítope conformacional en Ia molécula de VEGF-A humano. La zona reconocida en Ia estructura terciaria del VEGF-A no coincide con los epítopes descritos para otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan el VEGF-A humano, y es por tanto novedosa. Esta definición epitópica abre también nuevas posibilidades de conocimiento sobre Ia compleja interacción entre el VEGF-A humano y su receptor KDR, que no está aún resuelta. Las moléculas polipeptídicas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H 1-8.2 descritas en Ia presente invención, y sus variantes equivalentes, son capaces de interactuar con el VEGF-A humano activo, e interferir con su efecto de estimulación de Ia neo-angiogénesis. Debido a ello, son útiles para el desarrollo de tratamientos novedosos para enfermedades que cursan con una angiogénesis anormal y excesiva, entre las cuales se encuentran: (a) el cáncer (tanto los tumores primarios como sus metástasis); (b) enfermedades oculares como Ia degeneración macular asociada a Ia edad, variante húmeda, los glaucomas neovasculares, y Ia retinopatía diabética y del recién nacido; (c) procesos inflamatorios agudos y crónicos como el asma, el distrés respiratorio, Ia endometriosis, Ia ateroesclerosis, y los edemas tisulares; (d) enfermedades de origen infeccioso como las Hepatitis y el sarcoma de Kaposi; (e) enfermedades autoinmunes como Ia diabetes, Ia psoriasis, Ia artritis reumatoide, Ia tiroiditis; y (f) otras varias enfermedades y estados, tales como el rechazo al transplante de órganos, los hemangiomas y los angiofibromas. Otro aspecto de Ia presente invención es el uso de las moléculas descritas en Ia presente invención para producir una composición farmacéutica para Ia inhibición de Ia angiogénesis y el tratamiento de condiciones patológicas asociadas a Ia misma. Dicho tratamiento comprende Ia administración de una cantidad efectiva de las moléculas descritas en Ia presente invención a un ser humano.
En una realización de Ia invención, estas moléculas polipeptídicas recombinantes que reconocen el VEGF humano son útiles para el tratamiento de procesos neoplásicos malignos y sus metástasis. En una realización preferida, son efectivas en el tratamiento de carcinomas, sarcomas y tumores vascularizados. En el Ejemplo 12, Ia aplicación de moléculas descritas en esta invención tuvo efecto de inhibición del crecimiento de un carcinoma humano, trasplantado a ratones desnudos atímicos. Algunos ejemplos de tumores que pueden ser tratados con esta estrategia incluyen (pero no se limitan a): tumores epidermoides, tumores escamosos como los de cabeza y cuello, tumores colorectales, de próstata, de mama, de pulmón (incluyendo los de células pequeñas y no pequeñas), de páncreas, tiroides, ovario e hígado. También resultan efectivos en el tratamiento de otros tipos de tumores, como el sarcoma de Kaposi, las neoplasias del sistema nervioso central (neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales), melanomas, carcinomas renales y gastrointestinales, rabdomiosarcoma, glioblastomas, y leiomiosarcomas.
Debido a que las moléculas polipeptídicas recombinantes descritas en Ia presente invención poseen un reconocimiento epitópico del VEGF-A humano que las distingue del Bevacizumab como se presenta en el Ejemplo 5, y por tanto son diferentes en cuanto a Ia forma de interferir en Ia unión entre el VEGF-A humano y su receptor, las mismas pueden desarrollar efectos terapéuticos in vivo diferentes de otras moléculas que también actúan inhibiendo esta interacción. Está bien documentado que es posible lograr diferentes efectos terapéuticos in vivo, incluyendo los efectos colaterales del tratamiento, mediante anticuerpos producidos contra un mismo antígeno, pero que reconozcan epítopes distintos, o que posean diferente afinidad (Alian D. G. P. 2005. The Oncologist 10: 760-761 ,). Igualmente, es conocido por las personas versadas en este campo de Ia técnica que moléculas que reconocen el VEGF humano por regiones diferentes a las identificadas por el anticuerpo recombinante humanizado Bevacizumab, pueden producir efectos de interferencia entre el VEGF y su receptor (Lee, F-H. et al. 2005. PNAS 102).
Es conocido que los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, como el Ranibizumab y el Bevacizumab, tienen aplicación en el tratamiento de otras enfermedades que cursan con una angiogénesis excesiva (Gaudreault, J. et al. 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46:726-733; Costa, RA et al. 2006. Investig Ophthalmol Visual Sci 47:4569-4578). En una realización de Ia invención, las moléculas polipeptídicas recombinantes descritas son útiles en el tratamiento de Ia degeneración macular asociada a Ia edad, variante húmeda. Dos de las moléculas descritas en esta invención, específicamente scFv 2H1 y ScFv2-Fc 2H1-4.1 , mostraron efecto preventivo y terapéutico (Ejemplo 14) sobre Ia neovascularización coroidea inducida por quemadura de láser en un modelo experimental de primate no humano. Respecto a las posibles diferencias en el potencial terapéutico de las moléculas referidas con las existentes en el estado del arte, cabe resaltar las diferencias intrínsecas al reconocimiento de un epítope diferente, así como el hecho de que el scFv 2H1 tiene aproximadamente Ia mitad del tamaño molecular que el fragmento Fab Ranibizumab, Io que Ie permite mejorar Ia penetración en las capas de Ia retina, hecho este que ha sido planteado como importante para un mejor efecto terapéutico. Igualmente, Ia molécula scFv2-Fc 2H 1-4.1 es menor en tamaño molecular que el Bevacizumab, Io que Ie otorga ventajas. En otra realización de Ia invención, las moléculas polipeptídicas recombinantes descritas, o sus variantes equivalentes, se emplean en procedimientos diagnósticos in vivo para formas de cáncer humano que expresan VEGF, como por ejemplo, los adenocarcinomas de colon, pulmón o mama, y otros. Para ello, las moléculas polipeptídicas específicas al VEGF-A humano descritas en esta invención pueden ser radiomarcadas, e inyectadas en Ia forma de agentes que permitan obtener imágenes demostrativas de Ia presencia y localización de tumores que expresan VEGF-A en el hombre. Para ello, se asocia una molécula polipeptídica como las descritas en esta invención a un isótopo radiactivo y se determina Ia unión de estas al tumor. El método puede comprender Ia administración de Ia molécula polipeptídica radiomarcada a un individuo. Como se demuestra experimentalmente en Ia invención, el fragmento scFv 2H1 radiomarcado con 125I se une al VEGF-A humano expresado por células tumorales humanas trasplantadas a ratones desnudos atímicos y se acumula específicamente en Ia zona del tumor. La reactividad con tejidos que expresan anormalmente altas cantidades de VEGF-A humano se puede detectar mediante cualquier medio apropiado. Cuando se usa un radionúclido como 125I, 111In o 99mTc para marcar a las moléculas polipeptídicas descritas en Ia presente invención, estos se localizan preferiblemente en el tumor, y no en los tejidos normales, Ia presencia del mareaje radioactivo en el tejido tumoral puede ser detectado y cuantificado usando una cámara ganma o un contador ganma. La calidad de Ia imagen del tumor obtenida se correlaciona directamente con Ia relación señal:fondo (Goldenberg DM. 1992. Int. J. of Biol. Markers, 7; 183- 188). El uso experimental de 125I se ejemplifica en esta invención, pero no limita el empleo de otros radionúclidos diferentes. Si estos radionúclidos tienen capacidad terapéutica, como el 131I1 90Y, etc., las moléculas polipeptídicas descritas en Ia presente invención, una vez radiomarcadas, proporcionan un efecto terapéutico beneficioso para el paciente, al alojarse en Ia zona del tumor productor de VEGF-A humano y afectar tanto a las células tumorales, como a las que componen sólo a los vasos sanguíneos tumorales, así como a otros elementos celulares del estroma tumoral que producen VEGF-A.
De acuerdo a Io anterior, y como sugiere el mencionado ejemplo, las moléculas polipeptídicas descritas en Ia presente invención, o sus variantes equivalentes, acopladas a otros agentes pueden ser Ia base de métodos de tratamiento que comprenden su administración como medicamentos o composiciones farmacéuticas. De esta forma, estas moléculas acopladas químicamente o mediante ingeniería genética a radionúclidos terapéuticos, toxinas, drogas o modificadores de Ia respuesta biológica, pueden dirigir el efecto terapéutico de los elementos acoplados a zonas anatómicas con una concentración anormalmente alta de VEGF- A humano, como puede ser un tumor y su vecindad inmediata, y ejercer un efecto terapéutico. La cantidad a administrar, Ia frecuencia e intervalos de administración, dependen de Ia naturaleza y severidad de Ia enfermedad que es tratada, y estas decisiones son Ia responsabilidad de especialistas y otros doctores en medicina, que se basan en Io ya conocido en este campo de Ia técnica.
Las composiciones de Ia presente invención pueden administrarse aisladamente o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o secuencial, Io cual depende de Ia enfermedad que vaya a ser tratada. Las composiciones farmacéuticas comprenden, además del ingrediente activo, un excipiente, tampón, estabilizador o "carrier" farmacéutico aceptados, u otros materiales bien conocidos para aquellos diestros en el arte. Estos materiales no son tóxicos, no interfieren con Ia eficacia del ingrediente activo, y su naturaleza precisa depende de Ia ruta de administración, sea oral, mucosal, o parenteral, por ejemplo, inyección endovenosa.
Las moléculas descritas en Ia presente invención, o sus variantes equivalentes, se producen por Ia expresión del ácido nucleico que las codifica. Por tanto, también son parte de Ia presente invención las secuencias de ácido nucleico que codifican para cualquiera de las moléculas polipeptídicas antes descritas y los procedimientos para
Ia expresión de dicho ácido nucleico. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica, principalmente (aunque no exclusivamente), para las secuencias de bases que se ejemplifican para las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y
ScFv2-Fc 2H1-8.2.
Para Ia expresión recombinante de las moléculas descritas en Ia presente invención, o sus variantes equivalentes, se pueden escoger o construir vectores apropiados que contengan las secuencias regulatorias adecuadas al caso, incluyendo promotor, terminador, aumentador (enhanceή, poliadenilación, genes marcadores y otras secuencias pertinentes. Los vectores pueden ser plasmidios.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema del plasmidio pACR.1 , empleado para Ia producción de fragmentos solubles tipo scFv en el periplasma y medio de cultivo de E. coli. El vector tiene un promotor LacZ, un sitio de unión a ribosomas (en inglés Ribosome Binding Site, abreviado RBS) y el péptido señal (SP) pe/B. Figura 2. Secuencia de ADN (SEC ID No.6) que codifica para el fragmento de anticuerpo recombinante scFv 2H1 , producido en el vector pACR.1 de E. coli. Las primeras 354 bases conforman Ia región variable (RV) de cadena pesada de inmunoglobulina humana (denominada 2H1 RVCP, SEC ID No.7), seguidas por 48 bases que codifican para el segmento de unión (linker), que continúan con 333 bases que codifican para Ia RV de cadena ligera de inmunoglobulina humana (denominada 2H1 RVCL, SEC ID No. 8), para terminar con 69 bases que codifican para los aminoácidos que proporciona el sitio de clonaje, el péptido c-myc y seis histidinas contenidas en el vector. Las bases subrayadas representan las anotaciones de las CDR, según Kabat et al. (Sequences of Immunological Interest, Department of Health and Public Servcies, Fifth Edition, 1991 ), en el orden (de arriba abajo): CDR1 de RV de cadena pesada (RVP), CDR2 de RVP, CDR3 de RVP, CDR1 de RV de cadena ligera (RVL), CDR2 de RVL y CDR3 de RVL.
Figura 3. Resultados de Ia expresión del scFv 2H1 en E. coli BL-21. De izquierda a derecha se observan el patrón de peso molecular (66, 45, 35, 29, 20 y 14,2 kDa; carril 1); un scFv control (scFv M3; carril 2), el sobrenadante de cultivo de las bacterias transformadas con el plasmidio pACR.1-scFv 2H1 (carril 3), donde se ve una banda reforzada que migra algo por encima de 29 kDa, y en el carril 4, el sobrenadante de cultivo de las bacterias transformadas con el plasmidio pACR.1 sin el inserto. Figura 4. Resultados de Ia purificación del scFv 2H1 mediante IMAC. La Figura 4A es una electroforesis en geles de poliacrilamida (en inglés "Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide GeI Electrophoresis", abreviado SDS-PAGE) al 12% donde se observan, de izquierda a derecha: Un scFv control (scFv M3), de talla molecular de alrededor de 29 kDa (carril 1), Material de partida que contiene el scFv 2H1 (carril 2), y scFv 2H1 eluido con alta pureza (carril 3). En B se observa un Western blot realizado a partir de una réplica de Ia electroforesis anterior. Se empleó para Ia detección el anticuerpo monoclonal 9E10, que identifica el dominio c-myc presente en estas proteínas.
Figura 5. Resultados de un ELISA de competencia donde se evaluó Ia capacidad del scFv 2H1 purificado para bloquear el acceso de un receptor soluble de VEGF (KDR-Fc) al ligando (VEGF-A humano), este último adsorbido a Ia fase sólida. Se utilizaron diferentes concentraciones de scFv 2H1 , hasta 80 μg/mL y como control negativo un scFv anti-HBsAg (Antígeno de superficie del virus de hepatitis B). En el ensayo se detecta el KDR-Fc unido al VEGF-A humano en Ia fase sólida mediante anticuerpos anti-lgG humana conjugados con peroxidasa (Sigma).
Figura 6. Esquema del plasmidio pFabHum-1 , empleado para Ia producción de fragmentos solubles tipo Fab en el periplasma y medio de cultivo de E. coli. Figura 7. Secuencia de ADN (SEC ID No. 9 y SEC ID No. 10) de las dos cadenas que codifican para formar Ia molécula madura del fragmento de anticuerpo Fab 2H1- 32 que se ensambla en el periplasma bacteriano. En Ia Figura 7A y en el sentido 5'- 3', aparece Ia secuencia codificante para una región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas, seguida por Ia secuencia codificante de un dominio Cλ de inmunoglobulina. Las bases subrayadas representan las anotaciones de las CDR en el orden: CDR1 de RV de cadena ligera (RVL), CDR2 de RVL y CDR3 de RVL. En Ia Figura 7B, aparecen las secuencias codificantes para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas, un dominio CHI de inmunoglobulina humana, seis histidinas y un péptido c-myc. Las bases subrayadas representan las anotaciones de las CDR, en el orden: CDR1 de RV de cadena pesada (RVP), CDR2 de RVP y CDR3 de RVP.
Figura 8. Mapa del plasmidio pVSJG-HucFc, empleado para Ia obtención de moléculas divalentes tipo "anticuerpo completo", a partir del clonaje de fragmentos scFv entre los sitios de restricción AfI Il y Xba I (Figura 8A). Representación esquemática del tipo de molécula que se produce por las células de mamífero transfectadas con este plasmidio, una vez que se ha clonado en este un fragmento scFv dado (Figura 8B). Figura 9. Secuencia de ADN (SEC ID No. 13) que codifica para Ia molécula madura tipo anticuerpo denominada ScFv2-Fc 2H1-4.1. En el sentido 5'-3', aparecen una región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas, seguida por un segmento de unión (linker) y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas, para terminar en este orden con un espaciador que codifica para 10 aminoácidos, y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana tipo IgGL Las bases subrayadas representan las anotaciones de las CDR en el orden (de arriba abajo): CDR1 de RV de cadena pesada (RVP), CDR2 de RVP, CDR3 de RVP, CDR1 de RV de cadena ligera (RVL), CDR2 de RVL y CDR3 de RVL. Figura 10. Secuencia de ADN (SEC ID No. 14) que codifica para Ia molécula madura tipo anticuerpo denominada ScFv2-Fc 2H 1-8.2. En el sentido 5'-3', aparecen una región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas, seguida por un segmento de unión (linker) y una región variable de cadena ligera de ¡nmunoglobulinas, para terminar en este orden con un espaciador que codifica para 10 aminoácidos, y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana tipo IgGL Las bases subrayadas representan las anotaciones de las CDR en el orden (de arriba abajo): CDR1 de RV de cadena pesada (RVP), CDR2 de RVP, CDR3 de RVP, CDR1 de RV de cadena ligera (RVL), CDR2 de RVL y CDR3 de RVL.
Figura 11. Reconocimiento específico de los péptidos sobre fagos, en cuanto al sitio de unión del fragmento scFv 2H1 , en un ensayo tipo ELISA donde se evaluó Ia unión al fragmento adsorbido a una superficie sólida en presencia de un exceso de VEGF (Peprotech). En Ia Figura se muestran 10 clones de fagos portadores de péptidos, representativos del comportamiento que exhibieron los 35. En el experimento las muestras de fagos se incubaron o no con VEGF en solución. Figura 12. Mapeo de los residuos que definen principalmente el epítope reconocido en Ia molécula del VEGF-A por el scFv 2H1 , en comparación con aquellos descritos para otros anticuerpos. Para ello se emplea un diagrama representativo de Ia estructura terciaria del VEGF-A humano en su conformación dimérica, con hélices alfa, cadenas beta y lazos. Las dos moléculas idénticas del dímero aparecen como gris claro y negro. La posición de los residuos definidos como indicativos principales del epítope reconocido por el scFv 2H1 se marcan sólo en Ia cadena gris claro, y aparecen en negro, en representación Van der Waals (VDW). Los residuos reconocidos por otros anticuerpos se marcan como VDW gris claro en las Figuras A a Ia D. En Ia Figura 12E muestra Ia posición de aminoácidos contiguos (en VDW gris claro) que son diferentes cuando se comparan las secuencias del VEGF-A humano y de ratón, en relación con Ia posición del epítope definido por los residuos indicativos principales para el scFv 2H1 (en VDW negro). Figura 13. Capacidad de las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2, para interferir con el efecto estimulador del VEGF-A humano en el crecimiento de células endoteliales humanas de cordón umbilical (HuVEC). Las moléculas purificadas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2, se añadieron a tres concentraciones diferentes (barra rayada: 2 μg/mL; barra completa: 1 μg/mL y barra vacía: 0,5 μg/mL) con 10 ng/mL de VEGF-A humano (Peprotech).
Figura 14. Actividad anti-tumoral de las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2 a las dosis de: 2,5 mg/kg de peso (Figura 14A) y 25 mg/kg de peso (Figura 14B). Los puntos en las curvas se refieren a Ia media de los volúmenes estimados para los 5 animales/grupo. Control negativo: anticuerpo monoclonal no relacionado CB-Hep.1 (anti-HBsAg) a Ia dosis mayor.
Figura 15. Porciento de Ia dosis inyectada por gramo de tejido, después de 24 horas (primeras dos barras en cada tejido) y 48 horas (segundas dos barras en cada tejido) de ser inoculados el fragmento scFv 2H1 (barras oscuras) o el fragmento scFv Hep.1 (barras claras) radiactivos (125I) a ratones desnudos con tumores derivados de células humanas tumorales A431. Cada barra representa Ia media de los conteos recuperados de los órganos/tejidos recuperados de 5 ratones.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos Ejemplo 1. Clonaje, expresión en bacterias y purificación de Ia isoforma 121 del VEGF humano fusionada a P64K.
(a) Clonaje de Ia isoforma 121 del VEGF humano
Para el clonaje de Ia isoforma 121 del VEGF se utilizó Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (RCP) empleando Ia enzima Taq DNA Polymerase (Roche) y el procedimiento recomendado por el fabricante. En Ia RCP se usaron los oligonucleótidos sintéticos # 1 (SEC ID No. 1) y # 2 (SEC ID No. 2) que aparecen en Ia Tabla I1 como cebadores. Tabla 1.- Cebadores empleados en Ia RCP de Ia isoforma 121 del VEGF humano.
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En Ia técnica se empleó como molde el ADN del plasmidio pVEGF (Ojalvo, A. G. et al. 2003. Electronic J. Biotechnol. 6, 208-222), al cual se Ie introdujeron mediante RCP las mutaciones correspondientes para que los aminoácidos R82, K84 y H86 se sustituyeran por ácido glutámico.
La banda correspondiente al producto de Ia amplificación se extrajo de gel de agarosa al 2%. Luego de Ia digestión de Ia banda con las endonucleasas Nhe I y BamH1 , el ADN se purificó y clonó en el vector pM238 (Yero, D. et al. 2006. Biotechnol. Appl. Biochem 44:27-34). Mediante este vector, las proteínas se expresan en bacteria como proteínas de fusión con un dominio N-terminal de 47 aminoácidos de Ia proteína P64K de Neisseria meningitidis. El plasmidio resultante (P6447aa-VEGF) se secuenció automáticamente y se determinó que este contenía solamente las mutaciones descritas arriba, como muestra Ia SEC ID No. 3, con respecto a las secuencias de aminoácidos reportadas en Ia base de datos del Laboratorio de Biología Molecular Europeo (www.embl-heidelberg.de) para Ia zona de Ia isoforma del VEGF humano clonada.
(b) Expresión de Ia proteína de fusión en E. coli Se extrajo ADN plasmídico del clon P6447aa-VEGF y se usó para transformar Ia cepa de E. coli BL21. Varias colonias resultantes se inocularon en 50 mL de medio LB con Ampicillina y Triptόfano y se crecieron durante 5h a 370C. Posteriormente, se inocularon 25 mL de estos cultivos en 250 mL de medio M9 enriquecido con Ampicillina e incubaron nuevamente durante 2 h a 370C. La inducción se realizó por Ia adición de ácido 3 β-indolacrílico (40 μg/mL). Las células se colectaron 8 h después, y tras disrupción ultrasónica Ia proteína de interés quedó en el precipitado de ruptura. La solubilización se realizó con tampón fosfato de sodio más urea 6M. El sobrenadante se sometió a IMAC en matriz Ni-NTA (QIAGEN).
Las fracciones eluidas se evaluaron mediante SDS-PAGE, observándose dos bandas que comprenden más del 98% de Ia proteína en Ia preparación, con las tallas de alrededor de 26 kDa, 54 kDa y mayores. La primera talla corresponde a un monómero, mientras que Ia segunda a una molécula dimérica, y las mayores a agregaciones superiores. La fracción de elución se dializó en PBS, se sometió a una cromatografía en una columna Superosa F12 (Pharmacia), para seleccionar exclusivamente las especies de mayor peso molecular aparente (mayor o igual que 54 kDa), que se denominaron P6447aa-VEGF. Esta preparación se congeló a -2O0C para su uso posterior.
(c) Ensayo de unión a receptor con Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF. Se recubrió una ¡nmunoplaca Maxisorp (Nunc) de 96 pocilios con Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF o VEGF-A humano (Peprotech), ambos a 5 μg/mL en PBS por 16h a 40C. La placa se bloqueó a 220C con PBS-leche al 4% durante 1 h. El receptor humano soluble KDR-Fc (Sigma) se diluyó en PBS-leche al 4% en diferentes concentraciones, se añadió a Ia placa, y se incubó durante 1 h a 220C. Luego de lavados repetidos, Ia unión del receptor al recubrimiento se reveló empleando anticuerpos de cabra anti-lgG humana, conjugados con peroxidasa (Sigma), seguido de una solución de sustrato compuesta de orfo-fenilendiamina 0,5 mg/mL y peróxido de hidrógeno al 0,015%, en tampón citrato, pH 5,5. La lectura se realizó en un lector de placas de ELISA a 492 nm, y los valores medios de absorbancia se estimaron a partir de tres pozos réplica por muestra experimental. La Tabla 1a demuestra que Ia unión del receptor soluble se limitó a Ia fase sólida recubierta con el VEGF-A humano no mutado de Peprotech. La proteína de fusión P6447aa-VEGF, en Ia cual se introdujeron exprofeso tres mutaciones críticas (los residuos R82, K84, y H86 se sustituyeron por ácido glutámico) no se identificó por el KDR soluble, un resultado que coincide con las predicciones hechas por Shen et al. (Shen, B. et al. 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985), y que hace nuestro antígeno diferente de otros reportados en Ia literatura y usados para el desarrollo de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan el VEGF humano.
Tabla 1a. Ensayo de unión para KDR-Fc, usando VEGF-A o Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF como recubrimiento en ELISA.
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Ejemplo 2. Inmunización de ratones BALB/c con Ia proteína P6447aa-VEGF y evaluación de Ia capacidad de los sueros para reconocer VEGF isoforma 121 humano comercial. La potencialidad de Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF de generar anticuerpos neutralizantes al VEGF se evaluó mediante Ia inmunización de 10 ratones BALB/c hembra (CENPALAB, Habana) de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se inmunizaron con 100 μg de Ia proteína P6447aa-VEGF por dosis, empleando el adyuvante conocido como VSSP (Estévez F. et al. 1999. Vaccine 99: 190-197), en un esquema de cuatro dosis, separadas por 7 días, por vía subcutánea. Una semana después de Ia última inmunización se realizó extracción de sangre a los animales y el suero se separó, se alicuotó y conservó a -2O0C. Para determinar el reconocimiento específico del VEGF por el suero de los animales inmunizados con Ia proteína P6447aa-VEGF se realizó un ELISA con Ia isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprotech). El mismo se inmovilizó en una inmunoplaca de 96 pozos Maxisorp (Nunc) a una concentración de 1 μg/ml en PBS, durante 16 horas a 40C. La placa se bloqueó a 220C con PBS-leche al 4% durante 1h. Luego se incubaron diluciones seriadas del suero, en PBS-leche al 4% por 1 h. La placa se lavó y se incubó con un conjugado anti-ratón peroxidasa (Sigma). La reacción se reveló con Ia solución sustrato compuesta por o/to-fenilendiamina 0,5 mg/mL y peróxido de hidrógeno 0,015%, en tampón citrato fosfato; pH 5,5. El suero de los animales inmunizados con Ia proteína P6447aa-VEGF reconoció de manera específica el VEGF humano comercial con títulos de hasta 1 :32 000. Ejemplo 3. Selección de sitios de unión de anticuerpos contra el VEGF humano.
Para Ia selección de sitios de unión contra Ia isoforma 121 del VEGF humano, se utilizó una biblioteca de fragmentos de anticuerpos del tipo Fv de cadena sencilla (scFv) humanos, sobre fagos filamentosos, construida especialmente para esta invención. En ella, las regiones variables (RV) de cadena ligera humana presentes en los scFv son las correspondientes a un repertorio de RV de tipo lambda. En el proceso de construcción de esta biblioteca sesgada a RV de cadena lambda, y de acuerdo a procedimientos reportados en Ia literatura (Rojas G, et al. 2005. Biochem Biophys Res Común 336: 1207-1213), los genes condificantes para el repertorio de RV de cadena pesada se recuperaron de una semibiblioteca y se ligaron al ADN plasmídico de otra semibiblioteca de regiones Vλ a una relación vector : inserto de 1 :1. Los productos de Ia ligazón se electroporaron a células TG1 para obtener Ia biblioteca final. La presencia y tamaño de los insertos se determinó en una muestra de 30 colonias, con oligonucleótidos que se asocian a las regiones flanqueantes de los scFv clonados.
En las selecciones a partir de esta biblioteca se empleó como antígeno Ia proteína recombinante P6447aa-VEGF. La mezcla de fagos que conforman Ia biblioteca se sometió previamente a un proceso de depleción con un exceso (1 mg/mL) del antígeno P64k en solución, para eliminar los scFv no deseados específicos para esta proteína. La mezcla depletada se enfrentó a Ia proteína P6447aa-VEGF inmovilizada en inmunotubos Maxisorp (Nunc). Para ello, los inmunotubos se recubrieron con 10 μg/mL de Ia proteína en PBS, a 4°C durante Ia noche, y luego se bloquearon con PBS-leche descremada al 4%. Los fagos que no se unieron se eliminaron mediante 20 lavados con una solución de PBS-Tween al 0,1 %, seguido por 2 lavados con PBS. A continuación, los fagos unidos se eluyeron con una solución de 100 mmol/L de trietilamina durante 10 min, que fue inmediatamente neutralizada con 0.5 mol/L de Tris (pH 7,5). Los fagos eluídos se amplificaron en Ia cepa TG 1 de E. coli y se usaron como material de partida en el próximo ciclo de selección. Este procedimiento se repitió 3 veces bajo las mismas condiciones. Posteriormente, se seleccionaron al azar colonias individuales de TG1 infectadas con los fagos eluidos del segundo y tercer ciclo de selección para producir fagos a escala de 96 pozos. La capacidad de estos clones de fagos que portan fragmentos scFv de anticuerpo para unir P6447aa-VEGF se evaluó por un ELISA. Para ello se recubrieron placas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con 10 μg/mL de P6447aa-VEGF, y luego se bloquearon. Los fagos diluidos en PBS-leche descremada al 4% se incubaron durante 1 hora a 22°C en las placas, seguido por varios lavados. Los fagos unidos se detectaron mediante Ia adición de anticuerpos anti-M13 conjugados a peroxidasa (Amersham) por 1 hora a 22°C. Luego de varios lavados, Ia reacción se reveló con Ia adición de solución sustrato. La absorbancia se leyó a 492 nm en un lector de microplacas. De los 96 clones de fagos evaluados mediante este ELISA, 87 de ellos resultaron positivos. El ADN que codifica para los fragmentos de anticuerpos tipo scFv que portan los clones de fagos que resultaron positivos por ELISA se amplificó por RCP y sometió a un análisis de restricción con Ia enzima BstN-l. El producto de esta digestión se observó en un gel de agarosa al 4%. De este análisis se identificaron 7 patrones de restricción diferentes y se seleccionó un clon representativo de cada patrón. Para Ia producción de los clones de fagos seleccionados se infectaron bacterias TG-1 , que se crecieron a 28°C por 16 horas. Se precipitaron los fagos contenidos en el sobrenadante de los cultivos con una solución de PEG 5000 en 2,5 M de NaCI; y se alicuotaron para Ia caracterización inmunoquímica que se describe a continuación.
Ejemplo 4. Caracterización inmunoquímica de los scFv en fagos seleccionados de Ia biblioteca. (a) Reconocimiento de diferentes isoformas de VEGF humano y murino
Para determinar el reconocimiento específico del VEGF humano, isoformas 121 y 165, asi como de Ia isoforma 165 del VEGF murino, los 7 clones de fagos portadores de fragmentos scFv se sometieron a un ensayo ELISA. Las inmunoplacas se recubrieron con las isoformas 121 y 165 de VEGF humano (Peprotech) y Ia isoforma 120 de VEGF murino (R&D) a una concentración de 1μg/ml en PBS. Después de bloquear las placas, se añadieron los fagos purificados como se describe arriba y diluidos en PBS-leche descremada al 4%, y se incubaron durante 1 hora a 22°C. Luego de varios lavados, los fagos unidos se detectaron mediante Ia adición de anticuerpos anti-M13 conjugados. La reacción se reveló y midió como se describe en el Ejemplo 2. Se empleó como control negativo una muestra de Ia mezcla de fagos que conforman Ia biblioteca antes de seleccionar, precipitada como se ha descrito anteriormente. Como se observa en Ia Tabla 2 los 7 clones de fagos seleccionados para esta caracterización reconocen específicamente las ¡soformas 121 y 165 del VEGF humano. De ellos, los clones 2H1-F y 3C1 no reconocen a Ia isoforma 120 del VEGF murino. La Tabla muestra Ia capacidad de reconocimiento de los clones, clasificándose como positivos (+) aquellos que dieron densidades ópticas en el ELISA por encima de 5 veces el control negativo.
Tabla 2. Reconocimiento de diferentes isoformas de VEGF-A humano y del VEGF-A murino por 7 clones de scFv desplegados en fagos filamentosos.
Clon de fago Isoforma 121 de Isoforma 165 de Isoforma 120 de
VEGF-A humano VEGF-A humano VEGF-A de ratón
3C1 + +
2B2 + + +
2D2 + + +
2E1 + + +
3E8 + + +
2H1-F + +
2E3 + + +
(b) Reconocimiento diferenciado entre VEGF-A humano nativo y reducido Para estudiar Ia importancia del plegamiento del VEGF-A en su forma nativa de homodímero, respecto al reconocimiento de los distintos fragmentos de anticuerpos seleccionados de Ia biblioteca, se realizó un ELISA recubriendo con VEGF humano, isoforma 121 (Peprotech). Después de bloqueada Ia placa, Ia mitad de los pozos se trató con una solución de 5OmM de ditiotreitol en PBS-leche al 4% durante 1 hora a 22°C y a Ia otra mitad solo se Ie añadió PBS-leche al 4%. Después de varios lavados, a los pozos donde se había reducido el VEGF-A con Ia solución de ditiotreitol se Ie adicionó una solución de iodoacetamida a 100 mM en PBS-leche al 4% y se incubó por 1 hora a 220C. El resto de los pozos se mantuvo con PBS-leche al 4%. Después de lavar nuevamente Ia placa, se añadieron los fagos purificados, diluidos en PBS-leche al 4%, tanto en los pozos tratados con ditiotreitol como los no tratados y se incubaron durante 1 hora a 22°C. Luego de varios lavados, los fagos unidos se detectaron mediante Ia adición de anticuerpos anti-M13 conjugados a peroxidasa. Se empleó como control negativo una muestra de Ia mezcla de fagos que conforman Ia biblioteca antes de seleccionar. La Tabla 3 muestra que se observan 3 patrones: uno en que no se afectó el reconocimiento frente al VEGF reducido (ejemplificado por el clon 3C1), un segundo patrón en el que se observó una afectación parcial (ejemplificado por los clones 2B2 y el 3E8) y un tercero donde se evidenció una afectación completa del reconocimiento ante Ia forma reducida del VEGF (ejemplificado por los clones 2D2, 2E1 , 2H1-F y 2E3). Se tomó Ia capacidad de reconocimiento de los clones para el VEGF-A, en términos de Ia Densidad Óptica (a 492 nm) promedio de tres pozos obtenida en el experimento, y como referencia aquella producida por el control negativo.
Tabla 3. Reconocimiento de VEGF-A humano tratado con ditiotreitol por 7 clones de scFv desplegados en fagos filamentosos.
Figure imgf000032_0001
(c) ELISA de competencia entre una forma soluble del receptor de VEGF (KDR-Fc) y los fagos seleccionados, por el VEGF-A humano Se evaluó mediante un ELISA de competencia Ia capacidad de los clones de fagos seleccionados para bloquear el acceso de un receptor soluble de VEGF al antígeno. Para ello se recubrieron inmunoplacas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con Ia isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprotech). Las placas se bloquearon y posteriormente los pozos se incubaron con una mezcla del clon de fago correspondiente, diluido en PBS-leche al 4%, y 2 μg/mL de receptor soluble (KDR-Fc, Sigma), o sólo con el vehículo (PBS-leche al 4%). Los fagos unidos se detectaron con un conjugado anti- M13 peroxidasa (Amersham). Como se muestra en Ia Tabla 4 el clon que mostró más evidencias de bloquear Ia unión del KDR-Fc al VEGF-A fue el 2H1-F. La Tabla muestra Ia capacidad de reconocimiento de los clones para el VEGF-A, en términos de Ia Densidad Óptica (a 492 nm) promedio de tres pozos obtenida en el experimento, tomándose como referencia aquella producida por el control negativo
Tabla 4. Reconocimiento de VEGF-A humano luego de mezclar los 7 clones de scFv desplegados en fagos filamentosos, de manera individual, con 2 μg/mL de KDR-Fc.
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 5. Expresión del fragmento scFv 2H1 en E. coli, purificación y caracterización de su reconocimiento para el VEGF humano.
(a) Clonaje del scFv 2H1 en el vector pACR.1 y secuenciación El vector pACR.1 es un plasmidio diseñado para Ia expresión de fragmentos de anticuerpos hacia el periplasma de E. coli (Figura 1). Como elementos principales tiene el promotor LacZ, un péptido señal, sitios de restricción Ncol y Not I para Ia inserción del gen del fragmento, un dominio codificante del péptido c-myc y una secuencia que codifica para 6 histidinas, esta última con vistas a Ia purificación de los productos de expresión mediante IMAC. El ADN correspondiente al fagomidio que porta el scFv denominado 2H1-F se empleó como molde para Ia RCP. Este procedimiento se realizó con Ia enzima ProofStart (Stratagene), y el procedimiento recomendado por el fabricante. En Ia técnica se emplearon los oligonucleótidos sintéticos # 3 (SEC ID No.4) y # 4 (SEC ID No.5) como cebadores (Tabla 5).
Tabla 5. Oligonucleótidos sintéticos para Ia amplificación y modificación del scFv 2H1-F contenido en el vector de fagomidio, con vistas a su clonaje en el vector pACR.1.
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A partir de Ia amplificación se obtuvo una banda de Ia talla esperada (700 pb), que se purificó a partir de gel de agarosa al 1 % empleando el kit de extracción de ADN de geles de QIAGEN, se digirió Neo I y Not I (Promega) y se repurificó para su ligazón. El vector pACR.1 se digirió Neo I y Not I (Promega), y se ligó con Ia banda predigerida empleando T4 ADN ligasa (Promega). El producto de Ia reacción de ligazón se usó para transformar E. coli competentes (cepa XL-1 Blue; Stratagene) mediante electroporación. Las células transformadas se plaquearon en medio sólido selectivo y se crecieron a 37°C. Los métodos empleados son ampliamente conocidos (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. 1989. Sambrook, Fritsch y Maniatis).
Se purificó ADN plasmídico a partir de distintas colonias (QIAGEN MiniPrep kit), y se chequeó por digestión con las enzimas de restricción ya descritas para el producto esperado de Ia ligazón. Se escogieron varios plasmidios para obtener Ia secuencia consenso de ADN del scFv 2H1 , empleando secuenciación automática y cebadores específicos que hibridan externamente a las regiones de clonaje del vector pACR.1. La secuencia de ADN consenso obtenida para el fragmento completo (VH-linker-VL- c myc-histidinas) denominado scFv 2H1 (SEC ID No. 6) aparece en Ia Figura 2. El plasmidio representativo de esta construcción se denominó pACR.1-scFv 2H1. Esta misma Figura presenta las secuencias individuales de Ia RV de cadena pesada (denominada 2H1 RVCP; SEC ID No. 7), y de cadena ligera (denominada 2H1 RVCL; SEC ID No. 8). Según Ia clasificación de Kabat et al., Ia 2H1 RVCP pertenece al Subgrupo I de regiones variables de inmunoglobulinas humanas y Ia 2H1 RVCL puede clasificarse en varios grupos de regiones variables de inmunoglobulinas humanas tipo lambda. Aparecen subrayadas en Ia Figura las secuencias de las CDR, anotadas según Ia clasificación de Kabat et al.
(b) Expresión del scFv 2H1 en E. coli
Se empleó el pACR.1-scFv 2H1 para transformar células competentes BL21 de E. coli. Esta cepa permite Ia expresión de Ia proteína heteróloga en el periplasma y/o el medio de cultivo. La transformación se plaqueó en medio sólido selectivo y se permitió el crecimiento a 37°C. Una colonia representativa de Ia construcción se creció en medio líquido y al alcanzar 1 de DO530nIn se indujo por 12 horas añadiendo 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (en inglés "isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside", abreviado IPTG) al medio de cultivo. Las células se centrifugaron y el contenido periplasmático se aisló mediante shock osmótico y sonicación breve. Tanto Ia fracción periplasmática, como el sobrenadante de cultivo se evaluaron en SDS-PAGE al 12%, en condiciones de desnaturalización. Este ensayo reveló Ia expresión de una proteína de peso molecular aparente por encima de 29 kDa, según Io esperado, cuando se compara con el patrón de pesos moleculares, y con un scFv anti-antígeno carcinoembrionario [scFv-M3]; (Pérez L. et al. 2006. Biotechnol. Appl. Biochem. 43: 39-48) (Figura 3). La mayoría del fragmento se encuentra en el sobrenadante de cultivo. (c) Purificación del fragmento scFv 2H1 utilizando IMAC
Para Ia purificación se aprovechó Ia presencia del dominio de seis histidinas en Ia proteína recombinante, aportado por el vector pACR.1. Estas secuencias confieren a las proteínas una afinidad muy alta por iones metálicos (por ejemplo, Zn+2, Cu+2' Ni+2) que pueden ser quelados a diferentes soportes cromatográficos. Las bacterias recombinantes transformadas con el vector pACR.1-scFv 2H1 se centrifugaron y el sobrenadante se dializó por 72 horas en el tampón de acomplamiento (NaH2PO4 5OmM, 30OmM NaCI, pH 7-8). Las preparaciones conteniendo el scFv se aplicaron directamente a una matriz de Agarose-NTA (QIAGEN). La Figura 4A demuestra que se obtiene una proteína con una alta pureza que sigue migrando algo por encima de 29 kDa. Las fracciones obtenidas se evaluaron por Western Blot utilizando como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal específico (9E10) contra el péptido derivado del c-myc que contiene esta proteína y en el patrón (scFv-M3), seguido por anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma). La Figura 4B demuestra que el AcM 9E10 detectó al scFv 2H1 sin presentarse degradaciones importantes.
(d) Reconocimiento específico del VEGF humano por el scFv 2H1 en ELISA
Para ello se recubrieron ¡nmunoplacas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con las isoformas 121 y 165 de VEGF humano (Peprotech) y Ia isoforma 120 de VEGF de ratón (R&D) a una concentración de 1 μg/ml en PBS durante 16 horas a 40C. Después de bloqueadas las placas con PBS-leche descremada al 4% se añadió el scFv 2H1 purificado, a distintas concentraciones en PBS-leche descremada al 4% y se incubó durante 1 hora a 22°C. Luego de varios lavados se añadió un anticuerpo monoclonal específico (9E10) contra el péptido derivado del c-myc que contiene esta proteína (1 μg/mL), seguido por anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma). La unión del fragmento al antígeno en Ia fase sólida se reveló y midió como se describe en otros ejemplos. Se empleó como control negativo un scFv anti-HBsAg no relacionado, obtenido y purificado de manera semejante a Ia descrita. En Ia Tabla 6 se observa que el scFv 2H1 mantiene el reconocimiento específico descrito para el scFv de fago (2H1-F) que Ie dio origen. La Tabla muestra Ia capacidad de reconocimiento del fragmento por los diferentes VEGF-A, en términos de Ia Densidad Óptica (a 492 nm) promedio de tres pozos obtenida en el experimento, tomándose como referencia aquella producida por el control negativo.
Tabla 6. Reconocimiento de diferentes isoformas de VEGF-A humano y de VEGF-A de ratón por el fragmento scFv 2H1.
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(e) ELISA de competencia entre una forma soluble del receptor de VEGF (KDR-Fc) y el scFv 2H1 , por el VEGF-A
Se evaluó mediante un ELISA de competencia, Ia capacidad del scFv 2H1 purificado para bloquear el acceso de un receptor soluble de VEGF al antígeno. El ensayo se basa en Ia inhibición de Ia unión de un receptor soluble KDR-Fc al VEGF-A humano adsorbido a una superficie sólida, mediante Ia adición de concentraciones crecientes de scFv 2H1. Para ello se recubrieron inmunoplacas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprotech) a una concentración de 1 μιg/mL en PBS durante 16 horas a 40C. Las placas se bloquearon y posteriormente los pozos se incubaron con concentraciones crecientes de scFv 2H1 purificado, y 0,5 μg/mL de receptor soluble (KDR-Fc, SIGMA), o sólo con el vehículo (PBS-leche al 4%). Se empleó como control negativo un scFv anti-HBsAg. El KDR-Fc unido al VEGF-A humano en Ia fase sólida se detectó con anticuerpos anti-lgG humana conjugados con peroxidasa (Sigma). Como se muestra en Ia Figura 5, el scFv 2H1 es capaz de afectar Ia unión del receptor soluble al VEGF-A humano en Ia fase sólida, con una clara dependencia de Ia dosis utilizada.
(f) Comparación inmunoquímica entre el scFv 2H1 y el Avastin
Se comparó el fragmento bacteriano scFv 2H1 con Bevacizumab (Avastin®, Genentech) con respecto a su capacidad de identificación de Ia proteína de fusión P6447aa-VEGF, originalmente usada para el procedimiento de selección de anticuerpos en fagos descrito en el Ejemplo 3 y que dio origen al scFv 2H1-F. Se inmovilizaron P6447aa-VEGF o VEGF-A humano (Peprotech) en inmunoplacas Maxisorp (Nunc) de 96 pocilios a una concentración 1 μg/ml in PBS, durante 16h a 40C. La placa se bloqueó a 220C con PBS-leche al 4% durante 1 h. Se incubaron diluciones seriadas de scFv 2H1 o Bevacizumab en PBS-leche al 4% por 1h, se lavaron las placas, y se realizó otra incubación como sigue: (i) para el scFv 2H1 , con el anticuerpo monoclonal anti c-myc 9E10, seguido de anticuerpos anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma), y (ii) para el Bevacizumab, con anticuerpos de cabra anti-lgG humana, conjugados con peroxidasa (Sigma). Las reacciones se revelaron con una solución sustrato compuesta de orfo-fenilendiamina 0,5 mg/mL y peróxido de hidrógeno 0,015%, en tampón citrato pH 5,5. Como se ve en Ia Tabla 6a, que presenta las absorbancias promedio a 492 nm obtenidas en un lector de ELISA, con 3 pozos réplicas por muestra estudiada, el scFv 2H1 reconoce tanto P6447aa-VEGF como el VEGF-A humano, mientras que el Bevacizumab sólo reconoce el VEGF-A humano de Peprotech. Las moléculas no relacionadas scFv anti-HBsAg y TheraCIM (anticuerpo humanizado IgGI contra el receptor de EGF; CIMAB SA, Habana) se usaron como controles negativos.
Tabla 6a. Inmunoreactividad del fragmento scFv 2H1 y el Bevacizumab contra P6447aa-VEGF y Ia isoforma 121 del VEGF-A humano.
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Ejemplo 6. Expresión del scFv 2H1 en Pichia pastoris y demostración de su reconocimiento para el VEGF humano.
(a) Re-amplificación del scFv y clonaje en el vector pPS9
El gen que codifica para el scFv 2H1 se digirió Ncol/Xbal a partir del pACR.1-2H1 con vistas a su clonaje en el vector de expresión pPS9 de Pichia pastoris. El plasmidio pPS9 es un vector integrativo que contiene un fragmento de 1 ,15 Kb que corresponde al promotor de Ia enzima alcohol oxidasa (AOX.1) seguido del gen que codifica para Ia señal de secreción de Ia sucrosa invertasa (sucll) de Saccharomyces cerevisiae, un sitio múltiple de clonaje, un fragmento de 960 pb de Ia enzima gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (Gapt) para garantizar Ia terminación de Ia transcripción, y el gen HIS3 de S. cerevisiae como marcador de selección. Además, este vector contiene un fragmento de 2.1 kb, correspondiente a Ia secuencia 3' del gen AOX.1. Todos estos elementos están insertados en un vector pUC18 (EP0438200 A1). Luego de Ia digestión Ncol/Xbal del gen del 2H1 , y purificación desde gel de agarosa esta se ligó al vector pPS9 previamente digerido Ncol/Spel, y los productos de Ia ligazón se emplearon para transformar Ia cepa XL-1 Blue de E. coli. Se analizaron colonias aisladas correspondientes a Ia transformación de Ia cepa con cada vector recombinante, utilizando una RCP de colonias con un cebador que híbrida en el promotor, seleccionándose aquellas que resultaron contener el inserto. La secuenciación de los genes clonados se realizó según procedimiento descrito en otros ejemplos. Las secuencias obtenidas para los plasmidios recombinantes denominados pPS2H1-12 y pPS2H1-13 concuerdan, y contienen el scFv 2H1 , con secuencia compatible a Ia citada en SEC ID No. 6. Se obtuvieron cepas recombinantes de P. pastoris con estos dos plasmidios mediante Ia electroporación de Ia cepa salvaje MP36 his 3 (Yong V. et al. 1992. Biotechnol. Applic. 9: 55-61), previamente digeridos con Ia enzima de restricción Pvull (Promega), y seleccionando en medio mínimo deficiente de histidina. Producto de los diferentes mecanismos de recombinación de los plasmidios con sitios específicos en el genoma de P. pastoris, se lograron aislar dos tipos de fenotipos diferentes de cepas secretoras: (a) cepas cuyo gen del AOX.1 no fue afectado durante el evento de recombinación y, por consiguiente, crecieron en un medio con metanol y mostraron un crecimiento similar al de Ia cepa salvaje (Mut+) y (b) cepas cuyo gen de AOX.1 fue reemplazado por el cásete de expresión y manifestaron un crecimiento lento en presencia de metanol (Mut s).
(b) Estudios de expresión
Los estudios de expresión del fragmento de anticuerpo se realizaron partiendo de las colonias prototróficas His+ crecidas en placas con medio selectivo. Se inocularon 10 ml_ de medio rico tamponado en tubos de 50 ml_, con las colonias en cuestión y se colocaron a 280C con rotación de 150 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron 2 unidades de D. O a 600 nm, se centrifugó a 2000 rpm, durante 10 minutos. Los precipitados celulares se resuspendieron en 10 mL de medio rico con metanol en lugar de glicerol como fuente única de carbono. A partir de este momento y durante 96 horas se procedió a Ia inducción de las proteínas de interés, con Ia adición diaria de metanol puro hasta una concentración final de 1 % en el cultivo. Como control negativo se empleó Ia cepa MP36his3 transformada con un vector sin inserto.
Culminado el período de cultivo las células se centrifugaron y se colectó el medio de cultivo metabolizado durante Ia fase de inducción, el cual se centrifugó una vez más para su clarificación final y detección del scFv 2H1 en SDS-PAGE al 15%. Este ensayo reveló Ia expresión, en ambos casos, de proteínas del peso molecular esperado (aprox. 29 kDa), que luego se evaluaron por Western Blot utilizando el
AcM 9E10, como anticuerpo primario, y anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma). Para las dos construcciones, las proteínas recombinantes fueron identificadas por el AcM 9E10.
(c) Reconocimiento del VEGF humano por el scFv 2H1 en ELISA
Se realizó un ensayo ELISA semejante al descrito para el scFv 2H1 derivado de E. coli, empleando similares fase sólidas, reactivos y condiciones de recubrimiento, incubación, revelado y controles. Las muestras de cultivo metabolizado de las cepas recombinantes inducidas se añadieron diluidas en PBS-1 % de leche, y se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente. Como controles negativos se emplearon medios metabolizados correspondiente a Ia cepa MP36 his 3, y un scFv anti-HBsAg no relacionado. Como control positivo se empleó el scFv 2H1 purificado. Se consideraron positivos aquellos valores de absorbancia al menos 4 veces mayores que los producidos por los controles negativos. Las muestras de medios metabolizados en fase de inducción del fragmento scFv 2H1 expresado en P. pastorís (denominado scFv 2H1-Pp17) resultaron positivas en cuanto a su capacidad de reconocimiento de VEGF-A humano adsorbido a una fase sólida.
Ejemplo 7. Obtención de fragmento Fab bacteriano a partir de las regiones variables del scFv 2H1 y caracterización de su reconocimiento para el VEGF humano
(a) Amplificación de las RV del scFv 2H1 , clonaje en el vector pFabHum-1 y secuencia
En Ia Figura 6 se esquematiza el plasmidio pFabHum-1 , empleado para Ia producción de fragmentos solubles tipo Fab en el periplasma y medio de cultivo de E. coli. El vector tiene un promotor LacZ, un RBS, Ia secuencia de un péptido señal (PS), sitios de clonaje para Ia región variable de cadena ligera (Sal I y Avr II), y Ia secuencia codificante para un dominio Cλ de inmunoglobulina humana, seguidos por otro RBS y secuencia de PS, sitios de clonaje para Ia región variable de cadena pesada (Apa Ll y Bst EII) seguidos por Ia secuencia codificante de un dominio CH1 de inmunoglobulina humana, extendida para incluir Ia primera cisteína de Ia región bisagra de una IgGI humana. La proteína RV pesada-CH1 se expresa asociada a un dominio de seis histidinas para Ia purificación mediante IMAC y a un péptido c- myc para propósitos analíticos, ambos en el extremo C-terminal y que aporta el propio vector. El ADN correspondiente al fagomidio que porta el scFv denominado 2H1-F se digirió primero con las enzimas Sal I y Avr Il para obtener Ia región variable de cadena ligera. Luego de verificar Ia talla en gel de agarosa al 1 ,5% se procedió al clonaje en el pFabHum-1. Una vez verificado el clonaje mediante enzimas de restricción, el plásmido (denominado pFab-Hum-1 RVL) se replicó, purificó y sometió entonces a una nueva digestión con las enzimas Apa Ll y Bst EII. En el caso de Ia Bst EII, Ia digestión fue parcial. Una vez verificada Ia talla en gel de agarosa al 1 ,5% se procedió al clonaje en el pFab Hum-1 RVL. Una vez verificado el clonaje mediante enzimas de restricción, el plásmido (denominado pFab 2H1-32), se replicó, purificó y se secuenció automáticamente. La secuencia de ADN codificante para Ia proteína madura Fab 2H1-32 se describe en Ia Figura 7. La correspondiente a Ia combinación RV de cadena ligera y Cλ se puede ver en 7A (SEC ID No.9) y Ia correspondiente a Ia combinación RV de cadena pesada y CH1 se puede ver en 7B (SEC ID No.10). Aparecen subrayadas en Ia Figura las secuencias de las CDR, anotadas según Ia clasificación de Kabat et al.
(b) Expresión del Fab en E. coli
Se empleó el pFabHum-1 H1-32 para transformar células competentes BL21 de E. coli. La transformación se plaqueó en medio sólido selectivo y se permitió el crecimiento a 37°C por 16 horas. Una colonia representativa de Ia construcción se creció en medio líquido y al alcanzar 1 de DO530nm se indujo por 12 horas añadiendo 1 mM de IPTG al medio de cultivo. Las células se centrifugaron y el contenido periplasmático se aisló mediante shock osmótico y sonicación breve, tanto Ia fracción periplasmática, como el sobrenadante de cultivo se evaluaron en SDS- PAGE al 12%. Este ensayo reveló Ia expresión de una proteína de peso molecular esperado (aprox. 50 kDa), que luego se evaluó por Western Blot utilizando como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal específico contra el péptido derivado del c-myc (9E10), seguido por anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma). El Western blot demostró que el AcM 9E10 detectó una proteína de Ia talla esperada, distribuida tanto en el sobrenadante de cultivo como en el periplasma bacteriano.
(c) Purificación del Fab 2H1-32 mediante IMAC y caracterización del reconocimiento de VEGF por ELISA Las bacterias recombinantes transformadas con el vector pFabHum-1 H1-32 se centrifugaron y el sobrenadante se dializó por 72 horas en el tampón de acomplamiento. Las preparaciones conteniendo el Fab se aplicaron directamente a una matriz de Agarose-NTA (QIAGEN). Después de eliminar los contaminantes de E. coli mediante lavados, el Fab 2H1-32 se obtiene en Ia fracción eluida con un pureza de alrededor del 85%, estimada por SDS-PAGE al 12%.
El fragmento Fab purificado se evaluó para su capacidad de reconocimiento de VEGF humano mediante un ensayo de ELISA. Para ello se recubrieron inmunoplacas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con las isoformas 121 y 165 de VEGF- A humano (Peprotech) y Ia isoforma 120 de VEGF-A de ratón (R&D) a una concentración de 1 μg/ml. Las muestras del Fab purificado se diluyeron y se incubaron una hora a 220C. Luego de varios lavados se añadió un anticuerpo monoclonal específico (9E10) contra el péptido derivado del c-myc (1 μg/mL), seguido por anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma). Se empleó como control negativo un scFv anti-HBsAg y como positivo el scFv 2H1 purificado. Como muestra Ia Tabla 7 se demostró que el Fab producido en E. coli reconoce de forma específica el VEGF humano por ELISA. La Tabla muestra Ia capacidad de reconocimiento del fragmento Fab 2H1-32 por los diferentes VEGF-A, en términos de Ia Densidad Óptica (a 492 nm) promedio de tres pozos obtenida en el experimento, tomándose como referencia aquella producida por el control negativo.
Tabla 7. Reconocimiento de diferentes isoformas de VEGF-A humano y de VEGF-A de ratón por el fragmento Fab 2H1-32.
Figure imgf000043_0001
Ejemplo 8. Obtención y caracterización del reconocimiento de moléculas diméricas que comprenden dos unidades del fragmento scFv fusionadas genéticamente al fragmento Fc de una IgGI humana.
(a) Obtención de transfectomas productores de moléculas scFv?-Fc anti-VEGF
Para obtener moléculas tipo "anticuerpo completo" con dos sitios de unión semejantes al definido por el scFv 2H1 , se realizó una RCP utilizando como molde el plásmidio pACR.1-scFv 2H1 que contiene Ia secuencia génica del scFv 2H1 y los cebadores # 5 (SEC ID No. 10) y # 6 (SEC ID No.11 ) que aparecen en Ia Tabla 8, para modificar Ia secuencia de ADN que codifica para este fragmento de anticuerpo y hacerla compatible con el clonaje que sigue. Este procedimiento se realizó con Ia enzima PanoTaq (Panorama Inc.), y el procedimiento recomendado por el fabricante.
Tabla 8. Cebadores empleados en Ia RCP del pACR.1-scFv 2H1 para su clonaje en pVSJG-HucFc.
Figure imgf000044_0001
El ADN amplificado se clonó en el vector pVSJG-HucFc. Este vector se representa en Ia Figura 8A y fue diseñado para Ia expresión en células de mamífero de una cadena polipeptídica que comprenda, en este orden: una secuencia líder (péptido señal) de Ia cadena pesada de un anticuerpo monoclonal murino, seguida de un fragmento scFv, separado por 10 aminoácidos (que actúan como espaciador) de las secuencias consenso que forman los dominios bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina IgGI humana. Gracias a Ia secuencia líder, esta cadena pasa al retículo endoplásmico, donde se dimeriza a partir de Ia formación de los enlaces covalentes disulfuros en el dominio bisagra y Ia asociación complementaria de las regiones CH2 y CH3. Los dominios bisagra, CH2 y CH3 forman así un Fc de inmunoglobulina humana, al cual están asociados por su extremo N-terminal dos scFv idénticos que Ia convierten en una molécula bivalente tipo "anticuerpo completo" (Figura 8B). Entre las características principales de este vector están Ia presencia de un promotor de Citomegalovirus.
La banda correspondiente al producto de Ia amplificación se digirió con las enzimas AfI Il y Xba I y se clonó en el vector pVSJG-HucFc, previamente digerido con estas mismas enzimas. De las colonias bacterianas resultantes de Ia transformación con esta preparación plasmídica recombinante se seleccionaron dos para secuencia. La secuencia automática detectó que las dos colonias . producían plasmidios recombinantes casi idénticos, que se denominaron scFv2-Fc 2H1-4.1 y scFv2-Fc 2H1-8.2, cuya única diferencia entre sí estaba en que el primero de estos tiene una base de Ia RV de cadena pesada diferente, que es silente respecto al aminoácido que codifica, y tres bases diferentes en Ia RV de Ia cadena ligera, todo respecto a las RV (SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8) del scFv 2H1. Las secuencias que codifican para las proteínas maduras resultantes aparecen en las Figura 9 (SEC ID No. 13) y Figura 10 (SEC ID No. 14), respectivamente. Aparecen subrayadas en Ia Figura las secuencias de las CDR, anotadas según Ia clasificación de Kabat et al.
Los dos plasmidios se purificaron en condiciones libres de endotoxina utilizando el sistema de Puré Yield Plasmid Midiprep (Promega), y se emplearon para transfectar células del mieloma P3/x63.Ag8.653 utilizando el reactivo SuperFect (QIAGEN). Los transfectomas se seleccionaron en presencia del marcador de selección G418. Los sobrenadantes obtenidos a partir de las colonias de transfectomas resistentes a este antibiótico se evaluaron mediante un ensayo de ELISA. Para ello se recubrieron ¡nmunoplacas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con Ia isoforma 121 del VEGF humano (Peprotech). Los sobrenadantes de las colonias de transfectomas diluidos en PBS- leche al 2% se adicionaron a las placas y Ia presencia de moléculas tipo ScFv2-Fc anti-VEGF se detectó con anticuerpos anti-Fc humano conjugado a peroxidasa (Sigma). Las colonias de células transfectomas que secretaron mayores cantidades de moléculas ScFv2-Fc anti-VEGF humano detectadas por ELISA se clonaron repetidamente por dilución limitante, en presencia de G418 y siempre evaluando su capacidad productora mediante ELISA. Después de dos clonajes consecutivos se obtuvieron dos clones estables independientes, productores del ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2.
(b) Purificación de las moléculas ScFv2-Fc 2H 1-4.1 y scFv?-Fc 2H 1-8.2 y evaluación de su capacidad de reconocimiento de VEGF humano por ELISA
Los clones de transfectoma productores de las moléculas ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2- Fc 2H 1-8.2 se cultivaron en frascos de 162 cm2 en presencia de 10% de suero fetal bovino y se colectó el sobrenadante a partir de alcanzada una alta densidad celular.
Los sobrenadantes de los dos clones se diluyeron 1 :1 en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0 y se purificaron de forma independiente mediante cromatografía de afinidad, empleando matrices de Proteína A Sepharosa Fast Flow 4 (Amersham). Las moléculas scFv2-Fc 2H 1-4.1 y scFv2-Fc 2H 1-8.2 se eluyeron con tampón Glicina 0,2 M; pH 4,0 y sometieron a una rápida neutralización con Tris 1 M; pH 10,0. Luego de diálisis contra PBS, se estimó Ia concentración mediante adsorbancia UV a 280 nm y Ia pureza por SDS-PAGE al 12%. Se determinó que Ia preparación tenía más de un 85% de pureza. Muestras de las moléculas purificadas se aplicaron a un sistema ELISA como el descrito en el procedimiento anterior, en comparación con sobrenadante sin purificar, determinándose que las mismas poseían una adecuada actividad de reconocimiento de VEGF-A humano por este método.
Ejemplo 9. Identificación del epitopo del VEGF humano reconocido por el scFv 2H1
(a) Selección de péptidos reconocidos por el scFv 2H1 a partir de bibliotecas combinatorias de péptidos en fagos filamentosos Para Ia identificación del epitopo reconocido por el scFv 2H1 en el VEGF-A humano se siguió Ia estrategia de enfrentar el scFv 2H1 a una biblioteca combinatoria de péptidos lineales de 12 aminoácidos, desplegada en Ia superficie de fagos filamentosos (Combinatoria Molecular. Santiago Vispo, N. (Ed.) Elfos Scientiae, 2004, La Habana.). La mezcla de fagos que conforman Ia biblioteca, diluida en PBS- leche descremada al 4%, se enfrentó al scFv 2H1 purificado de bacterias inmovilizado en inmunotubos (Nunc, Maxisorp). Para ello, los tubos se recubrieron con scFv, y luego se bloquearon con PBS-leche descremada al 4%. Los fagos que no se unieron al scFv en los inmunotubos se eliminaron mediante 20 lavados con una solución de PBS-Tween al 0,1 % y 2 lavados con PBS. Los fagos unidos se eluyeron con una solución de 100 mmol/L de trietilamina que fue inmediatamente neutralizada con 0,5 mol/L de Tris (pH 7,5). Los fagos eluídos se amplificaron en bacterias TG1 y se usaron como material de partida en el próximo ciclo de selección. Este procedimiento se repitió 3 veces bajo las mismas condiciones. Posteriormente, se seleccionaron al azar colonias individuales de TG1 infectadas con los fagos eluidos del segundo y tercer ciclo de selección para producir fagos a escala de 96 pozos.
La capacidad de unión de estos clones de fagos que portan péptidos al scFv 2H1 se evaluó mediante un ELISA de fagos. En este ELISA se recubrieron placas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) con scFv 2H1 , y luego se bloquearon. Los fagos diluidos en PBS-leche descremada al 4% se incubaron durante 1 hora a 22°C en las placas, seguido por varios lavados con PBS-Tween al 0,1 %. Los fagos unidos se detectaron mediante Ia adición de un conjugado anti-M13 peroxidasa (Amersham). De los 40 clones de fagos evaluados mediante este ELISA, 35 de ellos resultaron positivos y se emplearon para el procedimiento que aparece a continuación.
(b) ELISA de competencia por Ia unión al scFv 2H1
Para comprobar que los 35 clones de péptidos en fagos seleccionados reconocen específicamente al sitio de unión del scFv 2H1 , se realizó un ELISA donde se evaluó Ia competencia de los péptidos en fagos con el VEGF-A, por Ia unión al fragmento scFv adsorbido a una superficie sólida. Para ello se recubrió una placa de 96 pozos (Nunc, Maxisorp) con 10 μg del scFv 2H1 , y se bloqueó. La mitad de los pozos de Ia placa se incubaron con 10 μg /mL de VEGF (Peprotech) en PBS-leche descremada al 4%, y luego de varios lavados con PBS-Tween al 0,1 %, se añadieron los fagos diluidos en PBS-leche descremada al 4%, conteniendo 10 μg /mL de VEGF (Peprotech), que se incubaron en condiciones semejantes a las descritas. Simultáneamente, Ia otra mitad de los pozos de Ia placa se incubaron con PBS- leche descremada y luego de varios lavados con PBS-Tween al 0,1%, se añadieron los fagos diluidos en PBS-leche descremada al 4%. Los fagos unidos se detectaron mediante Ia adición de un conjugado anti-M13 peroxidasa (Amersham). Como se ve en Ia Figura 11 para una muestra de los clones ensayados, Ia presencia de VEGF impide completamente Ia unión de los péptidos asociados a fago al scFv 2H1 inmovilizado.
(c) Secuenciación de los péptidos obtenidos de las bibliotecas De una muestra de 20 de los 35 clones de péptidos caracterizados en el procedimiento anterior se obtuvo ADN de fagemido y se sometió a secuenciación automática. Las secuencias obtenidas para los 20 clones estudiados ofrecieron resultados idénticas, siendo esta: CCRTLMLLQYHR (SEC ID No 15).
(d) Estudio predictivo del epítope reconocido por el scFv 2H1 La secuencia definida en el procedimiento anterior se analizó mediante los programas FINDEPI (http://www.biocomp.cigb.edu.cu/findepi) y 3D Epitope Explorer (Schreiber A. J. 2005. Comput Chem 26: 879-887), con resultados semejantes. Estos son métodos computacionales que predicen parches proteicos de superficie implicados en las interacciones proteína-proteína. Como datos de entrada, los métodos precisan de Ia estructura 3D de un elemento de Ia pareja de interacción (proteína molde; en nuestro caso el VEGF-A humano, a partir del Banco de Datos de Proteínas PDB (Código 1 BJ1 ) y Ia secuencia aminoacídica del segundo elemento en esta interacción (proteína de unión; en nuestro caso el péptido CCRTLMLLQYHR; SEC ID NO. 15). A manera de ejemplo, el programa FINDEPI genera una base de datos de mimotopos potenciales de cada parche de superficie en Ia proteína molde, aplicando un conjunto de reglas estereoquímicas. Esta base de datos se explora usando métodos de alineamiento de perfiles para detectar mimotopos potencialmente similares a los péptidos seleccionados experimentalmente por su unión. Luego de aplicar un algoritmo de agrupamiento, el programa reporta una lista de residuos expuestos en Ia superficie de Ia proteína molde, con posibilidad de estar localizados en Ia interfase de interacción entre las dos proteínas. La certeza del método se ha ensayado con complejos proteína- proteína para los cuales se conoce su estructura cristalográfica, y para los que hay datos experimentales de secuencia de los péptidos que se unen.
Con ambos programas se definió una zona de interacción en Ia molécula de VEGF- A humano que comprende principalmente los residuos C102, C57, R56, T31 y L32 (anotados según el Banco de Datos de Proteínas PDB Código 1 BJ1 ). Se considera en esta invención que estos residuos son indicadores principales del epítope reconocido por el scFv 2H1. De acuerdo a las predicciones realizadas pudieran aparecer también asociados a los residuos indicadores principales del epítope descritos arriba, aunque con una puntuación menor, los residuos G59, C68, V69, P70 y H99. El epítope definido principalmente a través de los residuos C102, C57, R56, T31 y L32 no coincide con aquellos reportados para otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan el VEGF humano (Muller AY et al. 1997. PNAS 94: 7192-7197; Muller AY. et al. 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaeppi J.-M. et al. 1999. J Cáncer Res Clin Oncol 125: 336-342; Fuh G. et al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631 ; WO2005012359). El epítope definido principalmente a través de los residuos C102, C57, R56, T31 y L32 puede estar relacionado con Ia conservación de Ia estructura dimérica del VEGF-A, si tenemos en consideración los experimentos descritos en el Ejemplo 4 que indican Ia pérdida de reconocimiento del scFv 2H1 por su antígeno cuando este último se somete a una reducción de los puentes disulfuro, que separa el dímero en monómeros.
La Figura 12 muestra el mapeo de los residuos que definen principalmente el epítope reconocido en Ia molécula del VEGF-A por el scFv 2H1 , en comparación con aquellos descritos para otros anticuerpos. Para ello se emplea un diagrama representativo tipo cartoon de Ia estructura terciaria del VEGF-A humano en su conformación dimérica, con hélices alfa, cadenas beta y lazos. Las dos moléculas idénticas del dímero aparecen como gris claro y negro. Para simplificar, Ia posición de los residuos definidos como indicativos principales del epítope reconocido por el scFv 2H1 se marcan sólo en Ia cadena gris claro, y aparecen en negro, en representación Van der Waals (VDW). Los residuos reconocidos por otros anticuerpos se marcan como VDW gris claro en las Figuras 12 A a Ia D. Las Figuras 12A y 12B muestran que el epítope definido por los residuos indicativos principales para el scFv 2H1 es contiguo pero no solapado con aquel definido para los Fab G6 y B20-4 (Fuh G. et al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631 ). La Figura 12C muestra que el epítope definido por los residuos indicativos principales para el scFv 2H1 es bien diferente y alejado estructuralmente con aquel definido para el anticuerpo humanizado Bevacizumab, conocido comercialmente como Avastin. La Figura 12D muestra que el epítope definido por los residuos indicativos principales para el scFv 2H1 tampoco se solapa estructuralmente con aquel definido para el anticuerpo 3.2E3.1.1 (Muller AY et al. 1997. PNAS 94: 7192-7197).
En Ia Figura 12E se muestra Ia posición de aminoácidos contiguos (en VDW gris claro) que son diferentes cuando se comparan las secuencias del VEGF-A humano y de ratón, en relación con Ia posición del epítope definido por los residuos indicativos principales C102, C57, R56, T31 y L32 para el scFv 2H1 (en VDW negro). Es conocido en el estado del arte que los residuos contiguos a un epitope dado son críticos para Ia proyección de Ia estructura terciaria del mismo, y por tanto, para su reconocimiento por anticuerpos, así como que el cambio de un solo aminoácido es suficiente para determinar Ia especificidad de un anticuerpo por una molécula de una especie u otra (Fuh G. eí al. 2006. J Biol Chem 281 : 6625-6631). Ello pudiera explicar porqué el scFv 2H1 no reconoce el VEGF-A de ratón.
Todos estos elementos indican que el sitio de unión al antígeno definido por las RV que componen el scFv 2H1 es diferente a los de otros anticuerpos y fragmentos que neutralizan el VEGF humano reportados en Ia literatura, no sólo en cuanto a su secuencia de aminoácidos, sino también en Io que respecta al epítope reconocido en el antígeno y, por tanto, en su probable mecanismo de interferencia con las funciones biológicas del VEGF humano nativo. Ejemplo 10. Evaluación del efecto anti-proliferativo in vitro de diferentes moléculas que reconocen el VEGF humano, en el modelo de células endoteliales humanas de cordón umbilical, estimuladas con VEGF humano.
Se evaluó el efecto antiproliferativo in vitro de las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 y ScFv2-Fc 2H 1-8.2 en el modelo de células endoteliales humanas de Ia vena del cordón umbilical (HuVEC) estimuladas con VEGF humano. Brevemente, se sembraron 3 000 células HuVEC (PromoCell GmbH) por pozo en placas de cultivo celular de 96 pocilios (Costar), previamente recubiertas con Gelatina (Sigma) al 1 %, en medio RPMI 1640 suplementado con 1 % (v/v) de suero fetal bovino (Gibco) y se crecieron a 370C en atmósfera de 5% de CO2 durante 24 horas. Las células se estimularon con medio fresco suplementado con 10 ng/ml de VEGF-A humano (Peprotech) y se incubaron con diferentes concentraciones de las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2.
Las células HuVEC se crecieron en presencia de 10 ng/mL de VEGF-A humano, donde alcanzan una proliferación que se define arbitrariamente como 100% (controles de proliferación sin interferencia, barra VEGF), o se les añadieron mezclas de las moléculas purificadas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2, a tres concentraciones diferentes (barra rayada: 2 μg/mL; barra completa: 1 μg/mL y barra vacía: 0,5 μg/mL) con 10 ng/mL de VEGF-A humano (Peprotech). Se usó como control de inhibición Ia mezcla con el receptor soluble KDR-Fc a 0,5 μg/mL. Como control negativo se empleó un scFv anti-HBsAg en Ia mezcla. Después de 72 horas de incubación las células se tiñieron con 0,5% de violeta cristal en 20% de metanol. Las placas se lavaron con agua y se dejaron secar al aire. La tinción se eluyó con una solución 1 :1 de etanol en 0,1 M de citrato de sodio y se midió Ia absorbancia en un lector de placas a 562 nm. El valor de Ia absorbancia de Ia proliferación celular basal fue sustraída a todos los valores de Ia placa y los datos fueron representados como el porciento de inhibición respecto al control de máxima proliferación. Como se muestra en Ia Figura 13 las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2 provocan una inhibición de Ia proliferación de las células HuVEC, que es dependiente de dosis y que puede llegar a ser de entre 45 y 58%.
Ejemplo 11. Evaluación del efecto antiangiogénico in vivo de diferentes moléculas que reconocen el VEGF humano, en el modelo del pellet de Matrigel subcutáneo en el ratón.
Se evaluó el efecto antiangiogénico in vivo de las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2 en el modelo descrito por Passaniti y colaboradores (Passaniti A et al. 1992. Lab Invest. 67:519-28). En este modelo se induce Ia angiogénesis mediante una inoculación subcutánea de ratones C57BI/6 con un extracto de proteínas de Ia matriz extracelular (Matrigel, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA) en presencia de factores pro- angiogénicos. Los animales se dividieron en grupos de 10 y se inyectaron por vía subcutánea en Ia línea media abdominal con 500 μL de Matrigel conteniendo 100 ng de VEGF humano (Peprotech), y diferentes concentraciones de las moléculas a ensayar o de un anticuerpo no relacionado (CB-Hep.1 , Heber Biotec, Habana). A los seis días, los animales se sacrificaron y se les extrajo el tapón de Matrigel, a partir del cual se determinó el contenido de hemoglobina por el Método de Drabkin utilizando el sistema Drabkin's reagent kit (Sigma) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las moléculas scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1- 8.2 inhiben de manera significativa (p<0,001 ) Ia vascularización inducida por el VEGF humano en los pellet de Matrigel, Io cual se correlacionó con una disminución de los niveles de hemoglobina.
Ejemplo 12. Evaluación del efecto antiangiogénico in vivo de diferentes moléculas que reconocen el VEGF humano, en el modelo de ratones desnudos xenotrasplantados con células tumorales humanas de Ia línea A431.
Debido a que Ia angiogénesis inducida por el tumor y por algunas de las células del estroma tumoral es imprescindible para el crecimiento y Ia diseminación de los mismos, y esta angiogénesis está principalmente mediada el VEGF producido por estos elementos celulares, un modelo efectivo para el ensayo de sustancias anti- angiogénicas es aquel de Ia inhibición del crecimiento tumoral en animales. Debido a que el scFv 2H1 , y por tanto las moléculas derivadas de las RV que Io componen, identifican solamente VEGF humano, el modelo de crecimiento tumoral en ratones fue establecido con células tumorales humanas inoculadas a ratones atímicos congénitos (ratones desnudos; nu/nu). En el experimento realizado se emplearon 9 grupos de 5 ratones atímicos nu/nu de estirpe BALB/c (CENPALAB, Habana), con edades de entre 8 y 10 semanas. Los grupos de tratamiento se organizaron para cada una de las cuatro moléculas (scFv 2H1 , Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 y ScFv2-Fc 2H1-8.2) teniendo en consideración dos niveles de dosis: 25 mg/kg y 2,5 mg/kg por ratón en PBS pH 7,2. El noveno grupo (control negativo) fue tratado sólo con el vehículo (PBS pH 7,2). Los ratones se inocularon por vía subcutánea con 5x106 células tumorales humanas de Ia línea A431 (ATCC, CRL 1555) en Ia zona dorsal derecha. Cuando los tumores alcanzaron volúmenes de 200 mm3 los ratones se aleatorizaron en los 9 grupos de 5 animales y se comenzó el tratamiento según Io indicado para cada grupo experimental. Las administraciones se realizaron por vía ¡ntrapeπtoneal, en un volumen de 200 μL totales, cada 2 días durante 3 semanas. El control fue inoculado con el anticuerpo monoclonal murino no relacionado CB-Hep.1 a Ia dosis mayor. Se realizó el seguimiento del crecimiento tumoral con mediciones de los diámetros mayor (largo) y menor (ancho) de los tumprs, usando un calibrador digital. Los volúmenes tumorales se calcularon como: volumen tumoral (mm3) =0.52 x largo (mm) x ancho2 (mm). Se compararon los volúmenes tumorales para todos los grupos a Io largo del período de observación mencionado, empleando como estadígrafo un ANOVA de una vía y un post-test de Bonferroni. En ese momento, los animales se sacrificaron y los tumores se removieron quirúrgicamente y analizaron por histopatología mediante tinción con Hematoxilina y Eosina. Como demuestra Ia Figura 14, todos los ratones inoculados con scFv 2H1 , Fab 2H1- 32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 y ScFv2-Fc 2H 1-8.2 manifestaron una reducción estadísticamente significativa del volumen tumoral respecto al control negativo, y una marcada dependencia de dosis. De las cuatro moléculas, ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2 dieron los mejores resultados, pudiendo esto estar relacionado con el mayor tamaño de Ia molécula, que aumenta su biodisponibilidad, a pesar de que en términos del número de sitios de unión al antígeno inyectados, por unidad de masa, el scFv 2H1 tiene una ligera ventaja sobre los otros dos tipos de molécula. Las diferencias encontradas entre el Fab y el scFv 2 H1 no fueron estadísticamente significativas, aún cuando Ia diferencia en masa es casi del doble, a favor del Fab. Esto puede deberse a que, en el caso de anticuerpos cuyo efecto se basa en neutralizar moléculas solubles más que en afectar directamente a las células tumorales, Ia penetración tumoral (supuestamente mejor a menos tamaño) no es tan importante como Ia biodisponibilidad, que está favorecida para las moléculas "tipo IgG" como ScFv2-Fc 2H1 4.1 y ScFv2-Fc 2H1 8.2, por Ia presencia de un Fc compatible con el reciclaje mediado por el FcRn (Vaccaro C. et al. 2005. Nature Biotechnol 23:1283-1288). Para esta propiedad, el scFv y el Fab no son tan diferentes, ya que ambos carecen de Fc. Al análisis histopatológico, los tumores de los ratones tratados mostraron una reducción significativa de Ia densidad vascular, una reducción del diámetro de los vasos, un aumento de Ia apoptosis tumoral y reducción de las figuras mitóticas.
Ejemplo 13. Capacidad del fragmento scFv 2H1 marcado con 125I para alojarse selectivamente en Ia zona del tumor en ratones desnudos inoculados con células A431.
Para Ia determinación de Ia capacidad del fragmento scFv 2H1 de alojarse en Ia zona correspondiente al crecimiento tumoral de las células A431 , este fragmento, y un fragmento de anticuerpo scFv murino anti-antígeno de superfice de Ia hepatitis B (scFv-Hep.1) se marcaron con 125I (Amersham, UK) mediante el método de lodogen (Fraker PJ, Speck JC Jr. 1978. Biochem Biophys Res Comm 80:849-857) para actividades específicas de 1 ,3 MBq/5 μg y 1 ,28 MBq/5 μg, respectivamente.
Los productos radiomarcados se analizaron en cromatografía de capa delgada para determinar Ia incorporación a proteína, encontrándose valores de 93 y 95% de Ia radiactividad, respectivamente. La capacidad de los productos radiomarcados para detectar sus antígenos correspondientes (VEGF humano y HBsAg) se ensayó en un sistema donde se recubrieron inmunotubos de poliestireno con Ia isoforma 121 de VEGF humano recombinante (5 μg/mL; Peprotech), o HBsAg recombinante (5 μg/mL; Heber Biotec, Habana), se bloquearon, y se les añadió Ia muestra del fragmento radiomarcado de especificidad correspondiente, ajustada a las cantidades que podían ser atrapadas por esa fase sólida. Luego de Ia incubación y el lavado se determinó que Ia fase sólida era capaz de unir el 84% y el 82% de Ia radiactividad, para el scFv 2H1 y el scFv-Hep.1 , respectivamente, demostrando que el procedimiento de radiomarcaje no afectó sensiblemente Ia actividad biológica de los fragmentos.
Para estudiar Ia biodistribución se usaron 20 ratones nu/nu. Los animales se inocularon por vía subcutánea con 5x106 células tumorales humanas de Ia línea A431 en Ia zona dorsal derecha. Cuando los tumores alcanzaron volúmenes de alrededor de 300 mm3 se aleatorizaron cuatro grupos de 5 animales y comenzó el tratamiento. Los ratones se inyectaron por Ia vena de Ia cola con el producto radiomarcado en cuestión (10 con scFv 2H1 y otros 10 con scFv Hep.1 ), y se sacrificaron en grupos de 5 de cada producto a las 24 y 48 horas, removiéndose quirúrgicamente el tumor y los siguientes tejidos normales: bazo, hígado, riñon, intestino, músculo, médula y sangre. La acumulación de radiactividad se expresó como porciento de Ia dosis inyectada por gramo de tejido. La calibración se realizó mediante una muestra estándar de Ia dosis inyectada. La radiactividad se determinó empleando un contador de centelleo gamma. La Figura 15 muestra los porcientos de radiactividad recuperada por tejido estudiado, a los diferentes tiempos, respecto a Ia radiactividad total inyectada. Junto a los resultados resumidos en Ia Tabla 9 para el caso específico de Ia relación de los valores radiactividad en tumorradiactividad en sangre, el experimento demuestra que entre las 24 y 48 horas el scFv 2H1 se mantiene localizado preferentemente en el tejido tumoral, no así para el scFv Hep.1 inespecífico.
Tabla 9. Relación radiactividad en tumorradiactividad en sangre para ratones desnudos trasplantados con las células humanas tumorales A431, que expresan VEGF humano.
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Estos resultados sugieren que el scFv 2H1 puede localizar, de forma específica, zonas anatómicas donde existe una alta concentración local de VEGF humano, tales como un tumor A431 , y por Io tanto es útil para transportar a esta zona de forma específica diferentes productos terapéuticos, tales como un isótopo radiactivo, o eventualmente una toxina o una droga. Los valores corresponden luego de 24 y 48 horas de inyectados los animales con las diferentes moléculas radiomarcadas con 125I. Cada relación se calculó a partir de los valores medios derivados de los tejidos recuperados de 5 ratones.
EJEMPLO 14. Prevención de Ia neovascularización coroidea (NVC) experimental en primates no humanos mediante el fragmento scFv 2H1 y Ia molécula bivalente ScFv2-Fc 2H1-4.1.
Como modelo de neovascularización coroidea experimental se empleó el reportado por Krzystolik y colaboradores (Krzystolik M. G., et al. 2006. Acta Ophthalmol, 120:338-346). Se utilizaron 6 monos cynomolgus (Macaca fascicularis, CENPALAB, Habana), mantenidos y manipulados de acuerdo con las guías de Buenas Prácticas con Animales de Laboratorio vigentes en Ia institución. Los animales se anestesiaron para todos los procedimientos con inyecciones intramusculares de hidroclorato de ketamina, maleato de acepromazina y sulfato de atropina. También se empleó Ia anestesia tópica de hidroclorato de proparacaina. La anestesia antes Ia enucleación y para Ia eutanasia se hizo con pentobarbital sódico intravenoso. Las membranas de NVC se indujeron en Ia mácula mediante quemaduras con láser de argón, asegurándose que el procedimiento provocaba una ampolla y una pequeña hemorragia, con puntos de aplicación de entre 50 y 100 μm. Se usaron Ia fotografía y Ia angiografía fluorescente para detectar y medir Ia extensión y características de las lesiones. Se chequearon los ojos de los animales a diferentes días, antes y después de Ia aplicación del fragmento y del placebo, del procedimiento de quemadura mediante láser, y al final del experimento, que terminó con Ia enucleación y muerte.
Los animales se dividieron en dos grupos de 3, según Ia molécula a estudiar: el fragmento de anticuerpo scFv 2H1 o Ia molécula bivalente tipo inmunoglobulina ScFv2-Fc 2H1-4.1. El ojo derecho de cada animal recibió 500 μg de scFv 2H1 o de ScFv2-Fc 2H1-4.1 , según el grupo, en 50 μL de PBS mediante inyección intravítrea, mientras que el izquierdo sólo el vehículo. Los ojos recibieron 2 inyecciones antes del tratamiento con láser (días 0 y 14). En el día 21 , todos los ojos recibieron el tratamiento con láser para Ia inducción de NVC. Se repitió una inyección en cada ojo en el día 2 con el producto específico o el vehículo. Tres semanas después de Ia inducción por láser (día 42), los animales recibieron inyecciones intravítreas, esta vez todas de fragmento scFv 2H1 o ScFv2-Fc 2H1-4.1 , según el grupo, para terminar con una última inyección semejante el día 56.
En Ia fase I del tratamiento (antes del día 42) los estudios demostraron una reducción en el advenimiento de lesiones grado 4 en los ojos donde se administró el scFv 2H1 o el ScFv2-Fc 2H 1-4.1 , en comparación con los respectivos ojos control, Io que sugiere que el fragmento ayuda en Ia prevención de Ia NVC. En Ia fase Il del tratamiento, cuando todos los ojos recibieron fragmento scFv 2H1 o el ScFv2-Fc
2H1-4.1 , se vio una reducción de las lesiones grado 4, Io que sugiere que el fragmento y Ia molécula bivalente son también beneficiosos para lesiones establecidas.
EJEMPLO 15. Expresión de moléculas diméricas que comprenden dos unidades del fragmento scFv fusionadas genéticamente al Fc de una IgGI humana en plantas transgénicas de tabaco. Se empleó Ia RCP, en condiciones tales como las descritas en el Ejemplo 8, para amplificar el gen que codifica para ScFv2-Fc 2H1-4.1 , y modificar sus extremos para Ia adición de sitios de restricción apropiados (Ncol and Xbal) para clonar en vectores de células de plantas. Los oligonucleótidos sintéticos básicos empleados en Ia RCP se diseñaron sobre Ia base de las secuencias reportadas en SEQ ID No. 13. El fragmento de ADN amplificado se detectó como una banda mayoritaria de aproximadamente 1 ,4 Kb y se purificó desde un gel de agarosa al 1 % (Sigma) empleando el QIAquick GeI Extraction Kit (QIAGEN, GmbH). El ADN se digirió posteriormente con las enzimas anteriormente mencionadas y se clonó en el vector pHES74 (López A., et al. 1996. Biotecnología Aplicada 13: 265-270) como una construcción scFv-bisagra-CH2-CH3 precedida de Ia secuencia señal de Ia esporamina del boniato. Este vector tiene el promotor del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV) 35S, una región líder omega del virus del mosaico del tabaco que actúa como aumentador traduccional para incrementar Ia cantidad de proteína producida, y el terminador nopalina sintasa que también promueve Ia expresión alta de genes foráneos en plantas transgénicas. El "cassette" de expresión promotor-gen de scFv-Fc-terminador se introdujo en el vector binario pDE1001 , para producir el plasmidio final pDEscFv-Fc.70. Los detalles para construcciones similares y para el trabajo con este tipo de material se han reportado previamente (Ramírez, N. et al. 2002. Transgenic Res. 11 : 61-64).
El plasmidio final pDEscFv-Fc.70 se usó para transformar células de plantas de Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 , mediante transferencia génica mediada por Agrobacteríum tumefaciens. Las plantas FO y F1 se obtuvieron por procedimientos convencionales descritos anteriormente y Ia expresión de moléculas scFv-Fc activas se detectó empleando un sistema ELISA similar al descrito en el Ejemplo 8.
La molécula scFv-Fc biológicamente activa se prepara en Ia forma de proteínas totales solubles (TSP) de plantas, que se extrajeron moliendo 0,4 g de hojas de tabaco de plantas transformadas, o controles, en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino, básicamente como se ha descrito. El polvo se transfirió a un tubo de reacción, se mezcló 1 :2 (peso/volumen) con tampón de extracción (61 mM Tris-HCI pH 6,9; 2% SDS; 12,5% glicerol), y se incubó en hielo por 5 minutos. El material insoluble se removió centrifugando a 13 000 rpm y Ia parte soluble se ensayó en ELISA a diferentes diluciones, empleando anticuerpos anti-Fc humano conjugados a fosfatasa alcalina (Sigma) para detectar Ia expresión. Se demostró que las TSP de las plantas transgénicas contenían moléculas capaces de reconocer el VEGF humano de Ia fase sólida, no así las TSP de las plantas controles.

Claims

REIVINDICACIONESANTICUERPOS RECOMBINANTES CONTRA EL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR (VEGF).
1. Anticuerpos recombinantes caracterizados porque comprenden regiones variables de inmunoglobulinas humanas codificadas por las secuencias nucleotídicas SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8, o secuencias homologas, que reconocen un epítope en el VEGF-A humano definido alrededor de, aunque no necesariamente limitado a, sus residuos C102, C57, R56, T31 y L32, e interfieren con su efecto pro-angiogénico.
2. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque las secuencias SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8, o secuencias homologas, están comprendidas dentro de Ia secuencia codificante para un fragmento de anticuerpo tipo Fv de cadena simple (scFv), donde las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo de origen humano están separadas por un segmento de unión (linker).
3. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 2, caracterizado porque Ia secuencia codificante para el scFv es Ia SEC ID No. 6.
4. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque las secuencias SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8, o secuencias homologas, están comprendidas dentro de las secuencias codificantes para un fragmento de anticuerpo tipo Fab, cuyos dominios constantes son de una inmunoglobulina humana consenso tipo IgG.
5. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 4, caracterizado porque las secuencias codificantes para el fragmento tipo Fab son las SEC ID No. 9 y SEC ID No. 10.
6. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque las secuencias SEC ID No. 7 y SEC ID No. 8, o secuencias homologas, están comprendidas dentro de Ia secuencia codificante para una cadena polipeptídica, constituida por un fragmento scFv unido por un espaciador a los dominios constantes bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana, que en su forma proteica se asocia covalentemente a otra cadena polipeptídica idéntica para formar una molécula dimérica.
7. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 6, caracterizado porque los dominios constantes de inmunoglobulina humana son de tipo IgGI , lgG2, lgG3 o lgG4.
8. Anticuerpo recombinante según Ia reivindicación 6-7, caracterizado porque Ia secuencia codificante para Ia cadena polipeptídica constituida por un fragmento scFv unido por un espaciador a los dominios constantes bisagra, CH2 y CH3 es Ia SEC ID No. 13 o es Ia SEC ID No. 14.
9. Anticuerpo recombinante según las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque adicionalmente contiene un isótopo radiactivo, o un agente químico o biológico que posean potencial antitumoral o anti-angiogénico.
10. Anticuerpo recombinante según las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque adicionalmente contiene un isótopo radiactivo que Ie confiere potencial para el diagnóstico in vivo de tumores.
11. Anticuerpo recombinante según las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque son producidos en bacterias y levaduras recombinantes, o en células de mamíferos u otros sistemas de eucariotes.
12. Vectores que codifican para anticuerpos recombinantes de las reivindicaciones 1-8, obtenidos mediante Ia manipulación genética por vía del
ADN recombinante, siendo estos vectores plasmidios o secuencias capaces de integrarse en células hospederas.
13. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo recombinante de las reivindicaciones 1-9.
14. Uso de los anticuerpos recombinantes de las reivindicaciones 1-9 para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de entidades que cursan con incremento de Ia angiogénesis, como entidades oculares, procesos neoplásicos, inflamatorios agudos y crónicos, y procesos autoinmunes, mediante Ia inmunoterapia pasiva.
15. Uso de los anticuerpos recombinantes de las reivindicaciones 1-9 para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores malignos y sus metástasis, mediante Ia inmunoterapia pasiva.
16. Uso de los anticuerpos recombinantes de las reivindicaciones 1-9 para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de Ia degeneración macular asociada a Ia edad, mediante Ia inmunoterapia pasiva.
17. Uso del anticuerpo recombinante de Ia reivindicación 10 para Ia fabricación de un radiofármaco para el diagnóstico in vivo de tumores malignos y sus metástasis, mediante técnicas de imágenes.
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