WO2023109982A1 - Polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos - Google Patents

Polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos Download PDF

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WO2023109982A1 PCT/CU2022/050011 CU2022050011W WO2023109982A1 WO 2023109982 A1 WO2023109982 A1 WO 2023109982A1 CU 2022050011 W CU2022050011 W CU 2022050011W WO 2023109982 A1 WO2023109982 A1 WO 2023109982A1
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Isabel González Moya
Mónica BEQUET ROMERO
Marta AYALA ÁVILA
Yanelys MORERA DÍAZ
Yasmiana MUÑOZ POZO
Camila CANAÁN-HADEN AYALA
Humberto LAMDAN ORDÁS
Sonia González Blanco
Jorge Victor Gavilondo Cowley
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, and to the field of human health. It provides polypeptides that bind to proangiogenic growth factors such as human vascular endothelial growth factor (VEGF) or basic fibroblast growth factor (bFGF), and inhibit their biologic effects. It offers the bases for the generation of pharmaceutical compositions that comprise said polypeptides, which are used in the treatment of pathologies that occur with increased angiogenesis, inflammation and immunosuppression.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • single domain antibodies also known by the abbreviation V H
  • V H single domain antibodies
  • these polypeptides are resistant to high temperatures, extreme pH and proteases (Muyldermans, FEBS J, 2021: 288: 2084-102).
  • the small size of a VHH can be a disadvantage for therapy.
  • Phage display technology allows for efficient, stringent selection that retrieves, within a few weeks, multiple high-affinity polypeptides within a large and diverse library (McCafferty, et al., Nature, 1990:348:552-4).
  • VHHS three types of libraries can be used: immune libraries, non-immune (naive) and synthetic libraries. Of these, only synthetic ones can provide a true universal library, making it possible to obtain HSVs specific for almost any antigen (Knappik, et al., Journal of Molecular Biology, 2000: 296: 57-86).
  • VEGF-specific HSVs have been generated exclusively from camelid immune libraries (Farajpour, et al., Journal of Biomolecular Screening, 2014: 19: 547-55 , Ebrahimizadeh, et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015: 176: 1985-95, Kazemi-Lomedasht, et al., Molecular Immunology, 2015: 65: 58-67).
  • V H have demonstrated their inhibitory effect on the proliferation of endothelial cells and the formation of tubular structures and, in one of them, their antitumor effect was verified in the TC-1 model.
  • VHHs recognize VEGF in a denatured conformation, so they must be specific for a linear segment, an element that makes them similar to Bevacizumab (Kazemi-Lomedasht, et al., Egyptian Journal of Basic Medical Sciences, 2017: 399-496).
  • V H Only one of the VEGF-specific V H underwent a humanization process (Kazemi-Lomedasht, et al., Egyptian Journal of Basic Medical Sciences, 2018: 21: 260-6). So far, the behavior in in vivo systems for this protein is unknown.
  • anti-VEGF V H that has been partially humanized, and is part of the bispecific construct known as BI836880 (Kovalchuk, et al., Clinical & Experimental Metastasis, 2020: 37: 637-48).
  • This V H is in phase II clinical studies for age-related macular degeneration (AMD) and for metastatic lesions of advanced solid tumors (www.htto//cl ⁇ n ⁇ caltr ⁇ als.qov).
  • bivalent, mono- or bispecific polypeptides have been described that also incorporate binding sites to serum proteins, such as albumin or the Fe segment of the immunoglobulins IgG1, IgG2 and lgG4.
  • serum proteins such as albumin or the Fe segment of the immunoglobulins IgG1, IgG2 and lgG4.
  • VEGF or bFGF no described strategies that incorporate Fe from immunoglobulins, or binding sites for other proteins, to VH-like binding sites.
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing polypeptides that bind to proangiogenic growth factors.
  • These polypeptides comprise in their amino acid sequence at least one single domain antibody fragment (V H) that has an amino acid sequence identified as SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24, or an amino acid sequence that is 95% identical. identity with said sequences.
  • Said polypeptides are obtained from the sub-libraries generated within the framework of the invention, and show physicochemical properties that make them attractive from the point of view of drug formulation and development.
  • the proangiogenic growth factor to which said polypeptides bind is VEGF or human bFGF.
  • the polypeptide that binds to human VEGF or bFGF binds to at least two VEGF or bFGF molecules, or to one VEGF molecule and one bFGF molecule.
  • the invention provides polypeptides that have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28.
  • the invention shows the obtaining of a polypeptide called Nb-V1 that binds to human and mouse VEGF, and inhibits its binding to the VEGF type 2 receptor. (VEGFR2), but not the VEGF type 1 receptor (VEGFR1 ).
  • the amino acid sequence of said polypeptide is identified as SEQ ID NO: 12.
  • Nb-V1 is preferentially distributed! towards tumors, and it was shown that it possesses antiangiogenic properties.
  • Nb-V1 differs from other anti-VEGF antibody fragments in that it does not inhibit the binding of VEGF to VEGFR1.
  • This receptor has frequently been described as a way to store VEGF in the extracellular matrix, since it does not have effective signal transduction and is also essential in multiple homeostatic processes (Shibuya, Cell structure and function, 2001 : 26 : 25-35). Its blockade by other inhibitors of the VEGF/VEGFR system is associated with increases in kidney and liver damage, so achieving selective inhibition of VEGFR2 provides an advantage from a toxicological point of view (Sullivan, et al., PLoS ONE 2010: 5:7-8).
  • VEGFR2 is a mediator of the effects of VEGF on endothelial cell proliferation, migration, and tube formation (Selvaraj, et al., Cancer Cell, 2015: 27: 780-96), and on TReg cell attraction and MDSC, and induction of T cell senescence (Bourhis, et al., Frontiers in Immunology, 2021 : 12: 616837)
  • the invention also shows the obtaining of a V H H called Nb-F3, which binds to human and mouse bFGF, and inhibits its binding to FGFR1, and which is characterized in that its amino acid sequence is identified as SEQ ID NO : 13.
  • Nb-F3 polypeptide showed antiangiogenic and antiproliferative properties in vitro.
  • the monovalent and monospecific polypeptides Nb-V1 and Nb-F3 were obtained in their monochemical form, and they maintained more than 70% of their antigen recognition and blockade of binding to their respective receptors, when subjected to 75°C for 2 hours. .
  • the stability of the VHs at high concentrations, in a variety of buffers of different pHs, and in simple and complex formulations was evidenced.
  • the results obtained for VHHS Nb-V1 and Nb-F3 in terms of thermal stability from the conformational and functional point of view, indicate the feasibility of obtaining polypeptides with an adequate profile of thermal stability and solubility, from the universal library and the maturation libraries designed.
  • V HS Nb-V1 and Nb-F3 disclosed by the invention have a size of approximately 15 kDa. This characteristic offers advantages from the point of view of tissue penetrability, but conditions its rapid elimination via the kidneys (Cortez-Retamozo, et al., Int J Cancer, 2002: 98: 456-62). Renal elimination necessitates repeated administration.
  • the polypeptide of the invention is a fusion polypeptide comprising: a) an amino acid sequence that is selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 and b) an amino acid sequence corresponding to an albumin binding site or an Fe domain of a human immunoglobulin.
  • the Fe domain is from a human immunoglobulin IgGi, IgG 2 , IgG 3 or IgG 4 .
  • the invention discloses obtaining a polypeptide that recognizes two VEGF molecules (monospecific bivalent by VEGF), called Nb-VV6, which inhibits its interaction with VEGFR2 and which has the sequence identified as SEQ ID NO: 20. It is also the obtaining of a polypeptide that recognizes two bFGF molecules (monospecific bivalent by bFGF), called Nb-FF2, which inhibits its interaction with FGFR1, and which has the sequence identified as SEQ ID NO: 21, is revealed. -VV6 and Nb-FF2, unlike others in the state of the art, were obtained in their monomeric form and lost less than 30% of their binding and blocking activity to receptors when subjected to 75°C for 2 hours.
  • bFGF or VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the exclusive sequestration of one of these ligands does not definitively neutralize the angiogenic processes associated with diseases, due to the redundancy of their induction pathways (Haibe, et al., Frontiers in Oncology, 2020 :10:221 ).
  • the inhibition of two or more pro-angiogenic factors is more effective in the prolonged management of macula diseases (Campa, Curr Drug Targets, 2020: 21 : 1194-200) and liver tumors (Zahra, et al., Cancers ( Basel), 2021: 13: 1422).
  • the invention provides bispecific monovalent polypeptides, called Nb-VF3 and Nb-FV1, which bind to both VEGF and bFGF, and inhibit the interaction of these factors with VEGFR2 and FGFR1 receptors, respectively.
  • These bispecific polypeptides are characterized by having an amino acid sequence that is identified as SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, respectively.
  • SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 amino acid sequence that is identified as SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 19
  • SEQ ID NO: 24 it was observed that regardless of the order of the segments corresponding to SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 in the bispecific polypeptides, they recognize the VEGF and bFGF antigens, and inhibit their interaction with their specific receptors.
  • These bispecific VHHs retained the physicochemical and biological properties described for the monovalent versions of their parents. Analyzes in models of neovascularization in the macula or in tumors, in
  • polypeptides resulting from the addition of human lgG1 Fe were named Nb-V1_hFc, Nb-F3_hFc, Nb-VV6_hFc, Nb-FF2_hFc, Nb-FV1_hFc and Nb-VF3_hFc, and have the sequences identified as SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36, respectively.
  • the c-myc and polyhistidine tracer peptides are deleterious for the functionality of small molecules, such as V H.
  • these tracer segments are located preferentially in the kidney, and convert this organ in a target of toxic effects, due to repeated administration (Huyvetter, et al., Theranostics, 2014: 4).
  • polypeptides Nb-V1, Nb-F3, Nb-VV6, Nb-FF2, Nb-FV1 and Nb-VF3 had the carboxyl terminus removed, and the resulting polypeptides were named Nb-V1.
  • These polypeptides have amino acid sequences that are identified as SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, respectively.
  • These HS Vs showed similar biological properties to their c-myc and polyhistidine counterparts.
  • the present invention is not restricted to a particular way of obtaining or stabilizing VHHs. These can be obtained and separated, for example, by protein A affinity chromatography, a widely accepted strategy for the manufacture of recombinant products and which, moreover, ensures the correct folding of the resulting polypeptides. Likewise, the VH, given their chemical and thermal stability, can be purified by means of precipitation strategies combined with ion exchange.
  • polypeptides of the present invention are administered to an individual in need thereof, in a pharmaceutically effective dose, by routes that are known to one skilled in the art.
  • polypeptides of the invention significantly reduced tumor growth of neoplasms of various origins, including lung carcinoma, colon carcinoma, and renal carcinoma. These results were obtained in models that have been relevant to the translation of results from other anti-tumor treatments to clinical practice, which indicates the applicability of this strategy to the clinical setting in cancer treatment.
  • the doses of the polypeptides to be used for each application depend on the desired effect, since with increasing doses an increase in the biological effect has been observed.
  • the invention also provides a vector encoding a polypeptide that binds proangiogenic growth factors, where the polypeptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: : 31 to SEQ ID NO: 36.
  • This strategy increases the in vivo lifetime of these polypeptides that bind proangiogenic growth factors.
  • the use of adeno-associated vectors has been described, especially in the suprachoroidal or intravitreal administration of vectors that code for polypeptides with proven benefit in intravitreal administration (Antonio, et al., 2021: 2: 151 -7).
  • the use of the AAV2 adeno-associated vector enabled the in vitro and in vivo expression of the polypeptides of interest, as shown in Example 14.
  • the invention discloses a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: a) a polypeptide whose amino acid sequence is identified as SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36 or b) a vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • phosphate buffered saline was preferably used as a vehicle for polypeptide preparations, but its stability was verified in a wide range of additives.
  • the polypeptides or the vectors can be administered in excipients accepted for pharmaceutical use that are not toxic or have therapeutic effects.
  • the pharmaceutical compositions of the invention are not restricted to a specific route of administration, and it is evident that, without specific formulations, HSVs can be administered intravitreal, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and intranasal, and generate antiangiogenic effects. , antitumor, anti-inflammatory and immunorestorative. Therefore, in one embodiment of the invention, the pharmaceutical composition is formulated for administration by systemic, mucosal or intravitreal route.
  • polypeptide whose amino acid sequence is identified as SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or a vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or a vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or a vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or a vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or a vector encoding a polypeptide
  • the drug is useful for treating a pathology that occurs with increased angiogenesis, inflammation, or immunosuppression.
  • the invention does not restrict the use of the medicament in particular diseases.
  • the drug is useful for the treatment of cancer, diabetic retinopathy, macular degeneration or rheumatoid arthritis.
  • the invention provides a treatment method for a pathology that occurs with increased angiogenesis, inflammation, or immunosuppression in an individual who needs it, characterized in that a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition is administered that comprises a polypeptide whose amino acid sequence is identified as SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36; or the vector encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 36.
  • the pathology is cancer, diabetic retinopathy, macular degeneration, or rheumatoid arthritis.
  • said pharmaceutical composition is administered by systemic, mucosal or intravitreal route.
  • the vectors pHG-1 m, pACR-1 K and pVSJG-huFc (Lamdan, H et al, WO 2008/052489), together with the strains TG1 (K12_(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F' traD36 , proA+B+, laclq, lacZ_M15) and BL21 (F- ompT hsdS (rB-mB-) gal dem met (DE3)) of Escherichia coli were obtained from the CIGB strain collection.
  • the vector pINFUSE was supplied by InvivoGen, USA.
  • the enzyme KOD Hot Start Master Mix was purchased from Novagen, USA and the enzymes T4 DNA ligase, alkaline phosphatase, ApaL ⁇ , Not, Nco ⁇ , BglW, EcoR ⁇ , Afl ⁇ and Xba ⁇ and Taq polymerase Master Mix were supplied by Promega, USA Platinum POR 2X enzyme Master Mix was purchased from ThermoScientific, USA.
  • Helper filamentous phage M13K0, streptavidin protein, and anti-mouse-based Polyhistidine, rabbit-anti-mouse IgG, and sheep-based anti-human IgG1 antibodies, all conjugated to the enzyme horseradish peroxidase (HRP, its horseradish peroxidase) were supplied by Sigma-Aldhch, USA.
  • HRP-conjugated anti-M13 antibody (directed against phage PVIII protein) was purchased from GE Healthcare, USA.
  • mAb 9E10 directed against the c-myc peptide
  • protein A conjugated to the HRP enzyme were supplied by the CIGB, Sancti-Spiritus (Cuba).
  • CHO-VEGF protein was obtained in the supernatant of Chinese hamster ovary (CHO) cells, transformed for the secretion of human VEGF 121. This was purified by affinity to metal ions, as described (Sanchez Ramirez, et al., Journal of immunoassay & immunochemistry, 2016: 37: 636-58).
  • the GST-hVEGF and GST-mVEGF proteins were produced in E.coli and affinity purified to glutathione, according to the procedures described (Morera, et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006: 44: 45-53).
  • the scFv-like antibody fragment CIGB-166a (Lamdan, et al., Journal of Biotechnology, 2011:151:166-74) and the recombinant protein VEGFKDR- (Gavilondo, et al., Vaccine, 2014:32:2241-50 ) were obtained from the Department of Technological Development of the CIGB, Havana (Cuba).
  • Biotinylated variants of the Bevacizumab antibody and the scFv CIGB166a named Bevacizumab-biot and CIGB166a-biot, were prepared in the laboratory, following the manufacturer's instructions.
  • HHV-bearing phages from the libraries was directed against two antigens: vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF), and was carried out as described. (Lamdan et al., 2011). Briefly, a concentration of 10 pg/mL was used for GST-hVEGF, and 5 pg/mL for bFGF. To guarantee the selection of clones with the highest affinity, the concentration in the coating was reduced by 50% between each cycle.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • free GST (Morera, et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006: 44: 45-53) was added to the phage mixture, at a concentration of 1 mg/mL, in order to increase the specificity. during the selection process.
  • the stringency of the selection increased with an increase in the number of washes, and the time of the same in each round of selection with PBS-0.1% Tween (PBST) (up to 20 washes for 4 hours).
  • PBST PBS-0.1% Tween
  • Twenty to forty clones were randomly selected from rounds 2 and 3 and assessed for immunoreactivity against the antigen by phage ELISA which is briefly described below. Plasmid DNA from 10-20 positive clones from each library per antigen was isolated and sequenced (Microsith, Germany).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Peroxidase enzyme activity was detected with substrate solution and absorbance values at 492 nm were determined in a microtiter plate reader (BMG, Clahostar, Germany). Those phage mixtures that produced an absorbance value for the target antigen twice the value against the unrelated antigens BSA and GST were considered positive.
  • HSV-carrying phages were produced from isolated colonies after infection with E. col! strain TG1 bacteria. with the selected phages from the second and third selection cycle, in 96-well cell culture plates, according to the procedure described (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991: 222: 581-97). HSV immunoreactivity on phage contained in the supernatant of each well was assessed by phage ELISA.
  • the HSV-bearing filamentous phages that showed greater recognition by the antigens were produced and purified by precipitation with polyethylene glycol at a 50 mL scale, according to the procedure described (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991 : 222: 581-97).
  • E. cell strain TG1 bacteria in exponential growth phase were infected with the phage preparations, and plated on 2xYTA solid culture medium with 2% glucose ( v/v). They were cultured for 16 h at 37 S C.
  • the phage concentration in the preparations (colony-forming units (cfu)/mL) was determined by colony counting.
  • the phage preparations, at a concentration of 10 11 cfu/mL, were used for the evaluation by ELISA on phage.
  • a representative colony of each plasmid construct was grown in liquid LBK medium (8 g/L thptone, 5 g/L yeast extract, 2.5 g/L NaCI, 50 pg/mL kanamycin, pH 7.0- 7,5) and, when reaching an absorbance of 0.8 at 600 nm, it was induced for 19 h after the addition of 1 mM isopropyl-[3-Dthiogalactop ⁇ ranos ⁇ do (IPTG, Sigma) to the culture medium. . The culture was centrifuged at 4500 rpm for 15 min.
  • the periplasmic fraction was obtained by osmotic shock, after incubation with TES buffer (200 mM Ths-HCl, 1 mM EDTA, 500 mM sucrose, pH 8) in a 1:20 (g:mL) ratio. for 16 h at 4 S C.
  • the culture supernatant or the pehplasma extract was diluted in coupling buffer (50mM NaH 2 PO4, 300mM NaCI, pH 7.8 or 1X phosphate buffer), at a 1:2 ratio, before begin the purification process.
  • the fragments of Antibodies were purified by metal affinity chromatography or protein A affinity chromatography, using the AKTAPure automatic system and the pre-packed HisTrap FF 5mL or HiTrap rProtein A FF columns (GE Healthcare, USA), respectively, according to to the manufacturer's guidelines. After a buffer change to 1x PBS the proteins present were quantified by Micro Coomassie (BIORAD, USA).
  • the 96-well plates were coated with 100 pL/well of a 20 pg/mL solution of GST-hVEGF121, GST-mVEGF120 or GST, or a 10 pg/mL solution of VEGFKDR-. or hFGF-2 or mFGF-2 at a concentration of 5 pg/mL in 1X PBS for 16 hours at 4°C. After the plates were blocked with PBS-5% skim milk for one hour, a curve of 1:2 serial dilutions of the purified VHHs was added, starting at 2 pg/mL in PBS-0.5% skim milk.
  • the plates were incubated for 1 hour at 37°C and after several washings, the monoclonal antibody 9E10, specific for c-myc, was added. After one hour of incubation at 25°C the plates were washed abundantly. The binding of the fragment to the antigen on the solid phase was revealed as a correlate of the peroxidase enzymatic activity using 100 pL/well of TMB. The reaction was stopped with 50 pL/well stop solution, and absorbance values at 450 nm were determined in a microtiter plate reader.
  • the determination of the affinity constant (K a ff) of the antibody fragments was performed by the method described by Beatty et al. (Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. J Immunol Methods. 1987 Jun 26;100(1 -2 ):173-9), for which a variation of the ELISA-type antigen recognition assay described above was used. In this case, two concentrations were used for each antigen of interest in the coating (7.5 pg/mL and 2.5 pg/ml for the GST-hVEGF; and 5 pg/ml and 2.5 pg/ml for the bFGF). The K a ff was calculated using the formula:
  • Kaf f (N-1 ) / 2 (N [Nb'] - [Nb])
  • N [Ag] / [Ag']
  • [Ag] and [Ag'] correspond to the maximum and minimum concentration of antigen in the coating
  • [Nb] and [Nb'] correspond to the concentration of VHH at the which 50% recognition is achieved for the coating [Ag] and [Ag'], respectively.
  • VHs The ability of VHs to compete with receptors for their ligand binding was assessed by ELISA, for which 96-well plates (NUNC, USA) were coated with GST-hVEGF or bFGF and blocked as described. in the previous section. Serial 1:2 dilutions of the purified HSVs were added, from 7500 nM to 46.8 nM, and the plates were incubated for 1 h at 37 S C. In this step, some wells were left where only PBS-milk was added. Next, Fc-VEGFR2, Fc-VEGFR1 or Fc-FGFR1 were added, diluted in PBS-milk to a final concentration of 6.25 ng/mL, 50 ng/mL and 100 ng/mL, respectively.
  • the CIGB166a antibody fragment was used as a positive control, and for the FGF/FGFR axis, the anti-FGF polyclonal antibody was used.
  • the percent inhibition of receptor binding to its ligand was calculated as follows:
  • the proteins associated with the tumor and metastatic tissues were lysed and recovered in M tubes (Miltenyi) and RIPA solution (SIGMA), using an OctoMacs Dissociator, according to the manufacturer's instructions (Miltenyi, Germany). Lysates were centrifuged to remove debris and protein concentration was assessed by BCA (Thermo Fisher Scientific, USA). VHH concentration was assessed by ELISA, as already described.
  • the MAGPMAG-24K reagent kit was used, and the values were normalized in the case of the tissues to the protein concentration previously determined for the extract.
  • the Human VEGF according to R&D instructions for reagent set DV001 (R&D, Germany).
  • VHH synthetic library the nucleic acid sequence of VHH h-NbBCII10, described by Conrath et al. (Conrath, et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2001 : 45: 2807-12), was selected as a template. 13 mutations were incorporated, in order to humanize the V H polypeptide without affecting the antigenic recognition capacity, and without altering the physicochemical properties of the polypeptides in terms of solubility and stability (Vincke, et al., Journal of Biological Chemistry, 2009 :284:3273-84). The desired sequence was entered into the DNAWorks Online Software (http://helixweb.nih.qov/dnaworks (Hoover, D.
  • a set of 18 oligonucleotides was obtained by optimizing codon usage. for bacteria, in order to synthesize the selected template by an overlapping polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR overlapping polymerase chain reaction
  • a mutagenic oligonucleotide was designed that includes fragments of the FR3 and FR4 framework regions, respecting the 18 amino acid length for CDR3 (SEQ ID NO: 1).Codons were formed according to the NNK sequence (where N is an equimolar mixture of A, G, C, and T, and K is an equimolar mixture of G and T).
  • the presence and size of the inserts in a sample of 12 colonies was determined, by PCR, with oligonucleotides that hybridize to sequences of the vector pHG-1 m that flank the genes of the cloned VHHs.
  • a size of 1.6*10 12 cfu/mL was estimated for the library and a final size of 9.3*10 11 cfu/mL, after adjusting for 58.3% diversity detected (7 of 12 clones with different template sequences).
  • Example 3 Selection of specific V H HS carrier phages from the CDR3 Universal Library against different antigens.
  • VHH-carrying phages were produced from isolated colonies after infection of E.coli strain TG1 bacteria with the selected phages from the third selection cycle, according to the procedure described (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991 : 222: 581-97). Immunoreactivity of the V H H expressed on the phage contained in the supernatant of each well was assessed by a phage ELISA specific for VEGF and bFGF, as described above. Thus, 20 and 25 positive VHH-producing clones, respectively, with at least 4 times the optical density of the negative control (on GST or BSA), were identified and sequenced to assess diversity (Macrogen, Korea).
  • VH-bearing filamentous phages were produced and purified at a 50 mL scale, according to the procedure described (Marks, et al., Journal of molecular biology, 1991:222:581-97). They were used at a concentration of 10 11 cfu/mL for the evaluation, by ELISA, of the immunoreactivity profile. Thus, 12 and 18 positive VHH-producing clones were identified, respectively, with at least 4 times the OD of the negative control (on GST or BSA). The study was continued with the phage clones that presented greater immunoreactivity to the target antigen [Clone pHG-1 m_Nb-E7 for VEGF and Clone pHG-1 m_Nb-A5 for bFGF].
  • Nb-E7 and Nb-A5 (SEQ ID NO: 5) polypeptides were amplified by means of a PCR reaction, from the purified DNA of the two selected phage clones (pHG- 1 m _Nb-E7 and pHG-1 m _Nb-A5) with the oligonucleotides SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • PCR products were purified with the QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Germany) and Ncol/Notl digested.
  • the vector pACR1 -K was digested with the same enzymes, and ligated with the predicted bands using the enzyme T4 DNA ligase.
  • the reaction product was transformed into chemocompetent BL21 DE3 cells.
  • a representative colony of each construct was used to express the proteins, as described in Example 1.
  • the presence of the VH fragments in the pehplasmatic fraction was evaluated by SDS-PAGE at 15%.
  • the result indicated the expression of a protein with an apparent molecular weight between 20-15 kDa (when compared with the standard molecular weight), which represents 32% of the total proteins.
  • the identity and integrity of the carboxyl terminus was verified by means of an anti-polyhistidine Western Blot (Sigma, USA).
  • VH The purification of the VH was carried out by affinity to metal ions as detailed in Example 1, following the manufacturer's recommendations (GE Healthcare, USA). As a result of the process, the VH named Nb-E7 and Nb-A5 with a purity greater than 95% were obtained.
  • the affinity calculation for both polypeptides indicated values between 10' 6 and 10' 7 M, which are considered low for this type of polypeptide, so we proceeded to mature the affinity by randomizing CDR1 and CDR2.
  • the DNA segments coding for the randomized antibody fragments at CDR3 were amplified by two-step PCR with the enzyme KOD DNA polymerase (Millipore, USA). Random mutagenesis of CDR1 in reaction A was carried out, using the oligonucleotides SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 8, and of CDR2 in reaction B with the oligonucleotides SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 9.
  • the product bands of these amplifications (A: 150 bp and B: 270 bp) were mixed 1:1 (10 ng of each), and were taken as a template for the second reaction in which 400 bp bands were amplified, to each of the parental DNAs, using the oligonucleotides SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. These bands were cloned after digesting ApaL ⁇ and Not ⁇ in the vector pHG-1 m, previously digested with the same enzymes, and the products were transformed by electroporation in the TG1 strain in 2xYTA solid medium with 2% glucose.
  • Colonies were flushed with 2xYT liquid culture medium, after 24-26 h of growth, to form the maturation sub-library, and stored at -70 s C in the presence of 20% glycerol, as a source for production. of filamentous phages carrying antibody fragments.
  • the size of the sub-libraries was determined as described in Example 2. A size of 7.5*10 12 cfu/mL was estimated for the Nb-E7 mutated sub-library, and a size of 3*10 12 cfu/mL for the Nb-A5 mutated sub-library.
  • the selection, production, obtaining and characterization of phages expressing VHH with increased recognition of the antigens of interest was carried out as described in Example 3.
  • Example 5 Expression in E. coli of the VHH fragments, purification and characterization of the recognition of the specific antigen.
  • VHH sequences into the pACR1-K vector was performed as described in Example 3.
  • a representative colony of each construct was expressed in LBK liquid medium.
  • the presence of the VHH fragments in the periplasmic fraction was evaluated by 15% SDS-PAGE. This revealed the expression of proteins of apparent molecular size between 15-20 kDa (when compared to the molecular weight standard), which represent 35% of the total proteins.
  • the identity and integrity of the carboxyl terminus was verified by means of an anti-polyhistidine Western Blot (Sigma, USA).
  • the fragments were named Nb-V1 and Nb-F3, and their amino acid sequences were identified as SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, respectively.
  • VHHs were purified by affinity to metal ions, as described in Example , and yields of 7 were obtained. mg/L and 25 mg/L when processing the soluble and periplasmic fraction, respectively. These yields exceed those reported by other authors using different humanization strategies, and immune libraries (WO Publication 2003/035694).
  • the main characteristic of an antibody and of the fragments derived from it is its recognition of the antigen, which determines its specificity and affinity.
  • the specific binding to VEGF was evaluated as described in the VEGF recognition ELISAs section (Example 1).
  • EC50 (nM) was used, which represents the VHH concentration value that generates 50% recognition.
  • VHH Nb-V1 showed an EC50 for human VEGF of 4.734 nM, three times lower than that detected for Nb-E7 (12.9 nM).
  • Nb-V1 recognizes mouse growth factor with an EC50 of 4.075 nM.
  • Nb-V1 also recognized in the ELISA system a mutated variant of VEGF121 where, in the so-called 80's loop, amino acids R82, K84 and H86 are replaced by E82, E84 and E86. It shares this property with CIGB166a, but differentiates it from Bevacizumab.
  • V H H Nb-V1 did not recognize other antigens (GST, bFGF) in a similar ELISA format, demonstrating its antigen specificity.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the VHH called Nb-V1 did not show a dose-dependent inhibition in the case of the VEGFR1/VEGF interaction. Only one antibody with similar characteristics has been reported, selectively binding to VEGFR2, called Va ⁇ sacumab, or r84. Renal damage is not observed with prolonged use of the r84 antibody, and it has been suggested that the causal element of this innocuousness is precisely that it does not inhibit VEGFR1 ( Sullivan, et al., PLoS ONE 2010: 5: 7-8). Taking into account the above, the VHH developed in this invention can induce fewer adverse effects than other similar drugs on the market.
  • the monoclonal antibody Bevacizumab and the scFv CIGB166a recognize different epitopes within VEGF, and have demonstrated their antiangiogenic effect in various experimental models. Their displacement from their binding to VEGF could be an indication of the potential of the new polypeptides to mediate the desired effects in vivo.
  • the ability of anti-VEGF HHV to compete with Bevacizumab antibody and CIGB166a antibody fragment for binding to its ligand was assessed by a variation of the solid phase ligand competition ELISA as described.
  • 96-well plates (NUNC, Germany) were coated with 1 pg/mL of hVEGF121, produced in the CHO cell line.
  • the percentage inhibition of the binding of Bevacizumab, CIGB166a or VEGFR2 to its ligand was calculated as previously described in Example 1.
  • the results of this trial showed that the new VH called Nb-V1 inhibits, in a dose-dependent manner, the binding of Bevacizumab and CIGB166a to VEGF.
  • a 50% inhibition of the VEGF/Bevacizumab or CIGB166a interaction was observed at 930.9 nM and 67.48 nM, respectively.
  • VH Nb-V1 recognizes a different epitope than Bevacizumab, these results indicate that they may share amino acid residues within the sequence that it recognizes in VEGF.
  • the specific binding to bFGF was evaluated as described in the section on recognition ELISAs for bFGF (Example 1).
  • concentration necessary to produce 50% of the binding to bFGF of human origin is 58.61 nM and 11.26 nM, respectively.
  • Nb-V1 a 5-fold increase in recognition was achieved, in correspondence with the affinity maturation process.
  • This VHH also recognized mouse bFGF in the ELISA system, with an EC50 of 11.52 nM, which does not differ significantly from that obtained for that of human origin, due to the high homology between the polypeptides of both species.
  • no recognition of the GST or VEGF proteins was observed, thus reinforcing the evidence of the specificity of the binding of the Nb-F3 fragment to its antigen.
  • FGFs mediate their biological action by binding to the extracellular domains of receptor tyrosine kinases called FGFR1-4, present on the surface of endothelial and tumor cells.
  • FGFR1 is the one frequently found on the surface of endothelial cells, and its inhibition in vivo has been shown to significantly reduce tumor burden and vasculature (Ronca, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2015: 19: 1 -17).
  • the ability of anti-bFGF Nb-F3 HHV to compete with receptor 1 for binding to its ligand was assessed by a solid phase ligand competition ELISA.
  • a PCR was performed in two steps, using the Platinum Hot Start DNA polymerase enzyme (Invitrogen, USA) and the corresponding oligonucleotide primers.
  • the oligonucleotides were designed to incorporate in the first PCR the hinge region of a y2C llama immunoglobulin as a spacer between the two VHHs. In this region, the cysteines were replaced by alanines, in order to avoid the formation of unwanted structures (Hmila, et al., FASEB Journal, 2010: 24: 3479-89).
  • Oligonucleotides SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 were used to amplify segment 1, and oligonucleotides SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 to amplify segment 2.
  • the products of the first PCR were used as template in the second PCR, to assemble the bispecific and bivalent constructs.
  • the aforementioned enzyme was used, and the primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 17.
  • the PCR products were purified and Nco ⁇ /Not digested, according to the manufacturer's instructions.
  • the vector pACR1 -K was digested with the same enzymes, and ligated with the predigested bands using the enzyme T4 DNA ligase (Promega).
  • the nucleotide sequence of the constructs was checked by automated sequencing (Microsynth AG, Germany).
  • the experimental mass of the polypeptides and the arrangement of the disulfide bridges were checked by ESI/MS-MS.
  • the experimental and theoretical mass for each polypeptide coincided, with errors of less than 0.0015% in all cases, and the formation of intramolecular bridges between C22-C101 and C168-C247 was verified.
  • Automated Edman sequencing analysis of the amino terminus demonstrated its integrity.
  • the biological activity of the polypeptides was evaluated by ELISA for recognition by the VEGF and bFGF antigens, in addition to the ability to displace their binding to their respective VEGFR2 and FGFR1 receptors.
  • the bands corresponding to each VHH, OR ITS bispecific or bivalent constructs were amplified using the Platinum Hot Start DNA polymerase enzyme and the set of primers defined by SEQ ID. NO: 15 and SEQ ID NO: 22, which introduces the restriction site of the Bgl ⁇ enzyme towards the 3' end of the polypeptide.
  • PCR products were purified and digested Nco ⁇ /Bgl ⁇ (Promega).
  • the vector pACR1 -K was digested with the same enzymes, and ligated with the pre-digested bands using the enzyme T4 DNA ligase.
  • the nucleotide sequence of the VHs is verified by automated sequencing (Microsynth AG, Germany).
  • the polypeptides, without the c-myc tracer sequence and without histidine tag, were named Nb-V1 ⁇ cmycH6 (SEQ ID NO: 23), Nb-F3 ⁇ cmycH6 (SEQ ID NO: 24), Nb-VV6 ⁇ cmycH6 ( SEQ ID NO: 25), Nb-FF2 ⁇ cmycH6 (SEQ ID NO: 26), Nb-FV1 ⁇ cmycH6 (SEQ ID NO: 27) and Nb-VF3 ⁇ cmycH6 (SEQ ID NO: 28).
  • polypeptides with a purity greater than 95% were obtained, which migrate between 15-20 kDa (for Nb-V1 ⁇ cmycH6 and Nb-F3 ⁇ cmycH6) and 30-40 kDa (for Nb-VV6 ⁇ cmycH6 , Nb-FF2 ⁇ cmycH6, Nb-FV1 ⁇ cmycH6 and Nb-VF3 ⁇ cmycH6) when compared to the molecular weight standard on a 12% SDS-PAGE.
  • the correct removal of the tracer sequences was demonstrated by anti-polyhistidine and anti-c-myc Western Blot, and Protein A-HRP was used as a positive control. The integrity analysis of the amino terminal did not detect its degradation.
  • the ESI/MS-MS results showed a correspondence between the theoretical and the experimental size of the polypeptides, with an error ⁇ 0.0019%.
  • the biological activity of the polypeptides without the c-myc tracer sequence and without histidine tag was evaluated by means of ELISAs for recognition of the VEGF and bFGF antigens, and displacement of the binding to their respective VEGFR2 and FGFR1 receptors.
  • Table 2 shows the results, expressed as the Vi-iHs ⁇ cmycH6 concentration values necessary to achieve 50% antigen recognition or 50% inhibition of antigen/receptor complex formation. No differences were detected, in terms of binding or inhibition, between the VHs that do not present the tracer peptides and their homologous VHs. Table 2. Concentration of V Hs ⁇ cmycH6 that represent 50% of the antigenic recognition or 50% of the inhibition of the formation of the Antigen/Receptor complex in ELISA-type assays.
  • ⁇ H6 no c-myc tracer peptide and no histidine tag Fusion to the Fe region of a human immunoglobulin.
  • the Fe fraction of antibodies mediates effector functions such as antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-dependent cytotoxicity.
  • the VH Nb-V1, Nb-F3 and their bispecific and bivalent constructs were inserted into the vector pVSJG-huFc (Publication WO 2012/089176).
  • This plasmid was designed to obtain proteins as fusion polypeptides to the Fe regions of human origin.
  • the oligonucleotide sequences of the V H HS were amplified using the Platinum Hot Start DNA Polymerase enzyme and the oligonucleotides SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for pVSJG-huFc.
  • the restriction sites of the Afl ⁇ and Xba ⁇ enzymes were incorporated.
  • the purified PCR products were digested with these enzymes, as was the pVSJG-huFc vector. Predigested bands and vectors were ligated using the enzyme T4 DNA ligase.
  • Nb-V1_hFc SEQ ID NO: 31
  • Nb-F3_hFc SEQ ID NO: 32
  • Nb-VV6_hFc SEQ ID NO: 33
  • Nb-FF2_hFc SEQ ID NO: 34
  • Nb-FV1_hFc SEQ ID NO: 35
  • Nb-VF3_hFc Plasmid constructs with the correct sequences were transfected into CHO cells using Superfect reagent (Qiagen, Germany).
  • the clones with the highest expression in the supernatant were selected by ELISAs. of antigen recognition similar to those already described, where only the detection conjugate for anti-human IgG conjugated to peroxidase changed.
  • Protein A affinity chromatography was used for purification.
  • polypeptides with a purity greater than 95% and with an apparent size between 40-60 kDa were obtained, when compared with the weight standard (Invitrogen, EE USA), on a 12% SDS-PAGE. Their identity was verified by ELISA. The integrity analyzes of the amino terminal did not detect its degradation, and the ESI/MS-MS results determined a coincidence between the experimental and theoretical mass for each polypeptide, with errors of less than 0.0012% in all cases.
  • the biological activity of the polypeptides fused to the hFc region was evaluated by means of ELISAs for the recognition of the VEGF and bFGF antigens, and for the displacement of their binding to their respective VEGFR2 and FGFR1 receptors.
  • Table 3 shows the results of these studies, expressed as HSV IFC concentration values representing 50% antigen recognition, or 50% inhibition of Antigen/Receptor complex formation in ELISA-type assays.
  • a 2- to 4-fold decrease in the EC50 of the fusion polypeptides was observed compared to the V H homologues. This increase in recognition corresponds to the increase in valence since, like a monoclonal antibody, these polypeptides organize as homodimers.
  • a decrease in the IC50 for the antigen/receptor interaction was detected, equal in magnitude to the increase in antigenic recognition.
  • VHs are known to be resistant to high temperatures, unlike other antibody fragments such as Fab or scFv.
  • Fab antibody fragments
  • a study was conducted where 13 pg of each fragment were incubated at 4, 37, 50, and 75 S C. Immunoreactivity of the same was evaluated by ELISA, after two hours of incubation, and the maximum recognition obtained for the incubation condition at 4 S C was taken as the maximum recognition.
  • the scFv CIGB-166a fragment was used as control.
  • Table 4 shows the recognition capacity of the different fragments by VEGF or bFGF antigens, in terms of the percentage of recovered activity, taking as reference the value obtained for the protein stored at -20 s C in each case. It was observed that the specific recognition of VEGF by the V H HS Nb-V1, Nb-VV6, and Nb-FV1 remained close to 70%, even after incubating for two hours at 75 S C. This behavior was not observed for the scFv CIGB-166a, which lost antigen recognition. The same resistance to the increase in temperature, but in terms of bFGF recognition, was detected for Nb-F3, Nb-FF2 and Nb-FV1.
  • Example 8 Ex vivo study of the solubility of the V H H fragments in different buffers and in the vitreous humor of Chinchilla rabbits.
  • Formulation A a (+) 10% Trehalose, 100 mM Phosphate Buffer, 10 mM L-Arginine, 0.3% NaCI and 0.04% Tween 80, pH 6.78.
  • Formulation B a (+) 7.5% Trehalose, 100 mM Phosphate Buffer, 10 mM L-Arginine, 0.3% NaCI and 0.04% Tween 80, pH 6.78.
  • the VHHs were concentrated to a maximum of 28 mg/mL, and subsequently adjusted to a concentration of 5 mg/mL.
  • the VHH were diluted in the different buffers up to a concentration of 100 and 200 pg/mL and incubated at 4 S C for five days. After this period, their immunoreactivity was determined.
  • the scFv CIGB-166a fragment was used as a control. 100% of the activity was recovered, for all the polypeptides under study, in the six buffers, while for the scFv CIGB-166a a recovery of 100% was observed only for the Ranibizumab buffer, and losses greater than 20% for the rest of the experimental conditions.
  • the solubility of the V H H fragments in the vitreous humor was evaluated in an ex vivo model, considering that the doses to be used in the treatment of conditions of the macula and cornea range between 0.5 and 2 mg for a final concentration in the vitreous between 0.125 and 0.5 mg/mL (Giannos, et al., Pharmaceutical Research, 2018: 1 -15).
  • the kinetic study at 37 S C did not indicate the presence of precipitation phenomena upon optical microscope inspection (400X). Analysis of the supernatant, after centrifugation at 6000 rpm, showed no loss of biological activity in terms of ligand recognition (95-100% activity recovery for all VHs compared to polypeptides in buffer). phosphate, which was taken as maximum recognition).
  • Bevacizumab Bev
  • scFv fragment CIGB-166a He recovered 100% activity for all polypeptides under study, except for scFv CIGB-166a, for which a 50% loss of activity was observed, attributable to precipitation.
  • Example 9 Evaluation of the effect of adding the different polypeptides to in vitro I ex vivo systems.
  • 6000 HDMEC cells per well were seeded in 100 pL of MCDB131 medium (SIGMA) supplemented with 10% serum, in 96-well plates (COSTAR). After 12 hours, the serum was removed from the culture medium by washing and 100 pL of MCDB131 medium were added for 24 hours.
  • the addition of VEGF (5 ng/mL), bFGF (10 ng/mL), or VEGF/bFGF (2.5 ng/mL and 5 ng/mL respectively) induced significant cell proliferation at 72 hours of culture.
  • the V H were added in final concentrations between 300 and 0.5 nM to the proliferation activators in MCDB131 medium, for one hour at 37°C, and added to the cells for a final volume of 200 pL.
  • Cell proliferation was calculated from the metabolism of Alamar Blue added to the culture. A 50% reduction in proliferation was observed, for the concentrations shown in Table 5 (IC50):
  • Nb-V1, Nb-VV6, Nb-F3, Nb-FF2, Nb-FV1 and Nb-VF3 resulted in a reduction of VEGF or bFGF-dependent proliferation of the endothelial line.
  • HDMEC microvascular Additive cooperation was evidenced between the use as a target of both systems, when using the two stimuli.
  • 3T3A31 and NIH3T3 cells were seeded at a density of 6000 cells per well in 100pL of DMEM medium, supplemented with 10% SFB, while A549 and B16F10 cells were used at 2000 cells per well.
  • VEGF activation was used as a negative control.
  • the assay was performed differentially, in terms of bFGF concentrations that generate maximum proliferation (100 ng/mL for 3T3A31 and NIH3T3, and 20 ng/mL for A549 and B16F10).
  • a significant reduction in proliferation in response to bFGF was observed for the experimental conditions that included polypeptides with specificity for this growth factor, and the doses for 50% inhibition of proliferation are detailed in Table 6.
  • HDMEC cells seeded on three-dimensional Matrigel matrix were used for these evaluations (Montesano, R., Pepper, MS, 1998. In: Little, CD, Mironov, V., Sage, EH (Eds.), Vascular Morphogenesis: In vivo , In vitro, In mente. Birkhauser, Boston, pp. 79-110.).
  • 2.5 pL of MATRIGEL was added per well. (SIGMA, USA) at 4°C in Terasaki plates, and it solidified when the temperature was changed to 37°C.
  • 10 pL of CFSE-labeled HDMEC cells were added to the gel, at a rate of 2000 cells per well in MCDB131 medium, and 10 pL of the treatments shown in Table 7 were added to them.
  • Table 7 Average number of nodes observed in five fields per experimental replicate for each treatment.
  • VHHS object of the invention is the use in the treatment of vascular disorders of the macula.
  • vascular disorders of the macula In order to analyze the feasibility of using some of them in the treatment of hypervascularization dependent on the growth factors VEGF and bFGF, Chinchilla rabbits were used, as described by Morera et al (Morera, et al., Exp Eye Res, 2014: 122: 102-9). Single injections of 2.5 pg VEGF or bFGF in 50 pL were used to induce vascular damage, which proved to be enough to induce an aberrant vascularization pattern at 10 days.
  • V H HS Nb-V1, Nb-F3, Nb-VV6 and Nb-FV1 also by single intravitreal injection of 100 pg in each case, in 50 pL of saline solution.
  • Examinations under the operating microscope, color fundus photography, and fluorescein angiography (FA) were performed one week before the first intravitreal injection of proangiogenic factors, and ten days after it.
  • the rabbits were anesthetized and the pupils were dilated as described. At least five photographs were taken in each eye: optic disc, temporal medullary wing, nasal medullary wing, upper retina above the disk, and lower retina below the disk.
  • VEGF and/or bFGF Injection of human VEGF and/or bFGF into the vitreous of the right eye generated retinal neovascularization in ten days, associated with disc hyperemia, vascular dilatation and tortuosity, and fluorescein leakage in the optic disc, medullary wings, and anterior chamber (AC).
  • the left eye in which only the V H preparations were injected in the absence of VEGF and/or bFGF and the corresponding images at the start of treatment were used as control.
  • HSV HSV to lodge in the zone corresponding to tumor growth of A673 or A549 cells was determined, taking as a negative reference a VHH purified from a negative clone for binding to VEGF or bFGF.
  • A673 human tumor cells express human VEGF and A549 cells express both VEGF and bFGF.
  • Polypeptides were labeled with 1131 (Amersham, UK), by lodogen method (Fraker PJ, Speck JC Jr. 1978. Biochem Biophys Res Comm 80:849-857), for specific activities of 1.51 MBq/5 pg and 1.55 MBq/5 pg, respectively.
  • the radiolabeled products were analyzed using thin layer chromatography to determine their incorporation into the protein, finding values between 92 and 95% of the radioactivity in all cases.
  • the ability of the radiolabeled products to detect their corresponding antigens was tested in a system where polystyrene immunotubes were coated with recombinant human VEGF isoform 121 (5 pg/mL; Peprotech), or recombinant bFGF ( 5 pg/mL; SinoBiological, USA). Subsequently, they were blocked, and the sample of the radiolabeled fragments of the corresponding specificity was added, adjusted to the amounts that could be trapped by that solid phase. After the Incubation and washing, it was determined that the solid phase bound between 84.2% and 87.3% of the radioactivity, in all cases, demonstrating that the radiolabeling procedure did not significantly affect the biological activity of HSV.
  • mice 126 nu/nu mice were used. The animals were inoculated, via the subcutaneous route, with 5x10 6 human tumor cells of the lines A673 or A549 in the right dorsal zone. When the tumors reached volumes of 280 ⁇ 20 mm 3 they were randomized into six groups of 9 animals, for each tumor model, and treatment began. The mice were injected through the tail vein with the radiolabeled product in question, and were sacrificed in groups of 3 at 24, 48, and 72 hours, surgically removing the tumor and the following normal tissues: spleen, liver, kidney, intestine. , muscle, marrow and blood. The accumulation of radioactivity was expressed as a percentage of the injected dose per gram of tissue. Calibration was performed using a standard sample of the injected dose. Radioactivity was determined using a gamma scintillation counter.
  • Table 9 presents the ratio of the values of radioactivity in the tumor: radioactivity in the blood, calculated from the measurements made in these tissues.
  • the study showed that, between 24 and 72 hours, HSV localize preferentially! in tumor tissue, which is not the case for non-specific Nb-Neg.
  • a greater accumulation of Nb-V1 and Nb-VV6 polypeptides was observed in A673 tumors, and a greater concentration of Nb-F3 and Nb-FF2 polypeptides in those originated by the implantation of A549 cells, in correspondence with the high expression of VEGF in A673 and of bFGF in A549.
  • the bispecific constructs accumulated in a similar percentage in both tumor types, and in a higher proportion than the monospecific and bivalent monospecific variants. No specific deposit of radiolabeled VHH was found in tissues other than the tumor, 48 hours after the VH injection.
  • Table 9 Tumor radioactivity to blood radioactivity ratio for nude mice transplanted with A673 or A549 human tumor cells.
  • VH concentration in the serum of the treated animals showed that 24 hours after the administration of a single dose of 300 pg, equivalent to 15 mg/kg, the concentration of the VHH not fused to Fe (Nb -V1, Nb-F3, Nb-VV6, Nb-FF2 and Nb-FV1) was less than 5 pg/mL.
  • Nb-FV1_Fc 132 pg/mL were detected, indicating the superior stability of this construction to maintain high systemic levels of V H.
  • Example 12 Effect of VHHs on dendritic cell maturation and T lymphocyte activation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • CD8+ cells isolated from a negative selection process using magnetic beads (Miltenyi, Germany), from the spleen of an animal. C57BI/6, 20 weeks old, and (B) immature dendritic cells differentiated with mFLT3 for one week, isolated from a bone marrow extraction from the same animal.
  • CD8+ lymphocytes were added to plates coated with anti-CD3 at 10 pg/mL, and incubated for 48 hours with 50 ng/mL VEGF (Sigma, USA) preincubated for 2 hours with decreasing concentrations of HSV. . After this time, the cells were labeled as described by Voron et al. (Voron, et al., J Exp Med, 2015: 212: 139-48), and the results were analyzed on a SYSMEX (Germany) flow cytometer.
  • Table 10B Analysis of the expression of MHCII and CD86 measured as mean fluorescence intensity (IMF) in dendritic cells treated with VEGF and with HSV under conditions of activation with lipopolysacchard.
  • IMF mean fluorescence intensity
  • the animals were anesthetized with a lethal dose of ketamine, to extract whole blood, and proceed to perfusion of the right atrium with PBS. Serum was separated and primary tumors, liver, kidney and lung were weighed separately, depending on the model. The primary tumors, in all cases with diameters less than 10 mm, and the tissues with metastases were divided into three sections that included all the tumor layers. In each case, the tumors or metastases were analyzed by: (a) immunohistochemistry, in order to analyze the vascular density by CD34 selective staining, (b) flow cytometry, to quantify and characterize the leukocyte infiltrate in the tumor tissue. , and (c) ELISA for the quantification of V H , cytokines and growth factors in RIPA tissue lysate and plasma, as described in Example 1 .
  • MC-38 Colon Carcinoma Liver Metastasis Model C57BL/6 animals were challenged by intrahepatic administration of MC-38 mouse metastatic colorectal cancer cells. A laparotomy was performed under anesthesia, and the upper liver lobe was exposed, where a total of 10,000 cells in 20 pL were inoculated. Polypeptides were administered intraperitoneally 72 hours after challenge.
  • RENCA Metastatic Renal Tumor Model BALB/c animals were challenged by administration of 20000 RENCA mouse metastatic renal carcinoma cells. A laparotomy was performed under anesthesia and the kidney was exposed, to inoculate the cells in 20pL, with an ultrafine needle in the subcapsular area. The polypeptides were administered intraperitoneally, 72 hours after the challenge.
  • CT26 Subcutaneous Tumor Model BALB/co nu/nu animals were challenged by subcutaneous administration of 20000 CT26 mouse colon carcinoma cells. Treatment began in a pehtumoral manner when tumor diameters between 7 and 8 mm were reached. It was administered every 72 hours for two weeks.
  • A673 or A549 subcutaneous tumor model nu/nu animals were challenged by subcutaneous administration of 5x10 6 human A673 or A549 cells. Treatment began in a pehtumoral manner when tumor diameters between 7 and 8 mm were reached. It was administered every 72 hours for two weeks. In these models, in particular, the VH variant Nb-FV1-hFc was evaluated at the same doses and route.
  • CT26 lung implant model BALB/c animals were challenged by retro-orbital administration of 20,000 CT26 cells, in 20 pL, with an ultrafine needle. Treatment was started via the nasal route 72 hours after the challenge, with 25 pL per nostril, for a total dose of 15 mg/kg.
  • Tables 11, 12, and 13 show a summary of the results of tumor growth inhibition, histopathological studies of tumor vascularization and concentrations, particularly of VEGF in tumor lysates, referred to the negative control.
  • Table 13 VEGF expression in neoplastic tissue of treated and untreated animals.
  • Nb-FV1 for its part, resulted in an increase in the antitumor and antiangiogenic effect compared to Nb-V1 and Nb-VV6, due to the incorporation of a second molecular target and the known cooperativity of the inhibition of the VEGF systems.
  • /VEGFR and bFGF/FGFR in the induction of the angiogenic event (Asahara, et al., Circulation, 1995: 92: 11365-71 ).
  • Nb-FV1 The incorporation into Nb-FV1 of the CH2-CH3 segment of human IgG1 resulted in an increased antitumor and antiangiogenic effect, compared to the use of Nb-FV1 in the subcutaneous tumor models in which it was tested (p ⁇ 0.05 t-test). of Student).
  • Table 14A Analysis of the senescence of the infiltrating T cell population in the tumors according to the percentage of expression of the PD1 marker.
  • Table 14B Analysis of the expression of MHC II in the fraction of macrophages infiltrating tumor lesions.
  • Example 14 In vitro functional evaluation of HSV gene transfer with viral vector.
  • Nb-VV6_hFc and Nb-FV1_hFc was amplified with a PCR, using the oligonucleotides SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38, according to the protocols already described. After digesting Not/Pme ⁇ , both the pAAVK-EIF2-MCS vector and the band were ligated and transformed into strain DH5a.
  • pAAVK-EIF2-Nb-VV6_hFc and pAAVK-EIF2-Nb-FV1_hFc were used to package the viral particles in the AVV2 system in HEK-293 cells, according to the manufacturer's instructions. (GENEMEDI, China). Viral particles were isolated and concentrated from co-transfected HEK293 cells with 72 hours of culture, as described by Hughes et al. (Hughes, et al., Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, 2019: 13: 86-98). After titration by qPCR, they were stored at -80 s C until use (Aurnhammer, et al., Hum Gene Ther Methods, 2012: 23: 18-28).
  • VH_hFc the total amount of VH_hFc in tissue was measured by ELISA, as described in Example 1, using a standard curve of each VHH IFC purified and characterized from CHO cells.
  • VH concentrations between 50 and 100 pg per processed gram were detected.
  • the concentrations detected in both expression formats coincide with those reported for each case in the literature for viral particles packaged in the AVV2 system and in all cases evidenced its functionality in terms of binding to specific antigens and blocking their binding. to their receivers.

Abstract

Polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos que comprenden en su secuencia aminoacídica al menos un fragmento de anticuerpo de simple dominio (VHH) y vector que codifica para polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos. Composición farmacéutica que comprende dichos polipéptidos o dichos vectores que codificas para polipéptidos que se unes a factores de crecimiento proangiogénicos. Uso de los polipéptidos que se unes a factores de crecimiento proangiogénicos, o del vector que codifica para dichos polipéptidos, para la manufactura de un medicamento. Método de tratamiento de una patología que cursa con el incremento de la angiogénesis, la inflamación o la inmunosupresión, en un individuo que lo necesita, donde se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido que se une a factores de crecimiento proangiogénicos o el vector que codifica para dicho polipéptido.

Description

POLIPÉPTIDOS QUE SE UNEN A FACTORES DE CRECIMIENTO PROANGIOGÉNICOS
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con la biotecnología, y con el campo de la salud humana. Proporciona polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) humanos, e inhiben sus efectos biológicos. Ofrece las bases para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos, las que se emplean en el tratamiento de patologías que cursan con el incremento de la angiogénesis, la inflamación y la inmunosupresión.
Estado de la técnica anterior
Los procesos de vascularización “de novo” ocupan en la actualidad una posición central en las investigaciones de múltiples enfermedades, y la angiogénesis se describe hoy como un principio organizacional en el descubrimiento de nuevos fármacos (Folkman, Nat Rev Drug Discov, 2007: 6: 273-86). En la última década, se han aprobado para su uso en humano múltiples tratamientos con base en inhibidores de la proliferación endotelial, y moduladores del ensamblaje y permeabilidad de las estructuras vasculares. Estos tratamientos pudieran dividirse en tres grupos fundamentales: I) los que emplean polipéptidos pequeños y del tipo de los inhibidores de tirosina kinasa; II) los que se basan en anticuerpos, sus fragmentos y variaciones; III) aquellos que emplean la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) codificante de los anticuerpos, sus fragmentos o variaciones insertadas en un vector viral (Apte, et al., Cell, 2019: 176: 1248-64).
En fases avanzadas de ensayos clínicos se encuentran anticuerpos monoclonales completos y fragmentos de estos que conservan el sitio de unión al antígeno. A pesar del éxito terapéutico de los anticuerpos monoclonales, estos presentan una serie de inconvenientes desde el punto de vista productivo. Su peso molecular elevado (150 000 Da), su composición heterotetramérica, y la presencia de cerca de 15 enlaces disulfuro impiden su producción fácil en bacterias, y la dificultan en células eucañotas. Además, su elevada talla molecular entorpece la penetración en los tejidos, lo que limita su localización en el sitio de acción (Jovcevska y Muyldermans, BioDrugs, 2020: 34: 11 -26). Por ello, se han desarrollado plataformas tecnológicas que utilizan el sitio de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales para generar polipéptidos de menor talla molecular.
En este contexto, los anticuerpos de simple dominio, también conocidos por la abreviatura V H, son los fragmentos de anticuerpos más pequeños que existen en la naturaleza (15-17 kDa), capaces de reconocer de manera específica un antígeno. Se derivan de las regiones variables de los anticuerpos de cadena pesada de los camélidos. Además, estos polipéptidos, son resistentes a altas temperaturas, pH extremos y proteasas (Muyldermans, FEBS J, 2021 : 288: 2084-102). El pequeño tamaño de un VHH puede ser una desventaja para la terapia. Sin embargo, la alta eficiencia y solubilidad en ambientes acuosos, la gran penetrabilidad en los tejidos y tumores, y el excelente perfil de seguridad y baja inmunogenicidad de los V H los hacen prometedores en diversas aplicaciones inmunológicas (Sun, et al., Int J Nanomedicine, 2021 : 16: 2337-56).
En la última década los V HS demostraron su potencialidad en diferentes campos de la investigación científica (Jovcevska y Muyldermans, BioDrugs, 2020: 34: 11 - 26). Recientemente, el primer VHH recibió la aprobación para el uso en humanos y otros dos polipéptidos se encuentran en las fases II y III de ensayos clínicos (Scully, et al., New England Journal of Medicine, 2019: 380: 335-46). Otros avanzan por los diferentes estratos de ensayos pre-clínicos y clínicos.
La tecnología de presentación de fagos permite una selección astringente y eficiente que recupera, en unas pocas semanas, múltiples polipéptidos de alta afinidad dentro una librería grande y diversa (McCafferty, et al., Nature, 1990: 348: 552-4). Para la selección de los VHHS se pueden emplear tres tipos de bibliotecas: bibliotecas inmunes, las no inmunes (naive) y las bibliotecas sintéticas. De ellas, solo las sintéticas pueden proporcionar una biblioteca universal auténtica, lo que posibilita la obtención de V HS específicos para casi cualquier antígeno (Knappik, et al., Journal of Molecular Biology, 2000: 296: 57-86).
En los últimos años se generaron, seleccionaron y evaluaron diversos V H, O polipéptidos derivados de estos, con especificidad por mediadores del proceso angiogénico. Un número creciente de estudios atribuyen al eje bFGF/FGFR un papel preponderante en el mecanismo de resistencia a los fármacos anti- VEGF/VEGFR. Sin embargo, no existen hasta el momento V HS específicos por el bFGF (Wang, et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2012: 11 : 864-72, Ronca, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2015: 19: 1 -17, Zahra, et al., Cancers (Basel), 2021 : 13: 1422).
Teniendo en cuenta el papel fundamental del VEGF en el proceso angiogénico, se han generado V HS específicos por el VEGF, exclusivamente a partir de bibliotecas inmunes de camélidos (Farajpour, et al., Journal of Biomolecular Screening, 2014: 19: 547-55, Ebrahimizadeh, et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015: 176: 1985-95, Kazemi-Lomedasht, et al., Molecular Immunology, 2015: 65: 58-67). Estos V H han demostrado su efecto inhibitorio sobre la proliferación de células endoteliales y la formación de estructuras tubulares y, en uno de ellos se comprobó su efecto antitumoral en el modelo TC-1. Estos VHH reconocen al VEGF en conformación desnaturalizada, por lo que deben ser específicos para un segmento lineal, elemento que los asemeja al Bevacizumab (Kazemi-Lomedasht, et al., Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 2017: 399-496).
Los inconvenientes fundamentales para el desarrollo posterior de estos polipéptidos, más allá del mareaje radioactivo o fluorescente, se relacionan con: a) la probable antigenicidad de las secuencias derivadas de camélidos, b) su bajo peso molecular que limita la biodisponibilidad, debido a la rápida eliminación por la vía renal, c) la naturaleza multifactorial de las patologías, que apunta a la necesidad de usar como blanco más de un sistema de factores de crecimiento/receptores.
Solo uno de los V H específicos para el VEGF se sometió a un proceso de humanización (Kazemi-Lomedasht, et al., Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 2018: 21 : 260-6). Hasta el momento se desconoce el comportamiento en sistemas in vivo para esta proteína. Existe al menos un V H anti-VEGF que ha sido parcialmente humanizado, y forma parte de la construcción biespecífica conocida como BI836880 (Kovalchuk, et al., Clinical & Experimental Metastasis, 2020: 37: 637-48). Este V H se encuentra en estudios clínicos de fase II, para degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y para lesiones metastásicas de tumores sólidos avanzados (www.htto//cl¡n¡caltr¡als.qov).
A fin de incrementar la talla de los VHH específicos para otros blancos moleculares, se han descrito polipéptidos bivalentes, mono- o biespecíficos que incorporan, además, sitios de unión a proteínas séricas, como la albúmina o al segmento Fe de las inmunoglobulinas lgG1 , lgG2 e lgG4. Para el VEGF o el bFGF no se han descrito estrategias que incorporen Fe de inmunoglobulinas, o sitios de unión para otras proteínas, a los sitios de unión tipo V H.
Hasta el momento, no se han descrito polipéptidos del tipo V H multivalentes mono- o biespecíficos humanizados que usen como blanco el bFGF y solo dos acercamientos utilizan VHHS parcialmente humanizados específicos para el VEGF. Adicionalmente, ninguna de las estrategias discutidas anteriormente ha aprovechado aún la diversidad que pudiera generar el uso de una librería sintética humanizada.
Por tanto, sigue siendo necesaria la obtención de variantes terapéuticas con sitios de unión novedosos y específicos para el VEGF y el bFGF humanos, que muestren un efecto antiangiogénico, antitumoral, antimetastásico, anti-inflamatorio e inmunorestaurador incrementado. Esto permitiría una mejora adicional en la biodisponibilidad y acceso tisular de las mismas.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente, al proveer polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos. Estos polipéptidos comprenden en su secuencia aminoacídica al menos un fragmento de anticuerpo de simple dominio (V H) que posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que posee un 95% de identidad con dichas secuencias. Dichos polipéptidos se obtienen a partir de las sub-bibliotecas generadas en el marco de la invención, y muestran propiedades físico-químicas que los hacen atractivos desde el punto de vista de la formulación y el desarrollo de medicamentos. En una realización de la invención, el factor de crecimiento proangiogénico al que se unen dichos polipéptidos es el VEGF o el bFGF humano.
En una materialización de la invención, el polipéptido que se une al VEGF o al bFGF humano se une al menos a dos moléculas de VEGF o de bFGF, o a una molécula de VEGF y una molécula de bFGF. En una realización particular, la invención provee polipéptidos que poseen una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.
En la invención se muestra la obtención de un polipéptido denominado Nb-V1 que se une al VEGF humano y al de ratón, e inhibe su unión al receptor tipo 2 del VEGF (VEGFR2), pero no al receptor tipo 1 del VEGF (VEGFR1 ). La secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido se identifica como SEQ ID NO: 12. A diferencia de los anticuerpos de talla completa, el Nb-V1 se distribuye de manera preferencia! hacia los tumores, y se evidenció que posee propiedades antiangiogénicas. EL Nb- V1 difiere de otros fragmentos de anticuerpos anti-VEGF en que no inhibe la unión del VEGF al VEGFR1. Este receptor se ha descrito con frecuencia como una forma de almacenar el VEGF en la matriz extracelular, ya que no tiene una transducción efectiva de la señal y resulta, además, esencial en múltiples procesos homeostáticos (Shibuya, Cell structure and function, 2001 : 26: 25-35). Su bloqueo por otros inhibidores del sistema VEGF/VEGFR se relaciona con incrementos en el daño renal y hepático, por lo que lograr la inhibición selectiva del VEGFR2 aporta una ventaja desde el punto de vista toxicológico (Sullivan, et al., PLoS ONE 2010: 5: 7-8). El VEGFR2 es un mediador de los efectos del VEGF sobre la proliferación, migración, y formación de tubos por las células endoteliales (Selvaraj, et al., Cancer Cell, 2015: 27: 780-96), y sobre la atracción de células TReg y MDSC, y la inducción de la senescencia de linfocitos T (Bourhis, et al., Frontiers in Immunology, 2021 : 12: 616837)
En la invención también se muestra la obtención de un VHH denominado Nb-F3, que se une al bFGF humano y de ratón, e inhibe su unión al FGFR1 , y que se caracteriza porque su secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 13. Esta molécula es única en su clase, pues no se ha descrito ningún V H con especificidad para el bFGF. El polipéptido Nb-F3 mostró propiedades antiangiogénicas y antiproliferatives in vitro.
Los polipéptidos monovalentes y monoespecíficos Nb-V1 y Nb-F3 se obtuvieron en su forma monoméñca, y mantuvieron más del 70% de su reconocimiento del antígeno y del bloqueo de la unión a sus respectivos receptores, al someterse a 75°C por 2 horas. Se evidenció, además, la estabilidad de los V H a altas concentraciones, en una variedad de tampones de diferentes pHs, y en formulaciones sencillas y complejas. Los resultados obtenidos para los VHHS Nb-V1 y Nb-F3, en términos de estabilidad térmica desde el punto de vista conformacional y funcional, indican la factibilidad de la obtención de polipéptidos con un perfil adecuado de estabilidad térmica y de solubilidad, a partir de la biblioteca universal y de las bibliotecas de maduración diseñadas. Los V HS Nb-V1 y Nb-F3 que revela la invención tienen una talla aproximada de 15 kDa. Esta característica ofrece ventajas desde el punto de vista de la penetrabilidad tisular, pero condiciona su rápida eliminación por la vía renal (Cortez- Retamozo, et al., Int J Cancer, 2002: 98: 456-62). La eliminación renal hace necesaria la administración reiterada.
A fin de incrementar la retención en la circulación, en una realización, el polipéptido de la invención es un polipéptido de fusión que comprende: a) una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 y b) una secuencia de aminoácidos que corresponde a un sitio de unión a albúmina o un dominio Fe de una inmunoglobulina humana. En una materialización de la invención, el dominio Fe es de una inmunoglobulina humana IgGi, lgG2, lgG3 o lgG4.
El diseño de multímeros con espaciadores (linkers) o regiones bisagra (hinge se ha descrito ampliamente en la literatura. Estos pueden ser sintéticos, como los multímeros de la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. También pueden escogerse del grupo de secuencias de las bisagras y espaciadores de origen humano, o de la familia camelidae, que cumplen esta función dentro de las inmunoglobulinas de dichas especies (Nezlin, The Immunoglobulins, 1998: 3-73, Conrath, et al., Developmental and Comparative Immunology, 2003: 27: 87-103, Saerens, et al., Anal Chem, 2005: 77: 7547-55).
En la invención se revela la obtención de un polipéptido que reconoce dos moléculas de VEGF (bivalente monoespecífico por el VEGF), denominado Nb-VV6, que inhibe su interacción con el VEGFR2 y que posee la secuencia identificada como SEQ ID NO: 20. También se revela la obtención de un polipéptido que reconoce dos moléculas de bFGF (bivalente monoespecífico por el bFGF), denominado Nb-FF2, que inhibe su interacción con el FGFR1 , y que posee la secuencia identificada como SEQ ID NO: 21. Los VHHS Nb-VV6 y Nb-FF2, a diferencia de otros en el estado del arte, se obtuvieron en su forma monomérica y perdieron menos del 30% de su actividad de unión y bloqueo de unión a receptores al someterse por 2 horas a 75°C. Con esta estrategia, se logró un incremento de 3 veces en el reconocimiento de los ligandos respectivos, al comparar con las variantes monovalentes, lo que correlacionó con el aumento de los efectos antiangiogénicos in vitro. Los estudios de biodistribución demostraron una acumulación de estos polipéptidos bivalentes monoespecíficos en lesiones tumorales, similares a las observadas para las variantes monovalentes. Los análisis en modelos de neovascularización en mácula o en tumor, en varios estudios in vivo, indicaron un efecto superior de estos polipéptidos bivalentes monoespecíficos.
El secuestro exclusivo de uno de estos ligandos (bFGF o VEGF) no neutraliza de manera definitiva los procesos angiogénicos asociados a las enfermedades, debido a la redundancia de las vías de inducción de los mismos (Haibe, et al., Frontiers in Oncology, 2020: 10: 221 ). La inhibición de dos o más factores pro-angiogénicos resulta más efectiva en el manejo prolongado de enfermedades de la mácula (Campa, Curr Drug Targets, 2020: 21 : 1194-200) y de tumores hepáticos (Zahra, et al., Cancers (Basel), 2021 : 13: 1422). Considerando esto, en la invención se proveen polipéptidos monovalentes biespecíficos, denominados Nb-VF3 y Nb- FV1 , que se unen tanto al VEGF como al bFGF, e inhiben la interacción de estos factores con los receptores VEGFR2 y FGFR1 , respectivamente. Estos polipéptidos biespecíficos se caracterizan por poseer una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. De manera interesante, se observó que independientemente del orden de los segmentos correspondientes a SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 en los polipéptidos biespecíficos, estos reconocen los antígenos VEGF y bFGF, e inhiben la interacción de los mismos con sus receptores específicos. Estos VHH biespecíficos conservaron las propiedades físico-químicas y biológicas descritas para las versiones monovalentes de sus parentales. Los análisis en modelos de neovascularización en mácula o en tumor, en varios estudios in vivo, indicaron la superioridad del polipéptido biespecífico Nb-FV1 respecto a la vahante monoespecífica Nb-V1 .
En la invención se hace referencia particular a la incorporación a la secuencia de los polipéptidos que se identifican como SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28 de un fragmento Fe (CH1 -CH2) de una inmunoglobulina tipo lgG1 humana. Este elemento incorpora una función efectora, en términos de unión del complemento, e incrementa en más de 60 kDa la talla de esos polipéptidos V H, elementos que son deseables para su uso en enfermedades neoplásicas (Rath T et al. HHS Public Access. 2016; 35: 235-254). Los polipéptidos resultantes de la adición del Fe de lgG1 humana se denominaron Nb-V1_hFc, Nb-F3_hFc, Nb-VV6_hFc, Nb-FF2_hFc, Nb-FV1_hFc y Nb-VF3_hFc, y poseen las secuencias que se identifican como SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36, respectivamente. El análisis del reconocimiento de los antígenos respectivos, y de la inhibición de la unión de los mismos a sus receptores, indicó que la adición de este segmento carboxilo terminal no afecta las propiedades biológicas, respecto a lo descrito para sus contrapartes sin segmento Fe. Adicionalmente, se evidenció que la incorporación de ese segmento aumenta de forma significativa la vida media del V H en plasma, lo que correlaciona con los efectos antitumorales, antiangiogénicos, e inmunorestauradores de la terapia con los mismos en modelos tumorales. De manera similar, pueden incorporarse los segmentos CH2-CH3 de otras inmunoglobulinas con menor capacidad de activación del complemento, que pudieran ser útiles en la captura de ligando, sin la inducción paralela de fenómenos inflamatorios.
Por otra parte, se ha descrito que los péptidos trazadores c-myc y polihistidina resultan deletéreos para la funcionalidad de moléculas pequeñas, como pudieran ser los V H. Además, estos segmentos trazadores se localizan de manera preferencial en riñón, y convierten a este órgano en una diana de los efectos tóxicos, debido a la administración reiterada (Huyvetter, et al., Theranostics, 2014: 4).
Por tanto, a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos Nb-V1 , Nb-F3, Nb- VV6, Nb-FF2, Nb-FV1 y Nb-VF3 se les eliminó el carboxilo terminal, y los polipéptidos resultantes se denominaron Nb-V1\cmycH6, Nb-F3\cmycH6, Nb- VV6\cmycH6, Nb-FF2\cmycH6, Nb-FV1\cmycH6 y Nb-VF3\cmycH6, respectivamente. Estos polipéptidos poseen secuencias de aminoácidos que se identifican como SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 28, respectivamente. Estos V HS mostraron propiedades biológicas similares a sus contrapartes con c-myc y polihistidina.
La presente invención no se restringe a una forma particular de obtener o estabilizar los VHH. Estos pueden obtenerse y separarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad por proteína A, una estrategia ampliamente aceptada para la fabricación de productos recombinantes y que, además, asegura el plegamiento correcto de los polipéptidos que se obtienen. Igualmente los V H, dada su estabilidad química y térmica, se pueden purificar mediante estrategias de precipitación combinadas con intercambio iónico.
Los estudios in vivo en animales desnudos indicaron los efectos antitumorales y antiangiogénicos de los V H, y su localización preferencial hacia las lesiones tumorales. El estudio de la densidad de vasos evidenció una reducción de significación en los tumores y focos metastásicos de los animales tratados con varias variantes de V H. El análisis de los efectos antitumorales en modelos singénicos de ratón indicó un impacto superior de la intervención al comparar animales inmunocompetentes con los inmunocomprometidos, lo cual pudiera relacionarse con el efecto inmunorestaurador potencial del secuestro de estos factores de crecimiento. Estos efectos se verificaron in vitro e in vivo.
Para aplicaciones terapéuticas, los polipéptidos de la presente invención se administran a un individuo que lo necesita, en una dosis farmacéuticamente efectiva, por vías que son conocidas para un versado en esta rama de la técnica.
La administración de los polipéptidos de la invención redujo de manera significativa el crecimiento tumoral de neoplasias de diversos orígenes, que incluyen carcinoma de pulmón, carcinoma de colon, y carcinoma renal. Estos resultados se obtuvieron en modelos que han resultado relevantes a la traslación de resultados de otros tratamientos anti-tumorales a la práctica clínica, lo que indica la aplicabilidad de esta estrategia al escenario clínico en el tratamiento del cáncer. Las dosis de los polipéptidos a utilizar para cada aplicación dependen del efecto deseado, ya que con el aumento de la dosis se ha observado incremento en el efecto biológico.
La invención también provee un vector que codifica para un polipéptido que se une a factores de crecimiento proangiogénicos, donde el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 36. Esta estrategia incrementa la permanencia in vivo de estos polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos. Al respecto se ha descrito el uso de vectores adenoasociados, sobre todo en la administración supracoroidal o intravítrea de vectores que codifican para polipéptidos con probado beneficio en la administración intravítrea (Antonio, et al., 2021 : 2: 151 -7). El uso del vector adenoasociado AAV2 posibilitó la expresión in vitro e in vivo de los polipéptidos de interés, como se muestra en el Ejemplo 14.
La invención revela una composición farmacéutica que comprende: a) un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 36 o b) un vector que codifica para un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En la presente invención se utilizó preferentemente tampón fosfato salino como vehículo de las preparaciones polipeptídicas, pero se comprobó su estabilidad en un amplio rango de aditivos. Los polipéptidos o los vectores pueden ser administrados en excipientes aceptados para el uso farmacéutico que no sean tóxicos, ni presenten efectos terapéuticos.
De igual forma, las composiciones farmacéuticas de la invención no se restringen a una vía de administración específica, y se evidencia que, sin formulaciones específicas, los VHHS pueden administrarse por vía intravítrea, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, e intranasal, y generar efectos antiangiogénicos, antitumorales, antiinflamatorios e inmunorestauradores. Por tanto, en una materialización de la invención, la composición farmacéutica está formulada para su administración por ruta sistémica, mucosal o intravítrea.
Es también objeto de la presente invención el uso de un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28, SEO ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36; o de un vector que codifica para un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID
NO: 23 a la SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36, para la manufactura de un medicamento. En una realización de la invención, el medicamento es útil para el tratamiento de una patología que cursa con el incremento de la angiogénesis, la inflamación o la inmunosupresión. La invención no restringe el uso del medicamento en enfermedades particulares. Esta ¡lustra como la terapia con medicamentos que comprenden los polipéptidos o los vectores de la invención, resulta efectiva también en otros contextos, a partir de los resultados de modulación de la activación de células dendríticas, células T y macrófagos obtenidos in vitro. En una realización particular de la invención el medicamento es útil para el tratamiento del cáncer, de la retinopatía diabética, de la degeneración macular o de la artritis reumatoide.
En otro aspecto, la invención provee un método de tratamiento de una patología que cursa con el incremento de la angiogénesis, la inflamación o la inmunosupresión en un individuo que lo necesita, que se caracteriza porque se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36; o el vector que codifica para un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36. En una materialización de la invención, en dicho método de tratamiento, la patología es el cáncer, la retinopatía diabética, la degeneración macular, o la artritis reumatoide. En una realización particular de la invención, en el método de tratamiento dicha composición farmacéutica se administra por ruta sistémica, mucosal o intravítrea.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1: Métodos Generales
Plásmidos, microorganismos, enzimas, anticuerpos y proteínas recombinantes
Los vectores pHG-1 m, pACR-1 K y pVSJG-huFc (Lamdan, H et al, WO 2008/052489), junto a las cepas TG1 (K12_(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F’ traD36, proA+B+, laclq, lacZ_M15) y BL21 (F- ompT hsdS (rB-mB-) gal dem met (DE3)) de Escherichia coli se obtuvieron del cepario del CIGB. El vector pINFUSE se suministró por InvivoGen, EE.UU. La enzima KOD Hot Start Master Mix se adquirió de Novagen, EE.UU. y las enzimas T4 DNA ligasa, fosfatasa alcalina, ApaL\, Not, Nco\, BglW, EcoR\, Afl\\ y Xba\ y Taq polimerasa Master Mix se suministraron por Promega, EE.UU. La enzima Platinum POR 2X Master Mix se adquirió a través de ThermoScientific, EE.UU.
El fago filamentoso auxiliador M13K0, la proteína estreptavidina y los anticuerpos anti-Polihistidina desarrollados en ratón, anti-lgG de ratón desarrollado en conejo y anti-lgG1 humano desarrollado en carnero, todos conjugados a la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP, de sus siglas en inglés, horseradish peroxidase), se suministraron por Sigma-Aldhch, EE.UU. El anticuerpo anti-M13 (dirigido contra la proteína PVIII del fago) conjugado a HRP se adquirió de GE Healthcare, EE.UU. El mAb 9E10 (dirigido contra el péptido c-myc) y la proteína A conjugados a la enzima HRP se suministraron por el CIGB, Sancti-Spiritus (Cuba).
La proteína recombinante bFGF humano, y los receptores tipo 1 y 2 del VEGF fusionados a la Fe de una lgG1 humana (Flt1 -Fe y KDR-Fc) se obtuvieron de Sigma, EE.UU. El bFGF de ratón y el receptor tipo 1 del bFGF se suministraron por SinoBiological, EE.UU. La proteína CHO-VEGF se obtuvo en el sobrenadante de células de ovario de hamster chino (CHO), transformadas para la secreción del VEGF 121 humano. Esta se purificó mediante afinidad a iones metálicos, según lo descrito (Sanchez Ramirez, et al., Journal of immunoassay & immunochemistry, 2016: 37: 636-58). Las proteínas GST-hVEGF y GST-mVEGF se produjeron en E.coli y se purificaron mediante afinidad a glutatión, según los procedimientos descritos (Morera, et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006: 44: 45-53). El fragmento de anticuerpo tipo scFv CIGB-166a (Lamdan, et al., Journal of Biotechnology, 2011 : 151 : 166-74) y la proteína recombinante VEGFKDR- (Gavilondo, et al., Vaccine, 2014: 32: 2241 -50) se obtuvieron del Departamento de Desarrollo Tecnológico del CIGB, La Habana (Cuba). Las vahantes biotiniladas del anticuerpo Bevacizumab y del scFv CIGB166a, nombradas Bevacizumab-biot y CIGB166a-biot, se prepararon en el laboratorio, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Selección de fagos con capacidad de unión a VEGF o bFGF
La selección de los fagos portadores de los VHH a partir de las bibliotecas se dirigió contra dos antígenos: el factor de crecimiento del endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y se llevó a cabo según lo descrito (Lamdan et al., 2011 ). Brevemente, se utilizó una concentración de 10 pg/mL en el caso del GST-hVEGF, y de 5 pg/mL para el bFGF. Para garantizar la selección de clones con mayor afinidad se redujo la concentración en el recubrimiento en un 50% entre cada ciclo. En el caso del VEGF se adicionó GST libre (Morera, et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006: 44: 45-53) a la mezcla de fagos, a una concentración de 1 mg/mL, a fin de aumentar la especificidad durante el proceso de selección. La rigurosidad de la selección se elevó con un incremento en el número de lavados, y el tiempo del mismo en cada ronda de selección con PBS-0,1% Tween (PBST) (hasta 20 lavados por 4 horas). Se seleccionaron de 20 a 40 clones al azar de las rondas 2 y 3, y se evaluó su inmunorreactividad frente al antígeno, mediante un ELISA sobre fagos que se describe brevemente a continuación. El ADN plasmídico de 10-20 clones positivos de cada biblioteca por antígeno se aisló y secuenció (Microsith, Alemania).
ELISA de fagos:
En el caso del VEGF, se recubrieron placas de micro-titulación (Costar, EE.UU.) con GST-hVEGF (10 pg/mL), mientras que para el bFGF se usó una solución a 5 pg/mL. Se utilizaron como controles negativos los recubrimientos con los antígenos no relacionados albúmina de suero bovino (BSA) y glutatión S transferasa (GST) a 10 pg/mL. Las mezclas de fagos diluidas entre 1 :10 y 1 :1000 se incubaron sobre las placas durante 1 h a 25SC. Los fagos unidos se detectaron con una solución que contenía el anticuerpo anti-M13 conjugado a HRP. La actividad de la enzima peroxidasa se detectó con solución sustrato y se determinaron los valores de absorbencia a 492 nm en un lector de placas de microtitulación (BMG, Clahostar, Alemania). Se consideraron positivas aquellas mezclas de fagos que produjeron un valor de absorbencia para el antígeno blanco dos veces superior al valor contra los antígenos no relacionados BSA y GST.
Tamizaje de clones, producción y caracterización de fagos
Los fagos portadores de VHHS se produjeron a partir de colonias aisladas, después de la infección de bacterias de la cepa TG1 de E. col! con los fagos seleccionados del segundo y tercer ciclo de selección, en placas de cultivo celular de 96 pocilios, según el procedimiento descrito (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991 : 222: 581 -97). La inmunorreactividad de los VHHS sobre fagos contenidos en el sobrenadante de cada pozo se evaluó mediante un ELISA sobre fago.
Los fagos filamentosos portadores de V HS que presentaron un mayor reconocimiento por los antígenos se produjeron y purificaron por precipitación con polietilenglicol a una escala de 50 mL, según el procedimiento descrito (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991 : 222: 581 -97). Para determinar la concentración de fagos en las preparaciones resultantes, se infectaron bacterias de la cepa TG1 de E. cell en fase exponencial del crecimiento con las preparaciones de fagos, y se sembraron en placas con medio de cultivo sólido 2xYTA con glucosa al 2% (v/v). Se cultivaron durante 16 h a 37SC. La concentración de fagos en las preparaciones (unidades formadoras de colonias (ufc)/mL) se determinó por conteo de colonias. Las preparaciones de fagos, a una concentración de 1011 ufc/mL, se utilizaron para la evaluación por ELISA sobre fago.
Condiciones de fermentación y purificación de los fragmentos VHH y sus construcciones bivalentes y biespecíficas
Una colonia representativa de cada construcción plasmídica se creció en medio líquido LBK (8 g/L de thptona, 5 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de NaCI, kanamicina 50 pg/mL, pH 7, 0-7,5) y, al alcanzar una absorbencia de 0,8 a 600 nm, se indujo por 19 h tras la adición de 1 mM isopropil-[3-D-t¡ogalactop¡ranós¡do (IPTG, Sigma) al medio de cultivo. El cultivo se centrifugó a 4500 rpm durante 15 min. Del sedimento celular se obtuvo la fracción peri-plasmática por choque osmótico, después de una incubación con tampón TES (Ths-HCI 200 mM, EDTA 1 mM, Sacarosa 500 mM, pH 8) en una relación 1 :20 (g:mL) durante 16 h a 4SC. El sobrenadante del cultivo o el extracto del pehplasma se diluyó en tampón de acoplamiento (NaH2PO4 50mM, NaCI 300mM, pH 7,8 o tampón fosfato 1X), a una relación 1 :2, antes de comenzar el proceso de purificación. Los fragmentos de anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad a metales o cromatografía de afinidad a proteína A, utilizando el sistema automático AKTAPure y las columnas pre-empacadas HisTrap FF 5mL o HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare, EE.UU.), respectivamente, de acuerdo a las orientaciones del fabricante. Después de un cambio de tampón a PBS 1x se cuantificaron las proteínas presentes mediante Micro Coomassie (BIORAD, EE.UU.).
ELISA de reconocimiento de los VHH por su antígeno blanco
Las placas de 96 pozos se recubrieron con 100 pL/pozo de una solución de GST- hVEGF121 , GST-mVEGF120 o GST a una concentración de 20 pg/mL, o de una solución de VEGFKDR- a una concentración de 10 pg/mL, o hFGF-2 o mFGF-2 a una concentración de 5 pg/mL en PBS 1X durante 16 horas a 4°C. Después de bloqueadas las placas con PBS-leche descremada al 5% durante una hora se añadió una curva de diluciones seriadas 1 :2 de los VHH purificados, comenzando a partir de 2 pg/mL en PBS-leche descremada al 0,5%. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C y luego de varios lavados se añadió el anticuerpo monoclonal 9E10, específico para c-myc. Después de una hora de incubación a 25°C las placas se lavaron abundantemente. La unión del fragmento al antígeno en la fase sólida se reveló como correlato de la actividad enzimática de la peroxidasa utilizando 100 pL/pozo de TMB. La reacción se detuvo con 50 pL/pozo de solución de parada, y se determinaron los valores de absorbencia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación.
Determinación de la constante de afinidad
La determinación de la constante de afinidad (Kaff) de los fragmentos de anticuerpos se realizó mediante el método descrito por Beatty y colaboradores (Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. J Immunol Methods. 1987 Jun 26;100(1 -2):173-9), para lo cual se utilizó una variación del ensayo tipo ELISA de reconocimiento antigénico descrito anteriormente. En este caso, se utilizaron dos concentraciones para cada antígeno de interés en el recubrimiento (7,5 pg/mL y 2,5 pg/ml para el GST-hVEGF; y 5 pg/ml y 2,5 pg/ml para el bFGF). La Kaff se calculó utilizando la fórmula:
Kaff= (N-1 ) / 2 (N [Nb’] - [Nb])
Donde N = [Ag] / [Ag’], [Ag] y [Ag’] corresponden a la máxima y mínima concentración de antígeno en el recubrimiento, y [Nb] y [Nb’] corresponden a la concentración de VHH a la cual se alcanza el 50% del reconocimiento para el recubrimiento [Ag] y [Ag’], respectivamente. ELISA de competencia entre una forma soluble del receptor y el ligando
La capacidad de los V H de competir con los receptores por la unión a su ligando se evaluó mediante ELISA, para lo cual se recubrieron placas de 96 pozos (NUNC, EE.UU.) con GST-hVEGF o bFGF y se bloquearon como se describió en la sección anterior. Se añadieron diluciones seriadas 1 :2 de los VHHS purificados, desde 7500 nM hasta 46,8 nM, y las placas se incubaron durante 1 h a 37SC. En este paso se dejaron algunos pocilios donde solo se añadió PBS-leche. Seguidamente, se adicionaron Fc-VEGFR2, Fc-VEGFR1 o Fc-FGFR1 , diluidos en PBS-leche a una concentración final de 6,25 ng/mL, 50 ng/mL y 100 ng/mL, respectivamente. Después de 45 min de incubación a 37SC, las placas se lavaron con PBS-Tween 0,05%. Para detectar la unión de los receptores se adicionó el anticuerpo anti-lgG humana conjugado a HRP, diluido 1 :5000 en PBS-leche 0,5%. Después de una incubación durante 1 h a 37°C, las placas se lavaron con PBS-Tween, y se adicionó TMB. La reacción se detuvo después de 10 min. Los pocilios incubados con los receptores sin la adición de los fragmentos de anticuerpo se tomaron como referencia de la unión máxima en ausencia de competidor. En este ensayo, para el caso de la inhibición del eje VEGF/VEGFR, se utilizó como control positivo el fragmento de anticuerpo CIGB166a, y para el eje FGF/FGFR se utilizó el anticuerpo policlonal anti-FGF. El porciento de inhibición de la unión del receptor a su ligando se calculó de la siguiente forma:
% de inhibición = 100 - (Absorbencia 450) / (Absorbencia Umáx) * 100
Análisis de concentración tisular y sérica de citocinas y factores de crecimiento
Se procedió a lisar y recuperar las proteínas asociadas a los tejidos tumorales y metastásicos en tubos M (Miltenyi) y solución RIPA (SIGMA), mediante el uso de un OctoMacs Dissociator, de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Miltenyi, Alemania). Los lisados se centrifugaron para eliminar el debris y la concentración de proteínas se evaluó mediante BCA (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). La concentración de VHH se evaluó mediante un ELISA, de la forma que ya se describió. A fin de evaluar la concentración de factores proangiogénicos, tanto en el lisado como en el suero de los animales, se utilizó el juego de reactivos MAGPMAG- 24K (Millipore, EE.UU.), y los valores se normalizaron en el caso de los tejidos a la concentración proteica previamente determinada para el extracto. En el caso de los tumores humanos implantados en ratones desnudos nu/nu se cuantificó, además, el VEGF humano según las instrucciones de R&D para el juego de reactivos DV001 (R&D, Alemania).
Ejemplo 2. Construcción de la biblioteca sintética humanizada aleatorizada en el CDR3.
Para la biblioteca sintética de VHH humanizada se seleccionó como molde la secuencia de ácidos nucleicos del VHH h-NbBCII10, descrita por Conrath y colaboradores (Conrath, et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2001 : 45: 2807-12). Se incorporaron 13 mutaciones, a fin de humanizar el polipéptido V H sin afectar la capacidad de reconocimiento antigénico, y sin alterar las propiedades físico-químicas de los polipéptidos en términos de solubilidad y estabilidad (Vincke, et al., Journal of Biological Chemistry, 2009: 284: 3273-84). La secuencia deseada se introdujo en el Software en línea DNAWorks (http://helixweb.nih.qov/dnaworks (Hoover, D. y Lubkowski, J., 2002), y se obtuvo un juego de 18 oligonucléotidos optimizando el usaje de codones para bacteria, a fin de sintetizar el molde seleccionado mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de solapamiento. A fin de introducir variabilidad en el CDR3, se diseñó un oligonucleótido mutagénico que incluye fragmentos de las regiones marco FR3 y FR4, respetando la longitud de 18 aminoácidos para el CDR3 (SEQ ID NO: 1 ). Los codones se formaron de acuerdo a la secuencia NNK (donde N es una mezcla equimolar de A, G, C, y T, y K es una mezcla equimolar de G y T). A los oligonucléotidos de los extremos se adicionaron los sitios de restricción necesarios para realizar las digestiones ApaL\/Noti (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3) e incorporar el ADN con el CDR3 aleatorizado al vector fagomidio pHG-1 m.
Para la construcción de la librería sintética, que incluye diversificaciones solo del CDR3, se utilizó el protocolo descrito por Kunkel (Kunkel, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985: 82: 488-92), con algunas modificaciones, según describen Cabanillas-Bernal y colaboradores (Cabanillas-Bernal, et al., PLoS One, 2019: 14: e0213394). La talla de la biblioteca se determinó mediante el conteo de la cantidad total de colonias obtenidas después de la electroporación, para esto se realizaron diluciones señadas comprendidas entre 10'2 hasta 10'10. Se determinó la presencia y el tamaño de los insertos en una muestra de 12 colonias, mediante PCR, con oligonucléotidos que hibridan en secuencias del vector pHG-1 m que flanquean los genes de los VHH clonados. Se estimó una talla de 1 ,6*1012 ufc/mL para la biblioteca y una talla final de 9,3*1011 ufc/mL, después de ajustar a la diversidad del 58,3% detectada (7 de 12 clones con secuencias diferentes del molde).
Ejemplo 3. Selección de fagos portadores de VHHS específicos a partir de la Biblioteca Universal CDR3 contra diferentes antígenos.
Se utilizaron dos antígenos para la selección de las bibliotecas: el VEGF y el bFGF. La selección de fagos se llevó a cabo según se describe en el Ejemplo 1. Se observó un enriquecimiento de significación en el reconocimiento de los antígenos contra los que se realizó la selección, sobre todo con los ciclos 2 y 3 de las mismas. Se produjeron fagos portadores de VHH, a partir de colonias aisladas después de la infección de bacterias de la cepa TG1 de E.coli con los fagos seleccionados del tercer ciclo de selección, según el procedimiento descrito (Marks, et al., Journal of Molecular Biology, 1991 : 222: 581 -97). La inmunorreactividad de los VHH expresados en los fagos contenidos en el sobrenadante de cada pozo se evaluó mediante un ELISA de fago específico para VEGF y bFGF, como se describió anteriormente. Se identificaron así 20 y 25 clones productores de VHH positivos, respectivamente, con al menos 4 veces la densidad óptica del control negativo (sobre GST o BSA), los cuales se secuenciaron a fin de evaluar la diversidad (Macrogen, Corea).
Producción y caracterización de fagos portadores de los VHH.
A partir de los clones positivos, se produjeron y purificaron los fagos filamentosos portadores de V H a una escala de 50 mL, según el procedimiento descrito (Marks, et al., Journal of molecular biology, 1991 : 222: 581 -97). Los mismos se usaron a una concentración de 1011 ufc/mL para la evaluación, mediante ELISA, del perfil de inmunorreactividad. Se identificaron así 12 y 18 clones productores de VHH positivos, respectivamente, con al menos 4 veces la DO del control negativo (sobre GST o BSA). Se continuó el estudio con los clones de fagos que presentaban mayor inmunorreactividad ante el antígeno blanco [Clon pHG-1 m_Nb-E7 para el VEGF y Clon pHG-1 m _Nb-A5 para el bFGF],
Obtención y caracterización de los VHH Nb-E7 y Nb-A5.
Las secuencias codificantes para los polipéptidos Nb-E7 (SEQ ID NO: 4) y Nb-A5 (SEO ID NO: 5) se amplificaron mediante una reacción de PCR, a partir del ADN purificado de los dos clones de fagos seleccionados (pHG-1 m _Nb-E7 y pHG-1 m _Nb-A5) con los oligonucleótidos SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Los productos de la PCR se purificaron con el juego de reactivos QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Alemania) y se digirieron Ncol/Notl. El vector pACR1 -K se digirió con las mismas enzimas, y se ligó con las bandas predigehdas empleando la enzima T4 DNA ligasa. El producto de la reacción se transformó en células BL21 DE3 quimiocompetentes. Se utilizó una colonia representativa de cada construcción para expresar las proteínas, según se describió en el Ejemplo 1 . La presencia de los fragmentos V H en la fracción pehplasmática se evaluó por SDS-PAGE al 15%. El resultado indicó la expresión de una proteína de peso molecular aparente entre 20- 15 kDa (cuando se compara con el patrón de peso molecular), que representa un 32% de las proteínas totales. La identidad e integridad del carboxilo terminal se comprobó mediante un Western Blot anti-polihistidina (Sigma, EE.UU.).
La purificación de los V H se realizó mediante afinidad a iones metálicos como se detalló en el Ejemplo 1 , siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare, EE.UU.). Como resultado del proceso, se obtuvieron los V H denominados Nb-E7 y Nb-A5 con una pureza superior al 95%. El cálculo de afinidad para ambos polipéptidos indicó valores entre 10'6 y 10’7 M, los cuales se consideran bajos para este tipo de polipéptidos, por lo que se procedió a madurar la afinidad mediante aleatohzación de los CDR1 y CDR2.
Ejemplo 4. Construcción de las bibliotecas de maduración de la afinidad.
En la construcción de las bibliotecas sintéticas, para la maduración de la afinidad, se tomó como molde el ADN plasmídico purificado a partir de los clones pHG-1 m _Nb- E7 (SEQ ID NO: 4), que reconoce al VEGF humano; y pHG-1 m _Nb-A5 (SEQ ID NO: 5), que reconoce el bFGF.
Los segmentos de ADN que codifican para los fragmentos de anticuerpo aleatohzados en el CDR3 se amplificaron mediante una PCR de dos pasos con la enzima KOD DNA polimerasa (Millipore, EE.UU.). Se procedió a la mutagénesis aleatoria del CDR1 en la reacción A, usando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 8, y del CDR2 en la reacción B con los oligonucleótidos SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9. Las bandas productos de estas amplificaciones (A: 150 pb y B: 270 pb) se mezclaron 1 :1 (10 ng de cada una), y se tomaron como molde para la segunda reacción en la que se amplificaron bandas de 400 pb, para cada uno de los ADN parentales, utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Estas bandas se clonaron después de digerirse ApaL\ y Not\ en el vector pHG-1 m, previamente digerido con las mismas enzimas, y los productos se transformaron mediante electroporación en la cepa TG1 en medio sólido 2xYTA con glucosa al 2%. Las colonias se barrieron con medio de cultivo líquido 2xYT, después de 24-26 h de crecimiento, para formar la sub-biblioteca de maduración, y se conservaron a -70sC en presencia de glicerol al 20%, como fuente para la producción de fagos filamentosos portadores de fragmentos de anticuerpo.
La talla de las sub-bibliotecas se determinó según se describió en el Ejemplo 2. Se estimó una talla de 7,5*1012 ufc/mL para la sub-biblioteca mutada del Nb-E7, y una talla de 3*1012 ufc/mL para la sub-biblioteca mutada del Nb-A5.
La selección, producción, obtención y caracterización de fagos que expresan VHH con reconocimiento incrementado de los antígenos de interés se llevó a cabo según se describe en el Ejemplo 3. Al igual que para la biblioteca universal, se observó un enriquecimiento de fagos portadores de V H específicos por los antígenos después del segundo y tercer ciclo de selección. Al analizar los clones independientes del tercer ciclo de selección, para cada antígeno, se detectaron numerosos clones positivos. Los estudios se continuaron con los clones de fagos que presentaban mayor inmunorreactividad ante el antígeno blanco [Clon pHG-1 m _Nb-V1 para el VEGF y Clon pHG-1 m _Nb-F3 para el bFGF], cuyas secuencias de ácidos nucleicos se corresponden con las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 , respectivamente.
Ejemplo 5. Expresión en E. coli de los fragmentos VHH, purificación y caracterización del reconocimiento del antígeno específico.
Clonaje y expresión de los fragmentos VHHS Nb-V1 y Nb-F3 en el vector pACR1-K
La inserción de las secuencias de los VHH en el vector pACR1 -K se realizó según lo descrito en el Ejemplo 3. Una colonia representativa de cada construcción se expresó en medio líquido LBK. La presencia de los fragmentos VHH en la fracción periplasmática se evaluó por SDS-PAGE al 15%. Esto reveló la expresión de proteínas de talla molecular aparente de entre 15-20 kDa (cuando se compara con el patrón de peso molecular), que representan un 35% de las proteínas totales. La identidad e integridad del carboxilo terminal se comprobó mediante un Western Blot anti-polihistidina (Sigma, EE.UU.). Los fragmentos se denominaron Nb-V1 y Nb-F3, y sus secuencias de aminoácidos se identificaron como SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente. Los VHH se purificaron mediante afinidad a iones metálicos, según se describe en el Ejemplol , y se obtuvieron rendimientos de 7 mg/L y 25 mg/L al procesar la fracción soluble y periplasmática, respectivamente. Estos rendimientos superan los informados por otros autores que usan estrategias de humanización diferentes, y bibliotecas inmunes (Publicación WO 2003/035694).
Caracterización inmunoquímica de los fragmentos VHH Nb-V1 y Nb-F3 purificados.
Reconocimiento específico del VEGF humano y de ratón.
La principal característica de un anticuerpo y de los fragmentos que se derivan del mismo es su reconocimiento del antígeno, lo que determina su especificidad y afinidad. La unión específica al VEGF se evaluó según se describió en el acápite de ELISAs de reconocimiento para el VEGF (Ejemplo 1 ). Para comparar la capacidad de reconocimiento de los fragmentos VHH denominados Nb-V1 y Nb-E7 por los diferentes VEGF-A se utilizó la EC50 (nM), que representa el valor de concentración del VHH que genera un 50% del reconocimiento. El VHH Nb-V1 mostró una EC50 para el VEGF humano de 4,734 nM, tres veces inferior a la detectada para el Nb-E7 (12,9 nM). Este resultado indicó que el reconocimiento específico del Nb-V1 mejoró respecto al V H Nb-E7, elemento asociable al procedimiento de aleatohzación empleado para los CDR1 y 2 durante el proceso de maduración de la afinidad. Los resultados evidenciaron, además, que a diferencia de otros polipéptidos en desarrollo como el Bevacizumab y el CIGB-166a, el Nb-V1 reconoce el factor de crecimiento de ratón con una EC50 de 4,075 nM. El Nb-V1 también reconoció en el sistema ELISA a una variante mutada del VEGF121 donde, en el denominado lazo de los 80, se sustituyen los aminoácidos R82, K84 y H86 por E82, E84 y E86. Esta propiedad la comparte con el CIGB166a, pero lo diferencia del Bevacizumab. Adicionalmente, el VHH Nb-V1 no reconoció a otros antígenos (GST, bFGF) en un formato de ELISA similar, lo que demuestra su especificidad por el antígeno.
ELISA de competencia entre una forma soluble del receptor 1 y 2 del VEGF (Fc- VEGFR1 y Fc-VEGFR2, respectivamente) y el Nb-V1 .
El efecto biológico del VEGF es una consecuencia de la unión del mismo a dos receptores fundamentales (VEGFR1 y VEGFR2), por lo que para que un polipéptido que se une al VEGF sea efectivo, en el ámbito terapéutico, debe bloquear estas interacciones (Shibuya, Cell Structure and Function, 2001 : 26: 25-35). La capacidad del Nb-V1 para competir con los receptores 1 y 2 por la unión a su ligando (VEGF) se evaluó mediante un ELISA de competencia por el ligando en fase sólida, como se describió anteriormente. Los resultados de este ensayo mostraron una inhibición dosis-dependiente de la unión del VEGFR2-Fc al VEGF por el VHH Nb-V1 , donde la inhibición del 50% de la señal (IC50) se alcanzó a la concentración de 28,57 nM. En este parámetro también se evidenció una mejora después de la maduración de la afinidad, pues el V H Nb-E7 presentó una IC50 cuatro veces superior, en un estudio similar.
A diferencia de lo informado para el Bevacizumab y el CIGB166a, el VHH denominado Nb-V1 no mostró una inhibición dosis-dependiente en el caso de la interacción VEGFR1/VEGF. Solo se ha informado de un anticuerpo con características similares, de unión selectiva al VEGFR2, denominado como Vañsacumab, o r84. Con el uso prolongado del anticuerpo r84 no se observan daños renales, y se ha sugerido que el elemento causal de esta inocuidad es precisamente que no inhibe al VEGFR1 ( Sullivan, et al., PLoS ONE 2010: 5: 7-8). Teniendo en cuenta lo anterior, los VHH desarrollados en esta invención pueden inducir menos efectos adversos que otros fármacos similares en el mercado.
ELISA de competencia entre el VHH Nb-V1 y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos por el VEGF.
El anticuerpo monoclonal Bevacizumab y el scFv CIGB166a reconocen epítopos diferentes dentro del VEGF, y han demostrado su efecto antiangiogénico en diversos modelos experimentales. El desplazamiento de los mismos de su unión al VEGF pudiera ser un indicativo de la potencialidad de los nuevos polipéptidos para mediar los efectos deseados in vivo. La capacidad del VHH anti-VEGF de competir con el anticuerpo Bevacizumab y el fragmento de anticuerpo CIGB166a por la unión a su ligando se evaluó mediante una variación del ELISA de competencia por el ligando en fase sólida según lo descrito. Se recubrieron placas de 96 pozos (NUNC, Alemania) con 1 pg/mL de hVEGF121 , producido en la línea celular CHO. Se añadieron diluciones señadas de los VHH purificados, desde 15000 nM hasta 1200 nM. Seguidamente se adicionó Bevacizumab-biotinilado o CIGB166a- biotinilado, diluidos en solución de bloqueo a una concentración final de 2,3 ng/mL y 14,3 ng/mL, respectivamente. Para detectar la unión de los anticuerpos biotinilados se adicionó streptavidina conjugado a HRP. Los pocilios incubados con Bevacizumab-biotinilado o CIGB166a-biotinilado, sin la adición de los fragmentos de anticuerpo, se tomaron como referencia de la unión máxima en ausencia de competidor. En este ensayo, se utilizó como control positivo el receptor quimera Fe- VEGFR2. El porcentaje de inhibición de la unión del Bevacizumab, el CIGB166a o el VEGFR2 a su ligando se calculó como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 . Los resultados de este ensayo mostraron que el nuevo V H denominado Nb-V1 inhibe, de forma dosis-dependiente, la unión del Bevacizumab y del CIGB166a al VEGF. Se observó una inhibición del 50% de la interacción VEGF/Bevacizumab o CIGB166a a los 930,9 nM y 67,48 nM, respectivamente. Si bien se demostró que el V H Nb-V1 reconoce un epítopo diferente al Bevacizumab, estos resultados indican que pudieran compartir residuos aminoacídicos dentro de la secuencia que reconoce en el VEGF.
Reconocimiento específico de la ¡soforma básica del FGF humano y de ratón.
La unión específica al bFGF se evaluó según se describió en el acápite de ELISAs de reconocimiento para el bFGF (Ejemplo 1 ). Para los polipéptidos Nb-A5 y Nb-F3 se obtuvo que la concentración necesaria para producir un 50% de la unión al bFGF de origen humano es 58,61 nM y 11 ,26 nM, respectivamente. Al igual que en el caso del Nb-V1 , se logró un aumento del reconocimiento en 5 veces, en correspondencia con el proceso de maduración de la afinidad. Este VHH también reconoció en el sistema ELISA al bFGF de ratón, con una EC50 de 11 ,52 nM, que no difiere de manera significativa de la obtenida para el de origen humano, debido a la alta homología entre los polipéptidos de ambas especies. Como en el caso del Nb-V1 , no se observó reconocimiento de las proteínas GST o VEGF, reforzando así las evidencias de la especificidad de la unión del fragmento Nb-F3 a su antígeno.
ELISA de competencia entre una forma soluble del receptor 1 de la ¡soforma básica del hFGF (Fc-FGFR1 ) y el VHH Nb-F3.
Los FGFs median su acción biológica por la unión a los dominios extracelulares de receptores tirosina quinasa denominados FGFR1 -4, presentes en la superficie de las células endoteliales y tumorales. El FGFR1 es el que se encuentra frecuentemente en la superficie de las células endoteliales, y se ha demostrado que su inhibición in vivo reduce significativamente la carga y vasculatura tumoral (Ronca, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2015: 19: 1 -17). La capacidad del VHH Nb-F3 anti- bFGF de competir con el receptor 1 por la unión a su ligando se evaluó mediante un ELISA de competencia por el ligando en fase sólida. Los resultados de este ensayo indicaron una inhibición dosis-dependiente de la unión del Fc-FGFR1 al bFGF por el VHH Nb-F3, donde se observó una IC50 de 134,4 nM. El uso del Nb-A5, como control, resultó en una IC50 5 veces superior, elemento que corrobora la maduración de la afinidad con el procedimiento empleado.
Ejemplo 6. Introducción de modificaciones a los VHH.
Construcción de polipéptidos biespecíficos y bivalentes con los fragmentos VHHS V1 y F3.
Para la construcción de los polipéptidos biespecíficos y bivalentes se realizó una PCR en dos pasos, utilizando la enzima Platinum Hot Start DNA polimerasa (Invitrogen, EE.UU.) y los oligonucleótidos cebadores correspondientes. Los oligonucleótidos se diseñaron para incorporar en la primera PCR la región bisagra de una inmunoglobulina de llama y2C como espaciador entre los dos VHH. En esta región se sustituyeron las cisteínas por alaninas, a fin de evitar la formación de estructuras no deseadas (Hmila, et al., FASEB Journal, 2010: 24: 3479-89). Se emplearon los oligonucleótidos SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 para amplificar el segmento 1 , y los oligonucleótidos SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para amplificar el segmento 2. Los productos de la primera PCR se utilizaron como molde en la segunda PCR, para ensamblar las construcciones biespecíficas y bivalentes. Se utilizó la enzima mencionada anteriormente, y los cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17. Los productos de la PCR se purificaron y digirieron Nco\/Not, de acuerdo a las indicaciones del fabricante. El vector pACR1 -K se digirió con las mismas enzimas, y se ligó con las bandas predigeridas empleando la enzima T4 DNA ligasa (Promega). La secuencia nucleotídica de las construcciones se comprobó mediante secuenciación automática (Microsynth AG, Alemania).
Los polipéptidos biespecíficos Nb-VF3 y Nb-FV1 con secuencias identificadas como SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, y los bivalentes Nb-VV6 y Nb-FF2 con secuencias identificadas como SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 , se expresaron y purificaron como se describió en el Ejemplo 1 . En todos los casos, se comprobó la pureza e identidad de las proteínas por SDS-PAGE 12% y Western Blot anti-polihistidina. En las preparaciones de los cuatro polipéptidos, se identificó una banda con una pureza superior al 95%, que migra entre 30 y 40 kDa, al compararse con el patrón de peso. La masa experimental de los polipéptidos y la disposición de los puentes disulfuro se comprobó por ESI/MS-MS. La masa experimental y teórica para cada polipéptido coincidió, con errores inferiores al 0,0015% en todos los casos, y se comprobó la formación de los puentes intramoleculares entre C22-C101 y C168-C247. El análisis de secuenciación automática de Edman del amino terminal demostró su integridad. La actividad biológica de los polipéptidos se evaluó mediante ELISA de reconocimiento por los antígenos VEGF y bFGF, además de la capacidad de desplazar la unión de los mismos a sus respectivos receptores VEGFR2 y FGFR1. En el caso de los polipéptidos biespecíficos denominados Nb-FV1 y Nb-VF3 se demostró que la EC50 para cada antígeno no varió, cuando se comparó con los VHH parentales Nb-V1 y Nb-F3. De igual forma, se demostró que no se afectó la capacidad de desplazar la unión de los antígenos por sus receptores. Por otro lado, para los polipéptidos bivalentes Nb-VV6 y Nb-FF2 la EC50 para el VEGF y el bFGF disminuyó 2 veces, al compararlas con la obtenida para Nb-V1 y Nb-F3, respectivamente (Tabla 1 ). En concordancia con el aumento en el reconocimiento, se observó una disminución de la KD de los fragmentos calculada según la metodología descrita por Beatty y colaboradores (Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. J Immunol Methods. 1987 Jun 26;100(1 -2):173-9). Este aumento aparente de la afinidad de los polipéptidos bivalentes se atribuye a un aumento de la avidez de los mismos al adicionarse el segundo dominio.
Tabla 1. Concentraciones de VHH que muestran el 50% del reconocimiento antigénico o el 50% de la inhibición de la formación del complejo Antígeno/Receptor en ensayos tipo ELISA.
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Eliminación del péptido trazador c-myc y la cola de histidinas
Para la remoción del péptido trazador c-myc y de la cola de histidinas, se amplificaron las bandas correspondientes a cada VHH, O SUS construcciones biespecíficas o bivalentes, utilizando la enzima Platinum Hot Start DNA polimerasa y el juego de cebadores definidos por las SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 22, que introduce el sitio de restricción de la enzima Bgl\\ hacia el extremo 3' del polipéptido. Los productos de la PCR se purificaron y digirieron Nco\/Bgl\\ (Promega). El vector pACR1 -K se digirió con las mismas enzimas, y se ligó con las bandas pre-digeridas empleando la enzima T4 DNA ligasa. La secuencia de nucleótidos de los V H se comprobó mediante secuenciación automática (Microsynth AG, Alemania). Los polipéptidos, sin la secuencia trazadora c-myc y sin cola de histidina, se denominaron Nb-V1\cmycH6 (SEQ ID NO: 23), Nb-F3\cmycH6 (SEQ ID NO: 24), Nb-VV6\cmycH6 (SEQ ID NO: 25), Nb-FF2\cmycH6 (SEQ ID NO: 26), Nb- FV1\cmycH6 (SEQ ID NO: 27) y Nb-VF3\cmycH6 (SEQ ID NO: 28).
La expresión de estos polipéptidos se realizó como se describió. Para la purificación, se utilizó una cromatografía de afinidad a Proteína A, aprovechando que los fragmentos de anticuerpos V H, según el diseño de la librería sintética, conservan el sitio de unión a la misma (Crauwels M, Van Vaerenbergh N, Kulaya NB et al. New Biotechnology 2020; 57: 20-28). El sobrenadante de cultivo o la extracción del peñplasma se diluyeron en PBS 1X, en una relación 1 :2, antes de aplicarse en la columna pre-empacada HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare). El resto de la purificación se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante. Como resultado de este proceso se obtuvieron polipéptidos con una pureza superior al 95%, que migran entre los 15-20 kDa (para Nb-V1\cmycH6 y Nb-F3\cmycH6) y 30-40 kDa (para Nb-VV6\cmycH6, Nb-FF2\cmycH6, Nb-FV1\cmycH6 y Nb- VF3\cmycH6) cuando se comparan con el patrón de peso molecular en una SDS- PAGE 12%. La correcta remoción de las secuencias trazadoras se demostró mediante Western Blot anti-polihistidina y anti- c-myc, y como control positivo se utilizó Proteína A-HRP. Los análisis de integridad del amino terminal no detectaron degradaciones del mismo. Los resultados de ESI/MS-MS mostraron una correspondencia de la talla teórica y la experimental de los polipéptidos, con un error <0,0019%. Además, demostraron una disposición de los puentes disulfuro similar a la observada para las VHH Nb-V1 , Nb-F3, Nb-VV6, Nb-FF2, Nb-FV1 y Nb-VF3. La actividad biológica de los polipéptidos sin la secuencia trazadora c-myc y sin cola de histidinas se evaluó mediante ELISAs de reconocimiento de los antígenos VEGF y bFGF, y de desplazamiento de la unión a sus respectivos receptores VEGFR2 y FGFR1. En la Tabla 2 se muestran los resultados, expresados como los valores de concentración de los Vi-iHs\cmycH6 necesarios para alcanzar el 50% del reconocimiento antigénico o el 50% de la inhibición de la formación del complejo antígeno/receptor. No se detectaron diferencias, en términos de unión o inhibición, entre las V H que no presentan los péptidos trazadores y sus V H homologas. Tabla 2. Concentración de V Hs\cmycH6 que representan el 50% del reconocimiento antigénico o el 50% de la inhibición de la formación del complejo Antígeno/Receptor en ensayos tipo ELISAs.
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\cmycH6: sin péptido trazador c-myc y sin cola de histidinas Fusión a la región Fe de una inmunoglobulina humana.
La fracción Fe de los anticuerpos media funciones efectoras como la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo y la citotoxicidad dependiente del complemento. Con la finalidad de analizar la potencialidad de los polipéptidos para promover una actividad efectora, los V H Nb-V1 , Nb-F3 y sus construcciones biespecíficas y bivalentes se insertaron en el vector pVSJG-huFc (Publicación WO 2012/089176). Este plasmidio se diseñó para la obtención de las proteínas como polipéptidos de fusión a las regiones Fe de origen humano. Las secuencias oligonucleotídicas de los VHHS se amplificaron, utilizando la enzima Platinum Hot Start DNA Polimerasa y los oligonucleótidos SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para el pVSJG-huFc. Se incorporaron los sitios de restricción de las enzimas Afl\\ y Xba\. Los productos de la PCR purificados se digirieron con estas enzimas, al igual que el vector pVSJG-huFc. Las bandas y los vectores predigeridos se ligaron empleando la enzima T4 DNA ligasa. La secuencia de nucleótidos se comprobó mediante secuenciación automática (Microsynth AG, Alemania), y los nuevos polipéptidos se denominaron Nb-V1_hFc (SEQ ID NO: 31), Nb-F3_hFc (SEQ ID NO: 32), Nb-VV6_hFc (SEQ ID NO: 33), Nb-FF2_hFc (SEQ ID NO: 34), Nb-FV1_hFc (SEQ ID NO: 35), y Nb- VF3_hFc (SEQ ID NO: 36). Las construcciones plasmídicas con las secuencias correctas se transfectaron en células CHO utilizando el reactivo Superfect (Qiagen, Alemania). Después de una selección con el antibiótico G418 (Invitrogen, EE.UU.), se seleccionaron los clones con mayor expresión al sobrenadante, mediante ELISAs de reconocimiento de antígeno similares a los ya descritos, donde solo cambió el conjugado de detección para anti-lgG humano conjugado a peroxidasa.
Para la purificación se utilizó una cromatografía de afinidad a Proteína A. Como resultado, se obtuvieron polipéptidos con una pureza superior al 95% y con una talla aparente entre los 40-60 kDa, cuando se comparan con el patrón de peso (Invitrogen, EE.UU.), en una SDS-PAGE al 12%. La identidad de las mismas se comprobó mediante ELISA. Los análisis de integridad del amino terminal no detectaron degradaciones del mismo, y los resultados de ESI/MS-MS determinaron una coincidencia entre la masa experimental y teórica para cada polipéptido, con errores inferiores al 0,0012% en todos los casos. La actividad biológica de los polipéptidos fusionados a la región hFc se evaluó mediante ELISAs de reconocimiento de los antígenos VEGF y bFGF, y de desplazamiento de la unión de los mismos a sus respectivos receptores VEGFR2 y FGFR1 . La Tabla 3 muestra los resultados de estos estudios, expresados como valores de concentración de VHHS IFC que representan el 50% del reconocimiento antigénico, o el 50% de la inhibición de la formación del complejo Antígeno/Receptor en ensayos tipo ELISA. En este caso, se observó una disminución entre 2 y 4 veces de las EC50 de los polipéptidos de fusión comparado con las V H homologas. Este aumento del reconocimiento corresponde con el aumento de la valencia pues, al igual que un anticuerpo monoclonal, estos polipéptidos se organizan como homodímeros. se detectó una disminución de la IC50 para la interacción antígeno/receptor, de igual magnitud al aumento del reconocimiento antigénico.
Tabla 3. Concentración de VHHS IFC que representa el 50% del reconocimiento antigénico o el 50% de la inhibición de la formación del complejo Antígeno/Receptor en ensayos ELISAs.
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Ejemplo 7. Estudios de estabilidad térmica de los VHH.
Los V H son conocidos por ser resistentes a altas temperaturas, a diferencia de otros fragmentos de anticuerpos como Fab o scFv. Para determinar la resistencia de los VHH Nb-V1 , Nb-VV6, Nb-F3, y Nb-FV1 a diferentes temperaturas se condujo un estudio donde se incubaron 13 pg de cada fragmento a 4, 37, 50 y 75SC. La inmunorreactividad de los mismos se evaluó mediante ELISA, después de dos horas de incubación, y se tomó como máximo reconocimiento el obtenido para la condición de incubación a 4SC. En este ensayo se utilizó como control el fragmento scFv CIGB-166a. En la Tabla 4 se muestra la capacidad de reconocimiento de los diferentes fragmentos por los antígenos VEGF o bFGF, en términos del porcentaje de la actividad recuperada, tomando como referencia el valor obtenido para la proteína almacenada a -20sC en cada caso. Se observó que el reconocimiento específico del VEGF por los VHHS Nb-V1 , Nb-VV6, y Nb-FV1 se mantuvo cerca del 70%, aún después de incubarse por dos horas a 75SC. Este comportamiento no se observó para el scFv CIGB-166a, el cual perdió el reconocimiento del antígeno. La misma resistencia al incremento de la temperatura, pero en términos de reconocimiento del bFGF, se detectó para los Nb-F3, Nb-FF2 y Nb-FV1 .
Tabla 4. Reconocimiento antigénico de los VHH Nb-V1 y Nb-F3 luego de someterse a un estrés térmico.
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Ejemplo 8. Estudio ex vivo de la solubilidad de los fragmentos VHH en diferentes tampones y en el humor vitreo de conejos Chinchilla.
Teniendo en cuenta la importancia clínica que tiene que los anticuerpos que se administren por vía intravítrea o sistémica no formen agregados, se realizó un estudio preliminar de estabilidad en diferentes tampones. Se probaron seis tampones. Tres de ellos están aprobados para la administración intravítrea (Giannos, etal., Pharmaceutical Research, 2018: 1 -15): i. Formulación de almacenamiento del fármaco Ranibizumab (B. Lucentis): 100 mg/mL de a(+)Trehalosa, Tween 20 al 0,01 % y 1 ,98 mg/mL de L- Histidina pH 5,5.
¡i. Formulación A: a (+) Trehalosa al 10 %, Tampón Fosfato 100 mM, L-Arginina 10 mM, NaCI al 0,3% y Tween 80 al 0,04%, pH 6,78. iii. Formulación B: a (+) Trehalosa al 7,5 %, Tampón Fosfato 100 mM, L-Arginina 10 mM, NaCI al 0,3% y Tween 80 al 0,04%, pH 6,78.
Otros tres son tampones para los que se espera una buena estabilidad de los VHH (Muyldermans, Annual Review of Biochemistry, 2013: 82: 17.1— .23 ): iv. PBS 1X, pH 7,2 v. Tris 200 mM, pH 8,0 vi. Tris 50 mM, pH 8,0
Los VHH se concentraron hasta un máximo de 28 mg/mL, y posteriormente se ajustaron a una concentración de 5 mg/mL. Los VHH se diluyeron en los diferentes tampones hasta una concentración de 100 y 200 pg/mL y se incubaron a 4SC por cinco días. Concluido este período, se determinó la inmunorreactividad de los mismos. Se utilizó como control el fragmento scFv CIGB-166a. Se recuperó el 100% de la actividad, para todos los polipéptidos en estudio, en los seis tampones, mientras para el scFv CIGB-166a se observó una recuperación del 100% solo para el tampón del Ranibizumab, y pérdidas superiores al 20% para el resto de las condiciones experimentales.
La solubilidad de los fragmentos VHH en humor vitreo se evaluó en un modelo ex vivo, considerando que las dosis a emplear en el tratamiento de las afecciones de la mácula y la córnea oscilan entre 0,5 y 2 mg para una concentración final en el vitreo entre 0,125 y 0,5 mg/mL (Giannos, et al., Pharmaceutical Research, 2018: 1 -15). El estudio cinético a 37SC no indicó la presencia de fenómenos de precipitación a la inspección al microscopio óptico (400X). El análisis del sobrenadante, después de una centrifugación a 6000 rpm, evidenció que no hubo pérdidas de la actividad biológica en términos de reconocimiento de los ligandos (recuperación del 95-100% de la actividad para todos los V H en comparación con los polipéptidos en tampón fosfato, el cual se tomó como máximo reconocimiento). En este ensayo se utilizaron como controles el Bevacizumab (Bev) y el fragmento scFv CIGB-166a. Se recuperó el 100% de la actividad para todos los polipéptidos en estudio, excepto para el scFv CIGB-166a, para el que se observó una pérdida del 50% de la actividad, atribuidle a las precipitaciones.
Ejemplo 9. Evaluación del efecto de la adición de los diferentes polipéptidos a sistemas in vitro I ex vivo.
Se analizó el impacto de la adición de los polipéptidos en diluciones seriadas en condiciones previamente establecidas que inducen la proliferación celular, la formación de redes tubulares y la migración en más de dos veces, y que son dependientes de la interacción VEGF/VEGFR2 o bFGF/FGFR1 .
Estudios de proliferación en células endoteliales:
Brevemente, se sembraron 6000 células HDMEC por pozo en 100 pL de medio MCDB131 (SIGMA) suplementado con 10% de suero, en placas de 96 pozos (COSTAR). Después de 12 horas, se eliminó el suero del medio de cultivo mediante un lavado y se adicionaron 100 pL de medio MCDB131 por 24 horas. La adición de VEGF (5 ng/mL), bFGF (10 ng/mL), o VEGF/bFGF (2,5 ng/mL y 5 ng/mL respectivamente) indujo una proliferación celular significativa a las 72 horas de cultivo. Los V H se adicionaron en concentraciones finales entre 300 y 0,5 nM a los activadores de proliferación en medio MCDB131 , por una hora a 37°C, y se adicionaron a las células para un volumen final de 200 pL. La proliferación celular se calculó a partir del metabolismo del Alamar Blue adicionado al cultivo. Se observó una reducción del 50% de la proliferación, para las concentraciones que se muestran en la Tabla 5 (IC50):
Tabla 5. Resumen de concentraciones de los VHH que inhiben la proliferación de células endoteliales en un 50% (IC50).
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La adición de Nb-V1 , Nb-VV6, Nb-F3, Nb-FF2, Nb-FV1 y Nb-VF3 resultó en una reducción de la proliferación dependiente de VEGF o bFGF de la línea de endotelio microvascular HDMEC. Se evidenció la cooperación aditiva entre el uso como blanco de ambos sistemas, al utilizar los dos estímulos. Estos análisis se replicaron con células endoteliales de ratón inmortalizadas (H5V) y con células endoteliales primarias (HUVEC) y se obtuvieron resultados similares.
Estudios de la proliferación de células fibroblastoides inmortalizadas 3T3A31 y NIH3T3 y de las células tumorales A549 y B16F10:
En este caso, las células 3T3A31 y NIH3T3 se sembraron a una densidad de 6000 células por pozo en 100pL de medio DMEM, suplementado con 10% de SFB, mientras que las células A549 y B16F10 se utilizaron a 2000 células por pozo. La activación con VEGF se usó como un control negativo. El ensayo se desarrolló de manera diferencial, en términos de concentraciones de bFGF que generan una proliferación máxima (100 ng/mL para 3T3A31 y NIH3T3, y 20 ng/mL para las A549 y B16F10). Se observó una reducción significativa de la proliferación en respuesta al bFGF, para las condiciones experimentales que incluyeron polipéptidos con especificidad para este factor de crecimiento, y las dosis para la inhibición del 50% de la proliferación se detallan en la Tabla 6.
Tabla 6. Concentración de los VHH que inhiben la proliferación de células fibroblastoides y epiteliales en un 50% (IC50).
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Estudios de formación de redes endoteliales:
Para estas evaluaciones se utilizaron las células HDMEC sembradas en matriz tridimensional de Matrigel (Montesano, R., Pepper, M.S., 1998. En: Little, C.D., Mironov, V., Sage, E.H. (Eds.), Vascular Morphogenesis: In vivo, In vitro, In mente. Birkhauser, Boston, pp. 79-110.). Se adicionaron 2,5 pL de MATRIGEL por pozo (SIGMA, EE.UU.) a 4°C en placas Terasaki, y el mismo se solidificó al cambiar la temperatura a 37°C. Se adicionaron sobre el gel 10 pL de células HDMEC marcadas con CFSE, a razón de 2000 células por pozo en medio MCDB131 , y a estas se adicionaron 10 pl de los tratamientos que se muestran en la Tabla 7.
Los resultados se evaluaron a las 6 y a las 24 horas, y se cuantificaron a partir de las imágenes obtenidas con contraste de fase, en un microscopio invertido de fluorescencia (Olympus, Japón). La cuantificación se realizó según procedimientos ya descritos, utilizando el programa ImageJ ((http://rsb.info.nih.gov/ij; NIH, Bethesda, MD, EE.UU.), (D. Guidolin Microvascular Research 67 (2004) 117-124). La Tabla 7 muestra un promedio de los nodos detectados por campo visual (100X), en respuesta a una concentración fija de 10 pg/mL de los V H en presencia de 2,5% de suero, 100 ng/mL de VEGF o 10 ng/mL de bFGF.
Tabla 7. Promedio de nodos observados en cinco campos por réplica experimental para cada tratamiento.
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Ejemplo 10. Estudios in vivo en conejos Chinchilla.
Como ya se ha discutido uno de los usos potenciales de los VHHS objeto de la invención es el uso en el tratamiento de afecciones vasculares de la mácula. Con el objetivo de analizar la factibilidad del uso de algunos de ellos en el tratamiento de la hipervascularización dependiente de los factores de crecimiento VEGF y bFGF, se utilizaron conejos Chinchilla, de acuerdo a lo descrito por Morera y col (Morera, et al., Exp Eye Res, 2014: 122: 102-9). Se utilizaron para inducir el daño vascular inyecciones únicas de 2,5 pg VEGF o bFGF en 50 pL, las cuales evidenciaron ser suficientes para inducir un patrón de vascularización aberrante a los 10 días. A las 72 horas de la inyección se administraron con los VHHS Nb-V1 , Nb-F3, Nb-VV6 y Nb-FV1 , también mediante inyección única intravítrea de 100pg en cada caso, en 50 pL de solución salina. Se realizaron exámenes en el microscopio quirúrgico, fotografía en color de fondo de ojo y angiografía fluoresceínica (AF) una semana antes de la primera inyección intravítrea de los factores proangiogénicos, y diez días después de la misma. En todos los casos se anestesió a los conejos y se dilataron las pupilas según se ha descrito. Se tomaron al menos cinco fotografías en cada ojo: disco óptico, ala medular temporal, ala medular nasal, retina superior por encima del disco, y retina inferior por debajo del disco. Se colocó una vía intravenosa en la vena marginal de la oreja, y se inyectaron 0,2 mL de fluoresceína al 10%. Se tomaron fotografías secuenciales del fondo de ojo inmediatamente después de la inyección de fluoresceína. Se tomaron fotografías tardías después de 10 minutos de iniciar el experimento. En casos seleccionados, también se tomaron fotografías del segmento anterior. Las imágenes se procesaron con el software Heidelberg Eye Explorer.
La inyección de VEGF y/o bFGF humano en el vitreo del ojo derecho generó neovasculahzación retiniana en diez días, asociada con hiperemia discal, dilatación vascular y tortuosidad, y fuga de fluoresceína en el disco óptico, alas medulares y cámara anterior (CA). Se utilizó como control el ojo izquierdo en el que solo se inyectaron las preparaciones de V H en ausencia de VEGF y/o bFGF y las imágenes correspondientes al inicio del tratamiento.
Las evaluaciones semicuantitativas de estos efectos se muestran en la Tabla 8, para cada animal y tratamiento en comparación con el momento inicial y con el ojo que no recibió estímulo proangiogénico y si los VHHS. LOS efectos inducidos por el VEGF o el bFGF se resumen en una alta pérdida vascular, que desaparece en los animales tratados con una sola dosis de los V H específicos, los cuales no presentaron ninguna fuga en el disco óptico ni en la cámara anterior. Los vasos retiñíanos se volvieron menos dilatados y tortuosos, y los capilares retiñíanos disminuyeron, en comparación con los animales del grupo control para todos los casos. El análisis de los ojos tratados solo con los V H indicó la inocuidad del tratamiento, al no observarse fenómenos inflamatorios asociables a la inyección de los mismos. Tabla 8. Análisis de parámetros vasculares en la retina de conejos Chinchilla tratados con VEGF o bFGF y los V HS.
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En el caso de los animales A1_Nb-VV6, A3_Nb-VV6, A1_Nb-FV1 , A2_Nb- FV1 , A3_Nb- FV1 no se observaron daños vasculares de ningún tipo.
Ejemplo 11. Biodistribución.
Se determinó la capacidad de los V HS de alojarse en la zona correspondiente al crecimiento tumoral de las células A673 o A549, tomando como referencia negativa un VHH purificado a partir de un clon negativo para la unión a VEGF o bFGF. Las células humanas tumorales A673 expresan VEGF humano y las células A549 expresan tanto VEGF como bFGF. Los polipéptidos se marcaron con 1131 (Amersham, Reino Unido), mediante el método de lodogen (Fraker PJ, Speck JC Jr. 1978. Biochem Biophys Res Comm 80:849-857), para actividades específicas de 1 ,51 MBq/5 pg y 1 ,55 MBq/5 pg, respectivamente. Los productos radiomarcados se analizaron en cromatografía de capa delgada, para determinar la incorporación a la proteína, encontrándose valores entre el 92 y el 95% de la radiactividad, en todos los casos. La capacidad de los productos radiomarcados para detectar sus antígenos correspondientes (VEGF y bFGF humano) se ensayó en un sistema donde se recubrieron inmunotubos de poliestireno con la ¡soforma 121 de VEGF humano recombinante (5 pg/mL; Peprotech), o bFGF recombinante (5 pg/mL; SinoBiological, EE.UU.). Posteriormente, se bloquearon, y se les añadió la muestra de los fragmentos radiomarcados de la especificidad correspondiente, ajustada a las cantidades que podían ser atrapadas por esa fase sólida. Luego de la incubación y el lavado, se determinó que la fase sólida unía entre el 84,2% y el 87,3% de la radiactividad, en todos los casos, demostrando que el procedimiento de radiomarcaje no afectó sensiblemente la actividad biológica de los V HS.
Para estudiar la biodisthbución se usaron 126 ratones nu/nu. Los animales se inocularon, por la vía subcutánea, con 5x106 células tumorales humanas de las líneas A673 o A549 en la zona dorsal derecha. Cuando los tumores alcanzaron volúmenes de 280 ± 20 mm3 se aleatorizaron en seis grupos de 9 animales, por cada modelo tumoral, y comenzó el tratamiento. Los ratones se inyectaron por la vena de la cola con el producto radiomarcado en cuestión, y se sacrificaron en grupos de 3 a las 24, 48 y 72 horas, removiéndose quirúrgicamente el tumor y los siguientes tejidos normales: bazo, hígado, riñón, intestino, músculo, médula y sangre. La acumulación de radiactividad se expresó como porciento de la dosis inyectada por gramo de tejido. La calibración se realizó mediante una muestra estándar de la dosis inyectada. La radiactividad se determinó empleando un contador de centelleo gamma.
La Tabla 9 presenta la relación de los valores d e radiactividad en tumor: radioactividad en sangre, calculado a partir de las mediciones realizadas en estos tejidos. El estudio demostró que, entre las 24 y las 72 horas, los V HS se localizan de manera preferencia! en el tejido tumoral, cosa que no ocurre para el Nb-Neg inespecífico. Se observó mayor acumulación de los polipéptidos Nb-V1 y Nb-VV6 en tumores A673, y mayor concentración de los polipéptidos Nb-F3 y Nb-FF2 en los originados por el implante de células A549, en correspondencia con la alta expresión de VEGF en A673 y de bFGF en A549. Las construcciones biespecíficas se acumularon en un porcentaje similar en ambos tipos de tumor, y en una mayor proporción que las variantes monoespecíficas mono y bivalentes. No se encontró un depósito específico de los VHH radiomarcados en otros tejidos diferentes al tumor, a partir de las 48 horas de inyectados los V H.
Tabla 9. Relación radiactividad en tumor respecto a radiactividad en sangre para ratones desnudos trasplantados con las células humanas tumorales A673 o A549.
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El análisis de la concentración de los V H en el suero de los animales tratados evidenció que a las 24 horas de la administración de una dosis única de 300 pg, equivalente a 15 mg/kg, la concentración de los VHH no fusionados a Fe (Nb-V1 , Nb-F3, Nb-VV6, Nb-FF2 y Nb-FV1) era inferior a 5 pg/mL. En el caso del Nb- FV1_Fc se detectaron 132 pg/mL, indicando la estabilidad superior de esta construcción para mantener altos niveles sistémicos del V H.
Ejemplo 12. Efecto de los VHH sobre la maduración de células dendríticas y la activación de linfocitos T.
El VEGF modula la maduración y el fenotipo de células dendríticas y células T respectivamente (Bourhis, et al., Frontiers in immunology, 2021 : 12: 616837). Para demostrar el efecto inmunomodulador potencial de los V H sobre células de estas estirpes, se realizó un estudio in vitro con (A) células CD8+ aisladas a partir de un proceso de selección negativa mediante perlas magnéticas (Miltenyi, Alemania), del bazo de un animal C57BI/6 de 20 semanas de edad, y (B) células dendríticas inmaduras diferenciadas con mFLT3 por una semana, aisladas a partir de una extracción de médula ósea del mismo animal.
Los linfocitos CD8+ se adicionaron a placas recubiertas con un anti-CD3 a 10 pg/mL, y se incubaron por 48 horas con 50 ng/mL de VEGF (Sigma, EE.UU.) preincubados por 2 horas con concentraciones decrecientes de los VHHS. Transcurrido este tiempo, las células se marcaron según lo descrito por Voron y cois. (Voron, et al., J Exp Med, 2015: 212: 139-48), y los resultados se analizaron en un citómetro de flujo SYSMEX (Alemania). El tratamiento con concentraciones crecientes de los VHH resultó en una reducción significativa en todos los casos de la expresión del marcador de senescencia PD1 en las células CD8+ (p<0,05, prueba a posteriori de Dunnet), tal como se observa en la Tabla 10A. Tabla 10A. Análisis de la expresión de PD1 (%) en células CD8+ tratadas con VEGF y con los VHHS.
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En el caso de las células dendríticas diferenciadas con FLT3, se sembraron en placas de 96 pozos, 105 células por pozo en 50 pL de medio IMDM (Gibco, EE.UU.) a los que se adicionaron 50 pl de las mezclas preincubadas por 2 h de VEGF humano y los VHH, para una concentración final de VEGF de 25 ng/mL y 10, 5 y 1 pg/mL de los V H. Después de cuatro horas de incubación, se adicionaron 50 pL de lipopolisacáhdo (SIGMA, EE.UU.), para una concentración final de 250 ng/mL. Dieciocho horas más tarde las células se lavaron y marcaron con anti-CD86 PE (Becton Dickinson, EE.UU.) y anti-MHCII I-A/I-E-V500 (BD Horizon, EE.UU.), y se analizaron un número fijo de 20000 eventos en el citómetro de flujo (SYSMEX, Alemania). La adición al cultivo de células dendríticas, de VHH en concentraciones crecientes restauró la respuesta de estas células al estímulo con lipopolisacáhdo, en presencia del VEGF, de forma dosis dependiente y significativa en todos los casos (p<0,05, prueba a posteriori de Dunnet), como se observa en la Tabla 10B.
Tabla 10B. Análisis de la expresión de MHCII y CD86 medida como intensidad media de fluorescencia (IMF) en células dendríticas tratadas con VEGF y con los V HS en condiciones de activación con lipopolisacáhdo.
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Ejemplo 13. Eficacia antitumoral del tratamiento con Nb-V1, Nb-VV6, Nb-F3, Nb-VF3 con o sin el fragmento Fe en el tratamiento de tumores sólidos en ratón.
Una réplica del estudio mostrado en el Ejemplo 11 , en ausencia de mareaje isotópico de los VHH, se realizó a fin de evaluar el efecto antitumoral. En todos los casos se utilizaron grupos de 5 ratones. Los animales recibieron el reto tumoral, y de acuerdo a las características del modelo, el tratamiento comenzó entre los 3 y 7 días posteriores. Los animales se trataron por dos semanas con dosis de 5 mg/kg de los VHH Nb-V1 , Nb-VV6 y Nb-FV1 , cada 72 horas. A los 15 minutos, 2 horas y 72 horas de la primera administración se realizaron extracciones de aproximadamente 50pL de sangre, para los análisis de biodistribución. A los 22 días de inicio del tratamiento, los animales se anestesiaron con dosis letal de ketamina, para realizar una extracción de sangre total, y proceder a la perfusión de la aurícula derecha con PBS. Se separó el suero y se pesaron por separado los tumores primarios, el hígado, los riñones y los pulmones, dependiendo del modelo. Los tumores primarios, en todos los casos con diámetros inferiores a 10 mm, y los tejidos con metástasis se dividieron en tres secciones que incluyeron todas las capas tumorales. En cada caso, los tumores o las metástasis se analizaron mediante: (a) inmunohistoquímica, a fin de analizar la densidad vascular mediante el mareaje selectivo de CD34, (b) citometría de flujo, para cuantificar y caracterizar el infiltrado leucocitario en el tejido tumoral, y (c) ELISA de cuantificación de los V H, citocinas y factores de crecimiento en el lisado del tejido con RIPA y en el plasma, según se describió en el Ejemplo 1 .
Modelo de metástasis hepáticas del carcinoma de colon MC-38: Los animales C57BL/6 se retaron mediante la administración intrahepática de las células de cáncer colorrectal metastásico de ratón MC-38. Se realizó una laparotomía bajo anestesia, y se expuso el lóbulo hepático superior, donde se inocularon un total de 10000 células en 20 pL. Los polipéptidos se administraron por la vía intraperitoneal 72 horas después del reto.
Modelo de tumor renal metastásico RENCA: Los animales BALB/c se retaron mediante la administración de 20000 células de carcinoma renal metastásico de ratón RENCA. Se realizó una laparotomía bajo anestesia y se expuso el riñón, para inocular las células en 20pL, con una aguja ultrafina en la zona subcapsular. Los polipéptidos se administraron por la vía intraperitoneal, 72 horas después del reto. Modelo de tumor subcutáneo CT26: Los animales BALB/c o nu/nu se retaron mediante la administración subcutánea de 20000 células de carcinoma de colon de ratón CT26. El tratamiento se inició de forma pehtumoral al alcanzarse diámetros tumorales entre 7 y 8 mm. Se administró cada 72 horas, por dos semanas.
Modelo de tumor subcutáneo A673 o A549: Los animales nu/nu se retaron mediante la administración subcutánea de 5x106 células humanas A673 o A549. El tratamiento se inició de forma pehtumoral al alcanzarse diámetros tumorales entre 7 y 8 mm. Se administró cada 72 horas, por dos semanas. En estos modelos, en particular, se evaluó la vahante de V H Nb-FV1 -hFc en las mismas dosis y ruta.
Modelo de implante pulmonar de CT26: Los animales BALB/c se retaron mediante la administración vía retro-orbital de 20000 células CT26, en 20 pL, con una aguja ultrafina. El tratamiento se inició por la ruta nasal a las 72 horas del reto, con 25 pL por fosa nasal, para una dosis total de 15 mg/kg.
Análisis histopatológico
Para investigar si el tratamiento con los V H afectaba la angiogénesis tumoral y la supervivencia de las células tumorales, las secciones de los tumores se analizaron mediante tinción con hematoxilina/eosina, y mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-CD34 de ratón, según lo descrito por Adinolfi y colaboradores (Adinolfi, et al., 2012: 2957-69). Los resultados se expresaron como la densidad vascular media (MVD, del inglés median vascular density) en función del número de vasos por mm 2.
Las tablas 11 , 12, y 13 muestran un resumen de los resultados de inhibición del crecimiento tumoral, estudios histopatológicos de la vascularización tumoral y de las concentraciones, en particular de VEGF en los lisados tumorales, referidos al control negativo.
Tabla 11. Porcentaje de inhibición del crecimiento de las lesiones neoplásicas respecto al grupo control tratado con Nb-Neg.
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Tabla 12. Densidad de microvasos (MVD, vasos CD34+/mm2) en lesiones neoplásicas de animales tratados y no tratados.
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Tabla 13. Expresión de VEGF en el tejido neoplásico de animales tratados y no tratados.
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Se observó un efecto antitumoral significativo (Tabla 11 ) tras el uso del Nb-V1 por las diferentes vías de administración (intraperitoneal, peritumoral y nasal), en los modelos tumorales estudiados (p<0,05 prueba t de Student). Este efecto correlacionó con la reducción de la vascularización y los niveles tisulares del VEGF de ratón en animales inmunocompetentes, y humano en animales desnudos (p<0,05; prueba de Pearson para todos los casos) (Tabla 12 y Tabla 13). El uso de dosis similares del Nb-VV6 resultó en un efecto significativamente superior, en comparación con el Nb-V1 , en concordancia con la mayor afinidad y avidez de este V H por el VEGF y con su mayor vida media sistémica (p<0,05; prueba t de Student en todos los casos).
El uso del Nb-FV1 , por su parte, resultó en un incremento del efecto antitumoral y antiangiogénico respecto a Nb-V1 y Nb-VV6, debido a la incorporación de un segundo blanco molecular y a la conocida cooperatividad de la inhibición de los sistemas VEGF/VEGFR y bFGF/FGFR en la inducción del evento angiogénico (Asahara, et al., Circulation, 1995: 92: 11365-71 ). La incorporación al Nb-FV1 del segmento CH2-CH3 de la lgG1 humana resultó en un aumento del efecto antitumoral y antiangiogénico, respecto al uso del Nb-FV1 en los modelos de tumor subcutáneo en que se ensayó (p<0,05 prueba t de Student).
La comparación del tratamiento en el modelo subcutáneo CT26 en animales inmunocompetentes, respecto a inmunocomprometidos, indicó un efecto antitumoral superior en los inmunocompetentes. Este hecho pudiera relacionarse con los efectos inmunopotenciadores y anti-inflamatohos descritos para los tratamientos anti-VEGF y anti-bFGF. Previamente, se demostró que la adición de los V H Nb-V1 , Nb-F3 y Nb-FV1 , a sistemas in vitro de análisis fenotípico de células T, y células dendríticas inhibe los efectos del VEGF y el bFGF sobre la funcionalidad de estos leucocitos (Ejemplo 12).
El análisis de las células CD3+ infiltrantes del tumor CT26 en ratones BALB/c indicó que, de manera significativa, el tratamiento con los VHH logró inmunorestaurar los linfocitos T (Tabla 14A). En esta misma muestra se analizó, además, la población de macrófagos F4/80+GR1 -, en términos de la expresión del marcador del fenotipo M1 : MHC II (expresado como IMF). Los resultados indican que todos los tratamientos incrementaron la funcionalidad de macrófagos de tipo M1 , respecto al grupo que recibió tratamiento con el Nb-Neg en cada modelo experimental (p<0,05 prueba a posteriori de Dunnet) (Tabla 14B). Se detectó un incremento superior en los grupos en los cuales se usó como tratamiento el Nb-FV1 , elemento que pudiera asociarse con el hecho de que la inhibición del bFGF contribuye de manera adicional al rescate de la inmunosupresión según lo informado por Im y cols. (Im, et al., Nature communications, 2020: 11 : 1 -14).
Tabla 14A. Análisis de la senescencia de la población celular T infiltrante en los tumores de acuerdo al porcentaje de expresión del marcador PD1 .
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Tabla 14B. Análisis de la expresión de MHC II en la fracción de macrófagos infiltrante a las lesiones tumorales.
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* Se muestra la IMF promedio de 5 muestras evaluadas por modelo.
El análisis de la concentración de los V H en el suero de los animales BALB/c y desnudos, tratados por la vía peh-tumoral, evidenció que la vida media de los VHH Nb-V1 , Nb-VV6 y Nb-FV1 era inferior a las 2 horas, con un aumento significativo de la concentración remanente en plasma para los V H bivalentes o biespecíficos respecto al Nb-V1. El análisis de la vahante de fusión al hFc del Nb-FV1 , por su parte, mostró una estabilidad en plasma superior a los 3 días, por lo que sus concentraciones fueron incrementándose debido a la administración de las múltiples dosis (Tabla 15).
Tabla 15. Evaluación de la concentración plasmática de los V H (pg/mL).
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Ejemplo 14. Evaluación funcional in vitro de transferencia génica de VHHS con vector viral.
Una de las estrategias de administración incluida en ensayos clínicos en la terapéutica actual para DMAE y el cáncer es la transferencia génica temporal de los polipéptidos terapéuticos. Con este fin la secuencia correspondiente al Nb-VV6_hFc y al Nb-FV1_hFc se amplificó con una PCR, mediante el uso de los oligonucleótidos SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, según los protocolos ya descritos. Después de digerir Not/Pme\, tanto el vector pAAVK-EIF2-MCS como la banda, estos se ligaron y transformaron en la cepa DH5a. Tras la verificación de la secuencia de los nuevos vectores: pAAVK-EIF2-Nb-VV6_hFc y pAAVK-EIF2-Nb-FV1_hFc, estos se usaron para empacar las partículas virales en el sistema AVV2 en células HEK-293, según las instrucciones del fabricante (GENEMEDI, China). Se aislaron y concentraron partículas virales a partir de células HEK293 co-transfectadas con 72 horas de cultivo, según describen Hughes y colaboradores (Hughes, et al., Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, 2019: 13: 86-98). Después de su titulación mediante qPCR, se conservaron a -80sC hasta su utilización (Aurnhammer, et al., Hum Gene Ther Methods, 2012: 23: 18-28).
La infectividad y la capacidad de producir de manera exitosa los polipéptidos se evaluaron en ensayos in vitro e in vivo. Se sembraron células HEK-293 a una densidad de 5x105 células por pozo en el formato de placas de 6 pozos. Después de 24 h se adicionaron al cultivo 8x108 UG (Unidades de genoma) en 1 mL de medio libre de suero suplementado con glutamina 200 nM. Se dejaron en contacto durante una hora, antes de adicionar 1 mL de medio suplementado con SFB 20% y glutamina. Los sobrenadantes de cultivo se colectaron después de 72 h de incubación a 37SC y 5% de CO2. Para la evaluación de la traducción in vivo se administró a ratones C57BL/6 una única inyección de 8x108 UG por la ruta intramuscular. Catorce días después del reto se midió la cantidad total de V H_hFc en tejido mediante ELISA, según lo descrito en el Ejemplo 1 , utilizando una curva estándar de cada VHH IFC purificado y caracterizado a partir de células CHO. Se detectó la expresión de los polipéptidos Nb-VV6_hFc y Nb-FV1_hFc en el sobrenadante de cultivo de células HEK-293 infectadas (125 pg/mL y 220 pg/mL, respectivamente). En el tejido muscular se detectaron concentraciones de los V H entre 50 y 100 pg por gramo procesado. Las concentraciones detectadas en ambos formatos de expresión coinciden con los reportados para cada caso en la literatura para partículas virales empacadas en el sistema AVV2 y en todos los casos evidenciaron su funcionabilidad en términos de unión a los antígenos específicos y bloqueo de la unión de los mismos a sus receptores.

Claims

REIVINDICACIONES Un polipéptido que se une a factores de crecimiento proangiogénicos que comprende en su secuencia aminoacídica al menos un fragmento de anticuerpo de simple dominio (VHH) que posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que posee un 95% de identidad con las secuencias de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. El polipéptido de la reivindicación 1 donde el factor de crecimiento proangiogénico es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) humano. El polipéptido de la reivindicación 2 que se une a más de una molécula de VEGF o de bFGF humano. El polipéptido de la reivindicación 3 que se une al menos a: i) dos moléculas de VEGF, ¡i) a dos moléculas de bFGF, o iii) a una molécula de VEGF y una molécula de bFGF. El polipéptido de la reivindicación 1 que posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. El polipéptido de la reivindicación 1 que es un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 y una secuencia de aminoácidos que corresponde a un sitio de unión a albúmina o un dominio Fe de una inmunoglobulina humana. El polipéptido de la reivindicación 6 donde el dominio Fe es de una inmunoglobulina humana IgGi, lgG2, lgG3 o lgG4. El polipéptido de la reivindicación 7 que posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36. Un vector que codifica para un polipéptido que se une a factores de crecimiento proangiogénicos donde el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID NO: 23 a la SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 31 a la SEQ ID NO: 36.
10. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8 o el vector de la reivindicación 9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
1 1. La composición de la reivindicación 10 que está formulada para su administración por ruta sistémica, mucosal o intravítrea.
12. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8 o del vector de la reivindicación 9 para la manufactura de un medicamento.
13. El uso del polipéptido de acuerdo a la reivindicación 12 donde el medicamento es útil para el tratamiento de una patología que cursa con el incremento de la angiogénesis, la inflamación o la inmunosupresión.
14. El uso del polipéptido de acuerdo a la reivindicación 13 donde el medicamento es útil para el tratamiento del cáncer, de la retinopatía diabética, de la degeneración macular o de la artritis reumatoide.
15. Un método de tratamiento de una patología que cursa con el incremento de la angiogénesis, la inflamación o la inmunosupresión en un individuo que lo necesita que se caracteriza porque se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8 o el vector de la reivindicación 9.
16. El método de tratamiento de acuerdo a la reivindicación 15 donde la patología es el cáncer, la retinopatía diabética, la degeneración macular, o la artritis reumatoide.
17. El método de tratamiento de acuerdo a la reivindicación 15 donde dicha composición farmacéutica se administra por ruta sistémica, mucosal o intravítrea.
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