CN101573379A - 针对血管内皮生长因子(vegf)的重组抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与抗体相关的重组多肽分子，其特异性地识别人血管内皮生长因子－A(VEGF－A)，并且干扰其体外刺激效应和体内促血管生成活性。这些重组多肽分子能够影响人内皮细胞在体外的增殖，在小鼠中由包含VEGF－A的基质胶栓诱导的皮下血管生成，和移植到裸鼠中的人肿瘤的生长。这些分子中的一些在非人灵长类动物实验模型中防止脉络膜新血管形成。这些分子可以用于病理学实体的被动免疫疗法，所述病理学实体的进程与脉管***的增加相关，例如年龄相关的黄斑变性(湿型)、癌症及其转移、新生血管性青光眼、糖尿病性和新生儿视网膜病变、急性和慢性炎症过程、传染病、自身免疫疾病、器官移植排斥、血管瘤和血管纤维瘤，以及其他。

Description

针对血管内皮生长因子(VEGF)的重组抗体

技术领域

本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别涉及与抗体相关的重组多肽分子的开发和应用，所述重组多肽分子特异性地识别人血管内皮生长因子-A(VEGF-A)(Ferrara，N.等人，2003.Nature Medicine9：669-676)，并且干扰其体外刺激效应和体内促血管生成活性。在这些分子中存在有单链Fv抗体片段(scFv)、Fab抗体片段、和“完整抗体”类型的二价分子(scFv₂-Fc)。

发明背景

从预先存在的血管形成新血管的过程被命名为血管生成，并且通过促和抗血管生成因子的平衡而得到调节。在与促血管生成因子的异常诱导和新血管的形成相关的疾病中存在有：癌症(原发性肿瘤及其转移)，急性和慢性炎症过程例如哮喘、呼吸窘迫、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化和组织水肿，传染性起源的疾病例如肝炎和卡波西肉瘤，自身免疫疾病例如糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎和甲状腺炎，以及其他各种疾病和状态例如糖尿病性视网膜病变、器官移植排斥、年龄相关的黄斑变性(湿型)、新生血管性青光眼、血管瘤和血管纤维瘤(Carmeliet，P.和Jain，RK.2000.Nature 407：249-257；KuwanoM等人，2001.Intern Med 40：565-572)。

用于这些疾病中许多疾病的吸引人的治疗操作程序基于通过施用中和分子来抑制促血管生成因子的活性，所述促血管生成因子刺激血管的异常形成。在医疗实践中，识别并中和人VEGF-A的促血管生成效应的重组人源化抗体贝伐珠单抗(在商业上称为阿瓦斯丁(Avastin))(Ferrara，N.等人，2005.Biochem Biophys Res Comun 333：328-335)，已在数个国家中被批准用于***过程。已显示，它的效应主要依赖于抑制由VEGF-A诱导的新血管生成，所述VEGF-A由肿瘤细胞和肿瘤基质的其他细胞例如巨噬细胞和成纤维细胞产生。这种抗体最初是通过用获自哺乳动物细胞的人VEGF-A的同种型165免疫接种小鼠，从而作为鼠类单克隆抗体而获得的(Kim，KJ.等人，1992.GrowthFactors 7：53-64)。然后，该抗体通过基因工程进行修饰以达到其人源化，当将其应用于人时，这赋予该分子更好的耐受性和治疗效果。

近来，雷珠单抗(Gaudreault，J.等人，2005.Invest OphthalmolVisual Sci 46：726-733)(在商业上称为Lucentis，其为衍生自已经提及的阿瓦斯丁的抗体片段)，已在数个国家中被批准用于治疗年龄相关的黄斑变性(湿型)。雷珠单抗是重组Fab抗体片段，其源于使用基因工程对贝伐珠单抗进行操作。玻璃体内注射雷珠单抗中和了局部产生的VEGF-A，并且控制了进一步的视网膜的新血管生成，这是该疾病的基础。

血管内皮生长因子是以直接且特异的方式诱导新血管形成的分子家族(Leung，D.等人，1989.Science 246：1306-1309)。这个家族包括血管通透因子(VPF)(也称为血管肉皮生长因子，目前命名为VEGF-A)，胎盘生长因子(P1GF)，血小板衍生生长因子(PDGF)PDGF-A和PDGF-B，以及命名为VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E的其他在结构和功能上与VEGF-A相关的分子(Olofsson，B.等人，1996.ProcNatl Acad Sci USA 93：2576-2581；Joukov，V.等人，1996.EMBO J15：290-298；Yamada，Y.等人，1997.Genomics 42：483-488；Ogawa，S.等人，1998.J Biol Chem 273：31273-31282)。

VEGF-A是由两个23kDa亚基形成的同二聚体糖蛋白(Ferrara，N.等人，1989.Biochem Biophys Res Comun 161：851-858)，其中存在有从同一种核糖核酸(RNA)的差别剪接中衍生而来的5种单体同种型。这些包括保持与细胞膜附着的两种同种型(VEGF 189和VEGF 206)和具有可溶性质的三种同种型(VEGF 121、VEGF 145和VEGF 165)。VEGF 165在哺乳动物组织中最丰富，除了在其中VEGF 189占优势的肺和心脏中(Neufeld G等人，1995.Canc Met Rev 15：153-158)，以及在其中VEGF 121的表达盛行的胎盘中(Shibuya，M.1995.AdvCancer Res 67：281-316)。

VEGF-A是这个家族中经最广泛地研究和表征的蛋白质，并且已在大量疾病中描述了它的改变。VEGF-A过表达与下述相关：不同起源和定位的肿瘤及其转移(Grunstein，J.等人，1999.Cancer Res 59：1592-1598)，慢性炎症过程例如溃疡性结肠炎和克罗恩病(Kanazawa，S.等人，2001.Am J Gastroenterol 96：822-828)，牛皮癣(Detmar，M.等人，1994.J Exp Med 180：1141-1146)，呼吸窘迫(Thickett，DR.等人，2001.Am J Respir Crit Care Med 164：1601-1605)，动脉粥样硬化(Celletti，FL.等人，2001.Nat Med 7：425-429)，子宫内膜异位症(McLaren，J.2000.Hum Reprod Update 6：45-55)，哮喘(Hoshino，M.等人，2001.J Allergy Clin Immunol 107：295-301)，类风湿性关节炎和骨关节炎(Pufe，T.等人，2001.JRheumatol 28：1482-1485)，甲状腺炎(Nagura，S.等人，2001.HumPathol 32：10-17)，糖尿病性和新生儿视网膜病变(Murata，T.等人，1996.Lab Invest 74：819-825；Reynolds，JD.2001.PaediatrDrugs 3：263-272)，黄斑变性和青光眼(Wells，JA.等人，1996.BrJ Ophthalmol 80：363-366)，组织水肿(Kaner，RJ.等人，2000.AmJ Respir Cell Mol Biol 22：640-641)，肥胖症(Tonello，C.等人，1999.FEBS Lett 442：167-172)，血管瘤(Wizigmann，S.和Plate，KH.1996.Histol Histopathol 11：1049-1061)；在具有炎性关节病的患者的滑膜液中出现(Bottomley，MJ.等人，2000.ClinExp Immunol 119：182-188)；以及与移植排斥相关(Vasir，B.等人，2001.Transplantation 71：924-935)。在肿瘤的具体情况下，表达VEGF-A的三种基本同种型(121、165和189)的细胞是在体内更快速生长的细胞(Grunstein，J.2000.Mol Cell Biol 20：7282-7291)。

由VEGF家族的分子诱导的内皮细胞功能的改变通过它们结合III类酪氨酸激酶受体来介导，所述受体迄今为止包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(KDR/Flk1)和VEGFR3(Flt4)(Kaipainen，A.1993.J ExpMed 178：2077-2088)。所述受体的第二个N-末端结构域已被鉴定为负责配体结合，这促成胞质结构域的磷酸化和信号转导(Davis-Smyth，T.等人，1996.EMBO 15：4919-4927)。

VEGFR2(KDR/Flk1)介导VEGF-A的生物学效应，并且还结合VEGF-C和VEGF-D。这个受体在活性内皮中和在几种肿瘤起源的细胞系中差异表达，在其中可以用分泌的VEGF来建立自分泌环。除了参与前述的与其配体过表达相关的病理学状况之外，受体过表达还与下述疾病的进展相关：子宫内膜癌(Giatromanolaki，A.等人，2001.Cancer92：2569-2577)，恶性间皮瘤(Strizzi，L.等人，2001.J Pathol193：468-475)，星形细胞肿瘤(Carroll，RS.等人，1999.Cancer86：1335-1341)，原发性乳腺癌(Kranz，A.等人，1999.Int J Cancer84：293-298)，肠型胃癌(Takahashi，Y.等人，1996.Clin CancerRes 2：1679-1684)，多形性成胶质细胞瘤，间变性少突神经胶质细胞瘤和坏死性室管膜瘤(Chan，AS.等人，1998.Am J Surg Pathol 22：816-826)。KDR过表达还与自发性VHL疾病和成血管细胞瘤(Wizigmann-Voos，S.等人，1995.Cancer Res 55：1358-1364)、糖尿病性视网膜病变的进展(Ishibashi，T.2000.Jpn J Ophthalmol44：323-324)相关。连同Flt-1一起，KDR还与迟发型超敏反应相关(Brown，LF.等人，1995.J Immunol 154：2801-2807)。

涉及抑制血管生成(尤其是在癌症中)的大多数新治疗策略基于阻断VEGF-A和/或其受体。在经批准或处于临床试验中的产品中，发现下列是突出的：(1)阻断VEGF-A或KDR的单克隆抗体；(2)金属蛋白酶抑制剂，例如新伐司他和普啉司他；(3)VEGF抑制剂，例如沙利度胺、苏拉明、肌钙蛋白I、IFN-α和新伐司他；(4)VEGF受体阻断剂，例如SU5416、FTK787和SU6668；(5)肿瘤内皮凋亡的诱导剂，例如内皮生长抑素和CA4-P；以及(6)降低VEGF表达或其受体表达的核酶(Angiozyme)。

在所有上述中，中和VEGF-A的促血管生成效应的抗体(和抗体片段)在其作为治疗产品的应用和接受方面是最先进的。除了上文提及并已注册的贝伐珠单抗和雷珠单抗的例子外，还存在关于识别并中和人VEGF的其他抗体和抗体片段的报道(Muller，Y.等人，1997.ProcNatl Acad Sci USA 94：7192-7197；Asano，M.等人，1998.Hybridoma17：185-190；Vitaliti A.等人，2000.Cancer Res60：4311-4314；Brekken，RA.和Thorpe，PE.2001.J ControlledRelease 74：173-181；Jayson，G.等人，2002.JNCI94：1484-1493；Brekken，RA.等人，2000.Cancer Res 60：5117-5124；Fuh，G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631；US5730977)。

发明详述

本发明描述了与抗体相关的重组多肽分子，该重组多肽分子包含由核苷酸序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8或同源序列编码的人免疫球蛋白可变区(VR)；识别人VEGF-A中在残基C102、C57、R56、T31和L32周围定义的表位，尽管不一定限于残基C102、C57、R56、T31和L32；并且干扰人VEGF-A的促血管生成效应。在与新血管生成相关的体外和体内模型中证明了此类分子中和人VEGF-A的促血管生成效应的能力。这些分子由一个或多个抗原结合位点形成，此类位点由经人免疫球蛋白重链和轻链VR的DNA序列所编码的氨基酸构成。

为了本发明的目的，定义了下列术语：

·重组抗体

该术语描述了部分地或完全地通过合成方法(借助于重组DNA或人工基因合成)产生的免疫球蛋白或其部分，其通过一个或多个相互作用结构域(由免疫球蛋白重链和轻链可变区的特定组合形成，并且通常被称为抗原结合位点)而特异性地识别抗原(Gavilondo和Larrick.2000.Biotechniques 29：128-136)。重组抗体的实例是所谓的嵌合和人源化抗体，其中获自一个物种的可变区(或其部分)通过使用基因工程而与另一个物种的免疫球蛋白恒定区相联合。在重组抗体中，还包括通过基因工程产生的抗体片段，其包含一个或多个抗原结合位点。重组抗体片段的实例是：(i)Fab片段，其包括免疫球蛋白的VL、VH、CL和CH1；(ii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)Fv片段，其由抗体的VL和VH形成；(iv)scFv片段，其中抗体的VH和VL结构域通过肽接头区段以不同形式(VH-VL或VL-VH)相连接，所述肽接头区段允许这两个结构域相联合从而形成抗原结合位点(Bird等人，1988.Science 242：423-426；Huston等人，1988.PNAS USA 85：5879-5883)；(v)“双抗体”，其为以与scFv相似的方式构建的多价或多特异性片段，但其中接头的小尺寸不允许单个scFv分子的VH和VL结构域彼此联合，并且结合位点必须通过两个或更多个单独的scFv分子的联合来形成(WO 94/13804；Holliger P等人，1993.PNAS USA 90：6444-6448)；(vi)其他片段，例如dAb(Ward SE等人，1989.Nature 341：544-546)、分离的互补决定区(CDR)、F(ab′)₂片段和scFv双特异性二聚体(PCT/US92/09965；Holliger P和Winter G.1993.Current OpinionBiotechnol.4：446-449；de Haard，H等人，1998.Adv.Drug DeliveryRev.31：5-31)。某些类型的片段，例如scFv和Fab，还可以从抗体文库中获得，其中使物种的VR基因(合成的或源自天然来源的)的广泛储库(repertoire)随机组合，以产生抗体VR的特定联合，其随后展示在丝状噬菌体的表面上。

其中通过基因工程将抗体片段与抗体恒定区人工装配在一起的“抗体-类型”分子也被视为重组抗体。例如，可以通过使scFv与由免疫球蛋白Fc的铰链、CH2、CH3和有时还有CH4结构域形成的区域相连接来构建二价“抗体-类型”分子。依赖于所有或数个所描述区域的拥有和糖基化的程度，抗体-类型分子可以显示出通常与免疫球蛋白Fc相关的效应子功能。

·抗原结合位点。表位

第一个术语描述了与抗原(或其部分)特异性地相互作用的抗体的部分。当抗原的分子尺寸大时，抗体可以仅与抗原的特定区域结合，所述区域被称为表位。抗原结合位点主要由两个抗体可变区(轻链可变区和重链可变区)形成。抗原结合位点通过可变区的非共价相互作用而形成。可以通过用接头肽连接这两个可变区来人为地稳定抗原结合位点，所述接头肽不干扰其特异性地识别抗原的性质，如scFv片段的情况。实际上，抗原结合位点通过可变区的非共价相互作用来进行装配，这通过在天然分子结构中分别跟随重链和轻链可变区的CH1和CL(κ或λ)结构域的非共价相互作用而得到加强。天然的完整抗体具有2个相同的抗原结合位点。在抗原是蛋白质的情况下，由抗原结合位点所识别的表位可以由氨基酸的线性序列来形成，或者可以是构象的，即由抗原结合位点所识别的氨基酸在该蛋白质的三级结构中是接近的，但在其一级结构中不一定是相继的。在蛋白质的情况下，表位天然地是不连续的区域，其由通过非连接键与抗体相互作用的氨基酸的特定组来限定。

·同源抗体

这是天然的或基因工程产生的抗体，其特异性地识别抗原的表位，所述抗原还由另一种不同的抗体特异性地鉴定。所讨论的这两种抗体就其可变区的序列而言可以是相关的(例如，一种抗体由于可以或多或少广泛的突变而衍生自另一种抗体)，或者可以具有完全不同的可变区序列。后者是由于下述事实：抗体和抗原之间的特异性相互作用(特别是在蛋白质的情况下)是通过可变区的氨基酸残基之间的表面相互作用，即非共价键(氢键、范德华力等)的形成来进行的(虽然在结构上与可变区接近的某些其他不连续的残基有时也可以参与该相互作用)。这产生了就序列而言具有不同的结合位点的两种不同抗体，但它们仍然可以具有足够的同一性以与特定表位相互作用，所述特定表位使得两者对于其均是特异的。同源抗体必须能够特异性地鉴定由其他抗体所识别的特定表位。术语“同源的”可延伸至在上文对于重组抗体所作的定义中所包括的抗体的其他形式(抗体片段、“抗体-类型”分子等等)。

·特异的

该术语涉及这样的情形，即抗体或抗体片段不显示出与不同于其特异性结合伙伴的其他分子的显著结合。这个术语还可应用于下述情况：抗原结合位点对于在许多相关或无关抗原中出现的特定表位而言是特异的，在所述情况下所述结合位点将能够结合具有所述表位的数种抗原。

在本发明的一个实施方案中，所述与抗体相关的重组多肽分子为：单链Fv类型(scFv)的人抗体片段(scFv 2H1)、Fab抗体片段(Fab2H1-32)和“完整抗体”类型的scFv₂-Fc二价分子(scFv₂-Fc 2H14.1和scFv₂-Fc 2H1 8.2)。在所有这些中，不同的VR自发地进行装配从而形成抗原结合位点。人工连接区段(接头)或其他抗体相关序列例如免疫球蛋白恒定结构域为这种装配的稳定性作出了贡献。所述VR源自包含在scFv中的那些，所述scFv分离自展示在丝状噬菌体表面上的人scFv抗体片段的文库，该文库专门使用人λ链的VR储库来构建。

由于所采用的策略，本发明中所描述的与抗体相关的重组多肽分子具有这样的免疫球蛋白VR，所述免疫球蛋白VR具有新型DNA序列且不同于由其他作者报道的那些，所述其他作者也已获得了中和VEGF-A的促血管生成作用的抗体，如源自下述的那些：杂交瘤(Kim，KJ.等人，1992.Growth Factors 7：53-64；Muller，Y.等人，1997.Proc Natl Acad Sci USA 94：7192-7197；Asano，M.等人，1998.Hybridoma 17：185-190；Schaeppi，JM.等人，1999.J Cancer ResClin Oncol 125：336-342；Brekken，RA.等人，2000.Cancer Res 60：5117-5124；Brekken，RA.和Thorpe，PE.2001.J Controlled Release74：173-181)，人细胞的病毒转化(US 5730977)，通过基因工程修饰先存的抗体(Jayson，G.等人，2002.JNCI 94：1484-1493；Ferrara，N.等人，2005.Biochem Biophys Res Comun 333：328-335)，以及人抗体片段文库(Vitaliti，A.等人，2000.Cancer Res 60：4311-4314；Fuh，G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631)。本发明中所描述的与抗体相关的重组多肽分子在下述方面而言也是新型的：它们识别人VEGF-A中与由中和人VEGF-A的其他抗体所定义的那些构象表位不同的构象表位(Muller，Y.等人，1997.Proc Natl AcadSci USA 94：7192-7197；Muller，AY.等人，1998.Structure 6：1153-1167；Schaeppi，JM.等人，1999.J Cancer Res Clin Oncol 125：336-342；Brekken，RA.等人，2000.Cancer Res 60：5117-5124；Fuh，G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631；WO 2005012359)。

通过应用本发明中所描述的与抗体相关的重组多肽分子及其等价变体而获得的抗血管生成效应是基于干扰了人VEGF-A和存在于激活的血管内皮细胞中的其受体之间的相互作用，因此影响了血管内皮细胞进行增殖和维持其生理学稳定性的能力。

在本发明的背景中，“等价变体”是从包含在下列VR中的序列的其他联合和操作中衍生而来的多肽分子：2H1RVCP(SEQ ID No.7)和2H1RVCL(SEQ ID No.8)这些VR；以及包含在本发明(SEQ ID No.13)中的其他同源VR，其保留了特异性地识别人VEGF-A并干扰其刺激内皮细胞生长和促血管生成的生物学效应的能力。这些多肽分子可以采取其他重组抗体片段的形式，如scFv，其中VL结构域在该序列中位于VH结构域之前，或者其中现有技术已知的其他连接区段(接头)用于连接VR，或如F(ab′)₂、Fabc、Facb、二聚scFv、三聚scFv和四聚scFv抗体片段(Winter G，Milstein C.1991.Nature 349：293-299；WO94/13804；de Haard，H等人，1998.Adv.Drug Delivery Rev.31：5-31)。此外，在添加衍生自免疫球蛋白的其他序列后产生等价变体，从而形成多价分子(Bestagno M等人，2001.Biochemistry 40：10686-10692)。“等价变体”分子还可以是双特异性抗体的形式，其中分子的一部分保留其对于VEGF-A的特异性，和另一部分具有不同的特异性；或以者是完整抗体的形式，其中VR序列与人或其他起源的免疫球蛋白恒定区相联合。使用基因工程来进行所有这些操作是本领域技术人员已知的。

“等价变体”还考虑了通过所谓的“CDR移植”而产生的那些分子，其中在包含在2H1RVCP(SEQ ID No.7)和2H1RVCL(SEQ ID No.8)这些VR以及其他同源VR(如包含在例如SEQ ID No.13中的那些)中的CDR序列的侧翼，人为地放置并非原始的序列框架，如例如在EP-B-0239400、EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400中所揭示的，在某种意义上这种操作不会影响特异性地识别人VEGF-A以及干扰内皮细胞生长和促血管生成的能力。

以scFv片段形式的重组多肽分子(命名为scFv 2H1)特异性地识别人VEGF-A的不同同种型。在该scFv中，人免疫球蛋白重链和轻链VR以这种顺序通过16氨基酸的接头在基因上相联合，从而形成在SEQ ID No 6中所描述的DNA序列。该scFv 2H1片段获自命名为scFv2H1-F的同源scFv，从通过与已描述的那些类似的方法(Rojas G等人，2005.Biochem Biophys Res Comun 336：1207-1213)并使用人λ链VR的储库而构建的展示在丝状噬菌体中的scFv片段的文库中选择出来。在该轻链VR储库中引入故意的偏差(intentional bias)，以增加发现与由其他作者所报道的那些不同的抗体的可能性，并且所述抗体将通过与先前鉴定的那些不同的机制来中和VEGF-A。

在从文库中进行选择的过程中，采用了这样的融合蛋白，其包含通过将残基R82、K84、H86置换成谷氨酸而在这些残基中发生突变的人VEGF-A的同种型121，并且影响其与KDR受体的相互作用(Shen，B.等人，1998.J Biol Chem 273：29979-29985)，如实施例1中所显示的。在细菌中产生这种重组融合蛋白(命名为P64_47aa-VEGF，SEQ IDNo.3)，并且以对于具有人VEGF-A的体外生物活性的分子种类所采用的那种类似的方式进行纯化。因此，在本发明中所使用的抗原不同于由已获得了识别人VEGF的单克隆或重组抗体的其他作者所使用的抗原或免疫原。位于P64_47aa-VEGF的N-末端中的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的P64K蛋白结构域增加免疫原性，并且允许在大肠杆菌(E.coli)中高水平地进行表达，和形成具有生物活性的与人VEGF相似的二聚体形式。突变的区域包括由报道为中和VEGF-A的生物学功能的其他抗体所识别的表位(Muller，Y.等人，1997.Proc Natl Acad Sci USA 94：7192-7197；Muller，AY.等人，1998.Structure 6：1153-1167)。

根据本发明，使用融合蛋白P64_47aa-VEGF来用于从包含λ链VR储库的scFv抗体片段文库中选择出关于人VEGF的结合位点，是在鉴定识别先前未描述的人VEGF-A的构象表位的抗体片段(scFv 2H1-F)中的决定因素。

为了产生多肽分子scFv 2H1，将获自文库的scFv 2H1-F片段的DNA序列从相应的噬菌粒载体克隆到周质表达载体中。从经转化的细菌的培养基和周质中回收具有稍微高于29kDa的表观分子量的scFv2H1抗体片段，并使用金属离子亲和层析(IMAC)来容易地进行纯化(Porath J.1992.Prot.Expr.Purif.3：263-281)。表达载体pACR.1向分子scFv 2H1的C-末端添加c-myc肽结构域(其用作用于分析目的的“标签”)，随后为6-组氨酸结构域(其用于促进使用IMAC来进行的纯化)。

以Fab片段形式的重组多肽分子(命名为Fab 2H1-32)特异性地识别人VEGF-A的不同同种型。在该Fab中，将编码scFv 2H1的VR(命名为2H1RVCP(SEQ ID No.7)和2H1RVCL(SEQ ID No.8))的DNA序列克隆到载体pFabHum-1中，并且分别与人IgG型免疫球蛋白的CH1和Cλ在基因上相联合，如SEQ ID No.10和SEQ ID No.9中所描述的。pFabHum-1质粒是被构建用于在细菌周质中表达具有人Cλ和CH1恒定区的Fab片段的双顺反子载体。所产生的多肽链包含VR以及其各自的轻或重恒定区，它们进行装配从而在细菌周质中形成Fab片段，它们通过由载体所提供的信号肽而从细胞质中被输出到所述周质中。Fab的周质装配是基于轻链和重链VR之间，以及CH1和Cλ结构域之间的非共价相互作用，但它通过也由载体提供的、接近于CH1和Cλ区域的C-末端的两个半胱氨酸之间的二硫化物类型的共价键而得到加强。Fab 2H1-32具有50kDa的表观分子大小。

命名为scFv₂-Fc 2H1-8.2和scFv₂-Fc 2H1-4.1的“完整抗体”类型的二价重组多肽分子包含scFv 2H1的VR序列，该序列与编码10氨基酸间隔体的序列相联合，随后分别为编码IgG1类型的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID No.14)，和与前面的非常相似的在某些VR碱基中具有有限改变的序列(SEQ ID No13)。在将编码scFv 2H1的基因的PCR产物克隆到pVSJG-HucFc载体中后获得这些分子，排除了其3′结构域(其编码c-myc肽和6个组氨酸)。pVSJG-HucFc载体被设计用于在哺乳动物细胞中表达“完整抗体”类型的分子，所述分子包含两个相同的与人IgG1免疫球蛋白的Fc相联合的scFv。导致产生这些二价分子的多肽链经由存在于pVSJG-HucFc载体中的免疫球蛋白信号肽而被转运到哺乳动物细胞的内质网。该肽在内质网中被去除，并且两个相同的多肽链通过铰链区中的二硫键共价联合，这是通过CH2和CH3区域的非共价相互作用而得到加强的连接。scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2分子具有100-120kDa的相似的表观分子大小。这些分泌的蛋白质在其氨基末端处具有由载体所提供的4个额外的氨基酸(QVLK)。

本发明的重组抗体，如scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2，也可以在其他真核***中产生，如转基因植物的情况(Pujol，M.等人，2005.Vaccine 23：1833-1837)。

在本发明的其他方面，上文描述的重组多肽分子特异性地识别人VEGF-A的同种型121和165，并且不鉴定小鼠VEGF。这些分子可以结合可溶性人VEGF-A、吸附在固体表面上的人VEGF-A、或者与产生其的人细胞相联合或接近的人VEGF-A，在后者之中包括有在(无胸腺的)裸鼠中生长的人肿瘤中存在的那些。

本发明中描述的重组多肽分子，尤其是scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2，能够与有活性的人VEGF-A相互作用，从而干扰体外人内皮细胞生长以及体内新血管生成过程，后者在下列实验模型中进行测量：小鼠中的皮下基质胶栓(Matrigelpellet)的实验模型，以及移植到同基因无胸腺小鼠(裸鼠)中的人肿瘤细胞的实验模型。本发明中描述的重组多肽分子不识别小鼠VEGF-A，并且有效地干扰人VEGF-A和可溶形式的KDR受体之间的结合。在其中经由使用激光的光凝固术来产生脉络膜新血管形成(choroideal neo vascularization，CNV)的非人灵长类动物实验模型中，多肽分子scFv 2H1和scFv₂-Fc 2H1-4.1的应用防止了CNV，或者改善了其演化。考虑到它们对于人VEGF的特异性类似于多肽分子scFv 2H1和scFv₂-Fc 2H1 4.1的特异性，多肽分子Fab 2H1-32和scFv₂-Fc 2H1-8.2也将能够对CNV产生此类作用，并且在其他体外和体内模型中具有抗血管生成效应。

本发明中描述的重组多肽分子可以与酶或其片段、生物应答调节剂、毒素或药物、或者放射性同位素相缀合，这向原始的分子添加了除与人VEGF-A结合的功能之外的另外功能特征，这可以是鉴定和/或影响细胞的生存力的能力，所述细胞位于其中存在有高浓度的人VEGF-A的多细胞生物的特定解剖学位置中或位于紧邻该位置的附近；或者是与结合至细胞膜的VEGF-A形式相互作用的能力。

因为它们能够识别并与人VEGF-A相互作用，并且干扰其促血管生成活性和刺激内皮细胞增殖的能力，作为本发明目标的重组多肽分子还可以影响其他对于人VEGF所描述的生物学功能，如其中该分子在免疫应答的负调控中起作用的那些(Chouaib S等人，1997.ImmunologyToday 18：493-497)。

一组要素使得作为本发明目标的重组多肽分子相对于中和人VEGF-A的其他抗体和抗体片段而言是新颖的。在这些要素中包括下列：

(a)编码形成作为本发明目标的多肽分子的抗原结合位点的VR的碱基序列之前未被报道，并且不同于其他抗VEGF-A抗体的那些。所述VR的CDR序列，特别是重链VR的CDR3，显著不同于先前报道的富含芳香族氨基酸酪氨酸和/或色氨酸的其他那些，这与特定表位的识别相关(Fellouse F.A.等人，2004.PNAS 101：12467-12472)。在本发明中描述的多肽分子的情况下，重链VR的CDR3不含酪氨酸。

(b)作为本发明目标的多肽分子对于人VEGF-A的免疫化学特异性不同于获自其他文库的人Fab片段的免疫化学特异性(Fuh G.等人，2006.J.Biol Chem 281：6625-6631)，所述获自其他文库的人Fab片段另外还识别小鼠VEGF-A。

(c)本发明中描述的多肽分子在它们对于人VEGF-A的识别方面非常依赖于其生物学活性二聚体构象，如通过在用还原剂处理VEGF-A后检测出识别丧失所显示的。

(d)当与由中和人VEGF-A的生物学功能的其他抗体和抗体片段所识别的表位相比较时，本发明中描述的多肽分子识别人VEGF上的先前未描述的构象表位(Muller Y等人，1997.PNAS 94：7192-7197；Muller AY.等人，1998.Structure 6：1153-1167；Schaeppi J.-M.等人，1999.J Cancer Res Clin Oncol 125：336-342；Fuh G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631；WO2005012359)。

如实施例9中所显示的，通过scFv 2H1抗体片段从12-氨基酸组合肽文库中特异地选择出的肽序列之间可能的联合的计算机分析，以及人VEGF-A的一级和三级结构的已知数据，全都暗示scFv 2H1的抗原结合位点与人VEGF-A分子中的构象表位相互作用。在VEGF的三级结构中被识别的区域与对于其他中和人VEGF-A的抗体和抗体片段所描述的表位不一致，因此是新颖的。这种表位限定还展现出了了解人VEGF-A及其受体KDR之间仍未解决的复杂相互作用的新可能性。

本发明中描述的多肽分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2及其等价变体能够与人活性VEGF-A相互作用，并干扰其刺激新血管生成的效应。因为这点，这些分子可用于开发用于其中存在异常和过量血管生成的疾病的新型治疗方法，例如：(a)癌症(原发性肿瘤和转移)，(b)眼疾病，例如年龄相关的黄斑变性(湿型)、新生血管性青光眼、糖尿病性和新生儿视网膜病变，(c)急性和慢性炎症过程，例如哮喘、呼吸窘迫、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化和组织水肿，(d)传染性起源的疾病，例如肝炎和卡波西肉瘤，(e)自身免疫疾病，例如糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎和甲状腺炎，以及(f)其他各种疾病和状态，例如器官移植排斥、血管瘤和血管纤维瘤。

本发明的另一个方面是所述分子在生产药物组合物中的用途，所述药物组合物用于抑制血管生成和治疗与此相关的病理学状态。此类治疗包括给人类施用有效量的本发明中描述的分子。

在本发明的一个实施方案中，识别人VEGF的重组多肽分子可用于治疗恶性瘤形成过程及其转移。在一个优选的实施方案中，它们在治疗血管化的(vascularized)癌、肉瘤和肿瘤方面有效。在实施例12中，应用本发明中描述的分子具有这样的效用，即抑制了移植到无胸腺裸鼠中的人癌的生长。可以使用这种策略来治疗的肿瘤的某些实例包括(但不限于)：表皮样肿瘤、鳞状肿瘤例如头与颈的肿瘤、结肠直肠肿瘤、***肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括小和非小细胞肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。所述分子还应当在治疗其他类型的肿瘤方面有效：例如卡波西肉瘤、中枢神经***的瘤形成(成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移)、黑素瘤、肾癌、胃肠肿瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤和平滑肌肉瘤。

因为本发明中描述的与抗体相关的重组多肽分子显示出使其与贝伐珠单抗相区别的人VEGF-A的表位识别(如实施例5中所显示的)，并且因此在它们干扰人VEGF-A与其受体结合的方式方面不同，所以它们可以产生与其他也通过抑制这种相互作用而起作用的分子不同的体内疗效。得到充分证明的是，使用针对相同抗原而产生的但识别不同表位或对于该抗原具有不同亲和力的抗体，可以达到不同的体内疗效，以及不同的附属治疗效果(Allan D.G.P.2005.The Oncologist 10：760-761)。本领域技术人员还已知，通过与由人源化抗体贝伐珠单抗所鉴定的区域不同的区域来识别人VEGF的分子，可以在VEGF及其受体之间产生干扰效应(Lee，F-H.等人2005.PNAS 102)。

已知抗体和抗体片段例如贝伐珠单抗和雷珠单抗可应用于其他随着过量血管生成而出现的疾病(Gaudreault，J.等人，2005.InvestOphthalmol Visual Sci 46：726-733；Costa，RA等人，2006.InvestigOphthalmol Visual Sci 47：4569-4578)。在本发明的一个实施方案中，所描述的重组多肽分子可用于治疗年龄相关的黄斑变性(湿型)。本发明中描述的分子中的两种，具体地scFv 2H1和scFv₂-Fc 2H1-4.1，在非人灵长类动物实验模型中对于由激光灼伤诱导的脉络膜新血管形成显示出预防和治疗效应(实施例14)。关于所提及的分子相对于现有技术中存在的那些而言在治疗潜力方面的可能差异，必须强调在抗原识别(不同的表位)方面的内在差异，以及scFv 2H1的分子大小为Fab片段雷珠单抗的分子大小的大约一半这一事实，这将允许更好地渗透视网膜层，视网膜层这个组织已被强调对于更好的疗效而言是重要的。此外，scFv₂-Fc 2H1-4.1分子还具有比贝伐珠单抗更小的分子大小，这具有类似的潜在优点。

在本发明的另一个实施方案中，所描述的重组多肽分子或其等价变体，被用于表达VEGF的人类癌症的体内诊断操作程序，例如结肠、肺或乳腺腺癌等等。为此，本发明中描述的对于人VEGF-A特异的多肽分子可以进行放射性标记，并以允许产生图像的试剂的形式进行注射，所述图像显示出在人中表达VEGF-A的肿瘤的存在和定位。为此，将多肽分子如本发明中描述的那些与放射性同位素相联合，并且评估这些与肿瘤的结合。该方法可以包括给人类施用经放射性标记的分子。如在本发明中通过实验所显示的，用¹²⁵I进行放射性标记的scFv 2H1片段结合由移植至无胸腺裸鼠的人肿瘤细胞所表达的人VEGF-A，并在肿瘤区域中特异性地积聚。与表达异常高数量的人VEGF-A的组织的反应性可以用任何合适的方法来进行检测。当将放射性核素如¹²⁵I、¹¹¹In或^99mTc用于标记本发明中描述的多肽分子时，这些优先定位在肿瘤中，而不是正常组织中，并且放射性标记在肿瘤组织中的存在可以使用γ相机或γ计数器来进行检测和定量。获得的肿瘤图像的质量与“信号：背景比”直接相关(Goldenberg DM.1992.Int.J.of Biol.Markers，7；183-188)。在本发明中例示了¹²⁵I的实验使用，但并不限制可能使用其他不同的放射性核素。如果这些放射性核酸具有治疗能力，例如¹³¹I、⁹⁰Y等，那么本发明中描述的经放射性标记的多肽分子可以给患者提供有益的疗效，因为它们停留在产生人VEGF-A的肿瘤的解剖学区域中，并且对于肿瘤细胞、形成肿瘤血管的细胞、以及构成肿瘤基质且产生VEGF-A的其他细胞成分具有作用。

与先前相一致，并且如所述实施例中所暗示的，与其他试剂相偶联的本发明中描述的重组多肽分子或其等价变体，可以是治疗方法的基础，所述治疗方法包括作为药物或药物组合物来施用所述重组多肽分子或其等价变体。采用化学方法或通过基因工程方法与治疗性放射性核素、毒素、药物或生物应答调节剂相偶联的这些分子，可以将所偶联的成分的疗效导向具有异常高浓度的人VEGF-A的解剖学区域(如可以是肿瘤及其紧邻区域)，并发挥疗效。施用的量、施用的频率和施用的间隔均依赖于疾病的性质和严重性，并且这些决定是医学领域的专业人员和其他医生的责任，基于本技术领域已知的知识。

本发明的组合物可以以分离的形式或者以与其他治疗的组合(同时或顺次)来进行施用，这全都依赖于待治疗的疾病。除活性成分之外，药物组合物还包含药学上可接受的媒介物、缓冲液、稳定剂或药物学“载体”，或者本领域技术人员熟知的其他材料。这些材料是无毒的，不干扰活性成分的功效，并且它们的精确性质取决于施用途径是口服、粘膜还是肠胃外(例如，静脉内注射)。

本发明中描述的分子或其等价变体，通过表达编码它们的核酸而产生。因此，编码任一种这些所述多肽分子的核酸序列，以及用于表达此类核酸的操作程序，也是本发明的一部分。在一个优选的实施方案中，所述核酸主要(虽然并非专一地)编码对于分子scFv 2H1、Fab2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2而描述的DNA碱基序列。

为了达到本发明中描述的分子或其等价变体的重组表达，可以选择或构建合适的载体，所述载体包含适合于每种情况的调节序列，所述调节序列包括启动子、终止子、增强子、多腺苷酸化、标记基因及其他有关的序列。所述载体可以是质粒。

附图简述

图1。质粒pACR.1的示意图，该质粒用于在大肠杆菌的周质和培养基中产生可溶性scFv片段。该载体具有LacZ启动子、核糖体结合位点(RBS)和信号肽(SP)pe1B。

图2。编码用pACR.1载体在大肠杆菌中产生的重组抗体片段scFv2H1的DNA序列(SEQ ID No.6)。前354个碱基与人免疫球蛋白重链可变区(VR)(命名为2H1RVCP，SEQ ID No.7)相符，随后为编码连接区段(接头)的48个碱基，接下来为编码人免疫球蛋白轻链VR(命名为2H1RVCL，SEQ ID No.8)的333个碱基，最后为编码由克隆位点所产生的氨基酸、c-myc肽、和由载体自身编码的6个组氨酸的69个碱基。根据Kabat等人(Sequences of Immunological Interest，Department of Health和Public Services，第5版，1991)，加下划线的碱基以下述顺序(从上至下)表示互补决定区(CDR)的注释：重链VR(VH)的CDR1、VH的CDR2、VH的CDR3、轻链VR(VL)的CDR1、VL的CDR2和VL的CDR3。

图3。scFv 2H1在经转化的大肠杆菌BL-21细胞中的表达。从左到右：分子量标准参照物(66、45、35、29、20和14.2kDa；泳道1)；对照scFv(scFv M3；泳道2)；用载体pACR.1-scFv 2H1转化的细菌的培养物上清液(泳道3)，其中可见迁移至大约29kDa的加强条带；以及用空质粒pACR.1转化的细菌的培养物上清液(泳道4)。

图4。使用IMAC来纯化scFv 2H1的结果。图4A是12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，其中(从左到右)：具有大约29kDa的分子大小的对照scFv(scFv M3)(泳道1)，包含scFv2H1的起始材料(泳道2)，和具有高纯度的经洗脱的scFv 2H1(泳道3)。图4B描述了在图4A中显示的SDS-PAGE的重复品的Western印迹。使用针对存在于这些蛋白质中的c-myc结构域的单克隆抗体9E10来进行检测。

图5。竞争ELISA的结果，其中评估了纯化的scFv 2H1阻断可溶性VEGF受体分子(KDR-Fc)接近配体人VEGF-A的能力。VEGF-A被吸附至固相。使用不同浓度(直至80μg/mL)的scFv 2H1。对于乙型肝炎表面抗原特异的scFv(抗-HBsAg scFv)用作阴性对照。在这个测定法中，使用缀合有过氧化物酶的抗-人IgG抗体(Sigma)来检测与VEGF-A结合的KDR-Fc。

图6。质粒pFabHum-1的示意图，该质粒用于在大肠杆菌的周质和培养基中产生Fab类型的可溶性抗体片段。

图7。编码形成Fab片段2H1-32的成熟分子的两条链的DNA序列(SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)，所述两条链在细菌周质中可自我装配。在图7A中，以5′-3′方向显示了编码免疫球蛋白轻链VR的序列，随后为编码免疫球蛋白Cλ恒定结构域的序列。加下划线的碱基以下述顺序(从上至下)表示CDR的注释：轻链VR(VL)的CDR1、VL的CDR2和VL的CDR3。在图7B中，以5′-3′方向显示了编码免疫球蛋白重链VR的序列，随后为编码CH1免疫球蛋白恒定结构域、6个组氨酸和c-myc肽的序列。加下划线的碱基以下述顺序(从上至下)表示CDR的注释：重链VR(VH)的CDR1、VH的CDR2和VH的CDR3。

图8。图8A是质粒pVSJG-HucFc的图谱，所述质粒用于在限制位点Afl II和Xba I之间克隆了scFv片段后，表达“完整抗体”类型的二价分子。图8B是由用包含给定scFv***片段的质粒转染的哺乳动物细胞所产生的分子的图示。

图9。编码被命名为scFv₂-Fc 2H1-4.1的成熟的抗体型分子的DNA序列(SEQ ID No.13)。以5′-3′方向，可见：免疫球蛋白重链可变区，随后为接头和免疫球蛋白轻链可变区，编码10个氨基酸的间隔体，随后为IgG1人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域。加下划线的碱基以下述顺序(从上至下)表示CDR的注释：VH的CDR1、VH的CDR2、VH的CDR3、VL的CDR1、VL的CDR2和VL的CDR3。

图10。编码被命名为scFv₂-Fc 2H1-8.2的成熟的抗体型分子的DNA序列(SEQ ID No.14)。以5′-3′方向，可见：免疫球蛋白重链可变区，随后为接头和免疫球蛋白轻链可变区，编码10个氨基酸的间隔体，随后为IgG1人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域。加下划线的碱基以下述顺序(从上至下)表示CDR的注释：VH的CDR1、VH的CDR2、VH的CDR3、VL的CDR1、VL的CDR2和VL的CDR3。

图11。关于片段scFv 2H1的结合位点，噬菌体展示的肽的特异性识别，如在ELISA测定法中所测定的，在所述ELISA测定法中在过量人VEGF(Peprotech)存在下评估与吸附至固相的片段的结合。该图显示了展示出肽的10个噬菌体克隆，它们是所有35个所研究的克隆所显示出的行为的代表。在该实验中，噬菌体样品在溶液中与或不与VEGF一起进行温育。

图12。主要鉴定出在VEGF-A分子中由scFv 2H1所识别的表位的残基的作图，与文献中描述的其他抗体相关分子相比较。使用显示出处于其二聚体构象的人VEGF-A的三级结构的图，其中具有α螺旋、β链和环。二聚体的两个相同的分子以淡灰色和黑色显现。被定义为由scFv 2H1所识别的表位的主要指示物的残基的位置仅在该二聚体的淡灰色链中进行标示，并且以黑色显现，被表示为范德华(VDW)球体。由其他抗体所识别的残基在图12A至D中被描绘为淡灰色VDW。图12E显示了当比较人和小鼠VEGF-A的序列时，不同的邻接氨基酸的位置(以淡灰色VDW)，相关于由对于scFv 2H1而言的主要指示性残基所定义的表位的位置(以黑色VDW)。

图13。分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc2H1 8.2干扰人VEGF-A对培养中的人脐带静脉血管内皮细胞(HuVEC)的生长刺激效应的能力。纯化的scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H14.1和scFv₂-Fc 2H1 8.2以三种不同的浓度(带条纹的柱：2μg/mL；实心柱：1μg/mL；空心柱：0.5μg/mL)与10ng/mL人VEGF-A(Peprotech)一起加入。

图14。scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc 2H18.2在2.5mg/kg(图14A)和25mg/kg(图14B)的剂量时的抗肿瘤活性。曲线中的点是指对于每组5只动物所评估的肿瘤体积的平均值。阴性对照：以最高剂量的无关的单克隆抗体CB-Hep.1(抗-HBsAg)。

图15。在用经¹²⁵I放射性标记的片段scFv 2H1(黑色柱)或片段scFv Hep.1(空心柱)接种具有衍生自A431细胞的人肿瘤的裸鼠后24小时(每种组织中，前两个柱)和48小时(每种组织中，后两个柱)，注射剂量的百分比/克组织。每个柱表示从获自5只小鼠的器官/组织中回收的计数的平均值。

实施方案详述/实施例

实施例1.与P64K相融合的人VEGF同种型121的克隆、细菌表达和纯化。

(a)人VEGF同种型121的克隆

使用聚合酶链式反应(PCR)来分离和克隆VEGF的同种型121，其中采用Taq DNA聚合酶(Roche)和由制造商推荐的操作程序。表1中呈现的合成的寡核苷酸#1(SEQ ID No.1)和#2(SEQ ID No.2)用作PCR中的引物。

表1.在人VEGF同种型121的PCR中所使用的引物。

寡核苷酸	序列
		#1(SEQ ID No.1)	5’...GATCTGCTAGCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGG...3’
#2(SEQ ID No.2)	5’...GGGGGATCCCCGCCTCGGCTTGTCAC...3’

在这个技术中，所使用的DNA模板是质粒pVEGF(Ojalvo，A.G.等人，2003.Electronic J.Biotechnol.6，208-222)，其事先通过PCR进行修饰，以包括将VEGF氨基酸残基R82、K84和H86置换为谷氨酸的突变。

从2％琼脂糖凝胶中提取出相应于扩增产物的条带。用核酸内切酶Nhe I和BamH1消化条带后，纯化出DNA并克隆到载体pM238(Yero，D.等人，2006.Biotechnol.Appl.Biochem 44：27-34)中。使用该载体，在细菌中所表达的蛋白质是具有脑膜炎奈瑟氏球菌P64K蛋白的N-末端结构域(47个氨基酸)的融合蛋白。对所得到的质粒(P64_47aa-VEGF)进行测序，并且确定其仅包含上文描述的突变，如SEQID No.3中所显示的，相关于由欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecular Biology Laboratory)(www.embl-heidelberg.de)对于相应的经克隆的人VEGF同种型所报道的氨基酸序列而言。

(b)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

从克隆P64_47aa-VEGF中提取质粒DNA，并用于转化大肠杆菌BL21。将所得到的几个菌落接种在含有氨苄青霉素和色氨酸的50mL LB培养基中，并于37℃生长5小时。将25mL这些培养物接种在250mL富含氨苄青霉素的M9培养基中，并于37℃再次温育2小时。通过添加40μg/mL3-β-吲哚丙烯酸来进行温育。8小时后收集细胞，并且在超声波破裂后，目的蛋白保留在沉淀物中。蛋白质的溶解用磷酸钠缓冲液+6M尿素来进行。在Ni-NTA凝胶(QIAGEN)中对上清液实施IMAC。

使用SDS-PAGE来评估洗脱下的级分，显示出26kDa、54kDa和更高的条带，其中前两个条带包含超过98％的在该制备物中的蛋白质。第一个大小相应于单体的大小，第二个相应于二聚体分子，和更高的重量相应于进一步的聚集。洗脱级分在PBS中进行透析，在SuperoseF12(Pharmacia)中实施层析，以专一地选择出被命名为P64_47aa-VEGF的具有更高表观分子量(大约54kDa)的种类。该制备物于-20℃进行冷冻以用于进一步的使用。

(c)融合蛋白P64 _47aa -VEGF的受体结合测定法

用纯化的P64_47aa-VEGF融合蛋白或人VEGF-A(Peprotech)(都以5μg/mL，在PBS中)于4℃包被Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板16小时。于22℃用PBS-4％乳封闭平板1小时。将可溶性人受体KDR-Fc(Sigma)在PBS-4％乳中以不同浓度进行稀释，加入到平板中，并于22℃温育1小时。在反复洗涤后，使用下列物质来揭示受体与包被物的结合：缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG抗体(Sigma)，随后为由0.5mg/mL邻苯二胺和0.015％过氧化氢(在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中)制成的底物溶液。平板在ELISA平板阅读器中于492nm处进行读取，并且对于每个实验样品从三个重复孔中得出平均吸光度值。

表1a显示，可溶性受体的结合局限于用来自Peprotech的非突变型人VEGF-A包被的固相。其中由我们有意引入了三个关键突变(残基R82、K84和H86置换为谷氨酸)的融合蛋白P64_47aa-VEGF不被可溶性KDR所鉴定，这个结果与由Shen等人(Shen，B.等人，1998.J BiolChem 273：29979-29985)所作出的预测相一致，并且使得我们的抗原不同于在文献中所报道的用于开发中和人VEGF的抗体和抗体片段的其他抗原。

表1a.关于KDR-Fc的结合测定法，其中使用VEGF-A或融合蛋白P64_47aa-VEGF作为ELISA中的包被物。

实施例2.用P64_47aa-VEGF蛋白来免疫接种BALB/c小鼠，并评估血清识别商业化的人VEGF同种型121的能力。

通过免疫接种10只8-10周龄的雌性BALB/c小鼠(CENPALAB，Havana)来评估融合蛋白P64_47aa-VEGF产生VEGF中和抗体的潜力。动物用100μg P64_47aa-VEGF蛋白/剂进行免疫接种，其中使用称为VSSP(Estévez F.等人，1999.Vaccine 99：190-197)的佐剂，采用4次皮下剂量(间隔7天)的方案。在最后一次免疫接种后1周，对动物进行抽血并分离出血清，并且以等分试样贮存于-20℃。

为了测定来自用P64_47aa-VEGF免疫接种的小鼠的血清是否具有对于VEGF的特异性抗体，使用人VEGF-A的同种型121(Peprotech)来进行ELISA。后者以1μg/ml(在PBS中)的浓度于4℃在96-孔Maxisorp(Nunc)免疫平板中固定16小时。于22℃用PBS-4％乳封闭平板1小时。使在PBS-4％乳中的系列血清稀释物温育1小时，洗涤平板，并与抗小鼠过氧化物酶缀合物(Sigma)一起温育。反应使用由0.5mg/mL邻苯二胺和0.015％过氧化氢(在柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5中)制成的底物溶液来进行揭示。用P64_47aa-VEGF蛋白免疫接种的动物的血清以高至1∶32,000的滴度特异性地识别商业化的人VEGF。

实施例3.选择针对人VEGF的抗体结合位点。

为了选择针对人VEGF同种型121的结合位点，使用为了本发明特别构建的人单链Fv(scFv)抗体片段的丝状噬菌体展示文库。在这个文库中，在所得到的scFv中存在的人轻链可变区(VR)相应于λVR储库。在根据所公开的操作程序(Rojas G等人，2005.Biochem BiophysRes Comun 336：1207-1213)来构建偏向λVR(Vλ)的这个文库的过程中，从半文库(semi-libray)中回收编码人重链VR储库的基因，并以1∶1的载体：***片段之比连接至另一个Vλ区域半文库的质粒DNA。将连接产物电穿孔到TG1细胞中，从而获得最终的文库。使用与经克隆的scFv的侧翼区相关的寡核苷酸，在30个菌落的样品中测定***片段的存在和大小。

在使用这种新近构建的文库来进行的选择中，采用重组融合蛋白P64_47aa-VEGF作为抗原。符合该文库的噬菌体的混合物先前经历在溶液中使用过量(1mg/mL)P64k的耗竭过程，以去除不希望的对于这种蛋白质特异的scFv。将经耗竭的混合物用于探测固定在Maxisorp(Nunc)免疫管中的P64_47aa-VEGF蛋白。为此，免疫管用在PBS中的10μg/mL该蛋白质于4℃包被过夜，然后用PBS-4％脱脂乳进行封闭。通过用0.1％PBS-Tween溶液洗涤20次，随后用PBS洗涤2次来去除未结合的噬菌体。结合的噬菌体用100mmol/L三乙胺溶液来洗脱10分钟，这立即用0.5mol/L Tris(pH 7.5)来进行中和。洗脱下的噬菌体在大肠杆菌TG1菌株中进行扩增，并用作用于下一个选择循环的起始材料。这个操作程序在相同条件下重复3次。用从第二个和第三个选择循环中洗脱出的噬菌体感染的TG1细胞的随机单个菌落用于以96-孔的规模产生噬菌体。使用ELISA来评估携带scFv抗体片段的这些噬菌体克隆结合P64_47aa-VEGF的能力。用10μg/mL P64_47aa-VEGF来包被Maxisorp(Nunc)96-孔平板，随后进行封闭。使在PBS-4％脱脂乳中洗脱出的噬菌体在平板中于22℃温育1小时，随后为几次洗涤。结合的噬菌体用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体(Amersham)于22℃检测1小时。几次洗涤后，通过添加底物溶液来揭示反应。在微量培养板阅读器中于492nm处读取吸光度。在用ELISA进行评估的96个噬菌体克隆中，87个的结果为阳性。然后，通过PCR来扩增编码scFv抗体片段的DNA，所述scFv抗体片段由在ELISA中结果为阳性的噬菌体克隆所展示；并用酶BstN-I来进行限制性分析。在4％琼脂糖凝胶中检查这种消化的产物。从这个分析中，鉴定出了7种不同的限制图谱，并且选择出了各自的代表性克隆。通过感染于28℃生长16小时的TG1细菌细胞来产生所选择的克隆。用在2.5M NaCl中的PEG 5000溶液来沉淀出包含在培养物上清液中的噬菌体，并以等分试样进行贮存以用于随后的免疫化学表征。

实施例4.在从该文库中选择出的噬菌体中的scFv的免疫化学表征。

(a)人和鼠VEGF的不同同种型的识别

为了测定人VEGF的同种型121和165以及小鼠VEGF的同种型120的特异性识别，对于展示出scFv片段的7个噬菌体克隆实施ELISA测定法。用人VEGF-A的同种型121和165(Peprotech)以及小鼠VEGF的同种型120(R&D)以1μg/ml(在PBS中)的浓度包被免疫平板。在封闭平板后，添加如上所述进行纯化并在PBS-4％脱脂乳中进行稀释的噬菌体，并于22℃温育1小时。几次洗涤后，结合的噬菌体用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体来进行检测。如实施例2中所述来揭示和定量该反应。作为阴性对照，使用符合在进行选择之前的文库的噬菌体混合物的样品，其如上所述进行沉淀。如在表2中可见的，7个所选择的噬菌体克隆特异性地鉴定出人VEGF的同种型121和165。在这些中，克隆2H1-F和3C1不识别鼠VEGF的同种型120。该表显示了当在ELISA中获得的光密度值为阴性对照的至少5倍时被分类为阳性(+)的克隆的识别能力。

表2.在丝状噬菌体中展示的7个scFv克隆

对于人和鼠VEGF-A的不同同种型的识别。

噬菌体克隆    人VEGF-A的    人VEGF-A的    小鼠VEGF-A

              同种型121     同种型165     的同种型120

3C1           +             +             -

2B2           +             +             +

2D2           +             +             +

2E1           +             +             +

3E8           +             +             +

2H1-F         +             +             -

2E3           +             +             +

(b)天然的和还原的人VEGF-A之间的差异识别

使用ELISA来研究关于经由选自该文库的不同抗体片段的识别而言VEGF-A的天然同二聚体折叠的重要性，在所述ELISA中使用人VEGF的同种型121(Peprotech)来包被ELISA平板。在封闭平板后，一半的孔用在PBS-4％乳中的50mM DTT溶液于22℃处理1小时，和另一半仅用PBS-4％乳进行处理。在几次洗涤后，用在PBS-4％乳中的100mM碘乙酰胺处理其中VEGF-A已用DTT溶液还原的孔，并于22℃温育1小时。其余的孔用PBS-4％乳进行维持。在重新洗涤平板后，将在PBS-4％乳中稀释的纯化的噬菌体加入到所有孔中，并于22℃温育1小时。几次洗涤后，结合的噬菌体用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体来进行检测。作为阴性对照，使用符合在进行选择之前的文库的噬菌体混合物的样品。表3显示了3种模式：其中识别不受VEGF还原影响的第一种模式(由克隆3C1例示)，其中可见还原的部分影响的第二种模式(由克隆2B2和3E8例示)，和其中注意到针对还原形式的VEGF的识别被完全取消的第三种模式(由克隆2D2、2E1、2H1-F和2E3例示)。在该实验中依照3个重复孔的平均光密度(492nm)来测量所述克隆识别VEGF-A的能力，将由阴性对照所产生的光密度作为较低的参照。

表3.在丝状噬菌体中展示的7个scFv克隆对于用或不用DTT处理的人VEGF-A的识别。

噬菌体克隆的名称	未处理的人VEGF-A(天然的)	用DTT处理的人VEGF-A(还原的)
			3C1	2.125	2.096
2B2	2.015	0.600
			2D2	1.289	0.121
2E1	1.831	0.142
			3E8	1.109	0.770
2H1-F	1.250	0.103
			2E 3	1.803	0.125
未选择的噬菌体混合物	0.122	0.103

(c)对于人VEGF-A，在可溶形式的VEGF受体(KDR-Fc)和所选择 的噬菌体之间的竞争ELISA

使用竞争ELISA来评估所选择的噬菌体克隆阻断可溶性VEGF受体接近该抗原的能力。为此，用人VEGF-A的同种型121(Peprotech)来包被Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板。封闭平板，并进一步地与在PBS-4％乳中稀释的相应噬菌体的混合物一起进行温育，其中含或不含2g/mL可溶性受体(KDR-Fc，Sigma)。结合的噬菌体使用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体(Amersham)来进行检测。如表4中所示的，表现出更高地阻断了KDR-Fc与VEGF-A结合的克隆是命名为2H1-F的克隆。该表显示了所述克隆识别VEGF-A的能力，如在该实验中依照3个重复孔的平均光密度(492nm)所测量的，将由阴性对照所产生的光密度作为较低的参照。

表4.在各自地将在丝状噬菌体中展示的7个scFv克隆与或不与2μg/mL KDR-Fc混合后，人VEGF-A的识别。

噬菌体克隆的名称	含KDR-Fc2μg/mL	不含KDR-Fc
			3C1	1.269	1.290
2B2	2.261	2.213
			2D2	1.161	1.160
2E1	1.293	1.401
			3E8	0.828	0.993
2H1-F	0.577	1.149
			2E3	0.884	1.088
未选择的噬菌体混合物	0.121	0.115

实施例5.scFv 2H1片段在大肠杆菌中的表达，纯化，以及其对于人VEGF的识别的表征。

(a)将scFv 2H1克隆入DACR.1载体中并测序

pACR.1载体是被设计用于在大肠杆菌的周质中表达抗体片段的质粒(图1)。作为该载体的主要元件，有LacZ启动子、信号肽、用于***片段基因的限制位点NcoI和Not I、编码c-myc肽的结构域、和编码6个组氨酸的序列，后者用于使用IMAC来纯化表达产物。将包含命名为2H1-F的scFv的噬菌粒DNA用作用于PCR的模板。根据制造商的指导，用酶ProofStart(Stratagene)来进行这个操作程序。合成的寡核苷酸#3(SEQ ID No.4)和#4(SEQ ID No.5)用作该操作程序中的引物(表5)。

表5.合成的寡核苷酸，用于扩增和修饰包含在噬菌粒载体中的scFv 2H1-F，以便将其克隆到载体pACR.1中。

寡核苷酸	序列
		#3(SEQ ID No.4)	5’...CTATTCTCCCATGGCACAG...3’
#4(SEQ ID No.5)	5’...TTCTGTATGAGGTTTTGC...3’

使用QIAGEN DNA凝胶提取试剂盒从1％琼脂糖凝胶中纯化出在扩增后获得的具有预期大小(700bp)的条带，用Nco I和Not I(Promega)进行消化，并再次纯化以用于连接。pACR.1载体用Nco I和Not I(Promega)进行消化，并通过使用T4DNA连接酶(Promega)与经消化的条带进行连接。连接产物用于通过电穿孔来转化大肠杆菌感受态细胞(菌株XL-1Blue；Stratagene)。将经转化的细胞在选择性固体培养基上进行铺板，并于37℃进行生长。所采用的方法是众所周知的(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版.1989.Sambrook，Fritsch和Maniatis)。

从不同菌落中纯化出质粒DNA(QIAGEN MiniPrep试剂盒)，并通过用已描述的限制酶进行消化来就期望的连接产物进行检查。选择几个质粒以获得scFv 2H1的DNA共有序列，其中使用自动测序和与载体pACR.1的克隆区域外部杂交的特异性引物。对于命名为scFv 2H1(SEQID No.6)的完全片段(VH-接头-VL-c myc-组氨酸)而获得的DNA共有序列显示在图2中。将代表了这种构建过程的质粒命名为pACR.1-scFv 2H1。这个图呈现了重链VR(命名为2H1RVCP；SEQ ID No.7)和轻链VR(命名为2H1RVCL；SEQ ID No.8)的独个序列。根据Kabat等人的分类，2H1RVCP属于人免疫球蛋白VR的亚组1，和2H1RVCL可以被分类在人免疫球蛋白λ类型VR的几个组中。在该图中加下划线的是根据Kabat等人的分类进行注释的CDR序列。

(b)scFv 2H1在大肠杆菌中的表达

使用pACR.1-scFv 2H1来转化大肠杆菌BL21感受态细胞。该菌株允许在周质和/或培养基中表达异源蛋白质。将转化物在选择性固体培养基上进行铺板，并让其于37℃生长。代表了该构建过程的菌落在液体培养基中进行生长，并当达到1.0的OD_530nm时，使用在培养基中1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导12小时。将细胞离心，并且通过渗透压休克和简短的超声波处理来分离周质内容物。该周质级分和培养物上清液均在12％变性SDS-PAGE中进行评估。该测定法显示表达出了具有超过29kDa的预期表观分子量的蛋白质，当与分子量标准参照物和针对癌胚抗原的scFv[scFv-M3]相比较时；(Pérez L.等人，2006.Biotechnol.Appl.Biochem.43：39-48)(图3)。在培养物上清液中发现了大多数的scFv 2H1片段。

(c)使用IMAC来纯化scFv 2H1片段

使用由pACR.1载体所提供的、在该蛋白质中存在的6-组氨酸结构域来建立纯化操作程序。该序列赋予该蛋白质以非常高的对于金属离子(例如Zn⁺²、Cu⁺²、Ni⁺²)的亲和力，所述金属离子可以螯合至不同的层析支持物。将用pACR.1-scFv 2H1载体转化的细菌进行离心，并且分离出上清液，在偶联缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 7-8)中透析72小时，并直接施加至Agarose-NTA(QIAGEN)。图4A显示，在纯化后获得了在凝胶中迁移略微超过29kDa的高纯度蛋白质。对于获得的级分实施Western印迹法，其中使用针对c-myc肽(其存在于该scFv和对照(scFv-M3)中)的特异性单克隆抗体(9E10)，随后为与过氧化物酶相缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。图4B显示，9E10单克隆抗体检测出scFv 2H1，并且未见显著降解。

(d)在ELISA中scFv 2H1特异性地识别人VEGF

用人VEGF-A的同种型121和165(Peprotech)以及小鼠VEGF的同种型120(R&D)以1μg/ml(在PBS中)的浓度于4℃包被Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板16小时。在用PBS-4％脱脂乳封闭平板后，以不同的在PBS-4％脱脂乳中的浓度添加纯化的scFv 2H1，并于22℃温育1小时。几次洗涤后，添加针对c-myc肽的特异性单克隆抗体(9E10)(1μg/mL)，随后为与辣根过氧化物酶相缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。如在其他实施例中所描述的，揭示并测量该片段与固相中的抗原的结合。将无关的抗-HBsAg scFv用作阴性对照，其以与上文对于scFv 2H1所描述的相似的方式来获得和纯化。表6显示，scFv 2H1保持了原始噬菌体scFv(2H1-F)的特异性识别。该表显示了该片段对于不同VEGF-A的识别能力，依照在该实验中所获得的3个重复孔的平均光密度(492nm)，将由阴性对照所产生的值作为参照。

表6.片段scFv 2H1对于不同同种型的人VEGF-A和小鼠VEGF-A的识别。

片段	人VEGF-A的同种型121	人VEGF-A的同种型165	小鼠VEGF-A的同种型120
				scFv 2H1(20μg/mL)	1.193	1.199	0.110
scFv 2H1(2μg/mL)	1.162	1.087	0.091
				scFv 2H1(0.2μg/mL)	0.753	0.612	0.086
抗-HBsAg scFv(20μg/mL)	0.091	0.095	0.082

(e)对于VEGF-A，在可溶形式的VEGF受体(KDR-Fc)和scFv 2H1 之间的竞争ELISA

使用竞争ELISA来评估纯化的scFv 2H1阻断可溶性VEGF受体接近该抗原的能力。该测定法基于在添加浓度渐增的scFv 2H1后，抑制了KDR-Fc可溶性受体与吸附至固相的人VEGF-A的结合。为此，用在PBS中的人VEGF-A同种型121(Peprotech)于4℃包被Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板16小时。封闭平板，并进一步地与浓度渐增的纯化的scFv 2H1，以及0.5μg/mL可溶性受体(KDR-Fc，Sigma)或单独的媒介物(PBS-4％乳)一起进行温育。将抗-HBsAg scFv用作阴性对照。结合的噬菌体使用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体(Amersham)来进行检测。用与过氧化物酶相缀合的抗人IgG抗体(Sigma)来检测与固相中的人VEGF-A结合的KDR-Fc。如图5中所示，scFv 2H1能够干扰可溶性受体与固相中的人VEGF-A的结合，并且明显依赖于所使用的剂量。

(f)scFv 2H1和阿瓦斯丁的免疫化学比较

就它们鉴定融合蛋白P64_47aa-VEGF的能力而言，将细菌scFv 2H1与贝伐珠单抗(Genentech)进行比较，所述融合蛋白P64_47aa-VEGF最初用于在实施例3中所描述的、产生了scFv 2H1-F的在噬菌体中的抗体选择操作程序。将P64_47aa-VEGF或人VEGF-A(Peprotech)以1μg/ml(在PBS中)的浓度于4℃在Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板中固定16小时。于22℃用PBS-4％乳封闭平板1小时。使纯化的scFv 2H1或贝伐珠单抗在PBS-4％乳中的系列稀释物温育1小时，洗涤平板，并进一步如下进行温育：(i)对于scFv 2H1，与抗c-myc单克隆抗体9E10一起温育，随后为抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma)，和(ii)对于贝伐珠单抗，与缀合有过氧化物酶的山羊抗人IgG抗体(Sigma)一起温育。反应使用由0.5mg/mL邻苯二胺和0.015％过氧化氢(在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中)制成的底物溶液来进行揭示。

如在表6a中可见的，scFv 2H1识别P64_47aa-VEGF和人VEGF-A，而贝伐珠单抗仅能够识别Peprotech的人VEGF-A，所述表6a描绘了在ELISA平板阅读器中获得的在492nm处的平均吸光度值，其中每种所研究的样品采用3个重复孔。

无关的抗-HBsAg scFv和TheraCIM(抗EGF受体的人源化的IgG1抗体；CIMAB SA，Havana)用作阴性对照。

表6a.片段scFv 2H1和贝伐珠单抗针对P64_47aa-VEGF和人VEGF-A同种型121的免疫反应性。

抗体相关分子	人VEGF-A的同种型121	P6447aa-VEGF
			scFv 2H1(20μg/mL)	1.880	1.678
scFv 2H1(2μg/mL)	1.480	1.113
			scFv 2H1(0.2μg/mL)	0.610	0.490
贝伐珠单抗(20μg/mL)	3.201	0.145

贝伐珠单抗(2μg/mL)	2.907	0.127
			贝伐珠单抗(0.2μg/mL)	1.885	0.110
抗-HBsAg scFv(20μg/mL)	0.067	0.085
			TheraCIM(20μg/mL)	0.097	0.112

实施例6.scFv 2H1在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达以及其对于人VEGF的识别的证实。

(a)将scFv基因克隆到pPS9载体中

用NcoI/XbaI从pACR.1-2H1从载体中消化出编码scFv 2H1的基因，以用于克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPS9中。质粒pPS9是整合载体，其包含相应于醇氧化酶(AOX.1)的启动子的1.15kb片段，随后为编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的蔗糖转化酶(sucII)的分泌信号的基因、多克隆位点、用于转录终止的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapt)的960bp片段、和作为选择标记的酿酒酵母的HIS3基因。该载体还包含相应于AOX.1基因的3′序列的2.1kb片段。将所有这些元件***pUC18载体中(EP0438200 A1)。

在scFv-2H1基因的NcoI/XbaI消化及其从琼脂糖凝胶中纯化后，将所得到的序列与事先用NcoI/SpeI消化的pPS9相连接，并将连接产物用于转化大肠杆菌XL-1 Blue菌株。通过使用在启动子区域中杂交的引物的菌落PCR来分析分离的经转化的菌落，并且选择包含***片段的那些。如在其他实施例中所报告的来进行测序。对于命名为pPS2H1-12和pPS2H1-13的重组质粒所获得的序列是相同的，并且包含在SEQ ID No.6中所报告的scFv 2H1的序列。

用这两种质粒(事先用PvuII[Promega]消化)来获得巴斯德毕赤酵母重组菌株，其中使用电穿孔以及野生型菌株MP36 his 3(YongV.等人，1992.Biotechnol.Applic.9：55-61)和用于选择的缺乏组氨酸的基本培养基。由于所述具有特定位点的质粒在巴斯德毕赤酵母基因组中有着不同的重组机制，因而分离到了两种不同表型的分泌型菌株：(a)其中AOX.1基因在重组过程中未受影响，因而能够在甲醇中生长且显示出与野生型菌株相似的行为的菌株(Mut+)，和(b)其中AOX.1基因被表达盒替换并且在甲醇存在下显示出缓慢生长的菌株(Mut s)。

(b)表达研究

从在选择性培养基平板中生长的原养型His⁺菌落开始，进行关于该抗体片段的表达研究。在50mL管中的10mL经缓冲的丰富培养基中，在28℃和150rpm下，使菌落进行生长。当培养物达到2的OD(600nm)时，将它们在2000rpm下离心10分钟。使细胞粒状沉淀重悬浮于10mL丰富培养基中，其中使用甲醇代替甘油作为唯一的碳源。从那时候起和随后的96小时，通过每天向培养物中添加纯甲醇直至1％，来诱导目的蛋白。用空载体转化的MP36his3菌株用作阴性对照。

当诱导结束时，将细胞进行离心并收集经代谢的培养基，再次离心以为了最后澄清，并且使用15％SDS-PAGE来检测scFv 2H1。该测定法揭示，在所述两种情况下均存在有具有预期表观分子量(29kDa)的蛋白质，所述蛋白质随后通过Western印迹法来进行评估，其中使用单克隆抗体(Mab)9E10作为一抗，随后为与过氧化物酶相缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。所述两种重组蛋白质通过Mab 9E10来进行鉴定。

(c)在ELISA中scFv 2H1对于人VEGF-A的识别

使用在固相、试剂、包被、温育、显色和对照条件方面与上文对于源自大肠杆菌的scFv 2H1所描述的ELISA测定法相似的ELISA测定法。添加经诱导的重组酵母菌株的经代谢的培养物样品(在PBS-1％乳中稀释)，并在室温下温育2小时。作为阴性对照，使用野生型菌株MP36 his 3的经代谢的培养基和无关的抗-HBsAg scFv。作为阳性对照，使用细菌衍生的纯化的scFv 2H1片段。为阴性对照所产生的吸光度至少4倍的吸光度值被视为是阳性的。就它们识别与固相结合的人VEGF-A的能力而言，具有在诱导经转化的巴斯德毕赤酵母细胞后产生的scFv 2H1片段(命名为scFv 2H1-Pp17)的经代谢的培养基样品是阳性的。

实施例7.使用scFv 2H1的可变区(VR)来获得细菌Fab片段并且表征其对于人VEGF的识别。

(a)将scFv 2H1的VR克隆到pFabHum-1载体中并测序

图6是质粒pFabHum-1的示意图，该质粒用于在大肠杆菌的周质和培养基中产生Fab类型的抗体片段。该载体具有LacZ启动子，RBS，信号肽的序列(PS)，用于克隆轻链可变区(VR)的位点(Sal I和Avr II)，编码人免疫球蛋白Cλ结构域的序列，随后为另一个RBS和PS序列，用于克隆重链VR的位点(Apa LI和Bst EII)，随后为编码人免疫球蛋白CH1结构域的序列，预期包括人IgG1铰链区的第一个半胱氨酸。表达出VR-CH1蛋白，其与用于IMAC纯化的6-组氨酸结构域和用于分析目的的c-myc肽相联合，6-组氨酸结构域和c-myc肽这两者都在其C-末端处并且由该载体提供。

首先用Sal I和Avr II消化相应于携带有命名为2H1-F的scFv的噬菌粒的DNA，以获得轻链VR。在1.5％琼脂糖凝胶中检查其大小后，在pFabHum-1中进行克隆。一旦使用限制酶验证了该克隆过程后，就对所得质粒(命名为pFab-Hum-1 RVL)进行复制、纯化并经历使用Apa LI和Bst EII的新的消化。在Bst EII的情况下，消化是部分的。一旦在1.5％琼脂糖凝胶中验证了条带的大小后，就在pFab Hum-1RVL中进行克隆。使用限制酶来验证该克隆过程，并且将所得质粒命名为pFab 2H1-32。对该质粒进行复制、纯化并经历自动测序。编码成熟的Fab 2H1-32蛋白的DNA序列显示在图7中。图7A显示了相应于轻链VR和Cλ的组合的序列(SEQ ID No.9)，和图7B显示了相应于重链VR和CH1的组合的序列(SEQ ID No.10)。CDR以下划线显示，其根据Kabat等人的分类进行注释。

(b)Fab在大肠杆菌中的表达

使用质粒pFab 2H1-32来转化大肠杆菌BL21感受态细胞。将转化物在选择性固体培养基上进行铺板，并让其于37℃生长16小时。代表性菌落在液体培养基中进行生长，并且在达到1的OD_530nm后，使用1mM IPTG来诱导该培养物12小时。将细胞离心，并通过渗透压休克和简短的超声波处理来分离周质内容物，并且周质级分和上清液均在12％SDS-PAGE中进行分析。该测定法揭示出存在有具有预期大小(大约50kDa)的蛋白质，所述蛋白质随后通过Western印迹法来进行评估，其中使用针对c-myc肽的单克隆抗体(9E10)作为一抗，随后为与过氧化物酶相缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。Western印迹显示，9E10抗体在培养物上清液和周质样品中均检测出具有预期大小的蛋白质。

(c)使用IMAC来纯化Fab 2H1-32并通过ELISA来表征VEGF识别

将通过用pFab 2H1-32进行转化而产生的重组细菌进行离心，并将上清液逆偶联缓冲液透析72小时。将包含Fab的制备物直接施加至Agarose-NTA(QIAGEN)。在洗涤以去除大肠杆菌污染物后，在洗脱级分中以接近于85％的纯度(通过12％SDS-PAGE所评估的)获得Fab2H1-32。

使用ELISA测定法，就其识别人VEGF的能力来评估纯化的Fab片段。用人VEGF-A的同种型121和165(Peprotech)或小鼠VEGF-A的同种型120(R&D)以1μg/mL包被Maxisorp(Nunc)96-孔平板。稀释纯化的Fab片段，并于22℃温育1小时。在洗涤后，添加抗c-myc肽的单克隆抗体(1μg/mL)，随后为缀合有过氧化物酶的兔抗小鼠IgG抗体(Sigma)。将抗-HBsAg scFv用作阴性对照，并且将纯化的细菌scFv 2H1用作阳性对照。如表7中所显示的，在大肠杆菌中产生的Fab在ELISA中特异性地识别人VEGF。该表显示了Fab Fab 2H1-32片段对于不同的VEGF-A同种型的识别能力，在该实验中所获得的3个重复孔的平均光密度(492nm)，将由阴性对照所产生的值作为参照。

表7.片段Fab 2H1-32对于不同同种型的人VEGF-A和小鼠VEGF-A的识别。

片段	人VEGF-A的同种型121	人VEGF-A的同种型165	小鼠VEGF-A的同种型120
				Fab 2H1-32(20μg/mL)	1.020	1.101	0.089
Fab 2H1-32(2μg/mL)	1.087	1.065	0.090
				Fab 2H1-32(0.2μg/mL)	0.675	0.645	0.070
抗-HBsAg scFv(20μg/mL)	0.087	0.078	0.083
				scFv 2H1(2μg/mL)	1.098	1.076	0.082

实施例8.包含与人IgG1 Fc片段在基因上相融合的两个单元的scFv片段的二聚体分子的获得和识别表征。

(a)获得产生抗-VEGF scFv ₂ -Fc分子的转染瘤

为了获得具有两个相同的由scFv 2H1所限定的结合位点的“完整抗体”类型的分子，通过使用包含scFv 2H1的基因序列的质粒pACR.1-scFv 2H1作为模板以及表8中所呈现的引物#5(SEQ ID No.10)和#6(SEQ ID No.11)来进行PCR，以便修饰编码该抗体片段的DNA序列且使得其适合于随后的克隆。这个操作程序用PanoTaq(Panorama Inc.)来进行，并根据制造商的指导。

表8.PCR引物，用于修饰pACR.1-scFv 2H1，以便将其克隆到pVSJG-HucFc中。

合成的寡核苷酸	序列
		#5(SEQ ID No.11)	5’...ACAGGGCTTAAGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG...3’
#6(SEQ ID No.12)	5’...TGTTGTTCTAGAACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC...3’

将经扩增的DNA克隆在载体pVSJG-HucFc中。该载体描绘在图8A中，并被设计用于在哺乳动物细胞中表达多肽链，所述多肽链以下述顺序包含：鼠类单克隆抗体的重链的前导序列(信号肽)，随后为scFv片段，10氨基酸间隔体，以及形成人IgG1免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域的共有序列。前导序列将该链导向内质网，在那里它通过在铰链区中形成二硫键，以及两个相同多肽的CH2和CH3区域的互补结合而进行二聚化。如此，所述铰链、CH2和CH3结构域形成人免疫球蛋白的Fc，通过其N-末端连接有两个相同的scFv，这将其转化为“完整抗体”类型的二价分子(图8B)。在该载体的主要特征中，包括存在巨细胞病毒启动子。

用Af1 II和Xba I来消化相应于扩增产物的条带，并克隆到事先用相同酶消化的pVSJG-HucFc中。在由于转化而获得的细菌菌落中，选择两个用于测序。自动化测序表明，这两个菌落产生几乎相同的重组质粒，其被命名为scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2。在这两个质粒中序列的唯一差异是，前者具有1个在所编码的氨基酸方面“沉默的”不同的重链VR碱基，和3个不同的轻链VR碱基，均相对于scFv2H1的VR序列(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)。编码成熟的scFv₂-Fc2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2蛋白的序列分别显示在图9(SEQ ID No.13)和图10(SEQ ID No.14)中。在该图中，CDR序列是加下划线的，并且根据Kabat等人的分类进行注释。

使用Pure Yield Plasmid Midiprep(Promega)***，在无内毒素的条件下纯化这两种质粒，并用于通过使用SuperFect(QIAGEN)来转染P3/x63.Ag8.653骨髓瘤细胞。通过ELISA来评估从对G418具有抗性的细胞发展出的转染瘤的上清液。用人VEGF的同种型121(Peprotech)包被Maxisorp(Nunc)96-孔免疫平板。将转染瘤集落的上清液在PBS-2％乳中进行稀释并加入到平板中，并且用缀合有过氧化物酶的抗人Fc抗体(Sigma)来检测scFv₂-Fc类型的抗-VEGF分子的存在。重复克隆分泌较高量的抗-VEGF scFv₂-Fc分子(如通过ELISA所检测的)的转染瘤细胞集落，这通过在G418存在下进行有限稀释并且始终在ELISA中评估所选择的克隆产生抗人VEGF信号的能力来施行。在两次独立和连续的克隆后，获得两个稳定的克隆，其产生命名为scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2的scFv₂-Fc。

(b)纯化scFv ₂ -Fc 2H1-4.1和scFv ₂ -Fc 2H1-8.2，并在ELISA中评 估它们识别人VEGF的能力

在162cm²烧瓶中，在10％胎牛血清存在下培养产生scFv₂-Fc2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2分子的转染瘤克隆，并且在达到高细胞密度后收集上清液。将上清液在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中进行1∶1稀释，并且通过采用Protein A Sepharose Fast Flow 4(Amersham)的亲和层析独立地进行纯化。在0.2M甘氨酸(pH 4.0)缓冲液中洗脱scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2分子，并用1MTris(pH 10.0)进行快速中和。在逆PBS进行透析后，使用在280nm处的UV吸光度来计算浓度，并且通过12％SDS-PAGE来评估纯度。确定，所述制备物具有超过85％的纯度。如上所述，将纯化的分子施加至ELISA，其中与未纯化的上清液相比较，显示出这两种经纯化的制备物都能够识别人VEGF-A。

实施例9.鉴定由scFv 2H1所识别的人VEGF的表位。

(a)从展示在丝状噬菌体中的组合肽文库中选择由scFv 2H1所识别 的肽

为了鉴定由scFv 2H1所识别的人VEGF-A的表位，依照使scFv 2H1面对展示在丝状噬菌体中的组合12-氨基酸线性肽文库的策略(Combinatoria Molecular.Santiago Vispo，N.(编辑)ElfosScientiae，2004，La Havana)。将在PBS-4％脱脂乳中稀释的构成该文库的噬菌体混合物加入到免疫管(Nunc，Maxisorp)中，在所述免疫管中已固定了纯化的scFv 2H1。所述管已用scFv进行包被，并且固相进一步用PBS-4％脱脂乳进行封闭。通过用PBS-0.1％Tween溶液洗涤20次，随后用PBS洗涤2次来去除不与免疫管中的scFv结合的噬菌体。结合的噬菌体用100mmol/L三乙胺溶液来进行洗脱，这立即用0.5mol/L Tris(pH 7.5)进行中和。洗脱下的噬菌体在TG1细菌中进行扩增，并用作用于新的选择循环的起始材料。这个操作程序在相似条件下重复3次。用从第二个和第三个选择循环中洗脱出的噬菌体感染的TG1细胞的随机菌落用于以96-孔的规模产生噬菌体。

使用噬菌体ELISA来评估这些展示出肽的噬菌体克隆结合scFv2H1的能力。用scFv 2H1来包被Maxisorp(Nunc)96-孔平板，随后进行封闭。将由单个孔所产生的噬菌体在PBS-4％脱脂乳中进行稀释，并且在所述平板中于22℃温育1小时，随后为用PBS-0.1％Tween进行几次洗涤。结合的噬菌体使用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体(Amersham)来进行检测。在ELISA中所测定的40个噬菌体克隆中，35个结果为阳性，并且在下面的方法中使用。

(b)关于scFv 2H1结合的竞争ELISA

为了测试所选择的35个展示出肽的噬菌体克隆是否特异性地识别scFv 2H1的结合位点，进行ELISA，其中在噬菌体上的肽与VEGF-A竞争结合包被在固相上的scFv 2H1。用10μg scFv 2H1/孔来包被Maxisorp(Nunc)96-孔平板，随后进行封闭。一半的孔用在PBS-4％脱脂乳中的10μg/mL VEGF(Peprotech)进行温育，并且在用PBS-0.1％Tween洗涤几次后，添加在PBS-4％脱脂乳中稀释的噬菌体制备物(包含10μg/mL VEGF(Peprotech))，其在类似于已描述的那些条件的条件下进行温育。同时地，另一半的孔用PBS-脱脂乳进行温育，并且在用PBS-0.1％Tween洗涤几次后，添加在PBS-4％脱脂乳中稀释的噬菌体制备物。结合的噬菌体使用缀合有过氧化物酶的抗-M13抗体(Amersham)来进行检测。如图11中可见的，对于所研究的克隆的样品而言，VEGF的存在完全干扰了展示在噬菌体中的肽与固定化的scFv 2H1的结合。

(c)肽测序

将在上文提及的操作程序中表征的35个肽噬菌体克隆中的20个的样品用于提取噬菌粒DNA，以用于自动测序。对于20个所研究的克隆而获得的序列是相同的，这些是CCRTLMLLQYHR(SEQ ID No.15)。

(d)由scFv 2H1所识别的表位的预测研究

使用程序FINDEPI(http://www.biocomp.cigb.edu.cu/findepi)和3D Epitope Explorer(Schreiber A.J.2005.ComputChem 26：879-887)来分析上文获得的序列，具有类似的结果。前者是预测参与蛋白质-蛋白质相互作用的表面蛋白质斑片(patch)的计算方法。作为输入数据，该方法使用相互作用对中的元件之一的3D结构(模板蛋白质；在我们的情况下，为来自PDB蛋白质数据库(代码1BJ1)的人VEGF-A)，和在所述相互作用中的第二个元件的氨基酸序列(结合蛋白；在我们的情况下，为肽CCRTLMLLQYHR；SEQ ID No.15)。作为例子，FINDEPI程序通过应用许多立体化学规则而产生在模板蛋白质中每个表面斑片的可能模拟表位的数据库。使用特性谱(profile)比对法来探究该数据库，以检测与由于其的结合而在实验上选择出的肽可能相似的模拟表位。在应用分组算法后，该程序报告了一系列在模板蛋白质的表面上暴露的残基，其可能位于所述两个蛋白质的相互作用界面中。该方法的确定性已使用其晶体学结构为已知的蛋白质-蛋白质复合物进行了评估，并且对于所述蛋白质-蛋白质复合物可获得关于被这些分子所结合的肽的序列的实验数据。

所使用的这两种程序定义了相似的在人VEGF-A分子中的相互作用区域，所述区域主要包含残基C102、C57、R56、T31和L32(根据PDB蛋白质数据库(代码1BJ1)进行注释的)。在本发明中考虑了，这些残基是由scFv 2H1所识别的表位的主要指示物。根据该预测，其他残基也可以显示出与上文提及的主要指示性残基相关，然而具有较低的得分，这些是G59、C68、V69、P70和H99。主要通过残基C102、C57、R56、T31和L32限定的表位与对于其他中和人VEGF的抗体和抗体片段所报道的那些不一致(Muller AY等人，1997.PNAS 94：7192-7197；Muller AY.等人，1998.Structure 6：1153-1167；SchaeppiJ.-M.等人，1999.J Cancer Res Clin Oncol 125：336-342；Fuh G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631；WO2005012359)。如果考虑实施例4中显示的实验的结果(所述结果表明，当对所述抗原进行处理以还原二硫键从而将二聚体分开成单体时，scFv 2H1对于人VEGF-A的识别丧失)，那么主要通过残基C102、C57、R56、T31和L32限定的表位可能与VEGF-A的二聚体结构的保守性相关。

图12显示了主要地限定出在VEGF-A分子中由scFv 2H1所识别的表位的残基的作图，与对于其他抗体所描述的那些相比较。采用代表了处于其二聚体构象的人VEGF-A三级结构的卡通(cartoon)类型的图，具有α螺旋、β链和环。二聚体的两个相同的分子以淡灰色和黑色显现。为了简化，被定义为由scFv 2H1所识别的表位的主要指示物的残基的位置仅在淡灰色链中进行标示，并且以黑色显现，被表示为范德华(VDW)球体。由其他抗体所识别的残基在图12A至12D中显示为淡灰色VDW。图12A和12B显示，由关于scFv 2H1的主要指示性残基所限定的表位是邻接的，但不与对于Fab G6和B20-4所定义的表位(Fuh G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631)重叠。图12C显示，由关于scFv 2H1的主要指示性残基所限定的表位非常不同，并且与对于人源化抗体贝伐珠单抗(商业上称为阿瓦斯丁)所定义的表位在结构上相距较远。图12D显示，由关于scFv 2H1的主要指示性残基所限定的表位与对于抗体3.2E3.1.1所定义的表位(Muller AY等人，1997.PNAS 94：7192-7197)在结构上不重叠。

图12E显示了当比较人和小鼠VEGF-A的序列时，不同的邻接氨基酸(以淡灰色VDW)的位置，相关于由对于scFv 2H1而言的主要指示性残基C102、C57、R56、T31和L32所定义的表位的位置(以黑色VDW)。在现有技术中已知，给定表位的邻接残基对于其三级结构投射(projection)是关键的，并因而对于其被抗体的识别是关键的，并且单个氨基酸的改变足以决定抗体对于给定物种的分子的特异性，相对于另一个物种而言(Fuh G.等人，2006.J Biol Chem 281：6625-6631)。这些结果可以解释scFv 2H1片段为何不识别小鼠VEGF-A。

所有这些要素表明，由构成scFv 2H1片段的VR所限定的抗原结合位点不同于在文献中报道的其他中和人VEGF的抗体和抗体片段的抗原结合位点，不仅在氨基酸序列方面，而且还在该抗原中被识别的表位方面，并且因此，在其干扰天然人VEGF的生物学功能的可能的机制方面不同。

实施例10.在用人VEGF刺激的人脐带内皮细胞模型中，评估识别人VEGF的不同分子的体外抗增殖效应。

在用人VEGF刺激的人脐带静脉内皮细胞(HuVEC)模型中测定分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2的体外抗增殖效应。简而言之，在事先用1％明胶(Sigma)进行包被的96-孔培养板(Costar)的每个孔中，在补充有1％(v/v)胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基中，将3,000个HuVEC细胞(PromoCellGmbH)进行铺板，并于37℃在5％CO₂中生长24小时。用补充有10ng/mL人VEGF-A(Peprotech)的新鲜培养基来刺激细胞，并与不同浓度的分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2一起进行温育。

图13显示了在10ng/mL人VEGF-A存在下生长的HuVEC细胞的增殖，其被人为地定义为100％(无干扰的增殖对照，VEGF柱)；以及当将纯化的分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc2H1 8.2的混合物以三种不同的浓度(带条纹的柱：2μg/mL；实心柱：1μg/mL；和空心柱：0.5μg/mL)与10ng/mL人VEGF-A(Peprotech)一起添加至细胞时HuVEC细胞的增殖。作为抑制对照，使用具有0.5μg/mL可溶性受体KDR-Fc(Sigma)的混合物。作为阴性对照，在混合物中使用抗-HBsAg scFv。在温育72小时后，细胞用在20％甲醇中的0.5％结晶紫进行染色。用水洗涤平板，并风干。染色用在0.1M柠檬酸钠中的1∶1乙醇溶液进行洗脱，并在平板阅读器中于562nm处读取吸光度。对于所有平板值扣除基础细胞增殖吸光度值，并且将数据表示为相对于最大增殖对照而言的抑制百分比。如图13中所示，分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc 2H1 8.2以剂量依赖方式抑制HuVEC细胞的增殖，其中值为45-58％。

实施例11.在小鼠中的皮下基质胶栓模型中，评估识别人VEGF的不同分子的体内抗血管生成效应。

在由Passaniti等人(Passaniti A等人，1992.Lab Invest.67：519-28)所描述的实验模型中研究分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2的体内抗血管生成效应。在这个模型中，通过在促血管生成因子存在下，用细胞外基质的蛋白质提取物(Matrigel，Becton Dickinson)皮下接种C57Bl/6小鼠来诱导血管生成。将动物分成10只的组，并且在腹部区域中皮下注射500μL基质胶，所述基质胶包含100ng人VEGF(Peprotech)，和不同浓度的待分析的分子，包括无关抗体(CB-Hep.1，抗-HBsAg，Heber Biotec，Havana)。在6天后，处死动物，取出基质胶栓，并且根据制造商的指导，使用Drabkin’s试剂盒(Sigma)，通过Drabkin方法来测定各自的血红蛋白含量。分子scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2显著(p＜0.001)抑制在基质胶栓中由人VEGF所诱导的血管化，这与血红蛋白含量的降低相关。

实施例12.在用A431人肿瘤细胞异种移植的裸鼠模型中，评估识别人VEGF的不同分子的体内抗血管生成效应。

因为由肿瘤和某些肿瘤基质细胞所诱导的血管生成对于其生长和散布是必需的，并且这种血管生成主要是由于这些细胞要素所产生的VEGF，所以用于分析抗血管生成物质的有效模型是在动物中抑制肿瘤生长的模型。因为scFv 2H1以及衍生自其VR的所有其他分子鉴定人而非小鼠VEGF，所以用接种至同基因无胸腺小鼠(裸鼠；nu/nu)中的人肿瘤细胞来建立小鼠中的肿瘤生长模型。在该实验中，使用了9个组，每个组具有5只BALB/c品系的nu/nu无胸腺小鼠(CENPALAB，Havana)，具有8-10周的年龄。对于待测试的四种分子(scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2)中的每一种组建治疗组，其中考虑了两个剂量水平：25mg/kg小鼠和2.5mg/kg小鼠，在PBS pH 7.2中。第9个组(阴性对照)用媒介物(PBS pH 7.2)进行治疗。小鼠用5×10⁶个人A431肿瘤细胞(ATCC，CRL 1555)在右侧背部区域中进行皮下注射。当肿瘤达到200mm³的体积时，将小鼠随机化到9个组(每组5只)中，并且如对于每个实验组所指示的开始进行治疗。在3周内每2天，以200μL的体积进行腹膜内施用。对照用无关的鼠类单克隆抗体CB-Hep.1以最高剂量进行接种。通过使用数字测径器测量最高(长度)和最低(宽度)的肿瘤直径来进行肿瘤生长的追踪观察。如下计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝0.52×长度(mm)×宽度²(mm)。沿着所述观察期，对于所有组，使用作为stadigraph的单向ANOVA和Bonferroni后检验来比较肿瘤体积。在确定的治疗期后，处死动物并通过手术取出肿瘤，并且使用苏木精和伊红进行组织学分析。

如图14中所示，用scFv 2H1、Fab 2H1-32、scFv₂-Fc 2H1-4.1和scFv₂-Fc 2H1-8.2接种的所有动物都显示出相对于阴性对照而言统计上显著的肿瘤体积减少，和明显的剂量依赖性。在所述四种分子中，scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc 2H1 8.2给出最佳结果，这可能与更高的分子大小相关，这样的分子大小增加了其生物利用率，尽管就结合位点的数目/单位质量而言，scFv 2H1具有超过这些分子的微弱优势。对于Fab和scFv 2 H1片段所发现的差异不是统计上显著的，尽管分子量几乎是两倍(有利于Fab)。这可能是由于下述事实，对于其效应相比于直接影响肿瘤细胞而言更多地基于中和可溶性分子的抗体，肿瘤渗透(据推测，具有较小的尺寸会更好)不如生物利用率一样关键，所述生物利用率对于“IgG-类型”的分子例如scFv₂-Fc 2H1 4.1和scFv₂-Fc 2H1 8.2而言是受益的，因为存在有与由FcRn介导的再循环相容的Fc(Vaccaro C.等人，2005.Nature Biotechnol 23：1283-1288)。对于该性质，scFv和Fab片段并非如此不同，因为两者都缺乏Fc。组织学分析显示，经治疗的小鼠的肿瘤的血管密度显著降低，血管直径减小，肿瘤细胞凋亡增加，和有丝***象减少。

实施例13.使用用A431细胞进行接种的裸鼠，¹²⁵I-放射性标记的scFv2H1片段选择性地停留在肿瘤区域中的能力。

为了测定scFv 2H1片段停留在其中A431细胞正在生长的区域中的能力，使用Iodogen操作程序(Fraker PJ，Speck JC Jr.1978.Biochem Biophys Res Comm 80：849-857)，将该片段和对照片段(鼠类抗-乙型肝炎表面抗原scFv；scFv-Hep.1)用¹²⁵I(Amersham，UK)进行标记，以达到分别为1.3MBq/5μg和1.28MBq/5μg的最终比活性。

在薄层层析中分析经放射性标记的产物，以检测向蛋白质中的掺入，分别报告了93％和95％的放射性值。经放射性标记的产物检测其相应抗原(人VEGF和HBsAg)的能力在这样的***中进行研究，在所述***中用重组人VEGF同种型121(5μg/mL；Peprotech)或重组HBsAg(5μg/mL；Heber Biotec，Havana)包被聚苯乙烯免疫管，封闭所述免疫管，并将其与具有相应特异性的经放射性标记的片段的样品(调整至在理论上可以被固相捕获的量)进行接触。在温育和洗涤后，测定出分别对于scFv 2H1和scFv-Hep.1而言所述固相能够结合84％和82％的放射性，这显示所述放射性标记操作过程并未明显地改变所述片段的生物活性。

为了研究生物分布，使用20只nu/nu小鼠。所述动物用5×10⁶个A431系的人肿瘤细胞在右侧背部区域中进行皮下接种。当肿瘤达到大约300mm³的体积时，将动物随机化到4个组(每组5只)中，并开始进行治疗。通过尾静脉给小鼠注射经放射性标记的产物(10只小鼠用scFv 2H1，和10只小鼠用scFv Hep.1)，并在24和48小时后，对于每种产物以5只一组进行处死。通过手术取出肿瘤和下列正常组织：脾、肝、肾、肠、肌肉、骨髓和血液。将放射性的积聚表示为注射剂量的百分比/克组织。使用注射剂量的标准样品来进行校正。使用闪烁γ计数器来测量放射性。

图15显示了，相对于所注射的总放射性，在不同时间点上在每种所研究的组织中回收的放射性的百分比。连同在表9中对于肿瘤：血液放射性比的特定情况而概括出的结果一起，该实验显示，与非特异性的scFv Hep.1不同，从注射后24到48小时，scFv 2H1片段优先定位于肿瘤组织中。

表9.关于移植有表达人VEGF的A431人肿瘤细胞的裸鼠，肿瘤：血液放射性比。

分子	24小时	48小时
			scFv 2H1	33.3	30.0
scFv-Hep.1	0.4	1.0

这些结果暗示，scFv 2H1片段可以特异性地定位于其中存在高局部浓度的人VEGF的解剖学区域中，如在A431肿瘤中，并因此可用于将不同的治疗产品(例如放射性同位素，或者任选地毒素或药物)特异性地递送至该区域。所述值相应于在给动物注射不同的经¹²⁵I放射性标记的分子后24和48小时。从源自从5只小鼠回收的组织的平均值开始来计算每个比率。

实施例14.使用片段scFv 2H1和二价分子scFv₂-Fc 2H1-4.1在非人灵长类动物中防止实验性脉络膜新血管形成(CNV)。

作为用于实验性脉络膜新血管形成(CNV)的模型，采用由Krzystolik等人(Krzystolik M.G.等人，2006.Acta Ophthalmol，120：338-346)所报道的那种。6只恒河猴(食蟹猴(Ma ca cafascicularis)，CENPALAB，Havana)根据“研究机构良好实验动物实践指导”来进行维持和操作。对于所有操作程序均通过肌内注射盐酸***、马来酸乙酰丙嗪和硫酸阿托品来麻醉动物。还采用使用盐酸丙美卡因的局部麻醉。在摘出术之前和用于安乐死的麻醉使用静脉内的戊巴比妥钠来完成。使用氩激光灼伤在斑(macula)中诱导CNV膜，要确保所述操作程序产生水疱和少量出血，采用50-100μm的施加点。将照相术和荧光血管造影术用于检测和测量损伤的延伸和特征。在应用所述片段和安慰剂以及激光灼伤操作程序之前和之后不同天数时，以及在以摘除术和处死动物作为结束的该实验结束时，检查动物的眼睛。

根据待研究的分子，将动物分成2个组(每组3只)：抗体片段scFv 2H1，或免疫球蛋白类型的二价分子scFv₂-Fc 2H1-4.1。根据组，每只动物的右眼通过静脉内注射接受在50μL PBS中的500μg scFv2H1或scFv₂-Fc 2H1-4.1，而左眼仅用媒介物进行注射。眼在激光处理前(第0和14天)接受2次注射。在第21天时，所有眼接受激光处理以诱导CNV。在第2天，用特定产物或媒介物在每只眼中重复进行注射。在激光诱导后3周(第42天)，动物接受静脉内注射，这次根据组都用片段scFv 2H1或scFv₂-Fc 2H1-4.1，到第56天时以最后的类似注射结束。

在处理的阶段I中(在第42天之前)，所述研究显示了与各自的对照眼比较，在其中施用了scFv 2H1或scFv₂-Fc 2H1-4.1的眼中4级损伤的发作减少，所有这些均暗示所述分子帮助防止CNV。在处理的第二个阶段中，当所有眼都接受scFv 2H1或scFv₂-Fc 2H1-4.1时，检测出4级损伤的减少，这暗示该片段和该二价分子对于已建立的损伤也是有益的。

实施例15.包含与人IgG1 Fc在基因上相融合的两个单元的scFv片段的二聚体分子在转基因烟草植物中的表达。

使用以在实施例8中所描述的条件进行的PCR来扩增编码scFv₂-Fc 2H1-4.1的基因，并通过添加合适的限制位点(NcoI和XbaI)来修饰末端以克隆到植物细胞载体中。在SEQ ID No.13中所报告的序列上设计在PCR中使用的基础的合成的寡核苷酸。扩增出的DNA片段被检测为大约1.4kb的主要条带，并使用QIAquick Gel ExtractionKit(QIAGEN，GmbH)从1％琼脂糖凝胶(Sigma)中纯化出来。用前述的酶消化所述DNA，并以scFv-铰链-CH2-CH3构建体(之前为甘薯sporamine的信号序列)的形式克隆到pHES74载体(López A.等人，1996.Biotecnología Aplicada 13：265-270)中。该载体具有CaMV35S启动子，烟草花叶病毒的ω前导区(其充当翻译促进物以增加所产生的蛋白质的量)，和胭脂碱合酶终止子(其也促进外源基因在转基因植物中的高表达)。将该“启动子-scFv-Fc基因-终止子”表达“盒”引入到二元载体pDE1001中，从而产生最终的质粒pDEscFv-Fc.70。关于在这个实施例中所使用的构建过程的细节类似于先前报道的那些(Ramírez，N.等人，2002.Transgenic Res.11：61-64)。

通过由根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移，将最终的质粒pDEscFv-Fc.70用于转化烟草栽培种PetitHavana SR1(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)细胞。F0和F1植物通过先前所描述的常规操作程序来获得，并且使用与实施例8中描述的那种类似的ELISA测定法来检测活性scFv-Fc分子的表达。

以总可溶性植物蛋白质(TSP)的形式来制备生物学活性scFv-Fc分子，其通过在液氮中研磨0.4g经转化的烟草植物或未转化的对照的叶直至获得精细粉末来进行提取，如其他地方所描述的。将该粉末转移至反应管并与提取缓冲液(61mM Tris-HCl pH 6.9；2％SDS；12.5％甘油)以1∶2(w/v)混合，并且在冰上温育5分钟。通过在13,000r pm下离心来去除不溶性材料，并且在ELISA中以不同稀释度分析可溶性级分，其中使用与碱性磷酸酶相缀合的抗人Fc抗体(Sigma)来检测表达。证实了，来自转基因植物的TSP包含能够识别包被至固相的人VEGF的分子，而来源于对照植物的TSP却不是这样。

序列表

<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

<120>针对血管内皮生长因子(VEGF)的重组抗体

<130>anti-angio CIGB

<140>

<141>

<150>CU 2006-0208

<151>2006-11-01

<160>15

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>1

gatctgctag ccgcacccat ggcagaagga ggaggg                           36

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>2

gggggatccc cgcctcggct tgtcac                                      26

<210>3

<211>558

<212>DNA

<213>智人

<400>3

atggctttag ttgaattgaa agtgcccgac attggcggac acgaaaatgt agatattatc 60

gcggttgaag taaacgtggg cgacactatt gctgtggacg ataccctgat tactttggat 120

ctagatcacg atgacgatga cgataaagct tcagatctgc tagccgcacc catggcagaa 180

ggaggagggc agaatcatca cgaagtggtg aagttcatgg atgtctatca gcgcagctac 240

tgccatccaa tcgagaccct ggtggacatc ttccaggagt accctgatga gatcgagtac 300

atcttcaagc catcctgtgt gcccctgatg cgatgcgggg gctgctgcaa tgacgagggc 360

ctggagtgtg tgcccactga ggagtccaac atcaccatgc agattatgga gatcgaacct 420

gagcaaggcc agcacatagg agagatgagc ttcctacagc acaacaaatg tgaatgcaga 480

ccaaagaaag atagagcaag acaagaaaaa tgtgacaagc cgaggcgggg atcccgggca 540

caccatcacc atcaccat                                               558

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>4

ctattctccc atggcacag                                               19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>5

ttctgtatga ggttttgc                                                18

<210>6

<211>804

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：重组抗体片段

<400>6

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag  60

atctcctgta agggttctgg atacagcttt accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag  120

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc tgataccaga  180

tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc  240

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc  300

gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttcggcccct  360

caggccaaat cctcaggatc aggctccgaa tccaaagtcg accaggctgt ggtgactcag  420

gagccctcac tgactgtgtc cccaggaggg acagtcactc tcacctgtgc ttccagcatt  480

ggagcagtca ccagtggtaa ctatccaaac tggttccagc agagacctgg acagccaccc  540

agggcactga tttatagtac aagcaacaaa cactcctgga cccctgcccg gttctcaggc  600

tccctccttg ggggcaaagc tgccctgacc ctttcgggtg cgcagcctga ggatgaggct  660

gagtattact gcttgctctc ctatagtggt gctcggccgg tgttcggcgg agggaccaag  720

ctgaccgtcc taggtgcggc cgctggatcc gaacaaaagc tgatctcaga agaagaccta  780

aactcacatc accatcacca tcac                                         804

<210>7

<211>354

<212>DNA

<213>智人

<400>7

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag  60

atctcctgta agggttctgg atacagcttt accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag  120

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc tgataccaga  180

tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc  240

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc  300

gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttcg       354

<210>8

<211>333

<212>DNA

<213>智人

<400>8

caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60

acctgtgctt ccagcattgg agcagtcacc agtggtaact atccaaactg gttccagcag 120

agacctggac agccacccag ggcactgatt tatagtacaa gcaacaaaca ctcctggacc 180

cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc ttgctctcct atagtggtgc tcggccggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt                              333

<210>9

<211>657

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：重组FAB片段的轻链

<400>9

caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60

acctgtgctt ccagcattgg agcagtcacc agtggtaact atccaaactg gttccagcag 120

agacctggac agccacccag ggcactgatt tatagtacaa gcaacaaaca ctcctggacc 180

cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc ttgctctcct atagtggtgc tcggccggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360

tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420

tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 480

cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540

gccagcagct acctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacaaaag ctacagctgc 600

caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttca    657

<210>10

<211>732

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：重组FAB片段的重链

<400>10

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag 60

atctcctgta agggttctgg atacagcttt accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag 120

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc tgataccaga 180

tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc 240

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc 300

gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtccacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtagt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgcggccg cacatcacca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720

gaggatctga at                                             732

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>11

acagggctta aggaggtgca gctggtgcag tctgg                    35

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>12

tgttgttcta gaacctagga cggtgacctt ggtccc                   36

<210>13

<211>1467

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：重组抗体

<400>13

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagactcgtg 300

gttagggata cagaaatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc ggcccctcag 360

gccaaatcct caggatcagg ctccgaatcc aaagtcgacc aggctgtggt gactcaggag 420

ccctcactga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtgcttc cagcactgga 480

gcagtcacca gtggtaacta tccaaactgg ttccagcaga gacctggaca gccacccagg 540

gcactgattt atagtacaag caacaaacac tcctggaccc ctgcccggtt ctcaggctcc 600

ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgagga tgaggctgag 660

tattactgct tgctctccta tagtggtgct cggccggtgt tcggcggagg gaccaaggtc 720

accgtcctag gttctagagg cggaggtgga tcgggcggag gtggatcggc agagcccaaa 780

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960

gtggacggcg tgaaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1140

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa                                    1467

<210>14

<211>1467

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：重组抗体

<400>14

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc  60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgtcagatg  120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac  180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac  240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagactcgtg  300

gttagggata cagaaatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc ggcccctcag  360

gccaaatcct caggatcagg ctccgaatcc aaagtcgacc aggctgtggt gactcaggag  420

ccctcactga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtgcttc cagcattgga  480

gcagtcacca gtggtaacta tccaaactgg ttccagcaga gacctggaca gccacccagg  540

gcactgattt atagtacaag caacaaacac tcctggaccc ctgcccggtt ctcaggctcc  600

ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgagga tgaggctgag  660

tattactgct tgctctccta tagtggtgct cggccggtgt tcggcggagg gaccaagctg  720

accgtcctag gttctagagg cggaggtgga tcgggcggag gtggatcggc agagcccaaa  780

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg  840

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag  900

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac  960

gtggacggcg tgaaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc  1020

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag  1080

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa  1140

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg  1200

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc  1260

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg  1320

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag  1380

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag  1440

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa                                      1467

<210>15

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>15

Cys Cys Arg Thr Leu Met Leu Leu Gln Tyr His Arg

  1               5                  10

Claims (17)

1.重组抗体，其特征在于，所述抗体包含由核苷酸序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8或同源序列编码的人免疫球蛋白可变区，识别人VEGF-A中在其残基C102、C57、R56、T31和L32周围定义的表位，尽管不一定限于其残基C102、C57、R56、T31和L32，并且干扰人VEGF-A的促血管生成效应。

2.根据权利要求1的重组抗体，其特征在于，所述序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8或同源序列被包含在编码单链Fv型抗体片段(scFv)的序列内，其中人来源的抗体的重链和轻链可变区被接头区段分隔开。

3.根据权利要求2的重组抗体，其特征在于，所述编码scFv的序列为SEQ ID No.6。

4.根据权利要求1的重组抗体，其特征在于，所述序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8或同源序列被包含在编码Fab型抗体片段的序列内，所述Fab型抗体片段具有IgG类型的共有人免疫球蛋白的恒定结构域。

5.根据权利要求4的重组抗体，其特征在于，所述编码Fab型片段的序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。

6.根据权利要求1的重组抗体，其特征在于，所述序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8或同源序列被包含在编码多肽链的序列内，所述多肽链由通过间隔体与人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3恒定结构域相连接的scFv片段构成，并且以其蛋白质形式与另一条同样的多肽链共价结合从而形成二聚体分子。

7.根据权利要求6的重组抗体，其特征在于，所述人免疫球蛋白恒定结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。

8.根据权利要求6和7的重组抗体，其特征在于，所述编码多肽链的序列为SEQ ID No.13或SEQ ID No.14，所述多肽链由通过间隔体与铰链、CH2和CH3恒定结构域相连接的scFv片段构成。

9.根据权利要求1-8的重组抗体，其特征在于，所述抗体另外还包含具有抗肿瘤或抗血管生成潜力的放射性同位素或者化学或生物学试剂。

10.根据权利要求1-8的重组抗体，其特征在于，所述抗体另外还包含赋予肿瘤体内诊断潜力的放射性同位素。

11.根据权利要求1-8的重组抗体，其特征在于，所述抗体在重组细菌或酵母中，或者在哺乳动物细胞或其他真核生物***中产生。

12.编码根据权利要求1-8的重组抗体的载体，其通过遗传操作经由重组DNA而获得，这些载体是能够整合入宿主细胞中的质粒或序列。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1-9的重组抗体。

14.根据权利要求1-9的重组抗体在制备药物中的用途，所述药物用于通过被动免疫疗法来治疗随着血管生成增加而发展的实体例如眼实体、瘤形成过程、急性和慢性炎症过程、以及自身免疫过程。

15.根据权利要求1-9的重组抗体在制备药物中的用途，所述药物用于通过被动免疫疗法来治疗恶性肿瘤及其转移。

16.根据权利要求1-9的重组抗体在制备药物中的用途，所述药物用于通过被动免疫疗法来治疗年龄相关的黄斑变性。

17.根据权利要求10的重组抗体在制备放射性药物中的用途，所述放射性药物用于通过成像技术来体内诊断恶性肿瘤及其转移。

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