BRPI0717971A2

BRPI0717971A2 - Anticorpos recombinantes contra o fator de crescimento endotelial vascular (vegf)

Info

Publication number: BRPI0717971A2
Application number: BRPI0717971-5A2A
Authority: BR
Inventors: Humberto Lamdan Ordas; Jorge Victor Gavilondo Cowley; Marta Ayala Avila; Gertrudis Rojas Dorantes; Yanelys Morera Dias; Osmany Guirola Cruz; Glay Chinea Santiago; Nelson Francisco Santiago Vispo
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotech
Priority date: 2006-11-01
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2013-11-12
Also published as: RU2009120536A; AR063448A1; MX2009004765A; EP2093236A1; CN101573379A; WO2008052489A8; ZA200903017B; US20100151566A1; CO6341480A2; CA2667594A1; KR20090078363A; CU23636A1; JP2010508033A; WO2008052489A1; AU2007315484A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS RECOMBINANTES CONTRA O FATOR DE CRESCIMENTO ENDO- TELIAL VASCULAR (VEGF)".

Campo Técnico

5 A presente invenção se refere ao campo de biotecnologia e in-

dústria farmacêutica, em particular com o desenvolvimento e aplicação de moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas a anticorpos que reco- nhecem especificamente o Fator A de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-A) humano (Ferrara, N. e colaboradores, 2003. Nature Medicine 9: 10 669-676) e que interferem com seus efeitos estimulatórios in vitro e atividade pró-angiogênica in vivo. Dentre essas moléculas estão um fragmento de an- ticorpo Fv com uma única cadeia (scFv), um fragmento de anticorpo Fab e moléculas bivalentes do tipo "anticorpo completo" (ScFv2-Fc).

Antecedentes da Invenção O processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir

daqueles pré-existentes é denominado angiogênese e é regulado através do equilíbrio de fatores pró- e anti-angiogênicos. Dentre as doenças que foram relacionadas à indução anômala de fatores pró-angiogênicos e a formação de novos vasos sanguíneos estão: câncer (tumores primários e suas metás- 20 tases), processos inflamatórios agudos e crônicos tais como asma, dificulda- de respiratória, endometriose, aterosclerose e edema tecidual, doenças de origem infecciosa, tais como hepatite de sarcoma de Kaposi, doenças auto- imunes, tais como diabetes, psoríase, artrite reumatóide e tiroidite e várias outras doenças e estados, tais como retinopatia diabética, rejeição a trans- 25 plante de órgãos, degeneração macular relacionada à idade (variante úmi- da), glaucoma neovascular, hemangioma e angiofibroma (Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M. e colaboradores, 2001. Intern Med 40: 565-572).

Um procedimento terapêutico atraente para muitas dessas do- enças é baseado na inibição da atividade de fatores pró-angiogênicos que estimulam a formação anômala de vasos através da administração de molé- culas de neutralização. Na prática médica, o anticorpo humanizado recombi- nante Bevacizumab, conhecido comercialmente como Avastin (Ferrara, N. e colaboradores, 2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335), que re- conhece e neutraliza o efeito pró-angiogênico do VEGF-A humano, foi apro- vado em muitos países para o tratamento de processo tumorais. Foi mostra- 5 do que seu efeito depende principalmente da inibição da neo-angiogênese induzida por VEGF-A produzido pelas células tumorais e outras do estroma tumoral, tais como macrófagos e fibroblastos. O anticorpo foi originalmente obtido como um anticorpo monoclonal de murino (Kim, KJ. e colaboradores, 1992. Growth Factors 7: 53-64) através da imunização de camundongos 10 com a isoforma 165 de VEGF-A humano obtida de células de mamífero. O anticorpo foi, então, modificado através de engenharia genética para obter sua humanização, que confere à molécula uma melhor tolerância e eficácia terapêutica quando aplicada a seres humanos.

Recentemente, o Ranibizumab (Gaudreault, J. e colaboradores, 15 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733), um fragmento de anticorpo derivado do Avastin já mencionado e comercialmente conhecido como Lu- centis, foi aprovado em vários países para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade (variante úmida). O Ranibizumab é um frag- mento de anticorpo Fab recombinante originado a partir da manipulação do 20 Bevacizumab usando engenharia genética. A injeção intravítrea de Ranibi- zuman neutraliza o VEGF-A localmente produzido e contra neo-angiogênese adicional da retina, que é a base da doença.

Os fatores de crescimento endotelial vascular são uma família de moléculas que induzem, de uma maneira direta e específica, à formação 25 de novos vasos sanguíneos (Leung, D. e colaboradores, 1989. Science 246: 1306-1309). Essa família compreende o Fator de Permeabilidade Vascular (VPF)1 também conhecido como Fator de Crescimento Endotelial Vascular, agora denominado VEGF-A, o Fator de Crescimento Placental (PIGF), os Fatores de Crescimento Derivados de Plaqueta (PDGF), PDGF-A e PDGF-B 30 e outras moléculas estrutural e funcionalmente relacionadas ao VEGF-A de- nominadas VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E (Olofsson, B. e colabora- dores, 1996. Proc Natl Acad Sei USA 93: 2576-2581; Joukov, V. e colabora- dores, 1996. EMBO J 15: 290-298; Yamada, Y. e colaboradores, 1997. Ge- nomics 42: 483-488; Ogawa, S. e colaboradores, 1998. J Biol Chem 273: 31273-31282).

O VEGF-A é uma glicoproteína homodimérica formada por duas 5 subunidades de 23 kDa (Ferrara, N. e colaboradores, 1989. Biochem Bio- phys Res Comun 161: 851-858), das quais existem 5 isoformas monoméri- cas derivadas a partir de splicing diferencial de um mesmo ácido ribonuclei- co (RNA). Essas incluem duas isoformas que permanecem presas à mem- brana celular (VEGF 189 e VEGF 206) e três de natureza solúvel (VEGF 10 121, VEGF 145 e VEGF 165). O VEGF 165 é o mais abundante em tecidos de mam, exceção feita ao pulmão e coração, onde o VEGF 189 é maior (Neufeld G. e colaboradores, 1995. Canc Met Rev 15: 153-158) e na placen- ta, onde o VEGF 121 prevalece (Shibuya, M. 1995. Adv Cancer Res 67: 281- 316).

O VEGF-A é a proteína mais estudada e caracterizada dessa

família e sua alteração foi descrita em um grande número de doença. Su- perexpressão do VEGF-A está associação a tumores de diferentes origens e localizações, bem como suas metástases (Grunstein, J. e colaboradores,

1999. Cancer Res 59: 1592-1598), processos inflamatórios crônicos, tais como colite ulcerativa e doença de Chron (Kanazawa, S. e colaboradores, 2001. Am J Gastroenterol 96: 822-828), psoríase (Detmar, M. e colaborado- res, 1994. J Exp Med 180: 1141-1146), dificuldade respiratória (Thickett, DR. e colaboradores, 2001. Am J Respir Crit Care Med 164: 1601-1605), ateros- clerose (Celletti, FL. e colaboradores, 2001. Nat Med 7: 425-429), endome- triose (McLaren, J. 2000. Hum Reprod Update 6: 45-55), asma (Hoshino, M. e colaboradores, 2001. J Allergy Clin Immunol 107: 295-301), artrite reuma- tóide e osteoartrite (Pufe, T. e colaboradores 2001. J Rheumatol 28: 1482- 1485), tiroidite (Nagura, S. e colaboradores 2001. Hum Pathol 32: 10-17), retinopatia diabética e do recém-nascido (Murata, T. e colaboradores, 1996. Lab Invest 74: 819-825; Reynolds, JD. 2001. Paediatr Drugs 3: 263-272), degeneração macular e glaucoma (Wells, JA. e colaboradores, 1996. Br J Ophthalmol 80: 363-366), edema tecidual (Kaner, RJ. e colaboradores, 2000. Am J Respir Cell Mol Biol 22: 640-641), obesidade (Tonello, C. e colaborado- res, 1999. FEBS Lett 442: 167-172), hemangiomas (Wizigmann, S. y Plate, KH. 1996. Histol Histopathol 11: 1049-1061), no líquido sinovial de pacientes com artropatia inflamatória (Bottomley, MJ. e colaboradores, 2000. Clin Exp 5 Immunol 119: 182-188) e associado à rejeição a transplante (Vasir, B. e co- laboradores, 2001. Transplantation 71: 924-935). No caso particular de tu- mores, as células que expressam as três isoformas básicas de VEGF-A (121, 165 e 189) são aquelas que crescem mais rápido in vivo (Grunstein, J.

2000. Mol Cell Biol 20: 7282-7291).

As alterações na função de células endoteliais induzidas por mo-

léculas da família VEGF são mediadas através de sua ligação a receptores da classe 3 de quínase de tirosina, que até agora incluem VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) e VEGFR3 (Flt4) (Kaipainen, A. 1993. J Exp Med 178: 2077-2088). O segundo domínio N-terminal dos receptores foi identificado 15 como responsável pela ligação de Iigante que favorece a fosforilação do do- mínio citoplásmico e tradução de sinal (Davis-Smyth, T. e colaboradores, 1996. EMBO 15: 4919-4927).

O VEGFR2 (KDR/Flk1) media os efeitos biológicos do VEGF-A e também se liga ao VEGF-C e VEGF-D. Esse receptor é expresso diferenci- almente no endotélio ativo e em várias linhagens de célula de origem tumo- ral, onde Ioops de estimulação autócrinos-semelhantes podem se estabele- cer com o VEGF secretado. Além de estar envolvido nas patologias antes mencionadas, que estão relacionadas à superexpressão de seus ligantes, superexpressão do receptor também foi associada à progressão de: câncer endometrial (Giatromanolaki, A. e colaboradores, 2001. Cancer 92: 2569- 2577), mesotelioma maligno (Strizzi, L. e colaboradores, 2001. J Pathol 193: 468-475), tumores astrocíticos (Carroll, RS. e colaboradores, 1999. Cancer 86: 1335-1341), câncer de mama primário (Kranz, A. e colaboradores, 1999. Int J Cancer 84: 293-298), câncer gástrico do tipo intestinal (Takahashi, Y. e colaboradores, 1996. Clin Cancer Res 2: 1679-1684), glioblastoma multifor- me, oligodendroglioma anaplástico e ependimoma necrótico (Chan, AS. e colaboradores, 1998. Am J Surg Pathol 22: 816-826). Superexpressão de KDR também foi associada à doença VHL autonômica e hemangioblastoma (Wizigmann-Voos, S. e colaboradores, 1995. Cancer Res 55: 1358-1364), à progressão de retinopatia diabética (Ishibashi, T. 2000. Jpn J Ophthalmol 44: 323-324). Junto com Flt-1, o KDR foi associado à reação hiper-sensível re- 5 tardada (Brown, LF. e colaboradores, 1995. J Immunol 154: 2801-2807).

A maioria das novas estratégias terapêuticas envolvendo a inibi- ção de angiogênese, especialmente em câncer, está baseada no bloqueio de VEGF-A e/ou seus receptores. Figurando entre os produtos aprovados ou aqueles em experimentos clínicos nós encontramos os seguintes: (1) anti- 10 corpos monoclonais que bloqueiam o VEGF-A ou KDR, (2) inibidores de me- taloproteinase, tais como Neovastat e Prinomastat, (3) inibidores de VEGF, tais como Talidomida, Suramin, Troponina I, IFN-α e Neovastat, (4) bloquea- dores do receptor de VEGF, tais como SU5416, FTK787 e SU6668, (5) indu- tores de apoptose do endotélio tumoral, tais como Endostatina CA4-P e (6) 15 ribozimas que diminuem a expressão de VEGF ou aquela de seus recepto- res (Angiozyme).

De todos os mencionados, anticorpos (e fragmentos de anticor- po) que neutralizam os efeitos pró-angiogênicos do VEGF-A são aqueles que têm a aceitação e aplicação relacionada mais avançada como produtos 20 terapêuticos. Além dos exemplos do Bevacizumab e Ranibizumab que foram mencionados acima e já foram registrados, existem outros relatos que men- cionam anticorpos e fragmentos de anticorpo que reconhecem e neutralizam o VEGF humano (Muller, Y. e colaboradores, 1997. Proc Natl Aead Sci USA 94: 7192-7197; Asano, M. e colaboradores, 1998. Hybridoma 17: 185-190; 25 Vitaliti A. e colaboradores, 2000. Cancer Res 60: 4311-4314; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Release 74: 173-181; Jayson, G. e colabora- dores, 2002. JNCI 94: 1484-1493; Brekken, RA. e colaboradores, 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; US 5730977).

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve moléculas polipeptídicas recom- binantes relacionadas a anticorpos que compreendem regiões variáveis de imunoglobulina humana (VRs) codificadas pelas seqüências de nucleotídeo SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8 - ou seqüências homólogas - que reconhecem um epítopo no VEGF-A humano definido sobre, embora não necessariamen- te limitado a, os resíduos C102, C57, R56, T31 e L32 e que interferem com o 5 efeito pró-angiogênico do VEGF-A. A capacidade de tais moléculas de neu- tralizar os efeitos pró-angiogênicos do VEGF-A humano em modelos in vitro e in vivo relevantes para a neo-angiogênese é demonstrada. Essas molécu- las são formadas por um ou mais sítios de ligação de antígeno, tais como sítios constituídos pelos aminoácidos codificados pelas seqüências de DNA 10 das VRs de cadeias pesada e leve de imunoglobulina humana.

Para fins da presente invenção, a seguinte terminologia é defini- da:

• Anticorpos Recombinantes

Descreve uma imunoglobulina ou partes da mesma produzidas, em parte ou totalmente, através de meios sintéticos (por meio de DNA re- combinante ou síntese de gene artificial) com reconhecido específicos de um antígeno através de um ou mais domínios de interação (formados através de combinações particulares de regiões variáveis de cadeias pesada e leve de imunoglobulina que são comumente denominadas sítios de ligação de antí- geno) (Gavilondo y Larrick. 2000. Biotechniques 29: 128-136). Exemplos de anticorpos recombinantes são os assim denominados anticorpos quiméricos e humanizados, nos quais as regiões variáveis (ou partes das mesmas) obti- das de uma espécie são associadas, usando engenharia genética, às regi- ões constantes de imunoglobulina de outra espécie. Dentre os anticorpos recombinantes nós também termos fragmentos de anticorpo produzidos a- través de engenharia genética que compreendem um ou mais sítios de liga- ção de antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo recombinantes são:

(i) fragmentos Fab, que incluem a VL, VH, CL e CH1 de uma imunoglobulina;

(ii) fragmentos Fd, consistindo dos domínios VH e CH1; (iii) fragmentos Fv, formados pela VL e VH de um anticorpo; (iv) fragmentos scFv, onde os do- mínios VH e VL de um anticorpo são ligados em diferentes formas (VH-VL ou VL-VH) através de um segmento Iigante peptídico que permite a associa- ção dos dois domínios para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird e colaboradores, 1988. Science 242: 423-426; Huston e colaboradores, 1988. PNAS USA 85: 5879-5883); (v) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multi-específicos construídos de uma maneira similar ao scFv, mas onde o 5 pequeno tamanho do Iigante não permite que os domínios VH e VL de uma única molécula de scFv se associada umas às outras e os sítios de ligação têm de ser formados através da associação de duas ou mais moléculas de scFv individuais (W094/13804; Holliger P. e colaboradores, 1993. PNAS USA 90: 6444-6448); (vi) dAb (Ward SE e colaboradores, 1989. Nature 341: 10 544-546), regiões de determinação de complementaridade (CDR) isoladas, fragmentos F(ab')2 e dímeros de scFv bi-específicos (PCT/US92/09965; Hol- Iiger P y Winter G. 1993. Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449; de Haard,

H. e colaboradores, 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31: 5-31). Alguns tipos de fragmentos, tais como scFv e Fab, podem também ser obtidos a partir de 15 bibliotecas de anticorpo, onde um amplo repertório de genes de VR (sintéti- cos ou derivados de fontes naturais) é combinado aleatoriamente para pro- duzir associações particulares de VR de anticorpo que são visualizadas pos- teriormente na superfície de fagos filamentosos.

Moléculas "do tipo anticorpo", onde fragmentos de anticorpo são 20 artificialmente montados com regiões constantes de anticorpo através de engenharia genética também são consideradas anticorpos recombinantes. Por exemplo, é possível construir uma molécula "do tipo anticorpo" bivalente unindo um scFv a uma região formada pelos domínios de dobradiça, CH2, CH3 e, algumas vezes, CH4 de um Fc de imunoglobulina. Dependendo da 25 disponibilidade de todas ou várias das regiões descritas e da presença de glicosilação, a molécula do tipo anticorpo pode exibir funções efetuadoras comumente associadas ao Fc de imunoglobulina.

• Sítio de Liaacão de Antígeno. Epítopo

O primeiro termo descreve a porção de um anticorpo que intera- ge especificamente com um antígeno (ou parte do mesmo). Quando o tama- nho molecular do antígeno é grande, o anticorpo pode se ligar apenas a uma zona particular do antígeno, zona a qual é denominada epítopo. Um sítio de ligação de anticorpo é formado principalmente por duas regiões variáveis de anticorpo, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pe- sada. O sítio de ligação de anticorpo é formado através da interação não covalente das regiões variáveis. O sítio de ligação de anticorpo pode ser es- tabilizado artificialmente através da ligação das duas regiões variáveis com um peptídeo Iigante que não interferirá com suas propriedades de reconhe- cimento específico do antígeno, conforme é o caso de um fragmento scFv. Na natureza, os sítios de ligação de anticorpo são montados através da inte- ração não covalente de regiões variáveis, que é reforçada através da intera- ção não covalente dos domínios CH1 e CL (kappa ou lambda) que seguem nas regiões variáveis de cadeias pesada e leve, respectivamente, da estrutu- ra nativa da molécula. Anticorpos nativos completos possuem dois sítios de ligação de antígeno idênticos. O epítopo reconhecido por um sítio de ligação de antígeno, no caso no qual o antígeno é uma proteína, pode ser formado por uma seqüência linear de aminoácidos ou pode ser conformacional, isto é, os aminoácidos reconhecidos pelo sítio de ligação de anticorpo estão pró- ximos da estrutura terciária da proteína, mas não são necessariamente se- qüenciais quanto à sua estrutura primária. No caso de proteínas, o epítopo é naturalmente uma zona distinta, formada por um grupo particular de aminoá- cidos que interagem com o anticorpo através de uma ligação não covalente.

• Anticorpo Homólogo

Ele é um anticorpo natural ou produzido através de engenharia genética que reconhece especificamente o epítopo de um antígeno que também é especificamente identificado por outro anticorpo diferente. Os dois 25 anticorpos em questão podem ser relacionados em termos das seqüências de suas regiões variáveis (por exemplo, uma deriva da outra em virtude de mutações que podem ser mais ou menos extensas) ou podem ter seqüên- cias de região variável completamente diferentes. O último se deve ao fato de que as interações específicas entre anticorpos e antígeno e, especial- 30 mente no caso de proteínas, são feitas através de interações na superfície, isto é, a formação de ligação não covalentes (ligações e hidrogênio, van der Waals e similar) entre resíduos de aminoácido das regiões variáveis (isso considerando que alguns outros resíduos distintos estruturalmente próximos às regiões variáveis podem, algumas vezes, também participar da intera- ção). Isso produz dois anticorpos diferentes com sítios de ligação distintos em termos de seqüência mas que, todavia, podem ter identidade de intera- 5 ção o bastante com um epítopo particular que se torna específico para os mesmos. Um anticorpo homólogo pode, então, ser capaz de identificar es- pecificamente o epítopo particular reconhecido pelo outro anticorpo. O termo homólogo se estende à outras formas de anticorpos compreendidas nas de- finições acima feitas para anticorpos recombinantes (fragmentos de anticor- 10 po, moléculas "do tipo anticorpo" e outros).

• Específico

Se refere à situação na qual um anticorpo ou fragmento de anti- corpo não mostra uma ligação significativa à outras moléculas diferentes de seu parceiro de ligação específico. Esse termo também é aplicável ao caso 15 onde um sítio de ligação de antígeno é específico para um epítopo particular que aparece em uma série de antígenos relacionados ou não relacionados, caso no qual o sítio de ligação será capaz de ligar vários antígenos que pos- suem o epítopo mencionado.

Na modalidade da presente invenção, as moléculas polipeptídi- cas recombinantes relacionadas a anticorpo são: um fragmento de anticorpo humano (scFv 2H1) do tipo Fv com uma única cadeia (scFv), um fragmento de anticorpo Fab (Fab 2H1-32) e moléculas bivalentes ScFv2-Fc do tipo "an- ticorpo completo" (ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2). Em todos esses, as diferentes VRs se montam espontaneamente para formar sítios de Iiga- ção de antígeno. Para a estabilidade dessa montagem contribuem segmen- tos de ligação artificiais (Iigantes) ou outras seqüências relacionadas a anti- corpo, tais como domínios constantes de imunoglobulina. As VRs derivam daquelas contidas em um scFv que foi isolado de um biblioteca de fragmen- tos de anticorpo humano visualizada na superfície de fagos filamentosos, construída usando um repertório de VR de cadeias Iambda humanas.

Em virtude da estratégia empregada, as moléculas polipeptídi- cas recombinantes relacionadas a anticorpo descritas na presente invenção têm VRs de imunoglobulina com novas seqüências de DNA e diferentes da- quelas reportadas por outros autores, que também obtiveram anticorpos que neutralizam a ação pró-angiogênica do VEGF-A, tais como aquelas deriva- das de: hibridomas (Kim, KJ. e colaboradores, 1992. Growth Factors 7: 53- 5 64; Muller, Y. e colaboradores, 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7192- 7197; Asano, M. e colaboradores, 1998. Hybridoma 17: 185-190; Sehaep- pi, JM. e colaboradores, 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brek- ken, RA. e colaboradores, 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Release 74: 173-181), transformação viral de 10 células humanas (US 5730977), modificação de anticorpos pré-existentes através de engenharia genética (Jayson, G. e colaboradores, 2002. JNCI 94: 1484-1493; Ferrara, N. e colaboradores, 2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335) e bibliotecas de fragmento de anticorpo humano (Vitaliti, A. e colaboradores, 2000. Cancer Res 60: 4311-4314; Fuh, G. e colaboradores, 15 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631). As moléculas polipeptídicas recombi- nantes relacionadas a anticorpo descritas na presente invenção também são novas no sentido de que elas reconhecem um epítopo conformacional no VEGF-A humano que é diferente daquele definido por outros anticorpos que neutralizam o VEGF-A humano (Muller, Y. e colaboradores, 1997. Proc Natl 20 Acad Sci USA 94: 7192-7197; Muller, AY. e colaboradores, 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaeppi1JM. e colaboradores, 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brekken, RA. e colaboradores, 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; W02005012359).

Os efeitos anti-angiogênicos obtidos com a aplicação das molé-

culas polipeptídicas recombinantes relacionadas a anticorpo descritas na presente invenção e suas variantes equivalentes são baseados na interfe- rência da interação entre o VEGF-A humano e seus receptores presentes em células endoteliais vasculares ativadas, assim, afetando a capacidade das últimas de proliferar e manter sua estabilidade fisiológica.

No contexto da presente invenção, "variantes equivalentes" são moléculas polipeptídicas derivadas de outras associações e manipulações das seqüências contidas nas VRs 2H1RVCP (SEQ ID No. 7) e 2H1RVCL (SEQ ID No. 8) e outras VRs homólogas contidas na presente invenção (SEQ ID No. 13) que retêm a capacidade de reconhecer especificamente o VEGF-A humano e interferir com seu efeito biológico de estimulação de 5 crescimento de células endoteliais e pró-angiogênese. Essas moléculas po- lipeptídicas podem tomar a forma de outros fragmentos de recombinante recombinantes, tal como um scFv, onde o domínio VL está antes do domínio VH na seqüência ou onde outros segmentos de união (Iigantes) conhecidos no estado da técnica são usados para unir as VRs ou como fragmentos de 10 anticorpo F(ab')2, Fabc, Facb, scFv dimérico, scFv trimérico e scFv tetramé- rico (Winter G, Milstein C. 1991. Nature 349: 293-299; W094/13804; de Ha- ard, H. e colaboradores, 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31: 5-31). Também, variantes equivalentes são produzidas após a adição de outras seqüências derivadas de imunoglobulinas para formar moléculas multivalentes (Bestag- 15 no M. e colaboradores, 2001. Biochemistry 40: 10686-10692). Moléculas "variantes equivalentes" também podem estar na forma de anticorpos bi- específicos, onde uma porção da molécula preserva sua especificidade pelo VEGF-A e a outra tem uma especificidade diferente ou na forma de anticor- pos completos, onde as seqüências de VRs são associadas à regiões cons- 20 tantes de imunoglobulina de origem humana ou outra. Todas essas manipu- lações usando engenharia genética são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

"Variantes equivalentes" também são consideradas aquelas mo- léculas produzidas através do assim denominado "transplante de CDR", no 25 qual as seqüências de CDR contidas nas VRs 2H1RVCP (SEQ ID No. 7) e 2H1RVCL (SEQ ID No. 8) e outras VRs homólogas, tais como aquelas con- tidas, por exemplo, em SEQ ID No. 13, são artificialmente flanqueadas por redes de seqüência que não são originais, conforme é revelado, por exem- plo, no EP-B-0239400, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, de 30 forma que essa manipulação não afete a capacidade de reconhecer especi- ficamente o VEGF-A humano ou interfira com o crescimento de células en- doteliais e pró-angiogênese. A molécula polipeptídica recombinante na forma de um fragmen- to scFv (denominada scFv 2H1) reconhece especificamente diferentes iso- formas do VEGF-A humano. No scFv, as VRs de cadeias pesada e leve de imunoglobulina humana são geneticamente associadas nessa ordem através de um Iigante de 16 aminoácidos para formar a seqüência de DNA descrita em SEQ ID No 6. O fragmento scFv 2H1 foi obtido a partir de um scFv ho- mólogo denominado scFv 2H1-F, selecionado de uma biblioteca de fragmen- tos scFv visualizada em fagos filamentosos, construída através de métodos similares àqueles já descritos (Rojas G. e colaboradores, 2005. Biochem Bi- ophys Res Comun 336: 1207-1213), usando um repertório de VRs de cadeia Iambda humana. A propensão intencional introduzida no repertório de VR de cadeia leve foi feita para aumentar a possibilidade de descobrir anticorpos diferentes daqueles reportados por outros autores e que neutralizariam o VEGF-A através de mecanismos diferentes daqueles anteriormente identifi- cados.

No processo de seleção da biblioteca, nós empregamos uma proteína de fusão que contém a isoforma 121 do VEGF-A humano com mu- tação nos resíduos R82, K84, H86 através de sua substituição por ácido glu- tâmico e que afeta sua interação com o receptor KDR (Shen, B. e colabora- 20 dores, 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985), conforme mostrado no Exem- plo 1. Essa proteína de fusão recombinante (denominada P6447aa-VEGF, SEQ ID No. 3) foi produzida em bactérias e purificada de uma forma similar àquela empregada para espécies moleculares com a atividade biológica in vitro do VEGF-A humano. Em conseqüência, o antígeno usado na presente 25 invenção é diferente dos antígenos ou imunogênios usados por outros auto- res que obtiveram anticorpos monoclonais ou recombinantes que reconhe- cem o VEGF humano. O domínio da proteína P64K de Neisseria meningiti- dis, localizado na extremidade N-terminal de P6447aa-VEGF, aumenta a imu- nogenicidade e permite alto nível de expressão em E. coii e a formação de 30 formas diméricas com atividade biológica similar ao VEGF humano. A zona com mutação compreende um epítopo já reconhecido por outros anticorpos, reportado como neutralizando as funções biológicas do VEGF-A (Muller, Y. e colaboradores, 1997. Proc Natl Aead Sei USA 94: 7192-7197; Muller, AY. e colaboradores, 1998. Structure 6: 1153-1167).

Em concordância com a presente invenção, o uso da proteína de fusão P6447aa-VEGF para a seleção de sítios de ligação para o VEGF huma- 5 no a partir de uma biblioteca de fragmentos de anticorpo scFv que contém um repertório de VR de cadeias Iambda foi um fator determinante na identifi- cação de um fragmento de anticorpo (scFv 2H1-F) que reconhece um epíto- po conformacional do VEGF-A humano não descrito anteriormente.

Para produzir a molécula polipeptídica scFv 2H1, a seqüência de 10 DNA do fragmento scFv 2H1-F obtida da biblioteca foi clonada a partir do vetor de fagemídeo correspondente em um vetor de expressão de periplas- ma. O fragmento de anticorpo scFv 2H1, com um peso molecular aparente um pouco maior do que 29 kDa, é recuperado do meio de cultura e do peri- plasma das bactérias transformadas e facilmente purificado usando croma- 15 tografia de afinidade por metal (IMAC) (Porath J. 1992. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281). O vetor de expressão pACR.1 adicionado, ao C-término da molé- cula scFv 2H1, um domínio peptídico c-myc que é usado como "tag" para fins analíticos, seguido por um domínio com seis histidinas para facilitar a purificação usando IMAC.

A molécula polipeptídica recombinante na forma de um fragmen-

to Fab (denominada Fab 2H1-32) reconhece especificamente diferentes iso- formas de VEGF-A humano. No Fab, a seqüência de DNA que codifica as VRs de scFv 2H1, denominada 2H1RVCP (SEQ ID No. 7) e 2H1RVCL (SEQ ID No. 8), foram clonadas no vetor pFabHum-1 e geneticamente associadas 25 ao CH1 e Ck de uma imunoglobulina do tipo IgG humana, respectivamente, conforme descrito em SEQ ID No. 10 e SEQ ID No. 9. O plasmídeo pFa- bHum-1 é um vetor bicistrônico construído para a expressão de fragmentos Fab com regiões constantes humanas Ck e CH1 no periplasma de bactérias. As cadeias polipeptídicas produzidas compreendem as VRs e suas respecti- 30 vas regiões constantes pesada e leve, que são montadas para formar um fragmento Fab no periplasma bacteriano, onde elas são exportadas para o citoplasma através dos peptídeos sinalizadores fornecidos pelo vetor. A montagem periplásmica do Fab é baseada em interações não covalentes entre as VRs de cadeias pesada e leve e entre os domínios CH1 e CX, mas é reforçada através de uma ligação covalente do tipo dissulfeto entre duas cisteínas localizadas próximo do C-término das regiões CH1 e CX, também 5 fornecidas pelo vetor. O Fab 2H1-32 tem um tamanho molecular aparente de 50 kDa.

As moléculas polipeptídicas bivalentes recombinantes do tipo "anticorpo completo" denominadas ScFv2-Fc 2H 1-8.2 e ScFv2-Fc 2H 1-4.1 compreendem, respectivamente, as seqüências de VRs de scFv 2H1, segui- 10 do por uma seqüência que codifica dez aminoácidos espaçadores, uma se- qüência de nucleotídeo que codifica os domínios de dobradiça, CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana do tipo IgGI (SEQ ID No. 14) e uma se- qüência (SEQ ID No 13) muito similar à anterior, com alterações limitadas em algumas bases de VRs. Essas moléculas foram obtidas após clonagem 15 dos produtos de PCR do gene que codifica scFv 2H1, excluindo seus domí- nios 3' (que codificam o peptídeo c-myc e seis histidinas), no vetor pVSJG- HucFc. O vetor pVSJG-HucFc é criado para a expressão, em células de mamífero, de moléculas do tipo "anticorpo completo" que compreendem dois scFv idênticos associados ao Fc de uma imunoglobulina IgGI humana. A 20 cadeia polipeptídica que dá origem a essas moléculas bivalentes é transpor- tada para o retículo endoplásmico das células de mamífero via um peptídeo sinalizador de imunoglobulina presente no vetor pVSJG-HucFc. O peptídeo é removido do retículo endoplásmico e duas cadeias polipeptídicas idênticas se associam covalentemente através de ligações de dissulfeto nas regiões 25 de dobradiça, uma ligação que é reforçada por interações não covalentes das regiões CH2 e CH3. As moléculas ScFv2-Fc 2H1-4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2 têm um tamanho molecular aparente similar entre 100 e 120 kDa. Essas pro- teínas secretadas têm, em seu amino-término, quatro aminoácidos adicio- nais (QVLK) fornecidos pelo vetor.

Os anticorpos recombinantes da presente invenção, tais como

scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2, também po- dem ser produzidos em outros sistemas eucariotas, conforme é o caso de plantas transgênicas (Pujol, M. e colaboradores, 2005. Vaccine 23: 1833- 1837).

Em outro aspecto da presente invenção, as moléculas polipeptí- dicas recombinantes descritas acima reconhecem especificamente as iso- 5 formas 121 e 165 do VEGF-A humano e não identificam o VEGF de camun- dongo. As moléculas podem se ligar ao VEGF-A humano solúvel, ao VEGF- A humano adsorvido em superfícies sólidas ou ao VEGF-A humano associa- do ou próximo de células humanas que o produzem, dentre as últimas aque- las presentes em tumores humanos que crescem em camundongos nus (a- 10 tímicos).

As moléculas polipeptídicas recombinantes scFv 2H1, Fab 2H1- 32, ScFv2-Fc 2H1-4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2 descritas na presente invenção interagem com o VEGF-A humano ativo de uma forma tal que elas interfe- rem com sua atividade de promoção de crescimento em células endoteliais 15 humanas in vitro e em processos de neo-angiogênese in vivo, o último medi- do nos modelos experimentais de pelotas de Matrigel subcutâneas em ca- mundongos e de células tumorais humanas transplantadas em camundon- gos atímicos singeneicos (camundongos nus). As moléculas polipeptídicas recombinantes descritas na presente invenção não reconhecem o VEGF-A 20 de camundongo e interferem eficazmente na associação entre o VEGF-A humano e uma forma solúvel do receptor KDR. A aplicação das moléculas polipeptídicas scFv 2H1 e SeFv2-Fc 2H1-4.1 impede a neo-vascularização coroidal (CNV) ou melhora sua evolução, em um modelo experimental com primatas não-humanos onde CNV é produzida via foto-coagulação com Ia- 25 ser. As moléculas polipeptídicas Fab 2H1-32 e ScFv2-Fc 2H1-8.2 também seriam capazes de produzir tais efeitos sobre a CNV, levando em conta que sua especificidade pelo VEGF humano é similar àquela das moléculas poli- peptídicas scFv 2H1 e ScFv2-Fc 2H1 4.1 e têm efeito anti-angiogênico em outros modelos in vitro e in vivo.

As moléculas polipeptídicas recombinantes descritas na presen-

te invenção podem ser conjugadas a uma enzima ou seus fragmentos, a um modificador de resposta biológica, a uma toxina ou um fármaco ou a isóto- pos radioativos, que adicionam à molécula original uma característica fun- cional além daquela de ligação ao VEGF-A humano, sendo essa a capaci- dade de identificação e/ou afetar a viabilidade de células que estão localiza- das em um local anatômico em particular de um organismo multicelular, on- 5 de existe uma alta concentração de VEGF-A humano ou em sua proximida- de imediata ou através de interação com formas de VEGF-A associadas à membrana celular.

As moléculas polipeptídicas recombinantes objeto da presente invenção, além de possuírem a capacidade de reconhecer e interagir com o 10 VEGF-A humano e interagir com sua atividade pró-angiogênica e a capaci- dade de estimular a proliferação de células endoteliais, também podem de- sempenhar outras funções biológicas descritas para o VEGF humano, con- forme aquelas nas quais a molécula atua na regulação negativa da resposta imune (Chouaib S. e colaboradores, 1997. Immunology Today 18: 493-497). 15 Uma série de elementos fazem com que as moléculas polipeptí-

dicas objeto da presente invenção sejam novas com relação a outros anti- corpos e fragmentos de anticorpo que neutralizam o VEGF-A humano. Den- tre esses elementos estão os seguintes:

(a) as seqüências de base que codificam as VRs que foram os 20 sítios de ligação de antígeno das moléculas polipeptídicas objeto da presen- te invenção não foram reportadas antes e diferem daquelas de outros anti- corpos anti-VEGF-A. As seqüências de CDR das VRs e, em particular, aque- las da CDR3 da VR de cadeia pesada, diferem perceptivelmente de outras anteriormente reportadas que são ricas nos aminoácidos aromáticos tirosina

e/ou triptofano, um fato que não foi relacionado ao reconhecimento de um epítopo particular (Fellouse F.A. e colaboradores 2004. PNAS 101: 12467- 12472). No caso das moléculas polipeptídicas descritas na presente inven- ção, a CDR3 da VR de cadeia pesada não possui tirosinas.

(b) a especificidade imunoquímica das moléculas polipeptídicas objeto da presente invenção pelo VEGF-A humano difere daquela de frag- mentos Fab humanos obtidos de outras bibliotecas (Fuh G. e colaboradores, 2006. J. Biol Chem 281: 6625-6631) que, adicionalmente, reconhecem tam- bém o VEGF-A de camundongo.

(c) as molécula polipeptídicas descritas na presente invenção são muito dependentes de seu reconhecimento do VEGF-A humano para sua conformação dimérica biologicamente ativa, conforme mostrado pela

5 perda de reconhecimento detectada após tratamento do VEGF-A com agen- tes de redução.

(d) as moléculas polipeptídicas descritas na presente invenção reconhecem um epítopo conformacional sobre o VEGF humano não anteri- ormente descrito quando comparado com os epítopos que reconhecem ou-

tros anticorpos e fragmentos de anticorpo que neutralizam as funções bioló- gicas do VEGF-A humano (Muller Y. e colaboradores, 1997. PNAS 94: 7192- 7197; Muller AY. e colaboradores, 1998. Structure 6: 1153-1167; Schaep- pi J.-M. e colaboradores, 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Fuh G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; W02005012359).

Conforme mostrado no Exemplo 9, a análise in silico das prová-

veis associações entre a seqüência peptídica especificamente selecionada pelo fragmento de anticorpo scFv 2H1 de uma biblioteca de peptídeo combi- natorial de 12 aminoácidos e os dados conhecidos das estruturas primária e terciária do VEGF-A humano sugerem todos que o sítio de ligação de antí- 20 geno do scFv 2H1 está interagindo com um epítopo conformacional na mo- lécula de VEGF-A humano. A zona reconhecida pela estrutura terciária do VEGF não coincide com os epítopos descritos para outros anticorpos e fragmentos de anticorpo que neutralizam o VEGF-A humano e, assim, é no- va. Essa definição de epítopo abre também novas possibilidades de conhe- 25 cimento sobre a interação complexa entre o VEGF-A humano e seu receptor KDR, que permanece não solucionada.

As moléculas polipeptídicas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 descritas na presente invenção e suas variantes equivalentes são capazes de interagir com o VEGF-A humano ativo e inter- 30 ferir com seus efeitos de estimulação de neo-angiogênese. Em virtude disso, essas moléculas são úteis para o desenvolvimento de novos tratamentos para doenças nas quais uma angiogênese anormal ou excessiva está pre- sente, tais como: (a) câncer (tumores primários e metástases), (b) doenças dos olhos, tais como degeneração macular relacionada à idade (variante úmida), glaucoma neovascular, retinopatia diabética e do recém-nascido, (c) processos inflamatórios agudos e crônicos, tais como asma, dificuldade res- 5 piratória, endometriose, aterosclerose e edema tecidual, (d) doenças de ori- gem infecciosa, tais como hepatite e sarcoma de Kaposi, (e) doenças autoi- munes, tais como diabetes, psoríase, artrite reumatóide, tiroidite e (f) outras de várias doenças e estados, tais como rejeição a transplante de órgãos, hemangioma e angiofibroma.

Outro aspecto da presente invenção é o uso das moléculas des-

critas para produzir composições farmacêuticas para a inibição de angiogê- nese e o tratamento de condições patológicas associadas. Tal tratamento compreende a administração de uma quantidade eficaz das moléculas des- critas na presente invenção a um ser humano.

Em uma modalidade da presente invenção, as moléculas poli-

peptídicas recombinantes que reconhecem o VEGF humano são úteis para o tratamento de processos neoplásicos malignos e suas metástases. Em uma modalidade preferida, elas são eficazes no tratamento de carcinomas, sar- comas e tumores vascularizados. No Exemplo 12 nós ilustramos como a a- 20 plicação das moléculas descritas na presente invenção tinham o efeito de inibição do crescimento de um carcinoma humano, transplantado em ca- mundongos atímicos nus. Alguns exemplos de tumores que podem ser tra- tados usando essa estratégia incluem (mas não estão limitados a): tumores epidermóides, tumores escamosos, tais como aqueles de cabeça e pescoço, 25 tumores cólon-retais, de próstata, mama, pulmão (incluindo tumores de célu- las pequenas e não-pequenas), pancreático, da tiróide, ovário e fígado. As moléculas também são eficazes no tratamento de outros tipos de tumores, tais como sarcoma de Kaposi, neoplasia do sistema nervoso central (neuro- blastoma, hemangioblastoma capilar, meningioma e metástases cerebrais), 30 melanoma, carcinoma renal, tumores gastrintestinais, rhabdomiosarcoma, glioblastomas e leiomiosarcomas.

Em virtude do fato de as moléculas polipeptídicas recombinantes relacionadas a anticorpos descritas na presente invenção exibirem um reco- nhecimento de epítopo do VEGF-A humano que distingue as mesmas do Bevacizumab, conforme mostrado no Exemplo 5 e, assim, serem diferentes na maneira pela qual elas interferem na ligação do VEGF-A humano e seu receptor, elas podem dar origem a efeitos terapêuticos in vivo que são dife- rentes das outras moléculas que também atuam através de inibição dessa interação. É bem documentado que é possível obter diferentes efeitos tera- pêuticos in vivo e diferentes efeitos colaterais de tratamento com anticorpos produzidos contra o mesmo antígeno, mas que reconhecem diferentes epí- topos ou que possuem uma afinidade diferente pelo antígeno (Allan D.G.P. 2005. The Oncologist 10: 760-761). Também é sabido por aqueles habilita- dos na técnica que moléculas que reconhecem o VEGF humano através de regiões diferentes daquelas identificadas pelo anticorpo humanizado Bevaci- zumab podem produzir efeitos de interferência entre o VEGF e seu receptor (Lee, F-H. e colaboradores, 2005. PNAS 102).

Sabe-se que anticorpos e fragmentos de anticorpo, tais como o Bevacizumab e Ranibizumab, têm aplicação em outras doenças que progri- dem com angiogênese excessiva (Gaudreault, J. e colaboradores, 2005. In- vest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733; Costa, RA. e colaboradores, 2006. 20 Investig Ophthalmol Visual Sci 47: 4569-4578). Em uma modalidade da pre- sente invenção, as moléculas polipeptídicas recombinantes descritas são úteis para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade, em sua variante úmida. Duas das moléculas descritas na presente invenção, especificamente scFv 2H1 e ScFv2-Fc 2H 1-4.1, mostraram efeito terapêutico 25 e preventivo (Exemplo 14) sobre a neovascularização coroidal induzida por queima a laser em um modelo experimental com primata não-humano. No que se refere à base de possíveis diferenças no potencial terapêutico das moléculas mencionadas com relação àquelas existentes no estado da técni- ca, nós devemos destacar as diferenças intrínsecas no reconhecimento de 30 antígeno (um epítopo diferente), bem como o fato de que a scFv 2H1 tem aproximadamente metade do tamanho molecular do fragmento Fab Ranibi- zumab, um fato que permitiria melhor penetração das camadas retinais, um aspecto que foi enfatizado como importante para melhores efeitos terapêuti- cos. Também, a molécula ScFv2-Fc 2H 1-4.1 tem um tamanho molecular me- nor do que o Bevacizumab, com vantagens potenciais particulares quando comparado, nesse caso, com o primeiro.

5 Em outra modalidade da presente invenção, as moléculas poli-

peptídicas recombinantes descritas ou suas variantes equivalentes são usa- das em procedimentos diagnósticos in vivo para cânceres humanos que ex- pressam VEGF tais como, por exemplo, adenocarcinomas de cólon, pulmão ou mama e outros. Para isso, as moléculas polipeptídicas específicas para o 10 VEGF-A humano descrito na presente invenção podem ser radio-rotuIadas e injetadas na forma de agentes que permitem a produção de imagens que demonstram a presença e localização de tumores que expressam VEGF-A no homem. Para isso, moléculas polipeptídicas conforme aquelas descritas na presente invenção são associadas a um isótopo radioativo e a ligação 15 dessas ao tumor é avaliada. O método pode compreender a administração da molécula radio-rotulada a um ser humano. Conforme experimentalmente mostrado na invenção, o fragmento scFv 2H1 radio-rotulado com 125I se liga ao VEGF-A humano expresso por células tumorais transplantadas a camun- dongos atímicos nus e se acumula especificamente na área do tumor. A rea- 20 tividade com os tecidos que expressam quantidades anormalmente altas de VEGF-A humano pode ser detectada com qualquer método apropriado. Quando um radionuclídeo, tal como 125I, 111In ou 99mTc é empregado para rotular as moléculas polipeptídicas descritas na presente invenção, essas se localizam, de preferência, no tumor e não em tecidos normais e a presença 25 da radio-rotulação radioativa no tecido tumoral pode ser detectada e quanti- ficada usando uma câmera gama ou um contador gama. A qualidade da i- magem do tumor obtida se correlaciona diretamente com a proporção de sinal:ruído (Goldenberg DM. 1992. Int. J. of Biol. Markers, 7; 183-188). O uso experimental de 125I é exemplificado na presente invenção, mas não limita o 30 uso potencial de outros diferentes radionuclídeos. Se esses radionuclídeos têm capacidade terapêutica, tais como 1311,90Y, etc., as moléculas polipeptí- dicas radio-rotuIadas descritas na presente invenção podem conferir um efei- to terapêutico benéfico ao paciente, em virtude de seu alojamento na área anatômica de um tumor que produz VEGF-A humano e seus efeitos sobre células tumorais, sobre células que formam os vasos sanguíneos do tumor, bem como sobre outros elementos celulares que compõem o estroma do 5 tumor e produzem VEGF-A.

Em concordância com o anterior e conforme sugerido no Exem- plo antes mencionado, as moléculas polipeptídicas recombinantes descritas na presente invenção ou suas variantes equivalentes, associadas a outros agentes, podem ser a base de métodos terapêuticos que compreendem sua 10 administração como medicamentos ou composições farmacêuticas. Essas moléculas acopladas quimicamente ou através de métodos de engenharia genética a radionuclídeos terapêuticos, toxinas, fármacos ou modificadores de resposta biológica, podem direcionar o efeito terapêutico dos elementos acoplados à áreas anatômicas com uma concentração anormalmente alta de 15 VEGF-A humano, conforme pode ser aquela de um tumor e sua proximidade imediata, e exercer um efeito terapêutico. A quantidade a administrar, fre- qüência e intervalos de administração dependem todos da natureza e gravi- dade da doença e essas decisões são a responsabilidade de especialistas e outros médicos, baseado naquilo que já é conhecido nesse campo técnico.

As composições da presente invenção podem ser administradas

na forma isolada ou em combinação com outros tratamentos, quer simultâ- nea ou seqüencialmente, todos dependendo da doença a ser tratada. As composições farmacêuticas compreendem, além do ingrediente ativo, um veículo farmaceuticamente aceitável, tampão, um estabilizante ou "carrea- 25 dor" farmacêutico ou outros materiais bem conhecidos por aqueles habilita- dos na técnica. Esses materiais são não tóxicos, não interferem com a eficá- cia do ingrediente ativo e sua natureza precisa depende da via de adminis- tração, sendo essa mucosal, oral ou parenteral (por exemplo, injeção intra- venosa).

As moléculas descritas na presente invenção ou suas variantes

equivalentes são produzidas através da expressão do ácido nucleico que codifica as mesmas. Em conseqüência, as seqüências de ácido nucleico que codificam qualquer uma dessas moléculas polipeptídicas descritas e os pro- cedimentos para a expressão de tais ácidos nucleicos também são parte da presente invenção. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico codifica principalmente (embora não exclusivamente) as seqüências de base de DNA 5 que são descritas para as moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1- 4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2.

Para obter a expressão recombinante das moléculas descritas na presente invenção ou suas variantes equivalentes, vetores apropriados podem ser escolhidos e construídos contendo as seqüências regulatórias 10 que cada caso requer, incluindo seqüências promotoras, terminadoras, in- tensificadoras, de poliadenilação, genes marcadores e outras pertinentes. Os vetores podem ser plasmídeos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Esquema representando o plasmídeo pACR.1, usado na produção de fragmentos scFv solúveis no periplasma e meio de cultura de E. coli. O vetor tem um promotor LacZ, um Sítio de Ligação Ribossômica (RBS) e o peptídeo sinalizador (SP) pe/B.

Figura 2. Seqüência de DNA (SEQ ID No. 6) que codifica o fragmento de anticorpo recombinante scFv 2H1, produzido com o vetor pA- CR.1 em E. coli. As primeiras 354 bases se conformam á região variável (VR) de cadeia pesada de imunoglobulina humana (denominada 2H1RVCP, SEQ ID No. 7), seguido por 48 bases que codificam o segmento de união (ligante), continuando com 333 bases que codificam a VR de cadeia leve de imunoglobulina humana (denominada 2H1RVCL, SEQ ID No. 8), para termi- nar com 69 bases que codificam os aminoácidos que são produzidos pelo sítio de clonagem, o peptídeo c-myc e seis histidinas codificadas pelo vetor em si. As bases sublinhadas representam a anotação das Regiões de De- terminação de Complementaridade (CDRs), de acordo com Kabat e colabo- radores (Sequences of Immunological Interest, Department of Health and Public Services, Quinta Edição, 1991), na ordem (de cima para baixo): CDR1 de VR de cadeia pesada (VH), CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VR de cadeia leve (VL), CDR2 de VL e CDR3 de VL. Figura 3. Expressão de scFv 2H1 em células BL-21 de E. coli transformadas. Da esquerda para a direita: marcadores de peso molecular (66, 45, 35, 29, 20 e 14,2 kDa; fileira 1); um scFv de controle (scFv M3; fileira 2), sobrenadante de cultura de bactérias transformadas com o plasmídeo 5 pACR.1-scFv 2H1 (fileira 3), onde uma banda reforçada que migra em torno de 29 kDa pode ser observada e sobrenadante de cultura de bactérias trans- formadas com o plasmídeo vazio pACR.1 (fileira 4).

Figura 4. Resultados de purificação de scFv 2H1 usando IMAC. A Figura 4A é uma Eletroforese em Gel de Poliacrilamida-Dodecil Sulfato de 10 Sódio a 12% (SDS-PAGE) com (da esquerda para a direita): scFv de contro- le (scFv M3) com um tamanho molecular em torno de 29 kDa (fileira 1), ma- terial de iniciação que contém scFv 2H1 (fileira 2) e scFv 2H1 eluído com alta pureza (fileira 3). A Figura 4B representa uma Western blot de uma ré- plica da SDS-PAGE mostrada na Figura 4A. O anticorpo monoclonal 9E10 15 contra o domínio c-myc presente nessas proteínas foi usado para detecção.

Figura 5. Resultados de um ELISA por competição onde a capa- cidade do scFv 2H1 purificado de bloquear o acesso de uma molécula re- ceptora de VEGF solúvel (KDR-Fc) ao Iigante VEGF-A humano foi avaliada. O VEGF-A foi adsorvido à fase sólida. Diferentes concentrações (até 80 20 Mg/mL) de scFv 2H1 foram usadas. Um scFv específico para o antígeno na superfície de Hepatite B (scFv anti-HBsAg) foi usado como controle negati- vo. Nesse ensaio, a detecção de KDR-Fc ligada ao VEGF-A foi feita usando anticorpos de IgG anti-humanos conjugados à peroxidase (Sigma).

Figura 6. Representação esquemática do plasmídeo pFabHum- 1, usado para a produção de fragmentos de anticorpo solúveis do tipo Fab no periplasma e meio de cultura de E. coli.

Figura 7. Seqüências de DNA (SEQ ID No. 9 e SEQ ID No. 10) que codificam as duas cadeias que formam a molécula madura do fragmento Fab 2H1-32, que se auto-monta no periplasma bacteriano. Na Figura 7A e 30 no sentido 5-3', a seqüência que codifica a VR de cadeia leve de imunoglo- bulina, seguida por aquela que codifica o domínio constante CX humano, são mostradas. As bases sublinhadas representam as anotações de CDR na ordem (de cima para baixo): CDR1 da VR de cadeia leve (VL)1 CDR2 de VL e CDR3 de VL. Na Figura 7B e no sentido 5-3', a seqüência que codifica a VR de cadeia pesada de imunoglobulina, seguida por aquela que codifica o domínio constante de imunoglobulina CH1, seis histidinas e um peptídeo c- 5 myc são mostrados. As bases sublinhadas representam as anotações de CDR na ordem (de cima para baixo): CDR1 da VR de cadeia pesada (VH), CDR2 de VH e CDR3 de VH.

Figura 8. A Figura 8A é o mapa do plasmídeo pVSJG-HucFc, usado para expressar moléculas divalentes do tipo "anticorpo completo", a- pós clonagem de um fragmento scFv entre os sítios de restrição Afl Il e Xba

I. A Figura 8B é a representação esquemática da molécula produzida por células de mamífero transfectadas com o plasmídeo contendo um determi- nado inserto de scFv.

Figura 9. Seqüência de DNA (SEQ ID No. 13) que codifica a mo- 15 lécula semelhante a anticorpo madura denominada ScFv2-Fc 2H 1-4.1. No sentido 5'-3', podem ser observados: as bases que codificam a região variá- vel de cadeia pesada de imunoglobulina, seguido por um Iigante e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina, um espaçador que codifica 10 aminoácidos, seguido pelos domínios de dobradiça CH2 e CH3 de uma imu- 20 noglobulina IgGI humana. As bases sublinhadas representam anotações de CDR na ordem (de cima para baixo): CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL1 CDR2 de VL e CDR3 de VL.

Figura 10. Seqüência de DNA (SEQ ID No. 14) que codifica a molécula semelhante a anticorpo madura denominada ScFv2-Fc 2H1-8.2. No 25 sentido 5'-3', podem ser observados: as bases que codificam a região variá- vel de cadeia pesada de imunoglobulina, seguido por um Iigante e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina, um espaçador que codifica 10 aminoácidos, seguido pelos domínios de dobradiça, CH2 e CH3 de uma i- munoglobulina IgGI humana. As bases sublinhadas representam anotações 30 de CDR na ordem (de cima para baixo): CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL.

Figura 11. Reconhecimento específico de peptídeos visualizados em fago, em relação ao sítio de ligação do fragmento scFv 2H1, conforme determinado em um ensaio ELISA onde a ligação ao fragmento adsorvido a uma fase sólida na presença de VEGF humano em excesso (Peprotech) foi avaliada. A Figura mostra 10 clones de fago que visualizam peptídeos que 5 são representativos do comportamento mostrado por todos os 35 clones es- tudados. No experimento, as amostras de fago foram incubadas com ou sem (w/o) VEGF em solução.

Figura 12. Mapeamento dos resíduos que identificam principal- mente o epítopo reconhecido pelo scFv 2H1 na molécula de VEGF-A, em comparação com outras moléculas relacionadas a anticorpo descritas na literatura. Um diagrama que representa a estrutura terciária do VEGF-A hu- mano em sua conformação dimérica é usado, com alfa hélice, cadeias beta e loops. As duas moléculas diméricas idênticas aparecem em cinza claro e preto. As posições dos resíduos definidos como indicadores principais do epítopo reconhecido pelo scFv 2H1 são marcadas apenas na cadeia cinza clara do dímero e aparecem em preto, representadas como esferas de Van der Waals (VDW). Os resíduos reconhecidos por outros anticorpos são VDW em cinza claro nas Figuras A a D. A Figura 12E mostra a posição de amino- ácidos vizinhos (VDW em cinza claro) que são diferentes quando as se- qüências de VEGF-A humano e de camundongo são comparadas em rela- ção à posição do epítopo definido pelos principais resíduos indicadores para scFv 2H1 (VDW em preto).

Figura 13. Capacidade das moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 de interferir com o efeito estimulatório 25 de crescimento do VEGF-A humano sobre células endoteliais vasculares de veia do cordão umbilical humano (HuVEC) em cultura. scFv 2H1 purificado, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 foram adicionados em três concentrações diferentes (barra listrada: 2 pg/mL; barra sólida: 1 pg/mL; barra vazia: 0,5 pg/mL) com 10 ng/mL de VEGF-A humano (Peprotech).

Figura 14. Atividade anti-tumor de scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-

Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 em doses de: 2,5 mg/kg (Figura 14A) e 25 mg/kg (Figura 14B). Os pontos nas curvas se referem ao volume médio do tumor estimado para 5 animais por grupo. Controle negativo: anticorpo mo- noclonal não relacionado CB-Hep.1 (anti-HBsAg) na maior dose.

Figura 15. Percentual da dose injetada, por grama de tecido, 24 horas (primeiras duas barras em cada tecido) e 48 horas (segundas duas 5 barras em cada tecido) após inoculação de camundongos nus trazendo tu- mores humanos derivados de células A431 com o fragmento scFv 2H1 (bar- ras escuras) ou fragmento scFv Hep.1 (barras vazias) radio-rotulado com 125I. Cada barra representa a média das contagens recuperadas dos ór- gãos/tecido obtidos de 5 camundongos.

Descrição Detalhada das Modalidades / Exemplos

Exemplo 1. Clonagem, expressão bacteriana e purificação da isoforma 121

de VEGF humano fundido a P64K

(a) Clonagem da isoforma 121 de VEGF humano

Reação em cadeia de Polimerase (PCR) foi usada para o isola- mento e clonagem da isoforma 121 de VEGF, empregando DNA Polimerase Taq (Roche) e o procedimento recomendado pelo fabricante. Os oligonu- cleotídeos sintéticos # 1 (SEQ ID No. 1) e # 2 (SEQ ID No. 2) que aparecem na Tabela 1 foram usados como primers na PCR.

Tabela 1.- Primers usados na PCR da isoforma 121 de VEGF humano

Oligonucleotídeo Seqüência # 1 (SEQ ID No. 1) 5'... GATCTGCTAGCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGG. .3’ #2 (SEQ ID No. 2) 5'... GGGGGAT CCCCGCCT CGGCTT GT CAC... 3' Nessa técnica, o DNA template usado foi o plasmídeo pVEGF

(Ojalvo, A. G. e colaboradores, 2003. Electronic J. Biotechnol. 6, 208-222), previamente modificado através de PCR para incluir mutações que substitu- em os resíduos R82, K84 e H86 do VEGF por ácido glutâmico.

A banda correspondendo ao produto da amplificação foi extraída 25 de um gel de agarose a 2%. Após digestão da banda com as endonucleases Nhe I e BamHI, o DNA foi purificado e clonado no vetor pM238 (Yero, D. e colaboradores, 2006. Biotechnol. Appl. Biochem 44: 27-34). Com esse vetor, as proteínas expressas em bactérias são proteínas de fusão com um domí- nio N-terminal de 47 aminoácidos da proteína P64K de Neisseria meningiti- 30 dis. O plasmídeo resultante (P6447aa-VEGF) foi seqüenciado e determinado como contendo apenas as mutações exprofeso descritas acima, conforme mostrado em SEQ ID No. 3, com relação à seqüência de aminoácido repor- tada para a isoforma de VEGF humano clonada correspondente pelo Euro- pean Molecular Biology Laboratory (www.embl-heidelberq.de).

5 (b) Expressão da proteína de fusão em E. coli

DNA de plasmídeo foi extraído do clone P6447aa-VEGF e usado para transformar BL21 de E. coli. Várias colônias resultantes foram inocula- das em 50 mL de meio LB com Ampicilina e Triptofano e crescidas durante 5h a 37°C. Vinte e cinco mL dessas culturas foram inoculados em 250 mL de 10 meio M9 enriquecido com Ampicilina e incubados novamente durante 2h a 37°C. A indução foi feita adicionando 40 pg/mL de ácido 3-p-indola acrílico. As células foram coletadas 8h depois e, após ruptura ultra-sônica, a proteína de interesse permaneceu no precipitado. Solubilização da proteína foi feita com tampão de fosfato de sódio mais uréia a 6M. O sobrenadante foi sub- 15 metido à IMAC em gel Ni-NTA (QIAGEN).

A fração eluída foi avaliada usando SDS-PAGE mostrando ban- das de 26 kDa, 54 kDa e maiores, com as duas primeiras bandas compre- endendo mais de 98% da proteína no preparado. O primeiro tamanho cor- responde àquele de um monômero, o segundo a uma molécula dimérica e 20 aqueles de peso maior à outra agregação. A fração de eluição foi submetida à diálise em PBS, submetida à cromatografia em Superose F12 (Pharmacia) para selecionar exclusivamente a espécie com maior peso molecular apa- rente (em torno de 54 kDa) que foi denominada P6447aa-VEGF. Esse prepa- rado foi congelado para uso adicional a -20°C.

(c) Ensaio de ligação a receptor da proteína de fusão P6447aa-VEGF.

Uma imuno-lâmina com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foi reves- tida com a proteína de fusão P6447aa-VEGF purificada ou VEGF-A humano (Peprotech), ambos a 5 μg/mL em PBS durante 16h a 4°C. A lâmina foi blo- queada a 22°C com PBS-Ieite a 4% durante 1h. O receptor humano solúvel 30 KDR-Fc (Sigma) foi diluído em PBS-Ieite a 4% em diferentes concentrações, adicionado às lâminas e incubado durante 1 h a 22°C. Após lavagem repeti- damente, a ligação do receptor ao revestimento foi desenvolvida usando an- 10

15

ticorpos IgG anti-humanos de cabra conjugados com peroxidase (Sigma), seguido por uma solução de substrato feita de 0,5 mg/mL de orto- fenilendiamina e peróxido de hidrogênio a 0,015% em tampão de citrato, pH de 5,5. As lâminas foram lidas em uma leitora de lâminas ELISA a 492 nm e os valores médios de absorbância estimados a partir de três cavidades repe- tidas por amostra experimental.

A Tabela 1a mostra que a ligação do receptor solúvel estava li- mitada à fase sólida revestida com VEGF-A humano sem mutação da Pepro- tech. A proteína de fusão P6447aa-VEGF, na qual três mutações críticas fo- ram introduzidas por nós propositadamente (resíduos R82, K84 e H86 foram substituídos por ácido glutâmico) não foi identificada pelo KDR solúvel, um resultado que coincide com as previsões feitas por Shen e colaboradores (Shen, B. e colaboradores, 1998. J Biol Chem 273: 29979-29985) e torna nosso antígeno diferente dos outros reportados na literatura, conforme usa- do para o desenvolvimento de anticorpos e fragmentos de anticorpo que neutralizam o VEGF humano.

Tabela 1a. Ensaio de ligação para KDR-Fc, usando VEGF-A ou a proteína de fusão P6447aa-VEGF como revestimento em ELISA

KDR-Fc Revestimento de cavidades de lâmina para ELISA Isoforma 121 de VEGF- Proteína de fusão A humano P6447aa-VEGF 0 (controle negativo) 0,102 0,115 1,0 1,48 0,120 0,5 1,27 0,118 0,25 1,04 0,122 0,125 0,760 0,109 20

25

Exemplo 2. Imunização de camundongos BALB/c com a proteína P6447aa- VEGF e avaliação da capacidade dos soros de reconhecer uma isoforma 121 de VEGF humano comercial

O potencial da proteína de fusão P6447aa-VEGF de gerar anticor- pos de neutralização de VEGF foi avaliado imunizando 10 camundongos BALB/c fêmeas (CENPALAB, Havana) entre 8-10 semanas de idade. Os animais foram imunizados com 100 pg da proteína P6447aa-VEGF por dose, usando o adjuvante conhecido como VSSP (Estévez F. e colaboradores, 1999. Vaccine 99: 190-197), em um esquema de quatro doses subcutâneas, espaçadas 7 dias. Uma semana após a última imunização, o sangue dos animais foi coletado e o soro separado e armazenado em alíquotas a -20°C.

5 Para determinar se os soros de camundongos imunizados com

P6447aa-VEGF tinham anticorpos específicos para o VEGF, um ELISA foi desenvolvido revestindo com a isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprote- ch). A última foi imobilizada em uma imuno-lâmina com 96 cavidades Maxi- sorp (Nunc) em uma concentração de 1 pg/ml em PBS, durante 16h a 4°C. A 10 lâmina foi bloqueada a 22°C com PBS-Ieite a 4% durante 1h. Diluições seri- ais de soro em PBS-Ieite a 4% foram incubadas durante 1 h, a lâmina lavada e incubada com um conjugado de peroxidase anti-camundongo (Sigma). A reação foi desenvolvida com uma solução de substrato feita de 0,5 mg/mL de orfo-fenilendiamina e peróxido de hidrogênio a 0,015% em tampão de 15 citrato; pH de 5,5. O soro dos animais imunizados com a proteína P6447aa- VEGF reconheceu especificamente o VEGF humano comercial com titula- ções de até 1:32.000.

Exemplo 3. Seleção de sítios de ligação de anticorpo contra o VEGF huma- no

Para a seleção de sítios de ligação contra a isoforma 121 de

VEGF humano, nós usamos uma biblioteca de visualização da fago filamen- toso de fragmentos de anticorpo Fv humano com uma única cadeia (scFv), construída especificamente para a presente invenção. Nessa biblioteca, as regiões variáveis (VR) de cadeia leve humanas presentes no scFv resultan- 25 tes correspondem ao repertório de VR lambda. No processo de desenvolvi- mento dessa biblioteca propensa à VR lambda (νλ), construída de acordo com procedimentos publicados (Rojas G. e colaboradores, 2005. Biochem Biophys Res Comun 336: 1207-1213), os genes que codificam um repertório de VR de cadeia pesada humana foi recuperado de uma semi-biblioteca e 30 ligado ao DNA de plasmídeo de outra semi-biblioteca de regiões νλ em uma proporção de vetoninserto de 1:1. Os produtos da ligação foram eletropora- dos em células TG1 para obter a biblioteca final. A presença e o tamanho dos insetos foram determinados em uma amostra de 30 colônias, com oligo- nucleotídeos que se associam às regiões de flanqueamento do scFv clona- do.

Na seleção usando essa biblioteca recentemente construídas, nós empregamos como antígeno a proteína de fusão recombinante P6447aa- VEGF. A mistura de fago que se conforma à biblioteca foi submetida previa- mente a um processo de depleção com um excesso (1 mg/mL) de P64k em solução, para eliminar o scFv indesejado que é específico para essa proteí- na. A mistura com depleção foi usada para hibridização a proteína Ρ644733- VEGF imobilizada em imunotubos Maxisorp (Nunc). Para isso, os imunotu- bos foram revestidos com 10 pg/mL da proteína em PBS1 a 4°C durante a noite e, então, bloqueados com PBS-Ieite desnatado a 4%. Os fagos não ligados foram eliminados através de 20 lavagens com uma solução de PBS- Tween a 0,1%, seguido por 2 lavagens com PBS. Os fagos ligados foram eluídos com uma solução de trietilamina a 100 mmoles/L durante 10 min que foi imediatamente neutralizada com 0,5 moles/L de Tris (pH de 7,5). Os fa- gos eluídos foram amplificados na cepa TG1 de E. coli e usados como mate- rial de iniciação para o próximo ciclo de seleção. Esse procedimento foi re- petido 3 vezes sob as mesmas condições. Colônias individuais aleatórias de células TG1 infectadas com fagos eluídos dos segundo e terceiro ciclos de seleção foram usadas para produzir fagos em uma escala de 96 cavidades. A capacidade desses clones de fago que mostram fragmentos de anticorpo scFv de se ligar à P6447aa-VEGF foi avaliada usando ELISA. Lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 10 pg/mL de P6447aa- VEGF e, então, bloqueadas. Os fagos, diluídos em PBS-Ieite desnatado a 4% foram incubados nas lâminas durante 1h a 22°C, seguido por várias la- vagens. Os fagos lavados foram detectados com anticorpos anti-M13 conju- gados à peroxidase (Amersham) durante 1h a 22°C. Após várias lavagens, a reação foi desenvolvida com a adição de solução de substrato. A absorbân- cia foi lida a 492 nm em uma leitora de micro-lâmina. Dos 96 clones de fago avaliados com o ELISA, 87 deram resultados positivos. O DNA que codifica os fragmentos de anticorpo scFv que são visualizados pelos clones de fago que deram resultados positivos no ELISA foi amplificado através de PCR e submetido a uma análise de restrição com a enzima BstN-I. O produto dessa digestão foi verificado em um gel de agarose a 4%. A partir dessa análise, nós identificamos 7 padrões de restrição diferentes e um clone representati- vo de cada foi selecionado. Os clones selecionados foram produzidos atra- vés de infecção de células bacterianas TG1 que foram crescidas a 8°C du- rante 16 h. Os fagos contidos nos sobrenadantes de cultura foram precipita- dos de uma solução de PEG 5000 em NaCI a 2,5 M e armazenados para a caracterização imunoquímica que segue. Exemplo 4. Caracterização imunoquímica do scFv em fagos selecionados da biblioteca

(a) Reconhecimento de diferentes isoformas de VEGF humano e de murino

Para determinar o reconhecimento específico das isoformas 121 e 165 de VEGF humano e a isoforma 120 de VEGF de camundongo, os 7 clones de fago que mostram fragmentos scFv foram submetidos a um ensaio ELISA. As imuno-lâminas foram revestidas com as isoformas 121 e 165 de VEGF-A humano (Peprotech) e a isoforma 120 de VEGF de murino (R&D) em uma concentração de 1 μg/ml em PBS. Após bloqueio das lâminas, os fagos foram purificados conforme descrito acima e diluídos em PBS-Ieite desnatado a 4% foram adicionados e incubados durante 1h a 22°C. Após várias lavagens, os fagos ligados foram detectados com anticorpos anti-M13 conjugados à peroxidase. A reação foi desenvolvida e quantificada conforme descrito no Exemplo 2. Como controle negativo, uma amostra da mistura de fagos da biblioteca não selecionada foi usada, precipitada conforme descrito acima. Conforme observado na Tabela 2, os 7 clones de fago selecionados identificam especificamente as isoformas 121 e 165 de VEGF humano. Des- ses, os clones 2H1-F e 3C1 não reconhecem a isoforma 120 do VEGF de murino. A Tabela mostra a capacidade de reconhecimento dos clones, que são classificados como positivos (+) quando os valores de densidade óptica obtidos no ELISA são pelo menos 5 vezes aquele do controle negativo.

Tabela 2. Reconhecimento de diferentes isoformas de VEGF-A humano e de

murino por 7 clones de scFv visualizados em fagos filamentosos Clone Isoforma 121 de Isoforma 165 de Isoforma 120 de VEGF-

de fago VEGF-A humano VEGF-A humano A de camundongo

3C1 + +

2B2 + + +

2D2 + + +

2E1 + + +

3E8 + + +

2H1-F + +

2E3 + + +

(b) Reconhecimento diferencial de VEGF-A humano nativo e reduzido

A importância da duplicação homodimérica nativa de VEGF-A com relação ao reconhecimento pelos diferentes fragmentos de anticorpo selecionados da biblioteca foi estudada usando um ELISA onde a isoforma 121 de VEGF humano (Peprotech) foi revestida em lâminas para ELISA. A- pós bloqueio das lâminas, metade das cavidades foi tratada com solução de DTT a 50 mM em PBS-Ieite a 4% durante 1h a 22°C e a outra metade ape- nas com PBS-Ieite a 4%. Após várias lavagens, as cavidades onde o VEGF- A tinha sido reduzido com a solução de DTT foram tratadas com iodoaceta- mida a 100 mM em PBS-Ieite a 4% e incubadas durante 1h a 22°C. As cavi- dades restantes foram mantidas com PBS-Ieite a 4%. Após uma nova lava- gem da lâmina, o fago purificado, diluído em PBS-Ieite a 4%, foi adicionado às cavidades e incubado durante 1h a 22°C. Após várias lavagens, os fagos ligados foram detectados com anticorpos anti-M13 conjugado à peroxidase. Como controle negativo, uma amostra da mistura de fagos da biblioteca não selecionada foi usada. A Tabela 3 mostra 3 padrões: um no qual o reconhe- cimento não foi afetado pela redução de VEGF (exemplificado pelo clone 3C1), um segundo padrão no qual um efeito parcial da redução foi observa- do (exemplificado pelos clones 2B2 e 3E8) e um terceiro padrão no qual uma eliminação completa de reconhecimento contra a forma reduzida de VEGF foi notada (exemplificado pelos clones 2D2, 2E1, 2H1-F e 2E3). A capacida- de de reconhecimento do VEGF-A pelos clones foi medida em termos de Densidade Óptica média (492 nm) de três cavidades repetidas no experi- mento tomando, como uma referência mínima, aquela produzida pelo contro- Ie negativo.

Tabela 3. Reconhecimento do VEGF-A humano tratado ou não com DTT pelos 7 clones de scFv visualizados em fago filamentoso

Denominação do clone de fago VEGF-A humano sem tratamento (nativo) VEGF-A tratado com DTT (reduzido) 3C1 2,125 2,096 2B2 2,015 0,600 2D2 1,289 0,121 2E1 1,831 0,142 3E8 1,109 0,770 2H1-F 1,250 0,103 2E3 1,803 0,125 Mistura de fago não selecionado 0,122 0,103

(c) ELISA por competição entre uma forma solúvel do receptor KDR (KDR-

Fe) e o fago selecionado para VEGF-A humano

Um ELISA de competição foi usado para avaliar a capacidade dos clones de fago de bloguear o acesso de um receptor de VEGF solúvel ao antígeno. Para isso, imuno-lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com a isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprotech). As lâminas foram bloqueadas e ainda incubadas com uma mistura do fago cor- respondente, diluído em PBS-Ieite a 4%, com ou sem 2 μg/mL de receptor solúvel (KDR-Fc, Sigma). Os fagos ligados foram detectados usando anti- corpos anti-M13 conjugados à peroxidase (Amersham). Conforme mostrado na Tabela 4, o clone que evidenciou um maior bloqueio de ligação de KDR- Fc ao VEGF-A foi aquele denominado 2H1-F. A tabela mostra a capacidade de reconhecimento do VEGF-A pelos clones, medida em termos da Densi- dade Óptica média (492 nm) de três cavidades repetidas no experimento tomando, como uma referência mínima, aquela produzida pelo controle ne- gativo.

Tabela 4. Reconhecimento do VEGF-A humano após mistura individualmen- te ou não dos 7 clones de scFv visualizados em fago com 2 ug/mL de KDR- Fc Denominação do clone de fago Com 2 μg/mL de KDR-Fc Sem KDR-Fc 3C1 1,269 1,290 2B2 2,261 2,213 2D2 1,161 1,160 2E1 1,293 1,401 3E8 0,828 0,993 2H1-F 0,577 1,149 2E3 0,884 1,088 Mistura de fago não seleciona- do 0,121 0,115

Exemplo 5. Expressão do fragmento scFv 2H1 em E. coli, purificação e ca- racterização de seu reconhecimento do VEGF-A humano

(a) Clonagem de scFv 2H1 no vetor pACR.1 e sequenciamento

O vetor pACR. é um plasmídeo criado para a expressão de fragmentos de anticorpo no periplasma de E. coli (Figura 1). Como principais elementos do vetor, nós temos o promotor LacZ1 um peptídeo sinalizador, os sítios de restrição Ncol e Not I para a inserção do gene de fragmento, um domínio para codificação do peptídeo c-myc e uma seqüência para codifica- ção de 6 histidinas, a última para purificação dos produtos de expressão u- sando IMAC. O DNA de fagemídeo que contém o scFv denominado 2H1-F foi usado como template para PCR. Esse procedimento foi feito com a enzi- ma ProofStart (Stratagene)1 sob as instruções do fabricante. Os oligonucleo- tídeos sintéticos # 3 (SEQ ID No. 4) e # 4 (SEQ ID No. 5) foram usados co- mo primers no procedimento (Tabela 5). Tabela 5. Oliqonucleotídeos sintéticos para a amplificacão e modificação do

scFv 2H1-F contido no vetor de faoemídeo, para sua clonagem no vetor pA- CR.1

Oligonucleotídeo Seqüência # 3 (SEQ ID No. 4) 5'... CTATTCTCCCATGGCACAG... 3' #4 (SEQ ID No. 5) 5'... TTCTGTATGAGGTTTTGC... 3'

Uma banda do tamanho esperado (700 bp) obtida após amplifi- cação, foi purificada a partir de um gel de agarose a 1% usando o kit de ex- tração de DNA QIAGEN, digerida com Nco I e Not I (Promega) e re- purificada para ligação. O vetor pACR.1 foi digerido com Nco I e Not I (Pro- mega) e ligado com a banda digerida usando DNA Iigase T4 (Promega). O produto da ligação foi usado para transformar células competentes de E. coli (cepa XL-IBlue; Stratagene) através de eletroporação. As células transfor- madas foram colocadas em meio sólido seletivo e crescidas a 37°C. Os mé- todos empregados são amplamente conhecidos (Molecular Cloning1 A Labo- ratory Manual, Segunda Edição. 1989. Sambrook, Fritsch e Maniatis).

DNA de plasmídeo foi purificado a partir de diferentes colônias (kit QIAGEN MiniPrep) e verificado através de digestão do produto de Iiga- ção esperado com as enzimas de restrição já descritas. Vários plasmídeos foram escolhidos para obter a seqüência de DNA de consenso de scFv 2H1, usando sequenciamento automático e primers específicos que se hibridizam externamente às regiões de clonagem do vetor pACR.1. A seqüência de DNA de consenso obtida para o fragmento completo (VH-ligante-VL-c myc- histidinas), denominado scFv 2H1 (SEQ ID No. 6), é mostrada na Figura 2. O plasmídeo representativo dessa construção foi denominado pACR.1-scFv 2H1. Essa Figura apresenta as seqüências individuais de VR de cadeia pe- sada (denominada 2H1RVCP; SEQ ID No. 7) e VR de cadeia leve (denomi- nada 2H1RVCL; SEQ ID No. 8). De acordo com a classificação de Kabat e colaboradores, 2H1RVCP pertence ao Subgrupo I de VR de imunoglobulina humana e 2H1RVCL pode ser classificada em vários grupos de VR do tipo Iambda de imunoglobulina humana. Sublinhadas na Figura são as seqüên- cias de CDR, anotadas de acordo com a classificação de Kabat e colabora- dores.

(b) Expressão de scFv 2H1 em E. coli

pACR.1-scFv 2H1 foi usado para transformar células BL21 de E. coli competentes. Essa cepa permite a expressão da proteína heteróloga no periplasma e/ou meio de cultura. A transformação foi feita em meio sólido seletivo e deixada crescer a 37°C. Uma colônia representativa de construção foi crescida em meio líquido e, quando uma DO530nm de 1,0 foi obtida, indu- ção foi feita durante 12h usando isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a 1 mM no meio de cultura. As células foram centrifugadas e os con- teúdos periplásmicos foram isolados através de choque osmótico e rápido ultra-som. A fração periplásmica e o sobrenadante de cultura foram avalia- dos em SDS-PAGE de desnaturação a 12%. Esse ensaio mostrou a expres- são de uma proteína do peso molecular aparente esperado acima de 29 kDa, quando comparado com os marcadores de peso molecular e com um scFv contra um antígeno carcinoembriônico [scFv-M3]; (Pérez L. e colabora- dores, 2006. Biotechnol. Appl. Biochem. 43: 39-48) (Figura 3). A maioria do fragmento scFv 2H1 foi encontrado no sobrenadante de cultura. (c) Purificação do fragmento scFv 2H1 usando IMAC O domínio com seis histidinas presente na proteína, fornecido

pelo vetor pACR.1, foi usado para estabelecer o procedimento de purifica- ção. Essa seqüência confere às proteínas uma afinidade muito alta por íons de metal (Ex. Zn+2, Cu+2, Ni+2), que podem ser quelados a diferentes supor- tes cromatográficos. As bactérias transformadas com o vetor pACR.1-scFv 2H1 foram centrifugadas e o sobrenadante isolado, submetido à diálise du- rante 72h no tampão de acoplamento (NaH2PO4 a 50 mM, NaCI a 300 mM, pH de 7-8) e aplicado diretamente à Agarose-NTA (QIAGEN). A Figura 4A mostra que uma proteína de alta pureza que migra no gel um pouco acima de 29 kDa é obtida após purificação. As frações obtidas foram submetidas à Western Blot usando um anticorpo monoclonal (9E10) específico contra o peptídeo c-myc que está presente no scFv e no controle (scFv-M3), seguido por anticorpos de IgG anti-camundongo de coelho conjugados à peroxidase (Sigma). A Figura 4B mostra que o anticorpo monoclonal 9E10 detectou o scFv 2H1 e que nenhuma degradação importante é observada. (d) Reconhecimento específico do VEGF humano pelo scFv 2H1 em ELISA Imuno-lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram reves- tidas com as isoformas 121 e 165 de VEGF-A humano (Peprotech) e a iso- forma 120 de VEGF de murino (R&D) em uma concentração de 1 μg/mL em PBS durante 16 h a 4°C. Após bloqueio das lâminas com PBS-Ieite desnata- do a 4%, o scFv 2H1 purificado foi adicionado em diferentes concentrações em PBS-Ieite desnatado a 4% e incubado durante 1h a 22°C. Após várias lavagens, um anticorpo monoclonal (9E10) específico contra o peptídeo c- myc foi adicionado (1 μ9/ιτιΙ_), seguido por anticorpos de IgG anti- camundongo de coelho conjugados à peroxidase de armorácia (Sigma). A ligação do fragmento ao antígeno na fase sólida foi revelada e medida con- forme descrito em outros exemplos. Um scFv não relacionado anti-HBsAgA foi usado como controle negativo, obtido e purificado de um modo similar conforme descrito acima para o scFv 2H1. A Tabela 6 mostra que o scFv 2H1 mantém o reconhecimento específico do fago original scFv (2H1-F). A Tabela mostra a capacidade de reconhecimento do fragmento por diferentes VEGF-A, em termos da Densidade Óptica média (492 nm) calculada a partir dos valores reportados a partir de três réplicas no experimento tomando, como uma referência, o valor produzido pelo controle negativo.

Tabela 6. Reconhecimento de diferentes isoformas de VEGF-A humano e de camundonqo pelo fragmento scFv 2H1

Fragmento Isoforma 121 de VEGF-A hu- mano Isoforma 165 de VEGF-A hu- mano Isoforma 120 de VEGF-A de ca- mundongo scFv 2H1 (20 Mg/mL) 1,193 1,199 0,110 scFv 2H1 (2 Mg/mL) 1,162 1,087 0,091 scFv 2H1 (0,2 Mg/mL) 0,753 0,612 0,086 scFv anti-HBsAg (20 Mg/mL) 0,091 0,095 0,082

(e) ELISA por competição entre uma forma solúvel do receptor KDR (KDR-

Fe) e o fragmento scFv 2H1 pelo VEGF-A

Um ELISA por competição foi usado para avaliar a capacidade do fragmento scFv 2H1 purificado de bloquear o acesso de um receptor VEGF solúvel ao antígeno. O ensaio é baseado na inibição de uma forma de receptor KDR-Fc solúvel ao VEGF-A humano revestida a uma fase sólida, após a adição de concentrações crescentes de scFv 2H1. Para isso, imuno- lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com a isoforma 121 de VEGF-A humano (Peprotech) em PBS durante 16h a 4°C. As lâminas foram bloqueadas e ainda incubadas com concentrações crescentes de scFv 2Η1 purificado e 0,5 μ9/ιτιΙ_ de receptor solúvel (KDR-Fc, Sigma) ou o veícu- lo apenas (PBS-leite a 4%). Um fragmento de anticorpo scFv anti-HBsAg foi usado como controle negativo. Os fagos ligados foram detectados usando anticorpos anti-M13 conjugados à peroxidase (Amersham). O KDR-Fc ligado ao VEGF-A humano na fase sólida foi detectado com anticorpos de IgG anti- humanos conjugados à peroxidase (Sigma). Conforme mostrado na Figura 5, o scFv 2H1 é capaz de interferir na ligação do receptor solúvel ao VEGF-A humano na fase sólida, com uma dependência clara da dose usada. (f) Comparação imunoquímica de scFv 2H1 e Avastina O scFv 2H1 bacteriano foi comparado com Bevacizumab (Avas-

tin®, Genentech) com relação à sua capacidade de identificação da proteína de fusão P6447aa-VEGF, originalmente usada para o procedimento de sele- ção de anticorpo em fago descrito no Exemplo 3, que deu origem ao scFv 2H1-F. P6447aa-VEGF ou VEGF-A humano (Peprotech) foi imobilizado em imuno-lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) em uma concentração de 1 pg/ml em PBS, durante 16h a 4°C. A lâmina foi bloqueada a 22°C com PBS-leite a 4% durante 1h. Diluições seriais de scFv 2H1 purificado ou Be- vacizumab em PBS-leite a 4% foram incubadas durante 1 h, a lâmina lavada e ainda incubada como segue: (i) para scFv 2H1, com o anticorpo monoclo- nal anti-c-myc 9E10, seguido por um conjugado de IgG/peroxidase anti- camundongo (Sigma) e (ii) para Bevacizumab, com anticorpos de IgG anti- humanos de cabra conjugados à peroxidase (Sigma). As reações foram de- senvolvidas com uma solução de substrato feita de 0,5 mg/mL de orto- fenilendiamina e peróxido de hidrogênio a 0,015% em tampão de citrato, pH de 5,5.

Conforme observado na Tabela 6a, que representa os valores de absorbância médios a 492 nm obtidos em uma leitora de lâminas ELISA, com três cavidades repetidas por amostra estudada, o scFv 2H1 reconheceu P6447aa-VEGF e VEGF-A humano, enquanto que o Bevacizumab foi capaz de reconhecer apenas o VEGF-A humano da Peprotech.

O scFv anti-HBsAg não relacionado e TheraCIM (anticorpo de IgGI humanizado anti-receptor de EGF; CIMAB SA, Havana) foram usados como controles negativos.

Tabela 6a. Imuno-reatividades do fragmento scFv 2H1 e Bevacizumab con- tra P6447aa-VEGF e a isoforma 121 de VEGF-A humano

Molécula relacionada a anti- corpo Isoforma 121 de VEGF-A humano P6447aa- VEGF scFv 2H1 (20 Mg/ml_) 1,880 1,678 scFv 2H1 (2 pg/mL) 1,480 1,113 scFv 2H1 (0,2 Mg/mL) 0,610 0,490 Bevacizumab (20 Mg/mL) 3,201 0,145 Bevacizumab (2 Mg/mL) 2,907 0,127 Bevacizumab (0,2 Mg/mL) 1,885 0,110 scFv anti-HBsAg (20 Mg/mL) 0,067 0,085 TheraCIM (20 Mg/mL) 0,097 0,112

Exemplo 6. Expressão de scFv 2H1 em Pichia pastoris e demonstração de

seu reconhecimento pelo VEGF humano (a) Clonagem do gene de scFv no vetor pPS9

O gene que codifica scFv 2H1 foi digerido com Ncol/Xbal do ve- tor pACR.1-2H1 para clonagem no vetor de expressão pPS9 de Pichia pas- toris. O plasmídeo pPS9 é um vetor integrativo que contém um fragmento de 1,15 kb que corresponde ao promotor da enzima oxidase de álcool (AOX.1), seguido pelo gene que codifica o sinal de secreção de invertase de sacarose (sucll) de Saccharomyces eerevisiae, um sítio de clonagem múltipla, um fragmento de 960 bp correspondendo à enzima dehidrogenase de 3-fosfato de gliceraldeído (Gapt) para término de transcrição e o gene HIS3 de S. ee- revisiae como marcador de seleção. Esse vetor também contém um frag- mento de 2,1 kb que corresponde à seqüência 3' do gene AOX.1. Todos es- ses elementos são inseridos em um vetor pUC18 (EP0438200 A1).

Após digestão com Ncol/Xbal do gene de scFv-2H1 e sua purifi- cação a partir de géis de agarose, a seqüência resultante foi ligada ao pPS9, previamente digerido com Ncol/Spel e os produtos de ligação usados para transformar a cepa XL-1 Blue de E. eoli. Colônias transformadas isoladas foram analisadas usando PCR de colônia com um primer que se hibridiza na região promotora e aquelas que continham o inserto foram selecionadas. Sequenciamento foi feito conforme reportado em outros exemplos. As se- qüências obtidas para os plasmídeos recombinantes, denominados pPS2H1- 12 e pPS2H1-13, são idênticas e contêm aquela do scFv 2H1, reportada em SEQ ID No. 6.

Cepas recombinantes de P. pastoris foram obtidas com esses

dois plasmídeos (previamente digeridos com Pvull [Promega]), usando ele- troporação e a cepa do tipo silvestre MP36 his 3 (Yong V. e colaboradores, 1992. Biotechnol. Applic. 9: 55-61) e meio mínimo deficiente em histidina para seleção. Em virtude dos diferentes mecanismos de recombinação dos plasmídeos com sítios específicos no genoma de P. pastoris, nós isolamos dois fenotipos diferentes de células secretórias: (a) cepas onde o gene A- OX. 1 não foi afetado durante recombinação e são capazes de crescer em metanol e mostram comportamento similar à cepa do tipo silvestre (Mut+) e (b) cepas onde o gene AOX.1 foi substituído pelo cassete de expressão e mostrou crescimento lento na presença de metanol (Mut s). (b) Estudos de expressão

Os estudos de expressão para o fragmento de anticorpo foram feitos começando a partir de colônias prototróficas His+ crescidas em lâmi- nas com meio seletivo. As colônias foram crescidas em 10 mL de meio tam- ponado rico em tubos de 50 mL, a 28°C e sob 150 rpm. Quando as culturas obtiveram uma D.O a 600 nm de 2, elas foram centrifugadas a 2000 rpm du- rante 10 min. As pelotas de célula foram re-suspensas em 10 mL de meio rico com metanol ao invés de glicerol como a única fonte de carbono. Desse momento em diante e durante as próximas 96 h, a indução de proteínas de interesse foi feita com adições diárias de metanol puro até 1% à cultura. A cepa MP36his3 transformada com um vetor vazio foi usada como controle negativo.

Quando a indução terminou, as células foram centrifugadas e o meio metabolizado coletado, centrifugado novamente para clarificação final e SDS-PAGE a 15% empregado para detectar scFv 2H1. Esse ensaio revelou a presença, em ambos os casos, de proteínas com o peso molecular apa- rente esperado (29 kDa), que foram posteriormente avaliadas através de Western Blot usando o anticorpo monoclonal (Mab) 9E10, como anticorpo primário, seguido por anticorpos de IgG anti-camundongo de coelho conju- gados à peroxidase (Sigma). As duas proteínas recombinantes foram identi- ficadas pelo Mab 9E10.

(c) Reconhecimento do VEGF-A humano em ELISA pelo scFv 2H1

Um ensaio ELISA similar, com relação à fase sólida, reagentes, revestimento, incubação, desenvolvimento e condições de controle àquele descrito acima para o scFv 2H1 derivado de E. coli foi usado. As amostras de cultura de meio metabolizado das cepas de Ievedo recombinantes induzi- das diluídas em PBS-Ieite a 1% foram adicionadas e incubadas 2h em tem- peratura ambiente. Como controles negativos, os meios metabolizados da cepa do tipo silvestre MP36 his 3 e o fragmento de scFv anti-HBsAg não re- lacionado foram usados. Como controle positivo, o fragmento scFv 2H1 puri- ficado bacterianamente derivado foi usado. Valores de absorbância pelo menos 4 vezes maior do que aqueles produzidos pelos controles negativos eram considerados positivos. As amostras do meio metabolizado com o fragmento scFv 2H1, denominadas scFv 2H1-Pp17, produzidas após indu- ção de células de Ievedo P. pastoris transformadas, foram positivas com re- lação à sua capacidade de reconhecimento do VEGF-A humano ligado a uma fase sólida.

Exemplo 7. Obtenção de fragmentos Fab bacterianos usando as regiões va- riáveis (VR) de scFv 2H1 e caracterização de seu reconhecimento do VEGF humano

(a) Clonagem da VR de scFv 2H1 no vetor pFabHum-1 e seguenciamento A Figura 6 é um esquema do plasmídeo pFabHum-1, usado para

a produção dos fragmentos de anticorpo do tipo Fab no periplasma e meio de cultura de E. coli. O vetor tem um promotor LacZ, um RBS, a seqüência para um peptídeo sinalizador (PS), sítios para a clonagem da região variável (VR) de cadeia leve (Sal I e Avr II), a seqüência que codifica um domínio Ck de imunoglobulina humana, seguido por outro RBS e seqüência de PS, sítios para a clonagem da VR de cadeia pesada (Apa Ll e Bst Eli), seguido pela seqüência que codifica um domínio CH1 de imunoglobulina humana, esten- dido para incluir a primeira cisteína da região de dobradiça de IgGI humana. A proteína VR-CH1 é expressa associada a um domínio com seis histidinas para purificação por IMAC e um peptídeo c-myc para fins analíticos, ambos em seu C-término e fornecidos pelo vetor.

O DNA correspondendo ao fagemídeo que traz o scFv denomi-

nado 2H1-F foi primeiro digerido com Sal I e Avr Il para obter a VR de cadeia leve. Após verificação de seu tamanho em um gel de agarose a 1,5%, clo- nagem foi feita no pFabHum-1. Uma vez verificada a clonagem usando en- zimas de restrição, o plasmídeo (denominado pFab-Hum-1 RVL) foi replica- do, purificado e submetido a uma nova digestão com Apa Ll e Bst Eli. No caso de Bst Eli, a digestão foi parcial. Uma vez que o tamanho de banda foi verificado em agarose a 1,5%, clonagem foi feita no pFab Hum-1 RVL. A clonagem foi verificada com enzimas de restrição e o plasmídeo denominado pFab 2H1-32. Esse plasmídeo foi replicado, purificado e submetido a se- quenciamento automático. A seqüência de DNA que codifica a proteína ma- dura Fab 2H1-32 é mostrada na Figura 7. A Figura 7 A mostra a combinação de VR de cadeia leve e CX (SEQ ID No. 9) e a Figura 7B mostra a combina- ção de VR de cadeia pesada e CH1 (SEQ ID No. 10). As CDRs aparecem sublinhadas, anotadas de acordo com a classificação de Kabat e colabora- dores.

(b) Expressão do Fab em E. coli

O plasmídeo pFab 2H1-32 foi usado para transformar células competentes BL21 de E. coli. A transformação foi feita em meio sólido seleti- vo e crescida para permitir prosseguir a 37°C durante 16h. Uma colônia re- presentativa foi crescida em meio líquido e, após obtenção de uma DO530 nm de 1, a cultura foi induzida durante 12 h com IPTG a 1 mM. As células foram centrifugadas e o conteúdo periplásmico isolado com choque osmótico e rápido ultra-som e a fração periplásmica e o sobrenadante analisados em SDS-PAGE a 12%. Esse ensaio revelou a presença de uma proteína do ta- manho esperado (aprox. 50 kDa), que foi depois avaliada através de Wes- tern Blot usando, como anticorpo primário, um anticorpo monoclonal (9E10) contra o peptídeo c-myc, seguido por anticorpos de IgG anti-camundongo de coelho conjugados com peroxidase (Sigma). Western blot mostrou que o anticorpo 9E10 detectou uma proteína do tamanho esperado, no sobrena- dante de cultura e em amostras de periplasma.

(c) Purificação de Fab 2H1-32 usando IMAC e caracterização de seu reco- nhecimento do VEGF através de ELISA

As bactérias recombinantes produzidas através da transforma- ção com pFab 2H1-32 foram centrifugadas e o sobrenadante submetido à diálise durante 72h contra o tampão de acoplamento. Os preparados con- tendo o Fab foram diretamente aplicados à Agarose-NTA (QIAGEN). Após lavagem para eliminar os contaminantes de E. coli, o Fab 2H1-32 foi obtido na fração de eluição com pureza próxima de 85%, estimada usando SDS- PAGE a 12%.

O fragmento Fab purificado foi avaliado com relação à sua capa- cidade de reconhecimento do VEGF humano usando um ensaio ELISA. Lâ- minas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com as isofor- mas 121 e 165 de VEGF-A humano (Peprotech) ou a isoforma 120 de VEGF-A de camundongo (R&D) a 1 μg/mL. O fragmento Fab purificado foi diluído e incubado durante 1h a 22°C. Após lavagem, o anticorpo monoclo- nal anti-peptídeo c-myc foi adicionado (1 pg/mL), seguido por anticorpos de IgG anti-camundongo de coelho conjugados à peroxidase (Sigma). Um scFv anti-HBsAg foi usado como controle negativo e o scFv 2H1 bacteriano purifi- cado usado como controle positivo. Conforme mostrado na Tabela 7, o Fab produzido em E. coli reconhece especificamente o VEGF humano em ELI- SA. A Tabela mostra a capacidade de reconhecimento do fragmento Fab Fab 2H1-32 das diferentes isoformas de VEGF-A, em termos do valor de Densidade Óptica média (a 492 nm) obtido a partir de três cavidades repeti- das tomando, como uma referência, os valores produzidos pelo controle ne- gativo. Tabela 7. Reconhecimento de diferentes isoformas de VEGF-A humano e

VEGF-A de camundongo pelo fragmento Fab 2H1-32

Fragmento Isoforma Isoforma Isoforma 120 121 de 165 de de VEGF-A de VEGF-A VEGF-A camundongo humano humano Fab 2H1-32 (20 pg/mL) 1,020 1,101 0,089 Fab 2H1-32 (2 pg/mL) 1,087 1,065 0,090 Fab 2H1-32 (0,2 pg/mL) 0,675 0,645 0,070 scFv anti-HBsAg (20 pg/mL) 0,087 0,078 0,083 scFv 2H1 (2 pg/mL) 1,098 1,076 0,082

Exemplo 8. Produção e caracterização de reconhecimento das moléculas diméricas gue compreendem 2 unidades de scFv geneticamente fundidas a um Fcde IgGI humana

(a) Transfectomas gue produzem moléculas scFvg-Fc anti-VEGF

Para obter moléculas do tipo "anticorpo completo" com dois sí- tios de ligação idênticos, conforme definido pelo scFv 2H1, uma PCR foi feita usando, como template, o plasmídeo pACR.1-scFv 2H1 que contém a se- qüência gênica de scFv 2H1 e primers # 5 (SEQ ID No. 10) e # 6 (SEQ ID No. 11) que aparecem na Tabela 8, de forma a modificar a seqüência de DNA que codifica o fragmento de anticorpo e o torna compatível para a clo- nagem que segue. Esse procedimento foi feito com PanoTaq (Panorama Inc.), sob as instruções do fabricante. Tabela 8. Primers de PCR usados para modificar o pACR.1-scFv 2H1 para sua clonagem em pVSJG-HucFc

Oligonucleotídeo sintético Seqüência #5 (SEQ ID No. 11) 5'... ACAGGGCTTAAGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG... 3' #6 (SEQ ID No. 12) 5'... TGTTGTTCTAGAACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC... 3'

O DNA amplificado foi clonado no vetor pVSJG-HucFc. Esse

vetor é representado na Figura 8A e foi criado para expressão, em células de mamífero, de uma cadeia polipeptídica que compreende, nessa ordem: uma seqüência líder (peptídeo sinalizador) da cadeia pesada de um anticor- po monoclonal de murino, seguido por um fragmento scFv, um espaçador de aminoácidos e as seqüências de consenso das regiões de dobradiça, CH2 e CH3 de imunoglobulina IgGI humana. A seqüência líder direciona a cadeia ao retículo endoplásmico, onde ela dimeriza através da formação de ligações de dissulfeto entre as regiões de dobradiça e a associação por com- plementaridade das regiões CH2 e CH3 de dois polipeptídeos idênticos. Os domínios de dobradiça, CH2 e CH3 dimerizados para um Fc de imunoglobu- lina humana, ao qual segmentos N-terminais de dois scFv idênticos conver- tem essa construção bivalente em uma molécula do tipo "anticorpo comple- to" (Figura 8B). Dentre as principais características desse vetor, nós encon- tramos um promotor de Citomegalovírus.

A banda correspondendo ao produto da amplificação foi digerida com Afl Il e Xba I e clonada no pVSJG-HucFc, previamente digerido com as mesmas enzimas. Das colônias bacterianas resultantes de transformação, duas foram selecionadas para sequenciamento. Sequenciamento automático indicou que as duas colônias produziram plasmídeos recombinantes quase idênticos, que foram denominados ScFv2-Fc 2H1-4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2. A única diferença na seqüência entre esses dois plasmídeos é que o primeiro tem uma base de VR de cadeia pesada que é diferente e "silenciosa" com relação ao aminoácido codificado e três bases de VR de cadeia leve que são diferentes, com relação às seqüências de VR de scFv 2H1 (SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8). As seqüências que codificam as proteínas ScFv2-Fc 2H1-4.1 e ScFv2-Fc 2H1-8.2 maduras são mostradas na Figura 9 (SEQ ID No. 13) e Figura 10 (SEQ ID No. 14), respectivamente. Na Figura, as seqüências de CDR são sublinhadas e anotadas de acordo com a classificação de Kabat e colaboradores.

Os dois plasmídeos foram purificados sob condições isentas de endotoxina usando o sistema Pure Yield Plasmid Midiprep (Promega) e em- pregados para transfectar células de mieloma P3/x63.Ag8.653 usando Su- perFect (QIAGEN). Os sobrenadantes dos transfectomas desenvolvidos a partir de células que eram resistentes à G418 foram avaliados através de ELISA. Imuno-lâminas com 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com a isoforma 121 de VEGF humano (Peprotech). Os sobrenadantes das colônias de transfectoma foram diluídos em PBS-Ieite a 2% e adicionados às lâminas e a presença de molécula anti-VEGF do tipo ScFv2-Fc foram detec- tadas com anticorpos anti-Fc humano conjugados à peroxidase (Sigma). As colônias de células de transfectoma que secretaram maiores quantidade de moléculas ScFv2-Fc anti-VEGF, conforme detectado através de ELISA, foram repetidamente clonadas através de diluição limitada na presença de G418 e sempre avaliando a capacidade dos clones selecionados para produzir si- nais anti-VEGF humano em ELISA. Após duas clonagens independentes e consecutivas, dois clones estáveis foram obtidos, que produziram ScFv2-Fc denominados ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e SeFv2-Fc 2H 1-8.2.

(b) Purificação de seFv?-Fc 2H1-4.1 e ScFv7-Fc 2H 1-8.2 e elevação de sua capacidade de reconhecer o VEGF humano em ELISA

Clones de transfectoma que produzem as moléculas ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 foram cultivados em frascos de 162 cm2 na pre- sença de soro bovino fetal a 10% e o sobrenadante coletado após uma alta densidade celular ser obtida. Os sobrenadantes foram diluídos a 1:1 em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M, pH de 7,0 e foram purificados indepen- dentemente através de cromatografia por afinidade, usando Protein A Se- pharose Fast Flow 4 (Amersham). As moléculas ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2- Fc 2H1-8.2 foram eluídas em tampão de glicina a 0,2 M, pH de 4,0 e subme- tidas à neutralização rápida com Tris a 1 M, pH de 10,0. Após diálise contra PBS, a concentração foi calculada usando absorbância de UV a 280 nm e a pureza estimada através de SDS-PAGE a 12%. Foi determinado que os pre- parados eram mais de 85% puros. As moléculas purificadas foram aplicadas a um ELISA conforme descrito acima, em comparação com sobrenadantes não purificados, mostrando que ambos os preparados purificados eram ca- pazes de reconhecer o VEGF-A humano.

Exemplo 9. Identificação do epitooo de VEGF humano pelo scFv 2H1 (a) Seleção de peptídeos que são reconhecidos pelo scFv 2H1 a partir de uma biblioteca de peptídeo combinatorial visualizada em faao filamentoso

Para a identificação do epítopo de VEGF-A humano pelo scFv 2H1, nós seguimos a estratégia de confrontar o scFv 2H1 com uma bibliote- ca de peptídeo linear de 12 aminoácidos combinatorial visualizada sobre fa- gos filamentosos (Combinatoria Molecular. Santiago Vispo, N. (Ed.) Elfos Scientiae, 2004, La Havana). A mistura de fago que compõe a biblioteca, diluída em PBS-Ieite desnatado a 4%, foi adicionada a imunotubos (Nunc, Maxisorp) onde scFv 2H1 purificado tinha sido imobilizado. Os tubos tinham sido revestidos com o scFv e a fase sólida ainda bloqueada com PBS-Ieite desnatado a 4%. Os fagos que não se ligam ao scFv nos imunotubos foram eliminados com 20 lavagens de uma solução de PBS-Tween a 0,1%, segui- do por 2 lavagens com PBS. Os fagos ligados foram eluídos com uma solu- ção de trietilamina a 100 mmoles/L, a qual foi imediatamente neutralizada com Tris a 0,5 moles/L (pH de 7,5). Os fagos eluídos foram amplificados em bactérias TG1 e usados como material de iniciação para um novo ciclo de seleção. Esse procedimento foi repetido 3 vezes sob condições similares. Colônias aleatórias de células TG1 infectadas com fago eluído dos segundo e terceiro ciclos de seleção foram usadas para produzir fago em uma escala de 96 cavidades.

A capacidade desses clones de fago de visualização de peptí- deo de se ligar ao scFv 2H1 foi avaliada usando um ELISA de fago. Lâminas com 96 cavidades Maxisorb (Nunc) foram revestidas com scFv 2H1 e, então, bloqueadas. Os fagos produzidos por uma única cavidade foram diluídos em PBS-Ieite desnatado a 4% e incubados durante 1 h e 22°C em cavidades específicas das lâminas revestidas com scFv 2H1, seguido por várias lava- gens com PBS-Tween a 0,1%. Os fagos ligados foram detectados usando anticorpos anti-M13 conjugados à peroxidase (Amersham). Dos 40 clones de fago ensaiados em ELISA, 35 tiveram resultado positivo e foram usados nos métodos que seguem.

(b) Ensaio de ELISA por competição de ligação de scFv 2H1

Para testar se os 35 clones de fagos selecionados que visuali- zam peptídeos reconhecem especificamente o sítio de ligação do scFv 2H1, um ELISA foi feito por competição dos peptídeos sobre o fago com VEGF-A pela ligação ao scFv 2H1 revestido a uma fase sólida. Lâminas com 96 cavi- dades Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 10 pg por cavidade de scFv 2Η1 e, então, bloqueadas. Metade das cavidades foi incubada com 10 pg/mL de VEGF (Peprotech) em PBS-Ieite desnatado a 4% e, após várias lavagens com PBS-Tween a 0,1%, os preparados de fago foram adicionados diluídos em PBS-Ieite desnatado a 4% contendo 10 pg/mL de VEGF (Pepro- tech), que foram incubados em condições similares àquelas já descritas. De um modo simultâneo, o resto da lâmina foi incubado com PBS-Ieite desnata- do e, após várias lavagens com PBS-Tween a 0,1%, os preparados de fago foram adicionados diluídos em PBS-Ieite desnatado a 4%. Os fagos ligados foram detectados usando um anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase (Amersham). Conforme observado na Figura 11 para a amostra dos clones estudados, a presença de VEGF interfere completamente com a ligação do peptídeo visualizado em fagos ao scFv 2H1 imobilizado.

(c) Seqüenciamento de peptídeo

Uma amostra de 20 dos 35 clones de fago de peptídeo caracte- rizados no procedimento mencionado acima foi usada para extrair DNA de fagemídeo para seqüenciamento automático. As seqüências obtidas para os clones estudados eram idênticas, sendo essas CCRTLMLLQYHR (SEQ ID No 15).

(d) Estudo prognóstico do epítopo reconhecido pelo scFv 2H1

A seqüência obtida acima foi analisada usando os programas

FINDEPI (http://www.biocomp.cigb.edu.cu/findepi) e 3D Epitope Explorer (Schreiber A. J. 2005. Comput Chem 26: 879-887), com resultados similares. Esses são métodos computacionais que prevêem trechos de proteína na superfície implicados em interações proteína-proteína. Como dados de en- trada, os métodos usam a estrutura 3D de um dos elementos no par de inte- ração (proteína template; em nosso caso, o VEGF-A humano do banco de dados de proteína PDB, código 1BJ1) e a seqüência de aminoácido do se- gundo elemento na interação (proteína de ligação; em nosso caso, o peptí- deo CCRTLMLLQYHR; SEQ ID No. 15). Como um exemplo, o programa FINDEPI gera um banco de dados de mimótopos em potencial de cada tre- cho de superfície na proteína template, aplicando uma série de regras este- reoquímicas. Esse banco de dados é explorado usando métodos de alinha- mento de perfil para detectar mimótopos potencialmente similares ao peptí- deo selecionado experimentalmente em virtude de sua ligação. Após aplica- ção de um algoritmo de agrupamento, o programa reporta uma lista de resí- duos expostos na superfície da proteína template, com possibilidade de es- tarem localizados na interfase de interação das duas proteínas. A capacida- de do método foi avaliada com complexos de proteína-proteína para os quais a estrutura cristalográfica é conhecida e para os quais dados experi- mentais estão disponíveis sobre a seqüência dos polipeptídeos que são li- gados por essas moléculas. Ambos os programas usados definem uma zona de interação

similar na molécula de VEGF-A humano que compreende principalmente os resíduos C102, C57, R56, T31 e L32 (anotados de acordo com o banco de dados de proteína PDB1 código 1BJ1). Considera-se na presente invenção que esses resíduos são os principais indicadores do epítopo reconhecido pelo scFv 2H1. De acordo com as previsões, outros resíduos poderiam apa- recer associados aos principais indicadores mencionados acima, embora com escores menores, sendo esses G59, C68, V69, P70 e H99. O epítopo definido principalmente pelos resíduos C102, C57, R56, T31 e L32 não coin- cidem com aqueles reportados para outros anticorpos e fragmentos de anti- corpo que neutralizam o VEGF humano (Muller AY. e colaboradores, 1997. PNAS 94: 7192-7197; Muller AY. e colaboradores, 1998. Structure 6: 1153- 1167; Schaeppi J.-M. e colaboradores, 1999. J Câncer Res Clin Oncol 125: 336-342; Fuh G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; W02005012359). O epítopo definido principalmente pelos resíduos C102, C57, R56, T31 e L32 pode ser relacionado à conservação da estrutura dimé- rica do VEGF-A, se nós considerarmos os resultados dos experimentos mos- trados no Exemplo 4, que indicam uma perda de reconhecimento de scFv 2H1 pelo VEGF-A humano quando o antígeno é tratado com redução das ligações de dissulfeto, que separam dímeros em monômeros. A Figura 12 mostra o mapeamento dos resíduos que definem

principalmente o epítopo reconhecido na molécula de VEGF-A pelo scFv 2H1, em comparação com aqueles descritos para outros anticorpos. Um di- agrama do tipo cartoon representativo da estrutura terciária do VEGF-A hu- mano é usado, em sua conformação dimérica, com alfa hélice, cadeias beta e loops. As duas moléculas idênticas no dímero aparecem como cinza claro e preto. Para simplificar, a posição dos resíduos definidos como principais indicares do epítopo reconhecido pelo scFv 2H1 é representada apenas na cadeia cinza clara e aparece na representação de Van der Waals em preto (VDW). Os resíduos reconhecidos por outros anticorpos são mostrados co- mo VDW em cinza claro nas Figuras 12A a 12D. As Figuras 12A e 12B mos- tram que o epítopo definido pelos principais resíduos indicadores para scFv 2H1 são contínuos, mas não se sobrepõem àqueles definidos pelo Fab G6 e B20-4 (Fuh G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631). A Figu- ra 12C mostra que o epítopo definido pelos principais resíduos indicadores para o scFv 2H1 é muito diferente e está estruturalmente distante daqueles definidos para o anticorpo humanizado Bevacizumab, comercialmente co- nhecido como Avastina. A Figura 12D mostra que o epítopo definido pelos principais resíduos indicadores para scFv 2H1 não se sobrepõem estrutu- ralmente ao epítopo definido pelo anticorpo 3.2E3.1.1 (Muller AY. e colabo- radores, 1997. PNAS 94: 7192-7197).

A Figura 12E mostra a posição dos aminoácidos contínuos (VDW em cinza claro) que são diferentes quando as seqüências do VEGF-A humano e de camundongo são comparadas, em relação ao epítopo definido pelos principais resíduos indicadores C102, C57, R56, T31 e L32 para scFv 2H1 (VDW em preto). Sabe-se no estado da técnica que resíduos contínuos de um determinado epítopo são críticos para sua projeção de estrutura terci- ária, conseqüentemente, para seu reconhecimento por anticorpos e que a alteração de um único aminoácido é o bastante para determinar a especifici- dade de um anticorpo por uma molécula de uma determinada espécie, em relação aquela de outra espécie (Fuh G. e colaboradores, 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631). Esses resultados podem explicar porque o fragmento scFv 2H1 não reconhece o VEGF-A de camundongo.

Todos esses elementos indicam que o sítio de ligação de antí- geno definido pela VR que compõe o fragmento scFv 2H1 é diferente daque- Ie de outros anticorpos e fragmentos de anticorpo que neutralizam o VEGF humano reportados na literatura, não apenas com relação à seqüência de aminoácido, mas também em termos do epítopo reconhecido no antígeno e, em conseqüência, em seu provável mecanismo de interferência com as fun- ções biológicas do VEGF humano nativo.

Exemplo 10. Avaliação do efeito anti-proliferativo in vitro de diferentes molé- culas que reconhecem o VEGF humano no modelo de células endoteliais de cordão umbilical humano estimuladas com VEGF humano

Os efeitos anti-proliferativos in vitro de moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 foram determinados em um modelo de células endoteliais de veia de cordão umbilical humano (HuVEC), estimuladas com VEGF humano, resumidamente, 3.000 células HuVEC (PromoCeII GmbH) foram colocadas por cavidade de uma lâmina de cultura com 96 cavidades (Costar), previamente revestida com Gelatina a 1% (Sig- ma), em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 1% (v/v) (Gibco) em crescimento a 37°C em 5% de CO2 durante 24 h. As células fo- ram estimuladas com meio fresco suplementado com 10 ng/mL de VEGF-A humano (Peprotech) e incubadas com diferentes concentrações das molécu- las scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 y ScFv2-Fc 2H 1-8.2. A Figura 13 mostra a proliferação de células HuVEC crescidas

na presença de 10 ng/mL de VEGF-A humano, arbitrariamente definida co- mo 100% (controle de proliferação sem interferência, barra de VEGF) e quando misturas das moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 purificadas foram adicionadas às células em três concen- trações diferentes (barra listrada: 2 pg/mL; barra sólida: 1 pg/mL e barra va- zia: 0,5 pg/mL), com 10 ng/mL de VEGF-A humano (Peprotech). Como con- trole de inibição, a mistura de 0,5 pg/mL de receptor solúvel KDR-Fc (Sigma) foi usada. Como controle negativo, um scFv anti-HBsAg foi empregado na mistura. Após 72 horas de incubação, as células foram coradas com violeta cristal a 0,5% em metanol a 20%. As lâminas foram lavadas com água e se- cas ao ar. A coloração foi eluída com uma solução a 1:1 de etanol em citrato de sódio a 0,1 Mea absorbância lida em uma leitora de lâminas a 562 nm. O valor da absorbância de proliferação basal foi subtraído dos valores de todas as lâminas e os dados foram representados como o percentual de ini- bição versus o controle de proliferação máximo. Conforme mostrado na Fi- gura 13, as moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fe 2H1 8.2 inibem a proliferação de células HuVEC de uma maneira dependen- te da dose, em valores entre 45 e 58%.

Exemplo 11. Avaliação do efeito anti-anqioqênico in vivo de diferentes molé- culas que reconhecem o VEGF humano no modelo de pelotas de Matrigel subcutâneas em camundongos O efeito anti-angiogênico in vivo das moléculas scFv 2H1, Fab

2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 foi estudado no modelo expe- rimental descrito por Passaniti e colaboradores (Passaniti A. e colaborado- res, 1992. Lab Invest. 67: 519-28). Nesse modelo, a angiogênese é induzida através da inoculação subcutânea de camundongos C57BI/6 com um extrato de proteínas da matriz extracelular (Matrigel, Becton Dickinson) na presença de fatores pró-angiogênicos. Os animais foram divididos em grupos de 10 e injetados subcutaneamente na região abdominal com 500 μΐ- de Matrigel contendo 100 ng de VEGF humano (Peprotech) e diferentes concentrações das moléculas a ensaiar, incluindo um anticorpo não relacionado (CB-Hep.1, anti-HBsAg, Heber Biotec, Havana). Após seis dias, os animais foram sacri- ficados, as pelotas de Matrigel extraídas e os teores de hemoglobina de ca- da uma determinados através do método de Drabkin usando o kit reagente de Drabkin (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. As moléculas scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 inibem signifi- cativamente (p < 0,001) a vascularização induzida pelo VEGF nas pelotas de Matrigel, isso se correlacionando com a diminuição dos teores de hemoglo- bina.

Exemplo 12. Avaliação do efeito anti-anqioqênico in vivo de diferentes molé- culas que reconhecem o VEGF humano no modelo experimental de camun- donqos nus xenotransplantados com células tumorais A431 humanas

Em virtude do fato de a angiogênese induzida pelo tumor e al- gumas células do estroma do tumor serem essenciais para seu crescimento e disseminação e essa angiogênese ser principalmente em virtude do VEGF produzido por esses elementos celulares, o modelo eficaz para o ensaio de substâncias anti-angiogênicas é aquele da inibição do crescimento de tumor em animais. Em virtude do fato de o scFv 2H1 e todas as outras moléculas derivadas de sua VR identificarem o VEGF humano e não de camundongo, o modelo de crescimento de tumor em camundongos foi estabelecido com células tumorais humanas inoculadas em camundongos atímicos isogênicos (camundongos nus; nu/nu). No experimento, nós usamos 9 grupos de 5 ca- mundongos atímicos nu/nu do gênero BALB/c (CENPALAB, Havana), com 8-10 semanas de idade. Os grupos de tratamento foram organizados para cada uma das quatro moléculas a testar (scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2) considerando dois níveis de dose: 25 mg/kg e 2,5 mg/kg por camundongo em PBS, pH de 7,2. O nono grupo (controle ne- gativo) foi tratado com o veículo (PBS, pH de 7,2). Os camundongos foram injetados subcutaneamente com 5x106 células de tumor A431 humano (ATCC, CRL 1555) na zona dorsal direita. Quando os tumores obtiveram volumes de 200 mm3, os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em 9 grupos de 5 e o tratamento iniciado conforme indicado para cada grupo experimental. As administrações foram feitas intraperitonealmente, em um volume de 200 μ!_, cada 2 dias durante 3 semanas. O controle foi inoculado com o anticorpo monoclonal de murino não relacionado CB-Hep.1 na maior dose. O acompanhamento de crescimento do tumor foi feito com medições do maior (comprimento) e menor (largura) do tumor, usando um calibrador digital. Os volumes do tumor foram calculados como: volume do tumor (mm3) =0,52 χ comprimento (mm) χ Iargura2 (mm). Os volumes do tumor ao longo do período de observação foram comparados usando o estadigráfico ANO- VA de uma via e um pós-teste de Bonferroni. Após o período de tratamento estabelecido, os animais foram sacrificados e os tumores foram cirurgica- mente removidos e histologicamente analisados usando Hematoxilina e Eo- sina.

Conforme mostrado na Figura 14, todos os animais inoculados com scFv 2H1, Fab 2H1-32, ScFv2-Fc 2H 1-4.1 e ScFv2-Fc 2H 1-8.2 mostra- ram uma redução estatisticamente significativa do volume do tumor com re- lação ao controle negativo e uma dependência acentuada da dose. Das qua- tro moléculas, ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 proporcionaram os me- lhores resultados, isso sendo possivelmente relacionado aos maiores tama- nhos das moléculas, que aumenta sua biodisponibilidade, mesmo se acredi- te que, em termos de número de sítios de ligação por unidade de massa, o scFv 2H1 tenha uma ligeira vantagem com relação a essas moléculas. As diferenças encontradas para os fragmentos Fab e scFv 2 H1 não foram esta- tisticamente significativas, mesmo embora a massa molecular seja quase dupla em favor do Fab. Isso poderia ser em virtude do fato de que, para anti- corpos que neutralizariam moléculas solúveis, mais do que afetar diretamen- te as células tumorais, a penetração do tumor (supostamente melhor com um menor tamanho) não é tão crítica quanto a biodisponibilidade, isto é, fa- vorece apenas as moléculas "do tipo IgG' como ScFv2-Fc 2H1 4.1 e ScFv2-Fc 2H1 8.2 em virtude da presença de um Fc que é compatível para a recicla- gem mediada pelo FcRn (Vaccaro C. e colaboradores, 2005. Nature Biote- chnol 23: 1283-1288). Para a última propriedade, os fragmentos scFv e Fab não são tão diferentes, uma vez que ambos carecem do Fe. A análise histo- lógica mostrou que os tumores tratados tinham uma redução significativa na densidade vascular, uma redução no diâmetro dos vasos sangüíneos, um aumento na apoptose de células tumorais e uma redução nos quadros mitó- ticos.

Exemplo 13. Capacidade do fragmento scFv 2H1 radio-rotulado com 125I de se alojar seletivamente na área do tumor usando camundongos nus inocula- dos com células A431

Para determinar a capacidade do fragmento scFv 2H1 de se alo- jar na área onde células A431 estavam crescendo, esse fragmento e um de controle (um antígeno de scFv na superfície anti-Hepatite B de murino; scFv- Hep.1) foram rotulados com 125I (Amersham, Reino Unido) usando o proce- dimento Iodogen (Fraker PJ, Speck JC Jr. 1978. Biochem Biophys Res Comm 80: 849-857) para atividades específicas finais de 1,3 MBq/5 μg e 1,28 MBq/5 pg, respectivamente. Os produtos radio-rotulados foram analisados em cromatografia em camada fina para detectar a incorporação na proteína, reportando valo- res de 93 e 95% de radioatividade, respectivamente. A capacidade dos pro- dutos radio-rotulados de detectar seus antígenos correspondentes (VEGF humano e HBsAg) foi estudada em um sistema onde imunotubos de poliesti- reno foram revestidos com a isoforma 121 de VEGF recombinante humano (5 Mg/mL; Peprotech) ou HBsAg recombinante (5 pg/mL; Heber Biotec, Ha- vana), que foram então bloqueados e colocados em contato com amostras dos fragmentos radio-rotulados da especificidade correspondente, ajustada para as quantidades que poderiam ser teoricamente capturadas pela fase sólida. Após incubações e lavagens, nós determinamos que a fase sólida foi capaz de ligação de 84 e 82% de radioatividade para scFv 2H1 e scFv- Hep.1, respectivamente, mostrando que o procedimento de radio-rotulação não altera de modo importante a atividade biológica dos fragmentos. Para estudar a biodistribuição, nós usamos 20 camundongos

nu/nu. Os animais foram inoculados subcutaneamente com 5x106 células de tumor humano da linhagem de cultura A431 na zona dorsal direita. Quando os tumores obtiveram volumes em torno de 300 mm3, os animais foram alea- toriamente distribuídos em 4 grupos de 5 animais e o tratamento iniciado. Os camundongos foram injetados através da veia caudal com o produto radio- rotulado (10 com scFv 2H1 e 10 com scFv Hep.1) e sacrificados em grupos de cinco para cada produto após 24 e 48 h. Amostras de tumor, baço, fíga- do, rim, intestino, músculo, medula óssea e sangue foram removidas através de cirurgia ou amostragem. O acúmulo de radioatividade foi expresso como percentual da dose injetada por grama de tecido. Calibração foi feita usando uma amostra padrão da dose injetada. A radioatividade foi medida usando um contador de cintilação gama.

A Figura 15 mostra o percentual de radioatividade recuperada por tecido estudado, em diferentes momentos, com relação à radioatividade injetada total. Junto com os resultados resumidos na Tabela 9 para o caso específico da proporção de radioatividade no tumor:sangue, o experimento mostrou que de 24 a 48 horas após injeção, o fragmento scFv 2H1 se Iocali- za preferencialmente no tecido tumoral, diferente do scFv Hep.1 não especí- fico.

Tabela 9. Proporção de radioatividade no tumorsanque para camundongos nus transplantados com células de tumor humano A431 que expressam VEGF humano

Molécula 24 h 48 h scFv 2H1 33,3 30,0 scFv-Hep.1 0,4 1,0

Esses resultados sugerem que o fragmento scFv 2H1 pode se localizar especificamente em zonas anatômicas onde há uma alta concen- tração local de VEGF humano, como em um tumor A431 e acredita-se que seja útil para a distribuição específica de diferentes produtos terapêuticos a essa zona, tal como um isótopo radioativo ou, eventualmente, uma toxina ou um fármaco. Os valores correspondem a 24 e 48 h após injeção de diferen- tes moléculas radio-rotuladas com 125I aos animais. Cada proporção foi cal- culado começando a partir dos valores médios derivados de tecidos recupe- rados de 5 camundongos. Exemplo 14. Prevenção de neovascularização coroidal experimental (CNV) em primatas não-humanos usando o fragmento scFv 2H1 e a molécula biva- Iente ScFvrFc 2H 1-4.1.

Como um modelo para neovascularização coroidal experimental (CNV), nós empregamos aquele reportado por Krzystolik e colaboradores (Krzystolik M.G. e colaboradores, 2006. Acta Ophthalmol, 120: 338-346). Seis macacos cynomolgus (Macaca fascicularis, CENPALAB, Havana) foram mantidos e manipulados de acordo com as diretrizes Good Laboratory Ani- mal Practice da instituição. Os animais foram anestesiados para todos os procedimentos com injeções intramusculares de hidroclorato de cetamina, maleato de acepromazina e sulfato de atropina. Anestesia tópica com hidro- clorato de proparacaína também foi usada. Anestesia antes de enucleação e eutanásia foi feita com pentobarbital sódico intravenoso. As membranas de CNV foram induzidas na maculo usando queimas a laser de argônio, asse- gurando que o procedimento produzia uma bolha e uma pequena hemorra- gia, com um ponto de aplicação entre 50 e 100 Mm. Fotografia e angiografia fluorescente foram usadas para detectar e medir a extensão e característi- cas das lesões. Os olhos dos animais foram verificados em diferentes dias, antes e após aplicação do fragmento e placebo e do procedimento de quei- ma a laser, bem como no final do experimento, que terminou com enuclea- ção e sacrifício do animal.

Os animais foram divididos em dois grupos de 3, de acordo com a molécula a ser estudada: o fragmento de anticorpo scFv 2H1 ou a molécu- la bivalente do tipo imunoglobulina ScFv2-Fc 2H 1-4.1. O olho direito de cada animal recebeu 500 pg de scFv 2H1 ou ScFv2-Fc 2H 1-4.1, de acordo com o grupo, em 50 pL de PBS através de injeção intravítrea, enquanto que o olho esquerdo foi injetado apenas com o veículo. Os olhos receberam 2 injeções antes de tratamento a laser (dias 0 e 14). No dia 21, todos os olhos recebe- ram o tratamento a laser para a indução de CNV. A injeção foi repetida em cada olho no dia 2 com o produto específico ou veículo. Três semanas após indução a laser (dia 42), os animais receberam injeções intravítreas, esse tempo todo com o fragmento scFv 2H1 das molécula ScFv2-Fc 2H 1-4.1, de acordo com o grupo, para terminar com uma injeção similar final no dia 56.

Na fase I de tratamento (antes do dia 42), os estudos mostraram uma redução no início de lesões do grau 4 nos olhos onde scFv 2H1 ou ScFv2-Fc 2H 1-4.1 foram administrados, em comparação com os respectivos olhos de controle, todos os quais sugerem que a molécula ajuda na preven- ção de CNV. Na segunda fase de tratamento, quando todos os olhos recebe- ram scFv 2H1 ou ScFv2-Fc 2H1-4.1, nós detectamos uma redução nas Ie- sões de grau 4, o que sugere que o fragmento e a molécula bivalente tam- bém são benéficos para lesões estabelecidas.

Exemplo 15. Expressão de moléculas diméricas que compreendem duas unidades do fragmento scFv fundidas ao Fc de uma IqGI humana em plan- tas de tabaco transqênicas PCR em condições conforme descrito para o Exemplo 8 foi usa-

da para amplificar o gene que codifica ScFv2-Fc 2H1-4.1 e modificar as ex- tremidades com a adição de sítios de restrição apropriados (Ncol e Xbal) para clonar em vetores de células de planta. Os oligonucleotídeos sintéticos básicos usados em PCR foram criados sobre as seqüências reportadas em SEQ ID No. 13. O fragmento de DNA amplificado foi detectado como uma banda principal de aproximadamente 1,4 kb e purificada sobre um gel de agarose a 1% (Sigma) usando um kit de Extração de Gel QIAquick (QIA- GEN1 GmbH). O DNA foi digerido com as enzimas antes mencionadas e clo- nado no vetor pHES74 (López A. e colaboradores, 1996. Biotecnologia Apli- cada 13: 265-270) na forma de uma construção scFv-dobradiça-CH2-CH3, precedida da seqüência sinalizadora para a esporamina de batata doce. Es- se vetor tem o promotor 35S de CaMV, uma região líder do vírus mosaico de tabaco Omega que atua como um intensificador traducional da quantidade da proteína produzida e um terminador de sintase de nopalina que também promove a alta expressão de genes estranhos em plantas transgênicas. O "cassete" de expressão de gene de promotor-scFv-Fc-terminator foi introdu- zido no vetor binário pDE1001 para produzir o plasmídeo final pDEscFv- Fc.70. Os detalhes para as construções usadas nesse exemplo são simila- res àqueles reportados anteriormente (Ramírez, N. e colaboradores, 2002. Transgenic Res. 11: 61-64).

O plasmídeo final pDEscFv-Fc.70 foi usado para transformar células SR1 de Nicotiana tabacum cv. Petit Havana através de transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens. As plantas FO e F1 foram obtidas através de procedimentos convencionais previamente descritos e a expressão das moléculas scFv-Fc ativas foi detectada usando um ensaio ELISA similar àquele descrito no Exemplo 8. As moléculas de scFv-Fc biologicamente ativas são preparadas

na forma de proteínas de planta solúveis totais (TSP), extraídas através de trituração de 0,4 g de folhas de planta de tabaco transformadas ou controles não transformados em nitrogênio líquido até um pó fino ser obtido, conforme descrito em alguma parte. O pó é transferido para um tubo de reação e mis- turado a 1:2 (peso/v) com tampão de extração (Tris-HCI a 61 mM, pH de 6,9; SDS a 2%; glicerol a 12,5%) e incubado em gelo durante 5 min. O material insolúvel é removido através de centrifugação a 13.000 rpm e a fração solú- vel ensaiada em ELISA em diferentes diluições usando anticorpos anti-Fc humano conjugados à fosfatase alcalina (Sigma) para detectar a expressão. Nós detectamos que a TSP proveniente de plantas transgênicas continha moléculas capazes de reconhecer o VEGF humano revestido sobre uma superfície sólida, que nós não identificamos pela TSP originária das plantas de controle. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnologia

<120> Anticorpos Recombinantes Contra o Fator de Crescimento Endotel

al Vascular (VEGF)

<130> anti-angio CIGB <14 0> <141>

<150> CU 2006- 0208

<151> 2006-11-01

<160> 15

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 36

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<400> 1

gatctgctag ccgcacccat ggcagaagga ggaggg 36

<210> 2

<211> 26

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<400> 2

gggggatccc cgcctcggct tgtcac 26

<210> 3

<211> 558

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<4 00> 3 atggctttag ttgaattgaa agtgcccgac attggcggac acgaaaatgt agatattatc 60 gcggttgaag taaacgtggg cgacactatt gctgtggacg ataccctgat tactttggat 120 ctagatcacg atgacgatga cgataaagct tcagatctgc tagccgcacc catggcagaa 180 ggaggagggc agaatcatca cgaagtggtg aagttcatgg atgtctatca gcgcagctac 240 tgccatccaa tcgagaccct ggtggacatc ttccaggagt accctgatga gatcgagtac 300 atcttcaagc catcctgtgt gcccctgatg cgatgcgggg gctgctgcaa tgacgagggc 360 ctggagtgtg tgcccactga ggagtccaac atcaccatgc agattatgga gatcgaacct 420 gagcaaggcc agcacatagg agagatgagc ttcctacagc acaacaaatg tgaatgcaga 480 ccaaagaaag atagagcaag acaagaaaaa tgtgacaagc cgaggcgggg atcccgggca 540 caccatcacc atcaccat 558

<210> 4

<211> 19

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<4 00> 4

ctattctccc atggcacag 19

<210> 5

<211> 18

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<4 00> 5

ttctgtatga ggttttgc 18

<210> 6

<211> 804

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: FRAGMENTO DE ANTICORPO RECOM- BINANTE <400> 6

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca atctcctgta agggttctgg atacagcttt atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa caggccaaat cctcaggatc aggctccgaa gagccctcac tgactgtgtc cccaggaggg ggagcagtca ccagtggtaa ctatccaaac agggcactga tttatagtac aagcaacaaa tccctccttg ggggcaaagc tgccctgacc gagtattact gcttgctctc ctatagtggt ctgaccgtcc taggtgcggc cgctggatcc aactcacatc accatcacca tcac

<210> 7

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca

atctcctgta agggttctgg atacagcttt

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg

tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg

gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa

<210> 8

<211> 333

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

62

gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag 60 accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag 120 atcatctatc ctggtgactc tgataccaga 180 atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc 240 gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc 300 gggacaatgg tcaccgtctc ttcggcccct 360 tccaaagtcg accaggctgt ggtgactcag 420 acagtcactc tcacctgtgc ttccagcatt 480 tggttccagc agagacctgg acagccaccc 540 cactcctgga cccctgcccg gttctcaggc 600 ctttcgggtg cgcagcctga ggatgaggct 660 gctcggccgg tgttcggcgg agggaccaag 720 gaacaaaagc tgatctcaga agaagaccta 780 804 gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag 60 accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag 120 atcatctatc ctggtgactc tgataccaga 180 atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc 240 gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc 300 gggacaatgg tcaccgtctc ttcg 354 caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60 acctgtgctt ccagcattgg agcagtcacc agtggtaact atccaaactg gttccagcag 120 agacctggac agccacccag ggcactgatt tatagtacaa gcaacaaaca ctcctggacc 180 cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240 cagcctgagg atgaggctga gtattactgc ttgctctcct atagtggtgc tcggccggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 9

<211> 657

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição de seqüência Artificial: CADEIA LEVE DE FRAGMENTO FAB

RECOMBINANTE <400> 9

caggctgtgg tgactcagga gccctcactg acctgtgctt ccagcattgg agcagtcacc agacctggac agccacccag ggcactgatt cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg cagcctgagg atgaggctga gtattactgc ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca gccagcagct acctgagcct gacgcctgag caggtcacgc atgaagggag caccgtggag <210> 10 <211> 732

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: CADEIA PESADA DE FRAGMENTO

FAB RECOMBINANTE

actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60

agtggtaact atccaaactg gttccagcag 120

tatagtacaa gcaacaaaca ctcctggacc 180

ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

ttgctctcct atagtggtgc tcggccggtg 300

ggtgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360

gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420

gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 480

ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540

cagtggaagt cccacaaaag ctacagctgc 600

aagacagtgg cccctacaga atgttca 657 <400> 10

cagcaggtcc agctggtgca gtctggagca gaggtgaaaa agccggggga gtctctgaag 60

atctcctgta agggttctgg atacagcttt accagctact ggatcggctg ggtgcgtcag 120

atgcccggga aaggcctgga gtggatgggg atcatctatc ctggtgactc tgataccaga 180

tacagcccgt ccttccaagg ccaggtcacc atctcagccg acaagtccat cagcaccgcc 240

tacctgcagt ggagcagcct gaaggcctcg gacaccgcca tgtattactg tgcgagactc 300

gtggttaggg atacagaaat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtccacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtagt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgcggccg cacatcacca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa 720

gaggatctga at 732

<210> 11

<211> 35

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<400> 11

acagggctta aggaggtgca gctggtgcag tctgg 35

<210> 12

<211> 36

<212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO

<400> 12

tgttgttcta gaacctagga cggtgacctt ggtccc 36

<210> 13

<211> 1467 <212> ADN

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: ANTICORPO RECOMBINANTE

<4 00> 13

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagactcgtg 300

gttagggata cagaaatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc ggcccctcag 360

gccaaatcct caggatcagg ctccgaatcc aaagtcgacc aggctgtggt gactcaggag 420

ccctcactga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtgcttc cagcactgga 480

gcagtcacca gtggtaacta tccaaactgg ttccagcaga gacctggaca gccacccagg 540

gcactgattt atagtacaag caacaaacac tcctggaccc ctgcccggtt ctcaggctcc 600

ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgagga tgaggctgag 660

tattactgct tgctctccta tagtggtgct cggccggtgt tcggcggagg gaccaaggtc 720

accgtcctag gttctagagg cggaggtgga tcgggcggag gtggatcggc agagcccaaa 780

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960

gtggacggcg tgaaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1140

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 14 67 <210> 14 <211> 1467 <212> ADN

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição de seqüência Artificial: ANTICORPO RECOMBINANTE

<4 00> 14

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgtcagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagactcgtg 300 gttagggata cagaaatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc ggcccctcag 360 gccaaatcct caggatcagg ctccgaatcc aaagtcgacc aggctgtggt gactcaggag 420 ccctcactga ctgtgtcccc aggagggaca gtcactctca cctgtgcttc cagcattgga 480 gcagtcacca gtggtaacta tccaaactgg ttccagcaga gacctggaca gccacccagg 540 gcactgattt atagtacaag caacaaacac tcctggaccc ctgcccggtt ctcaggctcc 600 ctccttgggg gcaaagctgc cctgaccctt tcgggtgcgc agcctgagga tgaggctgag 660 tattactgct tgctctccta tagtggtgct cggccggtgt tcggcggagg gaccaagctg 720 accgtcctag gttctagagg cggaggtgga tcgggcggag gtggatcggc agagcccaaa 780 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960 gtggacggcg tgaaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1140 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1467 <210> 15 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição de seqüência Artificial: PEPTÍDEO SINTÉTICO

<4 00> 15

Cys Cys Arg Thr Leu Met Leu Leu Gln Tyr His Arg 10

Claims

1. Anticorpos recombinantes que interferem com o efeito pró- angiogênico do VEGF-A humano e que são caracterizados pelo fato de que eles compreendem regiões variáveis de imunoglobulina humana codificadas pelas seqüências de nucleotídeo SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8 ou seqüên- cias homólogas e reconhecem um epítopo no VEGF-A humano definido pe- los resíduos antigênicos C102, C57, R56, T31 e L32.

2. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ca- racterizado pelo fato de que as seqüências SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8 ou seqüências homólogas estão compreendidas dentro da seqüência que codi- fica um fragmento de anticorpo Fv com uma única cadeia (scFv) onde as regiões variáveis de cadeias pesada e leve originárias de anticorpo humano são separadas por um segmento ligante.

3. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 2 onde a seqüência de codificação de scFv é SEQ ID No. 6.

4. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ca- racterizado pelo fato de que as seqüências SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8 ou seqüências homólogas estão compreendidas dentro da seqüência que codi- fica um fragmento de anticorpo do tipo Fab1 com domínios constantes de uma imunoglobulina IgG humana de consenso.

5. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 4 ca- racterizado pelo fato de que as seqüências de codificação para o fragmento do tipo Fab são SEQ ID No. 9 e SEQ ID No. 10.

6. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ca- racterizado pelo fato de que as seqüências SEQ ID No. 7 e SEQ ID No. 8 ou seqüências homólogas estão compreendidas dentro da seqüência que codi- fica uma cadeia polipeptídica constituída por um fragmento scFv ligado, a- través de um espaçador, aos domínios constantes de dobradiça, CH2 e CH3 de imunoglobulina humana, pelo fato de que sua forma de proteína se asso- cia covalentemente à outra cadeia polipeptídica idêntica para formar uma molécula dimérica.

7. Anticorpo recombinante de acordo com a reivindicação 6 ca- racterizado pelo fato de que os domínios constantes de imunoglobulina hu- mana são dos tipos IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4.

8. Anticorpo recombinante de acordo com as reivindicações 6 e 7 caracterizado pelo fato de que as seqüências que codificam a cadeia poli- peptídica, constituídas por um fragmento scFv ligado através de um espaça- dor aos domínios constantes de dobradiça, CH2 e CH3, são SEQ ID No. 13 ou SEQ ID No. 14.

9. Anticorpo recombinante de acordo com as reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que ele contém, adicionalmente, um isótopo ra- dioativo ou um agente químico ou biológico que possui potencial anti-tumor ou anti-angiogênico.

10. Anticorpo recombinante de acordo com as reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que ele contém, adicionalmente, um isótopo ra- dioativo que confere potencial para diagnóstico de tumor in vivo.

11. Anticorpo recombinante de acordo com as reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que ele é produzido por bactérias ou Ievedos recombinantes ou em células de mamífero ou outros sistemas eucariotas.

12. Vetores que codificam anticorpos recombinantes de acordo as reivindicações 1 a 8 obtidos através de manipulação genética via DNA recombinante, esses vetores sendo plasmídeos ou seqüências capazes de integração em células hospedeiras.

13. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo re- combinante de acordo com as reivindicações 1 a 9.

14. Uso dos anticorpos recombinantes de acordo com as reivin- dicações 1 a 9 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de entidades que desenvolvem um aumento na angiogênese, tais como entida- des oculares, processos neoplásicos, processos inflamatórios agudos e crô- nicos e processos autoimunes, através de imunoterapia passiva.

15. Uso dos anticorpos recombinantes de acordo com as reivin- dicações 1 a 9 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de tumores malignos e metástases através de imunoterapia passiva.

16. Uso dos anticorpos recombinantes de acordo com as reivin- dicações 1 a 9 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade através de imunoterapia passiva.

17. Uso do anticorpo recombinante de acordo com a reivindica- ção 10 para a fabricação de um produto radio-farmacêutico para o diagnósti- co in vivo de tumores malignos e suas metástases empregando técnicas de formação de imagem.