WO2005040147A1 - 抗腫瘍剤 - Google Patents

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cell
anhydrofructose
tumor
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Ikurou Maruyama
Kazuhiro Abeyama
Yasushi Yoshimoto
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Nihon Starch Co., Ltd.
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    • C07D309/30—Oxygen atoms, e.g. delta-lactones

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor agent comprising 1,5-D-anhydrofructose and ⁇ or ascopilone as active ingredients.
  • 1,5-D-Fanhydrofructose is a sugar having a specific structure in which one water molecule is removed from glucose. It has already been reported that it has antioxidant activity (see Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-1505988) and antibacterial activity (see Japanese Patent Application No. 2001-89377). In addition, recent studies have reported that it has a hyperglycemic inhibitory effect (see Japanese Patent Publication No. 2003-519660), and it is also attracting attention as a novel physiologically active sugar.
  • ascopirone can be prepared from 1,5-D-anhydrofructose by an enzymatic reaction (see WO 3Z38084, WO 03/38085 and WOO 3Z38107).
  • Ascopirone was originally known to be biosynthesized by certain ascomycetes (see MA Baute, phy tochemi stry, 33, (1991) 41-45).
  • Ascopirone P (2_Hyd roxyme t hy l— 5—hyd r oxy— 2,3-di hyd r o-4H-pyr an-4-one) was obtained in 1978 and 1 Prepared in 981 by a group of scientists in the United States for the purpose of using ascopilone P as a starting material for organic synthesis by pyrolyzing amyctic pectin, amylose, and cellulose (Sha jazz ad eh). , F., eta 1., Carbohyd r. Res., 67, (1978) 433-447 and Stevenson, F., eta1., Carbohyd r. Res., 90, (1981 319-325).
  • Ascopilone P (hereinafter sometimes abbreviated as APP) has been reported to have antioxidant and antibacterial activities similar to 1,5-D-anhydrofructose (WO02 / 26060, WO02 / 26061 and lAVOO). 0/56838). Many of the antitumor agents currently used in clinical settings have a pro-oxidant effect due to their chemical properties, and may cause side effects such as liver damage, kidney damage, bone marrow suppression, and lung damage High. On the other hand, 1,5-D-anhydrofructoses and ascopilone have antioxidant activity and also suppress inflammatory cell activation (active oxygen production). It is thought to attenuate the inflammatory tissue damage seen in some antitumor agents. Therefore, when used in combination with other antitumor agents, it can be expected to be applied not only to enhancement of antitumor effects, but also to adjuncts to the treatment of iridaku which leads to reduction of side effects. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide 1,5-D-anhydrofluc! It is an object of the present invention to provide the use of mono- and z- or escopilone for inhibiting tumor growth or metastasis.
  • Another object of the present invention is to provide an antitumor agent having 1,5-D-anhydrofructose and Z or ascopilone as active ingredients, which is expected to suppress inflammation and has an excellent prognosis. .
  • antitumor agent characterized in that it contains 1,5-D-anhydrofructose and Z or ascopirone.
  • anti-tumor is a concept including an action of suppressing the growth or metastasis of a tumor.
  • Ascopirone in the present invention includes, for example, 1,5-D-anhydrofructose dehydratase derived from 1,5-D-anhydrofructose dehydratase derived from Ascomycetes (Ascomycetes), or 1,5-D —Dehydration of 1,5-D-anhydrofructose by chemical or physical manipulations, such as those produced by treating anhydrofructose under alkaline conditions or by heat treatment. Products can be mentioned. Some structural formulas are shown in Fig. 1 as examples of ascopirone.
  • the agent of the present invention can be administered by various methods known per se.
  • the dosage, administration site, administration interval, period, etc. are determined according to the patient's age, weight, medical condition or other drugs or treatment. Can be determined in consideration of the case of using together.
  • the administration method can be, for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or oral administration by injection or infusion, and is not particularly limited.
  • agent of the present invention it is also possible to add the agent of the present invention to food, take the food, and take it into the body.
  • the dose varies depending on the administration method, the interval between administrations, the type of tumor, and the severity of the patient.
  • the dose per dose is 0.00000001 g Zkg-l, 000 mg / kg for ascopilone, preferably 0.001 gZkg to 500 mgZkg, and 1,5-anhydrofurk] ⁇ 0.001 gZkg to 100,000 mg / kg, preferably 0.01 mgZkg to It can be 1,000 mgZkg.
  • this single dose can be administered in several divided doses.
  • the form of the agent of the present invention examples include, but are not limited to, tablets, capsules, powders, granules, suppositories, injections, and transdermal absorbents.
  • the agent of the present invention may also contain components necessary for preparing the preparation, such as a preparation carrier, an excipient, and a stabilizer. Further, as long as the effects of the present invention are exerted, the composition may contain other antitumor agents, other pharmacological components, or nutritional components such as glucose.
  • Adherent cancer cell line C57BL / 6 mouse melanoma cell line (B16 melanoma), human lung adenocarcinoma cell line (A549), human keratinocyte-derived tumor-like cell line (HaCaT), human uterine carcinoma cell lines (H e L a) is 10% FCS ( ⁇ shea calf serum) and DMEM medium supplemented with 2% penicillin Z streptomycin, 37 ° C, and cultured under the conditions of C_ ⁇ 2 concentration of 5%.
  • THP-1 pre-myeloid leukemia cell line
  • FCS FCS
  • RPMI 1640 medium 2% Penicillium phosphorus Bruno streptomycin, 37 ° C, C 0 2 concentration 5% under conditions of And cultured. How to measure the number of live cells
  • B16 me1 anoma cells grown on a 6-well plate were fixed with 2% gludealdehyde, stained with 4% crystal violet, and the stainable cells were determined as viable cells. How to measure the percentage of cell death and the percentage of cells in each cell cycle
  • the cell culture was stimulated with various concentrations of Ascopyrone P solution (Ascopiron P dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO)), and after culturing for a predetermined time, the cells were collected in a floating state using trypsin. Then, the cells were fixed with 70% ethanol at 4 ° C for 30 minutes, and then stained with 50 gZm1 propidium moxide (PI) solution. Thirty minutes later, DNA histograms were generated using FACS and examined for cell death rates and cell cycles. How to measure the number of adherent cells
  • ascopilone P exhibits a cell-killing effect with a wide spectrum, regardless of the type of cancer derived from each cancer cell.
  • apoptotic specific DNA fragmentation was observed 48 hours after addition of ascopilone II (1.4 mM) (FIG. 3). From this, it was confirmed that cell death caused by ascopilone P was apoptosis, and the same results were obtained in a system using A549 cells.
  • ascopilone P was found to induce cell death within 48 hours at 0.35 mM (FIG. 4).
  • HaCa T cells have the characteristics of tumor cells in the presence of 10% FCS, but are known to have characteristics similar to normal cells in the presence of low concentrations of FCS (1% or less). I have. By utilizing this property, the effect of ascopilone P on normal cells was examined. Fig. 5 shows the results. Under the condition of 10% FCS that grows like a tumor, about 30% of cell death was induced within 48 hours after addition of ascopilone P (1.4 mM) (Fig. 5 (c)). In FCS 1% having cell-like characteristics, almost no dead cells were observed even in the presence of 1.4 mM ascopilone P (FIG. 5 (b)). Thus, Ascopilone P is specific for highly proliferative cells (tumor cells) It was suggested that it had no effect on slow-growing cells (normal cells).
  • Fig. 7 shows the results. 12.3 mM 1,5-D-anhydrofluc! Reduced cell adhesion by holpol ester to about 25%. Therefore, it was speculated that 1,5-D-anhydrofructose could suppress the function of the integrin molecule, which is considered to play an important role in tumor cell metastasis. The invention's effect
  • mice After C 57 BL / 6 mice B 16 me 1 an om a cells (5 X 10 6 cells) were seeded intraperitoneally daily from day 15? 83 (phosphate buffer) and Ascopyrone P solution were intraperitoneally administered (the dose was 20 Omg / kg), and the survival rate was examined (cancer peritonitis model).
  • 83 phosphate buffer
  • Ascopyrone P solution were intraperitoneally administered (the dose was 20 Omg / kg), and the survival rate was examined (cancer peritonitis model).
  • B16me1 anoma cells were inoculated in the abdominal cavity of the mouse beforehand, the individual (mouse) died from the 14th day onward if no administration or PBS was administered.
  • the results of examining the life-prolonging effect of ascopirone P on terminal cancer models are shown in FIG.
  • the average survival days were 8 days in the aspcopilone P administration group and 4 days in the PBS group, demonstrating anti-tumor effects even in vivo.
  • B16me1anoma cells (1 ⁇ 10 5 cells) were subcutaneously seeded on the back of C57BL / 6 mice, and PBS and ascopilone P were applied to the tumor every other day from day 3 to day 13.
  • injected subcutaneously into solution dose used in PBS was 2 5mgZkg
  • commentary antitumor effect in tumor volume major axis X minor 2 X0. 52
  • Fig. 10 No difference was observed between the two days after tumor cell inoculation until day 7, but after day 7, the tumor volume of the aspcopilone P-administered group was significantly smaller than that of the PBS-administered group. I understand.
  • THP-1 cells promyelocytic leukemia cells
  • Ascopilone P solution Ascopilone P dissolved in DMSO
  • Cisplatin solution Similarly dissolved in DMS
  • Ascopilone P After stimulating for 48 hours, the cells were thoroughly pipetted and collected in the form of a uniform suspension of single cells. Here, the number of cells was partially measured under a microscope using a hemocytometer. The remaining cell suspension was fixed in 70% ethanol at 4 ° C for 30 minutes, and then stained with a final 5 O ⁇ g / ml propidium moxide (PI) solution.
  • PI propidium moxide
  • Figure 1 shows an example of the structural formula of ascopirone
  • Figure 2 shows the evaluation of aspcopilone P's ability to suppress cell growth by crystal violet staining.
  • Figure 3 shows DNA fragmentation analysis by agarose gel electrophoresis.
  • Fig. 4 shows quantitative evaluation of dead cells by flow cytometry (FACS).
  • Fig. 5 shows quantitative evaluation of dead cells by flow cytometry (FACS).
  • Fig. 6 shows cell cycle by flow cytometry (FACS).
  • Figure 7 shows the functional evaluation of integrin in leukemia cell lines
  • Figure 8 shows (Example 1) the survival rate of mice after administration of ascopilone P
  • Figure 9 shows the survival rate of mice after administration of 1,5-D-anhydrofructose (Example 2)
  • Fig. 10 (Example 3) Evaluation of tumor volume in mice after administration of aspcopilone P Fig. 11 (Example 4) Evaluation of cell growth inhibitory ability of ascopilone P and cisbratin

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Abstract

1,5-D-アンヒドロフルクトースおよび/またはアスコピロンを含有する抗腫瘍剤。この抗腫瘍剤はアスコピロンの腫瘍の増殖ないし転移抑制に有効であり、炎症を抑制することが期待され、予後に優れた効果を発揮する。

Description

技術分野
本発明は、 1, 5— D—アンヒドロフルクトースおよび Ζまたはァスコピロン を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
背景技術
明
1， 5— D—アンヒドロフルクト一ス （以下、 1, 5— AFと略すことがある） 田
は、 ある種の子嚢菌ゃ紅藻が有する酵素 一 1， 4-グルカンリァ一ゼを利用し て澱粉あるいは澱粉分解物を基質として生産することができる。 1, 5—D—ァ ンヒドロフルクトースは、 グルコースから水分子が 1つ取れた特異的な構造を有 する糖である。既に、 これまで抗酸化活性（特表平 9一 505988号公報参照） や抗菌活性を有することが報告されている （特晴 2001 - 89377号公報参 照)。 さらに、最近の研究では高血糖抑制作用（特表 2003— 519660号公 報参照） があることも報告されており、 生理活性を持つ新規の糖としても注目さ れている。
ァスコピロンは 1, 5— D—アンヒドロフルクトースから酵素反応によって調 製できることが報告されている （WOO 3Z38084、 WO 03/38085 および WOO 3Z38107参照）。元来ァスコピロンはある種の子嚢菌が生合成 することが知られており（M. A. Bau t e.， phy t ochemi s t r y, 33, (1991) 41 -45参照）、 P e z i z a 1 e s目例えば、 P i c a r i a 1 e i o c a r aおよび An t h r ac ob i a me l a l omaな らびに Tu b e r a 1 e s目例えば、 Tube r me 1 ano s po r umの 菌体抽出液を 1， 5— D—アンヒドロフルクトースに作用させ調製できることも 報告されている。
ァスコピロン P(2_Hyd r oxyme t hy l— 5— hyd r oxy— 2， 3-d i hyd r o-4H-py r an-4-one) は、 1978年および 1 981年に、 米国の科学者のグループによって、 ァスコピロン Pを有機合成の出 発物質として使用する目的で、 アミ口べクチン、 アミロース、 及びセルロースを 熱分解することによって調製された（Sh a f i z ad eh， F., e t a 1., Ca r bohyd r. Re s., 67, (1978) 433— 447および S t e v e n s o n, F.， e t a 1. , Ca r bohyd r. Re s., 90, (19 81) 319-325参照）。
ァスコピロン P (以下、 APPと略すことがある） は 1， 5— D—アンヒドロ フルクトースと同様に抗酸化活性、 抗菌活性を有することが報告されている （W O02/26060, WO02/26061およ lAVOO 0/56838参照）。 現在、 臨床の場で使用されている抗腫瘍剤の多くは、 化学的性質上、 酸化促進 作用を有しており、 副作用例えば肝障害、 腎障害、 骨髄抑制、 肺障害等を併発す る危険性が高い。 これに対し、 1， 5— D—アンヒドロフルクト一スおよびァス コピロンは抗酸化活性を有し、 炎症細胞の活性ィ匕 （活性酸素産生） をも抑制する ことにより、 ブレオマイシン、 シスブラチンなどの抗腫瘍剤にみられるような炎 症性の組織障害を減弱させると考えられる。 従って、 他の抗腫瘍剤との併用にお いて、 抗腫瘍効果の増強が期待できるだけでなく副作用の軽減をもたらすィ匕学療 法補助薬への応用も期待できる。 発明の開示
本発明の目的は、 1, 5— D—アンヒドロフルク！ ^一スおよび Zまたはァスコ ピロンの腫瘍の増殖ないし転移抑制のための使用を提供することにある。
本発明の他の目的は、 1， 5— D—アンヒドロフルクトースおよび Zまたはァ スコピロンを活性成分とし、 炎症を抑制することが期待される、 予後に優れた抗 腫瘍剤を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は、 以下の説明から明らかになろう。
本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 1, 5— D—アンヒドロフ ルクトースおよび Zまたはァスコピロンを含有することを特徴とする抗腫瘍剤に よって達成される。 本発明において 「抗腫瘍」 とは、 腫瘍の増殖ないし転移を抑制する作用を含む 概念である。
すなわち、 生体内に腫瘍細胞を保有する個体に本発明の剤を適当量しかるべき 方法で投与することにより、 有意に腫瘍の増殖ないし転移を抑制することが可能 である。
本発明におけるァスコピロンとしては、 例えば子嚢菌 (As c omy c e t e s) 由来の 1, 5— D—アンヒドロフルクトース脱水酵素による 1， 5—D—ァ ンヒドロフルクトースの脱水産物、 あるいは 1， 5— D—アンヒドロフルクトー スをアルカリ条件下で処理するか、 或は、 加熱処理を施すことによって生成され るような、 化学的あるいは物理的操作による 1， 5— D—アンヒドロフルクトー スの脱水生成物を挙げることができる。 ァスコピロンの例として、 幾つかの構造 式を図 1に示す。
本発明の剤は、 それ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、 投与 量、 投与部位、 投与する間隔、 期間等は、 患者の年齢や体重、 病状あるいは他の 薬剤や治療法と併用した場合などを考慮して決定することができる。
投与方法としては、 例えば、 注射や点滴などにより静脈内や皮下、 腹腔内、 あ るいは経口投与などによることができ、 特別に制限されない。
また、 本発明の剤を食品に添加し、 その食品を摂取して体内に取り込む形態を とることも可能である。
投与量は、 投与方法、 投与する間隔、 腫瘍の種類および患者の重篤度により異 なるが、 例えば、 一回あたりの投与量はァスコピロンでは 0. 000001 g Zkg〜l, 000mg/kg、好ましくは 0. 00 l gZkg〜500mgZ kgとすることができ、 また 1， 5—アンヒドロフルク ] ^一スでは、 0. 001 gZk g〜l 0， 00 Omg/k g、 好ましくは 0. 01 mgZk g〜 1 , 000 mgZkgとすることができる。
また、 この一回の投与量を数回に分けて投与することもできる。
本発明の剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、 注射剤、経皮吸収剤等が挙げられるが、特に制限されない。また、本発明の剤は、 製剤を調製するうえで必要な成分例えば、 製剤担体ゃ賦形剤、 安定剤等を含有す ることもできる。 さらに、 本発明の効果を奏する限り、 他の抗腫瘍剤あるいはそ の他の薬理成分あるいはブドウ糖などの栄養成分を含むことも可能である。
以下に本発明について検討した結果を詳述する。 なお、 以下の試験においては 1, 5— D—アンヒドロフルクトースおよびァスコピロンは、 公知の方法に基づ いて調製したものを使用した。
試験例
細胞株および培養方法
接着系癌細胞株の C 57 BL/6 マウスメラノーマ細胞株 (B 16 me l anoma)、 ヒト肺腺癌細胞株 （A 549)、 ヒトケラチノサイト由来腫瘍様 細胞株 (HaCaT), ヒト子宮類部癌細胞株（H e L a) は 10 % F C S (ゥシ 胎児血清）と 2 %ぺニシリン Zストレプトマイシンを添加した DMEM培地中で、 37°C、 C〇2濃度 5%の条件下で培養した。浮遊系腫瘍細胞の THP—1 (前骨 髄性白血病細胞株） は 10%FCSと 2 %ぺニシリンノストレプトマイシンを含 む RPMI 1640培地中で、 37°C、 C 02濃度 5 %の条件下で培養した。 生細胞数の測定方法
6ゥエルのプレート上に増殖した B 16 me 1 a n om a細胞を 2 %グル夕 ルアルデヒドで固定した後、 4%クリスタルバイオレットで染色し、 その染色性 のある細胞を生細胞と判定した。 細胞死の割合および各細胞周期にある細胞の割合の測定方法
細胞培養液を種々の濃度のァスコピロン P溶液 （ァスコピロン Pをジメチルス ルホキシド （DMSO) に溶解したもの） で刺激し、 所定の時間培養後、 トリプ シンを用い細胞を浮遊した状態で回収した。 その後、 4°Cで 30分間 70%エタ ノールで固定した後、 50 gZm 1プロピジゥムョード （P I ) 溶液で染色し た。 30分後、 FACSを用いて、 DNAヒストグラムを作成し、 細胞死の割合 および細胞周期について調べた。 接着細胞数の測定方法
THP— 1細胞培養液に 1, 5— D—アンヒドロフルクトース溶液 （1， 5— D—アンヒドロフルクト一スを DMSOに溶解したもの） を添加し、 次いでホル ポ一レエステフレ (PMA； p h o r b o 1 my r i s t a t e ac e t a t e) で刺激した。 37°C、 5%C02条件下で一時間培養後、 G i ems a染色 法で接着した細胞を染色した。 結果および考察
1) ァスコピロン Pによる細胞増殖抑制効果
5x103個/ m 1の B 16 me 1 a n oma細胞 （C 57 BL/6 マウ スメラノーマ細胞） を 6ゥエルのプレートに播種し、 細胞が底面に接着後 (24 h r)、 培養液中の最終濃度が 0〜0. 7 OmM になるようァスコピロン P溶液 (溶媒として DMSOを使用） を等量ずつ添加した。 37°C、 5%C〇2条件下で 一週間培養後、 生細胞数を測定した。
結果を図 2に示す。 コントロール （DMSOのみを添加） での生存細胞を 10 0%としたとき、 ァスコピロン Pを添加することで、 生細胞の数は濃度依存的に 顕著に減少し、 最終濃度 (0. 7 OmM) ではその割合は 50%以下まで低下し た。 これらの結果から、 ァスコピロン Pは腫瘍細胞の増殖抑制能を有すると考え られた。
2) ァスコピロン Pによる腫瘍細胞アポトーシス誘導効果
B 16 me l anoma細胞に対するァスコピロン Pの腫瘍細胞増殖抑制効 果の機序が、 他の抗腫瘍剤においてみられるような殺細胞効果によるものである かを検討した。 本検討項目において、 B 16 me 1 anoma細胞以外に 4種 類のヒト癌細胞株 （THP— 1 ：前骨髄性白血病、 H e L a：子宮顏癌、 A54 9 ：肺胞上皮癌、 H a C a T：皮膚癌モデル細胞） を加えて、 ァスコピロン Pの 刺激により誘導される死細胞の割合を調べた。 なお、 ここでは各癌細胞培養液に 対し、 ァスコピロン Pを 1. 4mMになるように添加し、 48時間後の死細胞の 割合を測定した。 結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000007_0001
表 1より、 ァスコピロン Pはそれぞれの癌細胞に由来する癌の種類を問わず、 幅広いスペクトラムをもった殺細胞効果を示すことがわかる。 さらに、 HaC a T細胞を用いた実験系において、 ァスコピロン Ρを添加後（1. 4mM)、 48時 間でアポト一シス特異的な DN Aの断片化が認められた （図 3)。 このことから、 ァスコピロン Pによる細胞死はアポトーシスであることが確認され、 同じ結果が A549細胞を用いた系においても得られた。 さらに、 THP— 1細胞を用いた 系において、 ァスコピロン Pは 0. 35mMで、 48時間以内に細胞死を誘導す ることが認められた （図 4)。
3) ァスコピロン Pの特異的細胞死誘導作用
HaCa T細胞は、 10 % F C Sの存在下では腫瘍細胞としての特徴を有して いるが、 低濃度の FCS存在下 （1%以下） では、 正常細胞に近い性格をもつこ とが知られている。 この性質を利用して、 ァスコピロン Pが正常細胞に及ぼす影 響を検討した。 結果を図 5に示す。 腫瘍様に増殖している FCS 10%条件下で はァスコピロン P添加後（1. 4mM)、 48時間以内で約 30%もの細胞死を誘 導したのに対し （図 5 (c))、 正常細胞様の特徴をもつ FCS 1%では 1. 4m Mのァスコピロン P存在下においても、 ほとんど死細胞は認められなかった （図 5 (b))。 これより、 ァスコピロン Pは増殖性の高い細胞 （腫瘍細胞） に特異的 に作用し、 増殖の遅い細胞 （正常細胞） にはほとんど影響を及ぼさないことが示 唆された。
一方、 F C S 1 0 %で腫瘍様に増殖している H e L a細胞において、 ァスコピ ロン P添加後 （1 . 4mM) 2 4時間では、 顕著な S期細胞集団の増加および G 2 ZM期の細胞集団の減少が観察され（図 6 )、その後、 4 8時間では先に示した ように約 1 0 %の細胞死を誘導した。 このことから、 ァスコピロン Pの細胞周期 上の作用点は D N A合成期間である S期であり、 G 2 ZM期への移行を阻害し、 結果として細胞死を誘導することが示唆される。 したがって、 ァスコピロン Pが 抗腫瘍剤として生体に投与された場合、 大半が細胞周期上の G 0 / 1期にあると 考えられる正常細胞に障害を与えることなく、 腫瘍細胞にのみ特異的に殺細胞効 果を発揮することが期待される。
4 ) 1 , 5— D—アンヒドロフルクトースによるインテグリンの機能抑制作用 白血病細胞株をホルポールエステル （P MA) で刺激すると、 接着分子インテ ダリンの活性化がみられ、 その結果， 細胞現象として活性酸素生成、 細胞接着宂 進、 細胞浸潤が誘導されることが知られている。 そこで、 1 , 5— D—アンヒド 口フルクトース存在下で、 TH P— 1細胞株を培養し、 ホルポールエステルで刺 激後の接着細胞数を指標としてィンテグリン機能を評価した。
結果を図 7に示す。 1 2 . 3 mMの 1， 5— D—アンヒドロフルク！ スはホ ルポールエステルによる細胞接着性を約 2 5 %程度に抑制した。 従って、 腫瘍細 胞の転移において重要な役割を果たすと考えられるィンテグリン分子の機能を 1， 5— D—アンヒドロフルクトースは抑制しうることが推察された。 発明の効果
1， 5— D—アンヒドロフルクトースおよび Zまたはァスコピロンを用いるこ とで、 副作用を殆ど伴わずに腫瘍の増殖ないし転移を抑制できる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳述する。 本発明はかかる実施例により何 ら制限されるものではない。
実施例
実施例 1
C 57 BL/6 マウスに B 16 m e 1 a n om a細胞 （ 5 X 106個） を腹腔内に播種した後， 15日目から毎日？83 (燐酸緩衝液） ならびにァスコ ピロン P溶液を腹腔内投与し（投与量は 20 Omg/kg),生存率を調べた（癌 性腹膜炎モデル)。 この実験系において、予め B 16 me 1 an oma細胞をマ ウスの腹腔内に播種すると、 無投与ならびに PBS投与の場合、 14日目以降か ら個体 （マウス） は死亡することが確認された。 本実験系を用いて、 ァスコピロ ン Pの末期癌モデルに対する延命効果について検討した結果を図 8に示す。 平均 生存日数はァスコピロン P投与群では 8日、 PBS群は 4日であり、 生体内にお いても抗腫瘍効果を有することが証明された。 さらに、 ァスコピロン P投与群の 40% (n = 2) において、 コントロール （PBS群） と比較して 3倍以上もの ァスコピロン P投与後の生存期間の延長がみられた。 このことは， ァスコピロン Pの in vivoにおける抗腫瘍効果を意味するものである。
実施例 2
実施例 1と同様に C 57 BLZ6マウスに B 16 me l an oma細胞 (5X 106個） を腹腔内に播種した後、 2日目から毎日 PBSならびに 1， 5_ D—アンヒドロフルクトースを腹腔内投与した（投与量は 20 Omg/k g)。生 存率を図 9に示す。 腫瘍細胞播種後の平均生存日数は 1， 5— D—アンヒドロフ ルクトース群が 19日、 コントロールの PBS群が 14日であった。 この結果か ら、 1, 5—D—アンヒドロフルクト一スの担癌マウスに対する延命効果が認め られた。
実施例 3
次に、 C57 BL/6 マウスに B 16 m e 1 a n om a細胞 （ 1 X 105 個） を背中に皮下播種し、 3日目から 13日目まで PBSならびにァスコピロン Pを 1日おきに腫瘍局所に皮下注射し （PBSに溶かした溶液を用い投与量は 2 5mgZkgとした)， 腫瘍の容積 （長径 X短径 2X0. 52) で抗腫瘍効果を評 価した （図 10). 腫瘍細胞播種後、 7日目まではいずれも差は認められなかつ たが、 7日目以降ァスコピロン P投与群は PBS投与群と比べて顕著に腫瘍の容 積が少ないことがわかった。 一般に， 臨床の場では腫瘍の増大速度が遅いものほ ど予後が良好といわれる。 すなわち， ァスコピロン Pの における抗腫瘍 効果を示すものである。 また、 ァスコピロン P投与群の屠殺後の解剖所見では腫 瘍の転移はほとんど観察されなかった。
実施例 4
前骨髄性白血病細胞 （THP— 1細胞） の細胞培養液を種々の濃度のァスコピ ロン P溶液（ァスコピロン Pを DMSOに溶解したもの）、 シスブラチン溶液（同 様に DMS〇で溶解)、さらにァスコピロン Pとシスブラチンの混合溶液で剌激し、 48時間培養後、 十分にピペッティングして均一な単一細胞からなる浮遊液の状 態で回収した。 ここで一部は血球計算板を用い顕微鏡下で細胞数を測定した。 残 りの細胞浮遊液は 4°Cで 30分間 70%エタノール固定した後、 最終 5 O^g/ mlプロピジゥムョード （P I) 溶液で染色した。 30分後、 FACSを用いて DNAヒストグラムを作成し、細胞死の割合を調べ各々の生細胞数を算出した（図 11)。 コントロール （DMSOのみを添加） での生細胞を 100%としたとき、 ァスコピロン Pを添加することでその割合は 30%前後から約 50%まで減少し、 細胞の増殖抑制効果が確認された。 一方、 シスブラチンとァスコピロン Pを併用 した群の生細胞の割合は、 10%前後であり、 ァスコピロン Pとシスブラチンと の相乗効果が確認された。
図面の簡単な説明
図 1はァスコピロンの構造式例
図 2はクリスタルバイオレツト染色法による、 ァスコピロン Pの細胞増殖抑 制能評価
図 3はァガロースゲル電気泳動法による DN A断片化解析
図 4はフローサイトメトリー （FACS) による死細胞の定量的評価 図 5はフローサイトメトリー （FACS) による死細胞の定量的評価 図 6はフローサイトメトリー （FACS) による細胞周期 図 7は白血病細胞株におけるィンテグリンの機能評価
図 8は （実施例 1) ァスコピロン P投与後のマウスの生存率
図 9は （実施例 2) 1, 5— D—アンヒドロフルクトース投与後のマウスの 生存率
図 10は （実施例 3) ァスコピロン P投与後マウスの腫瘍容積の評価 図 11は （実施例 4) ァスコピロン Pとシスブラチンの細胞増殖抑制能評価

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 1， 5— D—アンヒドロフルクトースおよび Zまたはァスコピロンを抗腫瘍 成分として含有することを特徴とする腫瘍の抗腫瘍剤。
2 . ァスコピロンがァスコピロン Pである、 請求項 1に記載の抗腫瘍剤。
3 . 1 , 5—D—アンヒドロフルクトースおよび Zまたはァスコピロンの、 腫瘍 の増殖ないし転移の抑制のための使用。
4. ァスコピロンがァスコピロン Pである、 請求項 3に記載の使用。
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