CN111170980B - 一种毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用。本发明所述毛蕊异黄酮衍生物的合成方法主要包括以下步骤：取化合物1和化合物2溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，然后于加热条件下进行反应，得到目标物粗品。申请人的实验结果表明，本发明所述毛蕊异黄酮衍生物能同时抑制ER阳性乳腺癌细胞和ER阴性乳腺癌细胞的增殖；随着衍生物浓度的增加，乳腺癌细胞的增殖率逐渐下降，且在高浓度时，抑制效果最明显，且对正常乳腺细胞MCF‑10A没有任何影响。

Description

一种毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一种毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术

在全球范围内，根据研究报道乳腺癌是女性中最常见的恶性癌症之一，同时乳腺癌的发病率也位居榜首，约占女性新恶性肿瘤的29％，病死率位于恶性肿瘤致死率的第二位，已经成为威胁女性生命安全的第一危险因素。据统计发现，截止到2016年，我国的乳腺癌患病患者人数已超过约50万，并且发病的年龄逐年下降，呈现低龄化的趋势，而发病率和致死率却逐年的升高，发病率最高的年龄段为35-49岁。国内外学者们对乳腺癌危险因素及发病因素进行广泛研究，提出不同的观点，研究结果存在很多不一致之处。而乳腺癌目前仍首选手术治疗，术后辅以化疗、放疗或内分泌治疗等。

TAK1(转化生长因子b激活的激酶-1)是促***原激活的蛋白激酶激酶激酶家族(MAP3K)的成员。它还会磷酸化MKK家族的成员，当磷酸化时，它可以激活JNK(Jun N末端激酶)和p38激酶。TAK1具有独特的活性，需要结合蛋白TAB1，TAB2和TAB3。泛素化激活TAK1/TAB2或TAK1/TAB3的复合物可以使丝氨酸Ser-177和Ser-181处的IKKb磷酸化，从而在激活环中激活IKK。此外，TAK1/TAB1的复合物还可以使MKK磷酸化并激活JNK和p38，但不激活IKK复合物。因此，这些研究表明，激活TAK1复合体，而激活IKK的TAK1。活化的JNK可以使C-jun磷酸化，进而可以影响细胞凋亡，炎症和肿瘤发生。最近有研究报道，TAK1在多种肿瘤中表达异常偏高，这其中也包括乳腺癌。

基因组学研究表明人类绝大多数基因被转录成非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs包括以miRNA为代表的短小RNA和长链非编码RNA。长链非编码RNA(longnon-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度在200nt～100kb之间的ncRNAs分子。近年大量研究表明，LncRNAs参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。经过充分研究的lncRNA之一是Hox转录反义基因间RNA(HOTAIR)，它位于HOXC(同源异型框C)基因簇中的12q13染色体区域，并隶属于2158个核苷酸长的lncRNA。Hotair是组蛋白修饰复合物的模块化支架，通过将其5'结构域与PRC2复合物结合而使特定基因的表达沉默，而3'结构域则与LSD1/CoREST复合物结合。Hotair在多种癌症(例如乳腺癌，胃癌，膀胱癌和肺癌)中起着致癌分子的作用。同样值得注意的是，HOTAIR在乳腺癌中的表达增加，这一发现为肿瘤转移和患者死亡提供了有力的生物标志物。

黄芪为豆科多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。据药典记载黄芪味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、改善心功能、扩张冠状动脉、利尿消肿、托疮生肌、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗衰老、促进造血功能、保护肝脏等功效。

毛蕊异黄酮(calycosin)是从黄芪中提取和分离出来的一种异黄酮类化合物(马晓丰等，蒙古黄芪中黄酮类成分的研究，中草药，第36卷第9期,2005年9月，p1293-1296)，其结构式如下式所示：

已有的研究表明，毛蕊异黄酮具有抗氧化应激、抗病毒和调节细胞凋亡等作用，但其不足之处在于其有效浓度较大，靶点不明确。低浓度毛蕊异黄酮(<16μM)能够促进ER阳性乳腺癌细胞MCF-7增殖；虽然高浓度毛蕊异黄酮(>20μM)能够抑制ER阳性乳腺癌细胞MCF-7及T47D增殖，但是其对ER阴性乳腺癌细胞的增殖无影响(周黎明、陈健，不同浓度的毛蕊异黄酮对ER阳性乳腺癌细胞的作用及其机制研究，中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集，2012年7月1日，p322-323)。目前还尚未见有能够同时抑制ER阳性乳腺癌细胞和ER阴性乳腺癌细胞的毛蕊异黄酮衍生物的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖，对正常乳腺细胞毒性低，且能抑制ER阳性乳腺癌细胞和/或ER阴性乳腺癌细胞的毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用。

本发明所述的毛蕊异黄酮衍生物，为具有下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

上述式(I)所示化合物的化学名称为：3-(4-甲氧基-3-(乙氧羰基乙氧基)苯基)-7-(乙氧羰基乙氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，分子量为456.4。

本发明还提供上述式(I)所示化合物的合成方法，主要包括以下步骤：主要包括以下步骤：取化合物1和化合物2溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，然后于加热条件下进行反应，得到目标物粗品；其中，所述化合物1和化合物2的结构分别如下：

化合物1、

化合物2。

上述合成方法中，化合物1和化合物2的摩尔比为化学计量比，在实际的操作中，化合物2可以稍微过量。

为了加快反应速率并进一步提高收率，优选是在反应之前加入碘化物，所述的碘化物为碘化钠和/或碘化钾。碘化物的加入使化合物1上的羟基活化从而更有利于反应的进行，所述碘化物的用量通常为化合物1物质的量的0.5-1.5倍。

上述合成方法中，所述的有机溶剂为丙酮和/或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。所述有机溶剂的用量可根据需要确定，通常以能溶解参加反应的原料为宜，具体的，以1mmol的化合物1为基准，参加反应的全部原料用6-20mL第一有机溶剂来溶解。

上述合成方法中，所述的缚酸剂为现有技术中的常规选择，具体可以是选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸铵、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、三乙醇胺、四丁基溴化铵、4-二甲氨基吡啶和吡啶等常用碱性物质中的一种或两种以上的组合，优选为三乙胺、吡啶、碳酸钠或碳酸钾。所述缚酸剂的用量与化合物1物质的量之比优选为1：1。

上述合成方法中，反应优选是在≥40℃的条件下进行，进一步优选是在45℃至第一有机溶剂的沸点温度范围内进行。反应是否完全可以采用TLC跟踪检测，展开剂优选为氯仿：甲醇＝60：1(体积比)。

上述合成方法中，由于反应结束后目标产物在有机溶剂中的溶解度较大，所以反应结束后反应物中的目标产物较少，为了使更多的目标产物析出，通常是在反应物冷却后再向其中加入冰水，通过改变溶液的极性使目标产物以沉淀形式大量析出；然后过滤，收集沉淀，该沉淀即为目标物粗品。还可以将目标物粗品用乙酸乙酯溶解后再用无水硫酸钠干燥以除去目标物粗品中所带的水份。

上述合成方法制得的是式(I)所示化合物的粗品，为了提高其纯度，可以采用现有常规的纯化方法对其进行纯化，因此，本发明所述合成方法优选还包括目标物粗品进行纯化的步骤。本申请中，所述的纯化步骤是将目标物粗品置于乙醇中进行重结晶。当然，也可以采用硅胶柱层析进行纯化。

本发明还包括上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗ER阳性乳腺癌的药物中的应用，或者是在制备治疗ER阴性乳腺癌的药物中的应用，或者是在制备同时治疗ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌的药物中的应用。

进一步的，本发明还提供一种药物组合物，它由治疗上有效剂量的上述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。所述药物的剂型可以是药学上可接受的任意剂型，具体的，可以是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊或注射剂等现有常规剂型。

申请人的实验结果表明，上述式(I)所示化合物能够下调Hotair和p-TAK1的表达水平，并能抑制下游靶点C-jun/IκBα的磷酸化水平，同时抑制ER阳性乳腺癌细胞(如MCF-7、T-47D)和ER阴性乳腺癌细胞(如MDA-MB-231)的增殖；其中MTT实验表明，随着式(I)所示化合物浓度的增加，MCF-7、MDA-MB-231、T-47D的增殖率逐渐下降，且在高浓度时，抑制效果最明显，且对正常乳腺细胞MCF-10A没有任何影响。

附图说明

图1为用不同浓度的式(I)所示化合物对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T-47D及正常乳腺细胞MCF-10A作用48h的量效曲线图，*p＜0.05vs control；其中，(a)为MCF-7，(b)为T-47D，(c)为MDA-MB-231，(d)为正常乳腺细胞MCF-10A。

图2为不同浓度的式(I)所示化合物对MCF-7、MDA-MB-231和T-47D细胞的单细胞克隆影响的染色照片；其中，(a)为MCF-7，(b)为MDA-MB-231，(c)为T-47D。

图3为不同浓度的式(I)所示化合物对MCF-7、MDA-MB-231和T-47D细胞的迁移能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为MCF-7细胞在不同时间划痕区域变化的显微镜照片，(b)为MCF-7细胞在24h的迁移能力柱状图，(c)为MCF-7细胞在48h的迁移能力柱状图；(d)为MDA-MB-231细胞在不同时间划痕区域变化的显微镜照片，(e)为MDA-MB-231细胞在12h的迁移能力柱状图，(f)为MDA-MB-231细胞在24h的迁移能力柱状图；(g)为T-47D细胞在不同时间划痕区域变化的显微镜照片，(h)为T-47D细胞在24h的迁移能力柱状图，(i)为T-47D细胞在36h的迁移能力柱状图。

图4为不同浓度的式(I)所示化合物对MCF-7、MDA-MB-231细胞的侵袭能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为不同浓度的式(I)所示化合物与MCF-7细胞在孵育48h后的染色照片，(b)为不同浓度的式(I)所示化合物与MDA-MB-231细胞在孵育48h后的染色照片，(c)为不同浓度的式(I)所示化合物与MCF-7细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图，(d)为不同浓度的式(I)所示化合物与MDA-MB-231细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图。

图5为不同浓度的式(I)所示化合物对MCF-7、MDA-MB-231、T-47D细胞中Hotair的mRNA表达水平的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为MCF-7，(b)为MDA-MB-231，(c)为T-47D。

图6为不同浓度的式(I)所示化合物对MCF-7、MDA-MB-231、T-47D细胞中TAK1，C-jun/IκBα的蛋白磷酸化水平的影响以及确定TAK1的下游通路为C-jun/IKBα，*p＜0.05vscontrol，#p<0.05vs TAK1；其中，(a)为MCF-7，(b)为MDA-MB-231，(c)为T-47D。

图7为通过转染分别上调MCF-7、MDA-MB-231和T-47D细胞中TAK1磷酸化表达水平，确定转染成功后，分别选取emoty组(A)、TAK1(B)、TAK1+16μM(C)和empty+16μM(D)进行实验，对C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平的检测结果；其中，(a)为MCF-7，(b)为MDA-MB-231，(c)为T-47D，(d)为上调MCF-7后，A、B、C和D组对C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平，(e)为上调MDA-MB-231后，A、B、C和D组对C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平，(f)为上调T-47D后，A、B、C和D组对C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平。

图8为在三种细胞内，Hotair上调成功后，式(I)所示化合物分别对三种细胞中的empty组、HOTAIR组、HOTAIR+16μM组、empty+16μM组式中Hotair的mRNA的表达水平的影响，*p＜0.05vs control，#p<0.05vs HOTAIR，^p<0.05vs HOTAIR；其中，(a)为上调Hotair后式(I)所示化合物对MCF-7细胞的空白组和HOTAIR组中的表达水平，(b)为上调Hotair后式(I)所示化合物对MDA-MB-231细胞的空白组和HOTAIR组中的表达水平，(c)为上调Hotair后式(I)所示化合物对T-47D细胞的空白组和HOTAIR组中的表达水平，(d)为上调Hotair后式(I)所示化合物对MCF-7细胞各组中的表达水平，(e)为上调Hotair后式(I)所示化合物对MDA-MB-231细胞各组中的表达水平，(f)为上调Hotair后式(I)所示化合物对T-47D细胞各组中的表达水平。

图9为通过转染分别上调MCF-7、MDA-MB-231和T-47D细胞中Hotair表达水平，确定转染成功后，分别选取emoty组(A)、TAK1(B)、TAK1+16μM(C)和empty+16μM(D)进行实验，对C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平的检测结果，*p＜0.05vs control，#p<0.05vs HOTAIR，^p<0.05vs HOTAIR；其中，(a)为MCF-7，(b)为MDA-MB-231，(c)为T-47D。

图10为三种细胞中的Hotair上调后，式(I)所示化合物对细胞迁移能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为上调Hotair后MCF-7细胞在不同组中48h后划痕区域变化的显微镜照片，(b)为上调Hotair后MCF-7细胞在48h的迁移能力柱状图，(c)为上调Hotair后MDA-MB-231细胞在不同组中24h后划痕区域变化的显微镜照片，(d)为上调Hotair后MDA-MB-231细胞在24h的迁移能力柱状图，(e)为上调Hotair后T-47D细胞在不同组中48h后划痕区域变化的显微镜照片，(f)为上调Hotair后T-47D细胞在48h的迁移能力柱状图。

图11为在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别上调Hotair后，式(I)所示化合物对细胞侵袭能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)上调Hotair后不同组与MCF-7细胞在孵育48h后的染色照片，(b)为上调Hotair后不同组与MDA-MB-231细胞在孵育48h后的染色照片，(c)为上调Hotair后不同组与MCF-7细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图，(d)为上调Hotair后不同组与MDA-MB-231细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图。

图12式(I)所示化合物抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线，*p＜0.05vs control；其中，(a)为式(I)所示化合物抑制MCF-7所致荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线，(b)为为式(I)所示化合物抑制MDA-MB-231所致荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线。

图13式(I)所示化合物对荷瘤裸鼠肿瘤中TAK1，IκBα，C-jun的蛋白磷酸化水平的影响；其中，(a)为式(I)所示化合物对MCF-7所致荷瘤裸鼠肿瘤中TAK1，IκBα，C-jun的蛋白磷酸化水平的影响；(b)为为式(I)所示化合物抑制MDA-MB-231所致荷瘤裸鼠肿瘤中TAK1，IκBα，C-jun的蛋白磷酸化水平的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：按下述合成路线合成式(I)所示化合物

其中，化合物1的化学名称为：7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物为2为氯乙酸乙酯。

具体的合成方法为：

取1g(3.52mmol)化合物1(毛蕊异黄酮)置于50ml圆底烧瓶中用40ml丙酮溶解,然后加入3g无水K₂CO₃和0.5gNaI，常温搅拌1h后再滴加0.91g(7.43mmol)化合物2(氯乙酸乙酯)，之后置于45℃水浴中搅拌回流4h(TCL监测反应，展开剂为氯仿：甲醇＝60：1，体积比)；然后停止加热，继续搅拌直至冷却。向冷却的反应物中加入冰水，过滤，收集沉淀，将沉淀用入乙酸乙酯溶解并用无水硫酸钠干燥，所得溶液蒸发除去溶剂，残渣用10ml乙醇溶解后置于-20℃冰箱中过夜重结晶，得到淡黄色固体1082.00mg，产率70.50％。

对本实施例所得淡黄色固体产物用核磁共振进行表征，其氢谱和碳谱如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),8.05(d,J＝8.9Hz,1H),7.37–7.08(m,5H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),5.00(s,2H),4.78(s,2H),4.19(dq,J＝14.2,7.1Hz,4H),3.82(s,3H),3.34(s,1H),1.22(d,J＝7.2Hz,6H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ174.94,169.18,168.54,162.42,157.57,154.31,149.34,147.01,127.54,124.62,123.60,122.83,118.55,115.39,115.01,112.58,102.08,65.98,65.56,61.35,61.06,56.15,40.60,40.39,40.19,39.98,39.77,39.56,39.35,14.51.

因此，可以确定本实施例所得淡黄色固体产物即为式(I)所示化合物，其结构式如下述式(I)所示：

实施例2：合成式(I)所示化合物

重复实施例1，不同的是，用无水Na₂CO₃代替无水K₂CO₃，用KI代替NaI，将反应改在55℃条件下进行。

最后得到淡黄色固体，70.21％。

对本实施例所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱表征，确定为式(I)所示化合物。

实施例3：合成式(I)所示化合物

重复实施例1，不同的是，用DMF代替丙酮，用三乙胺代替无水K₂CO₃，将反应改在40℃条件下进行。

最后得到淡黄色固体，23.18％。

对本实施例所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱表征，确定为式(I)所示化合物。

实施例4：合成式(I)所示化合物

重复实施例1，不同的是，不加NaI。

最后得到淡黄色固体，产率16.88％。

对本实施例所得产物进行核磁共振氢谱和碳谱表征，确定为式(I)所示化合物。

下面结合实验进一步说明式(I)所示化合物在制备治疗抑制乳腺癌的药物中的应用。

以下各实验例中所有数据用mean±SEM表示，统计学比较采用单因素方差分析并用Tukey’s test进行组间比较。

试验药物：按本发明实施例1所述方法制得的式(I)所示化合物(下面以CAG002作为其简称)，溶于DMSO中制成浓度为100mM的储备液，储于4℃备用。

试剂：DMEM，小牛血清(FBS)，磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素(P/S)和0.25％(W/V)胰蛋白酶/1mM EDTA(Trypsin-EDTA)购于Invitrogen(USA)，MCF-10A的培养液购买于上海中科院细胞库。PCR逆转录试剂盒购于Sigma(St Louis，MO)。MTT检测试剂盒由Roche(Mennheim，Germany)提供。TAK1、C-jun和IκBα的抗体，磷酸化的TAK1、C-jun和IκBα抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗均从Cell Signaling Technology(Beverly，MA)购得。

D)细胞培养：人性乳腺癌(MCF-7,MDA-MB-231，T-47D(T47D)，ATCC，Manassas)采用DMEM培养，其中含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％FBS，于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

实验例1：MTT法检测乳腺癌细胞增殖

取长至90％融合的MCF-7,MDA-MB-231，T-47D，MCF-10A，清洗、消化后制成细胞悬液。计数后，按5x10³/孔接种于96孔板，培养24h待细胞完全贴壁。实验组设不同浓度的CAG002(0.1μM～32μM)加药组别，每组6个复孔，按200μl/孔加入含药的培养液。同时设置对照，空白对照组为0.1％DMSO的培养液。

MTT结果显示，CAG002能够剂量依赖的抑制乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231，T-47D)的增殖，且在药物浓度最大的时候，抑制效果最明显。其中药物浓度为32μM时，抑制效果最为明显，与空白对照相比抑制率达34％(p<0.05)。但是对MCF-10A几乎没有抑制效果。不同浓度的CAG002对乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231，T-47D)增殖的影响如图1所示。

实验例2：平板克隆检测细胞单克隆增殖

将MCF-7，MDA-MB-231和T47D细胞以低密度(500个细胞/孔，三个复孔)接种到6孔板中，然后施加不同浓度的CAG002(0、4、8、16μM)并培养了5-10天。然后，将细胞用PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛固定15分钟，并用革兰氏染色液染色20分钟。结果如图2所示。

平板克隆实验结果显示，CAG002抑制了乳腺癌(MCF-7,MDA-MB-231，T-47D)细胞的单细胞克隆能力，且随着浓度的增加，抑制效果明显。

实验例3：划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力

通过划痕实验测定法评估细胞迁移能力。在6孔板中培养相等数量的细胞MCF-7，MDA-MB-231，T47D，直到达到90％融合为止。通过用无菌的10μL移液管尖端刮擦细胞片而产生伤口。通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤孔来除去漂浮的细胞。加入不同浓度的CAG002(用低血清的DMEM溶解)，每天用倒置显微镜(Leica，德国)观察划痕区域的变化。测量伤口宽度以计算细胞迁移能力。结果如图3所示。

通过划痕实验的结果得出，CAG002对乳腺癌细胞的迁移能力有抑制的作用，且随着药物浓度的增高，抑制的效果越明显。

实验例4：Transwell实验检测乳腺癌细胞的侵袭能力

使用具有8μm聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜(Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德的Millipore)的24孔Millicell悬浮细胞培养***物评估细胞侵袭。将每组的5×10⁴个细胞悬浮在200μl无血清培养基中，并接种到上室中。然后，加不同浓度的CAG002，同时将500μl含10％FBS的完全培养基添加至下室。在37℃下孵育48小时后，将非侵入性细胞小心地从过滤器的上表面去除。将下腔室中的侵袭细胞(位于过滤器表面下方)固定在100％甲醇中，用0.1mg/mL结晶紫溶液(Beyotime Biotechnology，上海，中国)染色，并在显微镜下计数。对每个孔计数五个随机视野，并确定平均值。结果如图4所示。

从Transwell实验的结果可以看出，CAG002可以抑制乳腺癌细胞的侵袭能力，且呈药物剂量依赖性增加。

实验例5：实时定量PCR检测Hotair基因表达

使用TRIzol试剂(Gibco-BRL)分离了总miRNA，并使用10ng RNA和可逆辅助第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，生命科学，美国)制备cDNA。使用对比CT测定相对miRNA表达(2^-△△ct)方法。接下来，使用SYBR Green qPCR Master Mix(Fermentas，生命科学，美国)和HOTAIR和GAPDH的特异性引物通过qPCR测量Hotair的定量。GAPDH作为内参基因来计算Hotair的相对表达水平。

CAG002影响乳腺癌细胞中的Hotair基因表达量的柱状图分别如图5所示。结果显示，CAG002能下调MCF-7，MDA-MB-231，T47D中的Hotair基因水平，且高浓度抑制效果更明显。

实验例6：免疫印记杂交(Western Blot)检测TAK1、C-jun和IκBα磷酸化水平

使用免疫沉淀测定裂解液(RIPA；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)从乳腺癌细胞中获得总蛋白，并通过BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Waltham，MA，美国)测定蛋白质浓度。每个泳道上样的蛋白质量为30μg。细胞裂解物在分析型10％SDSPAGE凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。通过在室温下与5％脱脂牛奶温育2小时来阻止非特异性结合。P-TAK1(1：1000-10000)，TAK1(1：1000-10000)，PC-JUN(1：1000)，C-JUN(1：1000)，P-IκBα(1：1000)，IκBα(1：1000)在4℃下过夜。然后，将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔作为二抗，并使用电化学发光(ECL)试剂(Pierce，Waltham，MA，USA)观察免疫印迹然后使用Image J软件(NIH，贝塞斯达，医学博士，美国)进行光密度测定。结果如图6-7所示。

由图6(a)至6(c)中可知，在乳腺癌细胞中，CAG002可以抑制TAK1、C-jun和IκBα蛋白磷酸化的表达水平，且随着浓度的增加，蛋白磷酸化的表达逐渐减少，在浓度达到16μM时，表达量最低。从图7(a)至7(c)TAK1的磷酸化表达情况可知，TAK1在三种乳腺癌细胞中转染成功，可以进行下一步的实验，由图7(d)至7(f)中可知，上调了TAK1后，不仅TAK1的磷酸化表达增加了，C-jun和IκBα蛋白磷酸化的表达也随之增加，*p＜0.05vs empty，而TAK1+16μM(C)与TAK1(B)相比明显降低，#p＜0.05vs TAK1。而empty+16μM的C-jun和IKBα的蛋白磷酸化水平要明显的低于empty组*p＜0.05vs empty，并且也明显的低于TAK1+16μM组^p＜0.05vs TAK1+16μM。这也确定了C-jun和IκBα是TAK1下游的靶点通路，并且CAG002可以通过该通路调节TAK1、C-jun和IκBα蛋白磷酸化的表达水平，进而调控乳腺癌细胞的生长。

图8为三种乳腺癌细胞中分别Hotair上调成功后，检测Hotair基因的表达情况。从图8(a)至8(c)中可以看出，上调后的Hotair的表达明显的增高了。HOTAIR加入了CAG002后，Hotair的表达明显的下降了，从图8(d)至8(f)中可知，分别选取emoty组(A)、TAK1(B)、TAK1+16μM(C)和empty+16μM(D)进行实验，CAG002可以在乳腺癌细胞中抑制Hotair的基因的表达。

图9是上调了Hotair后，提出蛋白，进行免疫蛋白实验，分别选取emoty组(A)、TAK1(B)、TAK1+16μM(C)和empty+16μM(D)进行实验的结果。通过实验发现，Hotair的上调后，TAK1、C-jun和IκBα蛋白磷酸化的表达水平也随之上调，而加入了CAG002后，不仅Hotair的表达降低了，TAK1、C-jun和IκBα蛋白磷酸化的表达水平也随之下降。这说明CAG002可以通过Hotair调节TAK1、C-jun/IκBα的蛋白磷酸化水平进而影响乳腺细胞的生长情况，这说明Hotair是TAK1以及C-jun和IKBα的上游靶点。

上调Hotair后，按实验例3和4所述方法检测乳腺癌细胞的迁移和侵袭的能力，结果分别如图10和图11所示。实验结果发现，上调了Hotair后，乳腺癌的侵袭和迁移能力明显的提高了，这说明Hotair的上调影响着细胞的侵袭和迁移的能力，同时加入CAG002后，迁移和侵袭能力明显的受到了抑制。

实验例7：荷瘤裸鼠实验

人乳腺癌细胞株MCF-7，MDA-MB-231细胞经培养传代扩增，经胰酶消化离心沉淀后制成约细胞悬液。取BALB/c裸鼠，用装有细胞悬液的注射器刺入裸鼠腋部皮下，将细胞悬液注入裸鼠皮下，每只大约0.1ml(1×10⁷个细胞)，缓慢退针，制成人乳腺癌荷瘤裸鼠模型。术后用游标卡尺测量肿块，种瘤后10d进行分组。成瘤裸鼠每组6只，分为用药组(30mg/kg，60mg/kg)和阴性对照组。腹腔注射给药，每日1次，共20次，无药物组同样途径给予等体积量PBS，游标卡尺测量肿块长宽。20天后处死动物，分离肿瘤周边皮肤及非肿瘤组织，电子天平称重。

CAG002抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长如图12所示。与模型组相比，30mg/kg，60mg/kgCAG002能抑制荷瘤裸鼠的肿瘤体积，这与体外结果是一致的。

实验例8：免疫组化检测p-TAK1，p-C-jun，p-IκBα的体内表达

分别将肿瘤固定在4％多聚甲醛中过夜，用一系列乙醇将其脱水，小心地包埋在石蜡中，并切成5μm厚的切片。在二甲苯中脱石蜡并用一系列乙醇水合后，将组织切片与3％H2O2孵育10分钟，然后进行3次PBS洗涤。通过在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.8)中进行微波处理从样品中回收抗原。然后，将切片与一抗分别孵育：抗p-TAK1抗体(1：200)、p-C-jun(1：150)、p-IκBα抗体(1：150)在4℃的恒温下过夜。用PBS洗涤3次后，使用PV-9000聚合物检测试剂盒用相应的二抗探测切片，并使用3,3-二氨基联苯胺(DAB)观察免疫反应性。用苏木精复染后，在光学显微镜下观察切片。结果如图13所示。

实验结果发现，CAG002降低了p-TAK1，p-C-jun，p-IκBα在体内的表达，同样是随着剂量依赖性降低，这与体内实验的结果相一致。

结论：

CAG002能产生Hotair抑制剂效应。Hotair是已被证实了在多种癌症(例如乳腺癌，胃癌，膀胱癌和肺癌)中起着致癌分子的作用。同样值得注意的是，HOTAIR在乳腺癌中的表达异常的增加，这一发现为肿瘤转移和患者死亡提供了有力的生物标志物。上述实验结果显示，CAG002均能通过下调Hotair的表达水平，与本课题组之前研究的结果相比，比毛蕊异黄酮更能抑制乳腺癌细胞增殖，因此，CAG002比毛蕊异黄酮更有希望成为抗肿瘤药物。

MTT实验表明CAG002能抑制MCF-7，MDA-MB-231，T47D增殖，且随着药物加量的增加，效果越明显；而与我们前期的实验结果相比较，CAG002抑制的效果要明显好于毛蕊异黄酮。划痕和transwell实验的结果说明了CAG002可以影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭的能力，但是具体是通过那条通路的调控呢，还不清楚。

CAG002能下调MCF-7，MDA-MB-231，T47D细胞lncRNAs(Hotair)的水平。实时定量PCR及免疫印记杂交的结果显示CAG002能下调MCF-7，MDA-MB-231，T47D细胞的Hotair基因水平及p-TAK1，p-C-jun，p-IκBα的磷酸化表达水平。同时，我们在三种乳腺癌细胞中分别上调了TAK1，发现C-jun，IκBα的磷酸化也相应的升高了，再加入CAG002后，p-TAK1，p-C-jun，p-IκBα表达水平明显下降，这说明TAK1的下游靶点是C-jun，IκBα。接着，我们有上调了三种细胞中的Hotair的表达，上调后再加入CAG002，Hotair的表达显著下降，然后又对TAK1,C-jun，IκBα的磷酸化进行检测，发现发生了相应的变化，这说明CAG002是通过调节Hotair的表达，进而调控TAK1,C-jun/IκBα下游而对乳腺癌细胞的生长产生影响的。

上调了Hotair后，继续进行细胞的功能实验的研究，结果发现，上调Hotair后，与对照组相比，细胞的侵袭和迁移能力都明显提高了，但加入了CAG002后，侵袭和迁移的能力明显受到了抑制作用。

动物实验结果显示，CAG002对荷瘤裸鼠具有很强的抑制增殖作用，用药组肿瘤体积曲线明显慢于对照组，免疫组化结果说明体内外结果是一致的。

总结：CAG002可以通过调控Hotair影响下游TAK1，C-jun/IκBα通路的蛋白磷酸化的表达，从而影响乳腺癌细胞的增殖，侵袭和迁移的能力。

Claims (9)

1.下式(I)所示化合物在制备治疗ER阳性乳腺癌和治疗ER阴性乳腺癌的药物中的应用；

(I)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式(I)所示化合物的合成方法主要包括以下步骤：取化合物1和化合物2溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，然后于加热条件下进行反应，得到目标物粗品；其中，

所述化合物1和化合物2的结构分别如下：

化合物1、

化合物2。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在反应之前加入碘化物，所述的碘化物为碘化钠和/或碘化钾。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的有机溶剂为丙酮和/或N，N-二甲基甲酰胺。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：反应在≥40℃的条件下进行。

6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：反应在45℃至有机溶剂的沸点温度范围内进行。

7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：还包括对目标物粗品进行纯化的步骤。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括药学上可接受的载体或辅料。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为药学上可接受的剂型。

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