WO2005024014A1 - Agent pour mesurer un analyte chez un patient au moyen d'un enzyme - Google Patents

Agent pour mesurer un analyte chez un patient au moyen d'un enzyme Download PDF

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WO2005024014A1
WO2005024014A1 PCT/CN2003/000749 CN0300749W WO2005024014A1 WO 2005024014 A1 WO2005024014 A1 WO 2005024014A1 CN 0300749 W CN0300749 W CN 0300749W WO 2005024014 A1 WO2005024014 A1 WO 2005024014A1
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glucose
analyte
patient
nadh
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PCT/CN2003/000749
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Inventor
Xiong Chen
Wang-Ge Liang
Original Assignee
Fenghui (Shanghai) Medical Science & Tech. Co., Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for enzymatic determination of a patient's analyte concentration, and particularly to a reagent for a quantitative measurement method of reduced coenzyme oxidation in a reaction sample which is directly related to the concentration of the analyte present in the sample.
  • the analytes measured by the detection technology of reduced coenzyme I ( ⁇ -NADH) oxidation to coenzyme I include: aspartate aminotransferase (AST); alanine aminotransferase (ALT), urea (UREA), lactate dehydrogenase (LDH-P), ⁇ -hydroxybutyrate dehydrogenase (a_HBDH), ammonia (NH 3 ), and carbon dioxide (CO 2 ).
  • AST Aspartate aminotransferase
  • AST in serum catalyzes the amino conversion of a-ketoglutarate and L-aspartic acid to form L-glutamic acid and oxaloacetate.
  • NADH reduced coenzyme I
  • MDH malate dehydrogenase
  • oxaloacetate is reduced to malate, and ⁇ -NADH is oxidized to coenzyme I ( ⁇ -NAD +), which causes a decrease in absorbance.
  • the rate of this decrease in absorbance is directly proportional to the AST activity, so AST activity can be measured by spectrophotometrically monitoring the rate of decrease in ⁇ -NADH absorbance at 340 nm.
  • lactate dehydrogenase in serum can convert endogenous pyruvate to lactic acid, and simultaneously oxidize 0-NADH to interfere with the test.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Endogenous pyruvate + ⁇ -NADH 4 ⁇ L-lactic acid + ⁇ -NAD + alanine aminotransferase (ALT) has a relatively high concentration in the liver, while it is contained in the kidney, heart, skeletal muscle, and lung less. Elevated ALT is usually caused by certain liver-related diseases, including cirrhosis, liver cancer, viral or toxic hepatitis, and obstructive jaundice.
  • ALT activity When measuring ALT activity, ALT in serum catalyzes the amino conversion of a-ketoglutarate and L-alanine to form L-glutamic acid and pyruvate. In the presence of ⁇ -NADH and lactate dehydrogenase (LDH), acetone The acid is reduced to L-lactic acid, while NADH is oxidized to ⁇ -NAD +, which causes the absorbance to decrease. The rate of decrease in absorbance is directly proportional to ALT activity, so spectrophotometry is used. ALT activity can be determined by spectrophotometrically monitoring the rate of decrease in ⁇ -NADH absorbance at 340 nm.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Endogenous pyruvate + ⁇ -NADH 4 ⁇ L-lactic acid + ⁇ - ⁇ + urea (UREA) is the main product of protein metabolism in the human body. It constitutes most of the non-protein nitrogen in the blood. Urea is produced in the liver And excreted into the urine through the kidney, various kidney diseases and urinary tract infarction can cause blood urea to rise, so blood urea is the main indicator of renal function.
  • urea is decomposed into ammonia and carbon dioxide under the catalysis of urease.
  • Ammonia and ⁇ -ketoglutarate form glutamic acid in the presence of ⁇ -NADH and glutamic acid dehydrogenase (GLDH), and ⁇ -NADH It is oxidized to e-NAD +, which causes a decrease in absorbance.
  • the decrease rate of absorbance at 340nra is proportional to the urea content in the sample. Therefore, the content of urea can be measured by monitoring the decline rate of ⁇ -NADH absorbance at 340nm by spectrophotometry. .
  • Tool enzymes should be selected from enzymes with few heterozymes, good thermal stability, and pH stability in the test pH range.
  • the amount of tool enzyme should be appropriate, not only to ensure that it has a relatively stable period in liquid reagents, but also to ensure that the test results are accurate.
  • the difficulty in ensuring reagent stability is mainly the stability of reduced coenzyme 1 ( ⁇ -NADH).
  • Reduced coenzyme 1 ( ⁇ -NADH) is a common indicator for the detection of three reagents, AST, ALT, and UREA. 0A ⁇
  • the NADH in the reagents should be maintained at a certain concentration, that is, the absorbance at 340nm cannot be less than 1.0A.
  • ⁇ -NADH is Unstable, will spontaneously oxidize to NAD + , and will be catalyzed by various enzymes in solution to be oxidized to ⁇ -NAD +.
  • the patent stipulates that the coenzyme reduction system "the enzyme has incomplete specificity to the substrate" and "the enzyme / substrate pair is glucose-6-phosphate dehydrogenase / D-glucose", although J. DeGeorgie Austria has achieved new results on the basis of its predecessors.
  • the amount of glucose-6-phosphate dehydrogenase and D-glucose used is very large, the amount of enzyme is 3500U / L, and the amount of D-glucose is 18.016g / L. Not only does this significantly increase the cost of reagents, but it is also possible to introduce new hybrid enzymes. Summary of the invention
  • An object of the present invention is to address the above-mentioned shortcomings of the prior art, and propose a reagent for measuring the concentration of an analyte in a patient by an enzymatic method, wherein the oxidation rate of reduced coenzyme is measured. It does not significantly increase the cost of reagents, can prevent the introduction of miscellaneous enzymes, and has good long-term stability.
  • a reagent for enzymatically determining the concentration of a patient's analyte is provided. During the measurement, the oxidation rate of the reduced coenzyme in the reagent is determined.
  • the reagent is stored in the reagent through a coenzyme reduction system of a specific enzyme / substrate pair. The dynamic stabilization effect of continuous regeneration of reduced coenzyme during the period realizes the long-term stability of the reagent.
  • the enzyme and the substrate are aligned, and the enzyme has complete specificity to the substrate.
  • the reagent is a liquid single reagent; the enzyme / substrate pair in the coenzyme reduction system is preferably glucose dehydrogenase / D-grape Sugar.
  • the invention also provides a reagent for enzymatically determining the concentration of aspartate aminotransferase in a patient, and during the measurement, the oxidation rate of the reduced coenzyme in the reagent is measured, and the reagent passes a coenzyme reduction system of a specific enzyme / substrate pair
  • the dynamic stabilization effect of continuous regeneration of reduced coenzyme during the storage of the reagent achieves long-term stability of the reagent, the enzyme has complete specificity to the substrate and the reagent is a liquid single reagent.
  • the enzyme / substrate pair is preferably glucose dehydrogenase / D-glucose.
  • the amount of the glucose dehydrogenase and D-glucose is 2-100 U / L and 0.1-20 mmol / L, respectively, preferably 5-50 U / L and 1-10 leg ol / L.
  • the invention also provides a reagent for measuring the alanine aminotransferase concentration of a patient by an enzymatic method.
  • the oxidation rate of the reduced coenzyme in the reagent is measured, and the reagent is passed through a coenzyme reduction system of a specific enzyme / substrate pair.
  • the dynamic stabilization effect of continuous regeneration of reduced coenzyme during the storage of the reagent achieves long-term stability of the reagent, the enzyme has complete specificity to the substrate and the reagent is a liquid single reagent.
  • the enzyme / substrate pair is preferably glucose dehydrogenase / D-glucose.
  • the amount of the glucose dehydrogenase and D-glucose is selected from 2 to 100 U / L and 0.1 to 20 mmol / L, preferably from 2 to 50 U / L and 1 to 10 mmol / L.
  • the invention also provides a reagent for measuring the blood urea concentration of a patient by an enzymatic method, and the oxidation rate of reduced coenzyme in the reagent is measured during the measurement.
  • the reagent is passed through a coenzyme reduction system of a specific enzyme / substrate pair during the storage of the reagent.
  • the dynamic stabilization effect of continuous regeneration of reduced coenzyme achieves long-term stability of the reagent, the enzyme has complete specificity to the substrate and the reagent is a liquid single reagent.
  • the enzyme / substrate pair is preferably glucose dehydrogenase / D-glucose.
  • the amount of the glucose dehydrogenase and D-glucose is 2-100 U / L and 0.1-20 mmol / L, respectively, preferably 5- 50 U / L and 1-10 leg ol / L.
  • Glucose dehydrogenase has a pH stable range of 6-8. 5, in the reagent test pH 7. 5-8. 2 range Is stable.
  • the optimal pH of glucose dehydrogenase is 8.0, and it is also in the reagent test pH 7. 5-8. 2 range.
  • the enzyme catalyzes the reaction at the highest rate. In the optimal pH ⁇ -NADH reduction system, it can reduce the amount of dehydrogenase and substrate, prevent the introduction of new hybrid enzymes and affect the stability of the reagent, and hardly increase the cost of the reagent.
  • the rate of ⁇ -NADH reduction and regeneration reaction can be controlled by the amount of glucose dehydrogenase and D-glucose added. Generally, the rate of regeneration reaction is similar to the rate of natural oxidation of ⁇ -NADH. In this way, the glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction and regeneration system can continuously regenerate ⁇ -NADH during the reagent storage period, and it will not affect the test results during the reagent test.
  • the amount of glucose dehydrogenase used in the NADH reduction and regeneration system is selected from 2-100U / L, and the D-glucose concentration is selected from 0.1-20mmol / L.
  • An excessively high amount of glucose dehydrogenase and D-glucose may reduce 0-NADH
  • the regeneration speed is too fast. Negative interference during agent detection.
  • the reagents of the present invention used to determine the AST content of a patient include: malate dehydrogenase ( MDH), lactate dehydrogenase (LDH), reduced coenzyme I ( ⁇ -NADH), L-aspartic acid and ⁇ -ketoglutarate.
  • the reagents of the present invention for determining the ALT content of patients also need: lactate dehydrogenase (LDH), reduced coenzyme I ( ⁇ - NADH), L-alanine and ⁇ -ketoglutarate.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • ⁇ - NADH reduced coenzyme I
  • L-alanine L-alanine and ⁇ -ketoglutarate.
  • the reagent of the present invention for determining the UREA content of a patient also needs: urease, glutamic acid dehydrogenase (GLDH), reduced coenzyme I ( ⁇ -NADH) and ⁇ -ketoglutarate.
  • the reagent of the present invention may also include buffers, preservatives, stabilizers, chelating agents, etc. Other components which do not affect the characteristics of the present invention.
  • Glycerol, sugar, and ethylene glycol are polyhydroxy compounds that can form many hydrogen bonds with protein molecules and help to form a "solvent layer".
  • the solvent layer surrounding this enzyme molecule is different from the overall water phase and they can increase surface tension And solution viscosity.
  • This type of additive stabilizes the enzyme by effectively dehydrating the protein and reducing the proteolytic effect, so the enzyme can be stabilized with a relatively low molecular weight polyol.
  • EDTA disodium salt forms a complex with heavy metal ions to prevent the inhibition of enzyme activity by heavy metal ions.
  • Microbial contamination reduces enzyme stability, and the addition of preservatives can inhibit microbial growth.
  • the preferred preservative in the present invention is sodium azide.
  • the liquid single agent AST prepared by using the glucose deoxygenase / D-glucose stabilized ⁇ -NADH stabilization technology basically includes:
  • Coenzyme reduction system (glucose dehydrogenase / D-glucose), L-aspartic acid, ⁇ -ketoglutarate, malate dehydrogenase (MDH), lactate dehydrogenase (LDH), reduced coenzyme I (e -NADH).
  • Tri s-HC1 buffer potassium hydroxide, disodium salt of EDTA, glycerol, sodium azide.
  • Tris_HCl buffer The concentration of Tris_HCl buffer is 20-100mmol / L; the concentration of ⁇ -ketoglutarate is 6-18 ol / L, and the concentration of a-ketoglutarate is 340nm. The concentration should not be too high; L-aspartic acid The acid concentration is selected from 100-300mmol / L ; potassium hydroxide is added to help dissolve L-aspartic acid, and the amount is equal to that of L-aspartic acid; EDTA disodium salt and metal ions Form a coordination complex to prevent heavy metal ions from inhibiting enzyme activity.
  • the concentration is selected from 1 to 10 mmol / L; the concentration of ⁇ -NADH is selected from 0.1 to 0.3 mmol / L, which is lower than 0. lmraol / L when AST test The linear range becomes smaller and affects the test results. Above 0.3mm O l / L will make the reagent blank absorbance too high; the amount of malate dehydrogenase should be 100-2500U / L; the addition of lactate dehydrogenase can eliminate the internal content of the sample.
  • the amount of lactate dehydrogenase is 1000-4000U / L; the addition of glucose dehydrogenase / D-glucose makes the unstable product of ⁇ -NADH e _NAD + regenerate to ⁇ -NADH to ensure The e-NADH in the reagent is relatively stable.
  • the amount of glucose dehydrogenase is 2-100U / L; the concentration of D-glucose is 0.1-20 mraol / 1; glycerol has a stabilizing effect on the enzyme, and the amount is 1%-20%.
  • a preferred AST reagent formulated according to the present invention is formulated as follows:
  • the liquid single reagent ALT prepared by the stabilization technique of glucose dehydrogenase / D-glucose stabilized ⁇ -NADH basically includes:
  • Coenzyme reduction system (glucose dehydrogenase / D-glucose), L-alanine, ⁇ -ketoglutarate, lactate dehydrogenase (LDH), reduced coenzyme I ( ⁇ -NADH).
  • Tris-HC1 buffer disodium EDTA, glycerol, sodium azide.
  • concentration of Tris-HCl buffer selected 20-lOOmmol / L; ⁇ - ketoglutarate concentration selected 8- 18mmol / L; preferably with L- alanine concentrations Videos 200-800 ol / L; EDTA disodium salt selected 1 -10 legs ol / L; ⁇ -NADH dosage is 0.1 to 0.
  • lactate dehydrogenase dosage should not only ensure the rapid elimination of endogenous pyruvate interference, but also ensure the linear range of the catalytic reaction 1-1000U / L; 2-100U / L for glucose dehydrogenase; 0.1-20mmol / L for D-glucose concentration, 1% _20% for glycerol and 0.1% for sodium azide lOOg / L.
  • a preferred ALT reagent formulated according to the present invention is as follows:
  • the single UREA liquid reagent prepared by the glucose dehydrogenase / D-glucose stabilized 0-NADH stabilization technology basically includes:
  • Coenzyme reduction system (glucose dehydrogenase / D-glucose), ⁇ -ketoglutarate, urease, glutamic acid dehydrogenase (GLDH), reduced coenzyme I ( ⁇ -NADH).
  • Tris-HCl buffer Tris-HCl buffer, ADP potassium salt, glycerol, sodium azide.
  • the concentration of Tris-HC1 buffer solution is selected from 20-150mmol / L; the concentration of ⁇ -ketoglutarate is selected from 1-15mmol / L; ⁇ -NADH is selected from 0.1-1.38mmol / L; the amount of ADP potassium salt is selected from 0.1 -10mmol / L ; urease should be able to quickly catalyze the decomposition of urea, and the dosage should be 2000-10000U / L; glutamic acid dehydrogenase can control the reaction speed. The more you add, the faster the reaction speed, preferably 200-2000U / L, glucose dehydration.
  • the amount of hydrogenase is selected from 2-100U / L; the amount of D-glucose is selected from 0.1 to 20mmol / L; the amount of glycerol is selected from 1% to 30%; the amount of sodium azide is selected from 0. 1-1. 0g / L.
  • a preferred UREA reagent formulated according to the present invention is formulated as follows:
  • lactate dehydrogenase should be selected to have a higher affinity for pyruvate, and it does not contain or contains only trace amounts of ALT, GLDH and other miscellaneous enzymes.
  • Malate dehydrogenase and glutamic acid dehydrogenase are selected from enzymes with good stability in aqueous solution. Under the premise of ensuring the linear test range, delay time, accuracy and stability, the amount of the above enzymes should be reduced as much as possible in order to reduce the interference of miscellaneous enzymes.
  • the analytes that can be measured with the reagent of the present invention include: lactate dehydrogenase (LDH-P), ⁇ -hydroxybutyrate dehydrogenase (a-HBDH), ammonia (NH 3 ), carbon dioxide (C0 2 ), etc.
  • the unstable product of reduced coenzyme II ( ⁇ -NADPH) coenzyme II can be reduced to ⁇ -NADPH by glucose dehydrogenase / D-glucose.
  • the beneficial effects of the present invention are: Because the enzyme-reducing system for stabilizing reagents to resist oxidation uses a highly specialized For a single enzyme / substrate pair, the amount of enzyme and substrate is greatly reduced, which not only hardly increases the reagent cost, but also does not introduce new hybrid enzymes due to the addition of a large amount of stable enzymes, thereby improving the stability of the reagent.
  • the stability of the AST reagent (D-glucose: 5mmol / L, glucose dehydrogenase: 20U / L) formulated according to the present invention was determined as follows: Stabilized AST liquid single reagent:
  • the corresponding non-stabilized AST liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other components and their concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ⁇ sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance reflects the content of ⁇ -NADH, the initial absorbance should be greater than 1.
  • Test Results 1) AST liquid single reagent blank absorbance after storage at 37 ° C
  • the stabilized AST liquid single reagent can be stored for 7 days at 37 ° C, and the unstabilized AST liquid single reagent can be stored for only three days.
  • ⁇ -NADH has good stability in the stabilized single reagent.
  • C-stabilized AST liquid single-agent ⁇ -NADH can be stable for more than 12 months, while non-stabilized AST liquid single-agent ⁇ -NADH can only be stable for 11 weeks (less than three months).
  • the stabilized AST liquid single reagent was stored at 37 ° C for 7 days.
  • the reagent accuracy test results were all within the target value range indicated by the quality control serum.
  • Target value for 12 months 30 (20—40) Measured value: 32 Target value: 101 (81— 121) Measured value: 106 Stabilized AST liquid single reagent Stored at 2-8 ° C for 12 months, reagent accuracy test The results were all within the target range indicated by the quality control serum.
  • the above data shows that the AST liquid single reagent 2—8 ⁇ is stored for 12 months or at 37 ° C for 7 days.
  • the reagent test results are normal. It is feasible to use highly specific glucose dehydrogenase and D-glucose as coenzyme reduction systems to stabilize ⁇ -NADH.
  • the stability of the AST reagent (D-glucose: lmmd / L, glucose dehydrogenase: 5U / L) formulated according to the present invention was determined as follows:
  • the corresponding non-stabilized AST liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other components and their concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ⁇ sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ⁇
  • Cuvette light path 10mm Volume ratio of sample to reagent: 1: 15 Delay time: 60 seconds Test time: 60 seconds Blank reagent absorbance: Reflects the content of ⁇ -NADH, the initial absorbance should be greater than 1. OA Accuracy: The measurement result should be within the quality control serum labelling range
  • the stability of the AST reagent (D-glucose: 10mmol / L, glucose dehydrogenase: 50U / L) formulated according to the present invention was determined as follows:
  • Corresponding unstabilized AST liquid single reagent does not contain glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other components and their concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2—8 ⁇ sealed storage, 37 ° C sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance reflects the content of ⁇ -NADH, the initial absorbance should be greater than 1.0 A
  • test results of the AST liquid single reagent are normal after storage at 2-8 ° C for 12 months or at 37 ° C for 7 days. It is possible to use highly specific glucose dehydrogenase and D-glucose as coenzyme reduction systems to stabilize ⁇ -NADH.
  • ALT D-glucose: 5mmol / L, glucose dehydrogenase: 10U / L
  • reagent formulated according to the present invention was determined as follows:
  • Corresponding unstabilized ALT liquid single reagent does not contain glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ° C sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance reflects the content of ⁇ -NADH, the effective initial absorbance should be greater than 1.
  • the test result should be within the range indicated by the quality control serum.
  • the single reagent of stabilized ALT liquid can be stored for 5 days at 37 ° C, and the single reagent of unstabilized ALT liquid can be stored for only one day.
  • NADH has good stability in the stabilized single reagent.
  • ⁇ -NADH can be stable for more than 12 months in 2-8 ⁇ stabilized ALT liquid single reagent, while ⁇ -NADH in non-stabilized single reagent can only be stable for four months.
  • the stabilized ALT liquid single reagent was stored at 37 ° C for 5 days, and the test results of reagent accuracy were all within the target range indicated by the quality control serum.
  • the stabilized ALT liquid single reagent is stored at 2-8 ° C for 12 months.
  • the reagent accuracy test results are all within the target value range indicated by the quality control serum.
  • ALT reagent D-glucose: 1 mmol / L, glucose dehydrogenase: 2U / L
  • stability of the ALT reagent was determined as follows:
  • ⁇ -NADH disodium salt 709.4 0.25 0.177g lactate dehydrogenase 3000U glucose dehydrogenase 2U hydrochloric acid 36.5 adjust pH 7.8
  • the corresponding unstabilized ALT liquid single reagent does not contain glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, no Contains glycerin.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ⁇ sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ⁇
  • Reagent blank absorbance Reflects the content of ⁇ -NADH, the effective initial absorbance should be greater than 1.
  • the test result should be within the range indicated by the quality control serum.
  • ALT reagent D-glucose: 10 mmol / L, glucose dehydrogenase: 50 U / L
  • stability of the ALT reagent was determined as follows:
  • the corresponding unstabilized ALT liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ° C sealed storage.
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance Reflects 0-NADH content, effective initial absorbance should be greater than 1.
  • the stability of the UREA reagent (D-glucose: 5mmol / L, glucose dehydrogenase: 30U / L) formulated according to the present invention was determined as follows:
  • Glucose dehydrogenase 30U / L hydrochloric acid 36.5 adjust pH 8.1
  • the corresponding non-stabilized UREA liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ° C sealed storage
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance Reflects the content of ⁇ -NADH, the effective initial absorbance should be greater than 1.
  • the stabilized Urea liquid single reagent can be stored for 7 days at 37 ° C, and the unstabilized BUN liquid single reagent can be stored for only 4 days.
  • ⁇ -NADH has better stability in the stabilized single reagent.
  • ⁇ -NADH can be stable for more than 18 months in the stabilized Urea single reagent at 2-8 ° C, while ⁇ -NADH can only be stable for 8 months in the non-stabilized Urea single reagent.
  • Stabilized Urea liquid single reagent is stored at 2_8 ° C for 12 months. All reagent accuracy test results are marked on the serum. Within target range.
  • the stability of the UREA reagent (D-glucose: 1 mmol / L, glucose dehydrogenase: 5U / L) formulated according to the present invention was determined as follows:
  • the corresponding unstabilized UREA liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ° C sealed storage
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance reflects the content of ⁇ -NADH, the effective initial absorbance should be greater than 1.
  • UREA reagent D-glucose: lOramol / L, glucose dehydrogenase: 50U / L
  • stability of UREA reagent was determined as follows:
  • the corresponding non-stabilized UREA liquid single reagent does not contain a glucose dehydrogenase / D-glucose coenzyme reduction system, and does not contain glycerol.
  • the other component concentrations are the same as in the table above.
  • Reagent storage conditions 2-8 ° C sealed storage, 37 ° C sealed storage
  • Test wavelength 340nm
  • Test temperature 37 ° C
  • Reagent blank absorbance Reflects 6-NADH content, effective initial absorbance should be greater than 1.
  • the present invention uses a highly specific enzyme / substrate pair for stabilizing reagents for the anti-oxidation coenzyme reduction system, the amount of enzymes and substrates is greatly reduced, which not only hardly increases the cost of reagents, but also does not cause stability due to large amounts
  • the addition of enzymes introduces new hybrid enzymes, thereby improving the stability of the reagent.

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Description

酶法测定病人分析物浓度用的试剂
技术领域
本发明涉及酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 特别是涉及同存在于样本中的分析物浓 度直接相关的反应样本中还原型辅酶氧化的定量测定方法中用的试剂。
背景技术
在临床上， 应用还原型辅酶 I ( β -NADH)氧化成辅酶 I ( e -NAD+) 的检测技术测定的分 析物包括： 天冬氨酸氨基转移酶（AST ) ; 丙氨酸氨基转移酶（ALT)、 尿素（UREA)、 乳酸脱氢 酶 （LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶（a _HBDH)、 氨 （NH3 )和二氧化碳（C02 )等。
天冬氨酸氨基转移酶（AST )广泛分布于人体， 在心、 肝、 骨骼肌、 肾和红细胞内有较高 的浓度。 这些组织的损伤， 如心肌梗塞、 病毒性肝炎， 肝坏死， 肝硬化和营养不良等症均会 引起血清或血浆中 AST水平的升高。
测定 AST活性时， 血清中 AST催化 a -酮戊二酸和 L-天冬氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸 和草酰乙酸。 在还原型辅酶 I NADH)和苹果酸脱氢酶（MDH )存在下， 草酰乙酸被还原 为苹果酸， 而 β - NADH被氧化为辅酶 I ( β - NAD+) , 从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降 的速率与 AST活性成正比， 所以用分光光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测 定 AST活性。 AST
L -天冬氨酸 + a -酮戊二酸 4 ► 草酰乙酸 + L-谷氨酸
MDH
草酰乙酸 + β -NADH 4 ^ 苹果酸 + β - NAD+
血清中存在的乳酸脱氢酶可使内源性丙酮酸转化为乳酸， 同时氧化 0 -NADH而干扰测试， 加入高浓度乳酸脱氢酶（LDH)， 可在延迟期内快速消除內源性丙酮酸的干扰。
LDH
内源性丙酮酸 + β -NADH 4 ► L-乳酸 + β -NAD+ 丙氨酸氨基转移酶（ALT )在肝脏中有较髙的浓度， 而在肾、 心、 骨骼肌、肺脏中则含有 较少。 通常 ALT的升高是由某些与肝脏有关的疾病引起， 包括肝硬化、 肝癌， 病毒性或中毒 性肝炎和阻塞性黄疸等。
测定 ALT活性时， 血清中 ALT催化 a -酮戊二酸和 L -丙氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸和 丙酮酸， 在 β - NADH和乳酸脱氢酶（LDH)存在下， 丙酮酸被还原为 L-乳酸， 而 NADH被氧 化为 β - NAD+, 从而引起吸光度下降。 这种吸光度的下降速率与 ALT活性成正比， 所以用分光' 光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测定 ALT活性。
ALT
L -丙氨酸 + α -酮戊二酸 4 ► 丙酮酸 + L-谷氨酸
LDH
丙酮酸 + β -NADH ► L-乳酸 + β - NAD+ 血清中内源性丙酮酸的干扰，可通过加入过量的乳酸脱氢酶（LDH)在延迟期内快速消除。
LDH
内源性丙酮酸 + β - NADH 4 ► L-乳酸 + β -ΝΑϋ+ 尿素 （UREA) 是人体内蛋白质代谢的主要产物， 它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮， 尿素在肝脏内产生并通过肾脏***至尿中，各种肾病及泌尿道的梗塞均可引起血液尿素升高， 因此血液尿素是肾功能的主要指标。
在测定尿素时， 尿素在脲酶的催化下分解为氨和二氧化碳， 氨和 α -酮戊二酸在 β - NADH 和谷氨酸脱氢酶（GLDH)存在下形成谷氨酸， 同时 β - NADH被氧化成 e -NAD+， 从而引起吸光 度的下降， 在 340nra处吸光度的下降速率与样品中尿素的含量成正比， 所以用分光光度法监 测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测得尿素的含量。
脲酶
尿素 + ¾0 4 ► 2NH3 + C02
GLDH
ΝΗ3+ α -酮戊二酸 + β -NADH ► 谷氨酸 + β -NAD+ 样品中内源性氨干扰在延迟期内即可消除。
GLDH
内源性 Ν¾+ α -酮戊二酸 + β -NADH 4 ► 谷氨酸 + β -NAD+ 要将 AST、 ALT, UREA检测试剂配制成长期稳定的液体单试剂， 关键是解决工具酶和还原 型辅酶 I ( β - NADH) 的稳定性问题。 因为酶是一种结构精细的蛋白质， 稳定性极差， 温度、 pH、 离子强度、 杂质、金属离子、微生物等均会影响其活性。要提高酶在水溶液中的稳定性， 可采角优化环境条件， 加入稳定剂和防腐剂等。 工具酶应选用含杂酶少、 热稳定性好、 pH稳 定范围在测试 pH范围内的酶。工具酶的用量要合适， 既要保证其在液体试剂中有相当长的稳 定期， 又要保证测试结果准确。
保证试剂稳定性的难点主要在于还原型辅酶 1( β -NADH)的稳定，还原型辅酶 1( β -NADH) 是 AST、 ALT, UREA三种试剂检测的共同指示物。为保证试剂达到应有的线性，试剂中 NADH 应保持一定的浓度， 即在 340nm处吸光度不能低于 1. 0A。但 β -NADH在 pH〈8. 6的水溶液中是 不稳定的， 会自发氧化为 NAD+， 还会受到溶液中各种杂酶的催化， 被氧化成 β - NAD+。
为了增加 β - NADH的稳定， 早在上世纪 70年代就有人做了大量研究工作， 除了运用一般 物理方法如将试剂制成冻干品或干粉， 或用无水有机溶剂等增加 NADH稳定性外， 1977年 Modrovich在他的专利（US Patent 4, 394, 449)中提出了用葡萄糖一 6—磷酸脱氢酶（G- 6-PDH) /葡萄糖 '一6—磯酸 （G- 6-P)把 β -NADH的不稳定产物 β -NAD+重新逆向反应生成 β - NADH, 起 到动态稳定 β -NADH的目的。 β - NAD++葡萄糖 -6-磷酸 菊唐 _6-麵脑 H++ P -NADH+6-磷酸葡萄糖内脂 但是由于当时的酶工程还没有发展到今天的水平， 根本性的技术问题没有解决， 他们只 能做成双试剂，合并成液体单试剂的稳定性只有一个月至三个月。 90年 F. Hoffmann La Roche AG (AU- A- 61906/90)运用 Modrivich Ivan E 的原理又做了不少工作， 将不稳定产物 β - NAD+ 重新变成 β -NADHo但是，他的方法也只能配成双试剂，一旦配成单试剂，稳定性就很差。 Klose 等人在专利 US Pantent 4, 019， 916中提出的类似方法的缺点是测试时间长， 而且只适用于含 有可被磷酸化底物的试剂***。 最有代表性的、 与本题关系密切的是澳大利亚 J.德乔吉奥等 于 1996. 2. 26在中国申请的专利（CN 1179792A), 它运用非专一性酶 /底物对， 成功地将动态 稳定技术运用到了 AST、 ALT的单试剂和 UREA的双试剂中， 可以将 AST和 ALT液体单试剂的 稳定性延长到 6-8月。 但是在专利中规定了辅酶还原*** "酶对底物具有不完全的专一性"， "酶 /底物对是葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶 /D-葡萄糖"， 虽然 J. 德乔吉奥在前人的基础上， 又取 得了新的成果。但是使用的葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶和 D-葡萄糖量都很大， 酶量为 3500U/L, D- 葡萄糖量为 18. 016g/L。 这样不仅明显增加了试剂的成本， 而且还有可能引入新的杂酶。 发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足， 提出一种酶法测定病人分析物浓度用的试 剂， 其中对还原型辅酶的氧化速率进行测定。 它并不明显增加试剂的成本， 能够防止杂酶引 入， 具有较好的长期稳定性。
为此， 提供了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 测定时对试剂中还原型辅酶的氧 化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还 原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定， 所述酶和底物对中， 酶对底物具有完全的专 一性。
所述试剂为液体单试剂； 所述辅酶还原***中酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄 糖。
本发明还提供了酶法测定病人的天冬氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还 原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期 间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定， 该酶对该底物具有完全的专一 性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖 脱氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L， 优选用 5-50U/L和 1-10腿 ol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的丙氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还原 型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间 连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定， 该酶对该底物具有完全的专一性 并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱 氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L， 优选用 2- 50U/L和 1- 10mmol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的血液尿素浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的 氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生 还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定， 该酶对该底物具有完全的专一性并且所述 试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和 D- 葡萄糖用量分别选用 2-100U/L和 0. l-20mmol/L, 优选用 5- 50U/L和 1- 10腿 ol/L。
在用脱氢酶 /底物再生还原 β -NADH***中，我们选用葡萄糖脱氢酶和它的 100%专一性底 物 D-葡萄糖。 D-葡萄糖被氧化为 D-葡萄糖酸内脂， β - NAD+被还原为 P -NADH。
D -葡萄糖 + β -NAD+ 籠鍾 ^ D-葡萄糖酸内脂 + β -NADH + H+ 葡萄糖脱氢酶的 pH稳定范围为 6-8. 5， 在试剂测试 PH 7. 5-8. 2范围是稳定的。 葡萄糖 脱氢酶的最适 pH为 8. 0， 也在试剂测试 pH7. 5-8. 2范围。 酶催化反应速率最高， 在最适 pH 的 β - NADH还原***中， 可减少脱氢酶和底物用量， 防止引入新的杂酶而影响试剂稳定性， 而且几乎不增加试剂成本。
β -NADH还原再生反应速率， 可以用葡萄糖脱氢酶及 D-葡萄糖加入量控制， 一般控制再 生反应速率与 β - NADH自然氧化速度相当。 这样， 葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖的辅酶还原再生系 统在试剂贮存时期可连续再生 β -NADH, 而在试剂测试时将不会影响测试结果。
用于 NADH还原再生***的葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L, D-葡萄糖浓度选用 0. l-20mmol/L, 过高的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖用量会使 0 -NADH还原再生速度过快， 在试 剂检测时产生负干扰。
如本说明书的开头中所述， 对于用来测定病人 AST含量的、 本发明的试剂除葡萄糖脱氢 酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原***外， 还需要的其他物质有： 苹果酸脱氢酶（MDH)、乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一天冬氨酸和 α -酮戊二酸。
对于用来测定病人 ALT含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原系 统外， 还需要的其他物质有： 乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一丙氨酸和 α - 酮戊二酸。
对于用来测定病人 UREA含量的、 本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原 ***外， 还需要的其他物质有： 脲酶、 谷氨酸脱氢酶 （GLDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH) 和 α -酮戊二酸。
本发明的试剂除了包括测定分析物浓度所需的辅酶还原***和其它基本底物和酶之外， 还可以包括缓冲剂、 防腐剂、 稳定剂、 螯合剂等和具有增强稳定性的功效而实质上不影响本 发明的特性的其他成分。
甘油、 糖和乙二醇是多羟基化合物， 能与蛋白质分子形成很多氢键， 并有助于形成 "溶 剂层"， 这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同， 它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添 加剂通过对蛋白质的有效脱水， 降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用， 因此可以用相对低 分子量多元醇稳定酶。 我们选用甘油或乙二醇作为酶的稳定剂， 过高浓度的甘油使溶液粘度 增高， 不利于测试。
EDTA二钠盐与重金属离子形成配位复合物， 防止重金属离子对酶活性的抑制。
微生物污染会降低酶的稳定性， 加入防腐剂可抑制微生物生长。 本发明中优选的防腐剂 为叠氮钠。
本发明中， 应用葡萄糖脱氧酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 AST基本上包括：
辅酶还原***（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一天冬氨酸、 α -酮戊二酸、苹果酸脱氢酶 (MDH)、 乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( e-NADH)。
此外还优选包括： Tri s- HC1缓冲液、 氢氧化钾、 EDTA二钠盐、 甘油、 叠氮钠。
其中 Tris_HCl缓冲液的浓度选用 20-100mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 6-18醒 ol/L， a -酮戊二酸在 340nm有吸收， 浓度不宜太高； L-天冬氨酸浓度选用 100-300mmol/L; 氢氧化钾 的加入是为了帮助 L-天冬氨酸溶解， 用量与 L-天冬氨酸为等摩尔； EDTA二钠盐与金属离子 形成配位复合物， 防止重金属离子抑制酶的活性， 浓度选用为 1-lOmmol/L; β -NADH的浓度 选用 0. 1- 0. 3mmol/L， 低于 0. lmraol/L 时 AST测试时线性范围变小， 影响测试结果， 高于 0. 3mmOl/L会使试剂空白吸光度过高；苹果酸脱氢酶用量选用 100-2500U/L; 乳酸脱氢酶的加 入可消除样品中内源性丙酮酸的干扰，乳酸脱氢酶用量选用 1000- 4000U/L;葡萄糖脱氢酶 /D- 葡萄糖的加入是使 β -NADH的不稳定产物 e _NAD+重新再生为 β - NADH, 以保证试剂中 e -NADH 的相对稳定， 葡萄糖脱氢酶用量选用 2- 100U/L; D-葡萄糖浓度选用 0. 1-20 mraol/1 ; 甘油对 酶有稳定作用， 用量选用 1%- 20%， 高浓度甘油会增加溶液粘度； 为防止微生物污染， 试剂中 加入叠氮钠作为防腐剂， 用量选用 0. 1-1. 0g/L。
依本发明配制的一种优选的 AST试剂配制如下：
表 1
Figure imgf000007_0001
本发明中， 应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 ALT基本上包括：
辅酶还原***（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一丙氨酸、 α -酮戊二酸、乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)。
此外还优选包括： Tris- HC1缓冲液、 EDTA二钠盐、 甘油、 叠氮钠。 其中 Tris-HCl缓冲液浓度选用 20-lOOmmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 8- 18mmol/L; L- 丙氨酸浓度优选用 200-800画 ol/L ; EDTA 二钠盐选用 1- 10腿 ol/L ; β - NADH 用量选用 0. 1-0. 30mfflol/L; 乳酸脱氢酶的用量既要能保证快速消除内源性丙酮酸的干扰， 还要保证催 化反应的线性范围， 选用 1000- 4000U/L; 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖浓度选 用 0. l-20mmol/L, 甘油用量选用 1%_20%， 叠氮钠用量选用 0. 1-lOOg/L.
依本发明配制的一种优选的 ALT试剂如下：
表 2
Figure imgf000008_0001
本发明中， 应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 0 -NADH的稳定化技术配制的 UREA液体单 试剂基本上包括：
辅酶还原***（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖）、 α -酮戊二酸、脲酶、谷氨酸脱氢酶（GLDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)。
此外还优选包括： Tris-HCl缓冲液、 ADP钾盐、 甘油、 叠氮钠。
其中 Tris- HC1缓冲液浓度选用 20- 150mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 1- 15mmol/L; β - NADH选用 0. 1-0. 38mmol/L; ADP钾盐用量选用 0. 1- 10mmol/L;脲酶要能快速催化分解尿素， 用量选用 2000- 10000U/L; 谷氨酸脱氢酶可控制反应速度， 加入越多， 反应速度越快， 优选 200-2000U/L, 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖用量选用 0. l_20mmol/L; 甘油用 量选用 1%- 30%; 叠氮钠用量选用 0. 1-1. 0g/L。 依本发明配制的一种优选的 UREA试剂配制如下:
Figure imgf000009_0001
在以上液体单试剂中， 乳酸脱氢酶应选用对丙酮酸有较高亲和力， 不含或仅含微量 ALT、 GLDH等杂酶。苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶选用在水溶液中的稳定性较好的酶。 在保证线性 测试范围， 延迟时间、 准确性和稳定性前提下， 应尽量减少以上酶的用量， 以便减少杂酶的 干扰。
可用本发明的试剂测定的分析物除天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT：)、 尿素（UREA)外还包括： 乳酸脱氢酶（LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶（a - HBDH)、 氨 （NH3) 和 二氧化碳 (C02)等。
此外， 用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖也可使还原型辅酶 II ( β -NADPH)的不稳定产物辅酶 II ( β - NADP+)重新还原为 β - NADPH。
D-葡萄糖 + β -NADP' D-葡萄糖酸内脂 + P -NADPH + 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 由于用于稳定试剂以抗氧化的寧酶还原***使 用了高度专一性的酶 /底物对， 酶和底物的用量大为降低， 不仅几乎不增加试剂成本， 而且不 会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶， 从而提高了试剂的稳定性。
最佳实施方式 本发明的各方面详细实施情况将在优选实施例的下述描述中变得更清楚。
实施例 1
如下测定依本发明配制的 AST试剂 (D-葡萄糖： 5mmol/L,葡萄糖脱氢酶： 20U/L)的稳定性: 稳定化 AST液体单试剂：
表 4
Figure imgf000010_0001
相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15
延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒
试剂空白吸光度： 反映 β -NADH的含量， 初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性： 550U/L
测试结果： 1 ) AST液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 5
Figure imgf000011_0001
可见， 稳定化 AST液体单试剂在 37°C可以存放 7天， 非稳定化 AST液体单试剂只 能存放三天。 稳定化单试剂中 β - NADH稳定性好。
2 ) AST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 6
Figure imgf000011_0002
2-8 C稳定化 AST液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上， 而非稳定化 AST液 体单试剂中 β -NADH只能稳定 11周 （不到三个月）。
3)稳定化 AST液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 7 2— 8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 0 116 233 349 466 582 实测值 U/L 4. 8 111 227 349 452 585
2— 8°C存放 6个月线性
理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5. 1 115 220 338 436 559
2— 8°C存放 9个月线性
理论值 U/L 0 105 210 315 420 524
实测值 4. 9 106 215 315 406 517
2— 8°C存放 13个月线性
理论值 U/L 0 122 244 366 488 610 实测值 5. 5 124 247 366 473 582 稳定化 AST液体单试剂在 2- 8°C贮存 13个月， 试剂线性测试结果仍然符合要求。 4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 8
Figure imgf000012_0001
稳定化 AST液体单试剂在 37°C存放 7天， 试剂准确度测试结果全部在质控血清标 示的靶值范围内。
5)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 9
2-8Ό存放时间 血清 I (U/L) 血清 III (U/L)
3个月 靶值: 28 (23- 33)实测值：32 靶值： 104 (84-124) 实测值： 117
6个月 靶值: 28 (23- 33) 实测值：32 靶值： 104 (84-124) 实测值：101 9个月 靶值: 28 (23- 33)实测值：30 靶值： 104 (84-124) 实测值：110
12个月 靶值: 30 (20— 40) 实测值 : 32 靶值： 101 (81— 121) 实测值：106 稳定化 AST液体单试剂在 2-8°C存放 12个月， 试剂准确度测试结果全部在质控血 清标示的靶值范围内。
上列数据显示， 该 AST液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 7天， 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 2
如下测定依本发明配制的 AST试剂（D-葡萄糖： lmmd/L， 葡萄糖脱氢酶： 5U/L)的稳定 性：
稳定化 AST液体单试剂配方：
表 10
Figure imgf000013_0001
相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。 测试波长： 340nm 测试温度： 37Ό
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15 延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒 试剂空白吸光度： 反映 β- NADH的含量， 初始吸光度应大于 1. OA 准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性： 550U/L
测试结果-
1) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度
表 11
Figure imgf000014_0001
3)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定 表 13
Figure imgf000015_0001
4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 14
Figure imgf000015_0002
5)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 15
Figure imgf000015_0003
上列数据显示，该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 9个月后或 37°C存放 5天，试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 0 - NADH的辅酶还原*** 是可行的。
实施例 3
如下测定依本发明配制的 AST试剂 （D-葡萄糖： 10mmol/L， 葡萄糖脱氢酶： 50U/L) 的 稳定性：
稳定化 AST液体单试剂配方： 原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 90 10.9g
α -酮戊二酸， Na盐 （2H20) 226.1 13 2.9g
L-天冬氨酸 133.1 220 29.3g
氢氧化钾 56.1 220 12.3g
D-葡萄糖 180.2 10 1.8g
甘油 92.1 7%
EDTA.2Na 372.2 4 1.5g
叠氮钠 65.1 0.4g
β -NADH二钠盐 709.4 0.28 0.199g 乳酸脱氢酶 1800U
苹果酸脱氢酶 1000U
葡萄糖脱氢酶 50U 盐酸 36.5 调 pH 8.0 相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8Ό密封存放， 37°C密封存放。
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15
延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒
试剂空白吸光度： 反映 β -NADH的含量， 初始吸光度应大于 1. 0A
准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性： 550U/L
测试结果：
1 ) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度
表 17
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.880 1.886 1 1.759
2 1.640
3 1.518 1.075
4 1.396
5 1.285
6 1.177
7 1.080
.ST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
8
2-8 °C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0周 1.878 1.883
3周 1.530
5周 1.395
7周 1.283
11周 1.092
3个月 1.720
6个月 1.541
9个月 1.375
12个月 1.192
) 稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
19
2— 8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 0 121.7 244.1 366.0 488.0 600 实测值 U/L 4.5 124 247 366 473 582
2— 8°C存放 6个月线性
理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5.0 115 220 338 436 559
2— 8°C存放 9个月线性
理论值 U/L 0 121 222 315 419 548 实测值 U/L 4.6 115 220 315 420 535
2— 8°C存放 12个月线性
理论值 U/L 0 114 228 343 457 571
实测值 U/L 5.2 114 231 346 449 548
4)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 20
Figure imgf000018_0001
5)稳定化 AST液体单试剂 37Ό存放后准确度测定
表 21
Figure imgf000018_0002
上列数据显示， 该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 7天， 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 4
如下测定依本发明配制的 ALT (D-葡萄糖： 5mmol/L， 葡萄糖脱氢酶： 10U/L)试剂的稳定 性：
稳定化 ALT液体单试剂：
表 22
原料 分子量 浓度 (ramol/L) 每升量
Tris 121. 1 100 12. lg α -酮戊二酸， Na盐 (2¾0) 226.1 15 3.39g
L -丙氨酸 89.1 500 44.6g
D -葡萄糖 180.2 5 0.9g
EDTA.2钠盐 372.2 5 1.86g
甘油 92.1 5%
叠氮钠 65.1 0.5g
β -NADH二钠盐 709.4 0.27 0.19g 乳酸脱氢酶 4000U
葡萄糖脱氢酶 10U 盐 rm.酴 pp 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放。
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15
延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒
试剂空白吸光度： 反映 β- NADH的含量， 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性： 550 U/L
测试结果：
1) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 23
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.857 1.752
1 1.687 1.375
2 1.066
3
4 1.188
5 1.057 可见，稳定化 ALT液体单试剂在 37°C可以存放 5天，非稳定化 ALT液体单试剂只能存放 天。 稳定化单试剂中 NADH稳定性较好。
2) ALT液体单试剂 2- 8°C存放后空白吸光度
表 24
Figure imgf000020_0001
在 2-8Ό稳定化 ALT液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上， 而非稳定化单试剂中 β -NADH只能稳定四个月。
3 ) 稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 25
Figure imgf000020_0002
稳定化 ALT液体单试剂在 2-8Ό贮存 12个月， 试剂线性测试结果仍然符合要求。 表 26
Figure imgf000021_0001
稳定化 ALT液体单试剂在 37°C存放 5天， 试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的 靶值范围内。
5)稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定
表 27
Figure imgf000021_0002
稳定化 ALT液体单试剂在 2- 8°C存放 12个月， 试剂准确度测试结果全部在质控血清标 示的靶值范围内。
上列数据显示， 该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 5天， 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是成功的。
实施例 5
如下测定依本发明配制的 ALT试剂 （D-葡萄糖： lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 2U/L) 的稳定 性：
稳定化 ALT液体单试剂配方：
表 28
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 80 9.69g
α -酮戊二酸， Na盐（2H20) 226.1 12 2.71g L-丙氨酸 89.1 400 35.6g
D-葡萄糖 180.2 1 0.18g
EDTA.2钠盐 372.2 3 1.12g 甘油 92.1 10%
叠氮钠 65.1 0.3g
β -NADH二钠盐 709.4 0.25 0.177g 乳酸脱氢酶 3000U 葡萄糖脱氢酶 2U 盐酸 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘 油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。
测试波长： 340nm 测试温度： 37Ό
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15
延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒
试剂空白吸光度： 反映 β -NADH的含量， 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性： 550 U/L
测试结果：
1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 29
Figure imgf000022_0001
2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 30 2-8 °C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0周 1.715 1.713
3个月 1.488 1.195
4个月 1.002
6个月 1.250
9个月 1.031
3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 31
Figure imgf000023_0001
4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 32
Figure imgf000023_0002
5)稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 33
37Ό存放时间 血清 I (U/L) 血清 II (U/L) 血清 ΙΠ (U/L) 靶值 24(19-29) 靶值 47(37-57) 靶值 92(77-107)
0天 22 51 90
Figure imgf000024_0001
上列数据显示，该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 9个月后或 37°C存放 4天，试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原*** 是成功的。
实施例 6
如下测定依本发明配制的 ALT试剂 （D-葡萄糖： lOmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 50U/L) 的稳 定性：
稳定化 ALT液体单试剂配方：
表 34
Figure imgf000024_0002
相应非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放。
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15
延迟时间： 60秒 测试时间： 60秒
试剂空白吸光度： 反映 0 - NADH的含量， 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在质控血清标示值范围内。 线性： ^ 550 U/L
测试结果：
1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 35
Figure imgf000025_0001
2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 36
Figure imgf000025_0002
3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 37
2- -8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 5.1 142 284 425 567 实测值 U/L 5.1 142 294 412 555
2— -8Ό存放 6个月线性
理论值 U/L 4.5 125 246 369 492 615 实测值 U/L 4.5 121 244 372 487 604
2- -8Ό存放 9个月线性 理论值 U/L 5.5 80 160 321 481 641 实测值 U/L 5.5 85 170 321 473 625
2—8°C存放 12个月线性
理论值 U/L 98 195 293 390 488 580 实测值 U/L 100 199 287 398 479 561
4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 38
Figure imgf000026_0001
5 )稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 39
Figure imgf000026_0002
上列数据显示， 该 ALT液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 5天， 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原系 统是成功的。
实施例 7
如下测定依本发明配制的 UREA试剂 （D-葡萄糖： 5mmol/L， 葡萄糖脱氢酶： 30U/L) 的稳 定性：
稳定化 UREA液体单试剂：
表 40
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121. 1 100 12. lg α -酮戊二酸， Na盐（2 0) 226.1 7 1.6g
叠氮钠 65.0 0.3g
D -葡萄糖 180.2 5 0.9g 甘油 92.1 10%
ADP. K盐 501.3 2 l.Og β -NADH, 钠盐 709.4 0.28 0.2g 谷氨酸脱氢酶 600U/L 脲酶 6000U/L
葡萄糖脱氢酶 30U/L 盐酸 36.5 调 pH 8.1
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2—8°C密封存放， 37°C密封存放
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 100
延迟时间： 30秒 测试时间： 60- 150秒
试剂空白吸光度： 反映 β -NADH的含量，有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在标示值范围内
线性： 50ramol/L
测试结果：
1) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 41
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.821 1.835
1 1.655 1.621
2 1.547 1.424
3 1.421 1.267
4 1.302 1.113
5 1.200 0.956 6 1.126
7 1.051
可见， 稳定化 Urea液体单试剂在 37°C可以存放 7天， 非稳定化 BUN液体单试剂只能存 放 4天。 稳定化单试剂中 β- NADH稳定性较好。
2) Urea液体单试剂 2 - 8°C存放后空白吸光度
表 42
Figure imgf000028_0001
在 2-8°C稳定化 Urea液体单试剂中 β -NADH可以稳定 18个月以上，而非稳定化 Urea液 体单试剂中 β -NADH只能稳定 8个月。
3)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 43
2— 8Ό存放 4个月线性
理论值（mmol IV) 1.59 10.58 21.16 31.74 42.32 52.90 实测值（mmol/L) 1.92 11.18 22.21 31.74 43.69 52.89
2— 8°C存放 6个月线性
理论值（mmol /1) 1.68 14.00 28.00 42.00 56.00 实测值（mmol/L) 1.82 14.32 28.09 41.95 54.26
2— 8Ό存放 9个月线性
理论值（腿 ol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（mmol/L) 1.80 14.14 27.55 40.16 52.08
2— 8°C存放 12个月线性 理论值（聽1 /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（fflfflol/L) 1.74 14.07 27.86 39.67 51.70
2— 8Ό存放 15个月线性
理论值 (mmol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15
2— 8 °C存放 18个月线性
理论值（mmol /1) 1.68 14.00 28.00
实测值（mmol/L) 1.80 14.59 28.44 40.61 53.38 稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C贮存 18个月， 试剂线性测试结果仍然符合要求。. 4)稳定化 Urea液体单试剂 37Ό存放后准确度测定
表 44
o O L
Figure imgf000029_0001
o
o 稳定化 Urea液体单试剂在 37 存放 7天， 试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的 靶值范围内。
5)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定
表 45
Figure imgf000029_0002
稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C存放 12个月， 试剂准确度测试结果全部在血清标示的 靶值范围内。
上列数据显示， Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37Ό存放 7天， 试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原*** 是可行的。
实施例 8
如下测定依本发明配制的 UREA试剂（D-葡萄糖： lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 5U/L)的稳定 性：
稳定化 UREA液体单试剂配方：
表 46
Figure imgf000030_0001
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 100
延迟时间： 30秒 测试时间： 60- 150秒
试剂空白吸光度： 反映 β -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在标示值范围内 线性： 50mmol/L
1 ) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 47
Figure imgf000031_0001
3 )稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后线性测定
表 49
2— 8 °C存放 3个月线性
理论值（mmol/L) 1.70 12.80 25.60 38.40 51.20 实测值（mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15
2- 8Ό存放 6个月线性
理论值（mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值（mmol/L) 11.36 22.11 31.75 41.61 52.29
2- 8°C存放 9个月线性
理论值（mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值（mmol/L) 11.12 21.84 31.61 41.50 50.18
2— 8°C存放 12个月线性 理论值（mmol/L) 10.22 20.44 30.66 40.88 51.10 实测值（mmol/L) 10.80 20.50 29.77 39.14 48.75
4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 50
Figure imgf000032_0001
5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 51
Figure imgf000032_0002
上列数据显示，该 Urea液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37Ό存放 4天，试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 9
如下测定依本发明配制的 UREA试剂（D-葡萄糖： lOramol/L, 葡萄糖脱氢酶： 50U/L)的稳 定性：
稳定化 UREA液体单试剂配方：
表 52
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 120 14.5g
α -酮戊二酸， Na盐（2¾0) 226.1 8 2.26g
叠氮钠 65.0 0.5g
D-葡萄糖 180.2 10 1.8g 甘油 92.1 15%
ADP.K盐 501.3 4
β -NADH, 钠盐 709.4 0.3 0.21g
谷氨酸脱氢酶 1000U
脲酶 8000U
葡萄糖脱氢酶 50U
盐酸 36.5 调 pH 8.1
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***， 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放
测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C
比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 100
延迟时间： 30秒 测试时间： 60-150秒
试剂空白吸光度： 反映 6 -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度： 测定结果应在标示值范围内
线性： 50mmol/L
1 ) UREA液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 53
Figure imgf000033_0001
2) Urea液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 54 2-8°C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0个月 1.933 1.930
3个月 1.770 1.613
6个月 1.669 1.362
8个月 1.124
9个月 1.555
12个月 1.392
15个月 1.295
18个月 1.203
3 ) 稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 55
2— 8°C存放 3个月线性
理论值（mmol/L) 11.47 22.93 34.40 45.87 57.34 实测值（mmol/L) 11.96 23.02 34.40 43.62 55.43
2— 8°C存放 6个月线性
理论值（mmol/L) 10.03 20.06 30.09 40.12 50.15 实测值（mmol/L) 10.03 20.80 31.43 40.12 50.29
2— 8°C存放 9个月线性
理论值（mmol/L) 11.30 22.60 34.00 45.30 56.60 实测值（mmol/L) 11.90 23.20 34.00 43.70 54.20
2— 8Ό存放 12个月线性
理论值（mmol/L) 11.66 23.31 34.97 46.63 58.29 实测值（mmol/L) 12.07 24.44 34.97 46.22 56.96
2— 8°C存放 15个月线性
理论值（mmol/L) 11.00 21.90 32.90 43.80 54.80 实测值（mmol/L) 11.80 22.40 31.70 43.80 52.30
2— 8°C存放 18个月线性
理论值（mmol/L) 10.27 20.54 30.80 41.07 51.34 实测值（mmol/L) 11.09 21.73 31.95 41.07 50.81 4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 56
Figure imgf000035_0001
5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 57
Figure imgf000035_0002
上列数据显示， Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37°C存放 7天， 试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原*** 是可行的。
工业实用性
本发明由于用于稳定试剂以抗氧化的辅酶还原***使用了高度专一性的酶 /底物对，酶和 底物的用量大为降低， 不仅几乎不增加试剂成本， 而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的 杂酶， 从而提高了试剂的稳定性。

Claims

权利 要求
1、一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行 测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***，在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶 的动态稳定作用实现试剂的长期稳定， 其特征在于： 所述酶和底物对中， 酶对底物具有完全 的专一性。
2、根据权利要求 1所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述试剂为 液体单试剂。
3、根据权利要求 1或 2所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述酶
/底物对是葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖。
4、根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 其中所述的 分析物是天冬氨酸氨基转移酶。
5、根据权利要求 4所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述葡萄糖 脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20mraol/Lo
6、根据权利要求 5所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述葡萄糖 脱氢酶用量为 5-50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 l-10mmol/L。
7、根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述分析物 是丙氨酸氨基转移酶。
8、根据权利要求 7所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述葡萄糖 脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20mmol/Lc
9、根据权利要求 8所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述葡萄糖 脱氢酶用量为 2-50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 1- 10mraOl/L。
10、 根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述分析 物是血液尿素。
11、根据权利要求 10所述的酶法测定病人分析物浓度用的的试剂， 其特征在于： 所述葡 萄糖脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20ramol/Lo
12、根据权利要求 11所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂， 其特征在于： 所述葡萄 糖脱氢酶用量为 5- 50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 1- 10mmol/L。
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