酶法测定病人分析物浓度用的试剂
技术领域
本发明涉及酶法测定病人分析物浓度用的试剂, 特别是涉及同存在于样本中的分析物浓 度直接相关的反应样本中还原型辅酶氧化的定量测定方法中用的试剂。
背景技术
在临床上, 应用还原型辅酶 I ( β -NADH)氧化成辅酶 I ( e -NAD+) 的检测技术测定的分 析物包括: 天冬氨酸氨基转移酶(AST ) ; 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、 尿素(UREA)、 乳酸脱氢 酶 (LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶(a _HBDH)、 氨 (NH3 )和二氧化碳(C02 )等。
天冬氨酸氨基转移酶(AST )广泛分布于人体, 在心、 肝、 骨骼肌、 肾和红细胞内有较高 的浓度。 这些组织的损伤, 如心肌梗塞、 病毒性肝炎, 肝坏死, 肝硬化和营养不良等症均会 引起血清或血浆中 AST水平的升高。
测定 AST活性时, 血清中 AST催化 a -酮戊二酸和 L-天冬氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸 和草酰乙酸。 在还原型辅酶 I NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH )存在下, 草酰乙酸被还原 为苹果酸, 而 β - NADH被氧化为辅酶 I ( β - NAD+) , 从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降 的速率与 AST活性成正比, 所以用分光光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测 定 AST活性。 AST
L -天冬氨酸 + a -酮戊二酸 4 ► 草酰乙酸 + L-谷氨酸
MDH
草酰乙酸 + β -NADH 4 ^ 苹果酸 + β - NAD+
血清中存在的乳酸脱氢酶可使内源性丙酮酸转化为乳酸, 同时氧化 0 -NADH而干扰测试, 加入高浓度乳酸脱氢酶(LDH), 可在延迟期内快速消除內源性丙酮酸的干扰。
LDH
内源性丙酮酸 + β -NADH 4 ► L-乳酸 + β -NAD+ 丙氨酸氨基转移酶(ALT )在肝脏中有较髙的浓度, 而在肾、 心、 骨骼肌、肺脏中则含有 较少。 通常 ALT的升高是由某些与肝脏有关的疾病引起, 包括肝硬化、 肝癌, 病毒性或中毒 性肝炎和阻塞性黄疸等。
测定 ALT活性时, 血清中 ALT催化 a -酮戊二酸和 L -丙氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸和 丙酮酸, 在 β - NADH和乳酸脱氢酶(LDH)存在下, 丙酮酸被还原为 L-乳酸, 而 NADH被氧 化为 β - NAD+, 从而引起吸光度下降。 这种吸光度的下降速率与 ALT活性成正比, 所以用分光'
光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测定 ALT活性。
ALT
L -丙氨酸 + α -酮戊二酸 4 ► 丙酮酸 + L-谷氨酸
LDH
丙酮酸 + β -NADH ► L-乳酸 + β - NAD+ 血清中内源性丙酮酸的干扰,可通过加入过量的乳酸脱氢酶(LDH)在延迟期内快速消除。
LDH
内源性丙酮酸 + β - NADH 4 ► L-乳酸 + β -ΝΑϋ+ 尿素 (UREA) 是人体内蛋白质代谢的主要产物, 它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮, 尿素在肝脏内产生并通过肾脏***至尿中,各种肾病及泌尿道的梗塞均可引起血液尿素升高, 因此血液尿素是肾功能的主要指标。
在测定尿素时, 尿素在脲酶的催化下分解为氨和二氧化碳, 氨和 α -酮戊二酸在 β - NADH 和谷氨酸脱氢酶(GLDH)存在下形成谷氨酸, 同时 β - NADH被氧化成 e -NAD+, 从而引起吸光 度的下降, 在 340nra处吸光度的下降速率与样品中尿素的含量成正比, 所以用分光光度法监 测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测得尿素的含量。
脲酶
尿素 + ¾0 4 ► 2NH3 + C02
GLDH
ΝΗ3+ α -酮戊二酸 + β -NADH ► 谷氨酸 + β -NAD+ 样品中内源性氨干扰在延迟期内即可消除。
GLDH
内源性 Ν¾+ α -酮戊二酸 + β -NADH 4 ► 谷氨酸 + β -NAD+ 要将 AST、 ALT, UREA检测试剂配制成长期稳定的液体单试剂, 关键是解决工具酶和还原 型辅酶 I ( β - NADH) 的稳定性问题。 因为酶是一种结构精细的蛋白质, 稳定性极差, 温度、 pH、 离子强度、 杂质、金属离子、微生物等均会影响其活性。要提高酶在水溶液中的稳定性, 可采角优化环境条件, 加入稳定剂和防腐剂等。 工具酶应选用含杂酶少、 热稳定性好、 pH稳 定范围在测试 pH范围内的酶。工具酶的用量要合适, 既要保证其在液体试剂中有相当长的稳 定期, 又要保证测试结果准确。
保证试剂稳定性的难点主要在于还原型辅酶 1( β -NADH)的稳定,还原型辅酶 1( β -NADH) 是 AST、 ALT, UREA三种试剂检测的共同指示物。为保证试剂达到应有的线性,试剂中 NADH 应保持一定的浓度, 即在 340nm处吸光度不能低于 1. 0A。但 β -NADH在 pH〈8. 6的水溶液中是
不稳定的, 会自发氧化为 NAD+, 还会受到溶液中各种杂酶的催化, 被氧化成 β - NAD+。
为了增加 β - NADH的稳定, 早在上世纪 70年代就有人做了大量研究工作, 除了运用一般 物理方法如将试剂制成冻干品或干粉, 或用无水有机溶剂等增加 NADH稳定性外, 1977年 Modrovich在他的专利(US Patent 4, 394, 449)中提出了用葡萄糖一 6—磷酸脱氢酶(G- 6-PDH) /葡萄糖 '一6—磯酸 (G- 6-P)把 β -NADH的不稳定产物 β -NAD+重新逆向反应生成 β - NADH, 起 到动态稳定 β -NADH的目的。 β - NAD++葡萄糖 -6-磷酸 菊唐 _6-麵脑 H++ P -NADH+6-磷酸葡萄糖内脂 但是由于当时的酶工程还没有发展到今天的水平, 根本性的技术问题没有解决, 他们只 能做成双试剂,合并成液体单试剂的稳定性只有一个月至三个月。 90年 F. Hoffmann La Roche AG (AU- A- 61906/90)运用 Modrivich Ivan E 的原理又做了不少工作, 将不稳定产物 β - NAD+ 重新变成 β -NADHo但是,他的方法也只能配成双试剂,一旦配成单试剂,稳定性就很差。 Klose 等人在专利 US Pantent 4, 019, 916中提出的类似方法的缺点是测试时间长, 而且只适用于含 有可被磷酸化底物的试剂***。 最有代表性的、 与本题关系密切的是澳大利亚 J.德乔吉奥等 于 1996. 2. 26在中国申请的专利(CN 1179792A), 它运用非专一性酶 /底物对, 成功地将动态 稳定技术运用到了 AST、 ALT的单试剂和 UREA的双试剂中, 可以将 AST和 ALT液体单试剂的 稳定性延长到 6-8月。 但是在专利中规定了辅酶还原*** "酶对底物具有不完全的专一性", "酶 /底物对是葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶 /D-葡萄糖", 虽然 J. 德乔吉奥在前人的基础上, 又取 得了新的成果。但是使用的葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶和 D-葡萄糖量都很大, 酶量为 3500U/L, D- 葡萄糖量为 18. 016g/L。 这样不仅明显增加了试剂的成本, 而且还有可能引入新的杂酶。 发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足, 提出一种酶法测定病人分析物浓度用的试 剂, 其中对还原型辅酶的氧化速率进行测定。 它并不明显增加试剂的成本, 能够防止杂酶引 入, 具有较好的长期稳定性。
为此, 提供了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂, 测定时对试剂中还原型辅酶的氧 化速率进行测定,所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还 原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定, 所述酶和底物对中, 酶对底物具有完全的专 一性。
所述试剂为液体单试剂; 所述辅酶还原***中酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄
糖。
本发明还提供了酶法测定病人的天冬氨酸氨基转移酶浓度用的试剂,测定时对试剂中还 原型辅酶的氧化速率进行测定,所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期 间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定, 该酶对该底物具有完全的专一 性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖 脱氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L, 优选用 5-50U/L和 1-10腿 ol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的丙氨酸氨基转移酶浓度用的试剂,测定时对试剂中还原 型辅酶的氧化速率进行测定,所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间 连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定, 该酶对该底物具有完全的专一性 并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱 氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L, 优选用 2- 50U/L和 1- 10mmol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的血液尿素浓度用的试剂,测定时对试剂中还原型辅酶的 氧化速率进行测定,所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生 还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定, 该酶对该底物具有完全的专一性并且所述 试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和 D- 葡萄糖用量分别选用 2-100U/L和 0. l-20mmol/L, 优选用 5- 50U/L和 1- 10腿 ol/L。
在用脱氢酶 /底物再生还原 β -NADH***中,我们选用葡萄糖脱氢酶和它的 100%专一性底 物 D-葡萄糖。 D-葡萄糖被氧化为 D-葡萄糖酸内脂, β - NAD+被还原为 P -NADH。
D -葡萄糖 + β -NAD+ 籠鍾 ^ D-葡萄糖酸内脂 + β -NADH + H+ 葡萄糖脱氢酶的 pH稳定范围为 6-8. 5, 在试剂测试 PH 7. 5-8. 2范围是稳定的。 葡萄糖 脱氢酶的最适 pH为 8. 0, 也在试剂测试 pH7. 5-8. 2范围。 酶催化反应速率最高, 在最适 pH 的 β - NADH还原***中, 可减少脱氢酶和底物用量, 防止引入新的杂酶而影响试剂稳定性, 而且几乎不增加试剂成本。
β -NADH还原再生反应速率, 可以用葡萄糖脱氢酶及 D-葡萄糖加入量控制, 一般控制再 生反应速率与 β - NADH自然氧化速度相当。 这样, 葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖的辅酶还原再生系 统在试剂贮存时期可连续再生 β -NADH, 而在试剂测试时将不会影响测试结果。
用于 NADH还原再生***的葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L, D-葡萄糖浓度选用 0. l-20mmol/L, 过高的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖用量会使 0 -NADH还原再生速度过快, 在试
剂检测时产生负干扰。
如本说明书的开头中所述, 对于用来测定病人 AST含量的、 本发明的试剂除葡萄糖脱氢 酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原***外, 还需要的其他物质有: 苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一天冬氨酸和 α -酮戊二酸。
对于用来测定病人 ALT含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原系 统外, 还需要的其他物质有: 乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一丙氨酸和 α - 酮戊二酸。
对于用来测定病人 UREA含量的、 本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原 ***外, 还需要的其他物质有: 脲酶、 谷氨酸脱氢酶 (GLDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH) 和 α -酮戊二酸。
本发明的试剂除了包括测定分析物浓度所需的辅酶还原***和其它基本底物和酶之外, 还可以包括缓冲剂、 防腐剂、 稳定剂、 螯合剂等和具有增强稳定性的功效而实质上不影响本 发明的特性的其他成分。
甘油、 糖和乙二醇是多羟基化合物, 能与蛋白质分子形成很多氢键, 并有助于形成 "溶 剂层", 这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同, 它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添 加剂通过对蛋白质的有效脱水, 降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用, 因此可以用相对低 分子量多元醇稳定酶。 我们选用甘油或乙二醇作为酶的稳定剂, 过高浓度的甘油使溶液粘度 增高, 不利于测试。
EDTA二钠盐与重金属离子形成配位复合物, 防止重金属离子对酶活性的抑制。
微生物污染会降低酶的稳定性, 加入防腐剂可抑制微生物生长。 本发明中优选的防腐剂 为叠氮钠。
本发明中, 应用葡萄糖脱氧酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 AST基本上包括:
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一天冬氨酸、 α -酮戊二酸、苹果酸脱氢酶 (MDH)、 乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( e-NADH)。
此外还优选包括: Tri s- HC1缓冲液、 氢氧化钾、 EDTA二钠盐、 甘油、 叠氮钠。
其中 Tris_HCl缓冲液的浓度选用 20-100mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 6-18醒 ol/L, a -酮戊二酸在 340nm有吸收, 浓度不宜太高; L-天冬氨酸浓度选用 100-300mmol/L; 氢氧化钾 的加入是为了帮助 L-天冬氨酸溶解, 用量与 L-天冬氨酸为等摩尔; EDTA二钠盐与金属离子
形成配位复合物, 防止重金属离子抑制酶的活性, 浓度选用为 1-lOmmol/L; β -NADH的浓度 选用 0. 1- 0. 3mmol/L, 低于 0. lmraol/L 时 AST测试时线性范围变小, 影响测试结果, 高于 0. 3mmOl/L会使试剂空白吸光度过高;苹果酸脱氢酶用量选用 100-2500U/L; 乳酸脱氢酶的加 入可消除样品中内源性丙酮酸的干扰,乳酸脱氢酶用量选用 1000- 4000U/L;葡萄糖脱氢酶 /D- 葡萄糖的加入是使 β -NADH的不稳定产物 e _NAD+重新再生为 β - NADH, 以保证试剂中 e -NADH 的相对稳定, 葡萄糖脱氢酶用量选用 2- 100U/L; D-葡萄糖浓度选用 0. 1-20 mraol/1 ; 甘油对 酶有稳定作用, 用量选用 1%- 20%, 高浓度甘油会增加溶液粘度; 为防止微生物污染, 试剂中 加入叠氮钠作为防腐剂, 用量选用 0. 1-1. 0g/L。
依本发明配制的一种优选的 AST试剂配制如下:
表 1
本发明中, 应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 ALT基本上包括:
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一丙氨酸、 α -酮戊二酸、乳酸脱氢酶 (LDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)。
此外还优选包括: Tris- HC1缓冲液、 EDTA二钠盐、 甘油、 叠氮钠。
其中 Tris-HCl缓冲液浓度选用 20-lOOmmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 8- 18mmol/L; L- 丙氨酸浓度优选用 200-800画 ol/L ; EDTA 二钠盐选用 1- 10腿 ol/L ; β - NADH 用量选用 0. 1-0. 30mfflol/L; 乳酸脱氢酶的用量既要能保证快速消除内源性丙酮酸的干扰, 还要保证催 化反应的线性范围, 选用 1000- 4000U/L; 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖浓度选 用 0. l-20mmol/L, 甘油用量选用 1%_20%, 叠氮钠用量选用 0. 1-lOOg/L.
依本发明配制的一种优选的 ALT试剂如下:
表 2
本发明中, 应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 0 -NADH的稳定化技术配制的 UREA液体单 试剂基本上包括:
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 α -酮戊二酸、脲酶、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、 还原型辅酶 I ( β - NADH)。
此外还优选包括: Tris-HCl缓冲液、 ADP钾盐、 甘油、 叠氮钠。
其中 Tris- HC1缓冲液浓度选用 20- 150mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 1- 15mmol/L; β - NADH选用 0. 1-0. 38mmol/L; ADP钾盐用量选用 0. 1- 10mmol/L;脲酶要能快速催化分解尿素, 用量选用 2000- 10000U/L; 谷氨酸脱氢酶可控制反应速度, 加入越多, 反应速度越快, 优选 200-2000U/L, 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖用量选用 0. l_20mmol/L; 甘油用 量选用 1%- 30%; 叠氮钠用量选用 0. 1-1. 0g/L。
依本发明配制的一种优选的 UREA试剂配制如下:
在以上液体单试剂中, 乳酸脱氢酶应选用对丙酮酸有较高亲和力, 不含或仅含微量 ALT、 GLDH等杂酶。苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶选用在水溶液中的稳定性较好的酶。 在保证线性 测试范围, 延迟时间、 准确性和稳定性前提下, 应尽量减少以上酶的用量, 以便减少杂酶的 干扰。
可用本发明的试剂测定的分析物除天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT:)、 尿素(UREA)外还包括: 乳酸脱氢酶(LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶(a - HBDH)、 氨 (NH3) 和 二氧化碳 (C02)等。
此外, 用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖也可使还原型辅酶 II ( β -NADPH)的不稳定产物辅酶 II ( β - NADP+)重新还原为 β - NADPH。
D-葡萄糖 + β -NADP' D-葡萄糖酸内脂 + P -NADPH + 与现有技术相比, 本发明的有益效果是: 由于用于稳定试剂以抗氧化的寧酶还原***使 用了高度专一性的酶 /底物对, 酶和底物的用量大为降低, 不仅几乎不增加试剂成本, 而且不 会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶, 从而提高了试剂的稳定性。
最佳实施方式
本发明的各方面详细实施情况将在优选实施例的下述描述中变得更清楚。
实施例 1
如下测定依本发明配制的 AST试剂 (D-葡萄糖: 5mmol/L,葡萄糖脱氢酶: 20U/L)的稳定性: 稳定化 AST液体单试剂:
表 4
相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37Ό密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1: 15
延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒
试剂空白吸光度: 反映 β -NADH的含量, 初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性: 550U/L
测试结果:
1 ) AST液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 5
可见, 稳定化 AST液体单试剂在 37°C可以存放 7天, 非稳定化 AST液体单试剂只 能存放三天。 稳定化单试剂中 β - NADH稳定性好。
2 ) AST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 6
2-8 C稳定化 AST液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上, 而非稳定化 AST液 体单试剂中 β -NADH只能稳定 11周 (不到三个月)。
3)稳定化 AST液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 7
2— 8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 0 116 233 349 466 582 实测值 U/L 4. 8 111 227 349 452 585
2— 8°C存放 6个月线性
理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5. 1 115 220 338 436 559
2— 8°C存放 9个月线性
理论值 U/L 0 105 210 315 420 524
实测值 4. 9 106 215 315 406 517
2— 8°C存放 13个月线性
理论值 U/L 0 122 244 366 488 610 实测值 5. 5 124 247 366 473 582 稳定化 AST液体单试剂在 2- 8°C贮存 13个月, 试剂线性测试结果仍然符合要求。 4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 8
稳定化 AST液体单试剂在 37°C存放 7天, 试剂准确度测试结果全部在质控血清标 示的靶值范围内。
5)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 9
2-8Ό存放时间 血清 I (U/L) 血清 III (U/L)
3个月 靶值: 28 (23- 33)实测值:32 靶值: 104 (84-124) 实测值: 117
6个月 靶值: 28 (23- 33) 实测值:32 靶值: 104 (84-124) 实测值:101
9个月 靶值: 28 (23- 33)实测值:30 靶值: 104 (84-124) 实测值:110
12个月 靶值: 30 (20— 40) 实测值 : 32 靶值: 101 (81— 121) 实测值:106 稳定化 AST液体单试剂在 2-8°C存放 12个月, 试剂准确度测试结果全部在质控血 清标示的靶值范围内。
上列数据显示, 该 AST液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 7天, 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 2
如下测定依本发明配制的 AST试剂(D-葡萄糖: lmmd/L, 葡萄糖脱氢酶: 5U/L)的稳定 性:
稳定化 AST液体单试剂配方:
表 10
相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37Ό密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37Ό
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1: 15 延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒 试剂空白吸光度: 反映 β- NADH的含量, 初始吸光度应大于 1. OA 准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性: 550U/L
测试结果-
1) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度
表 11
3)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 13
4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 14
5)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 15
上列数据显示,该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 9个月后或 37°C存放 5天,试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 0 - NADH的辅酶还原*** 是可行的。
实施例 3
如下测定依本发明配制的 AST试剂 (D-葡萄糖: 10mmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 50U/L) 的 稳定性:
稳定化 AST液体单试剂配方:
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 90 10.9g
α -酮戊二酸, Na盐 (2H20) 226.1 13 2.9g
L-天冬氨酸 133.1 220 29.3g
氢氧化钾 56.1 220 12.3g
D-葡萄糖 180.2 10 1.8g
甘油 92.1 7%
EDTA.2Na 372.2 4 1.5g
叠氮钠 65.1 0.4g
β -NADH二钠盐 709.4 0.28 0.199g 乳酸脱氢酶 1800U
苹果酸脱氢酶 1000U
葡萄糖脱氢酶 50U 盐酸 36.5 调 pH 8.0 相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8Ό密封存放, 37°C密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1 : 15
延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒
试剂空白吸光度: 反映 β -NADH的含量, 初始吸光度应大于 1. 0A
准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性: 550U/L
测试结果:
1 ) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度
表 17
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.880 1.886
1 1.759
2 1.640
3 1.518 1.075
4 1.396
5 1.285
6 1.177
7 1.080
.ST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
8
2-8 °C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0周 1.878 1.883
3周 1.530
5周 1.395
7周 1.283
11周 1.092
3个月 1.720
6个月 1.541
9个月 1.375
12个月 1.192
) 稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
19
2— 8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 0 121.7 244.1 366.0 488.0 600 实测值 U/L 4.5 124 247 366 473 582
2— 8°C存放 6个月线性
理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5.0 115 220 338 436 559
2— 8°C存放 9个月线性
理论值 U/L 0 121 222 315 419 548
实测值 U/L 4.6 115 220 315 420 535
2— 8°C存放 12个月线性
理论值 U/L 0 114 228 343 457 571
实测值 U/L 5.2 114 231 346 449 548
4)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 20
5)稳定化 AST液体单试剂 37Ό存放后准确度测定
表 21
上列数据显示, 该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 7天, 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 4
如下测定依本发明配制的 ALT (D-葡萄糖: 5mmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 10U/L)试剂的稳定 性:
稳定化 ALT液体单试剂:
表 22
原料 分子量 浓度 (ramol/L) 每升量
Tris 121. 1 100 12. lg
α -酮戊二酸, Na盐 (2¾0) 226.1 15 3.39g
L -丙氨酸 89.1 500 44.6g
D -葡萄糖 180.2 5 0.9g
EDTA.2钠盐 372.2 5 1.86g
甘油 92.1 5%
叠氮钠 65.1 0.5g
β -NADH二钠盐 709.4 0.27 0.19g 乳酸脱氢酶 4000U
葡萄糖脱氢酶 10U 盐 rm.酴 pp 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***,不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37°C密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1: 15
延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒
试剂空白吸光度: 反映 β- NADH的含量, 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性: 550 U/L
测试结果:
1) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 23
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.857 1.752
1 1.687 1.375
2 1.066
3
4 1.188
5 1.057
可见,稳定化 ALT液体单试剂在 37°C可以存放 5天,非稳定化 ALT液体单试剂只能存放 天。 稳定化单试剂中 NADH稳定性较好。
2) ALT液体单试剂 2- 8°C存放后空白吸光度
表 24
在 2-8Ό稳定化 ALT液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上, 而非稳定化单试剂中 β -NADH只能稳定四个月。
3 ) 稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 25
稳定化 ALT液体单试剂在 2-8Ό贮存 12个月, 试剂线性测试结果仍然符合要求。
表 26
稳定化 ALT液体单试剂在 37°C存放 5天, 试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的 靶值范围内。
5)稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定
表 27
稳定化 ALT液体单试剂在 2- 8°C存放 12个月, 试剂准确度测试结果全部在质控血清标 示的靶值范围内。
上列数据显示, 该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 5天, 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是成功的。
实施例 5
如下测定依本发明配制的 ALT试剂 (D-葡萄糖: lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 2U/L) 的稳定 性:
稳定化 ALT液体单试剂配方:
表 28
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 80 9.69g
α -酮戊二酸, Na盐(2H20) 226.1 12 2.71g
L-丙氨酸 89.1 400 35.6g
D-葡萄糖 180.2 1 0.18g
EDTA.2钠盐 372.2 3 1.12g 甘油 92.1 10%
叠氮钠 65.1 0.3g
β -NADH二钠盐 709.4 0.25 0.177g 乳酸脱氢酶 3000U 葡萄糖脱氢酶 2U 盐酸 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘 油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37Ό密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37Ό
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1 : 15
延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒
试剂空白吸光度: 反映 β -NADH的含量, 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性: 550 U/L
测试结果:
1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 29
2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 30
2-8 °C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0周 1.715 1.713
3个月 1.488 1.195
4个月 1.002
6个月 1.250
9个月 1.031
3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 31
4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 32
5)稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 33
37Ό存放时间 血清 I (U/L) 血清 II (U/L) 血清 ΙΠ (U/L) 靶值 24(19-29) 靶值 47(37-57) 靶值 92(77-107)
0天 22 51 90
上列数据显示,该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 9个月后或 37°C存放 4天,试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原*** 是成功的。
实施例 6
如下测定依本发明配制的 ALT试剂 (D-葡萄糖: lOmmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 50U/L) 的稳 定性:
稳定化 ALT液体单试剂配方:
表 34
相应非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37°C密封存放。
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1 : 15
延迟时间: 60秒 测试时间: 60秒
试剂空白吸光度: 反映 0 - NADH的含量, 有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性: ^ 550 U/L
测试结果:
1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 35
2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 36
3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 37
2- -8°C存放 3个月线性
理论值 U/L 5.1 142 284 425 567 实测值 U/L 5.1 142 294 412 555
2— -8Ό存放 6个月线性
理论值 U/L 4.5 125 246 369 492 615 实测值 U/L 4.5 121 244 372 487 604
2- -8Ό存放 9个月线性
理论值 U/L 5.5 80 160 321 481 641 实测值 U/L 5.5 85 170 321 473 625
2—8°C存放 12个月线性
理论值 U/L 98 195 293 390 488 580 实测值 U/L 100 199 287 398 479 561
4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 38
5 )稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 39
上列数据显示, 该 ALT液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 5天, 试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原系 统是成功的。
实施例 7
如下测定依本发明配制的 UREA试剂 (D-葡萄糖: 5mmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 30U/L) 的稳 定性:
稳定化 UREA液体单试剂:
表 40
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121. 1 100 12. lg
α -酮戊二酸, Na盐(2 0) 226.1 7 1.6g
叠氮钠 65.0 0.3g
D -葡萄糖 180.2 5 0.9g 甘油 92.1 10%
ADP. K盐 501.3 2 l.Og β -NADH, 钠盐 709.4 0.28 0.2g 谷氨酸脱氢酶 600U/L 脲酶 6000U/L
葡萄糖脱氢酶 30U/L 盐酸 36.5 调 pH 8.1
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2—8°C密封存放, 37°C密封存放
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1: 100
延迟时间: 30秒 测试时间: 60- 150秒
试剂空白吸光度: 反映 β -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在标示值范围内
线性: 50ramol/L
测试结果:
1) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 41
37°C存放天数 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0 1.821 1.835
1 1.655 1.621
2 1.547 1.424
3 1.421 1.267
4 1.302 1.113
5 1.200 0.956
6 1.126
7 1.051
可见, 稳定化 Urea液体单试剂在 37°C可以存放 7天, 非稳定化 BUN液体单试剂只能存 放 4天。 稳定化单试剂中 β- NADH稳定性较好。
2) Urea液体单试剂 2 - 8°C存放后空白吸光度
表 42
在 2-8°C稳定化 Urea液体单试剂中 β -NADH可以稳定 18个月以上,而非稳定化 Urea液 体单试剂中 β -NADH只能稳定 8个月。
3)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定
表 43
2— 8Ό存放 4个月线性
理论值(mmol IV) 1.59 10.58 21.16 31.74 42.32 52.90 实测值(mmol/L) 1.92 11.18 22.21 31.74 43.69 52.89
2— 8°C存放 6个月线性
理论值(mmol /1) 1.68 14.00 28.00 42.00 56.00 实测值(mmol/L) 1.82 14.32 28.09 41.95 54.26
2— 8Ό存放 9个月线性
理论值(腿 ol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值(mmol/L) 1.80 14.14 27.55 40.16 52.08
2— 8°C存放 12个月线性
理论值(聽1 /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值(fflfflol/L) 1.74 14.07 27.86 39.67 51.70
2— 8Ό存放 15个月线性
理论值 (mmol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值(mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15
2— 8 °C存放 18个月线性
理论值(mmol /1) 1.68 14.00 28.00
实测值(mmol/L) 1.80 14.59 28.44 40.61 53.38 稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C贮存 18个月, 试剂线性测试结果仍然符合要求。. 4)稳定化 Urea液体单试剂 37Ό存放后准确度测定
表 44
o O L
o 稳定化 Urea液体单试剂在 37 存放 7天, 试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的 靶值范围内。
5)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定
表 45
稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C存放 12个月, 试剂准确度测试结果全部在血清标示的
靶值范围内。
上列数据显示, Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37Ό存放 7天, 试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原*** 是可行的。
实施例 8
如下测定依本发明配制的 UREA试剂(D-葡萄糖: lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶: 5U/L)的稳定 性:
稳定化 UREA液体单试剂配方:
表 46
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原***,不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37°C密封存放
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1 : 100
延迟时间: 30秒 测试时间: 60- 150秒
试剂空白吸光度: 反映 β -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在标示值范围内
线性: 50mmol/L
1 ) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 47
3 )稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后线性测定
表 49
2— 8 °C存放 3个月线性
理论值(mmol/L) 1.70 12.80 25.60 38.40 51.20 实测值(mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15
2- 8Ό存放 6个月线性
理论值(mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值(mmol/L) 11.36 22.11 31.75 41.61 52.29
2- 8°C存放 9个月线性
理论值(mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值(mmol/L) 11.12 21.84 31.61 41.50 50.18
2— 8°C存放 12个月线性
理论值(mmol/L) 10.22 20.44 30.66 40.88 51.10 实测值(mmol/L) 10.80 20.50 29.77 39.14 48.75
4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 50
5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定
表 51
上列数据显示,该 Urea液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37Ό存放 4天,试剂测试结 果都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系 统是可行的。
实施例 9
如下测定依本发明配制的 UREA试剂(D-葡萄糖: lOramol/L, 葡萄糖脱氢酶: 50U/L)的稳 定性:
稳定化 UREA液体单试剂配方:
表 52
原料 分子量 浓度 (mmol/L) 每升量
Tris 121.1 120 14.5g
α -酮戊二酸, Na盐(2¾0) 226.1 8 2.26g
叠氮钠 65.0 0.5g
D-葡萄糖 180.2 10 1.8g
甘油 92.1 15%
ADP.K盐 501.3 4
β -NADH, 钠盐 709.4 0.3 0.21g
谷氨酸脱氢酶 1000U
脲酶 8000U
葡萄糖脱氢酶 50U
盐酸 36.5 调 pH 8.1
相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原***, 不含甘油。 其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件: 2— 8°C密封存放, 37°C密封存放
测试波长: 340nm 测试温度: 37 °C
比色杯光径: 10mm 样品与试剂体积比: 1: 100
延迟时间: 30秒 测试时间: 60-150秒
试剂空白吸光度: 反映 6 -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA
准确度: 测定结果应在标示值范围内
线性: 50mmol/L
1 ) UREA液体单试剂 37°C存放后空白吸光度
表 53
2) Urea液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度
表 54
2-8°C存放时间 稳定化单试剂 非稳定化单试剂
0个月 1.933 1.930
3个月 1.770 1.613
6个月 1.669 1.362
8个月 1.124
9个月 1.555
12个月 1.392
15个月 1.295
18个月 1.203
3 ) 稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后线性测定
表 55
2— 8°C存放 3个月线性
理论值(mmol/L) 11.47 22.93 34.40 45.87 57.34 实测值(mmol/L) 11.96 23.02 34.40 43.62 55.43
2— 8°C存放 6个月线性
理论值(mmol/L) 10.03 20.06 30.09 40.12 50.15 实测值(mmol/L) 10.03 20.80 31.43 40.12 50.29
2— 8°C存放 9个月线性
理论值(mmol/L) 11.30 22.60 34.00 45.30 56.60 实测值(mmol/L) 11.90 23.20 34.00 43.70 54.20
2— 8Ό存放 12个月线性
理论值(mmol/L) 11.66 23.31 34.97 46.63 58.29 实测值(mmol/L) 12.07 24.44 34.97 46.22 56.96
2— 8°C存放 15个月线性
理论值(mmol/L) 11.00 21.90 32.90 43.80 54.80 实测值(mmol/L) 11.80 22.40 31.70 43.80 52.30
2— 8°C存放 18个月线性
理论值(mmol/L) 10.27 20.54 30.80 41.07 51.34 实测值(mmol/L) 11.09 21.73 31.95 41.07 50.81
4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定
表 56
5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定
表 57
上列数据显示, Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37°C存放 7天, 试剂测试结果 都是正常的。 使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原*** 是可行的。
工业实用性
本发明由于用于稳定试剂以抗氧化的辅酶还原***使用了高度专一性的酶 /底物对,酶和 底物的用量大为降低, 不仅几乎不增加试剂成本, 而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的 杂酶, 从而提高了试剂的稳定性。