WO2004092731A1 - 生物学的活性物質を固定化した素子 - Google Patents

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WO2004092731A1
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particles
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biologically active
particle
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PCT/JP2004/005498
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Naoki Kimura
Ryuichi Oda
Gen Masuda
Toshifumi Hashiba
Kazutoshi Hayakawa
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Nisshinbo Industries, Inc.
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the present invention relates to a device for detecting or measuring a biologically active substance or for treating.
  • the device of the present invention relates to the fields of diagnosis, treatment, biochemistry and the like. Background art
  • nucleic acids Conventionally, in the analysis of nucleic acids by hybridization and in the technique of immunoassay, a technique for immobilizing nucleic acids and proteins on solid supports such as particles, membranes, and flat plates has been used. As a method for immobilizing such biomolecules, the following are known as nucleic acids.
  • the above method (1) requires a very special machine and reagent.
  • the methods (2) and (3) when hybridization is performed, the nucleic acid is peeled off from the support, particularly during the operation, resulting in a decrease in detection sensitivity and reproducibility. May not be possible.
  • long nucleic acids can be immobilized by this method, but immobilization cannot be carried out efficiently if short nucleic acids such as oligomers of about 50 mer or less are used.
  • the method (4) has the drawbacks that extremely special machines and reagents are required to synthesize DNA on a substrate, and that the number of nucleic acids that can be synthesized is limited to about 25%. .
  • the method (5) has a drawback that the material of the base material is limited and storage stability is poor.
  • the nucleic acid reacts with the carpoimide group, so that the nucleic acid does not peel off from the polycarpoimide during the hybridization.
  • the hybridization is not performed. Polycarboimide tends to peel off from polystyrene beads during chilling.
  • An object of the present invention is to provide an element for detecting or measuring a biologically active substance having good stability in a dispersion medium, or for treating, and a method for producing the same.
  • the present inventors have conducted intensive studies to overcome the above problems, and as a result, 2 or The present inventors have found that by immobilizing a biologically active substance on particles using an organic compound having a hydrophilic group more than that, it is possible to improve the solution dispersion stability, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a core particle a base particle made of an organic compound having two or more hydrophilic groups, which is immobilized to the core particle by a chemical bond, and a biological particle bonded to the base particle via the organic compound.
  • the core particles and the biologically active substance are bound by a reaction with a functional group selected from a carbodiimide group, an ester group, a carbonate group, an epoxy group, and an oxazoline group (1).
  • a functional group selected from a carbodiimide group, an ester group, a carbonate group, an epoxy group, and an oxazoline group (1).
  • Ax and Ay each independently represent a segment having a hydrophilic functional group, and may be the same or different.
  • R independently represents a divalent or higher valent organic group
  • X represents Independently represents a carbodiimide group, an epoxy group or an oxazoline group, and n is 2 to 80, preferably an integer of 2 to 40.
  • the biologically active substance is selected from a nucleic acid, a protein, a hapten, and a sugar.
  • the device detects or detects a second biologically active substance in a sample by specific binding between the biologically active substance and a second biologically active substance contained in the sample. Is for measuring, the element according to any one of (1) to (8).
  • the device of the present invention comprises: a core particle; and a mother particle, which is immobilized on the core particle by a chemical bond and has two or more hydrophilic groups (hereinafter, referred to as “organic compound A”). And a biologically active substance bound to the mother particles via the organic compound A.
  • the core particles serve as a support for immobilizing the biologically active substance.
  • the “biologically active substance” is a substance that is specifically bound to the second biologically active substance by a specific binding between the substance and the second biologically active substance.
  • the biologically active substance acts as a drug (active ingredient) used for treatment or as a ligand for binding the drug.
  • the biologically active substance examples include nucleic acids such as DNA and RNA, proteins (including peptides) such as antigens, antibodies, and enzymes, peptide nucleic acids, haptens, sugars, glycopeptides, and the like. Of these, nucleic acids are preferred.
  • Biologically active substances are described below.
  • the core particles are preferably insoluble in an aqueous solvent and have good dispersibility in an aqueous solvent.
  • Specific examples of the core particles include, for example, organic particles or inorganic particles, or organic-inorganic composite particles formed of plastic, metal, rubber, natural polymer, ceramic (including inorganic solid), and the like. .
  • plastic examples include polyethylene, polystyrene, polycarbonate, polypropylene, polyamide, phenolic resin, epoxy resin, polycarboimide resin, poly (vinyl chloride), poly (vinylidene fluoride), poly (ethylene chloride), poly (vinylidene fluoride), and the like.
  • inorganic polymers examples include glass, crystal, carbon, silica gel, and graphite.
  • Metals include room-temperature solid metals such as gold, platinum, silver, copper, iron, aluminum, magnets, paramagnets, and apatites.
  • Examples of natural polymers include cellulose, cellulose derivatives, chitin, chitosan, and alginic acid.
  • Examples of the ceramic include alumina, silica, gay oxide, aluminum hydroxide, magnesium hydroxide, gay carbide, silicon nitride, and boron carbide.
  • the above materials may be used alone or as composite particles using two or more kinds.
  • the core particle a commercially available product may be used, or may be manufactured by using various known methods.
  • the target particles are organic particles or organic-inorganic composite particles, the following methods may be mentioned, but the method is not particularly limited to these methods.
  • the particles obtained by the above polymerization method may be particles having a crosslinked structure in advance, and can be used in the production of the present invention.
  • a compound having a functional group capable of binding to an organic compound A described below (hereinafter, sometimes referred to as “compound B”) is copolymerized or mixed in the surface layer portion of the core particle, or in the inside and the surface layer portion.
  • the core particles may be modified in advance as necessary in order to bond the core particles with the organic compound A.
  • organic compound A may be contained in the core particles.
  • modification refers to a case where a functional group is introduced into a substrate on which the core particles are formed, and a case where a substrate having a functional group is manufactured using a compound having a functional group in advance. Including both. Compound B will be described later.
  • the core particles can contain the compound B as described above.
  • the core particle is a polymer particle derived from an unsaturated monomer
  • a method of producing a particle by copolymerizing an unsaturated monomer having a functional group capable of binding to the organic compound A during polymer polymerization may be mentioned.
  • the core particle is an inorganic particle such as a metal or silicon oxide, aluminum hydroxide, or magnesium hydroxide
  • the particle surface has a functional group capable of binding to the organic compound A.
  • Examples of the method include surface treatment with a silane coupling agent to obtain core particles.
  • the core particles are composite particles composed of an organic-inorganic material (such as polymer particles containing a magnetic substance)
  • the above-described method may be combined according to the component amount of the organic-inorganic material.
  • core particles can be produced.
  • the device of the present invention and the core particles serving as a support for the device may be irregular or spherical depending on the use of the device. However, in recent years, medical devices with high accuracy have been desired, and the surface area is uniform. Particles with a uniform particle size The particles are preferably spherical or substantially spherical particles.
  • the organic compound A has at least one functional group A 1 capable of binding to the core particle and one functional group A 2 capable of chemically binding to the biologically active substance, and has two or more hydrophilic groups.
  • a compound having The functional group A1 capable of binding to the core particle and the functional group A2 capable of binding to the biologically active substance may be the same or different.
  • the functional groups A1 and A2 include a carposimid group, an ester group, a ponate group, an epoxy group, and an oxazoline group.
  • the hydrophilic group may be any functional group that swells or dissolves in water, and specific examples thereof include a hydroxyl group, a sulfoxyl group, an ethylene oxide group, a propylene oxide group, a phosphoric acid group, and a sulfonic acid. Group, a nitrogen-containing heterocyclic hydrophilic functional group, and the like. It is preferable that the hydrophilic group contains 2 or more, preferably 8 or more, more preferably 12 or more in the molecule of the organic compound A. The upper limit of the hydrophilic group is usually 60 or less, preferably 60 or less, and more preferably 40 or less. The hydrophilic group is preferably such that the organic compound A having the hydrophilic group becomes water-soluble.
  • a carbodiimide group particularly a water-soluble carbodiimide compound
  • the organic compound A having a carposimid group will be exemplified.
  • the organic compound A having a sulfoimide group is preferably a compound represented by the following formula.
  • a X and A y each independently represent a segment having a functional group showing hydrophilicity, and may be the same or different.
  • R independently represents a divalent or higher valent organic group
  • X independently represents a carbodiimide group, an epoxy group or an oxazoline group
  • n represents an integer of 2 to 80, preferably 2 to 40.
  • Examples of the above-mentioned divalent or higher valent organic group include a hydrocarbon group and an organic group containing a nitrogen atom or an oxygen atom.
  • a divalent hydrocarbon group is preferable, and a C 1 to C 12 alkylene is preferable.
  • the organic compound A having a carpoimide group represented by the above formula (I) (hereinafter sometimes simply referred to as “carpoimide compound”) is disclosed in, for example, JP-A-51-61599.
  • Polycarbodiimide which can be produced by the method of LM Alberino et al. (J. Appl. Polym. Sci., 21, 190 (1990)) or the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-292316. Can be mentioned. That is, the compound can be produced from an organic polyisocyanate compound in the presence of a catalyst that promotes the formation of an isocyanate into a calposimid.
  • Examples of the above-mentioned organic polyisocyanate compound used in the production of polycarpoimide include 4,4'-dicyclohexylmethane diisocyanate, m-tetramethylxylylene diisocyanate, and 2,4-tolylene diisocyanate.
  • 2,6-tolylene diisocyanate mixture of 2,4-tolylene diisocyanate and 2,6-tolylene diisocyanate, crude tolylene diisocyanate, crude methylene diphenyl diisocyanate 4,4 ', 4' '' _ triphenylmethylene triisocyanate, xylene diisocyanate, hexamethylene-1,6-diisocyanate, lysine diisocyanate, hydrogenated methylene diphenyl diisocyanate, m-phenyldiisocyanate, naphthylene-1,5-diisocyanate, 4,4'-biphenylenediisocyanate, 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, 3,3'-dimethoxy-1,4,4'-biphenyldiisocyanate, 3,3'-dimethyldiphenylmethane 1,4,4'- Diisocyanate, isophorone diis
  • Polycondensation occurs when the isocyanate group of the above polyisocyanate compound or a mixture thereof is carpoimidated. This reaction is usually carried out by heating the isocyanate in the presence of a carpoimidization catalyst. At that time, it has a functional group reactive with an isocyanate group at an appropriate stage, for example, a hydroxyl group, a primary or secondary amino group, a hydroxyl group, a thiol group, etc., and has a hydrophilic group in the molecule.
  • the molecular weight (degree of polymerization) can be adjusted by charging the compound as a terminal blocking agent and blocking the terminal of the carpoimide compound. Also, The degree of polymerization can also be adjusted by the concentration of the polyisocyanate compound and the like and the reaction time.
  • catalysts can be exemplified as the catalyst for promoting the carposimidation of the above-mentioned organic isocyanate.
  • examples of such catalysts include: 1-phenyl-2-1-phosphorene-1-oxoxide, 3-methyl-1-phenyl-2-phosphorene-1- Oxide, 1-ethyl-21-phosphorene-1-oxide, and their 31-phosphorene isomers are preferred in terms of yield and other aspects.
  • the carbodiimide compound represented by the chemical formula (I) has an average molecular weight of usually 200 to 100,000, preferably 500 to 500,000.
  • the above-mentioned isocyanate is produced by heating in the presence of a carpoimidization catalyst.
  • the synthesis may be performed without a solvent or may be performed in a solvent. Further, a solvent may be added during the reaction. In that case, it may be appropriately selected according to the intended use.
  • Typical examples of the solvent include ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; esters such as ethyl acetate, butyl acetate, ethyl ethyl propionate, and cellosolve acetate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not interfere with the isocyanate group and the carbodiimide group during the synthesis, and a solvent suitable for the use of the polymerization method is suitable. You may choose it. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the dispersibility of the base particles can be freely adjusted, and the cohesion degree of the element itself and the The degree of dispersion can be controlled freely.
  • the hydrophilic segment may be any segment as long as it is a water-soluble segment having a hydrophilic group, and is preferably sodium hydroxyethanesulfonate / hydroxypropanesulfone.
  • a residue of an alkyl sulfonate having at least one reactive hydroxyl group such as sodium acid acid, 2-dimethylaminoethanol, 2-dimethylaminoethanol, 3-dimethylamino-1-propanol, 3-dimethylamino-11-propanol, Quaternary salts of residues of dialkylaminoalcohols such as 3-ethylamino-1-propanol, 5-ethylethylamino-2-propanol, and 2- (di-n-butylamino) ethanol; 3-dimethylamino-n —Propylamine, 3—Getylamino n—Pro Quaternary salts of dialkylaminoalkylamine residues such as pyramine, 2 (ethylethylamino) ethylamine, poly (ethylene oxide) monomethyl ether, poly (ethylene oxide) monoethyl ether, poly (ethylene oxide propylene oxide) D) Poly (alkylene oxide
  • the organic compound A may be used alone, two or more kinds may be used in combination, or may be used as a copolymerized mixed compound.
  • the mother particles are obtained by bonding an organic compound A to the core particles by a chemical bond.
  • chemical bond means a bond such as a covalent bond, a coordinate bond, and an ionic bond.
  • a core particle containing a compound B having a functional group capable of reacting with the organic compound A is prepared, and the core particle is not dissolved and the organic compound A is dissolved.
  • mother particles can be obtained without deforming the shape of the particles.
  • impurities or unnecessary substances may be melted or precipitated in the solution or particles may be aggregated in a later step. In many cases, the resulting device cannot maintain the high accuracy required for a test, diagnostic or therapeutic device.
  • a method for producing a base particle in which a core particle and an organic compound A are bonded will be described by taking, as an example, a case where a polymer particle is used as the core particle.
  • polymer particles that can be used as the core particles examples include styrene polymers, (meth) acrylic polymers, copolymers obtained by addition polymerization of other vinyl polymers, polymers obtained by hydrogen transfer polymerization, and polycondensation. Polymers, polymers obtained by addition condensation, etc. Can be
  • the copolymerizable raw material monomer as the main component include (i) styrene, 0-methylstyrene, m-methylstyrene, p-methylstyrene, ⁇ -methylstyrene, ⁇ - Ethylstyrene, 2,4-dimethylstyrene, ⁇ - ⁇ -butylstyrene, -tert-butylstyrene, ⁇ _ ⁇ _hexylstyrene, ⁇ - ⁇ -octylstyrene, ⁇ - ⁇ -nonylstyrene, ⁇ - ⁇ -decyl styrene, ⁇ — ⁇ — Styrenes such as dodecylstyrene, ⁇ -methoxystyrene, ⁇ -phenylstyrene, ⁇ -chlorostyrene, 3,4-dichlorostyrene, (ii)
  • the core particles in the base particles according to the present invention have a surface layer portion, or an organic layer in the inside and the surface layer portion. What is necessary is just to contain the compound B which has the functional group B1 which can couple
  • the functional group B 1 include a group having a carbon-carbon unsaturated bond (double bond, triple bond),, j8-unsaturated carboxy group, epoxy group, isocyanate group, carboxy group, Examples include compounds having a hydroxyl group, an amide group, a thiol group, a cyano group, an amino group, a chloromethyl group, a glycidyl ether group, an ester group, a formyl group, a nitrile group, a nitrono group, a sulfoimide group, and an oxazoline group. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the compound B include radically polymerizable monomers and compounds having a carboxyl group.
  • Typical examples include various unsaturated mono- or dicarboxylic acids such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, itaconic acid, maleic acid, fumaric acid, monobutyl itaconate and monobutyl maleate, or unsaturated dibasic bases. And the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the compound B include radically polymerizable monomers and compounds having a hydroxyl group. Typical examples are 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, and 3-hydroxypropyl.
  • (Meth) acrylic monomers such as (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, and polyalkylene dalicols such as polyethylene glycol mono (meth) acrylate and polypropylene glycol mono (meth) acrylate
  • Examples include (meth) acrylic compounds, various hydroxyalkyl vinyl ethers such as hydroxyethyl vinyl ether and hydroxybutyl vinyl ether, and various aryl compounds such as aryl alcohol and 2-hydroxyethyl aryl ether. They may be used alone or in combination of two or more.
  • the compound B includes a polymer having a hydroxyl group.
  • Typical examples include complete saponification of polyvinyl alcohol (PVA), etc., and partially saponified resin, and saponified resin of ester acetate-containing polymer consisting of a copolymer of vinyl acetate and other pinyl monomers. And the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the compound B include radically polymerizable monomers and compounds having an amino group.
  • Illustrative examples are aminoethyl acrylate, mono-N-propylaminoethyl acrylate, methacrylic acid-N-ethylaminopropyl, mono-methacrylic acid N-phenylaminoethyl, and methacrylic acid.
  • Alkyl derivatives of acrylic acid or methacrylic acid such as N-cyclohexylaminoethyl
  • allylic amine derivatives such as arylamine and N-methylarylamine
  • styrene derivatives such as P-aminostyrene
  • triazine derivatives such as vinyl-4,6-diamino-S-triazine and the like, and are preferably compounds having a primary or secondary amino group. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the compound B includes a radical polymerizable monomer or compound having a thiol (mercapto) group. Specific examples are shown below: 2-Proben-1-thiol, 3-butene-1-thiol, 4-pentene-1-thiol,
  • the monomer containing the various reactive groups described above is used.
  • a polyfunctional copolymer may be obtained by using a plurality of them.
  • a known radical polymerization initiator can be used as the polymerization initiator used for polymerizing the radical polymerizable monomer.
  • specific examples include peroxides such as benzoyl peroxide, peroxides of cumenehydride, t-butylhydroxide, sodium persulfate, and ammonium persulfate, and azobisisobutyronitrile.
  • azo-based compounds such as azobismethylbutyronitrile and 7-azobisisopareronitrile. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the polymerization solvent is not particularly limited, and a solvent suitable for the use of the polymerization method may be appropriately selected. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a dispersant, a stabilizer, an emulsifier (or a surfactant), an antioxidant or a catalyst (or a reaction accelerator), and the like are appropriately selected and used according to a usable polymerization method. May be.
  • dispersants and stabilizers include polyhydroxystyrene, polystyrenesulfonic acid, vinylphenol- (meth) acrylate copolymer, and styrene- (meth) acrylate.
  • Polystyrene derivatives such as acrylate copolymer, styrene-vinylphenol- (meth) acrylate copolymer; poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylamide, polyacrylonitrile, polyethyl (meth) acrylate Poly (meth) acrylic acid derivatives such as polybutyl (methyl) acrylate; polyvinyl alkyl ether derivatives such as polymethyl vinyl ether, polyethyl vinyl ether, polybutyl vinyl ether and polyisobutyl vinyl ether; cellulose, methyl Cellulose, Cellulose Acetate Cellulose, Cellulose Nitrate, Hydroxymethyl Cellulose, Hydroxyethyl Cellulose, Hydroxypropyl Cellulose, Cellulose Derivatives such as Carboxymethyl Cellulose; Polyacetic Acids such as Polyvinyl Alcohol, Polyvinyl Butyral, Polyvinyl Formal, Polyvinyl Acetate Vinyl derivatives; Nitrogen-
  • an alkyl such as sodium lauryl sulfate
  • Anionic emulsifiers such as alkyl benzene sulfonate, alkyl naphthalene sulfonate, fatty acid salt, alkyl phosphate, alkyl sulfosuccinate such as sodium sulfate, sodium dodecylbenzene sulfonate; alkylamine salt; Grade ammonium salts, alkyl betaines, cationic emulsifiers such as amine oxides, boroxyethylene alkyl aryl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, polyoxyethylene fatty acid esters And the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a small amount of a cross-linking agent may be used depending on the intended use.
  • Illustrative examples include aromatic divinyl compounds such as divinyl benzene and divinyl naphthalene; ethylene dalicol dimethacrylate, ethylene dalicol dimethacrylate, triethylene glycol dimethacrylate, and tetraethylene glycol dimethacrylate.
  • the core particles are thermoplastic particles containing an organic substance
  • only the surface (surface layer portion) of the particles or the inside and the surface layer portion may be crosslinked.
  • antioxidants examples include a phenol-based antioxidant, a sulfur-based antioxidant, a phosphorus-based antioxidant, an amine-based antioxidant, a hydroquinone-based antioxidant, and a hydroxylamine-based antioxidant.
  • the catalyst is not particularly limited as long as it promotes the reaction. It is not limited, and a known material may be used. An appropriate amount may be selected and added in a range that does not adversely affect the physical properties of the particles. For example, when an epoxy group is contained in at least one of the functional group of the core particle and the functional group of the organic compound A, specifically, benzyldimethylamine, triethylamine, tributylamine, pyridin, triphenylamine, etc.
  • Tertiary amines such as amines; quaternary ammonium compounds such as triethylbenzylammonium chloride, tetramethylammonium chloride; phosphines such as triphenylphosphine and tricyclophosphine; benzyltrimethylphospho Phosphonium compounds such as dimethyl chloride; imidazole compounds such as 2-methylimidazole and 2-methyl-4-ethylimidazole; alkali metal hydroxides such as potassium hydroxide, sodium hydroxide and lithium hydroxide Such as sodium carbonate and lithium carbonate; Metallic carbonates; Alkali metal salts of organic acids; Addition of catalysts such as boron trichloride, boron trifluoride, tin tetrachloride, titanium tetrachloride or other Lewis acid halides or complex salts thereof It is possible to do. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the weight average molecular weight is about 1,000 to 3,000, 000. If the core particles are spherical particles, the weight-average molecular weight is about 300,000. It is about 1, 000, 0000.
  • the core particles having a functional group capable of reacting with the organic compound A used for preparing the mother particles may have a functional group content of 30 to 200 when the core particles are polymer fine particles. It preferably satisfies the condition, preferably satisfies 50 to 100, more preferably 80 to 900, and particularly preferably 100 to 500 by equivalent. If the equivalent is more than 2000, the bonding with the core particles requires a considerable amount of time because the number of functional groups is too small. On the other hand, if it is less than 30, the binding density may be too high to leave functional groups capable of binding to the biologically active substance on the surface and the surface layer of the base particles. However, this does not apply if time margin or a very small amount of functional groups are required. That is, it may be a Z functional group of more than 2000 or less than 30 / functional group.
  • the core particles are composed of inorganic particles or organic-inorganic composite particles.
  • the term “equivalent” refers to the amount of a compound based on the quantitative relationship of a substance in a chemical reaction.
  • it indicates the chemical formula amount of the core particles per 1 m 01 of the functional group capable of reacting with the organic compound A.
  • the content of the functional group of the organic compound A necessary for preparing the mother particles is 50 to 1,500, preferably 80 to 1,000, and more preferably 100, in an equivalent amount. 0 to 800, particularly preferably 200 to 700.
  • the functional group equivalent of the organic compound A is more than 1,500, it may not be preferable because the number of the functional groups is too small and a considerable time is required for bonding to the core particles. On the other hand, when it is less than 50, a large number of functional groups capable of binding to the biologically active substance remain, which may have an adverse effect. However, this does not apply to cases where time margin or a very small amount of functional groups are required. That is, it may be more than 1,500 / functional group.
  • the amount of the organic compound A added to the core particles depends on the remaining amount of the necessary organic compound after curing or bonding. It is sufficient to add 1 to 20 as a standard, preferably 0.5 to 8, and more preferably 1 to 5. The same applies to the case where the core particles are organic-inorganic composite particles or core particles formed from inorganic particles. Further, the amount of the organic compound A to be added may be more than 20 in equivalent ratio, but it is not preferable in terms of cost because the amount of the remaining organic compound in the medium increases. If the amount added is less than 0.1 in equivalent ratio, it may not be possible to leave a functional group capable of binding to the biologically active substance. However, this does not apply if a sufficient amount of time is required and a very small amount of functional groups are required.
  • the average particle size of the mother particles is preferably from 0.01 to 100 m, preferably from 0.05 to 50 m, more preferably from 0.08 to 30 m, and particularly preferably from 0.1 to 30 m. ⁇ 10 m is good. If the average particle diameter is more than 100, the sedimentation speed of the particles will be high, which is not preferable as a biological or medical device. On the other hand, if the average particle size is less than 0.01, the particle size is too small, so that the degree of agglomeration increases and monodispersed particles may not be obtained. It is preferable that 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more of the base particles fall within the above range.
  • the reaction temperature for the reaction depends on the type of the solvent, but is preferably in the range of 10 to 200 ° C, more preferably 15 to 150 ° C, and still more preferably 2 to 150 ° C.
  • the range of 0 to 130 ° C is good.
  • the time required for the reaction may be the time required for the binding reaction between the core particles and the functional group of the organic compound A to be almost completed.
  • the organic compound used and the amount added, the type of the functional group in the particle, the solution Although it greatly depends on the viscosity, concentration, etc., the temperature is, for example, 50 ° C. for 1 to 24 hours, preferably about 2 to 15 hours.
  • reaction time is lengthened (more than 24 hours)
  • mother particles can be obtained, but it may not be preferable to require time in the production method.
  • Suitable reaction times can be easily determined by carrying out the reaction at various reaction times in preliminary experiments.
  • the solvent in which the core particles do not dissolve and the organic compound A dissolves is at least one solvent selected from water or an organic solvent.
  • the organic compound to be used, the amount added, and the type and content of the resin used as the component of the base particles It may be appropriately selected in consideration of the type of the functional group, the intended use, and the like.
  • Specific solvents include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol, 2- Pentanol, 3-pentanol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, 1-hexanol, 2-methyl-1-pentanol, 4-methyl-2-pentanoyl Alcohols such as 2-, 2-ethylbutanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 2-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, benzyl alcohol, cyclohexanol Classes: Methyl-Ce-solve, Ethyl-Ce-solve, Isopropyl Cello-solve, Butyl-Cesolve, butylene glycol monobutyl Et
  • water lower alcohols such as methanol and ethanol, ether alcohols such as methylcellosolve and ethylcellosolve, mixtures of water and lower alcohols, and water-soluble and hydrophilic media such as mixtures of water and ether alcohols, Toluene, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), methylethylketone (MEK), methylisobutylketone (MIBK), acetone, N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), dichloromethane, tetrachloroethylene
  • water, lower alcohols such as methanol and ethanol, mixtures of water with lower alcohols such as methanol and ethanol, mixtures of water with lower alcohols such as methanol and ethanol, and mixtures of water with lower alcohols such as methanol and ethanol.
  • Water-soluble and hydrophilic media are not particularly limited, and a solvent suitable for the intended use may be appropriately
  • the above-mentioned dispersant, antioxidant, stabilizer, emulsifier (surfactant), catalyst (reaction accelerator), etc. may be appropriately selected and added as required. it can.
  • the solution concentration at the time of reaction between the core particles and the organic compound A is from 1 to 60% by weight, preferably from 5 to 40% by weight, and more preferably from the following formula. Is from 10 to 30% by weight.
  • Solution concentration (% by weight) [(total solution one solvent) total solution] X 100 If the above solution concentration exceeds 80% by weight, the amount of core particles or organic compound A becomes excessive, and the The balance in the interior is lost, and monodispersed and stable particles can be obtained. It is not preferable because it becomes difficult. If the solution concentration is less than 1% by weight, mother particles can be produced, but synthesis must be performed for a long time to obtain the desired particles. However, it is not preferable that time is required in the production method.
  • the shape of the base particles is preferably uniform in particle diameter, and is preferably spherical or substantially spherical particles.
  • “spherical or substantially spherical” is defined as a shape that satisfies ⁇ 1 ⁇ long diameter / short diameter ⁇ 1.2 in a projected two-dimensional view of a sphere.
  • the average particle diameter is determined by taking a photograph at a magnification (100 to 100, 0000 times) that can be measured by SEM, measuring it at random (for example, 500 particles), and calculating the average diameter as the average particle diameter. By doing so, it can be measured.
  • CV (%) (standard deviation of particle [element] diameter / average particle [element] diameter) X 100
  • the dispersibility of the base particles and the element of the present invention is represented by a CV ratio represented by the following formula. Can be.
  • CV ratios CV b ratio and CV. It is preferred that at least one of the ratios is between 0.6 and 3.0, preferably between 0.8 and 1.5, more preferably between 0.9 and 1.1. Further, it is more preferred that both of the CV b ratio and CV c ratio of the range. Furthermore, in addition to the CV b ratio and C Vc ratio, it is particularly preferred CV a ratio is also the range.
  • cv c ratio cv 2 / cv 3 C (Standard deviation of core particle diameter Z Average particle diameter of core particle diameter) XI 0 0 C (Standard deviation of mother particle diameter Z Average particle diameter of mother particle) X 100
  • CV 3 (standard deviation of element diameter Z average particle diameter of element) X 1 0 0
  • the biologically active substance is for capturing a second biologically active substance that specifically binds to the substance.
  • the second biologically active substance to be detected include nucleic acids, proteins (including peptides), sugars and the like. Of these, nucleic acids are preferred.
  • the biologically active substance functions as an active ingredient of a therapeutic drug.
  • nucleic acid When a nucleic acid is used as a biologically active substance, there is no particular difference from the nucleic acid used for hybridization between nucleic acids using ordinary solid-phased nucleic acid, and a nucleic acid capable of hybridization is used. There is no particular limitation as long as it is present, and examples include natural or synthetic DNA (including oligonucleotides) or RNA (including oligonucleotides).
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • the chain length of the nucleic acid is not particularly limited as long as hybridization is possible, but it is usually 5 to 500 bases, preferably 20 to 1000 bases.
  • the nucleic acid may have a polymer having a reactive group by ultraviolet rays, such as thymine, at the 5 'end or 3' end of the nucleic acid.
  • the functional group A2 in the organic compound A capable of covalently binding to the biologically active substance is also used.
  • the solvent, reaction conditions, etc. may be appropriately set so that a reaction occurs so that the biologically active substance and the functional group A form a covalent bond.
  • the solvent for dissolving the nucleic acid is not particularly limited, either. Distilled water or a buffer commonly used for preparing a nucleic acid solution, for example, a Tris buffer such as TE buffer (10 mM Tris hydrochloric acid, pH 8.0Z lmM EDTA), Aqueous solution containing salt, aqueous solution containing carboxylate (sodium citrate, ammonium citrate, sodium acetate, etc.), aqueous solution containing sulfonate (sodium dodecyl sulfate, ammonium dodecyl sulfate, etc.), aqueous solution containing phosphonate Liquids (sodium phosphate, ammonium phosphate, etc.).
  • a Tris buffer such as TE buffer (10 mM Tris hydrochloric acid, pH 8.0Z lmM EDTA), Aqueous solution containing salt, aqueous solution containing carboxylate (sodium citrate,
  • the concentration of the nucleic acid solution is not particularly limited, either, but is usually lmmol / ml to lfmol / ml, preferably 100 pmol / ml to 100 fmol / ml.
  • Methods for bringing the nucleic acid solution into contact with the mother particles include a method of dropping the nucleic acid solution onto the mother particles with a pipette, a method using a commercially available spot, and a method of suspending the mother particles in the nucleic acid solution.
  • Can be The amount of the nucleic acid solution is not particularly limited, but is preferably 10 nl to 10 ml.
  • the nucleic acid solution may be one kind, two kinds or more. As a positive control indicating that the nucleic acid has been immobilized on the mother particle, a labeled nucleic acid may be brought into contact with the mother particle.
  • ultraviolet light is irradiated after the nucleic acid solution is brought into contact with the mother particles. Further, after contacting the nucleic acid solution, the mother particles can be dried before irradiation with ultraviolet rays.
  • the nucleic acid solution may be dried naturally or may be dried by heating. The temperature for heating is usually 30 to 100 ° (:, preferably 35 to 45 ° C.
  • the base particles are irradiated with ultraviolet rays.
  • ultraviolet light having a broad waveform including a wavelength of 280 nm may be used.
  • Irradiation dose is usually lOOmJ / cm 2 or more as the cumulative dose, preferably 200 mJ / cm 2 or more.
  • a nucleic acid having a photoreactive group introduced into an arbitrary portion of the nucleic acid may be used.
  • the element of the present invention is produced by immobilizing the nucleic acid on the mother particle.
  • the device obtained by the method of the present invention can be used, for example, for nucleic acid analysis by hybridization.
  • the nucleic acid immobilized on the mother particles by the method of the present invention has excellent dispersibility, and thus has better detection sensitivity and better reproducibility than the conventional method.
  • Hybridization and the detection thereof can be performed in the same manner as in the case of hybridization using an ordinary solid-phased nucleic acid.
  • proteins such as antibodies, antigens, enzymes, and hormones can be used in the same manner as ordinary solid phase immunoreagents.
  • the device of the present invention is used for detecting or measuring a second biologically active substance that specifically binds to the biologically active substance on the device.
  • a substance that inhibits the binding between the biologically active substance on the element and the second biological substance can be detected or measured.
  • nucleic acids examples include nucleic acids, proteins (including peptides), sugars and the like.
  • Nucleic acids include DNA or RNA, and proteins include antigens, antibodies, enzymes and the like.
  • nucleic acids will be described as an example of a biologically active substance.However, except for the formation of a hybrid as a nucleic acid-specific detection method, methods and conditions that are commonly used for detection of other substances may be used. it can.
  • the device of the present invention can be used as a template for detection, purification or PCR in a nucleic acid detection method by hybridization using a nucleic acid labeled with a labeling substance. That is, particles (hereinafter, referred to as “elements”) in which immobilized nucleic acids are immobilized on mother particles can be used as a probe for hybridization. After the probe is hybridized to the nucleic acid to be measured to form a nucleic acid-nucleic acid hybrid, the free probe is removed from the system, and then the nucleic acid to be measured is detected by detecting the labeling substance contained in the hybrid. Can be detected. Similarly, the target nucleic acid can be purified. Alternatively, the nucleic acid captured by the nucleic acid on the element can be used as a template for a PCR reaction.
  • the mother particles are directly detected by measuring the fluorescence intensity or the like using a fluorescence spectrophotometer, a 96-well micro tie fluorescence plate spectrophotometer, a fluorescence microscope, or the like. Can be.
  • Hybridization using the device of the present invention is not particularly different from normal nucleic acid hybridization.
  • nucleic acid used in the sample it is preferable to label the nucleic acid used in the sample by labeling the polynucleotide or oligonucleotide by a method usually used for labeling nucleic acid.However, the labeled nucleotide is incorporated into the polynucleotide or oligonucleotide by a polymerase reaction. Can also be done.
  • the device of the present invention is characterized in that the biologically active substance has two or more hydrophilic groups. Since it is bonded to the base particles through the organic compound, the dispersion stability in an aqueous solvent is good.
  • SNP Single nucleotide polymorphism
  • the devices aggregate in a hybridization solution, the It is not possible to maintain an appropriate distance between each other, and as a result, hybridization is likely to be hindered by steric hindrance of elements or genes.
  • the device of the present invention since the device of the present invention has good dispersibility in an aqueous solvent, the above-mentioned inhibition of the hybridization is unlikely to occur.
  • detection of a specimen using fluorescence, radioisotope, or the like can be performed with good reproducibility.
  • SNP and Gene expression analyzes can be detected with high efficiency and high sensitivity.
  • the aqueous solvent is water, TE buffer one, SSC buffer one, phosphate buffer one, acetate buffer one, borate buffer one, Tris_HCl buffer one, UniHybri Tk (Telec em International Inc.) ), ExpressHyD ' M Hybridization Solution (Clontech), SlideHyb TM Survey Kit (Ambion), etc., buffer, DMS0, DMF, etc., mixed with an aqueous solvent, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
  • a surfactant such as tetramethylammonium salt, formamide, etc.
  • the device of the present invention is used for treating a disease.
  • the biologically active agent functions as an active ingredient of a therapeutic agent. 8
  • a part of the particle solution is repeatedly washed and filtered about 3 to 5 times with a mixed solution of water and methanol (3: 7) using a suction filtration device, and then dried in a vacuum to remove core particles 1. Obtained. Observation of the shape of these particles with a SEM (Hitachi S-2150) revealed that they were spherical particles. When the particle diameter was measured, the average particle diameter was 1.4.
  • core particles 2 were obtained by vacuum drying. Observation of the shape of these particles with a SEM (Hitachi S-2150) revealed that they were spherical particles. When the particle diameter was measured, the average particle diameter was 0.78 xm.
  • Table 1 summarizes the production results of the above core particles.
  • Table 1 Particle-containing reactive groups
  • TXD I tetramethylxylylene diisocyanate
  • a carbodiimidation catalyst at 180 ° C for 10 hours
  • 55.6 g of distilled water was gradually added to obtain a polycarboimide compound 2 solution (resin concentration: 60 wt%).
  • the calposimid equivalent was 537 ZNCN.
  • Table 2 summarizes the results of the synthesis of the polycarboimide compound obtained above.
  • Table 2 Organic compounds Functional groups Terminal capping Functional groups Medium Synthetic example Seg raw material equivalent per molecule
  • mother particles were repeatedly washed and filtered three times with a mixed solution of water and methanol (3: 7) and twice with methanol using a suction filtration device, and then dried in vacuo to obtain mother particles 1.
  • SEM Hatachi S-2150
  • FT-IR 8200PC Fourier transform infrared spectrophotometer
  • mother particles are mixed with a water-methanol mixed solution (3: 7) using suction filtration equipment. After repeating washing and filtration three times and methanol twice, and then vacuum drying, mother particles 2 were obtained. The shape of the particles was observed with a SEM (Hitachi S-2150) and found to be 1.88 / m. Furthermore, these particles were converted to a Fourier transform infrared spectrophotometer (manufactured by Shimadzu).
  • a mixture comprising the following components is charged into a 300 ml flask at a time, and heated at 45 ° C for about 15 hours in an oil bath under a nitrogen stream while stirring with a stirrer to remove the boronic amide compound.
  • the reaction was performed to prepare a mother particle solution.
  • mother particles were washed with a water / methanol mixed solution (3: 7) three times and methanol twice, using a suction filtration device, and the filtration was repeated, followed by vacuum drying to obtain mother particles 3.
  • the shape of the particles was observed with a SEM (Hitachi S-2150) and found to be 0.98 m. Furthermore, these particles were converted to a Fourier transform infrared spectrophotometer (manufactured by Shimadzu).
  • the particle diameter was similar to the result obtained by SEM.
  • the particle size was monodisperse.
  • Example 6 of JP-A-8-23975 a mixture composed of the following components was charged into a 300 ml flask at a time and stirred with a stirrer. Immersed for about 30 minutes.
  • the mixture was filtered using a suction filtration device, and then dried in a dryer at a temperature of 60 ° C. for about 3 hours to obtain polycarboimide compound-coated particles.
  • Table 3 summarizes the production results of the above base particles.
  • Table 3 Base particles Organic compound A used Synthesis temperature Production example in aqueous medium Addition amount of core particles Dispersibility
  • Li is the average particle size of the prototype core particles (A)
  • L 2 is the average particle size of the prototype mother particles (A)
  • the mother particles having the organic compound A used in the examples of the present invention are the mother particles having the organic compound A layer on the surface layer of the core particles, and have the comparative particle size. It was confirmed that the particles were uniform spherical particles.
  • the base particles obtained in the above Production Examples 1 to 4 were dispersed in an aqueous medium using a known dispersing equipment, and then adjusted to a 1 wt% aqueous particle dispersion solution to obtain mother particle 1-4 solutions.
  • the solution of the base particles 1 to 4 was measured with a particle size distribution meter (Nikkiso Microtrac 932 0HRA), the average particle diameter was the same as above, and the distribution was sharp.
  • Example 5 was a group of monodispersed particles
  • an oligonucleotide (30 mer) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3 was synthesized using an oligonucleotide synthesizer (Perkin-elmer Applied biosystems).
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 1 was biotinylated at its 5 terminus.
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 2 has complementarity with the biotinylated probe (SEQ ID NO: 4), and the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 3 differs from the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 2 by one nucleotide sequence. . Not compatible.
  • These oligonucleotides were dissolved in 3 XSSC so as to be 100 pmol / 1.
  • Each of the oligonucleotide solutions was mixed with the mother particle 1 solution in a quartz cell.
  • Uvstratalinker 2400 manufactured by STRATAGENE
  • ultraviolet rays were irradiated at 1200 mJ / cm 2 from a distance of 16 cm.
  • the irradiation time was 480 seconds.
  • the mother particles were washed by shaking in water for 30 minutes, and then dried to obtain a device.
  • the following hybridization washing was performed under the following conditions to remove the biotinylated probe non-specifically adsorbed on the device.
  • Example 5 and Comparative Example 1 were diluted with water, and the dispersibility was confirmed using a particle size distribution analyzer (Nikkiso Microtrac 9320 HRA).
  • the device of Example 5 was a particle group showing a monodisperse distribution similar to that of the base particle 1 and did not show a change indicating a different distribution, but the oligonucleated compound of Comparative Example 1 In the device with immobilized leotide, a single-peak distribution with a longer distribution end than the core particle size distribution obtained was obtained.
  • agglomerated particles they were regarded as one particle, and the average value of the longest and shortest diameters of the particles was calculated using SEM, which was used as the particle size. From this, it was confirmed that the device of the present invention had good solution dispersibility and high performance.
  • the device of the present invention has a good solution dispersion stability, and can be suitably used as a device for detecting or measuring a biologically active substance or for treating.

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Abstract

コア粒子と、コア粒子に化学結合により固定化された、２又はそれ以上の親水性基を有する有機化合物からなる母粒子と、前記有機化合物を介して母粒子に結合した生物学的活性物質からなる、生物学的活性物質を固定化した素子を用いて、前記生物学的活性物質に特異的に結合する物質を検出又は測定する。

Description

明細書 生物学的活性物質を固定化した素子 技術分野
本発明は、 生物学的活性物質の検出もしくは測定用、 又は治療用の素子に関す る。 本発明の素子は、 診断、 治療、 生化学分野等に関する。 背景技術
従来、 ハイブリダィゼ一シヨンによる核酸の分析や、 ィムノアッセィ等におい ては、 核酸やタンパク質を粒子、 膜、 平板などの固体支持体上に固定化する技術 が利用されている。 このような生体分子の固定化法として、 核酸では、 以下のも のが知られている。
(1) 5' 末端にチオール基を有する核酸と、 チオール基を含むビーズ状基材間 のジスルフィ ド結合による固定 （P. J. R. Dayら， 「Biochem. J.J 1991年， 第 2 78巻， p.735- 740) 等のような、 修飾基を導入した核酸を基材に化学結合させる 方法。
(2) 核酸を、 紫外線 （UV) 照射又は加熱処理により、 ニトロセルロース、 ナイ ロンメンブレン、 又はポリ一 L一リジン等のカチオンポリマ一で被覆されたガラ ス等の担体等に、 吸着固定させる方法 （特表平 10- 503841号公報、 J. Sambrookら， 厂 Molecular Cloningj Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第 2版， .2.10 9-2.113, p.9.34-9. 6) 。
(3) ポリリジン溶液で処理されたマイクロプレートのゥエル中に核酸を注入し、 37°Cに加熱して、 核酸をゥエルに物理吸着させる方法 （G. C. N. Parryら， 「Bio chem. Soc. Trans. J ， 1989年， 第 17巻， p.230- 231) 。
(4) 基材上に結合させたヌクレオチドを用い、 基材上で DN Aを合成する方法 (W097/10365) 。
(5) 5' 末端にピオチン基を有する核酸とストレプトアビジン皮膜で覆われた マグネティックビーズ担体間による固定 （特表 2000- 507806号公報） 等のような、 修飾基を導入した核酸を化学結合させる方法。
( 6 ) ポリカルポジイミ ド （カルポジイミ ド基） で皮膜したポリスチレンビーズ に核酸を固定する方法 （特開平 8- 23975号公報） 。
しかしながら、 上記の （1 ) の方法は、 極めて特殊な機械と試薬を必要とする。 また、 ( 2 ) 及び ( 3 ) の方法においては、 八ィブリダイゼ一ションを行った場 合、 特に操作過程で支持体から核酸が剥がれ落ち、 結果として検出感度が下がつ たり、 再現性が得られないことがある。 また、 この方法では、 長い核酸は固定で きるが、 オリゴマ一等約 5 0マー以下の短い核酸になると、 効率よく固定化でき ない。 さらに、 （4 ) の方法は、 基材上で D N Aを合成するために、 極めて特殊 な機械と試薬を必要とし、 さらに、 合成できる核酸も 2 5マ一程度までに限られ るという欠点がある。 また、 （5 ) の方法は、 基材の材料が限られ、 保存安定性 に乏しいという欠点がある。 また、 （6 ) の方法では、 核酸をカルポジイミド基 と反応させるため、 ハイプリダイゼーション中にポリカルポジィミ ドから核酸が 剥がれ落ちることはないが、 ポリスチレンとポリカルポジイミ ドが化学的結合し ていないため、 ハイブリダイゼ一シヨン中にポリスチレンビーズからポリカルポ ジイミ ドが剥がれ落ちる傾向がある。
一方、 特許第 2629909号公報に記載されているように、 モノカルポジイミドを 活性化しアミノ酸などからアミ ド結合により母体となる粒子と固定化を試み、 分 散性を向上させる検討がなされているが、 縮合反応によって尿素誘導体等の不要 生成物を生じる為、 洗浄工程において時間を費やすといった問題が生じる。 さら にアミド結合を形成する特定の活性物質に限られてしまうことや、 母体となる粒 子とアミノ酸中のアミノ基ゃ力ルポキシル基等との結合部位 （位置） によって、 検査、 診断素子としての性能が発揮できないという問題が生じる。 発明の開示
本発明の目的は、 分散媒体中において良好な安定性を有する生物学的活性物質 の検出もしくは測定用、 又は治療用の素子及びその製造方法を提供することにあ る。
本発明者らは、 前記問題点を克服するため、 鋭意検討を行った結果、 2又はそ れ以上の親水性基を有する有機化合物を用いて生物学的活性物質を粒子に固定化 することにより、 溶液分散安定性を向上させることができることを見出し、 本発 明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
(1) コア粒子と、 コア粒子に化学結合により固定化された、 2又はそれ以上の 親水性基を有する有機化合物からなる母粒子と、 前記有機化合物を介して母粒子 に結合した生物学的活性物質からなる、 生物学的活性物質を固定化した素子。
(2) 水系溶媒中に用いられることを特徴とする（1)に記載の素子。
(3) 母粒子の平均粒子径が 0. 0 1〜 1 00 zmである（1)又は（2)に記載の素 子。
(4) 母粒子が球状又は略球状である（1)〜（3)のいずれかに記載の素子。
(5) 下記式で表される C Vb比及び C Vc比の少なくともいずれかが 0. 6〜3. 0であることを特徴とする（1)〜（4)のいずれかに記載の素子。
C Vb比 =C V!/C V:i
C Vc比 =C V2ノ C V3
C V!= (コア粒子径の標準偏差/コア粒子径の平均粒子径） X I 00 C V2= (母粒子径の標準偏差/母粒子の平均粒子径） X 1 00
C V3= (素子径の標準偏差/素子の平均粒子径） X I 00
(6) 前記コア粒子及び生物学的活性物質は、 カルポジイミド基、 エステル基、 カーボネート基、 エポキシ基、 及びォキサゾリン基から選ばれる官能基との反応 により結合していることを特徴とする（1)〜（5)のいずれかに記載の素子。
(7) 前記有機化合物は、 下記式で表される化合物である（1)〜（6)のいずれかに 記載の素子。
Ακ- (R-X) n-R-Ay … （ I )
(Ax、 Ayは、 独立して親水性を示す官能基を有するセグメントを示し、 同一で あってもよく、 異なっていても良い。 Rは独立して 2価以上の有機基を示し、 X は独立してカルポジイミド基、 エポキシ基又はォキサゾリン基を示し、 nは 2〜 8 0、 好ましくは 2〜4 0の整数を示す。 ）
( 8 ) 前記生物学的活性物質が、 核酸、 タンパク質、 ハプテン、 糖から選ばれる (1)〜（7)のいずれかに記載の素子。
( 9 ) 前記素子は、 前記生物学的活性物質と、 試料中に含まれる第二の生物学的 活性物質との特異的な結合によって、 試料中の第二の生物学的活性物質を検出又 は測定するためのものである、 （1)〜（8)のいずれかに記載の素子。
( 1 0 ) 前記生物学的活性物質は疾患の治療用の薬剤である、 （1)〜（8)のいずれ かに記載の素子。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明の素子
本発明の素子は、 コア粒子と、 コア粒子に化学結合により固定化された、 2又 はそれ以上の親水性基を有する有機化合物 （以下、 「有機化合物 A」 という） か らなる母粒子と、 前記有機化合物 Aを介して母粒子に結合した生物学的活性物質 からなる。
以下、 本発明の素子について説明する。
( 1 ) コア粒子
コア粒子は、 生物学的活性物質を固定化するための支持体としての役割を果た すものである。 本発明の素子の一態様 （ァフィニティー粒子） においては、 「生 物学的活性物質」 は、 同物質と、 第二の生物学的活性物質との特異的な結合によ つて、 試料中の第二の生物学的活性物質を捕捉するためのものである。 試料とし ては、 血液、 血漿、 血清等の体液や、 動植物細胞、 細菌等の細胞等が挙げられる。 また、 本発明の素子の他の態様においては、 生物学的活性物質は、 治療に用い る薬剤 (有効成分) として、 あるいは同薬剤を結合させるリガンドとして作用す る。 生物学的活性物質としては、 D N A、 R N A等の核酸、 抗原、 抗体、 酵素等 のタンパク質 (ぺプチドを含む) 、 ぺプチド核酸、 ハプテン、 糖、 糖ペプチド等 が挙げられる。 これらの中では核酸が好ましい。 生物学的活性物質については、 後述する。 前記コア粒子は、 水系溶媒には不溶であり、 かつ、 水系溶媒中で分散性のよい ものが好ましい。 コア粒子として具体的には、 例えば、 プラスチック、 金属、 力 一ボン、 天然高分子、 セラミック （無機固体含む） などから形成される、 有機粒 子もしくは無機粒子、 又は有機—無機複合粒子が挙げられる。
前記プラスチックとしては、 ポリエチレン、 ポリスチレン、 ポリカーボネート、 ポリプロピレン、 ポリアミ ド、 フエノール樹脂、 エポキシ樹脂、 ポリカルポジィ ミ ド樹脂、 ポリ塩化ピニル、 ポリ弗化ビニリデン、 ポリ弗化工チレン、 ボリイミ ド及びァクリル樹脂等が、
無機高分子としては、 ガラス、 水晶、 カーボン、 シリカゲル及びグラフアイ 卜 等が、
金属としては、 金、 白金、 銀、 銅、 鉄、 アルミニウム、 磁石、 パラマグネット 及びァパタイ ト等の常温固体金属が、
天然高分子としては、 セルロース、 セルロース誘導体、 キチン、 キトサン及び アルギン酸等が、
セラミックとしては、 アルミナ、 シリカ、 酸化ゲイ素、 水酸化アルミニウム、 水酸化マグネシウム、 炭化ゲイ素、 窒化ケィ素及び炭化ホウ素等が、 各々例示さ れる。
上記素材は、 単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用した複合粒子として もよい。
コア粒子は、 市販品があればそれを用いてもよいし、 公知の種々の方法を用い て製造してもよい。 例えば、 目的の粒子が有機粒子や有機一無機複合粒子であれ ば、 以下の方法が挙げられるが、 特にこれらの方法に限定されるものではない。
( i ) 一般的な塊状重合、 溶液重合により得られた溶液樹脂を粉砕、 分級して粒 子を得る方法、
( Π ) 上記と同様の重合法により得られた溶液樹脂を滴下して粒子 （球状粒子含 む） を得る方法、
( i i i ) 水溶液中で行う乳化もしくは懸濁重合により粒子 （球状を含む） を得る 方 法、
( iv) 上記 （i i i ) とシード法等を組み合わせて粒子を得る方法、 ( v ) 非水溶媒中又は水との混合溶媒中での分散重合法によって粒子 （主に球 状） を得る方法、
(v i ) 上記 （V ) とシード法等を組み合わせて粒子を得る方法、
(v i i ) 押し出し成形機などによりペレツト状にした粒子を得る方法。
また、 上記重合法により得られた粒子は、 予め架橋構造を有している粒子であ つても特に差し支えなく、 本発明の製造に用いることができる。
好ましくは、 コア粒子の表層部、 又は内部及び表層部には、 後述する有機化合 物 Aと結合可能な官能基を有する化合物 (以下、 「化合物 B」 ということがある） を、 共重合又は混合によって含有させることが望ましい。 例えば、 母粒子を作製 するにあたり、 コア粒子と、 有機化合物 Aとを結合させるためには、 必要に応じ てコア粒子をあらかじめ修飾しておいてもよい。 また、 コア粒子に有機化合物 A を含有させておいてもよい。 尚、 前記コア粒子の 「修飾」 とは、 コア粒子を形成 する基材に後から官能基を導入する場合、 及び、 予め官能基を有する化合物を用 いて官能基を有する基材を製造する場合、 の両者を含む。 化合物 Bについては、 後述する。
コア粒子に上記のような化合物 Bを含有させる方法としては、 公知の種々の方 法を採用できる。 例えば、 コア粒子が不飽和モノマー由来のポリマー粒子の場合 は、 ポリマー重合時に有機化合物 Aと結合可能な官能基を有する不飽和モノマー を共重合させて粒子を製造する方法等が挙げられる。
より具体的には、 例えば、 コアとなる粒子が金属類または酸化ケィ素、 水酸化 アルミニウム、 水酸化マグネシウムなどの無機粒子の場合は、 粒子の表面を有機 化合物 Aと結合可能な官能基を有するシランカツプリング剤で表面処理してコア 粒子とする方法等が挙げられる。
また、 例えば、 コアとなる粒子が有機—無機材料からなる複合粒子 （磁性体を 含有するポリマー粒子等） の場合にも、 有機一無機材料の成分量に応じて上記し た方法を複合することにより、 コァ粒子を作製することが可能である。
本発明の素子及びその支持体となるコア粒子は、 素子の用途に応じて異形でも 球形でも特に差し支えはないが、 近年、 医療用の素子は精度の高いものが望まれ ており、 表面積が均一な粒子が望まれていることから、 粒子径が揃った粒子や形 状が球状又は略球状の粒子であることが好ましい。
( 2 ) 有機化合物 A
有機化合物 Aは、 コア粒子に結合可能な少なくとも一の官能基 A 1 と、 生物学 的活性物質に化学結合可能な一の官能基 A 2を有し、 かつ、 2又はそれ以上の親 水性基を有する化合物である。 コア粒子に結合可能な官能基 A 1と、 生物学的活 性物質に結合可能な官能基 A 2は同一であってもよく、 異なっていてもよい。 前記官能基 A 1及び A 2としては、 例えばカルポジィミ ド基、 エステル基、 力 ーポネート基、 エポキシ基、 及びォキサゾリン基等が挙げられる。
前記親水性基としては、 水に膨潤するか、 溶解するような官能基であればよい が、 具体的には水酸基、 力ルポキシル基、 エチレンオキサイド基、 プロピレンォ キサイド基、 リン酸基、 スルホン酸基、 窒素を含むヘテロ環の親水性官能基等が 挙げられる。 親水性基は、 有機化合物 Aの分子内に 2以上、 好ましくは 8以上、 より好ましくは 1 2以上、 含まれていることが好ましい。 また、 親水性基の上限 としては、 通常 6 0以下、 好ましくは 6 0以下、 より好ましくは 4 0以下である ことが好ましい。 尚、 前記親水性基は、 それを有する有機化合物 Aが水溶性とな るようなものであることが好ましい。
上記官能基の中ではカルポジイミ ド基、 特に水溶性のカルポジイミ ド化合物が 好ましい。 以下、 カルポジイミ ド基を有する有機化合物 Aについて例示する。 力 ルポジイミド基を有する有機化合物 Aは、 好ましくは下記式で表される化合物で める。
Figure imgf000008_0001
( A X、 A yは、 独立して親水性を示す官能基を有するセグメントを示し、 同一で あってもよく、 異なっていても良い。 Rは独立して 2価以上の有機基を示し、 X は独立してカルポジイミ ド基、 エポキシ基又はォキサゾリン基を示し、 nは 2〜 8 0、 好ましくは 2〜4 0の整数を示す。 ）
上記 2価以上の有機基としては、 炭化水素基や窒素原子又は酸素原子を含む有 機基等が挙げられるが、 好ましくは 2価の炭化水素基であり、 C 1〜C 1 2のアル キレン基、 C 3〜C 10のシクロアルキレン基、 環状及び非環状構造を有する C 4〜 CI 6のアルキレン基、 2価の C 6〜（ 16の芳香環及び芳香環を含む C 7〜C18の アルキレン基等が挙げられる。
上記式 （ I ) で表されるカルポジイミ ド基を有する有機化合物 A (以下、 単に 「カルポジイミド化合物」 ということがある） としては、 例えば、 特開昭 51— 6 1 599号公報に開示されている方法や、 L. M. Alberinoらの方法 (J. Appl. Polym. Sci. , 21, 190 (1990)) 或いは特開平 2 - 2923 1 6号公報に開示さ れている方法等によって製造することができるポリカルボジィミ ドを挙げること ができる。 即ち、 有機ポリイソシァネー卜化合物からイソシァネ一卜のカルポジ ィミ ド化を促進する触媒の存在下に製造することができるものである。
ポリカルポジィミ ドの製造に用いる上記有機ポリイソシァネ一ト化合物として は、 例えば、 4， 4'ージシクロへキシルメタンジイソシァネート、 m—テトラ メチルキシリレンジイソシァネート、 2, 4—トリレンジイソシァネ一ト、 2, 6—トリレンジィソシァネー卜、 2, 4—トリレンジイソシァネートと 2 , 6一 トリレンジイソシァネートの混合物、 粗トリレンジイソシァネート、 粗メチレン ジフエニルジイソシァネート、 4, 4'， 4' ' _トリフエニルメチレントリイソ シァネート、 キシレンジイソシァネート、 へキサメチレン一 1， 6—ジイソシァ ネート、 リジンジイソシァネート、 水添メチレンジフエニルジイソシァネート、 m—フエニルジイソシァネート、 ナフチレン一 1 , 5—ジイソシァネート、 4, 4 'ービフエ二レンジイソシァネート、 4， 4 '—ジフエニルメタンジイソシァネ ート、 3， 3'—ジメ トキシ一 4， 4'—ビフエニルジイソシァネート、 3, 3 ' ージメチルジフエニルメタン一 4， 4'—ジイソシァネート、 イソホロンジイソ シァネ一トゃこれらの任意の混合物を挙げることができる。
上記ポリイソシァネート化合物又はそれらの混合物のイソシァネート基をカル ポジイミド化することによって重縮合が起こる。 この反応は、 通常、 イソシァネ 一トをカルポジィミド化触媒の存在下で加熱することことによって行われる。 そ の際、 適当な段階でイソシァネート基と反応性を有する官能基、 例えば水酸基、 1級又は 2級ァミノ基、 力ルポキシル基、 チオール基等を有し、 かつ分子中に親 水性官能基を有する化合物を末端封止剤として投入し、 カルポジイミ ド化合物の 末端を封止することにより、 分子量 （重合度） を調整することができる。 また、 重合度は、 ポリイソシァネート化合物等の濃度や反応時間によっても調整するこ とができる。
上記有機イソシァネートのカルポジイミ ド化を促進する触媒としては、 種々の ものを例示することができるが、 1一フエ二ルー 2一ホスホレン一 1ーォキシド、 3ーメチルー 1 一フエ二ルー 2一ホスホレン一 1—ォキシド、 1ーェチルー 2一 ホスホレン— 1—ォキシドゃこれらの 3一ホスホレン異性体などが収率その他の 面で好適である。
前記の化学式 （ I ) で示されるカルポジイミド化合物は、 平均分子量が、 通常 2 0 0〜： 1 0 0 , 0 0 0であり、 好ましくは、 5 0 0〜 5 0 , 0 0 0である。 前記したように、 本発明に係るカルポジイミ ド化合物を製造するには、 先ず、 上記のィソシァネートをカルポジィミ ド化触媒の存在下で加熱することにより製 造する。 その場合には、 無溶媒下で合成を行なってもよいし、 溶媒下で行っても よい。 また、 反応途中で溶媒を添加してもよい。 その場合は使用用途に応じて適 宜選択すればよい。
その具体的な溶媒としては、 代表的なものを例示すると、 アセトン、 メチルェ チルケトン、 メチルイソプチルケトン、 シクロへキサノン等のケトン類；酢酸ェ チル、 酢酸プチル、 プロピオン酸ェチル、 セロソルブアセテート等のエステル類 ；ペンタン、 2—メチルブタン、 n—へキサン、 シクロへキサン、 2ーメチルぺ ンタン、 2 , 2—ジメチルブタン、 2 , 3—ジメチルブタン、 ヘプタン、 η—ォ クタン、 イソオクタン、 2， 2， 3—トリメチルペンタン、 デカン、 ノナン、 シ クロペンタン、 メチルシクロペンタン、 メチルシクロへキサン、 ェチルシクロへ キサン、 p—メンタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ェチルベンゼン等の脂 肪族又は芳香族炭化水素類； 四塩化炭素、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 テトラブロムェタン等のハロゲン化炭化水素類； 工チルエーテル、 ジメチルエー テル、 トリォキサン、 テトラヒドロフラン等のエーテル類； メチラール、 ジェチ ルァセタール等のァセタール類； ニトロプロペン、 二トロベンゼン、 ピリジン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等の硫黄、 窒素含有有機化合物類 等が挙げられる。 合成時にイソシァネート基及びカルポジイミ ド基に支障を与え ないものであれば特に制限されることはなく、 重合方法の用途に合った溶媒を適 宜選択すればよい。 また、 これらは単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用 してもよい。
さらに、 合成終了後、 カルボジィミド樹脂末端を、 次に記述する水性化セグメ ント等で封止していれば、 稀釈剤として上記溶媒のほか、 水、 メタノール、 エタ ノール、 1 一プロパノール、 2—プロパノール、 1ーブ夕ノール、 2—ブタノ一 ル、 イソブチルアルコール、 t e r t 一ブチルアルコール、 1 一ペンタノ一ル、 2一ペン夕ノール、 3—ペン夕ノール、 2—メチルー 1—ブタノ一ル、 イソペン チルアルコール、 t e r t—ペンチルアルコール、 1一へキサノール、 2—メチ ルー 1一ペン夕ノール、 4ーメチルー 2—ペン夕ノール、 2ーェチルブ夕ノール、 1 一ヘプ夕ノール、 2—ヘプ夕ノール、 3一ヘプ夕ノール、 2—ォクタノール、 2ーェチルー 1一へキサノール、 ベンジルアルコール、 シクロへキサノール等の アルコール類； メチルセ口ソルブ、 ェチルセ口ソルブ、 ィソプロピルセロソルブ、 ブチルセ口ソルブ、 ジエチレンダリコールモノブチルェ一テル等のエーテルアル コール類等も使用可能である。 これらは単独で使用してもよいし、 2種類以上を 併用してもよい。 但し、 稀釈の際はカルポジイミ ド基の反応性が高いため、 比較 的低温であることが好ましい。
これらのカルポジィミ ド化合物のような有機化合物 Aの分子量又は組成、 ある いは親水性となるセグメントを変更することによって、 母粒子の分散性を自由に 調整することができ、 素子自身の凝集度や分散度を自由にコントロールすること が可能である。
親水性となるセグメント （上記式中、 A x、 A y ) としては、 例えば親水基を有 する水溶化可能なセグメントであれば何でも良いが、 好ましくは、 ヒドロキシェ タンスルホン酸ナトリゥムゃヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリゥム等の反応 性ヒドロキシル基を少なくとも一つ有するアルキルスルホン酸塩の残基、 2—ジ メチルアミノエ夕ノール、 2ージェチルアミノエタノール、 3—ジメチルァミノ 一 1—プロパノール、 3ージェチルアミノ一 1 一プロパノール、 3—ジェチルァ ミノ一 2—プロパノール、 5ージェチルアミノー 2—プロパノールや、 2— （ジ 一 n—プチルァミノ） エタノール等のジアルキルァミノアルコールの残基の四級 塩、 3—ジメチルアミノー n—プロピルァミン、 3—ジェチルアミノー n—プロ ピルァミン、 2 (ジェチルァミノ） ェチルァミン等のジアルキルアミノアルキル ァミンの残基の四級塩、 ポリ （エチレンオキサイド） モノメチルエーテル、 ポリ (エチレンォキサイ ド) モノェチルエーテル、 ポリ (エチレンォキサイ ド · プロ ピレンオキサイ ド） モノメチルエーテル、 ボリ （エチレンオキサイド · プロピレ ンォキサイド） モノェチルエーテル等の反応性ヒドロキシル基を少なくとも 1つ 有するポリ (アルキレンォキサイ ド) の残基が挙げられる。 尚、 これらの親水性 となるセグメント （A x、 A y) は単独でも良いし、 二種以上併用しても良いし、 共重合させた混合化合物として使用しても差し支えない。
特に、 医療用の検査、 診断又は治療用の素子は、 水を含めた水溶性の媒体を使 用することが多いため、 母粒子の分散性が素子の精度に大きく左右する。
尚、 母粒子の製造に際し、 上記有機化合物 Aは単独でもよいし、 二種以上併用 してもよいし、 共重合させた混合化合物として使用しても差し支えない。
( 3 ) 母粒子
母粒子は、 前記コア粒子に、 有機化合物 Aが化学結合により結合したものであ る。 本発明において、 「化学結合」 とは、 共有結合、 配位結合、 イオン結合等の 結合を意味する。
母粒子の作製方法としては、 例えば、 有機化合物 Aと反応し得る官能基を有す る化合物 Bを含有するコア粒子を作製し、 コア粒子が溶解せず、 かつ、 有機化合 物 Aが溶解する溶媒下で、 有機化合物 Aを.添加し、 化学的に反応させることによ つて、 粒子の形状を変形させることなく母粒子を得ることができる。 この場合、 母粒子は、 コア粒子と有機化合物 Aとが化学的に結合していないと、 後の工程に おいて不純物または不用物が溶液中に溶融又は析出したり、 粒子が凝集してしま う場合が多くなり、 結果的に得られる素子は、 検査、 診断又は治療用素子として 必要な高い精度が保てなくなつてしまう。
以下、 コア粒子と有機化合物 Aが結合した母粒子の作製法を、 コア粒子として ポリマ一粒子を用いた場合を一例として、 説明する。
コア粒子となり得るポリマー粒子としては、 例えば、 スチレン系重合体、 (メ タ） アクリル系重合体、 他のビニル系重合体の付加重合による共重合体、 水素移 動重合による重合体、 ポリ縮合による重合体、 付加縮合による重合体などが挙げ られる。
その主成分となる共重合可能な原料単量体としては、 代表的なものを例示する と、 ( i ) スチレン、 0ーメチルスチレン、 m—メチルスチレン、 p —メチルス チレン、 α—メチルスチレン、 ρ—ェチルスチレン、 2、 4—ジメチルスチレン、 ρ— η—ブチルスチレン、 - t e r tーブチルスチレン、 ρ _ η _へキシルス チレン、 ρ— η—ォクチルスチレン、 ρ - ηーノニルスチレン、 ρ― η —デシル スチレン、 ρ — η —ドデシルスチレン、 ρ —メ トキシスチレン、 ρ —フエニルス チレン、 ρ—クロルスチレン、 3、 4—ジク口ルスチレンなどのスチレン類、 ( i i ) アクリル酸メチル、 アクリル酸エヂル、 アクリル酸 n—ブチル、 ァクリ ル酸イソプチル、 アクリル酸プロピル、 アクリル酸へキシル、 アクリル酸 2—ェ チルへキシル、 アクリル酸 n—才クチル、 アクリル酸ドデシル、 アクリル酸ラウ リル、 アクリル酸ステアリル、 アクリル酸 2—クロルェチルアクリル酸フエニル、 ひ一クロルアクリル酸メチル、 メタクリル酸メチル、 メタクリル酸ェチル、 メタ クリル酸 n _プチル、 メタクリル酸イソプチル、 メタクリル酸プロピル、 メタク リル酸へキシル、 メ夕クリル酸 2—ェチルへキシル、 メタクリル酸 n—ォクチル、 メタクリル酸ドデシル、 メタクリル酸ラウリル、 メタクリル酸ステアリルのよう な （メタ） アクリル酸エステル類、 （ i i i ) 酢酸ビニル、 プロピオン酸ビニル、 安息香酸ビニル、 酪酸ビニルなどのビニルエステル類、 U V ) ァクリロ二トリ ル、 メタクリロニトリルなどの （メタ） アクリル酸誘導体、 （V ) ビニルメチル エーテル、 ビニルェチルエーテル、 ビニルイソブチルエーテルなどのビニルェ一 テル類、 （v i ) ピニルメチルケトン、 ビニルへキシルケトン、 メチルイソプロ ベニルケトンなどのビニルケトン類、 （v i i ) N—ビニルビロール、 N—ビニ ルカルバゾール、 N—ピニルインドール、 N—ビニルピロリ ドンなどの N—ビニ ル化合物、 （v i i i ) ふつ化ビニル、 ふつ化ビニリデン、 テトラフルォロエヂ レン、 へキサフルォロプロピレン、 又はアクリル酸トリフルォロェチル、 ァクリ ル酸テトラフルォロプロビレルなどのフッ素アルキル基を有する （メタ） ァクリ ル酸エステル類等が挙げられる。 これらは単独で使用してもよいし、 また、 2種 類以上を併用してもよい。
本発明に係る母粒子中のコア粒子は、 表層部、 又は内部及び表層部には、 有機 化合物 Aと結合可能な官能基 B 1を有する化合物 Bを含有すればよい。 前記官能 基 B 1としては、 例えば、 炭素一炭素不飽和結合 （二重結合、 三重結合） を有す る基、 , j8—不飽和カルボ二ル基、 エポキシ基、 イソシァネート基、 カルボキ シル基、 水酸基、 アミド基、 チオール基、 シァノ基、 アミノ基、 クロロメチル基、 グリシジルエーテル基、 エステル基、 ホルミル基、 二トリル基、 ニトロノ基、 力 ルポジィミ ド基、 ォキサゾリン基等を有する化合物が挙げられる。 これらは単独 でもよいし、 2種以上併用してもよい。 好ましくは、 カルボキシル基、 水酸基、 1級又は 2級ァミノ基、 チオール基がよい。
更に、 化合物 Bとして具体的には、 カルボキシル基を有するラジカル重合性単 量体及び化合物が挙げられる。 代表的なものを例示すると、 アクリル酸、 メタク リル酸、 クロトン酸、 ィタコン酸、 マレイン酸、 フマル酸、 ィタコン酸モノプチ ル、 マレイン酸モノブチルなど各種の不飽和モノないしジカルボン酸類又は不飽 和二塩基酸類等が挙げられ、 これらは、 単独で使用してもよいし、 2種類以上を 併用してもよい。
また、 化合物 Bとして水酸基を有するラジカル重合性単量体及び化合物が挙げ られる。 代表的なものを例示すると、 2—ヒドロキシェチル (メタ) ァクリレー ト、 2—ヒドロキシプロピル （メタ） ァクリレート、 3—ヒドロキシプロピル
(メタ） ァクリレート、 4—ヒドロキシブチル (メタ) ァクリレート等の (メタ) アクリル系単量体、 ポリエチレングリコールモノ （メタ） ァクリレート、 ポリプ ロピレンダリコールモノ (メタ) ァクリレート等のポリアルキレンダリコール
(メタ） アクリル系化合物類、 ヒドロキシェチルビニルエーテル、 ヒドロキシブ チルビニルエーテル等の各種ヒドロキシアルキルビニルエーテル類、 ァリルアル コール、 2—ヒドロキシェチルァリルエーテル等の各種ァリル化合物等が挙げら れ、 これらは、 単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
さらに、 化合物 Bとして水酸基を有するポリマーが挙げられる。 代表的なもの を例示すると、 ポリビニルアルコール ( P V A ) 等の完全けん化、 および部分け ん化樹脂、 酢酸ビニルとその他のピニル単量体との共重合体とからなる酢酸エス テル含有ポリマーのけん化樹脂等の水酸基含有熱可塑性樹脂が挙げられ、 これら は、 単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。 また、 化合物 Bとして、 アミノ基を有するラジカル重合性単量体及び化合物が 挙げられる。 具体的に代表的なものを例示すると、 アクリル酸アミノエチル、 ァ クリル酸一 N—プロピルアミノエチル、 メタクリル酸ー N—ェチルァミノプロピ ル、 メタクリル酸一 N—フエニルアミノエチル、 メタクリル酸一 N—シクロへキ シルアミノエチル等のァクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステル系誘導 体； ァリルァミン、 N—メチルァリルァミン等のァリルアミン系誘導体； P—ァ ミノスチレン等のスチレン系誘導体； 2—ビニル— 4， 6—ジアミノー S —トリ ァジン等のトリァジン誘導体等が挙げられ、 好ましくは一級もしくは二級のァミ ノ基を有する化合物である。 これらは、 単独で使用してもよいし、 2種類以上を 併用してもよい。
さらに、 化合物 Bとしてチオール （メルカプト） 基を有するラジカル重合性単 量体又は化合物が挙げられる。 具体的に代表的なものを例示すると、 2—プロべ ンー 1ーチオール、 3ーブテン一 1ーチオール、 4一ペンテン一 1ーチオール、
(メタ) ァクリル酸 2—メルカプトェチル、 (メタ) アクリル酸 2—メルカプト 一 1一力ルポキシェチル、 N— （2—メルカプトェチル） アクリルアミド、 N—
( 2—メルカプ卜ー 1 一カルボキシェチル) アクリルアミド、 N— ( 2—メルカ プトェチル） メタクリルアミ ド、 N— ( 4一メルカプトフエニル) アクリルアミ ド、 N— ( 7 —メルカプトナフチル） アクリルアミド、 マイレン酸モノ 2 —メル カプトェチルアミ ド等の不飽和二重結合を有するメルカプト （チオール） 基含有 単量体又は化合物等が挙げられる.が、 これらは、 単独で使用してもよいし、 2種 類以上を併用してもよい。 また、 チオール （メルカプト） 基を有するポリビニル アルコール変性体等のチオール （メルカプト） 基を含有した熱可塑性樹脂等も挙 げられる。
また、 コア粒子を形成する共重合体に、 力ルポキシル基、 水酸基、 アミノ基又 はチオール （メルカプト） 基などの複合基を導入したい場合は、 前記した各種の 反応基を含有する単量体を複数併用することによって、 多官能共重合体にすれば よい。
上記官能基量と有機化合物 Aの添加量や反応温度や条件を調整することで、 コ ァ粒子と有機化合物 Aを反応させたときに、 多官能を有する母粒子ができる。 —方、 コア粒子の作製において、 ラジカル重合性単量体を重合させる際に使用 する重合開始剤としては、 公知のラジカル重合開始剤を使用できる。 具体的に代 表的なものを例示すると、 過酸化べンゾィル、 クメンハイ ド口パーオキサイ ド、 t 一プチルハイ ドロパーォキサイ ド、 過硫酸ナ卜リゥム、 過硫酸アンモニゥム等 の過酸化物、 ァゾビスイソプチロニトリル、 ァゾビスメチルプチロニトリル、 7 ゾビスイソパレロニトリル等のァゾ系化合物等が挙げられる。 これらは単独で使 用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
また、 コア粒子を作製する場合、 前記したような様々な合成方法、 重合方法が 用いられるが、 塊状重合等のように無溶媒化での合成はもちろん、 溶液重合等の ような溶媒下での合成を挙げることができる。 その具体的な重合溶媒として代表 的なものを例示すると、 水、 メタノール、 エタノール、 1—プロパノール、 2— プロパノール、 1—ブタノール、 2—プタノ一ル、 イソブチルアルコール、 t e r t -ブチルアルコール、 1 一ペンタノ一ル、 2一ペン夕ノール、 3—ペンタノ —ル、 2—メチル— 1—ブタノ一ル、 イソペンチルアルコール、 t e r t —ペン チルアルコール、 1一へキサノール、 2ーメチルー 1 一ペンタノ一ル、 4ーメチ ルー 2—ペンタノ一ル、 2ーェチルブタノール、 1 一ヘプ夕ノ一ル、 2 一ヘプ夕 ノール、 3—ヘプ夕ノール、 2—ォクタノール、 2—ェチルー 1 _へキサノール、 ベンジルアルコール、 シクロへキサノール等のアルコール類； メチルセ口ソルブ、 ェチルセ口ソルブ、 イソプロピルセロソルブ、 ブチルセ口ソルブ、 ジエチレンブ リコールモノブチルエーテル等のェ一テルアルコール類； アセトン、 メチルェチ ルケトン、 メチルイソプチルケトン、 シクロへキサノン等のケトン類；酢酸ェチ ル、 酢酸プチル、 プロピオン酸ェチル、 セロソルブアセテート等のエステル類； ペンタン、 2—メチルブタン、 n—へキサン、 シクロへキサン、 2—メチルペン タン、 2， 2ージメチルブタン、 2， 3 一ジメチルブタン、 ヘプタン、 n—ォク タン、 イソオクタン、 2 , 2 , 3 —トリメチルペン夕ン、 デカン、 ノナン、 シク 口ペンタン、 メチルシクロペンタン、 メチルシクロへキサン、 ェチルシクロへキ サン、 p—メンタン、 ジシクロへキシル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ェチ ルベンゼン等の脂肪族又は芳香族炭化水素類； 四塩化炭素、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 テトラブロムェ夕ン等のハロゲン化炭化水素類；ェチルエーテ ル、 ジメチルエーテル、 トリオキサン、 テトラヒドロフラン等のエーテル類； メ チラール、 ジェチルァセタール等のァセタール類； ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸等 の脂肪酸類； ニトロプロペン、 ニトロベンゼン、 ジメチルァミン、 モノエタノー ルアミン.. ピリジン、 ジメチルホルムアミ ド.. ジメチルスルホキシド、, ァセトニ トリル等の硫黄、 窒素含有有機化合物類等が挙げられる'。 重合溶媒は、 特に制限 されることはなく、 重合方法の用途に合った溶媒を、 適宜選択すればよい。 また、 これらは単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
さらに、 コア粒子の作製においては、 使用可能な重合方法に応じて、 分散剤、 安定剤、 乳化剤 （又は界面活性剤） 、 酸化防止剤又は触媒 （又は反応促進剤） 等 を適宜選択し使用してもよい。
それらについて、 具体的に代表的なものを例示すると、 分散剤及び安定剤とし ては、 ボリヒドロキシスチレン、 ポリスチレンスルホン酸、 ビニルフエノールー (メタ） アクリル酸エステル共重合体、 スチレン一 （メタ） アクリル酸エステル 共重合体、 スチレン一ビニルフエノールー （メタ） アクリル酸エステル共重合体 等のポリスチレン誘導体； ポリ （メタ） アクリル酸、 ポリ （メタ） アクリルアミ ド、 ポリアクリロニトリル、 ポリェチル （メタ） ァクリレート、 ポリブチル （メ 夕） ァクリレート等のポリ （メタ） アクリル酸誘導体； ポリメチルビ二ルェ一テ ル、 ポリェチルビニルエーテル、 ポリプチルビニルエーテル、 ポリイソブチルビ ニルエーテル等のポリビニルアルキルェ一テル誘導体；セルロース、 メチルセル ロース、 酢酸セル口一ス、 硝酸セルロース、 ヒドロキシメチルセルロース、 ヒド ロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 カルボキシメチルセ ルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、 ポリビニルブチラール、 ポリビニルホルマール、 ポリ酢酸ビニル等のポリ酢酸ビニル誘導体； ポリビニル ピリジン、 ポリビニルピロリ ドン、 ポリエチレンィミン、 ポリ一 2—メチル一 2 一ォキサゾリン等の含窒素ポリマー誘導体； ポリ塩化ビエル、 ポリ塩化ビニリデ ン等のボリハロゲン化ビニル誘導体； ポリジメチルシロキサン等のポリシロキサ ン誘導体等の各種疎水性又は親水性の分散剤、 安定剤が挙げられる。 これらは単 独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
また、 乳化剤 （界面活性剤） としては、 ラウリル硫酸ナトリウムなどのアルキ ル硫酸エステル塩、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナ卜リゥムなどのアルキルベン ゼンスルホン酸塩、 アルキルナフタレンスルホン酸塩、 脂肪酸塩、 アルキルリン 酸塩、 アルキルスルホコハク酸塩等のァニオン系乳化剤 ； アルキルアミン塩、 第 四級アンモニゥム塩、 アルキルべタイン、 ァミンオキサイド等のカチオン系乳化 ル、 ボリォキシエチレンアルキルァリルエーテル、 ポリォキシエチレンアルキル フエニルエーテル、 ソルピタン脂肪酸エステル、 グリセリン脂肪酸エステル、 ポ リオキシエチレン脂肪酸エステル等のノニオン系乳化剤等が挙げられる。 これら は単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
また、 コア粒子の作製においては、 使用する用途に応じて少量の架橋剤を使用 しても、 特に差し支えない。 具体的に代表的なものを例示すると、 ジビニルペン ゼン、 ジビニルナフタレン等の芳香族ジビニル化合物； エチレンダリコールジァ クリレート、 エチレンダリコールジメタクリレー卜、 トリエチレングリコールジ メタクリレート、 テトラエチレングリコ一ルジメタクリレート、 1 , 3—ブチレ ングリコールジメタクリレート、 トリメチロールプロパントリァクリレート、 ト リメチロールプロパントリメタクリレート、 1 , 4一ブタンジオールジァクリレ —ト、 ネオペンチルグリコ一ルジァクリレート、 1 , 6—へキサンジオールジァ クリレー卜、 ペン夕エリスリ トールトリァクリレー卜、 ペンタエリスリ トールテ トラァクリレート、 ペン夕エリスリ トールジメタクリレート、 ペン夕エリスリ 卜 —ルテトラメタクリレート、 グリセロールァクロキシジメタクリレート、 N， N 一ジビニルァニリン、 ジビニルエーテル、 ジビニルスルフイ ド、 ジビニルスルフ オン等の化合物が挙げられる。 これらは単独で使用してもよいし、 2種類以上を 併用してもよい
コア粒子が有機物を含有する熱可塑性の粒子の場合は、 粒子の表面 （表層部） のみ、 又は内部と表層部を、 架橋させてもよい。
また、 酸化防止剤としては、 フエノール系酸化防止剤、 硫黄系酸化防止剤、 燐 系酸化防止剤、 アミン系酸化防止剤、 ヒドロキノン系酸化防止剤、 ヒドロキシル アミン系酸化防止剤等が挙げられる。
また、 触媒 （反応促進剤） としては、 反応を促進させる触媒であれば、 特に限 定されず、 公知のものを使用すればよく、 粒子物性に悪影響を及ぼさない範囲で 適宜選択して、 適量を添加すればよい。 例えば、 コア粒子の官能基と有機化合物 Aの官能基の少なくともどちらかにエポキシ基が含有されている場合は、 具体的 には、 ベンジルジメチルアミン、 トリェチルァミン、 卜リブチルアミン、 ピリジ ン、 トリフエニルァミン等の三級アミン類； トリェチルベンジルアンモニゥムク 口ライ ド、 テトラメチルアンモニゥムクロライド等の第四級アンモニゥム化合物 類； 卜リフエニルホスフィン、 トリシクロホスフィン等のホスフィン類； ベンジ ルトリメチルホスホニゥムクロライ ド、 等のホスホニゥム化合物類； 2—メチル ィミダゾ一ル、 2ーメチルー 4ーェチルイミダゾール等のィミダゾール化合物類 ；水酸化カリウム、 水酸化ナトリウム、 水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化 物類；炭酸ナトリゥム、 炭酸リチウム等のアル力リ金属炭酸塩類；有機酸のアル カリ金属塩類；三塩化硼素、 三弗化硼素、 四塩化錫、 四塩化チタン等のルイス酸 性を示すハロゲン化物類またはその錯塩類等の触媒を添加することが可能である。 これらは単独で使用してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
上記のコア粒子が有機含有粒子であれば、 その重量平均分子量は、 1 0 0 0〜 3， 0 0 0 , 0 0 0程度であり、 コア粒子が球状粒子であれば、 3 0 0 0〜 1 , 0 0 0 , 0 0 0程度程度である。
母粒子を作製するために用いる、 有機化合物 Aが反応可能な官能基を有するコ ァ粒子は、 コア粒子がポリマー微粒子であれば、 官能基の含有量は当量で 3 0〜 2 0 0 0を満たすものがよく、 好ましくは当量で 5 0〜 1 0 0 0、 さらに好まし くは 8 0〜 9 0 0を満たすものがよく、 特に好ましくは 1 0 0 ~ 5 0 0である。 当量が 2 0 0 0超であると、 官能基が少なすぎるためにコア粒子との結合にかな り時間を要するので、 好ましくない場合がある。 一方、 3 0未満であると、 結合 密度が上がりすぎて母粒子の表面及び表層部に生物学的活性物質に結合可能な官 能基を残存させることができない場合がある。 但し、 時間的余裕や極少量の官能 基が必要な場合は、 その限りでない。 すなわち、 2 0 0 0超 Z官能基又は 3 0未 満 /官能基でもよい。
またコア粒子が無機粒子や有機一無機複合粒子等からなる場合も同様である。 尚、 前記 「当量」 とは、 化学反応における物質の量的関係に基づいて化合物ご とに割り当てた一定量を示すものであり、 例えば本発明におけるコア粒子では、 有機化合物 Aと反応可能な官能基 1 m 0 1当たりのコァ粒子の化学式量を表す。 母粒子を作製するために、 必要な有機化合物 Aの官能基の含有量は、 当量で 5 0〜 1， 5 0 0であり、 好ましくは 8 0〜 1， 0 0 0、 更に好ましくは 1 0 0〜 8 0 0、 特に好ましくは 2 0 0〜 7 0 0である。 有機化合物 Aの官能基当量が 1 , 5 0 0超であると、 官能基が少なすぎるためにコア粒子との結合にかなり時間を 要するので、 好ましくない場合がある。 一方、 5 0未満であると、 生物学的活性 物質に結合可能な官能基を多く残存させることになり、 悪影響を及ぼす場合があ る。 但し、 時間的余裕や極少量の官能基が必要な場合は、 その限りでない。 す なわち、 1 , 5 0 0超/官能基でもよい。
母粒子の作製において、 コア粒子への有機化合物 Aの添加量は、 硬化又は結合 後の必要な有機化合物の残量に左右されるが、 コア粒子の官能基に対して、 当量 比で 0 . 1〜 2 0を目安に添加すれば良く、 好ましくは 0 . 5〜8、 更に好まし くは 1〜5がよい。 尚、 コアとなる粒子が有機一無機複合粒子や無機粒子から形 成されるコア粒子の場合でも同様である。 また、 有機化合物 Aの添加量は、 当量 比で 2 0超であってもよいが、 媒体中の残存有機化合物が多くなるのでコスト的 にも好ましくない。 また、 添加量が、 当量比で 0 . 1未満であると、 生物学的活 性物質に結合可能な官能基を残せなくなる場合がある。 但し、 時間的余裕ゃ極少 量の官能基が必要な場合は、 その限りでない。
また、 母粒子の平均粒子径は 0 . 0 1〜 1 0 0 mが良く、 好ましくは 0 . 0 5〜 5 0 m、 更に好ましくは 0 . 0 8〜3 0 m、 特に好ましくは 0 . 1〜 1 0 mがよい。 平均粒子径が 1 0 0 超であると、 粒子の沈殿速度が速くなり、 生物、 医療用の素子としては好ましくない。 一方、 平均粒子径が 0 . 0 1 未 満であると、 粒子径が小さすぎるために凝集度が大きくなり、 単分散化した粒子 が得られない場合がある。 尚、 母粒子の 8 0 %以上、 好ましくは 9 0 %以上、 よ り好ましくは 9 5 %以上が、 上記範囲に含まれることが好ましい。
母粒子を得るために、 反応させる反応温度は、 溶媒の種類に左右されるが、 1 0〜2 0 0 °Cの範囲が良く、 好ましくは 1 5〜 1 5 0 °C、 更に好ましくは 2 0〜 1 3 0 °Cの範囲がよい。 また、 反応に要する時間は、 コア粒子と有機化合物 Aの官能基同士の結合反応 がほぼ完結するのに要する時間であればよく、 使用する有機化合物及び添加量、 粒子内官能基の種類、 溶液の粘度、 及び濃度等に大きく左右されるが、 例えば 5 0 °〇で 1〜2 4時間、 好ましくは 2〜 1 5時間程度である。 尚、 前記要因を変更 し、 反応時間を長くした （2 4時間超） 場合においても、 母粒子は得られるが、 製造方法上、 時間を要すことは好ましくないことがある。 好適な反応時間は、 予 備実験において、 種々の反応時間で反応を行うことによって、 容易に決定するこ とができる。
コア粒子が溶解せず、 有機化合物 Aが溶解する溶媒は、 水又は有機溶媒から選 ばれる少なくとも一種の溶媒であり、 使用する有機化合物及び添加量、 母粒子の 成分となる樹脂の種類及び含有する官能基の種類、 使用用途等を考慮して、 適宜 選択すればよい。
その具体的な溶媒としては、 水、 メタノール、 ェタノ一ル、 1—プロパノール、 2—プロパノール、 1ーブタノール、 2ーブ夕ノール、 ィソブチルアルコール、 t e r t—ブチルアルコール、 1 一ペンタノール、 2 —ペンタノ一ル、 3 —ペン 夕ノール、 2—メチルー 1ーブ夕ノール、 ィソペンチルアルコール、 t e r t— ペンチルアルコール、 1—へキサノール、 2—メチルー 1 一ペン夕ノール、 4一 メチルー 2—ペンタノ一ル、 2—ェチルプタノ一ル、 1 一ヘプタノ一ル、 2 _へ プタノ一ル、 3 —ヘプ夕ノール、 2—ォクタノール、 2—ェチルー 1 _へキサノ ール、 ベンジルアルコール、 シクロへキサノール等のアルコール類； メチルセ口 ソルブ、 ェチルセ口ソルブ、 イソプロピルセロソルブ、 ブチルセ口ソルブ、 ジェ チレンプリコールモノブチルエーテル等のェ一テルアルコール類； アセトン、 メ チルェチルケトン、 メチルイソプチルケトン、 シクロへキサノン等のケトン類； 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 プロピオン酸ェチル、 セロソルブアセテート等のエス テル類； ペンタン、 2 一メチルブタン、 n—へキサン、 シクロへキサン、 2—メ チルペンタン、 2， 2 一ジメチルプ夕ン、 2 , 3—ジメチルブタン、 ヘプタン、 n—オクタン、 イソオクタン、 2， 2， 3 —トリメチルペンタン、 デカン、 ノナ ン、 シクロペンタン、 メチルシクロペン夕ン、 メチルシクロへキサン、 ェチルシ クロへキサン、 p—メンタン、 ジシクロへキシル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレ ン、 ェチルベンゼン等の脂肪族又は芳香族炭化水素類； 四塩化炭素、 トリクロ口 エチレン、 クロ口ベンゼン、 テトラブロムェタン等のハロゲン化炭化水素類； ェ チルエーテル、 ジメチルエーテル、 トリオキサン、 テトラヒドロフラン等のエー テル類； メチラール、 ジェチルァセタール等のァセ夕一ル類； ギ酸、 酢酸、 プロ ピオン酸等の脂肪酸類； 二トロプロペン、 二トロベンゼン、 ジメチルァミン、 モ ノエ夕ノールァミン、 ピリジン、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシド、 ァセトニトリル等の硫黄、 窒素含有有機化合物類等が挙げられる。 好ましくは、 水、 メタノールやエタノールなどの低級アルコール、 メチルセ口ソルブ、 ェチル セロソルブなどのエーテルアルコール、 水と低級アルコールの混合物、 水とェ一 テルアルコールの混合物のような水溶性及び親水性の媒体、 トルエン、 ジメチル ホルムアミ ド （D M F ) 、 テトラヒドロフラン （T H F ) 、 メチルェチルケトン (M E K) 、 メチルイソプチルケトン （M I B K) 、 アセトン、 N—メチルー 2 —ピロリ ドン （N M P ) 、 ジクロロメタン、 テトラクロ 0エチレンなどが挙げら れ、 さらに好ましくは、 水、 メタノールやエタノールなどの低級アルコール、 水 とメタノールやエタノールなどの低級アルコールとの混合物、 水とメタノールや エタノールなどの低級アルコールとの混合物、 水とエーテルアルコールとの混合 物のような水溶性及び親水性の媒体である。 これらは、 特に制限されることはな く、 使用用途に合った溶媒を、 適宜選択すればよい。 また、 これらは単独で使用 してもよいし、 2種類以上を併用してもよい。
なお、 母粒子の作製においては、 所望に応じて、 前述した分散剤、 酸化防止剤、 安定剤、 乳化剤 （界面活性剤） 、 触媒 （反応促進剤） などを適宜選択し、 添加す ることもできる。
母粒子を作製するにあたり、 コア粒子と有機化合物 Aとの反応時の溶液濃度は、 次の計算式で算出すると、 1〜 6 0重量％であり、 好ましくは 5〜4 0重量％、 更に好ましくは 1 0〜 3 0重量％である。 溶液濃度 （重量％) = [ (全溶液一溶媒） ノ全溶液] X 1 0 0 尚、 上記溶液濃度が 8 0重量％超であると、 コア粒子または有機化合物 Aの量 が過剰となり、 溶液内のバランスが崩れ、 単分散化し安定した粒子を得ることが 難しくなるため、 好ましくない。 また、 上記溶液濃度が 1重量％未満であると、 母粒子の作製は可能であるが、 目的の粒子を得るためには、 長時間に亘り合成を 行わなければならない。 しかし、 製造方法上、 時間を要することは好ましくない。 母粒子の形状は、 前述したように、 粒子径が揃っていることが好ましく、 球状 又は略球状の粒子であることが好ましい。 本発明において 「球状又は略球状」 と は、 球の投影二次元図において、 Γ 1≤長径/短径≤ 1. 2」 を満たす形状と定 義する。 長径及び短径の測定は、 例えば、 以下のようにして測定することができ る。 走査電子顕微鏡 （以後 「S EMj と称する) (例えば日立 S - 2 1 50) にて測定可能な倍率 （1 00〜 10, 000倍） で粒子の写真を撮り、 粒子 1個 に対して直径をランダムに 1 5回測定し、 長径及び短径を測定する。 これをラン ダムに繰り返し （例えば n= 1 00) 測定する。
また、 平均粒子径は、 S EMにて測定可能な倍率 （ 1 00〜 1 0， 0 0 0倍） で写真を撮り、 ランダムに測定し （例えば 500個） 、 直径の平均を平均 粒子径とすることにより、 測定することができる。
また、 コア粒子と母粒子の前記の粒子径測定結果から、 下記の式で定義される 粒子径分布 CV値 （バラツキ度） で表した場合の CV値を求め、 コア粒子及び母 粒子及び素子の各分布精度を確認することができる。
CV (%) = (粒子 [素子] 径の標準偏差/平均粒子 [素子] 径） X 1 00 また、 本発明の母粒子及び素子の分散性は、 下記式で表される CV比によって 表すことができる。 これらの CV比のうち、 C Vb比及び C V。比の少なくともい ずれかが、 0. 6〜3. 0、 好まし.くは 0. 8〜 1. 5、 より好ましくは 0. 9 〜1. 1であることが好ましい。 また、 前記 C Vb比及び C Vc比の両方が前記範 囲であることが、 より好ましい。 さらに、 C Vb比及び C Vc比に加えて、 CVa 比も前記範囲であることが特に好ましい。
C Va比 =C ViZC v2
C Vb比 =C ViZC v3
c vc比 =c v2/c v3 C (コア粒子径の標準偏差 Zコア粒子径の平均粒子径） X I 0 0 C
Figure imgf000024_0001
(母粒子径の標準偏差 Z母粒子の平均粒子径） X 1 0 0
C V 3 = (素子径の標準偏差 Z素子の平均粒子径） X 1 0 0
( 4 ) 生物学的活性物質
生物学的活性物質は、 同物質と特異的に結合する第二の生物学的活性物質を捕 捉するためのものである。 検出対象の第二の生物学的活性物質としては、 核酸、 タンパク質 (ぺプチドを含む) 、 糖等が挙げられる。 これらの中では核酸が好ま しい。 また、 本発明の素子を治療用に用いる場合は、 生物学的活性物質は、 治療 用薬剤の有効成分として機能する。
生物学的活性物質として核酸を用いる場合は、 通常の固相化核酸を用いた核酸 同士のハイブリダィゼーションに用いられる核酸と特に変わるところはなく、 ハ イブリダィゼーシヨンが可能な核酸であれば特に制限されず、 例えば、 天然又は 合成の D N A (オリゴヌクレオチドを含む） もしくは R N A (オリゴヌクレオチ ドを含む） が挙げられる。 また、 上記核酸は 1本鎖であっても、 2本鎖であって も構わない。 核酸の鎖長は、 ハイブリダィゼーシヨンが可能な長さであれば特に 制限されないが、 通常 5〜5 0 0 0 0塩基、 好ましくは 2 0〜 1 0 0 0 0塩基で ある。 また、 核酸の 5 '末端あるいは 3 '末端にチミン等、 紫外線によって反応活 性基を有する重合体を有してもよい。
以下、 生物学的活性物質として、 核酸を母粒子に結合させる方法を例示するが、 他の物質の場合も、 有機化合物 A中の、 生物学的活性物質に共有結合可能な官能 基 A 2の種類に応じて、 生物学的活性物質と官能基 Aが共有結合を形成するよう な反応が生ずるように、 適宜溶媒、 反応条件等を設定すればよい。
核酸を溶解する溶媒も特に制限されず、 蒸留水、 又は通常核酸溶液の調製に用 いられる緩衝液、 例えば TE緩衝液 （10mM Tr i s塩酸， pH8. 0Z lmM EDTA) 等の Tr i s 緩衝液、 食塩を含む水溶液、 カルボン酸塩を含む水溶液 (クェン酸ナトリウム、 クェン酸アンモニゥム、 酢酸ナトリウム等） 、 スルホン酸塩を含む水溶液 （ドデ シル硫酸ナトリウム、 ドデシル硫酸アンモニゥム等) 、 ホスホン酸塩を含む水溶 液等 （リン酸ナトリウム、 リン酸アンモニゥム等） 等を挙げることができる。 ま た、 一般に市販されている溶媒、 Micro Spotting Solution (TeleCHem Internat ional, In 社製） 等も挙げることができる。 また、 核酸溶液の濃度も特に制限 されないが、 通常 lmmol/ml〜lfmol/ml、 好ましくは 100pmol/ml〜100fmol/mlの濃 度である。
核酸溶液を母粒子上に接触させる方法としては、 ピぺットで核酸溶液を母粒子 上に滴下する方法、 市販のスポッ夕を用いる方法、 核酸溶液に母粒子を懸濁する 方法等が挙げられる。 核酸溶液の量としては、 特に制限されないが、 10nl〜10ml が好ましい。 核酸溶液は、 1種類でも 2種類又はそれ以上であってもよい。 尚、 母粒子に核酸が固定されたことを示す陽性コントロールとして、 標識した核酸を 母粒子に接触しておいてもよい。
本発明の好ましい形態においては、 核酸溶液を母粒子上に接触した後に、 紫外 線を照射する。 また、 前記核酸溶液を接触後、 紫外線照射前に母粒子を乾燥させ ることができる。 前記核酸溶液の乾燥方法としては、 自然に乾燥させてもよく、 加熱して乾燥させてもよい。 加熱する場合の温度は、 通常 30〜 1 00° (：、 好ま しくは 35〜45°Cである。
次に、 母粒子に、 紫外線を照射する。 具体的には、 波長 280nmを含むブロード な波形を有する紫外線であってもよい。 照射量は、 累積照射量として通常 lOOmJ/ cm2以上、 好ましくは 200mJ/cm2以上である。 また、 核酸の任意の部分に光反応性 基を導入した核酸を用いてもよい。
上記のようにして、 核酸を母粒子上に固定化することにより、 本発明の素子が 製造される。 本発明の方法により得られる素子は、 例えば、 ハイブリダィゼーシ ョンによる核酸の分析に用いることができる。 本発明の方法により母粒子に固定 化された核酸は、 分散性に優れるため、 従来法に比べて検出感度が良好で、 再現 性もよい。 ハイブリダィゼーシヨン及びその検出は、 通常の固相化核酸を用いた ハイブリダィゼーシヨンと同様にして行うことができる。
また、 生物学的活性物質としてタンパク質を用いる場合は、 通常の固相免疫試 薬等と同様に、 抗体、 抗原、 酵素、 ホルモン等のタンパク質を用いることができ る。
< 2 >本発明の素子の利用 本発明の素子は、 好ましい形態においては、 同素子上の生物学的活性物質に特 異的に結合する第二の生物学的活性物質の検出又は測定に用いられる。 この形態 においては、 素子上の生物学的活性物質と、 第二の生物学的物質との結合を阻害 する物質を検出又は測定することもできる。
前記生物学的活性物質としては、 核酸、 タンパク質 （ペプチドを含む） 、 糖等 が挙げられる。 核酸としては D N A又は R N Aが、 タンパク質としては、 抗原、 抗体、 酵素などが挙げられる。 以下、 生物学的活性物質として核酸を例として説 明するが、 核酸固有の検出法としてハイブリッドを形成させること以外は、 他の 物質でも通常検出に用いられている方法や条件を採用することができる。
本発明の素子は、 標識物質で標識した核酸を用いるハイプリダイゼ一シヨンに よる核酸の検出法において、 検出、 精製あるいは PCR反応のテンプレートとして 用いることができる。 すなわち、 母粒子に固定化核酸が固定された粒子 （以下、 「素子」 ） は、 ハイブリダィゼ一シヨン用のプロ一プとして用いることができる。 測定対象である核酸にプローブをハイブリダィズさせて、 核酸一核酸ハイブリ ッドを形成させ、 系から遊離のプローブを除去した後に、 ハイブリッドに含まれ る標識物質を検知することによって、 測定対象の核酸を検出することができる。 また、 同様にして、 目的とする核酸を精製することができる。 あるいは、 素子上 の核酸に捕捉された核酸を、 PCR反応のテンプレートとして使用することができ る。
本発明においては、 母粒子は、 蛍光分光光度計、 9 6穴マイクロタイ夕一プレ ート用蛍光分光光度計、 蛍光顕微鏡等を用いて蛍光強度等を測定することにより 直接的に検知することができる。
本発明の素子を用いたハイプリダイゼーションは、 通常の核酸のハイプリダイ ゼーションと特に変わるところはない。
試料に用いる核酸の標識は、 通常核酸の標識に用いられる方法によってポリヌ クレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することによって行うことが好ましい が、 標識されたヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレオチド又は オリゴヌクレオチドに取り込ませることによって行うこともできる。
本発明の素子は、 生物学的活性物質が、 2又はそれ以上の親水性基を有する有 機化合物を介して母粒子に結合しているため、 水系溶媒中での分散安定性がよい。 例えば、 疾患に関わる SNP (Single nucleotide polymorphism) の検出や、 Gene expression ana lysisを八ィプリダイゼーション法を用いて検出する場合、 従来 の素子では 素子同士がハイブリダィゼ一シヨン溶液中で凝集すると、 素子同士 が適切な距離を保つことができなくなり、 その結果、 素子又は遺伝子の立体障害 によりハイプリダイゼーシヨンが阻害されやすい。 それに対し、 本発明の素子は、 水系溶媒中での分散性がよいため、 前記のハイプリダイゼーシヨンの阻害が起こ りにくい。 また、 この水溶液中での優れた分散性のため、 蛍光やラジオアイソト —プ等を用いた検体の検出を再現性良く行なうことができる。 その結果として、 SNPや Gene expression analys i sを高効率、 高感度で検出することができる。 特 に、 生体試料の検出を行なう場合は、 検体が極微量しか確保できないことが多く、 高効率、 高感度で検出する手法の確立が望まれており、 本発明の素子を用いた検 出方法はこれら極微量の検体の検出を再現性良く検出できることから、 有効な検 出手法である。
尚、 本発明においては、 水系溶媒とは、 水、 TEバッファ一、 SSCバッファ一、 リン酸バッファ一、 酢酸バッファ一、 ホウ酸バッファ一、 Tris_HClバッファ一、 UniHybr iTk (Telec em Internat ional社製) 、 ExpressHyD'M Hybridization So lution (Clontech社製) 、 SlideHyb™ Survey Kit (Ambion社製) 等の緩衝液、 D MS0、 DMF等の有機溶剤を混合した前記水系溶媒、 SDS (ソディウムドデシル硫酸 塩） 等の界面活性剤を混合した前記水系溶媒、 テトラメチルアンモニゥム塩等の ォニゥム塩ゃホルムアミ ド等、 ハイプリダイズする核酸の Tmを変化させることが できる各種試薬を混合した前記水系溶媒等を意味する。
さらに、 例えば、 L丽 INEXシステム （日立ソフトエンジニアリング社製） を用 いた SNP検出、 GeneA即 2400 (パーキンエルマ一） 、 ΊΤ3000 (TAKARA) を用いた RT -PCR、 MBS;Te-MagS (テカン社製） 、 mRNAアイソレーションキッ ト （ロシュダイ ァグノスティック) 、 自動プラスミ ド抽出装置 （TAKARA) を用いた検体分離等の 機器にも、 本発明の素子は、 好適に利用できる。
本発明の素子は、 他の態様においては、 疾患の治療用に用いられる。 この態様 においては、 生物学的活性物質は、 治療用薬剤の有効成分として機能する。 8
27 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこれに限定 されるものではない。 以下において特に断りのない限り 「部」 は 「重量部」 を 「水」 は 「蒸留水」 の意味である。 実施例 1 コア粒子の製造
<1>コア粒子製造例 1
500 m lフラスコに、 下記に示した成分からなる混合物を一括して仕込み、 窒素で溶存酸素を置換した後、 撹拌機で撹拌しながら、 窒素気流下、 オイルバス を用いて、 68°Cで約 1 5時間加熱をして、 スチレンーメタクリル酸共重合粒子 溶液を得た。
48 2部
メタクリル酸 20 6部
メタノール 79 8部
エタノール 2 9 9部
水 59 8部
ァゾビス 2—メチルプチロニトリル （ABNE) 3 0部
スチレンーメタクリル系共重合樹脂溶液 75 0部
(スチレン： メタクリル酸 2-ヒドロキシェチル =2:8 40wt%メタノ-ル溶液）
次に、 この粒子溶液の一部を吸引ろ過設備を使って、 水一メタノール混合溶液 (3 : 7) で 3〜5回程度、 洗浄一ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 コア粒子 1を得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 50) にて形状を観察したとこ ろ、 球状の粒子群であり、 粒子径を測定したところ、 平均粒子径が 1. 4 であった。
< 2〉コア粒子製造例 2
500 m lフラスコに下記に示した成分からなる混合物を一括して仕込み、 窒 素にて溶存酸素を置換した後、 撹拌機で撹拌しながら、 窒素気流下、 オイルバス を用いて、 7 0°Cで約 1 5時間加熱をして、 スチレンーメタクリル酸共重合粒子 溶液を得た。
スチレン 34. 4部
メタクリル酸 8. 6部
メタノール 208. 0部
水 52. 0部
ァゾビス 2ーメチルブチロニトリル (ABNE) 1. 0部
ポリビニルピロリ ドン (K- 90) 1 5. 0部
次に、 この粒子溶液の一部を吸引ろ過設備を使って、 水一メタノール混合溶液
(3 : 7) で 3〜 5回程度洗浄一ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 コア粒子 2 を得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 50) にて形状を観察したところ、 球状の粒子群であり、 粒子径を測定したところ、 平均粒子径が 0. 7 8 xmであ つた。
以上のコア粒子の製造結果を、 まとめて表 1に示す。 表 1 粒子含有反応基 ポリマー粒子の 使用原料
官能基当量
コア粒子 1 力ルポキシル基 287 /C00H スチレン · タクリル酸 コア粒子 2 力ルポキシル基 430/COOH スチレン タクリル酸
実施例 2 有機化合物 Aの合成
<1>ポリカルポジイミド化合物合成例 1
2 , 6—トリレンジイソシァネート （TD I ) 500 gと、 重合度 m= 8のポ リオキシエチレンモノメチルエーテル 367. 8 gとを、 50でで1時間初期反 応させた後、 カルポジイミ ド化触媒 5 gを加え、 8 5 で 6時間反応させ、 末端 封止したポリカルポジイミド化合物 （重合度 =5) を得た。 これに蒸留水 508. 3 gを徐々に加え、 ポリカルポジィミ ド化合物 1溶液 (樹脂濃度 60wt ) を得 た。 カルポジイミ ド当量は 3 1 8/NCNであった。 < 2〉ポリカルポジイミ ド化合物合成例 2
テトラメチルキシリレンジイソシァネート （TMXD I ) 500 gと、 カルボ ジイミド化触媒 1 0 gを 1 80°Cで 10時間反応させ、 イソシァネート末端を有 するポリ m—テトラメチルキシリレンカルポジイミ ド （重合度 = 3) を得た。 こ れに、 重合度 m= 8のポリオキシエチレンモノメチルェ一テルを 393. 5 g加 え、 140°Cで 6時間反応させ、 末端封止したポリカルポジイミ ド化合物 2を得 た。 これに蒸留水 550. 6 gを徐々に加え、 ポリカルポジイミ ド化合物 2溶液 (樹脂濃度 60wt%) を得た。 カルポジイミ ド当量は 5 37 ZNCNであった。
< 3 >ポリカルポジイミ ド化合物合成例 3
2 , 6—トリレンジイソシァネート （TD I ) 5 0 0 gと、 エタノール 44. l gとを、 40°Cで 1時間初期反応させた後、 カルポジイミ ド化触媒 5 gを加え 7 5°Cで 7時間反応させ、 末端封止したポリカルポジイミ ド樹脂 （重合度 = 5) を得た。 これにテトラヒドロフラン 292. 4 gを徐々に加え、 ポリカルポジィ ミ ド化合物 3溶液 （樹脂濃度 60wt%) を得た。 カルポジイミ ド当量は 1 83Z NCNであった。 尚、得られたポリカルポジイミ ド化合物 （重合度 = 5) の一部 について、 水との溶解性を確認したところ、 殆ど溶解せず、 このポリカルポジィ ミド化合物は疎水性であった。
以上で得られたポリカルポジイミド化合物の合成結果を、 まとめて表 2に示す。 表 2 有機化合物 官能基 末端封止 官能基 媒体 合成例 一分子当たり セゲ ント原料 当量
平均個数
合成例 1 カル;]"、 ン 1 ト ¾ ホ。リオキシエチレン 3 1 8 水
5 モノ) ίチルェ -テル 合成例 2 カルホ"シ'ィミト"基 リオキシエチレン 537 水
3 モノ； ¾チルェ -テル 合成例 3 カルホ"シ'イミド基 エタノール 1 8 3 THF
5 実施例 3 母粒子 （A) の製造
< 1〉母粒子製造例 1
300 m l フラスコに、 下記の成分からなる混合物を一括して仕込み、 撹拌機 で撹拌しながら、 窒素気流下、 オイルバスを用いて、 45°Cで約 1 5時間加熱を 行い、 ポリカルポジイミ ド化合物を反応させて母粒子溶液を作製した。
コア粒子 1溶液 1 8. 0部
ポリカルポジイミ ド化合物 1溶液 1 6. 6部
水 3 1. 2部
メタノール 1 5 1. 4部
次に、 母粒子を、 吸引ろ過設備を使って、 水一メタノール混合溶液 （3 ： 7) で 3回、 メタノール 2回程度、 洗浄一ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 母粒子 1を得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 50) にて形状を観察したとこ ろ、 1. 76 111であった。 更に、 この粒子をフーリエ変換赤外分光光度計 （島 津製 FT— I R 82 0 0 P C) で測定したところ、 波長 2 1 50 ( 1 / c m) 前後でカルポジイミ ド基による吸収ピークが得られた。
また、 この粒子の一部を水媒体に分散させて、 粒度分布 （日機装 マイクロト ラック 9320HRA) で分散性の確認をしたところ、 S EMで得た結果と同様 の粒子径であり、 単分散を示す粒度であった。
< 2 >母粒子製造例 2
300m lフラスコに、 下記の成分からなる混合物を一括して仕込み、 撹拌機 で撹拌しながら、 窒素気流下オイルバスを用いて、 温度 50^で約 1 5時間加熱 を行い、 ポリカルポジィミド化合物を反応させて母粒子溶液を作製した。
コア粒子 1溶液 1 1. 1部
ポリカルポジイミド化合物 2溶液 9. 4部
水 28. 2部
メタノール 74. 6部
次に、 母粒子を、 吸引ろ過設備を使って水—メタノール混合溶液 （3 ： 7) で 3回、 メタノール 2回程度、 洗浄一ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 母粒子 2 を得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 50) にて形状を観察したところ、 1. 88 / mであった。 更に、 この粒子をフーリエ変換赤外分光光度計 （島津製
FT- I R 8200 P C) で測定したところ、 波長 2 1 50 ( 1 / c m) 前後 でカルポジィミ ド基による吸収ピークが得られた。
また、 この粒子の一部を水媒体に分散させて、 粒度分布 (日機装 マイクロト ラック 9320HRA) で分散性の確認をしたところ、 S EMで得た結果と同様 の粒子径であり単分散を示す粒度であった。
< 3 >母粒子製造例 3
300 m lフラスコに下記の成分からなる混合物を一括して仕込み、 撹拌機で 撹拌しながら、 窒素気流下、 オイルバスを用いて、 45°Cで約 1 5時間加熱を行 い、 ボリカルポジイミ ド化合物を反応させて母粒子溶液を作製した。
コア粒子 2溶液 22. 0部
ポリカルポジイミ ド化合物 1溶液 1 1. 1部
水 20. 9部
メタノール 1 0 1. 2部
次に、 母粒子を、 吸引ろ過設備を使って水一メタノール混合溶液 （3 ： 7) で 3回、 メタノール 2回程度洗浄—ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 母粒子 3を 得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 50) にて形状を観察したところ、 0. 98 mであった。 更に、 この粒子をフーリエ変換赤外分光光度計 （島津製
FT- I R 8200 P C) で測定したところ、 波長 2 1 50 ( 1 Z c m) 前後 でカルポジイミ ド基による吸収ピークが得られた。
また、 この粒子の一部を水媒体に分散させて、 粒度分布 （日機装 マイクロト ラック 9320HRA) で分散性の確認をしたところ、 S EMで得た結果と同様 の粒子径であり単分散を示す粒度であった。
< 4 >母粒子製造例 4
300m lフラスコに下記の成分からなる混合物を一括して仕込み、 撹拌機で撹 拌しながら、 窒素気流下オイルバスを用いて、 50°Cで約 1 5時間加熱を行い、 ポリカルポジィミ ド化合物を反応させて母粒子溶液を作製した。 コア粒子 2溶液 2 2. 1部
ポリカルポジイミ ド化合物 2溶液 1 2. 5部
水 3 7. 8部
メタノール 9 9. 8部 次に、 母粒子を、 吸引ろ過設備を使って水一メタノール混合溶液 （3 ： 7) で 3回、 メタノール 2回程度洗浄一ろ過を繰り返した後、 真空乾燥し、 母粒子 4を 得た。 この粒子を S EM (日立製 S— 2 1 5 0) にて形状を観察したところ、 1. 0 6 /xmであった。 更に、 この粒子をフーリエ変換赤外分光光度計 （島津製
FT- I R 8 2 0 0 P C) で測定したところ、 波長 2 1 5 0 ( 1 / c m) 前後 でカルポジイミ ド基による吸収ピークが得られた。
また、 この粒子の一部を水媒体に分散させて、 粒度分布 （日機装 マイクロト ラック 9 3 2 0 HRA) で分散性の確認をしたところ、 S EMで得た結果と同様 の粒子径であり単分散を示す粒度であった。
< 5 >母粒子製造例 5
特開平 8-23975号公報の実施例 6に記載された方法に準じて、 3 0 0 m I フラ スコに下記に示した成分からなる混合物を一括して仕込み、 撹拌機で攪拌しなが ら、 3 0分程度浸漬した。
架橋粒子 （シ"ビニルへ'ンセ"ン主成分） * 5. 0部
ポリカルポジイミ ド化合物 3溶液 1 6. 7部
THF 8 3. 3部
* ：架橋粒子 (積水ファインケミカル製 SP- 2095、 平均粒子径 9. 5 、 C V 値 4. 7 %)
次に、 前記混合物を、 吸引ろ過設備を使ってろ過をした後、 温度 6 0°Cの乾燥 機にて約 3時間乾燥して、 ポリカルポジイミ ド化合物被覆粒子を得た。
この粒子をフーリエ変換赤外分光光度計 （島津製 FT— I R 8 2 0 0 P C) で測定したところ、 波長 2 1 5 0 { 1 / cm) 前後でカルポジイミ ド基による吸 収ピークが得られた。
しかし、 この粒子の一部を水媒体に分散させて、 粒度分布 (日機装 マイクロ トラック 9 3 2 0 HRA) で分散性の確認をしたところ、 製造例 1〜4の母粒子 の粒子径分布よりも広く、 分布末端が長い一山の分布が得られた。 そこでこの粒 子を S EM (日立製 S— 2 1 5 0 ) にて形状を観察したところ、 平均粒子径が 1 7. 0 6 /xmであり、 凝集した粒子が散見された。 尚、 この平均粒子径の算出 にあたり、 凝集した粒子についてはそれを一つの粒子と見なして、 S EMを用い て粒子の最長径と最短径の平均値を算出し、 それを粒子径とした。
以上の母粒子の製造結果を、 まとめて表 3に示す。 表 3 母粒子 使用した 有機化合物 A 合成温度 水媒体への 製造例 コア粒子 添加量 分散性
(官能基での当量比） （°C)
〇 〇〇〇△
1 製造例 1 3 4 5
2 製造例 1 2 5 0
3 製造例 2 3 4 5
4 製造例 2 2 5 0
5 一
〇：単分散する母粒子である。
△ :一部単分散するが、 凝集した母粒子である。
X ：殆ど凝集した母粒子である。
実施例 4 コア粒子及び母粒子の評価
< 1 >評価試験 1
実施例 3で製造した母粒子 1〜 5及びそれらの製造に用いた各々のコァ粒子を、 S EMにて測定可能な倍率 （ 1 0 0〜 1 0 , 0 0 0倍） で写真を撮り、 粒子 1個 に対してランダムに長径及び短径を 1 5回測定し、 これをランダムに n= 1 0 0 個繰り返し測定して、 その平均値をとり、 球状粒子指数平均 （長径ノ短径） を求 めた。 結果を表 4に示す 表 4 母粒子 コア粒子 母粒子 単分散
製造例 球状粒子指数平均 球状粒子指数平均 球状化
1 1. 04 1. 0 3
2 1. 04 1. 05
3 1. 0 5 1. 0 5
4 1. 0 5 1. 06
〇：沈降速度の均一化、 粒子の表面積の均一化、 生物学的に活性な物質
の付加量の均一化が可能な精度の高い粒子である。
X ：沈降速度の均一化、 粒子の表面積の均一化、 生物学的に活性な物質
の付加量の均一化が難しい精度の低い粒子である。
< 2 >評価試験 2
実施例 3で製造した母粒子及びそれらの製造に用いた各々の〇 〇〇〇コア粒子の粒子径 を S EM (1 00〜 1 0, 000倍） にて写真を撮り、 その粒子径をランダムに r^ 500個測定し、 平均粒子径を測定した。 そして下記の計算式から力ルポ ジイミド化合物層の平均厚み径 （L) を求めた。 結果を表 5に示す。
L= (L 2 - L i) / 2
Liは試作したコア粒子 （A ) の平均粒子径
L 2は試作した母粒子 （A) の平均粒子径
表 5 母粒子 コア粒子 母粒子 L
製造例 平均粒子径 m) 平均粒子径（ m)
Figure imgf000036_0001
1 1. 4 2 1. 7 6 0 . 1
2 1. 4 2 1. 8 8 0 . 2
3 0. 7 8 0. 9 8 0 . 1
4 0. 7 8 1. 0 6 0 . 1
5 9. 5 1 7. 0 6 * 氺
* * * ：凝集粒子の為、 数値化できず
< 3 >評価試験 3
前記の評価で測定した母粒子及びコア粒子の測定結果から、 CV値、 CV比を 求めた。 結果を表 6に示す。 表 6 母粒子 コア粒子 母粒子 CVa比
製造例 CVi値 （％) CV2値 （％) C Vi/C v2
1 4. 5 8 4. 3 2 1. 0 6
2 4. 58 4. 2 6 1. 0 8
3 6. 0 6 5. 94 1. 0 2
4 6. 0 6 5. 8 2 1. 04
5 4. 7 3 3. 54 0. 1 4
上記の評価試験 1〜 3の結果より、 本発明の実施例に用いた有機化合物 Aを有 する母粒子は、 コア粒子の表層部に有機化合物 A層を有する母粒子であり、 比較 的粒度の揃つた球状の粒子であることが確認できた。
また、 上記製造例 1〜4で得られた母粒子を、 公知の分散設備を使用して水溶 媒に分散させた後、 1 wt%粒子分散水溶液に調整し、 母粒子 1〜4溶液とした。 この母粒子 1〜 4溶液を、 粒度分布計 （日機装 マイクロトラック 9 32 0HR A) で測定したところ、 前記と同等の平均粒子径であり、 分布もシャープな一山 となる単分散した粒子群であった 実施例 5
< 1 >素子の製造
常法に従い、 オリゴヌクレオチド合成機 (Perkin-elmer Applied biosystems) を用いて、 配列番号 1、 2及び 3に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド (30マー） を合成した。 尚、 配列番号 1に示すオリゴヌクレオチドは、 5， 末端 をピオチン化した。 また、 配列番号 2に示すオリゴヌクレオチドは、 ピオチン化 プローブ （配列番号 4) と相補性を持っており、 配列番号 3に示すオリゴヌクレ ォチドは、 配列番号 2に示すオリゴヌクレオチドと 1塩基配列が異なるため。 相 補性を持っていない。 これらのオリゴヌクレオチドを 100pmol/ 1になるように 3 XSSCに溶解した。
上記母粒子 1溶液に、 上記オリゴヌクレオチド溶液のそれぞれを、 石英セル中 で混合した。 次に Uvstratalinker 2400 (STRATAGENE社製） を用い、 紫外線を 16c mの距離から 1200mJ/cm2照射した。 照射時間は 48 0秒であった。 その後、 母粒 子を水中で 3 0分間振とうして洗浄した後、 乾燥させて、 素子を得た。
< 2 >ハイプリダイゼーシヨン
上記の素子と、 3pmolピオチン化プローブ （配列番号 4、 262bp) を含むハイブ リダィゼ一シヨン溶液 (Arrayi t UniHyb (TeleCHem International, Inc. ) 60/2 1を、 エツペンドルフチューブ内で混合し、 乾燥機を用いて 45°Cで 2時間加熱し た。 配列番号 2のオリゴヌクレオチドは、 ピオチン化プローブ （配列番号 4) と 相補的な配列を含んでいる。
上記ハイプリダイゼーシヨンの後、 以下の条件でボストハイプリダイゼ一ショ ン洗浄を行い、 素子に非特異的に吸着したピオチン化プローブを除去した。
〔ボストハイブリダィゼーション洗浄の条件〕
1 ) 2XSSC, 0.1%SDS; 室温、 5分間、 2回
2) 0.2XSSC, 0.1%SDS; 40°C、 5分間、 2回
3) 2XSSC; 室温 1分間、 3回 素子に、 乳タンパクを含むブロッキング溶液 （ブロックエース 雪印乳業製） 1.5mlをのせ、 室温で 3 0分間ブロッキングを行った。 ブロッキング溶液を除い た後、 ストレブトアビジン—アルカリホスファタ一ゼコンジユゲート溶液 (VECT OR社製） を 1.5mlのせ、 室温で 30分間反応させた。 つぎに、 素子を TBST (50mM Tr is-HCl (pH7.5), 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20) 溶液に浸し、 5分間振とうして、 反応しなかったコンジュゲートを除去した。 最後に、 素子に基質溶液 （TMB) を 1. 5ml加えて、 3 0分間放置し、 発色反応を行った。
その結果を、 表 7に示す。 配列番号 2のオリゴヌクレオチドを固定化した粒子 のシグナルは、 固定化されたオリゴヌクレオチドの量を、 配列番号 3のオリゴヌ クレオチドを固定化した粒子のシグナルはハイプリダイゼーションの強度を、 そ れぞれ示す。 比較例 1
<1>素子の製造
実施例 3の母粒子製造例 5で作製した母粒子 （特開平 8- 23975の実施例 6に記 載された方法に準じて作製した母粒子） 溶液と、 実施例 5のオリゴヌクレオチド 溶液のそれぞれを、 石英セル中で混合した。 次に、 Uvstratal inker 2400 (STRAT AGENE社製） を用い、 紫外線を 16cmの距離から 1200mJ/cm2照射した。 照射時間は 48 0秒であった。 その後、 母粒子を水中で 3 0分間振とうして洗浄した後、 乾 燥させ、 素子を得た。 く 2 >ハイブリダイゼーシヨン
上記の素子と、 3pmolピオチン化プローブ （配列番号 4、 262bp) を含むハイブ リダィゼ一シヨン溶液 (Arrayi t UniHyb (TeleCHem International, Inc. ) 60 x 1を、 エツペンドルフチューブ内で混合し、 乾燥機を用いて 45°Cで 2時間加熱し た。
上記ハイブリダイゼ一ションの後、 実施例 5と同様にして、 ハイブリダィゼー シヨンの検出を行った。 結果を表 7に示す。 ¾ ? 固定化したオリゴヌクレオチド 配列番号 1 配列番号 2 配列番号 3 実施例 5 ◎ ◎ X
比較例 1 Δ Δ X
◎： シグナルが非常に高感度かつ非常に明瞭に現れた。
〇 ：シダナルが高感度かつ明瞭に現れた。
△： シ ナルが低感度または不明瞭に現れた。
X ： Wナルが全く現れなかった。 表 7の結果から明らかなように、 実施例 5の素子は、 オリゴヌクレオチドが確 実に母粒子に固定化されていることがわかる。 また、 実施例 5の素子は、 ハイブ リダイゼーションシグナルも明瞭に現れた。 配列番号 3にはシグナルはまったく 現れなかった。 一方、 比較例 1の素子は、 固定したオリゴヌクレオチドからのシ グナル及びハイプリダイゼ一シヨンシグナルが低感度かつ不明瞭に現れたことか ら、 カルポジイミド化合物が母粒子から剥がれ落ちたと考えられる。 したがって、 実施例 5の素子では、 母粒子とカルポジィミド化合物が共有結合を形成すること により、 母粒子からカルポジイミド化合物が剥がれ落ちることを防ぎ、 その結果、 シグナルを高感度かつ明瞭に得ることができたと考えられる。
尚、 同様に母粒子 2〜 4溶液についても、 同様な手順でオリゴヌクレオチドを 母粒子に固定化して素子を作製し、 ハイブリダィゼ一シヨン検出を行なったとこ ろ、 実施例 5と同様な結果が得られた。 実施例 6 素子の分散性の評価
実施例 5及び比較例 1で得られた素子を水で希釈して、 粒度分布計 (日機装 マイクロトラック 9 3 2 0 H R A) で分散性の確認を行なった。
その結果、 実施例 5の素子は、 母粒子 1と類似した単分散分布を示す粒子群で あり、 異なった分布を示すような変化は現れなかったが、 比較例 1のオリゴヌク レオチドを固定化した素子では、 使用したコア粒子の粒子径分布よりも広く、 分 布末端が長い一山の分布が得られた。
また、 S EM (1 00〜 10， 000倍） により確認したところ、 実施例 5の 素子では、 凝集した粒子及び変形した粒子 （母粒子形状含む） は確認できなかつ たが、 比較例 1の素子では、 凝集した粒子群が散見された。 これらの結果を表 8 に、 また素子径、 CV値、 CV比を表 9に示す。
¾ 8 粒度分布による分散性 S EMによる凝集、 変形性 実施例 5の素子 A 凝集 ·変形粒子なし 比較例 1の素子 B 凝集粒子あり 母粒子に類似する粒子径を有する単分散素子である
一部母粒子と類似する粒子径を有するが、 分布幅が広い素子である 母粒子と類似の粒子径を有さず、 分布幅が広い素子である 表 9 チ 素子 C Vb比 c vc比 平均粒子径（/ m) c v3値（％) C Vi C v3 c v2/c v3 実施例 5 1. 8 1 4. 64 0. 9 9 0. 93 比較例 1 2 1. 72 64. 38 0. 0 7 0. 52
※ ：凝集した粒子についてはそれを一つの粒子と見なして、 S EMを用いて 粒子の最長径と最短径の平均値を算出し、 それを粒子径とした。 このことから、 本発明の素子は、 溶液分散性がよく、 高性能であることが確認 できた。
同様に、 母粒子 2〜4を用いて製造した素子についても分散性の確認を行なつ たところ、 粒度分布、 S EMともに良好であり、 溶液分散性がよいことが確認で ぎた。 産業上の利用の可能性
本発明の素子は、 溶液分散安定性がよく、 生物学的活性物質の検出もしくは測 定、 又は治療用の素子として、 好適に使用することができる。

Claims

請求の範囲
1. コア粒子と、 コア粒子に化学結合により固定化された、 2又はそれ以上 の親水性基を有する有機化合物からなる母粒子と、 前記有機化合物を介して母粒 子に結合した生物学的活性物質からなる、 生物学的活性物質を固定化した素子。
2. 水系溶媒中に用いられることを特徴とする請求項 1に記載の素子。
3. 母粒子の平均粒子径が 0. 0 1〜： 1 0 0 mである請求項 1又は 2に記 載の素子。
4. 母粒子が球状又は略球状である請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の素 子。
5. 下記式で表される CVb比及び CVc比の少なくともいずれかが、 0. 6 〜 3. 0であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか一項に記載の素子。
C Vb比 = C V C V3
C Vc比 =C V2ZC V3
(コア粒子径の標準偏差/コア粒子径の平均粒子径） X I 0 0 C V2= (母粒子径の標準偏差/母粒子の平均粒子径） X I 0 0
C Vs= (素子径の標準偏差 V/素子の平均粒子径） X I 0 0
6. 前記コア粒子及び生物学的活性物質は、 カルポジイミド基、 エステル基、 カーボネート基、 エポキシ基、 及びォキサゾリン基から選ばれる官能基との反応 により結合していることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の素子。
7. 前記有機化合物は、 下記式で表される化合物である請求項 1〜6のいず れか一項に記載の素子。
Ax - （R - X) n-R- Ay … ( I )
(Ax, Ayは、 独立して親水性を示す官能基を有するセグメントを示し、 同一で あってもよく、 異なっていても良い。 Rは独立して 2価以上の有機基を示し、 X は独立してカルボジィミド基、 エポキシ基又はォキサゾリン基を示し、 nは 2〜 8 0、 好ましくは 2〜40の整数を示す。 ）
8 . 前記生物学的活性物質が、 核酸、 タンパク質、 ハプテン、 糖から選ばれ る請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の素子。
9 . 前記素子は、 前記生物学的活性物質と、 試料中に含まれる第二の生物学 的活性物質との特異的な結合によって、 試料中の第二の生物学的活性物質を検出 又は測定するためのものである、 請求項 1〜 8のいずれか一項に記載の素子。
1 0 . 前記生物学的活性物質は疾患の治療用の薬剤である、 請求項 1〜 8の いずれか一項に記載の素子。
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