JP2001178460A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程を特に必要としない
ＤＮＡチップを得ること。 【解決手段】 環状の酸無水物構造を持つポリマーを表
面に担持した固相担体上に、末端部にアミノ基を有する
ＤＮＡ断片を含有する水性液体を点着すること、あるい
はカルボキシル基を持つモノマーを構成成分とするポリ
マーを表面に担持した固相担体を脱水剤により環状の酸
無水物とし、ついで、末端部にアミノ基を有するＤＮＡ
断片を含有する水性液体を点着することを特徴とするＤ
ＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。この方法により
得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチップを用い
るＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する
核酸断片を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる導電性基を持つ
インターカレータを利用する方法などが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。 （１）環状の酸無水物構造を有するポリマーを表面に担
持した固相担体上に、末端部にアミノ基を有するＤＮＡ
断片を含有する水性液体を点着すること特徴とするＤＮ
Ａ断片の固相担体表面への固定方法。この固定方法で
は、環状の酸無水物構造を有するポリマーが無水マレイ
ン酸を重合成分として得られたものであることが好まし
い。また、水性液体の点着後、８０乃至１８０℃の範囲
で加熱を行なうことが好ましい。 （２）カルボキシル基を有するモノマーを構成成分とす
るポリマーを表面に担持した固相担体を脱水剤により環
状の酸無水物とし、ついで、末端部にアミノ基を有する
ＤＮＡ断片を含有する水性液体を点着することを特徴と
するＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。この固定
方法でも、水性液体の点着後、８０乃至１８０℃の範囲
で加熱を行なうことが好ましい。

【００１３】（３）上記の方法によって得られたＤＮＡ
チップ。

【００１４】（４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （５）上記のＤＮＡチップの表面に、導電性基を有する
インターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与
する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と
相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーション
によってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡ
チップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハ
イブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの導
電性基を介して流れる電流を電気化学的に検出する工程
からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性
を有する核酸断片の検出方法。

【００１５】本発明は、被検体の核酸断片試料との相互
作用が小さく、かつアミノ基との反応性を有する固相担
体を用い、そして、アミノ基を末端に有するＤＮＡ断片
を作成し、固相担体上に点着した箇所でのみ、該ＤＮＡ
断片と固相担体との間に強固な共有結合が形成され、固
定化が起こる。被検体核酸断片試料との相互作用の小さ
い固相担体を用いている結果として、ブロッキング工程
が不要となることに基づいている。

【００１６】さらに詳しく述べると、本発明において
は、固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は共有結合の形成
をもって行われる。この共有結合の形成は固相担体表面
に環状構造を有する酸無水物を固定し、この酸無水物と
アミノ基を有するＤＮＡ断片間で形成される。一般に、
アミノ基は酸無水物との反応が極めて高いために、水が
存在しても大きく反応が阻害されることなく結合を形成
する。一方、被検体となる核酸断片は水が存在する系に
おいては、酸無水物との反応が遅く、実質的に反応しな
い。従って、固相担体上に固定されるべきＤＮＡ断片の
末端にアミノ基を含有せしめ、これを含む水性液体を該
固相担体上に点着して、共有結合を形成させることがで
き、一方、非点着部分では被検体の核酸断片が酸無水物
とは反応しないため、ハイブリダイゼーションの起こっ
た個所でのみ被検体核酸断片が結合する。ハイブリダイ
ゼーション工程の後に洗浄操作を行うことにより、非点
着部分における非特異的な結合（吸着）を極めて小さい
レベルに抑制することができる。この結果、ブロッキン
グ工程が不要となる。本発明は以上の発見に基づいてい
る。

【００１７】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）固相担体表面に環状の酸無水物構造を有するポリ
マーを結合させる。 （２）ＤＮＡ断片として、末端にアミノ基を有し、その
塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作製した固相担体表面に、（２）で示し
た末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片を含む液体を点着
する。点着部分においてはアミノ基を有するＤＮＡ断片
が共有結合により固定される。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体
（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面
に固定された環状の酸無水物構造を有する化合物に、共
有結合を介してＤＮＡ断片が固定されている。ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定は、固相担体表面に、環状の
酸無水物構造を有する化合物を固定する工程、そしてア
ミノ基を末端に含有したＤＮＡ断片を含む液体を点着
し、点着部分での酸無水物とアミノ基間の反応によって
ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行うことによってなさ
れる。

【００１９】本発明の代表的な固定方法を下記に示す。
環状の酸無水物構造を有するポリマーを固相担体表面に
担持してなる固相担体に、末端にアミノ基を有するＤＮ
Ａ断片を含む液体を点着する。点着部分においては酸無
水物部分とアミノ基を有するＤＮＡ断片が共有結合を形
成する。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次
行うことによってＤＮＡチップを得ることができる。Ｄ
ＮＡ断片が有するアミノ基と、ＤＮＡ断片のリン酸エス
テル基との間には、合成の都合上、クロスリンカーを存
在させてもよい。以下、各工程について説明する。

【００２０】本発明で用いる固相担体は、疎水性、ある
いは親水性の低い担体であることが好ましい。また、そ
の表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ま
しく用いることができる。固相担体の材質としては、ガ
ラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュ
ーセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セ
ルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シ
リコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、
多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物
質、金などの導電性材料などを拳げることができる。多
孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲
にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にある
ことが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしく
はシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処
理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによる
ものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。

【００２１】本発明で用いられる環状の酸無水物構造を
有するポリマーについて述べる。環状の酸無水物構造と
しては、４乃至２０員環を形成していることが好まし
く、５乃至１２員環がより好ましく、５乃至７員環がさ
らに好ましい。この環状の酸無水物構造を有するポリマ
ーは次に述べる二つの方法によって得ることができる。
一つは予め環状の酸無水物構造を有するモノマーを単独
であるいは他の重合性成分と共重合することによって得
ることができる。環状の酸無水物構造を有するモノマー
としては、無水マレイン酸、デヒドロ無水グルタル酸、
無水イタコン酸の２重結合をそのまま重合性基として用
いる方法であり、例えば特開平７−１１０５７７号に記
載のポリマーである。この他、無水マレイン酸、デヒド
ロ無水グルタル酸、無水グルタル酸、無水フタル酸、無
水ヒドロフタル酸、無水コハク酸、無水ホモフタル酸、
無水イサト酸、無水ナフタル酸、無水イミノジ酢酸、無
水ジグリコール酸、無水ジフェン酸、無水キノリン酸、
無水２，３−ピラジンジカルボン酸、無水３，４−ピリ
ジンジカルボン酸、無水２−スルホ安息香酸などの環状
無水物に対して、アクリル酸アミド、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸アミド、メタクリル酸エステル、スチ
レン、末端アルキレン、末端アルキンなどの重合性基を
結合する方法であり、例えば。特開平８−１２３０２６
号に記載のポリマーにおいて、ハーフアミド構造が酸無
水物構造になったものがこの例として挙げられる。

【００２２】もう一つの方法としては、カルボキシル基
を有するモノマーを単独であるいは他の重合性成分と共
重合し、固相担体表面に担持した後、脱水剤を作用させ
て環状の酸無水物を形成する方法である。この方法は環
状の酸無水物構造の導入密度が上記の方法に比して劣る
場合が多いが、固相担体表面に担持する際に水やアルコ
ールなどの求核性基が共存しても良く、固相担体表面へ
の薄膜形成の面で自由度が大きい点で有利である。カル
ボキシル基を有するモノマーの例としてはアクリル酸、
メタクリル酸、２−カルボキシエチルアクリレート、フ
マル酸、マレイン酸、ビニル酢酸、イタコン酸、マレイ
ン酸モノエステル、コハク酸モノ（２−アクリロイルオ
キシエチル）エステル、コハク酸モノ（２−メタクリロ
イルオキシエチル）エステルおよびこれらの塩が挙げら
れる。この他にマレイン酸、デヒドログルタル酸、グル
タル酸、フタル酸、ヒドロフタル酸、コハク酸、ホモフ
タル酸、ナフタル酸、イミノジ酢酸、ジグリコール酸、
ジフェン酸、キノリン酸、２，３−ピラジンジカルボン
酸、３，４−ピリジンジカルボン酸、２−スルホ安息香
酸などに対して、アクリル酸アミド、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸アミド、メタクリル酸エステル、スチ
レン、末端アルキレン、末端アルキンなどの重合性基を
結合したものを用い、固相担体表面に担持した後、脱水
剤を作用させて環状の酸無水物を形成する方法も好まし
く用いることができる。

【００２３】上記の方法で用いられる脱水剤としては、
酸無水物を生成する試薬として公知のものはいずれも使
用できるが、好ましくは酸無水物（無水酢酸、無水プロ
ピオン酸など）、酸ハロゲン化物（メタンスルホニルク
ロリド、クロロ炭酸イソブチルなど）、カルボジイミド
類（ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩など）、２−ハロピリジニウム化合物（ヨウ化−２−
フルオロ−１−メチルピリジニウムなど）、２位に離脱
基を有する１，１，３，３−テトラアルキルアミジニウ
ム化合物（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−
Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロリン酸塩、塩化２−クロロ−１，３−ジメチルイミ
ダゾリニウムなど）、活性エステルおよび活性アミド類
（酢酸１−スクシンイミジル、カルボニルジイミダゾー
ルなど）などが好ましく用いられる。

【００２４】本発明において、環状の酸無水物構造を有
するポリマーはモノマー単位として１０乃至１００％の
範囲の酸無水物構造を有していることが好ましく、２０
乃至９５％の範囲の酸無水物構造を有していることが特
に好ましい。

【００２５】本発明で用いられる環状の酸無水物構造を
有するポリマーは、固相担体と該ポリマーの密着性を向
上させる目的で、密着性改良用の共重合モノマーを使用
することができる。密着性改良用の共重合モノマーの例
としてはシランカップリング剤を好ましく用いることが
できる。この具体例としては、ジエトキシメチルビニル
シラン、ジメチルエトキシビニルシラン、メタクリル酸
−３−トリメトキシシリルプロピルエステル、トリアセ
トキシビニルシラン、アクリル酸−３−トリメトキシシ
リルプロピルエステル、トリアセトキシビニルシラン、
トリエトキシビニルシラン、３−（トリス（トリメチル
シリルオキシ）シリル）プロピルメタクリレート、３−
（トリス（トリメチルシリルオキシ）シリル）プロピル
アクリレート、トリメトキシビニルシラン、トリス（２
−メトキシエトキシ）ビニルシランなどが挙げられる。
これらのモノマーは、ポリマー全体の０．０５乃至２０
質量％の範囲にあることが好ましく、０．１乃至１０質
量％の範囲にあることが特により好ましく、０．３乃至
５質量％の範囲にあることが特に好ましい。

【００２６】本発明で用いられる環状の酸無水物構造を
有するポリマーにおいて共重合モノマーとして好ましく
用いられる例としては、（メタ）アクリル酸エステル
類、（メタ）アクリルアミド類、アリル化合物、ビニル
エチル類、ビニルエスエル類、スチレン類、クロトン酸
エステル類などから選ばれるものが挙げられる。具体的
には、例えば、（メタ）アクリル酸エステル類、例え
ば、アルキル（メタ）アクリレート、又は置換（メタ）
アルキルアクリレート（例えば、メチル（メ夕）アクリ
レート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メ
タ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレー
ト、ブチル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アク
リレート、へキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキ
シル（メタ）アクリレート、エチルヘキシル（メタ）ア
クリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ｔ−オク
チル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アク
リレート、アリル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキ
シエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピ
ル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシプチル（メ
タ）アクリレート、２，２−ジメチル−３−ヒドロキシ
プロピル（メタ）アクリレート、５−ヒドロキシペンチ
ル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ
（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メ
タ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、メ
トキシベンジル（メタ）アクリレート、クロロベンジル
（メタ）アクリレート、フルフリル（メタ）アクリレー
ト、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、フ
ェノキシエチル（メタ）アクリレートなど）；アリル
（メタ）アクリレート（例えば、フェニル（メタ）アク
リレート、クレジル（メタ）アクリレート、ナフチル
（メタ）アクリレートなど）；（メタ）アクリルアミド
類、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルキル
（メタ）アクリルアミド（該アルキル基としては、例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ｔ−
ブチル基、ヘプチル基、オクチル基、エチルヘキシル
基、シクロヘキシル基、ヒドロキシエチル基、ベンジル
基などがある。）、Ｎ−アリール（メタ）アクリルアミ
ド（該アリール基としては、例えば、フェニル基、トリ
ル基、ニトロフェニル基、ナフチル基、ヒドロキシフェ
ニル基などがある。）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）ア
クリルアミド（該アルキル基としては、例えば、メチル
基、エチル基、ブチル基、イソブチル基、エチルヘキシ
ル基、シクロヘキシル基などがある。）、Ｎ，Ｎ−ジア
リル（メタ）アクリルアミド（該アリル基としては、例
えば、フェニル基などがある。）、Ｎ−メチル−Ｎ−フ
ェニル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル
−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ²−アセトア
ミドエチル−Ｎ−アセチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ
−（フェニルスルホニル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ
−（ｐ−メチルフェニルスルホニル（メタ）アクリルア
ミドなど：アリル化合物、例えば、アリルエステル類
（例えば、酢酸アリル、カプロン酸アリル、カプリル酸
アリル、ラウリン酸アリル、パルミチン酸アリル、ステ
アリン酸アリル、安息香酸アリル、アセト酢酸アリル、
乳酸アリルなど）、アリルオキシエタノールなど；ビニ
ルエーテル類、例えば、アルキルビニルエーテル（該ア
ルキル基としては例えば、へキシル基、オクチル基、デ
シル基、エチルヘキシル基、メトキシエチル基、エトキ
シエチル基、クロルエチル基、１−メチル−２，２−ジ
メチルプロピル基、２−エチルブチル基、ヒドロキシエ
チル基、ヒドロキシエトキシエチル基、ジメチルアミノ
エチル基、ジエチルアミノエチル基、ブチルアミノエチ
ル基、ベンジル基、テトラヒトロフルフリル基などがあ
る）、ビニルアリルエーテル（該アリール基としては例
えぱ、フェニル基、トリル基、クロロフェニル基、２，
４−ジクロロフェニル基、ナフチル基、アントラニル基
などがある）；ビニルエステル類、例えば、ビニルブチ
レート、ピニルイソブチレート、ビニルトリメチルアセ
テート、ビニルジエチルアセテート、ビニルバレート、
ビニルカプロエート、ビニルクロルアセテート、ビニル
ジクロロアセテト、ビニルメトキシアセテート、ビニル
ブトキシアセテート、ビニルフェニルアセテート、ビニ
ルアセトアセテート、ビニルラクテート、ビニル−β−
フェニルブチレート、ビニルシクロヘキシルカルボキシ
レート、安息香酸ビニル、サリチル酸ビニル、クロロ安
息香酸ビニル、テトラクロロ安息香酸ビニル、ナフトエ
酸ビニルなど；スチレン類、例えば、スチレン、アルキ
ルスチレン（例えば、メチルスチレン、ジメチルスチレ
ン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルス
チレン、イソプロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキ
シルスチレン、シクロヘキシルスチレン、デシルスチレ
ン、ベンジルスチレン、クロロメチルスチレン、トリフ
ルオロメチルスチレン、エトキシメチルスチレン、アセ
トキシメチルスチレンなど）、アルコキシスチレン（例
えば、メトキシスチレン、４−メトキシ−３−メチルス
チレン、ジメトキシスチレンなど）、ハロゲノスチレン
（例えば、クロロスチレン、ジクロロスチレン、トリク
ロロスチレン、テトラクロロスチレン、ペンタクロロス
チレン、ブロモスチレン、ジブロモスチレン、ヨードス
チレン、フルオロスチレン、トリフルオロスチレン、２
−ブロモ−４−トリフルオロメチルスチレン、４−フル
オロ−３−トリフルオロメチルスチレンなど）；クロト
ン酸エステル類、例えば、クロトン酸アルキル（例え
ば、クロトン酸ブチル、クロトン酸ヘキシル、グリセリ
ンモノクロトネートなど）；イタコン酸ジアルキル類
（例えば、イタコン酸ジメチル、イタコン酸ジエチル、
イタコン酸ジブチルなど）；マレイン酸あるいはフマル
酸のジアルキル類（例えば、ジメチルマレエート、ジブ
チルフマレートなど）：（メタ）アクリロニトリル等が
ある。

【００２７】本発明において用いられる環状の酸無水物
構造を有するポリマーの重量平均分子量は、５００乃至
１０００００の範囲にあることが好ましく、７００乃至
５００００の範囲にあることがより好ましく、８００乃
至２００００の範囲にあることが特に好ましい。重量平
均分子量が５００未満のポリマーは、ＤＮＡ断片の固定
性に欠けるため、好ましくない。

【００２８】環状の酸無水物構造を有するポリマーが固
定された固相担体は、次のようにして作製することがで
きる。ガラス製の担体の場合には、ポリマーの共重合成
分として導入された前述のシランカップリング剤を接
触、反応させて固相表面上に環状の酸無水物構造を有す
るポリマーが担持された固相担体を得ることができる。

【００２９】表面にアミノ基を有する固相担体（例え
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製する）を用いる場合には、予
め環状の酸無水物構造が導入されたポリマーにおいて
は、該アミノ基に直接接触させる形で固定化することが
できる。また、環状の酸無水物構造を有していない、カ
ルボキシル基を有するポリマーの場合には、該カルボキ
シル基を有するポリマーの溶液を担体上に付与した後
に、適当な縮合剤を作用させて、アミド結合を形成させ
ることにより、固定することができる。この際に、縮合
剤としては、前述の酸無水物を固相担体上で形成する時
に用いられる脱水剤を使用することができる。従って、
この方法の場合には担体上へのポリマーの固定と酸無水
物の形成を同時に行うこともできる。

【００３０】担体として、脂肪族水酸基を有する重合性
モノマーを構成単位として有するポリマーを担持した固
相担体も好ましく用いることができる。この場合、脂肪
族水酸基を有する重合性モノマーとしては３−ヒドロキ
シプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリ
レート、２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどが挙
げられ、これらの重合性モノマーはホモポリマーとして
用いることもできるが、適宜、他の重合性モノマーと共
重合して用いることも好ましい。これらのポリマーは、
ラテックスとして担体表面に塗布した後、加熱処理など
によって融着させる方法もとることができる。

【００３１】上で述べた脂肪族水酸基を有する化合物を
固相担体に確実に固定する方法として、固定化剤を用い
ることができる。このような固定化剤としてはシランカ
ップリング剤、多官能エポキシ化合物、多官能ビニルス
ルホン、塩化シアヌルなどの多点反応剤が好ましく用い
られる。この中ではシランカップリング剤が好ましく、
シランカップリング剤の例としては１，２−ビス（トリ
メトキシシリル）エタン、１，７−ジクロロオクタメチ
ルテトラシロキサン、１，３−ジクロロ−１，１，３，
３−テトライソプロピルシロキサン、３−グリシジルオ
キシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。ま
た、シランカップリング剤を構成モノマーとして有する
ポリマーを用いることもできる。脂肪族水酸基を有する
化合物を固定する担体上には、層間の密着を良くするた
めに、ゼラチンなどの下塗り層を施してもよいし、コロ
ナ放電などにより、担体表面を処理する方法も用いるこ
とができる。

【００３２】本発明の環状の酸無水物構造を有するポリ
マーを固相担体上に固定する工程中およびＤＮＡ断片を
点着後までの工程においては、酸、塩基や触媒の使用、
水および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことがで
きる。酸としては無機酸および有機酸のいずれでも用い
ることができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫
酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフル
オロ酢酸、酢酸が好ましい。

【００３３】塩基としては、無機塩基および有機塩基の
何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリ
ドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムある
いは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−
メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピ
リジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２
−ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱する場
合には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあること
が好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に
好ましい。

【００３４】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。

【００３５】クロスリンカーは、単結合、アルキレン基
あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが
好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノへキシレン基であることが特に好ましい。

【００３６】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００３７】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００３８】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0³乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。

【００３９】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００４０】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０¹⁵モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００４１】環状の酸無水物構造を有するポリマーが導
入された固相担体に、アミノ基を有するＤＮＡ断片を点
着させると、該ＤＮＡ断片が共有結合によって固相担体
表面に固定されるが、固相担体の表面には該ＤＮＡ断片
が結合していない該ポリマーも存在する。このような該
ポリマーの酸無水物構造は、標識された核酸断片試料と
のハイブリダイゼーションにおいて非特異的な反応を生
じる可能性があるため、予め、その該酸無水物構造をブ
ロッキング処理（ブロッキング処理を施さなくても、本
発明の固定方法によって製造された、ＤＮＡ断片固定固
相担体は、充分にＤＮＡチップとして使用することがで
きる。）しておくことも好ましい。ブロッキング処理に
使用されるブロッキング試剤としては、アンモニア、エ
タノールアミン、タウリン、アミノ酸類、エチルアミン
等を挙げることができる。

【００４２】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００４３】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。

【００４４】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。

【００４５】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、***等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行って得ることが好ましい。

【００４６】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
つて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００４７】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００４８】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）環状の酸無水物構造を有するポリマーが固定され
たスライド（Ｃ）の作成常法にて合成したポリマー（ス
チレン：無水マレイン酸：３−（トリメトキシシリル）
プロピルメタクリレート（東京化成工業（株）製）＝６
５：３０：５モル比）をプロピレングリコールモノメチ
ルエーテルアセテート／メチルエチルケトン＝４／１に
溶解し、１０質量％の溶液を作成した。この溶液に、ス
ライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した
後取り出し、アセトニトリルで洗浄後、１１０℃で１０
分間乾燥して、環状の酸無水物構造を有するポリマーが
表面に固定されたスライド（Ｃ）を作成した。

【００４９】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×
１０^-6Ｍ、１μＬ）に、３質量％になるようにジメチル
スルホキシドを添加した溶液を作成し、上記（１）で得
たスライド（Ｃ）にこれを点着した。直ちに、点着後の
スライドを２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、
このスライドを０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２
倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）
との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次
洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍ
グリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した
後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥したのち、１００℃で
１５分間加熱し、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ
１）を得た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍
光スキャニング装置で測定したところ、１５３０であっ
た。本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よく
スライドガラスに固定されたことが分かる。

【００５０】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ３'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に点着し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１質量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、５４２であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００５１】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面に環状の酸無水物構造を有するポリマーを有
する場合には、ＤＮＡ断片の結合が共有結合であるた
め、強固にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ
断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用するこ
とができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製が
可能となる。その一つの例として、本発明によって作製
されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブ
リダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固
定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片
を感度よく検出することができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＺ (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B033 NA45 NB04 NB13 NB15 NB25 NB34 NB36 NC03 ND05 ND08 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR56 QR84 QS03 QS34 QS39 QX02

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 環状の酸無水物構造を有するポリマーを
   表面に担持した固相担体上に、末端部にアミノ基を有す
   るＤＮＡ断片を含有する水性液体を点着すること特徴と
   するＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
2. 【請求項２】 環状の酸無水物構造を有するポリマーが
   無水マレイン酸を重合成分として得られたものであるこ
   とを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体
   表面への固定方法。
3. 【請求項３】 カルボキシル基を有するモノマーを構成
   成分とするポリマーを表面に担持した固相担体を脱水剤
   により環状の酸無水物とし、ついで、末端部にアミノ基
   を有するＤＮＡ断片を含有する水性液体を点着すること
   を特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
4. 【請求項４】 水性液体の点着後、８０乃至１８０℃の
   範囲で加熱を行なうことを特徴する請求項１乃至３に記
   載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
5. 【請求項５】 請求項１乃至４のうちのいずれかの項に
   記載の方法によって得られたＤＮＡチップ。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
7. 【請求項７】 請求項５に記載のＤＮＡチップの表面
   に、導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料
   とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試
   料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれた
   インターカレータの導電性基を介して流れる電流を電気
   化学的に検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮ
   Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。