KR20080100461A - 집단-규모의 ηｌａ형 분석 및 이의 용도 - Google Patents

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마이클 이. 호건
크리슈나 자야라만
라울 미트라
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Abstract

본 발명은 필드 환경에서 실시간의 집단-규모의 HLA 유전자형 분석 및/또는 대립 유전자형 분석(allelotyping)을 위한 휴대용 시스템 및 이러한 집단-규모의 HLA 유전자형 분석 방법을 제공한다. 상기 시스템의 개별적 성분은 휴대가능하고, 필드 환경에서 수행가능함으로써, 고속 처리량의 실시간 유전자형 분석 또는 대립 유전자형 분석을 제공한다. HLA 유전자-특이적 프라이머 및 HLA 대립 유전자-특이적 또는 단일 누클레오티드 다형성-특이적 하이브리드화 프로브가 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 하이브리드화 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. HLA 유전자-특이적 프라이머 및 마이크로어레이를 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
유전자형 분석, 휴대용 시스템

Description

집단-규모의 ΗＬＡ형 분석 및 이의 용도 {POPULATION SCALE HLA-TYPING AND USES THEREOF}
본 출원은 2006년 2월 27일에 출원되고 현재 포기된 미국 가출원번호 제60/777,078호의 이익을 청구한다.
본 발명은 일반적으로, 마이크로어레이(microarray) 기술 및 집단 유전자형 분석의 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 필드(field) 환경에서 실시간의 고속 처리량의 집단-규모 HLA 유전자형 분석을 위한 휴대용 시스템 및 이의 방법에 관한 것이다.
생물 테러리즘 및 군대의 관심은 국토방위부(the Department of Homeland Defense)가 매우 빠르고, 융통성이 있고, 고용량의 백신 개발 방법을 대량으로 운영하도록 하는 것이다. 최근 연구에서는 기본 면역학이 예측한 것을 확인하기 시작하였으며, 즉 대량으로 노출된 집단에서, 감염에 대한 개체 반응 및 예방접종에 대한 개체 반응은 HLA형의 함수로서 크기 다양할 수 있다(1-2). 그러나, 몇 가지의 이러한 연구들만이 최근에 수행되었는데, 이는 부분적으로 HLA형 분석이 감염성 질환의 유행 병학 또는 백신 개발의 임상학적 유행 병학의 일부로서의 수행하기에 너무 비싸기 때문이다. 더욱이, 국토방위의 관점으로부터, HLA형과 감염증 또는 백신 반응 사이의 관계의 완전한 지식이 알려져 있고, "개별화된" 백신이 HLA형을 기초로 하여 이용가능하여도, HLA형 분석에 대한 현재 기술은 빠른 필드 반응 능력을 가지지 않고 너무 비싸고, 집단-규모의 비상시의 상황에서 수행되기에 너무 복잡하다.
병원체에 대한 인간 면역학적 반응 및 예방접종은 HLA 유전자좌에 의존적이다. 병원체에 대한 반응은 HLA 유전자좌에 의해 엔코팅된 다형성 세포 표면 당단백질의 두 개의 별도의 클래스에 기인한다 (3). HLA 클래스 I 분자는 박테리아 또는 바이러스에 의한 감염증에 의해 세포질에 존재하는 내인성 항원을 식별하고, 감염된 세포를 사멸시키는 CD8+ 세포독성 T 림프구로 제시된다. HLA 클래스 II 분자는 또한 침습 병원체에 대한 면역 반응을 초래하는 CD4+ 헬퍼(helper) T 세포에 대한 항원-제시 세포의 표면 상에 외인적으로 유도된 에피토프를 나타냄으로써 감염된 세포를 태그화한다. 에피토프-HLA-결합 상호작용에 대한 특이성의 다양한 범위는 HLA 유전자좌에서의 광범위한 다형성에 의존적이다.
HLA 유전자좌에서의 다형성은 재조합, 유전자 전환 및 돌연변이 및 병원체 및 감염성 질환에 대한 반응에서의 이들의 자연 선택에 의해 야기된다(4). 이에 따라, HLA 대립 유전자의 다양성은 집단-규모에서 감염성 및 병원성 제제에 대해 반응하고 이에 저항하는 인간의 능력을 향상시킨다. HLA 다형성은 여러 질환과 관련이 있으며 가장 최근에는 AIDS 바이러스에 대한 내성과 관련이 있다(5). 대부분의 바이러스 백신이 낮은 용량의 바이러스 표면 항원을 지니기 때문에, 이러한 예방접종에 대해 반응하는 이의 능력은 HLA 유전자좌에서의 다형성에 의존적이다. 예를 들어, 일배체형 HLA-B8, SCO1, DR3에는 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 반응 유전자가 결핍되어 있다(6). 예방접종을 발달시키기 위하여, HLA형을 발견하고 공지된 일배체형의 세트에 대한 백신 반응을 분류하는 것이 매우 중요하다.
HLA형 분석에 대한 통상적인 혈청학적 방법은 단일 누클레오티드 다형성에 기인한 구조적 차이를 식별하기 위한 대립 유전자-특이적 혈청의 이용가능성으로 제한된다(7). 통상적인 방법에서 사용되는 항체는 HLA 표면에 대해 특이적이다. 그러나, 단일 또는 다중 누클레오티드 다형성에 기인한 HLA 중쇄의 펩티드 결합 홈의 구조적 차이는 항체-기재 방법을 이용하여 용이하게 식별되지 않을 수 있다.
핵산 기재 방법은 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브 (SSOP) 또는 서열 특이적 프라이머 (SSP)를 사용한다. 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브 방법은 다형성을 식별하기 위해 개개의 DNA 샘플 또는 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브를 사용함을 기초로 한다(8). 현존하는 프라이머 고안 방법은 프라이머를 식별하기 위한 간단한 BLAST 유사 정렬에 의존적이고, 독특한 프라이머 세트를 골라내는 것이 항상 잘 수행되지 않는다. 유전자좌에 대해 특이적으로 식별된 개개 프라이머는 전체 유전자좌를 증폭시키기 위해 사용되며 특정 프로브는 다형성을 식별하기 위해 사용된다.
해상도가 낮거나 중간정도인 다단계 방법이 존재하며, 고해상도는 특정 프로브로 추가 프로빙(probing)함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법의 두 가지 버젼으로는 DNA 샘플이 막 지지체 상에 고정되고 표지된 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브가 고정된 샘플에서 다형성을 식별하기 위해 하이브리드화되는 도트 블 롯(dot bolt), 또는 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브가 고정되고 표지된 DNA 샘플이 다형성을 식별하기 위하여 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브에 첨가되는 역(reverse) 도트 블롯이 있다. 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브의 고정화는 여러 다형성의 시험을 허용하며, 여기서 DNA 샘플의 고정화는 특정 다형성에 대한 수개의 샘플의 시험을 허용한다.
서열 특이적 프라이머 방법은 다형성 각각에 대해 표적화된 특정 프라이머를 사용한다(9). 유전자좌의 분석을 위해 요구되는 프라이머의 수는 특정 유전자좌에서의 다형성 수에 의존적이다. 통상적으로, HLA형 분석을 완결하기 위해 많은 수의 PCR 반응이 필요하다. 이는 다형성의 존재 또는 부재가 생성물의 증폭을 초래하는 PCR 기재 방법이다. 통상적인 젤 전기영동을 이용하여, PCR 생성물의 존재 또는 부재가 확인될 수 있다. PCR 반응은 보존된 영역을 증폭시키는 양성 대조군 프라이머를 함유한다.
다른 방법은 구조 기재 방법이거나, 서열분석 방법을 사용한다. 다형성을 식별하기 위한 구조-기재 방법은 비-변성 젤에서 불일치된 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 함유 루핑 아웃(looped out) 영역이 임의의 불일치된 루프를 지니지 않는 헤테로듀플렉스와 상이하게 이동된다는 사실을 기초로 한다(10). DNA 서열분석의 자동화와 관련하여, HLA형 분석은 서열분석 기계에서 수행된다(11-12). 상기 방법은 다형성의 수 및 엑손의 수에 의존적이며, 예를 들어, HLA 클래스 II에 대해, 다형성은 수백 개의 염기를 갖는 엑손 2에 존재한다. 반대로, 클래스 I형 분석에 대해, 다형성은 수개의 엑손이 서열분석되는 것을 요구하고, 이에 따라 더 욱 복잡하게 되고 오차를 초래할 수 있다.
HLA형에서의 단일 누클레오티드 다형성은 대립 유전자의 수개의 서브타입에 의해 공유된다. 이는 통상적인 방법이 사용될 때 불분명성을 초래할 수 있다. 교차 하이브리드화에 기인한 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 다형성의 지식과 결합된 프라이머와 프로브의 조합은 필수적이다. 이에 따라, 간단한 SSOP 또는 서열 특이적 프라이머 하이브리드화는 HLA형의 지정을 초래하지 않을 수 있다.
HLA형의 정확한 지정은 이후 수개의 서브타입에 대한 프로브의 조합 패턴을 통해 조심스럽게 이동됨을 기초로 한다. PCR 기재 방법 또는 도트 블롯 방법은 많은 양의 샘플을 요구하며, 매우 고가가 되게 한다. 따라서, 보다 적은 양의 샘플을 요구하고 경제적인 소형화된 기술이 필요하다. 패턴 인식 소프트웨어와 결합된 마이크로어레이(13)는 HLA형을 명확하게 식별하기 위한 2-차원 바코드를 형성시키기 위해 이러한 플랫폼을 제공한다.
마이크로어레이는 HLA형 분석에서 고속-처리량의 요구에 대해 이상적으로 적합하다. 이는 소형화의 편리성 및 단일 실험에서 수천 개의 하이브리드화를 수행하는 능력을 제공한다. 이는 마이크로어레이의 특성과 매우 유사하고, 이들의 독특한 형태는 필드 사용에 이상적으로 적합하다. 이러한 잠재적인 이익에도 불구하고, 마이크로어레이는 HLA형 분석에서 필드 사용을 위해 완전하지 않다. 비용, 질 및 휴대가능성이 제한 인자이며, 제작 방법에 의존적이다.
시판되는 마이크로어레이는 특정 염료를 사용하며, 이에 따라 특정 타입의 영상 장치가 사용되어야 한다. 이상적으로, 영상 장치는 임의의 염료를 영상화할 수 있다. 또한, 시판되는 영상 장치는 휴대가능하지 않다. 부가적으로, 현존하는 분석 패키지는 동일하게 사용하기에 불편하며, 패턴을 식별하기 위해 일부 수작업 개입을 요구한다.
대립 유전자 변형체의 검출을 위한 최초의 올리고누클레오티드 마이크로어레이는 1989년에 보고되었다(14). 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브는 나일론 막 상에 스폿팅되고(spotted) DNA 샘플의 비오티닐화된 CR 생성물에 대해 하이브리드화된다. 대립 유전자의 유전자형은 스폿의 색 강도를 이용하여 식별된다. 더욱 최근에는 다른 연구가 클래스 II 다형성의 대립 유전자 변형을 식별하기 위해 130개의 프로브 요소 DNA 마이크로어레이의 사용을 보고하였다(15). 고해상도 HLA형 분석에 대한 매질을 수득하기 위한 마이크로어레이의 적용가능성은 명백하지만, 이의 현존하는 형태에서의 기술은 기술적 및 경제적 제한 모두를 포함하는 여러 제한 또한 갖게 된다.
추가적으로, 통상적인 방법, 예를 들어 서열 특이적 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여, DNA 샘플은 이중 가닥이 되며, 프로브는 단일 가닥이 된다. 이중 가닥 생성물의 존재는 하이브리드화의 효율을 감소시킨다. T7 또는 T3 중합효소 서열은 시험관 내 전사에 의해 단일-가닥 표적 분자를 형성시키기 위해 사용된다. RNA를 표지시키는 것은 어려우며, 이에 따라 증폭 방법은 모든 생성물이 표지될 수 있도록 비오틴 또는 형광 염료를 지닌 말단-표지된 프라이머를 사용한다. 비오틴의 존재는 증폭 과정을 간섭할 수 있다.
더욱이, 집단-규모의 HLA형 분석을 수행하기 위한 중대한 제한은 샘플의 수 거이다. 샘플 수거의 통상적인 방법은 침습 과정에 의한 10 내지 15 ml의 혈액 채취에 초점을 맞춘다. 이러한 수거 형태는 분해, 오염 및 부정확한 결과를 초래한다. 이러한 방식으로 수거된 혈액 샘플은 HLA형 분석의 비용 및 재료 흐름의 관리(logistical) 복잡성을 상당히 증가시키는 대규모 조작, 저장 및 이송 문제를 요구할 것이다. 혈액 채취 방법과 관련된 조작 및 수거의 문제점 이외에, 분리된 DNA의 저장은 문제점을 갖는다. 이에 따라, 집단-규모의 HLA형 분석을 위한 임의의 기술은 샘플 수거 및 추출된 DNA의 보관을 위한 대안적인 방법을 가져야 한다.
당해 분야에서는 집단-규모의 유전자형 분석을 위한 시스템 및 방법의 개선을 필요로 한다. 상세하게는, 종래 기술은 큰 집단의 고속-반응 HLA형 분석을 위한 향상된 유전체 분석 방법을 이용하는 저가이고, 대량생산되고, 필드에서 사용되도록(field-ready) 휴대가능한 마이크로어레이 시스템에 있어서 불충분하다. 본 발명은 이러한 오랜 동안의 필요성 및 당해 분야에서의 요구를 충족시킨다.
발명의 개요
본 발명은 HLA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머에 관한 것이다. HLA 유전자는 HLA A, B 또는 DRB1 또는 이들의 엑손(exon)일 수 있다. 프라이머는 SEQ ID NO:14-37에 나타낸 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HLA 유전자에서 단일 누클레오티드 다형성 (SNP)을 검출하기 위한 하이브리드화 프로브에 관한 것이다. 하이브리드화 프로브는 SNP 및 5' 및 3' 플랭킹 서열을 함유한 영역에 대해 상보적인 약 9-15머(mer) 올리고누클레오티드를 포함한다. SNP는 HLA-A 엑손 2 또는 엑손 3 또는 HLA-B 엑손 2 또는 엑손 3에 위치될 수 있다. 프로브는 SEQ ID NO:48-291에 나타낸 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 양이온 표면을 지닌 기판; 및 이에 흡착되는 본원에 기술된 하나 이상의 하이브리드화 프로브를 포함하는 단층(monolayer)을 포함하는 마이크로어레이 장치에 관한 것이다. 관련 발명에서, 마이크로어레이는 본원에 기술된 하이브리드화 프로브와 동시-흡착된 올리고-티미딘을 포함할 수 있다. 또 다른 관련 발명에서, 올리고-티미딘은 이에 부착된 형광 염료를 포함할 수 있다. 또 다른 관련 발명에서, 마이크로어레이 장치는 캡핑제(capping agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 HLA 유전자를 증폭시키기 위한 유전자-특이적 프라이머 및 마이크로어레이 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다. 관련된 발명에서, 키트는 추가로 PCR 반응을 위한 완충용액 및 중합효소 또는 형광 염료 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 필드 환경에서 실시간의 고속 처리량의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석(allelotyping)을 위한 시스템에 관한 것이다. 이러한 시스템은 본원에 기재된 마이크로어레이 장치, 집단을 포함하는 개체로부터 DNA 샘플을 수거하고 정제하기 위한 수단, 수거된 DNA로부터 하나 이상의 관심 HLA 유전자의 cRNA 표적 앰플리콘을 PCR 생성시키기 위한 수단, 및 각각의 개별적인 관심 HLA 유전자에 대해 HAL 대립 유전자형을 지정하기 위한 수단을 포함하며; 여기서 개개의 수단 및 장치를 포함하는 상기 시스템은 필드 환경 내에서 휴대가능하고 실시간으로 작동가능하다. 본원에 기술된 프라이머는 cRNA 표적 앰플리콘을 생성시키기에 유용하다.
본 발명은 또한 필드 환경에서 실시간의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석을 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 집단의 하나 이상의 일원으로부터 DNA를 수거하고, 분석을 위한 DNA를 정제하고, 본원에 기술된 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 DNA를 포함한 관심 HLA 유전자로부터 표적 앰플리콘을 생성시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 하이브리드화 프로브를 포함하는 마이크로어레이는 표적과 접촉되고, 접촉 후 형성된 하이브리드화 패턴이 영상화되며, 여기서 각 HLA 대립 유전자형은 이와 관련된 패턴을 갖는다. 본 발명은 지정된 대립 유전자형을 기초로 하여 각 개체에 대한 생물학적 제제 또는 무기에 의한 감염의 위험을 평가하는 것을 추가로 포함하는 관련 방법에 관한 것이다. 본 발명은 각 개체에 의해 생물학적 제제 또는 무기에 대항하는 특정 백신에 대한 반응을 평가하는 것을 추가로 포함하는 다른 관련 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, HLA 유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 제공된다. 이러한 구체예에서, HLA 유전자는 HLA A, B 또는 DRB1 또는 이들의 엑손일 수 있다.
이러한 구체예의 한 양태에서, HLA-A 프라이머는 SEQ ID NO:14-15에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-A 엑손 2 프라이머는 SEQ ID NO:20-21에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-A 엑손 3 프라이머는 SEQ ID NO:22-26에 나타낸 서열을 지닐 수 있다. 또 다른 양태에서, HLA-B 프라이머는 SEQ ID NO:16-19에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-B 엑손 2 프라이머는 SEQ ID NO:27-28에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-B 엑손 3 프라이머는 SEQ ID NO:29-31에 나타낸 서열을 지닐 수 있다. 또 다른 양태에서, HLA-DRB1 프라이머는 SEQ ID NO:32-37에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-B 엑손 2 프라이머는 SEQ ID NO:38-47에 나타낸 서열을 지닐 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 단일 누클레오티드 다형성 (SNP); 및 5' 및 3' 플랭킹 서열을 함유한 영역에 대해 상보적인 약 9-15머 올리고누클레오티드를 포함하는 HLA 유전자에서 SNP를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브가 제공된다.
이러한 구체예의 모든 양태에서, 플랭킹 서열은 올리고-티미딘 또는 올리고-티미딘-유사 다중음이온 폴리머일 수 있다. 또한, 모든 양태에서, SNP는 HLA-A 엑손 2 또는 엑손 3, HLA-B 엑손 2 또는 엑손 3 또는 HLA-DRB1 엑손 2에 위치할 수 있다. 한 특정 양태에서, HLA-A 엑손 2 프로브는 SEQ ID NO:48-99에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-A 엑손 3 프로브는 SEQ ID NO:100-155에 나타낸 서열을 지닐 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, HLA-A 엑손 2 프로브는 SEQ ID NO:156-239에 나타낸 서열을 지닐 수 있으며, HLA-A 엑손 3 프로브는 SEQ ID NO:240-291에 나타낸 서열을 지닐 수 있다.
또 다른 구체예에서, 양이온 표면을 지닌 기판; 및 이에 흡착되는 상기 기술된 하나 이상의 하이브리드화 프로브를 포함하는 단층을 포함하는, HLA 유전자를 대립 유전자형 분석하기 위한 마이크로어레이 장치가 제공된다. 또한 이러한 구체예에서, 마이크로어레이는 하이브리드화 프로브와 동시 흡착된 올리고-티미딘을 포함할 수 있다. 올리고-티미딘은 약 20개 내지 약 40개의 티미딘을 지닐 수 있다. 또한 올리고-티미딘은 이에 연결된 형광 염료를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 마이크로어레이 장치는 캡핑제를 포함할 수 있다. 모든 구체예에서, 양이온 표면은 아미노실란, 쿼니디늄(quanidinium), 산화주석, 산화알루미늄 또는 산화지르코늄 또는 다른 동등하게 하전된 부분을 포함할 수 있다. 또한, 모든 구체예에서, 기판은 유리, 플라스틱 또는 금속일 수 있다.
관련된 구체예에서, 본 발명은 HLA 유전자를 증폭시키기 위한 유전자-특이적 프라이머; 및 상술된 마이크로어레이 장치를 포함하는, 집단-규모의 HLA 유전자형 분석을 위한 키트를 제공한다. 또한 이러한 구체예에, 키트는 PCR 반응을 위한 완충용액 및 중합효소 또는 형광 염료 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 유전자 특이적 프라이머는 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지닐 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상술된 마이크로어레이 장치; 집단을 포함하는 개체로부터 DNA 샘플을 수거하고 정제하기 위한 수단; 수거된 DNA로부터 하나 이상의 관심 HLA 유전자의 DNA 표적 앰플리콘을 PCR 생성시키기 위한 수단; 및 각각의 개별적인 관심 HLA 유전자에 대해 HLA 대립 유전자형을 지정하기 위한 수단을 포함하는, 필드 환경에서 실시간의 고속 처리량의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 개개 수단 및 장치를 포함하는 상기 시스템은 휴대가능하고 필드 환경 내에서 실시간으로 작동가능하다.
이러한 구체예의 모든 양태에서, HLA 유전자는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DRB1일 수 있다. 또한, 모든 양태에서, 실시간의 고속 처리량의 대립 유전자형 분석은 작동되는 시스템 당 1 시간에 약 200개 내지 약 300개의 HLA 대립 유전자형일 수 있다. 이러한 구체예의 한 양태에서, DNA 샘플을 수거하기 위한 수단은 개체로부터 수거된 협측 세척 샘플, 협측 면봉법 샘플 또는 혈액 샘플을 수용하기에 적합한 용기를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 표적 앰플리콘을 생성시키기 위한 수단은 관심 HLA 유전자를 증폭시키기 위한 HLA 유전자-특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 유전자-특이적 프라이머의 예는 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지닌다. 또 다른 양태에서, 각 개체에 대해 HLA-대립 유전자형을 지정하기 위한 수단은 흡착되는 하이브리드화 프로브로의 표적의 하이브리드화 후 마이크로어레이 장치에 형성된 하이브리드화 패턴을 검출하기 위해 적합화된 영상화 장치; 및 HLA 대립 유전자형으로서 영상화된 하이브리드화 패턴을 인식하기 위해 적합화된 알고리즘의 세트를 포함하는 패턴 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 하이브리드화 프로브의 예는 SEQ ID NO:48-291에 나타낸 서열을 갖는다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 집단 중 하나 이상의 일원으로부터 DNA를 수거하고; 분석을 위한 DNA를 정제하고; 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 DNA를 포함하는 관심 HLA 유전자로부터 표적 앰플리콘을 생성시키고; 하이브리드화 프로브를 포함하는 상술된 마이크로어레이를 표적과 접촉시키고; 접촉 후 형성된 하이브리드화 패턴을 영상화시킴을 포함하여, 필드 환경에서 실시간의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석을 위한 방법이 제공되며, 여기서 각 HLA 대립 유전자형은 이와 관련된 패턴을 갖는다.
이러한 구체예에 추가로, 본 방법은 수거된 DNA를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 추가 구체예에서, 본 방법은 지정된 대립 유전자형을 기초로 한 각 개체에 대해 생물학 제제 또는 무기에 의한 감염의 위험을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 방법은 각 개체에 의한 생물학적 제제 또는 무기에 대항한 특정 백신에 대한 반응을 평가하는 것을 포함할 수 있다.
모든 구체예에서, DNA는 혈액으로부터, 협측 세척 또는 협측 면봉법으로 수거될 수 있다. 또한, 유전자-특이적 프라이머는 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지닐 수 있다. 또한, 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO:48-291에 나타낸 서열을 지닌다.
본원에서 사용되는 단수 용어는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 관련하여 사용될 때 청구의 범위(들)에서 사용되는 단수 단어들은 하나 또는 하나를 초과함을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 "또 다른" 또는 "다른"은 적어도 2개 이상을 의미할 수 있다.
단순하고, 휴대가능하고 필드-준비 환경에서 집단-규모의 HLA형 분석을 수행할 수 있는 인간 백혈구 항원(HLA) 칩 및 마이크로어레이 기술이 본원에 제공된다. HLA 칩은 인간 HLA-B 유전자형을 철저하게 분석하도록 고안된다. HLA 칩은 전체 인간 HLA 유전자좌를 분석하도록 고안될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 마이크로어레이 기술은 5 내지 10 배 정도로 낮은 비용의 휴대가능한 필드 실험을 이용하여 예를 들어 주당 100,000 개체 (그러나, 이에 제한되지 않음)의 대량 노출된 집단의 HLA형에 대해 효과적이다.
또한, 집단 형 분석을 통해 획득된 데이타는 HLA 수준에서 생물학적 무기에 의한 감염의 개별적인 위험을 예상하거나, 동일함 감염제에 대한 예방접종의 개인적 반응을 예상하기 위해 실시간으로 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 추가적으로, HLA 칩의 변형체는 제 3 세계 환경에서 필드에서 사용되는 신생아 스크리닝 또는 세계 전장에서 사용되는(battlefield-ready) 개인 식별을 제공하도록 사용될 수 있다. 더욱이, HLA형 분석 기술은 재해 기간동안 또는 이후에 시민 식별을 위해 또는 법의학 분야에서 사용될 수 있다. 따라서, 집단-규모의 HLA형 분석은 군사, 반-생화학테러 또는 유행 병학적 환경에 적용된다.
마이크로어레이 데이타의 실시간 해석은 필드 적용 환경에서 비전문가에 의해 이루질 수 있다. 이는 저가이고, 작고, 매우 휴대가능한 마이크로어레이 영상 장치를 통해 필드에서 수행될 수 있다. 운송 수단에 용이하게 휴대가능한 장치를 이용한 완전한 HLA 분석은 4 시간 미만의, 샘플 수거에서 최종 HLA 식별까지의 전체 공정 시간을 가질 수 있다. 이러한 작업 주기는 4 시간 마다 개인 당 약 20개의 샘플의 수작업 처리량으로 유지될 수 있다. 최소 샘플 조작 자동화와 관련하여, 처리량은 대략 이동성의 필드-사용 환경에서 워크스테이션당 시간당 약 200 내지 약 300개의 완전한 HLA 유전자형의 안정 상태까지 확대될 수 있다.
더욱이, 페턴 인식 소프트웨어, 예를 들어 이미지어낼라이저(16)는 이미지 분석 및 마이크로어레이 형광 패턴의 HLA 대립 유전자형으로의 전환에서 바코드와 같은 간소성을 제공한다. 패턴 인식 소프트웨어를 포함하는 알고리즘은 통상적이고 신규한 통계학적 및 데이타 마이닝(mining) 방법, 예를 들어 유클리드 및 상호 정보 기반 거리, 및 푸리어(Fourier) 및 웨이브렛(wavelet) 변형을 사용하지만, 이에 제한되지 않는다. 마이크로어레이 패턴 인식 소프트웨어는 하이브리드화의 패턴을 인식하고 하이브리드화의 가능한 퍼지(fuzzy) 패턴을 기초로 하여 유전체/종이 존재하는 지의 정보를 자동적으로 추출하는데 효과적이다. 이후 이러한 정보는 예상되는 스폿의 패턴을 기초로 하여 각 HLA 서브타입에 대한 패턴의 존재하는 데이타베이스와 비교된다. 이러한 시스템은 랩톱 컴퓨터에서 작동할 수 있는 사용하기 쉬운 GUI 인터페이스를 포함할 수 있다. "캠코더" 크기의 휴대가능한 마이크로어레이 영상 장치는 매우 휴대가능한 데이타 수거 환경으로 작업하기에 적합하다.
마이크로어레이 고안 및 제작 또는 미세제작은 표면에 올리고뉴클레오티드 프로브를 고정시키기 위해, 프로브 말단의 화학적 개질을 요구하지 않으며, 즉 링커를 요구하지 않는다(17). 올리고누클레오티드에 의한 표면 포화는 공유결합을 위해 요구되는 올리고누클레오티드의 농도의 분획으로 발생한다. 따라서, 표면에 전달된 모든 올리고누클레오티드는 알짜 포지티브 전하를 지니고 추가적으로 소수성 또는 친수성일 수 있는 단층 표면과의 흡착성 결합에 의해 고정된다. 스폿의 모양 및 형태학은 마이크로어레이어(microarrayer)에 의해 분산된 점적의 초기 접촉에 따른다. 공유결합이 형성되지 않기 때문에, 스폿 대 스폿 편차는 최소가 된다.
본 발명은 표적 내에서 단일 누클레오티드 다형성을 구별하기 위해 약 9 내지 약 15머의 짧은 올리고누클레오티드 프로브를 제공한다. 이러한 프로브는 올리고-티미딘 (올리고-T) 서열에 플랭킹(flanking)된다. 바람직하게는, 플랭킹된 프로브는 총 약 30개의 누클레오티드를 포함한다. 또한 올리고-T의 유사체가 플랭킹 서열로서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 제한하지 않는 한, 올리고-티미딘-유사 다중음이온 폴리머 플랭킹 서열, 예를 들어 폴리술포네이트는 올리고-T 플랭킹 서열을 대체할 수 있다. 프로브는 모두 임상적으로 관련된 HLA 서브타입에 대해 고안되는 것으로 고려된다. IMGT/HLA 서열 데이타베이스에서의 대립 유전자의 현존하는 수는 HLA 클래스 I에 대해 977개의 대립 유전자며, HLA 클래스 II에 대해 652개의 대립 유전자다(18). 본원에서 제공된 유용한 프로브는 HLA-A 엑손 2 (SEQ ID NO:48-99) 및 엑손 3 (SEQ ID NO:100-155), HLA-B 엑손 2 (SEQ ID NO:156-239) 및 엑손 3 (SEQ ID NO:240-291) 및 HLA-DRB1 엑손 2에서 구별하기에 효과적이다.
본원에서 사용되는 마이크로어레이의 제작은 포지티브 또는 양이온 표면에 짧은 올리고누클레오티드 프로브의 흡착성 비공유결합을 이용하는 매우 단순하고 재현가능한 방법(17)을 사용한다. 예를 들어, 양이온 표면은 아민 작용기, 예를 들어 아미노실란(이에 제한되지 않음)을 포함하거나 이로 코팅될 수 있거나, 구아니디늄 기를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 표면은 양이온 금속 또는 금속 산화물, 예를 들어, 산화주석, 산화지르코늄 또는 산화알루미늄 또는 알짜 포지티브 전하를 지니거나 다른 동등하게 하전된 부분을 지닌 금속 산화물 등을 포함할 수 있다. 이러한 산화물 코팅은 실제 미립자일 수 있거나 매끄러울 수 있고, 유리, 플라스틱 또는 금속 기판 상에 배치된다.
일반적으로, 본 방법은 기판의 양이온성 또는 알짜 포지티브로 하전된 표면 상에 수중에 용해된 올리고-T 플랭킹된 올리고누클레오티드 프로브의 증착 또는 프린팅을 요구한다. 대안적으로, 올리고-T 플랭킹된 프로브는 제 2의 일정한 올리고누클레오티드 프로브로 동시-프린팅될 수 있다. 이러한 프로브는 인쇄의 모든 예에서 동일하며, 약 T20 내지 약 T40 염기를 갖는 올리고-T 서열을 포함할 수 있다. 올리고-T 서열은 이에 연결된 염료를 포함할 수 있다. 염료의 예는 Cy-5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
올리고-T 서열은 HLA형 분석을 위한 인간 DNA에 대한 핵산 하이브리드화와 관련하여 불활성인 것으로 고려된다. 올리고-T는 핵산 프로브가 염료에 커플링된 올리고 T의 직접 검출 또는 올리고-T의 왓슨-크릭 상보적인 염료-표지된 올리고-아데닌(올리고-A)에 대한 올리고-T 하이브리드화에 의해 프린팅되는 지를 식별하기 위한 마커로서 도입된다. 올리고-T의 포함은 분석을 위한 하이브리드화 이미지 데이타를 지향하는 능력을 개선시키고 마이크로어레이 제작 동안 품질 조절을 위해 유용하다.
또한, 아민 코팅된 표면 상에, 프로브 증착 이후 건조 및 잔류 표면 전하 또는 흡착된 프로브 분자와의 직접 결합과 관련되지 않는 부분의 캡핑이 후속될 수 있다. 예를 들어, 및 당해 분야에 공지되고 표준화된 것으로서, 아미노실란 표면의 캡핑은 캡핑제, 예를 들어 계면활성제 나트륨 도데실술페이트와 미사용된 아민기를 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 대안적으로는, 세라믹 또는 금속 산화물 표면에 대해, 캡핑은 표면을 붕산, 플루오라이드 이온 또는 포스페이트와 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 건조 및 캡핑 후에, 결합된 올리고누클레오티드는 고농도 염, 5M NaCl 및 높은 pH 처리를 포함한 표준 하이브리드화 및 세척 조건하에서 표면으로부터 제거되지 않을 수 있다. 따라서, 제작된 마이크로어레이 내에, 심지어 흡착된 올리고누클레오티드가 표면에 다중 접촉에 의해 결합되고, 이에 따라 이의 동족 표적과 함께 완전한 이중 헬릭스를 형성하기 위해 요구되는 배열적 자유도를 잃을 수 있지만, 이러한 흡착성 커플링, 이후 표면 상에 과량의 전하를 중화시키기 위한 적절한 캡핑에 의한 생성물은 표준용액 상태 하이브리드화 반응에서 나타내는 바와 같이 높은 듀플렉스(duplex) 형성 또는 단일점에서 표면에 공유적으로 연결된 프로브에 대한 표면 하이브리드화를 위한 특이성을 나타낸다.
HLA 유전자좌에 대한 PCR 프라이머는 적당한 시간, 예를 들어 수분 내에 임의의 유전체에서 짧은 서열, 즉 n=5-25+ 누클레오티드 길이의 올리고누클레오티드 서열의 n-머의 발생 횟수를 계산하기 위한 신규한 알고리즘을 사용하여 고안된다(19-20). 이러한 알고리즘은 250개 초과의 미생물, 바이러스 및 인간을 포함한 다세포 유기체의 유전체에서 모든 가능한 "n-머"의 존재의 비교 통계학적 분석을 수행하기 위해 사용된다. 결과는 모든 유전체에서 상이한 n-머에 대한 존재/부재 분포의 상당한 유사성을 나타낸다. 모든 관심 유전체에서 n-머의 존재/부재 분포(단, 조건 M<<4n으로 고정, 여기서 M은 전체 유전체 서열 길이임)는 거의 무작위적으로 처리될 수 있는 것으로 암시된다. 하나 이상의 유전체에서 짧은 서열의 존재/부재의 대량의 계산 분석은 2002년 5월 이전에 모두 공개된 미생물 및 바이러스 유전체에 대해 수행되고, 2003년 5월까지 이용가능한 1600+ 유전체에 대해 반복되었다. 이는 제공된 유전체에서 반복되지 않는 유일한 서열을 형성한다.
이러한 신규한 알고리즘 및 데이타 구조는 1600+ 완전한 유전체의 수거과 함께, PCR 프라이머 고안 공정의 질을 현저하게 개선시킬 수 있게 한다. 이러한 알고리즘을 이용하여, 한번 정확하게 나타나고 적어도 2 또는 3개의 미스매치에 의해 공지된 SNP를 포함하는 전체 인간 유전체에서 나머지 n-머와 상이한 프라이머를 발견할 수 있다. 더욱이, 일부 박테리아/바이러스 유전체에 존재하는 프라이머는 배제된다. 이러한 대량의 비슷한 프라이머 고안은 집단-규모 DNA 공급원으로서 협측 세척물을 고려할 때 이러한 샘플이 50% 이하의 일부 다른 오염물을 함유할 수 있음에 특히 중요하다. 이러한 방법의 효능은 본원에 기재된 실시예에서, PCR/마이크로어레이에 보고된 프라이머 세트(15)가 또한 수개의 다른 염색체를 프라이밍(priming)하는 것으로 입증된다.
따라서, 본 발명은 HLA 클래스 I 및 클래스 II 유전자좌를 증폭시키기에 효과적인 프라이머 또는 프라이머 쌍을 제공한다. 예를 들어, 1차 PCR 반응에 대해 SEQ ID NO:14-15를 지닌 반응 프라이머는 클래스 I HLA-A 유전자좌를 증폭시키기에 유용하며, SEQ ID NO:16-19를 지닌 프라이머는 HLA-B 유전자좌를 증폭시키기에 유용하다. 2차 PCR 반응에서, HLA-A 엑손 2 및 3은 SEQ ID NO:20-21 및 SEQ ID NO:22-26 각각과 함께 증폭될 수 있다. HLA-B 엑소 2 및 3은 SEQ ID NO:27-28 및 SEQ ID NO:29-31 각각과 함께 증폭될 수 있다. 또한, 클래스 II HLA-DRB1 유전자좌는 SEQ ID NO:32-37을 지닌 프라이머를 사용하여 1차 PCR 반응에서 증폭될 수 있다. 2차 PCR은 SEQ ID NO:38-47을 지닌 프라이머를 이용하여 HLA-DRB1 엑손 2를 증폭시키기 위해 수행된다. 이러한 프라이머는 모든 대립 유전자를 포함하는 유전자를 증폭시키는데 효과적이며, 즉 프라이머는 유전자 특이적이고 대립 유전자 블라인드(blind)이다. 전체 증폭된 유전자 내에 관심 대립 유전자 미세 구조는 본원에서 제공된 바와 같은 마이크로어레이에서의 프로브에 대한 PCR 생성물의 하이브리드화에 의해 결정된다.
DNA 샘플은 건조된 혈액의 스폿으로부터, 협측 세척물 DNA로부터, 단일한 10 ㎕의 손가락 단자 검사, 또는 파라핀에 엠베딩(embedding)된 얇은 섹션으로부터의 DNA로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, DNA 샘플은 "구강세척" 방법 또는 피츠코 다크론(Fitzco Dacron) 면봉 상에 수거된 협측 면봉법 샘플에 의해 수거된 협측 DNA 샘플이다(21). 샘플로부터 추출된 DNA는 FTA 페이퍼 (GenVault, Carlsbad, CA) 상에 저장되거나 보관될 수 있다. 처리된 FTA 페이퍼 상에 샘플의 고정화시키는 이러한 방법은 분해 없이 DNA의 저장 및 이후 완전화 회수를 위해 제공되고 PCR 반응에 대해 적합하다.
본원에서 사용되는 짧은 올리고누클레오티드 프로브에 대한 표적은 증폭된 DNA 샘플로부터 전사된 단일가닥 DNA 또는 변성된 이중 가닥 PCR 생성물이다. 본원에 기술된 증폭 방법은 표지된 dsDNA PCR 생성물을 형성시킨다. DNA는 하나의 단순한 반응에서 개질된 PCR 프라이머 또는 시스-백금 콘주게이트된 염료를 이용하여 화학적으로 직접 표지될 수 있고(22) 조절된 알칼리 처리와 동시에 가수분해된다. 이는 하이브리드화를 위해 균일하게 표지된 DNA를 형성한다.
본 발명은 또한 DNA 샘플에서 정확하게 하나 또는 수개의 DNA 영역을 증폭시키기에 적합한 HLA 대립 유전자 정방향 및 역방향 프라이머의 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 키트를 제공한다. 임의적으로, 키트는 추가로 본원에 기술된 HLA 프로브를 갖는 하나 이상의 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 특히, 이러한 키트는 프라이머 쌍을 가질 수 있으며, 임의적으로 마이크로어레이는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DRB1 유전자좌를 하이브리드화시키고 SNP가 샘플 중에 존재하는지의 여부를 결정하고, 이에 따라 개체 또는 집단을 유전자형 분석하도록 고안된다. 더욱이, 이러한 키트는 PCR 반응을 위한 완충용액 및 중합효소를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명은 혈액, 협측 면봉법 또는 협측 세척물로부터 수거된 인간 DNA를 사용하여 유전자형 분석 및 대립 유전자형 분석을 위한 방법을 제공한다. 수거된 샘플은 즉시 사용될 수 있거나 건조 상태로 저장될 수 있다. 본원에 기술된 프라이머를 사용한 유전자 특이적 PCR은 대립 유전자 성향 없이 정제된 DNA에서, 관심 HLA 유전자, 예를 들어 HLA-A, -B 또는 -C 또는 HLA-DRB 1 또는 다른 HLA 유전자를 증폭시킨다. 임의의 특정 인간 DNA 샘플에서의 정확한 대립 유전자형은 마이크로어레이 상에서 서열-특이적 프로브에 대한 하이브리드화의 패턴을 측정함으로써 결정된다. 하이브리드화의 패턴은 대립 유전자를 결정한다.
하기 실시예(들)는 본 발명의 여러 구체예를 기술하기 위한 목적을 위하여 제공되는 것으로, 임의의 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 양태 또는 추가의 양태, 특징 및 장점은 하기의 발명의 바람직한 구체예의 설명으로부터 자명하게 될 것이다. 이러한 구체예들은 설명하기 위해 제공된 것이다.
상기 기재된 본 발명의 특징, 장점 및 목적, 뿐만 아니라 명확하게 되고, 달 성되고, 상세하게 이해될 수 있는 다른 것들, 더욱 구체적으로 상기 간단하게 요약된 본 발명의 설명은 첨부된 도면에 도시된 이의 특정 구체예를 참조로 할 수 있다. 이러한 도면은 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면들은 본 발명의 바람직한 구체예를 도시한 것으로서, 이에 따라 이의 범위를 제한하는 것으로 간주되진 않는다.
도 1A-1J는 표 2로부터의 다양한 프라이머 쌍을 이용한, HLA-A 및 HLA-B 유전자좌 (도 1A-1B), HLA-A 엑손 2 및 3 (도 1C-1D), HLA-B 엑손 2 및 3 (도 1E-1F), HLA-DRB1 유전자좌 (도 1G-1H), 및 HLA-DRB1 엑손 2 (도 1I-1J)의 증폭된 PCR 생성물의 젤을 나타낸 것이다. PCR 및 젤 조건은 실시예 2에 기술되어 있다.
도 2A-2B는 "구강세척" 법을 이용하여 수거되고 FTA 페이퍼 상에 저장된 5개의 협측 샘플의 DNA 추출물로부터 PCR을 이용하여 증폭된 558 bp의 앰플리콘(도 2A)이 온전하며, 혈액 샘플로부터 새로이 추출된 인간 DNA와 유사함(도 2B)을 입증한다. DNA는 추출되고 FTA 페이퍼 카드 상에 저장되고, 이후 젠볼트(GenVault) DNA 용리 생성물(GenVault, Carlsbad, CA)에 의해 용리되었다. PCR 증폭은 표준 방법을 이용하여 수행되었으며 아가로오스 젤 상에서 분석되었다. 각 레인은 10 ng의 출발 DNA 물질로부터 PCR 증폭된 생성물로 이루어져 있다. 558 bp의 앰플리콘을 생성시키기 위한 DNA 샘플을 지닌 양성 대조군은 레인 6에 도시되어 있으며, 앰플리콘이 첨가되지 않은 것은 레인 7에 도시되어 있다. 1 kb 크기의 마커는 레인 8에 도시되어 있다.
도 3A-3B는 UCLA 표준 및 지원자 샘플 앰플리콘의 젤이다. 도 3A는 피쯔코 다크론(Fitzco Dacron) 협측 면봉법을 이용하여 생성된 558 bp 앰플리콘의 젤을 도시한 것이다. 레인 2-4는 아르질라(Argylla) 프렙(prep) 입자를 이용하여 회수된 DNA를 도시한 것이며, 레인 5-7은 키아젠(Qiagen) 세척 컬럼을 이용하여 회수된 DNA를 도시한 것이다. 레인 1은 분자량 마커이다. 도 3B는 특정 프라이머 및 4 UCLA 참조 표준 59, 15, 20 및 45 및 두 명의 지원자(MH 및 BI)의 협측 면봉법으로부터 추출된 DNA를 이용한 PCR 생성물을 나타낸 젤이다. 피코그린(PicoGreen)(1/100th-1/200th의 샘플)에 의해 평가된 5 ng DNA 각각은 네스티드 PCR(nested PCR)에서 사용되어 HLA-B 엑손 2를 증폭시키고, 이에 따라 281 bp의 앰플리콘을 수득하였다. 젤은 레인 당 1/10th의 PCR 생성물을 갖는다. 두 개의 젤에서의 레인 1은 분자량 마커이다.
도 4A-4B는 마이크로어레이 영상에서 향상된 자동화 이미지 분석에서의 소프트웨어 패키지 이미지어낼라이저(ImageAnalyzer)의 유효성을 도시한 것이다. 도 4A는 부분적으로 손상된 마이크로어레이 이미지 섹션을 나타낸 것이다. 도 4B는 필터링, 백그라운드 보정 및 이미지어낼라이저에 의한 정확한 그리딩(gridding) 후에 도 4A에서와 동일한 이미지를 나타낸 것이다. 스폿 그리딩은 원으로 표시된다.
도 5A-5D는 K-ras 1, K-ras 2 및 K-ras 7에 대해 표 5에 도시된 포획 프로브를 이용한 하이브리드화의 결과를 도시한 마이크로어레이 페턴을 나타낸 것이다. 도 5A는 표적 야생형 및 돌연변이 2-5 모두의 하이브리드화를 나타낸 것이다. 도 5B는 동종 접합 야생형의 결합을 나타낸 것이며, 도 5C는 동종 접합 돌연변이 7의 결합을 나타낸 것이다. 도 5D는 야생형 및 돌연변이 2를 함유한 이종 접합 표적 샘플의 결합 프로필을 나타낸 것이다. 패턴 인식은 시각화된다.
도 6A-6B는 UCLA 참조 서열, 재서열분석 및 HLA-B 칩으로부터의 1차 성능 데이타의 비교를 나타낸 것이다. 회색 세포는 UCLA 대립 유전자형이다. 진한 색의 세포는 하나 또는 둘 모두의 대립 유전자에 대한 어래이 검정을 지시하는 것이며; '밑줄친' 세포는 어레이가 UCLA 대립 유전자형와 일치하지 않음을 나타내며, 이탤릭체의 세포는 서열분석이 UCLA 대립 유전자형과 일치하지 않음을 나타낸 것이다. 모든 다른 세포는 UCLA 대립 유전자형과 100% 일치 결과를 나타낸 것이다.
도 7A-7D는 UCLA 참조 샘플 72, 21, 27, 57 각각에 대한 HLA 마이크로어레이 이미지를 나타낸 것이며, 도 7E-7F는 두 명의 지원자 MD 및 BI 각각의 협측 면봉법으로부터의 DNA의 HLA 마이크로어레이 이미지를 나타낸 것이다. 도 7G는 코돈 9에 대한 상부 패널의 어레이 내에서 스폿 강도의 정량화를 도시한 것이다. 도 7G에서의 데이타는 6개의 클러스터로서 표시된다. 제 1의 4개 클러스터는 코돈 9에서 공지된 대립 유전자형의 UCLA 참조 샘플로부터의 하이브리드화 데이타에 해당한다. 각 클러스터 내에서, 두 개 세트의 프로브 타입, 즉 올리고-T 플랭킹 서열을 포함한 "긴 프로브" 및 중심에서의 서열 특이적 서열의 하나의 염기가 짧아진 "짧은 프로브"가, 특이성이 향상될 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해 시험되었다. 도 7H는 긴 프로브(플랭킹 세그먼트를 지님) 및 짧은 프로브(플랭킹 프로브를 지니지 않음)을 지닌 HLA-B 코돈 50에 대한 유사한 하이브리드화 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 스폿 크기를 결정하는 과정을 나타낸 것이다. P는 D≤R인 경우, 스 폿의 일부로 여겨지며, 여기서 D는 (A2+B2)의 제곱근이다.
도 9는 대립 유전자 콜링(calling)을 위한 결정 트리 기재 방법을 도시한 것이다. 왼쪽 화살표는 상기 다이아몬드에서의 조건이 참인 것을 지시하며, 오른쪽 화살표는 상기 다이아몬드의 조건이 거짓임을 지시한 것이다.
도 10은 PubMed 데이타베이스의 자동 검색에 의해 식별된 210개의 HLA 대립 유전자를 기술한 차트이다. 황색 음영은 대립 유전자가 UCLA 클래스 I 패널에 존재함을 나타낸 것이다. 녹색 음영은 UCLA 클래스 II 패널에 존재함을 나타낸 것이다. 오렌지색 음영은 대립 유전자가 높은 해상도 또는 낮은 비코딩 해상도로 UCLA 패널에 존재함을 나타낸 것이다. 청색 음영은 대립 유전자가 UCLA 패널에 형 분류되지 않은 것을 나타낸 것이다.
실시예 1
클래스 I 및 II HLA 유전자좌의 증폭을 위한 프라이머
SNP 특이적 프라이머의 고안을 위한 알고리즘의 확인
정방향 프라이머 5'GCTCCCACTCCATGAGGTAT3' (SEQ ID NO:1) 및 역방향 프라이머 5'ATACCTCATGGAGTGGGAGC3' (SEQ ID NO:2)를 클래스 I HLA-B 타입에 대한 대한 엑손 2 PCR 생성물을 증폭시키기 위해 사용하여 456 bp의 특정 생성물을 생성시켰다(15). 본원에서 나타낸 알고리즘을 프라이머가 단지 엑손 2 클래스 I HLA-B 유전자좌를 프라이밍하는 지를 나타내는 이러한 프라이머의 유일성을 확인하기 위해 사용하였다. 정방향 프라이머는 염색체 6에서 11개의 다른 위치에서 결합할 수 있고 또한 염색체 X 상에서 하나의 다른 위치에 결합할 수 있는 것으로 결정되었다. 클래스 I HLA-B 유전자좌의 엑손 2에 대한 역방향 프라이머가 염색체 6 상의 5개의 다른 위치 및 염색체 4 및 13 상의 하나의 위치에 결합하는 것으로 발견되었다. 클래스 I HLA-B의 엑손 3의 증폭을 위한 또 다른 프라이머 5'ACCCGGTTTACCCGGTTTCATTTG3' (SEQ ID NO:6)은 위치 164-184의 인트론 2 이외의 염색체 6 상의 8개의 위치에서, 및 수개의 다른 염색체에 결합하는 것으로 밝혀졌다(표 1). 표 1은 프라이머의 배 수 또는 프라이머 서열의 서브스트링(substring)을 나타낸 것이며, 밑줄친 부분에 나타낸 바와 같이, 정확한 위치 이외에 위치들에서 발견되었다. 알고리즘(19-20)은 프라이머의 고안이 고해상도 HLA형 분석을 수행하기 위해 매우 중요한 것임을 명확하게 나타낸다. 이러한 문제점은 인체 유체에 존재하는 다른 박테리아 및 바이러스 유전체로부터의 오염 가능성에 의해 더욱 복잡해진다.
Figure 112008067351813-PCT00001
HLA -B 및 HLA 유전자 클러스터의 증폭을 위한 프라이머 고안
각 HLA 유전자 및 대략 250 bp 길이의 생성물 쌍의 전체 관심 영역을 스패닝(spanning)하는 단순 500 bp 길이의 앰플리콘을 생성시켰다. 이는 HLA-A, B 또는 DRB1에 대한 단순 PCR 검정에 대해 적합하다. 그러나, 전체 HLA 유전자 클러스터는 이러한 방법에 의해 고안된 14 또는 28개의 프라이머 쌍을 요구할 것이다.
14개의 HLA 유전자좌, 즉 10개의 클래스 I HLA 유전자좌 및 4개의 클래스 II 유전자좌 각각에 대해, 관심 과가변 영역은 대략 500 bp를 스패닝한다. 그러므로, 프라이머 고안 문제는 열역학적으로 유사하지만, 협측 DNA를 오염시키는 인간 유전체 및 다른 유전체와는 다른 정방향 및 역방향 프라이머를 발견하는 것이다. 공정을 개시하기 위하여, 대략 100 bp 영역을 14개의 대략 500 bp의 HLA 유전자좌의 각 말단에서 식별하였다. 모든 가능한 18-20머 프라이머의 셋트를 본원에 기술된 계산 도구를 이용하여 이러한 쌍-방식(pair-wise)의 100 bp의 도메인에 대해 용이하게 수득하였다. 대략 1400개의 정방향 및 1400개의 역방향 프라이머의 세트를 이후 유사한 계산된 열역학적 안정성의 서브세트를 수득하기 위해 여과하였다. 이후 세트에서 다른 것과의 왓슨-크릭 상보성을 갖고 헤어핀을 형성하는 능력을 지니는 것을 추가로 여과하여 제거시켰다.
나머지 세트를 이후 추가로 18-20머의 인간 유전체 세트의 잔류부에 대해 여과하여 잘못된 프라이밍(false priming) 능력을 지니는 것을 제거하였다. 요망되는 PCR 생성물이 비교적 적기 때문에, 가장 큰 중량은 다른 경우에는 2000 bp 보다 작은 PCR 생성물을 생성하는 쌍-방식의 가능한 정방향 프라이머/역방향 프라이머 결합으로 제공된다. 이는 2000 bp 보다 큰 가짜 반응 생성 산물이 매우 효과적이지 않다는 실제 관찰을 기초로 한 것이다.
상술된 여과 공정이 14개의 HLA 유전자좌의 각각에 대해 수개의 가능한 정방향/역방향 쌍을 형성할 것으로 고려된다. 이러한 프라이머 쌍을 96-웰 열순환기 환경에서 개별적으로 시험하고, 생성물을 전기영동으로 분석하여 실험 상황에서 최적으로 작용하는 서브셋을 수득하였다. 프라이머 여과의 최종 수준은 혈액으로부터 얻어진 순수한 인간 DNA와 협측 세척 방법으로부터 얻어진 인간-비인간 혼합물 모두와 함께 달성된다.
표 2는 HLA A, B 및 DRB 유전자좌, 및 식별된 엑손을 증폭시키기에 효과적인 1차 및 2차 프라이머의 대표적인 목록이다.
Figure 112008067351813-PCT00002
실시예 2
클래스 I 및 II HLA 유전자좌의 1차 및 2차 증폭
HLA -A 및 B 유전자좌 및 엑손 2 및 3
1차 PCR 반응에서, HLA-A 유전자좌에 대한 A-LOC-FP1/A-LOC-RP1 및 HLA-B에 대한 B-LOC-FP1/B-LOC-RP1의 프라이머 쌍을 사용하여 다양한 UCLA 표준, 양성 대조군 및 음성 대조군의 증폭된 생성물을 생성시켰다. PCR 프로토콜은 96 웰 플레이트에서 50 ㎕의 부피로, 4분 동안 94℃의 1회의 예비-PCR 변성, 1분 동안 98℃, 1분 동안 71℃ 및 1분 동안 72℃에서의 35회의 PCR 주기; 7분 동안 72℃에서의 유지 주기이다 (중합효소: Roche Fast Start Taq). 증폭된 생성물(10 ㎕ 샘플)을 2% 아가로오스 젤 상에서 35분 동안 150 볼트로 전기영동시켰다 (레인 1: C1-034, 레인 2: C1-035, 레인 3: C1-036 및 레인 4: CCR1), 양성 대조군 (레인 5: Roche DNA) 및 음성 대조군 (레인 6: H20); 마지막 레인은 중량 표준물이었다. 젤은 HLA-A에 대해 980 bp의 생성물(도 1A) 및 HLA-B에 대해 1007 bp(도 1B)를 나타낸다.
2차 PCR 반응에서 HLA-Ax2 및 HLA-Ax3 엑손에 대한 프라이머 쌍 A-X2-FP1 /A-X2-RP1 및 A-X3-FP1/A-X3-RP1을 사용하여 증폭된 생성물을 생성시켰다. PCR 프로토콜은 96 웰 플레이트에서 50 ㎕의 부피로, 4분 동안 94℃에서의 1회의 예비 PCR 변성, 1분 동안 98℃ 및 30초 동안 58.3, 60.7, 63.3, 66.0, 68.6 또는 71.0℃ 중 하나에서의 35회의 PCR 주기, 및 7분 동안 72℃에서의 유지 주기이다 (중합효소: Lucigen EconoTaq). 증폭된 생성물 (10 ㎕ 샘플)을 2% 아가로오스 젤 상에서 45분 동안 150 볼트에서 전기영동시켰다 (레인 1: Aex2 또는 Aex3 음성 대조군, 레인 2: 58.3℃, 레인 3: 60.7℃, 레인 4: 63.3℃, 레인 5: 66.0℃, 레인 6: 68.6℃, 레인 7: 71.0℃; 도 1C-1D).
2차 PCR 반응에서, HLA-Bx2 및 HLA-Bx3 엑손에 대한 프라이머 쌍 B-X2-FP1/B-X2-RP1 및 B-X3-FP1/B-X3-RP1을 사용하여 증폭된 생성물을 생성시켰다. PCR 프로토콜은 96 웰 플레이트에서 50 ㎕의 부피로, 4분 동안 94℃에서의 1회의 예비 PCR 변성, 1분 동안 98℃ 및 30초 동안 60.7, 63.3, 66.0, 68.6, 71.0 또는 73.0℃ 중 하나에서의 35회의 PCR 주기, 및 7분 동안 72℃에서의 유지 주기이다 (중합효소: Roche Fast Start Taq). 증폭된 생성물 (10 ㎕ 샘플)을 2% 아가로오스 젤 상에서 45분 동안 150 볼트에서 전기영동시켰다 (레인 1: Aex2 또는 Aex3 음성 대조군, 레인 2: 60.7℃, 레인 3: 63.3℃, 레인 4: 66.0℃, 레인 5: 68.6℃, 레인 6: 71.0℃, 레인 7: 73.0℃; 도 1E-1F). 젤은 대략 1018 bp의 생성물을 나타낸다.
HLA - DRB1 유전자좌 및 엑손 2 및 3
일차 PCR 반응에서, 증폭 생성물을 생성시키기 위해 HLA-A 유전자좌에 대해서는 DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1 및 HLA-B 유전자좌에 대해서는 B-LOC-FP1/B-LOC-RP1의 프라이머쌍을 사용하였다. PCR 프로토콜은 96 웰 플레이트에서 25 ㎕의 부피로, 4분 동안 94℃에서의 1회의 예비-PCR 변성 주기, 1분 동안 98℃ 및 30초 동안 55.2, 56.5, 58.3, 60.7, 63.3, 66.0, 68.6, 71.0, 73.0, 74.4 또는 75.2℃중 하나에서의 35회의 PCR 주기, 및 7분 동안 72℃에서의 유지 주기이다 (중합효소: Roche. Fast Start Taq). 증폭된 생성물 (10 ㎕의 샘플)을 30분 동안 150 볼트에서 2% 아가로오스 젤에서 영동시켰다 (레인 1: DRB1 음성 대조군, 레인 2: 55.2℃, 레인 3: 56.5℃, 레인 4: 58.3℃, 레인 5: 60.7℃, 레인 6: 63.3℃, 레인 7: 66.0℃, 레인 8: 68.6℃, 레인 9: 71.0℃, 레인 10: 73.0℃, 레인 11: 74.4℃, 레인 12: 75.2℃; 도 1G).
HLA-DRB1을 증폭시키기 위해 프라이머쌍의 조합물을 사용하였다. PCR 프로토콜은 96 웰 플레이트에서 25 ㎕의 부피로, 4분 동안 94℃에서의 1회의 예비-PCR 변성 주기, 1분 동안 98℃, 1분 동안 74℃ 및 1분 동안 72℃에서의 35회의 PCR 주기; 7분 동안 72℃에서의 유지 주기이다 (중합효소: Roche Fast Start Taq). 증폭된 생성물 (10 ㎕의 샘플)을 35분 동안 150 볼트에서 2% 아가로오스 젤에서 영동시켰다 (레인 1: DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1a, 레인 2: DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1b, 레인 3: DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1c, 레인 4: DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1d, 레인 5: DRB-LOC-FP1a/DRB-LOC-RP1a 및 레인 6: DRB-LOC-FP1b/DRB-LOC-FP1a); 마지막 레인은 분자량 표준을 지닌다 (도 1H).
도 1G에 대해 기술된 조건하에서 프라이머쌍 DRB-x2-FP1g/DRB-x2-RP1a를 이용하여 HLA-DRB1 엑손 2 유전체 DNA 주형을 증폭시키기 위해 이차 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 생성물 (10 ㎕의 샘플)을 35분 동안 150 볼트에서 2% 아가로오스 젤에서 영동시켰다 (레인 1: DRB1ex2 음성 대조군, 레인 2: 55.2℃, 레인 3: 56.5℃, 레인 4: 58.3℃, 레인 5: 60.7℃, 레인 6: 63.3℃, 레인 7: 66.0℃, 레인 8: 68.6℃, 레인 9: 71.0℃, 레인 10: 73.0℃, 레인 11: 74.4℃, 레인 12: 75.2℃; 도 1I). 도 1H에 대해 기술된 조건하에서 HLA-DRB 1 엑손 2 유전체 DNA 주형을 증폭시키기 위해 프라이머쌍의 조합물을 사용하였다. 증폭된 생성물 (10 ㎕의 샘플)을 35분 동안 150 볼트에서 2% 아가로오스 젤에서 영동시켰고 (레인 1: DRB-x2-FP1g/DRB-x2-RP1a, 레인 2: DRB-x2-FP1g/DRB-x2-RP1b, 레인 3: DRB-x2-FP1g/DRB-x2-RP1c, 레인 4: DRB-x2-FP1a/DRB-x2-RP1a, 레인 5: DRB-x2-FP1b/DRB-x2-RP1a, 레인 6: DRB-x2-FP1c/DRB-x2-FP1a, 레인 7: DRB-x2-FP1d/DRB-x2-FP1a, 레인 8: DRB-x2-FP1e/DRB-x2-FP1a, 레인 9: DRB-x2-FP1f/DRB-x2-FP1a, 레인 10: DRB-x2-FP 1g/DRB-x2-FP1a), 마지막 레인은 분자량 표준을 지녔다 (도 1J).
실시예 3
마이크로어레이를 위한 프로브 고안
제공된 미스매치에 대해 모든 가능한 최근접 상황의 하이브리드화 파라미터를 시험하기 위해 적절하게 고안된 마이크로어레이를 사용하였다. 이는 임의의 종류의 단일 누클레오티드 다형성의 대행을 가능케 한다. 3중 서열에 대해서는, 중심 염기쌍에 의해 연구되는 64개의 조합 및 이들의 최근접 상황의 비염기쌍 (mispair)이 존재한다. 모든 이러한 조합으로부터의 결과는 당형성의 HLA 서브타입에 대한 단일 누클레오티드 다형성의 결합 특성의 예측을 가능케한다. 이는 열 용융 프로파일보다 훨씬 나은 결합 특성에 대한 추정치이다.
간단히, HLA-B 모델에 대해, HLA-B의 공지된 대립 유전자 다양성은 임상적 또는 역학적 값의 137개의 다형태를 나타내고, 따라서 충실한 하이브리드화 분석을 위해 137개의 대립 유전자 특이적 프로브 세트가 제공된다. 마이크로어레이에 대한 흡착 방법을 이용하여, 본원에 기술된 제법으로 12-15 염기 범위의 우수한 단일 누클레오티드 특이성을 지닌 프로브를 생성시켰다. 말단 인공물을 회피하기 위해 계산된 중심 위치 근처, 즉 위치 3 내지 N-2 근처에 다형태를 포함하는 모든 11-16 염기 길이의 후보 프로브 세트를 교정에 의해 생성시켰다. 이후, 이러한 프로브 세트를 여과시켜 표적에 완벽하게 매치되는, 결합 동족체에서 동일한 계산된 열역학적 안정성을 지니는 서브셋을 수득하였다. 상기 표준을 위해, 0.1M NaCl에서 55℃의 계산된 Tm을 설정하였다.
일차 여과된 프로브 후보자 서브셋으로부터, 나머지 인간 유전자에 대한 이차 여과 단계를 수행하여, 다른 곳 또는 HLA 유전자좌 내의 임의의 기타 부위에서 반복 서열을 또한 나타내는 프로브 후보자를 배제시켰다. 하이브리드화는 PCR 증폭된 표적에서 수행되므로, 추가의 엄격성은 원칙적으로 필요하지 않을 것이다. 그러나, 완전을 위해, 이차적으로 여과된 세트는 또한 본원에 기재된 미생물 또는 비인간 척추동물 서열의 1600개의 유전체 라이브러리 전체에 대한 유사성에 대해 분석될 것이다. 마이크로어레이를 제조하기 위해 이러한 프로브를 사용하였다.
특이적 프로브 서열
표 3-6은 각각 HLA A 및 HLA B 유전자좌, 엑손 2-3에 대한 프로브 서열을 나타낸다. 올리고-T 플랭킹 세그먼트가 각각의 프로브의 3' 및 5' 말단에 도입되어, 플랭킹 세그먼트가 어레이 표면에 흡착되었으나, 이는 용액 상태의 표적 핵산에 대해 거의 친화성을 지니지 않거나 친화성이 없다. 프로브 인식 크기는 약 9-15 염기이고, 모든 마이크로어레이 프로브에 대해 30염기의 최종 전장을 위해 올리고-T 세그먼트를 3' 및 5' 측면 둘 모두에 첨가하였다.
Figure 112008067351813-PCT00003
Figure 112008067351813-PCT00004
Figure 112008067351813-PCT00005
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실시예 4
마이크로어레이 제작
문헌[Belosludtsev et al . (17)]에 기술된 방법을 이용하여 마이크로어레이를 제작하였다. 간단히, 사용된 기판은 세제를 지닌 초음파 수조에서 세척 (2분)한 후 증류수 및 메탄올로 세척하고 건조 (40℃에서 30분)시킨 실리카 슬라이드였다. 슬라이드를 선반에서 조립된 세척된 슬라이드를 이용하여 70-80℃에서 밤새 25 in. Hg의 진공 오븐에서 50% 실란/p-자일렌 용액으로 평형화된 진공 상태에서 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-글리시독시-프로필트리메톡시실란으로 실란화시켰다.
시판되는 올리고누클레오티드 (Midland Certified Reagent Co. Midland; TX)를 5 μM의 증류수 중의 1 nl 용액으로서 마이크로어레이를 이용하여 실란화된 표면 상의 아미노실란화된 슬라이드에 증착시켰다. 올리고누클레오티드를 "프린팅"시킨 후, 슬라이드를 40℃에서 15분 또는 실온에서 밤새 건조시키고, 50℃에서 1시간 동안 22 in Hg의 진공 오븐에서 3 ml의 디메틸 포름아미드 (DMF) 중의 3 ml의 아세트산 무수물의 용액에 페트리접시를 둠으로써 증기상의 아세트산 무수물로 캡핑시켰다. 아세틸화된 아미노-유도된 슬라이드를 1시간 동안 실온에서 DMF 중의 0.5M 숙신산 무수물을 지닌 탱크에 슬라이드를 침지시킴으로써 숙신산 무수물로 캡핑시켰다. 슬라이드를 아세톤 (3x), 증류수 (2x) 및 다시 아세톤 (2x)에서 세척함으로써 세척하였다. 품질 대조군으로서, 30 ml의 하이브리드화 완충용액 중의 형광-표지된 올리고누클레오티드를 슬라이드 표면에 증착시켰다. 15분 후에 백그라운드가 관찰되지 않는 경우, 슬라이드가 하이브리드화 실험에 준비된 것으로 간주하였다.
올리고누클레오티드를 평면 유리 기판에 부착시키기 위한 흡착 대 공유 방법의 비교를 수행하였다. 말단 이차 아민 결합을 생성시키는, 표면으로의 공유 결합을 위한 당 분야의 표준 방법인 5'-아미노-변형된 올리고누클레오티드와 에폭시실란화된 표면의 반응에 의해 공유 결합을 수득하였다. 실험 밀도와 계산 밀도의 비교는 흡착 과정 동안 올리고누클레오티드의 빽빽하게 패킹된 단층이 형성되었다는 증거를 제공하였고, 길이 의존성 연구는 36 염기만큼 긴 프로브에 대해 빽빽하게 패킹된 프로브 필름이 형성될 수 있음을 입증하였다. 고정된 표적의 안정성 및 구조의 추가 결정에서, 36머 이하의 짧은 올리고누클레오티드에 대해, 단일 가닥 DNA의 리본 형태가 표면 상에 형성된 것이 발견되었다 (23). 하이브리드화 선택성 및 특이성은 표면에 공유 결합된 완전히 직립한 단일 가닥 DNA 분자와 유사하다.
실시예 5
샘플 수거 및 추출의 확인
샘플을 수거하기 위해 "구강세척" 방법 (21)이 사용될 수 있다. 샘플 수거를 위한 이러한 기술은 대규모의 집단 연구를 위한 협측 유래 DNA의 수거 및 지리적으로 분산된 대규모의 집단 연구로부터의 샘플 수거에 이상적으로 적합하다. "구강세척" 방법은 임의의 의학적 관리를 요하지 않는다. 이러한 기술은 심지어 다양한 온도 조건에 노출되는 경우에도, 새로이 제조된 DNA에 비해 1주 이하 동안 샘플의 온전성을 보전시키는 것으로 나타났다 (도 2A-2B).
간단히, 구강세척 용액 또는 임의의 기타 생체 적합 용액을 이용하여 약 45초 동안 강하게 구강을 세척한 후 10 ml 병에 뱉음으로써 협측 세포를 수거하였다. 병을 밀봉하고 우송하였다. 도착 후, 세포를 펠렛화시키고, 세포 펠렛을 간헐적으로 볼텍싱하면서 1시간 동안 25℃에서 100 ㎕의 Tris-EDTA 및 1% SDS의 용액중에 용해시켰다. 이러한 현탁액을 젠볼트 (GenVault) 성분 (각각 13 ㎕)에 직접 적용시켰다. 건조시킨 후, DNA를 2회의 염수 세척으로 분리시켰고, 이 시점에서 DNA는 다공성 성분에 결합된 채로 유지된다. 이후, 젤볼트 방출 완충용액에서 25℃에서 5분 동안 1회 세척하여 상기 성분으로부터 DNA를 방출시켰다. 따라서, 약 1 ㎕/성분으로 방출된 DNA는 추가 정제 없이 PCR에 사용할 수 있었다.
피츠코 다크론 (Fitzco Dacron) 협(cheek) 면봉법을 이용하여 협측 세포를 또한 수거할 수 있었다. 간단히, 우측 협 또는 좌측 협으로부터 면봉을 수거하고, 면봉 첨단을 원심분리 튜브 내의 회전 바구니 내에 두고, 밤새 대기 건조시킨 후, 보관을 위해 캡핑하였다. 필요시 200 ml의 SRB를 직접 첨가하여 첨단을 수화시킨 후, 55℃에서 4시간 동안 가열하였다. 이후, 회전 바구니로부터 샘플을 수거하고, 10,000G에서 1분 동안 원심분리시켰다. 90% 이상의 액체가 회수되었다. 생성된 물질은 제조업체의 권고에 따라 아르질라 프렙파티클즈 (Argylla PrepParticles) 또는 키아젠 (Qiagen) 컬럼을 이용한 회분식 세척에 의해 처리될 수 있다. 표 7은 5명의 지원자 각각에 대한 FBI의 색소 추출 완충용액, 이후 아르질라 (A) 및 키아젠 (Q)을 이용하여 추출된 협 면봉법으로부터의 DNA 수득량을 비교한다.
Figure 112008067351813-PCT00015
도 3A는 협 면봉법에 의한 지원자중 2명으로부터 추출된 DNA가 HLA-B에 대해 우수한 PCR 생성물을 제공하는 것을 입증한다. UCLA 표준을 협측 DNA 샘플로부터 유래된 PCR 생성물과 비교하였다. 도 3B에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 협측 면봉 수거물로부터의 HLA-B 특이적 PCR 반응물은 순수한 UCLA 참조 표준으로부터 수득된 것과 양적으로 유사하였다.
실시예 6
이미지 분석 및 패턴 인식
디지털 방식으로 포획된 마이크로어레이 이미지를 이미지어낼라이저 (ImageAnalyzer) 소프트웨어의 알고리즘을 이용하여 분석하였다. 간단히, 윤곽선 검출 방법을 이용하여 이미지로부터 백그라운드를 공제 (도 4A)하여, 백그라운드를 초과하는 소정의 역치에서 명료한 패턴을 생성시켰다 (도 4B). HLA 유형의 지정을 위한 패턴 인식 및 2-D 바 코드의 생성은 하이드리드된 스폿 패턴 및 이들의 HLA 타입 각각에 대한 공간적 관계를 기초로 한다. HLA 유형의 대립 유전자 각각은 바코드로 사용되는 스폿의 패턴 세트를 지닌다.
실시예 7
K- ras 모델: 흡착성 마이크로어레이에 대한 SNP 의 유전자형 분석 및 검출
앰플리콘 생성 및 올리고누클레오티드 프로브
HLA-형결정에 사용된 마이크로어레이가 단일 누클레오티드 다형성에 의해 야생형과는 상이한 K-ras 유전자좌의 유전자형을 확인하고 지정하는데 성공적으로 사용되었다. 중합효소 연쇄반응에 의해 152-bp의 K-ras 앰플리콘을 생성시켰다. 시판되는 유전체 DNA 공급원 (Sigma)의 증폭에 의해 야생형 앰플리콘 (K-ras 1)을 수득하였다. 세포주 A549 및 SW480 각각으로부터의 인간 유전체 DNA의 증폭에 의해 K-ras 2 및 K-ras 7 돌연변이를 수득하였다. PCR 프로토콜은 다음과 같았다: 12분 동안 94℃, 1분 동안 60℃ 및 1분 동안 72℃에서의 1회의 예비-PCR 주기; 1분 동안 95℃, 1분 동안 57℃ 및 1분 동안 72℃에서의 35회의 PCR 주기; 7분 동안 72℃에서의 유지 주기, 4℃에서 유지. k-ras 앰플리콘에 대한 PCR 프라이머를 이들의 5' 말단에서 디곡시제닌으로 표지하였고, 이는 다음과 같은 서열을 지녔다: 5'-DIG-ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3' (SEQ ID NO:292) 및 5'-DIG-TCAAAGAATGGTCCTGCACC-3' (SEQ ID NO:293). K-ras 앰플리콘은 코돈 12에 여러 점 돌연변이를 지녔다. 표 8에 나타낸 바와 같은 마이크로어레이 포획 프로브로서 사용하기 위한 특정 올리고누클레오티드를 고안하였다. 밑줄이 있는 누클레오티드는 점 돌연변이에 해당한다.
Figure 112008067351813-PCT00016
하이브리드화 및 패턴 검출
나트륨 이온 농도와 관련된 150 mM 시트르산 나트륨 및 5X 덴하르트 용액 (pH 8.0)을 함유하는 예비하이브리드화 용액을 10분 이상 동안 어레이에 적용시켰다. 용액을 진공에서 제거하고, 하이브리드화 용액 (1 nM 앰플리콘, 0.1 mM 샤페론, 나트륨과 관련된 150 mM 시트르산 나트륨, 5X 덴하르트 용액, pH 8.0)을 어레이에 적용시켰다. 이러한 연구에서, 포획 프로브 K-ras 1, K-ras 2, K-ras 7에 상보적인 앰플리콘만을 사용하였다. 하이브리드화 2시간 후, 어레이를 각각 10분 나트륨과 관련된 100 mM 시트르산 나트륨으로 2회 세척한 후, 13 SSC로 간단히 헹구었다. ELF-97 mRNA 인 시츄 하이브리다이제이션 키트 (In Situ Hybridization Kit) (Molecular Probes)로부터의 블로킹 완충용액에 1:1000 희석된 알칼리성 포스파타아제 (Boehringer Mannheim)에 연결된 항-디곡시제닌 항체를 이용하여 디곡시제닌 표지된 앰플리콘을 검출한 후, 동일한 키트로부터의 완충용액 A로 세척하고, 알칼리성 포스파타아제에 대한 기질인 키트 내에 기재된 바와 같은 ELF를 적용시켰다. 알칼리성 포스파타아제에 의한 분해 후, ELF 분자가 침전되고, UV 여기 하에서 형광이 되었다. 알파 이미저 (Alpha Imager) 2000 장치를 이용하여 형광 강도를 검출하고, 시그마 플롯 (Sigma Plot) 3.0 소프트웨어를 이용하여 처리하였다 (도 5A-5D).
실시예 8
HLA -B에서의 SNP 검출
HLA -B 확인 모델
UCLA는 공지된 HLA 타입을 지니는 어셈블리된 75개의 고도로 특성규명된 DNA 샘플의 라이브러리를 지니며, 이는 참조 표준으로 세계적으로 사용된다. 이러한 참조 세트를 수득하고, HLA-B 고변이 영역을 다시 서열분석하여 참조 세트에서의 서열 변이의 보다 높은 분석의 식별을 수득하였다. 도 6A-6B에서 관찰할 수 있는 바와 같이, UCLA에서 유래된 데이터는 매우 정확하였고, 원-패스 (one-pass) 재서열분석과 관련하여 단지 4-5개의 불일치만 생성되었다.
HLA -B 표적 제조
HLA-B의 엑손 2로부터의 500-bp의 단편을 상기 고안된 프라이머를 이용하는 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 시험 상황의 정제된 인간 유전체 DNA 샘플로부터 수득하였다. 다음과 같은 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭된 500 bp의 단편을 생성시켰다: 12분 동안 94℃, 1분 동안 60℃ 및 1분 동안 72℃에서의 1회의 예비-PCR 주기, 1분 동안 95℃, 1분 동안 57℃ 및 1분 동안 72℃에서의 35회의 PCR 주기; 7분 동안 72℃에서의 유지 주기, 4℃에서 유지. T7 중합효소 인식 서열 5' ATGTAATACGACTCACTATAG 3' (SEQ ID NO:317)를 함유하도록 HLA-B 앰플리콘에 대한 PCR 프라이머를 변형시켰다.
이중가닥의 PCR 생성물을 미세-컬럼 정제로 분리시킨 후, 하이일드 RNA 트랜스크립트 라벨링 키트 (HighYield RNA Transcript Labeling Kit) (Enzo Labs, Farmingdale, NY)를 이용하여 비오틴-표지된 리보누클레오티드의 존재하에서 시험관 내에서 전사시켰다. 간단히, 단일가닥의 cRNA를 생성시키기 위한 시험관 내 전사 반응을 75 mM NTP와 25% 비오티닐화된-rUTP를 함유하는 rUTP 분획의 혼합물, 10x 반응 완충용액 및 T7 중합효소 (Ambion, Austin, TX)를 함유하는 20 마이크로리터의 반응 부피로 수행하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 시험관 내 전사된 비오틴 표지된 cRNA를 키아젠 알앤이지 (Qiagen RNeasy) 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하고, 정량하고, 1x 분획화 완충용액 (40 mM Tris-아세테이트, pH 8.0, 100 mM Kac, 30 mM MgAc)의 존재하에서 35분 동안 94℃에서 분획화시켰다. 포름알데히드 아가로오스 젤을 이용하여 분획화 전 및 후에 RNA의 품질을 확인하였다.
하이브리드화 및 검출
나트륨 이온 농도와 관련된 150 mM 시트르산 나트륨을 함유하는 예비하이브리드화 용액 및 5X 덴하르트 용액, pH 8.0을 10분 이상 동안 어레이에 적용시켰다. 이후, 예비하이브리화 용액을 진공에서 제거하고, 나트륨과 관련된 150 mM 시트르산 나트륨 중의 단일 가닥의 표지된 cRNA 표적 및 5X 덴하르트 용액, pH 8.0을 함유하는 하이브리드화 용액을 HLA 마이크로어레이에 대한 하이브리드화를 위해 어레이에 적용시켰다. 하이브리드화 2시간 후, 어레이를 나트륨과 관련된 100 mM 시트르산 나트륨으로 각각 10분 동안 2회 세척한 후, 1X SSC로 간단히 헹구었다. 스트렙타비딘 결합된 피코에리트린이 cRNA 표적 상의 비오틴에 결합하였다 (22). CCD-기재 마이크로어레이 영상장치 (Array Worx, API, Issaquah, WA)를 이용하여 형광 강도를 검출하였다.
HLA -B 칩
도 7A-7F는 HLA-B의 코돈 9에 대한 하이브리드화 데이터를 나타낸다. 이러한 어레이에서, 올리고-T 플랭킹 서열이 결핍된 9-12개의 염기 길이의 프로브는 마이크로어레이의 우측 상단에 위치하고, 상응하는 30머 올리고-T 플랭킹된 유도체는 마이크로어레이의 좌측에 위치하였다. UCLA HLA 참조 DNA 라이브러리로부터 수득된 공지된 서열 변이의 Cy-3 표지된 281bp의 네스티드(nested) PCR 생성물로 하이브리드화를 수행하였다 (샘플 72, 21, 27, 57). 또한, 지원자로부터 수득된 281bp 생성물에 대한 마이크로어레이 하이브리드화 데이터를 도 7F-G에 나타내었다 (MH, BI). 관찰될 수 있는 바와 같이, 프로브 인식 서열을 일정하게 유지시키고, 올리고-T 플랭크를 첨가하는 것은 짧은 프로브 동족체에 비해 하이브리드화 신호를 10배 증가시켰다.
도 7G에서, 코돈 9에 대한 어레이에서 스폿 강도를 수작업으로 정량하였다. 도 7G의 데이터는 6개의 클러스터로 나타났다. 처음 4개의 클러스터는 코돈 9에서 공지된 대립 유전자형의 UCLA 참조 샘플로부터의 하이브리드화 데이터에 해당한다. 삼대립 유전자이므로 코돈 9를 선택하였고, 따라서 공지된 대립 유전자 변이를 인테로게이팅(interrogating)시키기 위해 세 개의 하이브리드화 프로브가 필요하였다. 각각의 클러스터에서, 특이성이 향상될 수 있는지를 결정하기 위해, "긴 프로프" 및 중심에서 서열 특이적 서열의 하나의 염기가 감소된 "짧은 프로브"와 같은 두 개 세트의 프로브 유형을 시험하였다. 중요하게, 모든 4개의 UCLA 참조 샘플에 대해 측정된 특이성은 코돈 9에서 거의 완전한 것이 관찰될 수 있었다 (도 7G). UCLA 표준으로부터 예측되는 바와 같이, 하이브리드되어야 하는 "스폿들"이 명백하게 검출되었다. 단일 누클레오티드 식별과 관련된 특이성이 10배를 초과하여 관찰되었고, 몇몇 경우에 상기 프로브 중에서 50배 정도로 큰 특이성이 관찰되었으며, 이는 명백한 핸즈-프리(hands-free) 분석을 가능케 한다.
코돈 50에 대해 거의 동일한 특이성 인자가 관찰되었다 (도 7H). 도 7E-7F에서, 마이크로어레이 데이터를 협측 면봉법 DNA로부터 유도시켰다 (MH, BI). 이러한 샘플은 지원자로부터 수득된 협측 DNA이므로, HLA 유형은 공지되지 않았다. 따라서, 그래프 아래의 표에 실려있는 값은 외적 확인 (external validation)이 아닌 상기 두 개의 샘플에 대한 "HLA 콜(call)"이다: 코돈 9에서 MH는 명백한 V2/V3 이형접합체이고, BI는 V2/V2 동형접합체이다. 막대 그래프는, 도 7A-7D의 4개의 UCLA 표준에 대한 경우에서와 같이, 표준화된 5 ng HLA-B 특이적 PCR 반응으로부터 협측 DNA의 명백하게 규정된 마이크로어레이 분석이 수득된 것을 나타내었다. 협측 면봉법당 DNA 수득량이 500-2000 ng인 경우, 도 7G-7H의 데이터는 각각의 협측 면봉법이 100개 이상의 DNA의 PCR 동등물을 수거하는 것을 입증한다. 데이터는 또한 데이터의 간단한 검사에 의해 매우 명백한 HLA 콜이 수득될 수 있음을 입증한다. 프로브는 화학적으로 변형되지 않았고, 올리고-T 플랭킹 서열은 물리적 "충전제"이므로, 프로브 합성 및 정제는 상기 마이크로어레이에 대해 매우 저렴한 채로 유지된다.
실시예 9
자동화된 마이크로어레이 신호 분석
처리되지 않은 이미지 (도 7A)로부터 강도를 도출하기 전, 적절한 그리딩 (gridding) 기술의 선택이 수행되어야 한다 (도 8). 추정 스폿 위치를 배치하기 위해 그리드의 구조 정보를 사용하였다. 마이크로어레이 스폿은 이들의 중심 주위에 상칭적으로 존재하므로, 스폿의 인접하는 영역 내에서 최적의 스폿 중심을 검색하기 위해 최적화 과정이 실시될 수 있다. 처리되지 않은 마이크로어레이 이미지로부터 출발하여, 그리딩 과정은 처리되지 않은 그리딩 추정, 국소화된 스폿 중심 조정 및 구조적 스폿 중심 조정을 포함한다. 그리딩이 완료된 후, 얼마나 많은 픽셀이 스폿의 일부인 것으로 간주될 수 있는지의 여부를 결정하는 것이 필요하였다. 반지름 R (픽셀로 측정됨)에 대해, 크기 2R + 1의 사각형이 스폿이 함유되는 것으로 용이하게 설정될 수 있었다. 픽셀이 스폿 내에 존재하는지 결정하기 위해, 도 7A-7F에 예시된 바와 같이 제공된 픽셀과 사각형의 중심 픽셀 사이의 거리 D를 계산하고, 반지름 R보다 작거나 혹은 동등한지를 관찰하였다. 각각의 픽셀에 대한 정보를 보관하는 효율적인 데이터 구조를 사용함으로써, 상기 상세하게 기술된 방법은 적절한 메모리 및 계산 시간을 소비하여 수천 개의 스폿을 지닌 마이크로어레이 영상을 처리할 수 있었다.
도 7A의 통상적인 스폿은 반지름 15 (픽셀)을 지니고, 이는 스폿 내에 709개의 픽셀이 존재하는 것으로 간주되었다. 각각의 스폿의 경계를 명백히 규정하여, 특정 스폿 내에 함유된 픽셀의 강도를 스폿의 신호로 전환시켰다. 사용된 측정 규준은 가장 강한 픽셀 s를 고려대상에서 배제한 후 스폿의 가장 강한 픽셀 n의 산술 평균을 취하였다. 이에 의해, 스파이크(spike) m 강도 값, 노이즈, 먼지 및 기타 관계없는 인자를 포함하는 오차를 제거하였다. s 및 n의 선택은 이미지의 특성을 반영해야 한다.
동일하게 향상된 30머 프로브 세트를 이용하여 일련의 12개의 UCLA 샘플에서 프로브를 시험하였다. 각각의 시험의 결과는 도 7A에 예시된 것과 유사한 이미지를 나타내었다. 상기 기술이 SNP 콜링(calling)의 수행에 성공적이라는 통계적으로 확실한 진술을 위해, 상이한 이미지 (샘플)로부터의 동일한 프로브의 신호를 조합시켰다. 이는 이미지 전역의 신호의 규격화를 필요로 하였다. 주어진 실험의 특성에서, HLA 형결정에서의 이미지는 주로 두 개의 극단의 강도를 지니는 스폿을 함유하는 것으로 예상된다 (프로브가 샘플에 존재하는 경우, 해당 스폿은 매우 높은 강도를 지닐 것이다. 반면, 프로브가 샘플에 존재하지 않는 경우, 해당 스폿은 매우 낮은 강도를 지닐 것이다). 각각의 극단에서의 스폿의 수는 프로브 및 샘플 특이적이다. HLA 형결정을 위해 이미지의 특성을 조절하기 위한 정교한 규격화 계획을 선택하였다. 이는 매우 높은 강도를 지닌 대표적인 스폿으로서 마커 스폿의 산술 평균을 취한다 (도 7A의 좌측 및 하단의 6개의 밝은 스폿, 통상적으로 이들은 픽셀 포맷의 이미지당 8-비트로 255의 강도를 지닌다). 매우 낮은 강도의 대표적인 스폿으로 백그라운드 픽셀의 산술 평균 강도를 선택하였다. 이후, 이미지의 범위를 마커 스폿의 산술 평균과 백그라운드의 산술 평균 사이의 차이로 규정하였다. 이미지를 규격화하여, 각각의 이미지가 규격화 후에 동일한 범위를 지니도록 하였다.
이후, 각각의 프로브의 규격화된 데이터를 존재 세트 및 비존재 세트의 두 개의 세트로 나누었다. 프로브의 존재 세트는 프로브가 존재하는 이미지 (샘플)로부터 신호를 함유하였다. 반면, 비존재 세트는 프로브가 존재하지 않는 이미지 (샘플)로부터 신호를 함유하였다. 각각의 프로브에 대해 존재 세트와 비존재 세트 사이에서 만-휘트니 (Mann-Whitney) U 시험을 수행하였다. 생성된 양측 (two-tailed) p-값은 2% 내지 5 x 10 -7%의 범위였고, 이는 프로브 존재 샘플과 프로브 비존재 샘플의 신호의 차이가 2% 수준에서 통계적으로 유의한 것을 나타낸다. 이러한 분석을 표 9에 나타내었다. 시험의 U 통계치는 세트 크기 22 및 2에 대해 가장 높은 44였으며, 2.16 x 10-2가 세트 크기 22 및 2에 대해 가장 적은 p-값이었다.
Figure 112008067351813-PCT00017
마이크로어레이 이미지를 이미지 어낼라이저 및 데이터 분석 방법의 사용을 가능케 하는 SNP 콜로 전환시킨 후, SNP 콜을 자동 방식의 대립 유전자 콜로 전환시켰다. HLA 칩 상의 프로브의 최종 통합된 세트의 하기 특성에 의해 정확하고 강한 대립 유전자 콜이 가능하였다: (1) 고려되는 각각의 대립 유전자는 하나 이상의 특정한 수의 프로브에 의해 동일함이 증명될 수 있어야 하고; (2) 임의의 두 개의 대립 유전자를 확인하는 서브셋은 하나 이상의 특정한 수의 프로브에 의해 상이하여야 한다.
대립 유전자 콜을 결정-트리-기반 방법 (decision-tree-based approach)으로 수행하였다. 예를 들어, ( ) k p p P ,... 1 =가 SNP 콜의 결과가 되도록 하였고, 여기서 i p , k i ,..., 1 =는 개별적인 프로브의 존재/부재를 의미한다. { } n a a A ,... 1 =가 고려하는 모든 대립 유전자의 세트가 되도록 하였고, 여기서 j a , n j ,..., 1 =은 개별적인 대립 유전자를 의미한다. i A, k i ,..., 1 =이 프로브 i에 의해 확인될 수 있는 대립 유전자 세트가 되도록 하였으며, i p가 존재인 경우 i A에 하나 이상의 대립 유전자가 존재하는 것으로 예상하였고, 그 반대도 마찬가지였다. 대립 유전자-콜링 결정 트리는 도 9에 예시되어 있다. 트리에서의 각각의 마디는 의사결정의 현재 단계에 존재하는 것으로 보이는 A 일원의 서브셋이다. 트리의 뿌리는 A이다. 각각의 잎은 샘플에 존재하는 것으로 결정되는 대립 유전자의 최종 세트이다. 샘플의 SNP 콜이 제공되면, 각각의 프로브의 존재/부재에 기초하여 결정 트리를 뿌리마디로부터 잎중 하나로 순회시킴으로써 샘플 내에 존재하는 대립 유전자의 세트가 결정된다. 대립 유전자 콜링 과정은 이제 단순한 트리 순회가 되며, 이는 "HLA 칩" 상의 프로브의 수에 대해 선형인 시간 복잡도를 지닌다. 따라서, SNP 콜은 수초만에 표준 데스크탑 PC (1GHz CPU 및 1GB RAM을 지님) 상의 대립 유전자 콜로 전환될 수 있다. 대립 유전자의 최종 세트가 공백이 되는 것이 가능한데, 이는 고려하는 대립 유전자의 세트가 조우된 것으로 가정하는 경우, 모든 가능한 패턴으로부터 독특한 하이브리드화 패턴을 의미한다. 이러한 경우, 샘플은 새로운 대립 유전자(들)을 함유하는 것으로 생각되며, 이는 추가 실험 또는 서열분석에 적용되어야 한다.
실시예 9
과학적인 관심 HLA 대립 유전자를 결정하기 위한 지식-기반 문헌 스크리닝 도구
최적의 임상적 장점을 제공하는 HLA 칩을 개발하기 위한 10,000개 이상의 HLA 대립 유전자가 공지되어 있으나, 축적된 과학적 관심의 가장 중요한 중요부와 관련된 전체 대립 유전자의 서브셋에 초점을 맞추는 것이 중요하다. PubMed 데이터베이스 내의 인용문에 정의된 바와 같은, 상기 대립 유전자를 결정하기 위한 지식-기반 문헌 스크리닝 도구가 본 발명에서 개발되었다. 일차 지식 기반 스크리닝에 기초하여, 가장 잠재적인 약 210개의 관심 대립 유전자 세트를 확인하였다. 적합화된 유의성 측정은 검색 구문으로서 대립 유전자명을 이용하여 PubMed 검색을 수행하면서 회수된 적중수이다. Entrez PubMed는 eUtils로 공지된 7개의 서버-측 프로그램의 세트를 제공하며, 이는 규칙적인 웹 질의 인터페이트의 외부의 Entrez 데이터로의 접근을 허용한다. Esearch는 일차 ID 및 용어 번역을 검색하고 회수하는 eUtil이며, 이는 임의로 사용자의 환경에서 이후의 사용을 위한 결과를 보유한다. 이는 상대 데이터, 데이터 범위, 회수 모드, 분류 순서 등과 같은 다양한 옵션에 기초하여 ID를 정정한다. 각각의 검색 구문에 대해 eUtil URL을 NCBI로 게시하는 스크립트는 HLA 대립 유전자를 검색하도록 기록된다. 이는 PubMed에 등록된 표제, 초록 및 전체 원문에서 검색 구문을 검색한다. 이후, 스크립트는 XML 포맷의 결과를 회수한다. XML 파일 내의 "계수" 태그에 포함된 각각의 검색 구문에 대한 적중 수는 파일을 분석함으로써 수득될 수 있다. 이러한 검색을 21개의 HLA 유전자에 대해 수행하였다. 표 10은 21개의 HLA 대립 유전자 인용에 대한 자동화된 PubMed 검색에 대한 결과를 나타낸다.
Figure 112008067351813-PCT00018
표 9는 2179개의 대립 유전자중 105개가 PubMed에서 2회 이상 인용되는 것을 나타낸다. 210개는 1회 이상 인용되었다. 가장 유의한 것으로 밝혀진, 즉 2회 이상 인용된 105개의 대립 유전자에 대해, 미국에서의 4개의 주요 집단에서의 이들의 빈도 정보를 수집하였다. 이러한 목록은 백신 반응에서의 HLA의 역할의 현재의 이해와 관련하여 추가로 교정될 수 있고, 약 10회의 PCR 반응 및 400개의 SNP-특이적 프로브의 세트가 210개의 대립 유전자 후보의 본래의 세트로로부터 유래된 대립 유전자 세트를 독특하게 확인하도록 고안될 것이다. 이는 HLA 칩을 제조하기 위한 가공되지 않은 물질 및 샘플 처리를 위한 관련 프로토콜을 제공한다. 모든 210개의 "1개 이상"의 PubMed 대립 유전자가 도 10의 도표에 제시되어 있다. PubMed 인용의 수는 우측에 제시되어 있다.
실시예 10
HLA 칩을 위한 후보 프로브 선택
IMGT/HLA 데이터베이스는 각각의 HLA 유전자좌에 대한 다중 정렬을 제공한다. 정렬된 서열은 SNP가 명백하게 표시되는 포맷이다. SNP는 하나의 대립 유전자를 또 다른 대립 유전자와 상이하도록 만드는 것이다. SNP의 조합은 대립 유전자를 독특하게 나타낼 수 있다. 즉각적인 계산으로부터, 각각 553개 및 562개의 대립 유전자를 엔코딩하는 HLA-B 엑손 2내의 125개의 SNP 및 엑손 3내의 93개의 SNP가 존재하는 것이 공지되었다. SNP가 짧은 n-머 (13 내지 15-누클레오티드 길이)를 발생시키는 각각의 위치에서, 주위의 SNP를 후보 프로브 서열에 대한 주형으로서 "필터링"하여 제거하였다. 단일 주형 및 혼성 주형의 두 가지 유형의 주형이 존재하였다. 단일 주형은 단지 하나의 SNP를 함유한다. 예를 들어, 이는 엑손 3 내의 위치 36에 SNP가 존재하며, 어느 측면에서도 6개의 누클레오티드 내에 기타 SNP가 발생하지 않는다. 중앙의 SNP 및 양 측면의 6개의 누클레오티드로 구성된 13-머 주형을 상기 SNP에 대해 제조하였다. 주형은 5'-TGCGACXTGGGGC (SEQ ID NO:318)이며, 여기서 X는 SNP를 나타낸다. 대립 유전자 B*7301에서, 이러한 위치에서 SNP는 "A"이다. 대립 유전자 B*0712 및 또 다른 126개의 대립 유전자에서, SNP는 "C"이다. 참조 대립 유전자를 포함하는 나머지 HLA-B 대립 유전자에서, SNP는 "G"이다. 따라서, 상기 주형으로부터 A-다형태, C-다형태 및 G-다형태로 세 개의 프로브 후보자를 제조하였다. 이러한 경우, SNP 부위에 "C"를 지닌 대립 유전자 B*0712 및 나머지 모든 대립 유전자는 C-다형태를 지닌 프로브 후보자에 의해 확인되는 것으로 나타낸다. 한편, 대립 유전자 B*7301은 A-다형태를 지닌 프로브 후보자에 의해 독특하게 확인되는 것으로 나타낸다.
다중 SNP가 매우 짧은 거리 내에서 또는 인접하여 발생하여, 동일한 주형에 해당될 수 있다. 이러한 주형은 혼성 주형으로 공지되어 있다. 엑손 3의 위치 254에서 출발하는 13-머가 혼성 주형의 예이다. 이는 위치 260에 두 개의 SNP를 함유하고, 이는 중심에 단일 누클레오티드에 의해 분리되어 있다. 혼성 주형은 5'-GAAGGAXAYGCTG (SEQ ID NO:319)이고, 여기서 X 및 Y는 두 개의 SNP를 의미한다. SNP의 조합을 고려하였다. 이러한 주형으로부터 세 개의 프로브 후보자를 제조하였다. C-다형태 및 C-다형태를 지닌 프로브 후보자에 의해 31개의 대립 유전자를 확인하였다. G-다형태 및 C-다형태를 지닌 프로브 후보자에 의해 478개의 대립 유전자를 확인하였다. C-다형태 및 A-다형태를 지닌 프로브 후보자에 의해 참조 대립 유전자를 포함하는 나머지 HLA-B 대립 유전자를 확인하였다.
다음 단계에서, 인간 유전체, 뿐만 아니라 1-, 2- 또는 3-미스매치를 지니는 임상 샘플에서 나타나는 것으로 예상되는 ~1000개의 미생물의 나머지에서 발생할 수 있는 후보자 프로브 서열을 추가 고려대상에서 배제시킬 수 있다. 이는 "백그라운드-블라인드 (background-blind)" 기술로 공지된 최근 개발된 계산 능력에 의해 가능하다. 이러한 새로운 기술은 적당한 시간으로 인간 유전체의 크기 (3Gb)의 서열에서 22개 이하의 누클레오티드 서열의 크기의 모든 부분서열 (n-머)의 존재/부재의 정확한 분석을 수행하는 것을 가능케 한다. 더욱이, 이는 1, 2 및 3개의 미스매치를 지니는 각각의 관심서열로부터 유래되는 모든 부분서열의 명백한 고찰을 가능케 한다 (BLAST 염기 프로브/프라이머 고안 적용과 같은 전통적으로 사용되는 발견 기재 정렬과는 대조적임).
도 10에 나타낸 바와 같은 마스터 목록이 제공되는 경우, 상기 계산은 SNP 특이적 프로브의 "완전한 세트" 및 "최소 세트"의 생성을 가능케 한다. "완전한 세트"는 도 10에서와 같이 마스터 목록의 모든 대립 유전자에서 모든 SNP를 확인하는 모든 프로브의 매우 중복적인 편집이다. 최소 프로브 세트는 완전한 세트가 확인하는 대립 유전자의 동일한 세트를 확인할 수 있으나, 최소 수의 프로브를 이용하여 확인할 수 있다. 이러한 최소한도화는 완전한 세트로부터 프로브 (SNP 부위)를 규칙적으로 결실시킴으로써 수행될 것이다. 각각의 단계에서, 알고리즘은 결실을 위한 프로브를 선택한다. 선택된 프로브를 제외한 잔류하는 프로브의 세트가 마스터 목록 중에서 대립 유전자의 동일한 세트를 확인할 수 있는 경우, 이러한 특정 프로브는 임의의 적용범위를 상실함이 없이 결실될 수 있다. 만약 그렇지 않으면, 알고리즘은 또 다른 프로브를 선택하고 상기 과정을 반복한다. 상기 세트 내의 임의의 프로브를 결실시키는 것이 상기 세트가 보다 적은 대립 유전자를 확인하는 것을 야기시키는 경우 이는 정지된다. 이 시점에서, 프로브의 세트가 최소화된다. 이러한 최소 세트에 대해, 단일 대립 유전자를 독특하게 확인하는 프로브가 대조군으로 첨가될 것이다. 대립 유전자 서열의 두 개의 샘플이 제공되는 경우, 이들 세트의 프로브가 두 개의 샘플 사이의 유사성을 측정, 즉 대립 유전자 서열이 둘 모두의 세트에 존재하는지 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이는 두 개체 사이의 적합성에 관심이 집중되는 이식에 매우 유용할 수 있다. 다른 경우에, 개체 사이의 차이가 확인될 수 있다. 예를 들어, 두 명의 환자가 이들의 HLA 유전자에서의 차이로 인해 동일한 약물 또는 치료제에 상이하게 반응할 수 있다. 이는 최적의 세트의 개념을 지지하는 중요한 동기부여가 된다. 대립 유전자 세트의 최적의 세트의 프로브는 최소수의 프로브를 이용하는 세트에서 각각의 대립 유전자를 독특하게 확인할 수 있다. 최적의 세트를 생성하기 위해 결정-트리 기재 알고리즘이 개발될 수 있다.
실시예 11
관심 유전자좌를 증폭시키기 위한 최적의 PCR 수
표 9는 10개의 관심 유전자좌를 증폭시키는데 필요한 일차 및 몇몇 경우에 이차 PCR 반응의 수의 추정치를 나타낸다. 일차 및 이차 (네스티드) PCR 둘 모두는 A, B 및 C를 필요로 할 것이다. 3회의 일차 PCR이 하나의 반응으로 다중화된 후, 네스티드 단계를 위한 이차 다중화 반응이 수행될 수 있다. 따라서, 클래스 Ⅰ 유전자의 전체 세트에 대해 단지 2회의 PCR 반응이 필요할 것이다.
클래스 Ⅱ 유전자 (표 11)에 대해, 클래스 Ⅱ 유전자에서의 주요 SNP 변이를 분석하기 위해 단지 1개의 엑손이 필요하다. 필요시, DRB1을 깨끗하게 분리시키기 위해 네스티드 PCR이 적용될 수 있다. DPA1, DPB1, DQA1 및 DQB1은 위유전자 (pseudogene)를 구별하기 위한 네스팅 (nesting)을 필요로 하지 않을 수 있다. DRB1 에 대한 일차 PCR이 다중화될 수 있는 경우, 클래스 Ⅱ 증폭은 1회의 1차 및 1회의 2차 PCR로 수행될 수 있다.
Figure 112008067351813-PCT00019
본원에 하기의 참고문헌이 인용되었다:
Figure 112008067351813-PCT00020
Figure 112008067351813-PCT00021
본 명세서에 언급된 임의의 특허 또는 간행물은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 또한, 이러한 특허 및 간행물은 각각의 개별적인 간행물이 참조로서 특이적 및 개별적으로 포함되는 것과 동일한 범위로 본원에 참조로서 포함된다.
당업자는 본원에 언급된 목적을 수행하고 언급된 결과 및 장점을 수득할 뿐 만 아니라, 본원의 고유의 목적, 결과 및 장점을 수득하기 위해 본 발명이 적합화된 것임을 용이하게 인지할 것이다. 청구의 범위에 의해 정의된 본 발명의 사상에 포함되는 본 명세서 및 기타 용도에서의 변이가 당업자에게 발생할 것이다.
<110> Genomics USA <120> Population Scale HLA-Typing and Uses Thereof <130> IP20080005 <150> US60/777,078 <151> 2006-02-27 <150> PCT/US2007/005121 <151> 2007-02-27 <160> 319 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for exon 2 of HLA-B locus <400> 1 gctcccactc catgaggtat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for exon 2 of HLA-B locus <400> 2 atacctcatg gagtgggagc 20 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for exon 2 of HLA-B locus <400> 3 ccactccatg aggtat 16 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for exon 2 of HLA-B locus <400> 4 gaaaccgggt aaac 14 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for exon 2 of HLA-B locus <400> 5 atgaaaccgg gtaaac 16 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for exon 3 of HLA-B locus <400> 6 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HLA-B exon 3 codon 121 variant 2 <400> 263 tttttttgat gtaatctttg cctctttttt 30 <210> 264 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 131 variant 1 <400> 264 tttttttttg acctgagctc cctttttttt 30 <210> 265 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 131 variant 2 <400> 265 ttttttttta cctgcgctcc tttttttttt 30 <210> 266 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 131 variant 1 <400> 266 tttttttttg gagctcaggt ctcttttttt 30 <210> 267 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 131 variant 2 <400> 267 ttttttttta ggagcgcagg tttttttttt 30 <210> 268 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 135 variant 1 <400> 268 ttttttttta ccgcggcgga tttttttttt 30 <210> 269 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 135 variant 2 <400> 269 ttttttttta ccgccgcgga tttttttttt 30 <210> 270 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 135 variant 1 <400> 270 ttttttttct tccgccgcgg tttttttttt 30 <210> 271 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 135 variant 2 <400> 271 ttttttttct tccgcggcgg tttttttttt 30 <210> 272 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 143 variant 1 <400> 272 ttttttttct cagatcaccc attttttttt 30 <210> 273 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 143 variant 2 <400> 273 ttttttttct cagatctccc attttttttt 30 <210> 274 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 143 variant 1 <400> 274 tttttttttt gggtgatctg agtttttttt 30 <210> 275 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 143 variant 2 <400> 275 tttttttttt gggagatctg agtttttttt 30 <210> 276 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 145 variant 1 <400> 276 ttttttttcc ccagcgcaag tctttttttt 30 <210> 277 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 145 variant 2 <400> 277 ttttttttcc ccagctcaag tgtttttttt 30 <210> 278 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 145 variant 1 <400> 278 ttttttttta cttgcgctgg gctttttttt 30 <210> 279 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 145 variant 2 <400> 279 ttttttttca cttgagctgg gctttttttt 30 <210> 280 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 152 variant 1 <400> 280 tttttttttt cccgtgtggc gttttttttt 30 <210> 281 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 152 variant 2 <400> 281 tttttttttt cccgtgaggc gttttttttt 30 <210> 282 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 152 variant 1 <400> 282 ttttttttct cgccacacgg gttttttttt 30 <210> 283 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 152 variant 2 <400> 283 ttttttttct cgcctcacgg gttttttttt 30 <210> 284 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 156 variant 1 <400> 284 ttttttttag cagctgagag ctcttttttt 30 <210> 285 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 156 variant 3 <400> 285 ttttttttta gcagcggaga gttttttttt 30 <210> 286 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 156 variant 1 <400> 286 tttttttttc tctcagctgc tctttttttt 30 <210> 287 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 156 variant 3 <400> 287 tttttttttc tctccgctgc tttttttttt 30 <210> 288 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 163 variant 1 <400> 288 tttttttttg gcctgtgcgt gttttttttt 30 <210> 289 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense probe for HLA-B exon 3 codon 163 variant 2 <400> 289 tttttttttg gcgagtgcgt gttttttttt 30 <210> 290 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 163 variant 1 <400> 290 tttttttctc acgcacaggc ctcttttttt 30 <210> 291 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense probe for HLA-B exon 3 codon 163 variant 2 <400> 291 tttttttctc acgcactcgc ctcttttttt 30 <210> 292 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the k-ras amplicon <400> 292 actgaatata aacttgtggt agttggacct 30 <210> 293 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the k-ras amplicon <400> 293 tcaaagaatg gtcctgcacc 20 <210> 294 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 294 gacctggtgg cg 12 <210> 295 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 295 gacctagtgg cg 12 <210> 296 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 296 gaccttgtgg cg 12 <210> 297 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 297 gacctcgtgg cg 12 <210> 298 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 298 gacctgatgg cg 12 <210> 299 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 299 gacctgctgg cg 12 <210> 300 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense k-ras amplicon <400> 300 gacctgttgg cg 12 <210> 301 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 301 cgccaccagg tc 12 <210> 302 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 302 cgccactagg tc 12 <210> 303 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 303 cgccactagg tc 12 <210> 304 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 304 cgccacgagg tc 12 <210> 305 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 305 cgccatcagg tc 12 <210> 306 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 306 cgccacgagg tc 12 <210> 307 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense k-ras amplicon <400> 307 cgccacaagg tc 12 <210> 308 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B codon 69 variant 1 <400> 308 gcccaggca 9 <210> 309 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B allele codon 69 variant 2 <400> 309 accaacaca 9 <210> 310 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> resequenced reference HLA-B 0702 codon 69 variant 1 <400> 310 rccmasrca 9 <210> 311 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B 7301 codon 69 <400> 311 gccaaggca 9 <210> 312 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B 13XX codon 69 <400> 312 rychmsrcr 9 <210> 313 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B 5801 codon 69 <400> 313 gcctccgcg 9 <210> 314 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B 4601 codon 69 <400> 314 ssccaggca 9 <210> 315 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> resequenced reference HLA-B 4006 codon 69 variant 2 <400> 315 mscmasrca 9 <210> 316 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference sequence for HLA-B 5101 codon 69 <400> 316 acyaacaca 9 <210> 317 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 polymerase recognition sequence included in primers for HLA-B amplicons <400> 317 atgtaatacg actcactata g 21 <210> 318 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B allele probe template where v at position 7 is a single nucleotide polymorphism <400> 318 tgcgacvtgg ggc 13 <210> 319 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B allele probe template where s at position 7 and m at position 9 are single nucleotide polymorphisms <400> 319 gaaggasamg ctg 13

Claims (36)

  1. HLA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서, HLA 유전자가 HLA A, B 또는 DRB1 또는 이들의 엑손인 프라이머.
  3. 제 2항에 있어서, HLA-A 프라이머가 SEQ ID NO:14-15에 나타낸 서열을 지니고, HLA-A 엑손 2 프라이머가 SEQ ID NO:20-21에 나타낸 서열을 지니고, HLA-A 엑손 3 프라이머가 SEQ ID NO:22-26에 나타낸 서열을 지니는 프라이머.
  4. 제 2항에 있어서, HLA-B 프라이머가 SEQ ID NO:16-19에 나타낸 서열을 지니고, HLA-B 엑손 2 프라이머가 SEQ ID NO:27-28에 나타낸 서열을 지니고, HLA-B 엑손 3 프라이머가 SEQ ID NO:29-31에 나타낸 서열을 지니는 프라이머.
  5. 제 2항에 있어서, HLA-DRB1 프라이머가 SEQ ID NO:32-37에 나타낸 서열을 지 니고, HLA-B 엑손 2 프라이머가 SEQ ID NO:38-47에 나타낸 서열을 지니는 프라이머.
  6. 단일 누클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 함유하는 영역에 상보적인 약 9-15머(mer)의 올리고누클레오티드; 및 5' 및 3' 플랭킹 (flanking) 서열을 포함하는, HLA 유전자 내의 SNP를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브.
  7. 제 6항에 있어서, 플랭킹 서열이 올리고-티미딘 또는 올리고-티미딘-유사 다중음이온 중합체인 하이브리드화 프로브.
  8. 제 6항에 있어서, SNP가 HLA-A 엑손 2 또는 엑손 3, HLA-B 엑손 2 또는 엑손 3 또는 HLA-DRB1 엑손 2에 위치하는 하이브리드화 프로브.
  9. 제 8항에 있어서, HLA-A 엑손 2 프로브가 SEQ ID NO:48-49에 나타낸 서열을 지니고, HLA-A 엑손 3 프로브가 SEQ ID NO:100-153에 나타낸 서열을 지니는 하이브 리드화 프로브.
  10. 제 8항에 있어서, HLA-B 엑손 2 프로브가 SEQ ID NO:154-237에 나타낸 서열을 지니고, HLA-B 엑손 3 프로브가 SEQ ID NO:238-239에 나타낸 서열을 지니는 하이브리드화 프로브.
  11. 양이온 표면을 지니는 기판; 및 이에 흡착되는 하나 이상의 제 6항의 하이브리드화 프로브를 포함하는 단층을 포함하는, HLA 유전자를 대립 유전자형 분석하기 위한 마이크로어레이 장치.
  12. 제 11항에 있어서, 양이온 표면이 아미노실란, 쿼니디늄(quanidinium), 산화주석, 산화알루미늄 또는 산화지르코늄 또는 기타 동등하게 하전된 부분을 포함하는 마이크로어레이 장치.
  13. 제 11항에 있어서, 기판이 유리, 플라스틱 또는 금속인 마이크로어레이 장치.
  14. 제 11항에 있어서, 하이브리드화 프로브과 함께 공동-흡착된 올리고-티미딘을 추가로 포함하는 마이크로어레이 장치.
  15. 제 14항에 있어서, 올리고-티미딘이 약 20 내지 약 40개의 티미딘을 지니는 마이크로어레이 장치.
  16. 제 14항에 있어서, 올리고-티미딘에 연결된 형광 염료를 추가로 포함하는 마이크로어레이 장치.
  17. 제 11항에 있어서, 캡핑제 (capping agent)를 추가로 포함하는 마이크로어레이 장치.
  18. HLA 유전자를 증폭시키기 위한 유전자-특이적 프라이머; 및 제 11항의 마이크로어레이 장치를 포함하는, 집단-규모의 HLA 유전자형 분석을 위한 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 프라이머가 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지니는 키트.
  20. 제 18항에 있어서, PCR 반응을 위한 완충용액 및 중합효소 또는 형광 염료 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 키트.
  21. 제 11항의 마이크로어레이 장치;
    집단을 포함하는 개체로부터 DNA 샘플을 수거하고 정제하기 위한 수단;
    수거된 DNA로부터 하나 이상의 관심 HLA 유전자의 cRNA 표적 앰플리콘 (amplicon)을 PCR 생성시키기 위한 수단; 및
    각각의 개별적인 관심 HLA 유전자에 대해 HLA 대립 유전자형을 지정하기 위한 수단을 포함하는, 필드 (field) 환경에서 실시간의 고속 처리량의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석을 위한 시스템으로서,
    개별적 수단 및 장치를 포함하는 상기 시스템이 휴대가능하고, 필드 환경에서 실시간으로 사용가능한 시스템.
  22. 제 21항에 있어서, HLA 유전자가 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DRB1인 시스템.
  23. 제 21항에 있어서, DNA 샘플을 수거하기 위한 수단이 개체로부터 수거된 협측 세척 샘플, 협측 면봉법 샘플 또는 혈액 샘플을 수용하기에 적절한 용기를 포함하는 시스템.
  24. 제 21항에 있어서, 표적 앰플리콘을 생성시키기 위한 수단이 관심 HLA 유전자를 증폭시키기 위한 HLA 유전자-특이적 프라이머를 포함하는 시스템.
  25. 제 24항에 있어서, 유전자-특이적 프라이머가 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지니는 시스템.
  26. 제 21항에 있어서, 각각의 개체에 대한 HLA-대립 유전자형을 지정하기 위한 상기 수단이 표적에 흡착되는 하이브리드화 프로브에 대한 표적의 하이브리드화 후에 마이크로어레이 장치에 형성된 하이브리드화 패턴을 검출하기 위해 적합화된 영 상 장치; 및 HLA 대립 유전자형으로서 영상화된 하이브리드화 패턴을 인식하도록 적합화된 알고리즘 세트를 포함하는 패턴 인식 소프트웨어를 포함하는 시스템.
  27. 제 26항에 있어서, 하이브리드화 프로브가 SEQ ID NO:48-289에 나타낸 서열을 지니는 시스템.
  28. 제 21항에 있어서, 실시간의 고속 처리량의 유전자형 분석이 작동하는 시스템당 1시간당 약 200 내지 약 300개의 HLA 대립 유전자형으로 수행되는 시스템.
  29. 집단의 하나 이상의 일원으로부터 DNA를 수거하는 단계;
    분석을 위한 DNA를 정제하는 단계;
    유전자 특이적 프라이머를 이용하여 DNA를 포함하는 관심 HLA 유전자로부터 표적 앰플리콘을 생성하는 단계;
    하이브리드화 프로브를 포함하는 제 11항의 마이크로어레이와 표적을 접촉시키는 단계; 및
    접촉 후에 형성된 하이브리드화 패턴을 영상화시키는 단계를 포함하는, 필드 환경에서 실시간의 집단-규모의 HLA 대립 유전자형 분석을 위한 방법으로서, 각각 의 HLA 대립 유전자형이 이와 관련된 패턴을 지니는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 수거된 DNA를 보관하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, DNA가 협측 세척액 또는 협측 면봉법과 함께 혈액으로부터 수거되는 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 유전자-특이적 프라이머가 SEQ ID NO:14-47에 나타낸 서열을 지니는 방법.
  33. 제 29항에 있어서, 하이브리드화 프로브가 SEQ ID NO:48-289에 나타낸 서열을 지니는 방법.
  34. 제 29항에 있어서, 지정된 대립 유전자형에 기초하여 각각의 개체에 대해 생물학적 작용제 또는 무기에 의한 감염의 위험을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방 법.
  35. 제 29항에 있어서, 각각의 개체에서 생물학적 작용제 또는 무기에 대한 특정 백신의 반응을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제 29항에 있어서, 집단의 각각의 개체에 대해 지정된 대립 유전자형이 이의 확인을 위한 수단을 포함하는 방법.
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